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재조합 DNA
제한 엔도뉴클레아제

플라스미드 클로닝 벡터
기술
플라스미드 클로닝 벡터 pBR322
변환 및 선택
기타 플라스미드 클로닝 벡터
라이브러리 생성 및 스크리닝
게놈 라이브러리 만들기
DNA 혼성화에 의한 스크리닝
면역학적 분석에 의한 스크리닝
단백질 활성에 의한 스크리닝
진핵생물 단백질을 암호화하는
DNA 서열 클로닝
큰 DNA 조각 복제를 위한 벡터
분자 복제는 여러 가지를 포괄하는 일반적인 용어입니다.
박테리오파지 λ 벡터 유전자 클로닝 또는 유전자
코스미드 한 유기체에서 다른클로닝
유기체로이라고도 불리는 재조합
유전 정보(DNA)를 DNA 기술
전달하는 실험 프로토콜입니다. 이 목
고용량 세균 벡터 시스템
표를 달성하는 데 사용할 수 있는 단일 방법 세트는 없습니다. 그러나 재조합 DNA 실험은 종종
원핵생물의 유전적 변형 다음과 같은 형식을 갖습니다(그림 3.1).

DNA를 대장균 으로 옮기기 • DNA(복제된 DNA, 삽입 DNA, 표적 DNA, 또는 외부 DNA)

전기천공 기증 유기체로부터 추출되고, 효소적으로 절단(절단 또는 소화)되고, 다른 DNA 개체(클
동사 변화 로닝 벡터)에 결합(연결)되어 새로운 재조합 DNA 분자(클로닝 벡터‑
요약

참고자료 DNA 구조 또는 DNA 구조를 삽입합니다).

질문 검토 • 이 클로닝 벡터 삽입 DNA 구조는 다음으로 전달됩니다.
숙주 세포 내에서 유지됩니다. 박테리아 숙주 세포에 DNA를 도입하는 것을 형질전환이라고 합니
다.

• DNA 구성물을 흡수하는 숙주 세포(형질전환된 세포)

그렇지 않은 것 중에서 식별되고 선택(분리 또는 격리)됩니다.

• 필요한 경우 DNA 구조를 생성하여 단백질을 생성할 수 있습니다.

복제된 DNA 서열에 의해 암호화된 생성물이 생성됩니다.
숙주 세포.

재조합 DNA 기술은 분자 생물학, 핵산 효소학, 박테리아 바이러스(박테리오파지)와 박테리

아 염색체외 DNA 요소(플라스미드)의 분자 유전학의 발견을 통해 개발되었습니다. 그러나 특정
이중 가닥 DNA 서열을 인식하고 이 두 가닥의 DNA를 절단하는 효소가 없다면 재조합 DNA 기
술은 존재하지 않을 것입니다.

서열 (제한 효소, 또는 제한 엔도뉴클레아제). 뉴클레아제

핵산 분자를 내부적으로 절단하는 것은 엔도뉴클레아제이고, 핵산의 말단에서 분해되는 것은 엑
소뉴클레아제입니다.

47
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48 장 3

원천 복제
DNA 벡터

표적
DNA
효소 단편화 효소적으로 선형화

벡터 DNA

표적 DNA와 클로닝 벡
터 결합

DNA 구조

숙주 세포에 DNA를 도입

복제된 유전자로 세포 분리

숙주 세포

복제된 유전자로부터 단백질 생산

암호화된 단백질
복제된 유전자에 의한

그림 3.1 재조합 DNA 클로닝 절차. 원본 유기체의 DNA는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 클로

닝 벡터에 삽입됩니다. 클로닝 벡터‑삽입(표적) DNA 구성물이 숙주 세포에 도입되고, 구성물을 운
반하는 세포가 식별되고 성장됩니다. 필요한 경우 복제된 유전자가 숙주 세포에서 발현(전사 및 번
역)되어 단백질(재조합 단백질)을 수확할 수 있습니다.
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재조합 DNA 기술 49

제한 엔도뉴클레아제
분자 클로닝을 위해서는 표적 서열을 포함하는 소스 DNA와 클로닝 벡터가 일관되게 개별
적이고 재현 가능한 단편으로 절단되어야 합니다. 특정 염기쌍 서열에서 내부적으로 DNA
분자를 절단하는 효소가 발견되어 분자 복제가 가능해졌습니다. 이 효소는 공식적으로 II형
제한 엔도뉴클레아제로 지정됩니다. 다른 종류의 제한 엔도뉴클레아제(I형, III형, 및 III형)
가 있다는 사실에도 불구하고 IV), II형 제한 엔도뉴클레아제는 일반적으로 제한 엔도뉴클
레아제 또는 간단히 제한 효소라고 합니다.

특성화될 첫 번째 유형 II 제한 엔도뉴클레아제 중 하나 는 Escherichia coli 박테리

아에서 유래되었으며 원래는 EcoRI로 지정되었습니다. 최근에는 이것이 제안되었습니다.
제한 엔도뉴클레아제의 명명을 위해 이탤릭체를 사용하는 것을 포기해야 합니다. 여기에서
우리는 이 권장 사항을 구현했습니다. EcoRI는 특정 회문 서열(인식)을 가진 DNA 영역에
결합하는 동종이량체 단백질(두 개의 동일한 단백질로 구성됨)입니다. 사이트 또는 결합 사
이트). 즉, 결합 사이트의 두 가닥에 있는 뉴클레오티드 서열은 둘 중 하나가 동일한 극성,
즉 5'에서 3'으로 판독될 때 동일합니다. .EcoRI 인식 서열은 6개의 염기쌍(bp)으로 구성되
며 각 가닥의 구아닌과 아데닌 잔기 사이에서 절단됩니다(그림 .3.2). EcoRI®는 한 뉴클레
오티드 당의 3' 탄소 산소와 인접한 뉴클레오티드 당의 5' 탄소에 부착된 인산기 사이의 뉴
클레오티드간 결합을 특이적으로 절단합니다. EcoRI에 의한 DNA의 대칭적인 엇갈린 절단
은 두 개의 단일 가닥의 상보적인 절단 말단을 생성하며, 각각은 접착 말단으로 알려진 4개
의 뉴클레오티드 확장을 갖습니다. 이 경우에는,

그림 3.2 제2형 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI에 의한 짧은 DNA 조각의 대칭적이고 엇갈린 절단.

큰 화살표는 절단 부위를 보여줍니다.
DNA 백본. S, 데옥시리보스 설탕; P, 인산염 그룹; OH, 하이드록실 그룹.
EcoRI 인식 순서는 점선으로 강조 표시됩니다.

피 피 피 피 피 피 피 피 오
에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

티 G ㅏ ㅏ 티 티 씨 티
ㅏ 씨 티 티 ㅏ ㅏ G ㅏ

에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

에게 피 피 피 피 피 피 피 피

엇갈린 분열

함몰된 3'‑히드록실기 5'‑인산염 그룹 확장

피 피 오 피 피 피 피 피 피 오
에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

티 G ㅏ ㅏ 티 티 씨 티
ㅏ 씨 티 티 ㅏ ㅏ G ㅏ

에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

에게 피 피 피 피 피 피 깡충깡충 뛰다 피
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50 제3장

각각의 단일 가닥 연장은 5' 인산염 그룹으로 끝나고, 반대편 가닥의 3' 하이드록실 그룹은
오목해집니다.
EcoRI 외에도 약 250개의 서로 다른 인식 부위를 가진 3,700개 이상의 유형 II 제한 엔
도뉴클레아제가 다양한 박테리아로부터 분리되었습니다. 이 효소의 명명 프로토콜은 EcoRI
의 명명 프로토콜과 동일합니다. 속(genus)은 대문자로 표시되고, 특정 이름의 첫 두 글자는
소문자로 표시됩니다. . 때로는 EcoRI의 R과 같이 이름에 균주 명칭이 추가되거나, 박테리아
균 소스의 혈청형이 표시되는 경우도 있습니다. HindIII에 있는 것과 같습니다. 로마 숫자는
동일한 유기체의 서로 다른 제한 엔도뉴클레아제의 특성화 순서를 지정하는 데 사용됩니다.
예를 들어, HpaI 및 HpaII 는 에서 분리된 첫 번째 및 두 번째 유형 II 제한 엔도뉴클레아제입
니다.

헤모필루스 파라인플루엔자.
대부분의 II형 제한 엔도뉴‑클레아제가 DNA 분자에 결합하고 절단하는 회문 서열은 인
식 부위 내에 있습니다. 일부 제한 엔도뉴클레아제는 DNA를 소화(절단)하여 오목한 3' 하이
드록실 말단과 함께 5' 인산염 연장 부분(돌출된 끝, 또는 끈적한 끝)을 남깁니다. 일부는 오
목한 5' 인산 말단을 갖는 3' 수산기 확장부를 남기고; 그리고 인식 부위 내에서 두 가닥의 백
본을 일부 잘라서 무딘 말단(플러시 말단) DNA 분자를 생성합니다(그림 3.3). 다양한 효소
에 대한 인식 부위의 길이는 4개, 5개, 6개, 8개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 쌍일 수 있습니
다(표 3.1). 왜냐하면 인식 부위의 빈도 때문입니다. DNA에서 발생하는 경우 4개(4개 커터)
및 6개(6개 커터) 뉴클레오티드 쌍 부위 내에서 절단되는 제한 엔도뉴클레아제가 대부분의 일
반적인 분자 복제 프로토콜에 사용됩니다. 유전자 복제를 위한 II형 제한 엔도뉴클레아제의
중요성은 아무리 강조해도 지나치지 않습니다.

그림 3.3 제한 엔도뉴클레아제 HindII 유형에 따른 DNA의 짧은 단편의 무딘 말단 절

단. 큰 화살표는 DNA 부위를 보여줍니다. DNA 백본에서 절단이 발생합니다. 약어는
그림 3.2의 범례를 참조하세요. HindII 인식 순서가 강조 표시되어 있습니다.

피 피 피 피 피 피 피 피 오
에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

티 G 티 티 ㅏ ㅏ 씨 티
ㅏ 씨 ㅏ ㅏ 티 티 G ㅏ

에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

에게 피 피 피 피 피 피 피 피

무딘 말단
분열

피 피 피 피 오 피 피 피 피 오
에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

티 G 티 티 ㅏ ㅏ 씨 티
ㅏ 씨 ㅏ ㅏ 티 티 G ㅏ

에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스 에스

에게 피 피 피 피 에게 피 피 피 피
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재조합 DNA 기술 51

표 3.1 일부 제한 엔도뉴클레아제의 인식 서열

효소 인식 사이트 절단 끝의 유형
에코RI G↓A—A—T—T—C 5' 인산염 연장
C—T—T—A—A↑G
밤HI G↓G—A—T—C—C 5' 인산염 연장
C—C—T—A—G↑G
PstI C—T—G—C—A↓G 3' 하이드록실 연장
G↑A—C—G—T—C
Sau3AI ↓G—A—T—C 5' 인산염 연장
C—T—A—G↑
PvuII C—A—G↓C—T—G 무딘 끝
G—T—C↑G—A—C

HPAI G—T—T↓A—A—C 무딘 끝
C—A—A↑T—T—G
플래그 III G—G↓C—C 무딘 끝
C—C↑G—G
메모 G↓C—G—G—C—C—G—C 5' 인산염 연장
C—G—C—C—G—G—C↑G

화살표는 절단 부위를 나타냅니다.

DNA 샘플이 이러한 효소 중 하나로 처리되면 모든 인식 부위가 절단된다는 가정 하에 항

상 동일한 조각 세트가 생성됩니다. 또한 다양한 제한 사항에 즉시 접근할 수 있습니다.
엔도뉴클레아제
유전자 복제 전략에 다양성을 추가합니다.
IIS형 제한 엔도뉴클레아제는 제한 효소의 II형 범주의 하위 그룹을 형성하며 때로
는 복제 및 기타 분자 연구(예: 멀티플렉스 폴로니)에 사용됩니다. 시퀀싱, 즉

4장에서 논의됩니다. 이 효소는 일반적으로 인식 부위의 한쪽 끝에서 고정된 수의 뉴클레

오티드가 떨어진 두 가닥 모두에서 DNA를 절단하는 매혹적인 특징을 가지고 있습니다.
시퀀스
뉴클레오티드는 결합 서열과 절단 부위 사이에 존재할 수 있습니다.
대부분의 유형의 IIS 제한 효소에 대한 절단은 시차를 두고 있습니다.
예를 들어, FokI 제한 엔도뉴클레아제는 GGATG CCTAC 에 결합하여 위쪽 가닥 하류
의 9개 뉴클레오티드와 아래쪽 가닥의 13개 뉴클레오티드를 절단하여 오목한 3' 수산기
말단과 4‑핵‑핵산을 생성합니다. 5' 인산 말단의 오타이드 연장. FokI 제한 엔도뉴클레
아제의 인식 서열 및 절단 부위의 한 가지 표현은 다음과 같습니다.

GGATGNNNNNNNNNN
여기서 N은 A, C, G 또는 T를 나타냅니다. 물론, 이 단일 문자
CCTACNNNNNNNNNNNNNN,

코드를 사용하면 서로 반대편에 있는 뉴클레오티드(N)가 염기쌍을 이루고 있는 것으로 이

해됩니다. 더 간단한 표기법은 GGATG(N)9 입니다. CCTAC(N)13 , 아마도 가장 간단한 것은
GGATG(9/13)일 것입니다. 일부 IIS 유형 제한 엔도뉴클레아제의 예는 다음과 같습니다.
표 3.2에 나와 있습니다. 몇 가지 유형의 IIS 제한 엔도뉴클레아제가 인식 부위의 상류
와 하류 모두에서 DNA를 절단한다는 점에 유의해야 합니다.

자연 조건에서 박테리아는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 감염성 박테리아 바이러

스(박테리오 파지)와 같은 외부 DNA를 절단하고 자신의 DNA가 분해되는 것을 방지하
는 시스템을 개발했습니다. 가장 흔히 메틸화 a의 시토신 잔기

숙주 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 부위는 제한 엔도뉴클레아제가 이 부위에서 절단되는

것을 방지하지만, 외래 DNA의 비메틸화 부위는 공격에 취약합니다.

다양한 박테리아의 제한 엔도뉴클레아제와 흥미로운 관계가 관찰되었습니다. 어떤 경우에

는 다른 포스포디에스테르 결합이 발견되었습니다.
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52 장 3

표 3.2 IIS 유형 제한 엔도뉴클레아제의 몇 가지 예

제한효소 인식 순서
AcuI 5′ CTGAAG(N)16
3′ GACTTC(N)14
BfuAI 5′ ACCTGC(N)4
3′ TGGACG(N)8
BsmBI 5′ CGTCTC(N)1
3′ GCAGAG(N)5
ECI 5′ GGCGGA(N)11
3′ CCGCCT(N)9
여우 5′ GGATG(N)9
3′ CCTAC(엔)13
HgaI 5' GACGC(N)5
3′ CTGCG(N)10
MlyI 5′ GAGTC(N)5
3′ CTCAG(N)5
음 5′ TCCRAC(N)20
3′ AGGYTG(N)18

인식 서열은 하류 절단 부위의 위치와 함께 표시됩니다. N = A, T, G, C; R = A

ㅏ G 그리고 N ㅏ 티 G 또 씨
또는 G; Y = T or C.단일 문자 코드 R Y는 염기쌍을 나타냅니다. 티
또는
씨, N은 는 T , A , C , G. _

동일한 인식 부위 내에서 서로 다른 유기체의 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단됩니다. 예를

들어 제한 효소 XmaI 및
SmaI는 둘 다 시퀀스를 인식합니다 CCCGGG
GGGCCC, 하지만 Xma는 첫 번째 5′ 이후에 갈라집니다.
각 가닥에 시토신이 있고 5' 인산염 확장을 생성하는 반면 SmaI는 CG 사이를 절단하여 둔한 말단을 생성합니다.

GC 인식 부위 중간에 염
기쌍이 있습니다. 특정 인식 부위에 결합하는 것으로 발견된 첫 번째 제한 엔도뉴클레아제
는 프로토타입으로 지정됩니다. 동일한 것을 공격하는 추가 제한 엔도뉴클레아제

원형과 같은 서열을 등분화체라고 합니다. 예를 들어,

서로 다른 유기체의 XhoI 및 PaeR7I 제한 엔도뉴클레아제
동일한 인식 서열과 절단 위치를 가지고 있습니다.
그림 3.4 신분열체. 4개의 제한 엔도뉴클레아제는 동일 동일한 인식 부위 내의 다른 위치에서 절단되는 것은 신분열체입니다(그림 3.4). 반면, 동일
한 인식 부위에 결합하고 다른 위치에서 절단됩니다. 제
한 뉴클레오티드 확장을 생성하지만 인식 부위가 다른 제한 엔도뉴클레아제는 isocaudomer
한 엔도뉴클레아제 및 절단 부위(화살표)는 색상으로 구
로 지정됩니다(예: BamHI 및 Sau3AI)(표 3.1).
분되어 있습니다:
KasI, red; NarI, blue; SfoI, black;
이 경우 제한 엔도뉴클레아제는 시토신이 있는 경우에만 서열을 절단합니다.
BbeI,녹색.NdaI와 같은 다른 제한 엔도뉴클레아제의 인식 부위의 일부는 메틸화되지 않은 반면, 이들 시토신이 메틸화되어 있다면 또 다른 제한
수
엔도뉴클레아제가 동일한 서열을 절단할 것입니다.
Mly113I, MchI, BinSII, DinI, EgeI, and
에헤이,그것이 이것을 묶고 쪼개는 것입니다
예를 들어, HpaII는 메틸화되지 않은 CCGG GGCC 사이트만 절단하고, HpaII의 이소분
시퀀스는 표시되지 않습니다. 열체인 MspI은 시토신 메틸화와 관계없이 이 서열을 절단합니다.
이 제한 엔도뉴클레아제 쌍은 종종 게놈 DNA의 메틸화 상태를 결정하는 데 사용됩니다.
SF영화
만약 DNA 분자가 HpaII에 의해 절단되지는 않았지만
그리고 나
MspI에 의해 절단되면 인식 사이트가 메틸화됩니다. 두 가지 제한 사항이 모두 적용되면
왜냐하면 비베I 엔도뉴클레아제가 DNA 분자를 절단하면 그 부위는 메틸화되지 않습니다.
특정 DNA 조각에서 제한 엔도뉴클레아제 부위의 상대적 위치를 지정하는 물리적 지
G G 씨 G 씨 씨 도는 DNA 분자를 다른 제한 엔도뉴클레아제로 단독으로 처리한 다음 동일한 제한 엔도뉴
씨 씨 G 씨 G G 클레아제의 조합으로 처리하여 구성할 수 있습니다. 절단 부위의 위치는 아가로스 겔 전기영
동에 의해 결정되는 단편 크기 분석을 통해 추론할 수 있습니다(박스 3.1). 예시를 통해 다양
비베I 왜냐하면
한 소화에 의해 생성된 조각 크기가 표시됩니다.
그리고 나

SF영화
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재조합 DNA 기술 53

그림 3.5A에서 이 DNA의 선형 조각은 두 개를 가지고 있다고 추론할 수 있습니다.

BamHI 사이트와 두 개의 EcoRI 사이트가 특정 순서로 지정되었습니다.
사이트를 분리하는 기본 쌍의 수입니다. 더 구체적으로, 크기
각각의 단일 소화에서 생성된 단편은 이중 소화에서 나온 단편과 비교되어 제한 엔도뉴클레
아제 부위의 위치를 결정하고 제한 엔도뉴클레아제 부위 맵(제한 엔도뉴클레아제 맵)을 생성
할 수 있습니다. 그림 3.5에 표시된 분석

다음과 같이 진행됩니다. 각각의 단일 분해는 선형 DNA 분자로부터 3개의 단편을 생성하기

때문에 원래의 DNA 조각에는 각 제한 엔도뉴클레아제에 대한 2개의 부위가 포함되어야 합니
다. 3,000bp 조각은

박스 3 .1

겔 전기영동 샘플의 크기가 확연히 다릅니다. 단량체성 아크릴아미드와 가교제의 공중합

그렇지 않으면 밴드가 감지되지 않습니다.
비스아크릴아미드는 가교된 선형 폴리아
G 엘 전기영동은 일반적으로
문제 해결을 위해 사용되는 기술
거대분자의 크기에는 거의 차이가 없다.

농축된 샘플에서는 얼룩진 물질이 번지는 것

단백질 또는 핵산.일반적으로,a
특정 유형의 거대분자(단백질, DNA 또는 RNA) 샘
플을 겔 매트릭스(겔)의 끝이나 끝 근처에 있는 웰에 넣
습니다. 전기영동 겔의 구성은 상호 연결된 선형의 반고
체 개방형 메쉬워크입니다.
가닥. 젤은 여러 개의 샘플 웰이 있는 얇은 슬래
브로 주조됩니다. 겔의 웰에 시료를 넣은 후 겔 전체
에 전기장을 가하고 동일한 크기의 전하를 띤
거대분자가 구동됩니다.
분리된 보이지 않는 재료 밴드로서 겔을 통해 양극
방향으로 함께 결합됩니다. 거리가
밴드가 겔로 이동하는 정도는 거대분자의 질량과
겔의 개구부 크기(기공 크기). 작은 거대분자는 큰 분
자보다 더 멀리 이동합니다.
겔 전기영동의 진행은 가시적인 염료(추적염료)의
이동을 관찰함으로써 모니터링됩니다.
젤을 통해. 추적 염료는 다음과 같습니다.
실행 시작 시 각 샘플 웰에 로드되는 전하를 띤 저분
자량 화합물입니다. 때
염료 추적이 마지막 단계에 도달했습니다.
젤, 실행이 종료됩니다. 각 웰 아래 레인에 정렬된 밴
드는 단백질, DNA 또는 RNA에 특이적인 염료로 젤을
염색하여 시각화됩니다. 개별 밴드는 밴드에 염료를 결
합하여 밴드를 보이게 할 만큼 충분한 물질이 밴드에
존재할 때 관찰됩니다.
이 관찰됩니다. 그만큼
염색된 밴드의 강도는 샘플 내 거대 분자의 발생 빈도
를 반영합니다.
겔 분별 거대 분자(밴드)의 분자량(분자량)
은 다음 세트를 기반으로 하는 표준 곡선에서 결정
됩니다.
알려진 분자의 거대분자 중
를 덮는 원형 질량(크기 표시)
겔 시스템의 분리 범위는 외부 중 하나 또는 둘 모두에
서 실행됩니다.
샘플과 동일한 젤의 측면 레인(교정기 레인). 크
기의 분자 질량의 로그 공식
마커는 상대 항목과 관련되어 있습니다.
겔을 통한 이동성 (Rf ) . Rf 값은 밴드가 이동한 거리
를 추적 염료(이온)가 이동한 거리로 나눈 값으로
정의됩니다.
앞쪽). 각 크기 마커의 분자 질량 로그와 해당 Rf
값 사이의 관계가 그려져 있습니다. 그런 다음 이
표준 곡선을 사용하여 레인의 각 밴드에 대한 분
자 질량을 계산합니다. 단백질과 이중 가닥 및
단일 가닥 핵산의 분자 질량 단위는 각각 달톤, 염기
쌍, 염기입니다. 사이즈 표시는 동일한 젤에 포함되
어 있습니다.
거대분자의 이동도는 전기영동마다 다르기 때문에
시료로 사용됩니다.
크릴아미드 가닥의 격자를 형성합니다.
폴리아크릴아미드 겔의 기공 크기는 아크릴아미드의
농도와 아크릴아미드와 비스아크릴아미드의 비율에
따라 결정됩니다. 많은 응용 분야에서 단백질
샘플은 전기영동 전에 음이온성 세제인 SDS(나
트륨 도데실 황산염)로 처리됩니다. SDS는 단
백질에 결합하고 대부분의 다중 사슬을 분리합
니다.
단백질. 각 SDS 코팅 단백질 사슬은 비슷한 전
하 대 질량 비율을 갖습니다. 결과적으로, 전기 영
동 중에 SDS‑
단백질 사슬은 주로 크기에 기초하며 구조의 영향
은 제거됩니다. 10% 폴리아크릴아미드 젤을 사용한
SDS‑폴리아크릴아미드 젤 전기영동은 20~200킬
로달톤(kDa) 범위의 단백질을 분리합니다.
해조류의 다당류인 아가로스(Agarose)는 중간
크기 핵산의 전기영동 분리를 위한 겔 매트릭스로 일상
적으로 사용됩니다.
분자. 1.0% 아가로스 겔은 약 600bp에서
10,000bp 범위의 이중 DNA 사슬을 분해할
수 있습니다.
특수한 아가로스 겔 전기영동 시스템은 수백만 염기의
DNA 분자를 분별하는 데 사용할 수 있습니다.
쌍, 변성 DNA 및 변성 RNA. 또한 특정 목적을 위해
폴리아크릴아미드 젤은 DNA 분자 분리에 사용
됩니다. 예를 들어, 6개의 염기만큼 작고 각각 다른
DNA 사슬

다음. 다른 하나의 뉴클레오티드는 20% 폴리아크

폴리아크릴아미드는 단백질 분리에 선호되는 겔 릴아미드 겔로 분해될 수 있습니다.
개별 거대분자는 시스템입니다.
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54 장 3

에코RI 밤HI EcoRI과 BamHI

소화 소화 소화

9,500

8,500

6,000 6,000

5,000

4,000

3,000 3,000
2,500

1,000 1,000

에코RI 에코RI
5,000 3,000 8,500

1,000 4,000 3,000 2,500 6,000

9,500 6,000
1,000
밤HI 밤HI

그림 3.5는 제한 엔도뉴클레아제 부위의 매핑입니다.(A) 제한 엔도뉴클레아제 분해 및 단편의 전기영동 분리. 정제된 선형

DNA 조각은 EcoRI 및 BamHI로 별도로 절단되고(단일 분해) 다음으로 절단됩니다.

두 효소가 함께 작용합니다(이중 소화). 소화 조건 하의 수평선은 전기영동 및 에티듐 브로마이드로 DNA를 염색한 후 겔의 레

인에 있는 DNA 단편(밴드)의 위치를 개략적으로 나타냅니다. 숫자는 염기쌍 단위의 소화 산물(단편)의 길이를 나타냅니다.
(B) 패널 A에 표시된 소화 및 전기 영동 분리에서 파생된 제한 엔도뉴클레아제 맵.

단일 EcoRI에 의해 생성되며 이중 분해 후에도 그대로 유지됩니다.

소화되는 반면, 8,500‑bp 및 5,000‑bp EcoRI 단편은 절단됩니다.
따라서 두 개의 EcoRI 사이트는 개입 없이 3,000bp 떨어져 있습니다.
BamHI 사이트는 8,500~8,500개 및 1개 지역 각각에 BamHI 사이트가 하나씩 있습니다.
5,000‑bp EcoRI 조각. 에 의해 생산된 9,500‑bp조각
단일 BamHI 소화는 이중 소화에서 EcoRI에 의해 절단되어
세 조각 (2,500 + 3,000 + 4,000 = 9,500 bp). 그러므로, the two BamHI
사이트는 EcoRI 사이트의 양쪽에 2,500bp와 4,000bp가 있습니다.
BamHI는 8,500‑bp EcoRI 조각을 2,500‑bp 및 6,000‑bp 조각으로 절단하며, EcoRI
사이트 중 하나는 2,500bp입니다. BamHI사이트,그래서
6,000‑bp 영역은 원래 분자의 말단 중 하나를 포함해야 합니다.
동일한 논리를 사용하여 BamHI를 사용한 소화가
5,000‑bp EcoRI 조각을 1,000‑ 및 4,000‑bp 조각으로 변환하고 그 중 하나
EcoRI 사이트 중 BamHI 사이트의 4,000bp가 있으므로, 따라서 1,000bp가 됩니다.
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재조합 DNA 기술 55

표 3.3 단일 및 이중 제한 엔도뉴클레아제 소화 후 DNA 단편 크기(킬로베이스 쌍 단위)

플라스미드

에코아이 밤HI HindIII 플래그 II 에코I + 밤HI + HindIII + 에코I + 에코I + 밤HI +
플래그 II 플래그 II 플래그 II HindIII 밤HI HindIII
12.0 12.0 12.0 6.0 5.0 6.0 6.0 6.5 10.5 8.0
4.0 4.0 4.0 2.5 5.5 1.5 4.0
2.0 2.0 1.5 2.0
1.0 0.5 1.5

영역은 원래 분자의 다른 쪽 끝을 포함해야 합니다. 마지막 부분에서

지도(그림 3.5B)에서 제한 엔도뉴클레아제 부위의 할당된 위치는 각 소화 반응에서 관찰된 단편 길이
와 일치합니다.

원형 DNA에 대한 제한 엔도뉴클레아제 지도를 작성하는 과정은 원칙적으로 각 절단이 단편을 생

성한다는 점을 제외하면 선형 DNA와 동일합니다. 즉, 3개의 조각이 형성됩니다.

세 개의 사이트가 잘릴 때 등등. 표 3.3의 데이터를 이용하여 원형 플라스미드의 제한 엔도뉴클레아제

맵을 추론하면 다음과 같다. 소스 DNA는 단일 EcoRI, BamHI 및 를 포함하는 12킬로염기쌍(kb) 원
입니다.
HindIII 사이트 및 3개의 HaeII 사이트. EcoRI, BamHI 또는 HindIII를 사용한 소화
별도로, 단일 12kb 단편을 생성하고, HaeII로 소화하는 동안
세 개의 단편을 생성합니다. EcoRI 및 HaeII 이중 분해 결과는 EcoRI 사이트가 6.0‑kb HaeII 단편
내에 있음을 나타냅니다. ,
2.0‑kb 및 4.0‑kb HaeII 조각은 그대로 유지되고 합계도 그대로 유지되기 때문입니다.
두 개의 새로운 작품 중(5.0kb + 1.0 kb)은 6.0kb입니다.BamHI와 BamHI를 기반으로 합니다.
HaeII의 이중 소화, BamHI 사이트는 2.0‑kbHaeII 영역 내에 있습니다.
BamHI 및 EcoRI 이중 소화는 이들 부위를 1.5kb² 떨어져 배치합니다.
따라서 6.0‑kb 및 2.0‑kb HaeII 조각은 인접해 있습니다. 데이터는 다음과 같습니다.
BamHI 및 EcoRI 사이트에 대한 다른 위치는 지원되지 않습니다.
원형 분자 주위의 HaeII 세그먼트 중 는 6.0 kb‑4.0 kb‑2.0kb.입니다.
동일한 추론으로 Hind III 사이트가 4.0‑kb HaeII 조각으로 현지화되었습니다.
및 BamHI 및 HindIII 및/또는 EcoRI 및 HindIII의 결과 그림 3.6 제한 엔도뉴클레아제

이중 소화는 제한 엔도뉴클레아제 지도를 완성합니다(그림 3.6). 표 3.3에 제시된 소화 산물에 대한 지도. 원형 DNA

일부 제한 엔도뉴클레아제 매핑 실험의 경우 일부 다중 소화의 단편 합계는 시작 DNA의 전체 길

12,000 bp(12kb)가 있습니다. 다음 중 하나 포함
이보다 작습니다. 왜냐하면 일부 위치의 우연한 위치에서 동일한 크기의 단편이 생성되기 때문입니다. 이
HaeII 사이트는 0/12.0kb 위치에 임의로 배치되었습니다.
러한 조건에서 전기 영동 후 젤의 동일한 위치로 이동하는 동일한 길이의 두 개의 서로 다른 단편은 종
종 한 종류의 단편만 사용하는 밴드보다 더 심하게 염색됩니다. ‑ment. 염색 강도의 이러한 차이는 제 다른 매핑된 제한 엔도뉴클레아제 사이트가 표시되어 있습니
한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 우연한 단편이 생성되었음을 나타냅니다. 일반적으로 컴퓨터 프로그램 다. 해당 사이트의 뉴클레오티드 위치는 괄호 안에 있습니다.

은 단일 및 다중 소화가 많은 대형 DNA 분자에 대한 제한 엔도뉴클레아제 지도를 구성하는 데 사용됩

니다. 또한 매우 큰 DNA 분자의 경우 특수 전기 영동 시스템을 사용하여 다수의 제한 엔도뉴클레아제 플래그 II
분해 산물을 분리합니다. 밤HI (11.5) (0/12.0)
EcoRI (1.0)

플래그 II
(10.0)

12.0kb
제한 엔도뉴클레아제 매핑을 위한 단편의 분해능은 일반적으로 5' 말단의 DNA 조각을 방사성 화
합물이나 형광 염료로 라벨링하고 전기영동 분리 후 각각 방사능촬영 또는 형광촬영으로 길이를 결정함
으로써 향상될 수 있습니다. 일반적인 5'‑말단 라벨링 절차는 선형 DNA 분자의 5'말단을 송아지 장과
HindIII
알칼리성으로 탈인산화하는 것을 수반합니다.
(7.5)
플래그 II
(6.0)
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56 장 3

포스파타제 및 아데노신 삼인산(ATP)에서 5'' OH' 말단으로 방사성 표지된 γ‑인산염을 첨가하면 T4' 폴
리뉴클레오티드' 키나아제가 생성됩니다.
표지된 DNA 단편은 겔 전기영동 전에 컬럼 크로마토그래피에 의해 통합되지 않은 표지로부터 분리됩니다.
괄호와 같이, 재조합 DNA 기술에는 다양한 효소를 포함하는 다양한 효소가 필요합니다.

활동. 이들 중 일부는 표 3.4에 나열되어 있습니다.

제한 엔도뉴클레아제 절단은 표적 DNA를 클로닝 벡터에 삽입하기 위한 분자 클로닝에서 중요합니
다. 두 개의 서로 다른 DNA 샘플이 엇갈린 절단, 즉 동일한 5' 또는 3' 확장 또는 끈끈한 말단을 생성하는
동일한 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 후 혼합되는 경우

함께, 확장(오버행) 영역 사이의 염기쌍 결합의 결과로 새로운 DNA 조합이 형성될 수 있습니다(그림 3.7).
그러나 제한 사항은 다음과 같습니다.
효소만으로는 분자 복제에 충분하지 않습니다. 첫째, 제한효소(예: BamHI)에 의해 생성된 확장말단이 절
단될 때
정렬되어 있으면 쌍을 이루는 4개 염기의 수소 결합이 두 개의 DNA 분자를 함께 유지할 만큼 강하지 않습
니다. A는 재형성을 의미합니다.
두 개의 깨진 결합 부위(닉)에 있는 백본의 3' 하이드록실 그룹과 5' 인산염 그룹 사이의 뉴클레오티드간 연
결이 필요합니다.
문제는 일반적으로 박테리오파지 T4의 DNA 리가제 효소를 사용하여 해결됩니다. 이 효소는 두 개의 확
장된 염기쌍에 의해 이미 결합되어 있는 DNA 가닥의 끝에서 포스포디에스테르 결합의 형성을 촉매합니다.
DNA 리가아제는 또한 둘 다 효소에 결합할 때 접촉하는 무딘 말단을 연결합니다(그림 3.8). DNA 결찰을
위한 반응 조건은 DNA 분자가 연장된 말단을 가지고 있는지, 아니면 무딘 말단을 가지고 있는지에 따라
달라집니다. 돌출된 말단의 경우 확장된 부분이 염기쌍을 유지하도록 하기 위해 반응이 장기간 낮은 온도
에서 수행되는 경우가 많습니다. 무딘 말단 결찰에는 T4·DNA 리가제가 10~100배 이상 필요합니다.

표 3.4 재조합 DNA 기술에 사용되는 일부 효소

효소 활동
알칼리포스파타제 DNA 분자의 5′ 인산염 그룹을 제거하며, 세균 알칼리 포스파타제가 더욱 안정적입니다.
그러나 송아지 장의 알칼리성 포스파타제보다 활성이 적습니다.
DNase I 내부 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 이중 가닥 DNA를 분해합니다.
E. coli 엑소뉴클레아제 III 돌출된 부분을 제외하고 DNA 분자의 3' OH 말단에서 뉴클레오티드를 순차적으로 제거합니다.
3' OH 용어
Klenow 조각 중합효소 와 3' 엑소뉴클레아제 활성을 모두 가지며 5' 엑소뉴클레아제 활성은 없는 E. coli DNA 중합효소 I의 단백질 분해 산
물(소화 산물의 분획으로 5' 엑소뉴클레아제 활성이 있는 단편이 제거됨) ; 3'엑소뉴클레아제 서열의 돌연변이로 인해
DNA 중합효소 활성만 있는 Klenow 단편도 사용 가능

녹두뉴클레아제 단일 가닥 DNA 및 RNA 엔도뉴클레아제

뉴클레아제 BAL 31 내부 절단 없이 DNA의 3' 및 5' 말단을 모두 분해합니다.
폴리(A) 중합효소 mRNA의 3' 말단에 ATP의 AMP를 추가합니다.
역전사 효소 레트로바이러스 RNA 지향 DNA 폴리머라제
RNase H DNA‑RNA 하이브리드 분자의 RNA 가닥을 분해합니다.
S1 뉴클레아제 단일 가닥 DNA를 분해합니다.
T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 뉴클레오시드 5' 삼인산에서 말단(γ) 인산염이 5' 삼인산으로 이동하는 것을 촉매합니다.
폴리뉴클레오티드의 수산기
T4 DNA 중합효소 DNA 중합효소와 3' 엑소뉴클레아제 활성
T7·DNA·중합효소 DNA 중합효소와 3' 엑소뉴클레아제 활성
Taq DNA 폴리머라제 β‑ Thermus aquaticus 의 열안정성 DNA 중합효소
아가라제 I 아가로스를 소화합니다. 아가로스 젤에서 분리된 DNA 분자를 회수하는 데 사용됩니다.
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재조합 DNA 기술 57

BamHI인식사이트 BamHI인식사이트

GTTT G GAT CC TTGAC C AT TG G AT C TC CSSIW

T ACAA 씨 티AC TG ㅏ
C AGG 가텍 티ㅏ
C GG AC CGG 티

쪼개다 쪼개다

오 피 오 피
GTTT G 가트 CC TTGAC C AT TG G AT CC 태그AGGC 씨
T ACAA 씨티
CAG ㅏIT
G앤 갓과 CG티 ㅏ ㅏ
GTCCG G
피 에게 피 에게

어닐링 혼합 및 어닐링

건강 상태 건강 상태

오피 오피

GTTT G GAT CC TTGAC C AT TG 가트 CC TTGAC

T ACAA 씨 티AC TG ㅏ
C AGG 티 TG
GAT AC C AGGAAC

피 오 피 오
건강 상태 건강 상태

그림 3.7 유형 II 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 엇갈린 절단 후 상보적인 확장을 어닐링합니다.

두 개의 서로 다른 DNA 단편이 다음으로 절단됩니다.
제한 엔도뉴클레아제 BamHI, 혼합 및 어닐링. 어닐링된 DNA의 가능한 조합이 모두 표시되지는
않습니다. BamHI 소화에 의해 생성된 4개의 단편은 서로 결합하여 6개의 서로 다른 DNA 중 하나
를 형성할 수 있습니다.
분자입니다. 이중 DNA의 한 가닥에 있는 포스포디에스테르 결합이 끊어지는 것은 다음과 같습니다.
닉이라고 불립니다. 반대쪽에 있는 닉 사이의 4개 염기쌍의 수소 결합
가닥은 용액에서 오랜 기간 동안 DNA 분자를 함께 붙잡을 만큼 강하지 않습니다. A, C, G 및 T는
뉴클레오티드를 나타냅니다.

확장된 DNA 분자의 결찰을 수행하는 것보다 안정적인 염기쌍 연결이 필요하지 않기 때
문에 실온에서 수행됩니다.
둘째, 새로운 DNA 조합(즉, 재조합 DNA)이 숙주 세포에서 영속될 수 없다면, 서로
다른 DNA 분자를 연결하는 능력 자체는 유용하지 않습니다. 따라서 결찰된 구조물에
는 세포 유지를 위한 생물학적 정보가 포함되어야 합니다. 이 요구 사항은 일반적으로 제
공됩니다.
이 문제를 극복하기 위해 개발된 클로닝 벡터에 대한 연구입니다.
셋째, 관심 유전자가 포함된 원본 DNA를 제한효소로 분해하면 DNA 분자의 혼합
물이 생성되고 클로닝 벡터와 연결한 후 여러 가지 다른 DNA 구조가 형성됩니다. DNA
를 식별하는 방법으로

표적 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포에서의 조합.스크리닝

특정 클로닝 벡터‑DNA 삽입 구조물을 운반하는 숙주 세포를 검출하기 위한 절차가 고안
되었습니다.

플라스미드 클로닝 벡터
플라스미드는 박테리아 내에서 독립적인 염색체외 개체로 유지되는 자가 복제 이중 가닥
원형 DNA 분자입니다.

. 3.07
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58 장 3

ㅏ 비
건강 상태
오 피
오피
TTG AC GTACTG 너에게 깃 달기
GTTT G GAT CC TTGAC
ACAT G ㅏ티
CGCACTAT 티 ㅏ
T ACAA 씨 티AC TG ㅏ
C AGG
피 오
피 오
건강 상태

T4 DNA
T4 DNA
리가제
리가제

아– 영형 그리고 –

피 포스포디에스테르 피 포스포디에스테르
노예 노예
OO OO

GTTT G GAT CC TTGAC TTG AC GT AC TG 너에게 깃 달기

T ACAA 씨 티AC TG ㅏ
C AGG ACAT G ㅏ티
CGCACTAT 티 ㅏ

OO OO
포스포디에스테르 포스포디에스테르
피 노예 피 노예

오–오 ‑영형 영형

그림 3.8 T4 DNA 리가제의 작용 방식. T4 DNA 리가제 효소는 다음을 형성합니다.

5' 인산염과 3' 수산기 그룹을 결합하여 인산디에스테르 결합을 합니다.
이중 가닥 DNA의 백본.(A)끈끈한 말단 DNA의 결찰;(B)무딘 말단 DNA의 결찰. A, C, G 및 T는 뉴클레오티드를 나타냅니
다.

사실상 모든 박테리아 속은 천연 플라스미드를 가지고 있습니다. 일부 플라스미드는 한

세포에서 다른 세포로의 자체 전달에 대한 정보를 담고 있고(예: F 플라스미드), 다른 플
라스미드는 항생제에 대한 내성을 암호화하고(R 플라스미드), 다른 플라스미드는 특이한
대사산물(분해성 플라스미드)을 활용하기 위한 특정 유전자 세트를 가지고 있습니다. 일
부에는 뚜렷한 기능적 코딩 유전자(비밀 플라스미드)가 없습니다. 플라스미드는 일반적
으로 실험실 조건에서 박테리아 세포 생존에 필수적이지는 않지만 종종 특정 조건에서 유
리한 유전자를 운반합니다. 플라스미드는 크기가 1kb 미만부터 500kb 이상까지 다양
합니다. 각 플라스미드는 다음과 같이 기능하는 서열을 가지고 있습니다.

DNA 복제의 기원; 이 사이트가 없으면 호스트 셀에서 복제할 수 없습니다.

일부 플라스미드는 숙주 세포당 10~100개의 복사본으로 표시됩니다. 이것을 고복

사수 플라스미드라고 합니다. 다른 것들은 세포당 1~4개의 복사본을 유지하며 낮은 복
사본 수 플라스미드라고 합니다. 박테리아 내 플라스미드 개체수가 대략 0.1~0.1개 이상
으로 구성되는 경우는 거의 없습니다.
전체 DNA의 5.0%. 두 개 이상의 서로 다른 플라스미드가 동일한 숙주 세포에 공존할
수 없는 경우 동일한 비호환성 그룹에 속한다고 말하지만, 서로 다른 비호환성 그룹의 플
라스미드는 동일한 세포에서 함께 유지될 수 있습니다. 이러한 공존은 개별 플라스미드
의 사본 수와 무관합니다. 일부 미생물은 8개에서 10개까지 다양한 플라스미드를 함유하
고 있는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 경우에는

각 플라스미드는 서로 다른 기능을 수행할 수 있으며 고유한 기능을 가지고 있습니다.

사본 번호이며 각각은 다른 비호환성 그룹에 속합니다. 일부 플라스미드는 복제 기원의
특이성으로 인해 한 종의 숙주 세포에서만 복제할 수 있습니다. 다른 플라스미드는 덜 구
체적인 오리엔테이션을 가지고 있습니다.
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재조합 DNA 기술 59

복제 진은 수많은 박테리아 종에서 복제될 수 있습니다. 이러한 플라스미드는 각각 좁은 숙주

범위 플라스미드와 넓은 숙주 범위 플라스미드라고 불립니다.
자율적이고 자가 복제되는 유전 요소인 플라스미드는 복제된 DNA를 운반하기 위한 잠
재적인 벡터를 만드는 기본 속성을 가지고 있습니다.
그러나 자연적으로 발생하는(변형되지 않거나 조작되지 않은) 플라스미드는 고품질을 위해 필
요한 몇 가지 중요한 기능이 부족한 경우가 많습니다.
복제 벡터. 더 중요한 기능은 (1) 고유한 옵션을 선택하는 것입니다.
삽입 DNA가 복제될 수 있는 (단일) 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 및 (2) iden‑tifying 수
용자 세포를 위한 하나 이상의 선택 가능한 유전적 마커 복제 벡터‑삽입 DNA 구조물.

즉, 플라스미드 클로닝 벡터는 유전적으로 조작되어야 합니다.

플라스미드 클로닝 벡터 pBR322

1980년대에 가장 잘 연구되고 가장 자주 사용되는 "일반 목적" 플라스미드 클로닝 벡터 중
하나는 pBR322였습니다. 일반적으로 플라스미드는 복제
벡터는 플라스미드를 나타내는 소문자 p와 설명적이거나 pBR322의 경우처럼 일화적인 일부
약어로 지정됩니다.pBR322의 "BR"은 다음의 작업을 인식합니다. 연구원들F.

플라스미드를 만든 Bolivar와 R. Rodriguez, 그리고 322는 이러한 작업자와 관련이 있는

숫자 지정입니다. 플라스미드 pBR322에는 다음이 포함되어 있습니다.
4,361 bp. 그림 3.9에 표시된 것처럼 pBR322는 두 가지 항생제 내성을 가지고 있습니다.
유전자. 하나는 암피실린(Ampr )에 대한 저항성을 부여하고, 다른 하나는 테트라사이클린(Tetr )
에 대한 저항성을 부여합니다. 이 플라스미드는 또한 독특한 BamHI를 가지고 있습니다.
Tetr 유전자 내의 HindIII 및 SalI 인식 부위 ;
Ampr 유전자, 어떤 코딩 DNA에도 속하지 않는 독특한 EcoRI 사이트, 그리고

중요한 단계

RI 제한 엔도뉴클레아제에 의한 DNA 절단으로 응집성 말단 생 샘플을 DNA 리가제로 처리하여 완만하게 닫힌 원형

성 DNA 분자를 분리합니다. 절단된 모든 DNA 분자
JE MERTZ 및 RW 데이비스 의 확장은 동일했으며 4~6개의 뉴클레오티드로 추정
진행 Natl. Acad. 알다 미국 69:3370–3374, 1972 되었습니다.

길고, 인식 부위는 6개의 뉴클레오티드 쌍입니다.

재조합 DNA 기술 원 (자연 217:1110–1114)표시 Mertz 및 Davis
아르 자형전달하려면 벡터가 필요합니다. E. coli 균주의 능력 "RI 사이트가 있는 두 개의 DNA 분자는 모
복제된 DNA, 특정 박테리아 바이러스(박테리오파지)의 발생을 방지(제 두 '재결합'될 수 있다는 결론을 내렸습니다.
벡터 결합 및 클로닝(삽입) 한)하는 것은 감염성 박테리오파지의 DNA를 절단 RI 엔도뉴클레아제의 연속적인 작용에 의해 자신의 제
벡터를 형성하는 DNA 분자 – 하는 숙주 세포 효소 때문이었습니다.Mertz가 수 한 부위에서
삽입 DNA 구조, 벡터 삽입 DNA 구조의 도입 행한 연구 하이브리드 DNA 분자를 생성하는 DNA 리가아
제.”EcoRI의 발견
숙주 세포에 삽입하고 복제된 숙주 세포를 식별합니 그리고 데이비스는 RI를 설립했습니다. Mertz와 Davis에 따르면, 응집력 있는 말단을 생성
다. E. coli 로부터의 제한 엔도뉴클레아제 , 하는 것은 재조합 DNA 기술 개발에 가장 중요한 기
DNA.유형 II 제한 없음 현재는 EcoRI, Cut DNA라고 불립니다. 여 중 하나였습니다.
엔도뉴클레아제가 없다면 재조합 DNA 기술을 일상적 특정 사이트에서 보완적인 확장을 생성했습니다.
으로 수행하는 것은 불가능할 것입니다. 이들 효소 간단히 말해서, 그들은 원형 DNA가 EcoRI 처리에
는 벡터의 발달을 촉진합니다(예: Bolivar et al., 의해 선형화 된 후,
"간단한 방법⋯구체적으로 생성하는 방법"
Gene 2:95–113, 1977 참조). 시험관 내에서 지향성 재조합 DNA 분자.”
분자 중 일부는 수소 결합된 원형 DNA 분
유전자를 벡터로 클로닝하는 데 필수적입니 자를 형성했고, 이는 공 증기로 전환되었습니다.
다. 1968년에는 M. Meselson과 R.
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60 장 3

ㅏ E. coli 에서만 기능하는 DNA 복제 기점은 E. coli 에서 높은 복제수로 유지되며 다른 박테

에코RI
HindIII 리아로 쉽게 전달될 수 없습니다.
밤HI
앰프
pBR322는 클로닝 벡터로서 어떻게 작동합니까? 정제되고 폐쇄된 원형
테트라
유전자 pBR322 분자는 항생제 내성 유전자 중 하나에 있는 제한 효소로 절단되고 플라스미드
유전자
DNA를 한 번만 절단하여 단일 선형의 끈적끈적 말단 DNA 분자를 생성합니다. 소스 유기체
PstI pBR322 살이 로부터 준비된 표적 DNA와 결합됩니다.

이 DNA는 동일한 제한 효소로 절단되어 플라스미드 DNA의 것과 동일한 끈적끈적한 말단

을 생성합니다. DNA 혼합물은 다음과 같습니다.
그런 다음 ATP가 있는 상태에서 T4 DNA 리가제로 처리합니다. 이러한 조건 하에서 원래
복제 원본 의 폐쇄 원형 플라스미드 DNA를 포함하여 다양한 결찰 조합이 생성됩니다. 이 특정 원치 않
는 결찰 생성물의 양을 줄이기 위해 절단된 플라스미드 DNA 준비물을 알칼리성 포스파타
제 효소로 처리하여 5'를 제거합니다.
비

선형화된 플라스미드 DNA로부터 인산염 그룹이 생성됩니다. 결과적으로, T4

DNA 리가아제는 탈인산화된 선형 플라스미드 DNA의 말단을 연결할 수 없습니다(그림
3.10). 그러나, 인산염을 제공하는 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 소스 DNA를 사용하여
알칼리성 포스파타제 처리된 플라스미드 DNA의 결찰 및 원형화 후에 T4 DNA 리가제에
의해 형성되는 두 개의 포스포디에스테르 결합 그룹은 두 개의 닉이 존재함에도 불구하고 두
개의 분자를 함께 유지하기에 충분합니다(그림 3.10).

형질전환 후, 이러한 틈은 숙주 세포 DNA 리가아제에 의해 밀봉됩니다.

그림 3.9 플라스미드 pBR322. (A) 플라스미드 클로닝
벡터 pBR322의 유전 지도. ° Unique HindIII, ° SalI,
° BamHI, °
그리고 PstI 인식 사이트가 다음 위치에 있습니다.
Ampr 및 Tetr 유전자. 독특한
EcoRI 사이트는 Tetr 유전자 바로 바깥에 있습니다 .
복제 기점은 박테리아 E. coli에서 기능합니다. pBR322
의 전체 DNA 서열은 다음으로 구성됩니다.
4,361 bp. (B) 플라스미드 pBR322. 배율,
의 전자현미경 사진
×100,000.출처: K. G. Murti. © Visuals
제한 없는.
체계. 소스 DNA의 소화된 단편도 T4 DNA 리가제에 의해 서로 연결됩니다. 그러나 이러한
원치 않는 결찰 생성물은 복제 기점을 포함하지 않으므로 숙주 세포에 도입된 후 복제되지
않습니다.
변환 및 선택
재조합 DNA 실험의 다음 단계에서는 DNA의 흡수가 필요합니다.
박테리아 세포, 일반적으로 E. coli에 의해 복제된 플라스미드 DNA. 정제된 DNA를 박테리
아 세포에 도입하는 과정을 형질전환이라고 하며, DNA를 흡수할 수 있는 세포를 유능한 세
포라고 합니다. 역량
많은 박테리아에서 자연적으로 발생합니다. 다른 박테리아 종에서는 일반적으로
세포 밀도가 높거나 기아가 임박하면 DNA 분자의 흡수를 촉진하는 단백질 세트가 생성됩니
다.
다른 박테리아 사이에 유전자가 전달될 수 있도록 합니다. 자연적인 변형 과정은 종종 (1)
이중 가닥 DNA가 세포벽 구성 요소에 결합하는 것; (2) DNA가 핵산을 분해하는 효소(뉴
클레아제)로부터 보호되는 내부 구획(주변세포질)으로 유입됩니다. (3) 한 가닥이 세포질로
전달되는 동안 다른 가닥은 분해됩니다. (4) DNA가 선형 분자인 경우 숙주 염색체에 통합됩
니다. 도입된 DNA가 플라스미드인 경우 두 번째 이후에는 세포질에 유지됩니다. 가닥이 합
성됩니다. 역량과 변화는 E. coli 의 본질적인 특성이 아닙니다 . 그러나 차가운 염화칼슘과
같은 다양한 특수 처리를 통해 대장균에서 능력이 유도될 수 있으며, 이는 결과적으로 세포
의 DNA 획득을 향상 시킵니다 .

짧은 열 충격은 외인성 DNA 분자의 흡수를 촉진합니다.

두 가지 매개변수인 변환 빈도와 변환 효율성이 DNA 변환의 성공 여부를 평가하는 데
사용됩니다. 형질전환 빈도는 형질전환된 세포의 총 수에 대한 비율입니다.
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재조합 DNA 기술 61

플라스미드 DNA 표적 DNA

제한 엔도뉴클레아제 제한 엔도뉴클레아제
분열 분열

알칼리포스파타제
치료

에게 오 피 오

에게 오 에게 피

T4 DNA 리가아제

영형

‑영형 포스포디에스테르
피 노예

OO

오
건강 상태
오

영형

영형‑

OO
오에게 포스포디에스테르
노예
건강 상태

변환

숙주 세포

그림 3.10 플라스미드 벡터에 외래 DNA 클로닝. 제한 엔도뉴‑절단 절단 및 알칼리성 포스파타

제 처리 후 플라스미드 DNA가 결찰됩니다.
제한 엔도뉴클레아제로 소화된 표적 DNA, 그리고 네 개의 닉 중 두 개는 다음과 같습니다.
봉인. 이 분자 구성은 안정적이며 두 DNA 분자가 공유 결합되어 있습니다. 숙주 세포에 도입된
후 이어지는 복제 주기는 흠집 없이 새로운 완전한 원형 DNA 분자를 생성합니다.

처리된 세포. 형질전환 효율은 원래 세포에 첨가된 DNA 양의 함수로서 형질전환된 세포

의 수입니다. 일반적으로 형질전환은 비효율적인 과정으로, 일반적으로 1,000개 중 1개
이하의 세포가 형질전환됩니다. 형질전환 후, 대부분의 세포는 새로운 플라스미드를 획득
하지 못했습니다. 더욱이, 소수의 세포는 탈인산화를 탈출한 재순환 플라스미드 DNA
에 의해 형질전환됩니다.
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62 장 3

알칼리성 인산분해효소, 다른 것들은 결찰된 것과 결찰되지 않은 비플라스미드를 획득합니다

DNA, 그리고 일부는 플라스미드 삽입 DNA 구조에 의해 변형됩니다.
앞서 언급한 바와 같이, 복제 기원이 결여된 염색체외 DNA는 박테리아 세포 내에서 유
지될 수 없습니다. 따라서,
비플라스미드 DNA는 일반적으로 재조합 DNA에서 아무런 결과가 없습니다.
실험. 플라스미드 복제된 DNA 구조가 원래 형태로 영속되도록 하려면 E. coli 숙주 세포에
특정 특징이 있어야 합니다.
예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제가 없으면 DNA 구조가 변형 후 분해되지 않도록 보장됩니
다. 또한 DNA 구조의 무결성은 다음과 같은 가능성이 더 높습니다. 숙주 세포에서 유지됩니
다.
숙주 세포가 재조합 음성(RecA‑)이기 때문에 DNA 분자 사이의 교환을 수행할 수 없습니다 .
또한 endA1 유전자 에 의해 암호화된 엔도뉴클레아제를 생산하지 않는 세포는 형질전환 빈
도가 증가합니다.

형질전환 단계 후에는 클로닝된 DNA와 함께 플라스미드를 포함하는 세포를 가능한 한

쉽게 식별하는 것이 필요합니다.
BamHI 사이트에 타겟 DNA가 삽입된 시스템입니다.
특정 식별은 플라스미드에 운반되는 두 개의 항생제 내성 마커를 사용하여 수행됩니다. 변환
후,
세포를 항생제가 없는 배지에서 배양하여 항생제 내성 유전자가 발현되도록 한 다음, 형질전
환 혼합물을 항생제 암피실린이 포함된 배지에 플레이팅합니다. 삽입 DNA가 있거나 없는
pBR322를 운반하는 세포는 pBR322의 Ampr 유전자가 손상되지 않기 때문에 이러한 조
건에서 자랄 수 있습니다. 형질전환되지 않은 세포는 암피실린에 민감합니다.

pBR322의 BamHI 사이트는 Tetr 유전자 내에 있으므로(그림 3.9), 이 유전자에

DNA를 삽입하면 코딩 서열이 중단되고 테트라사이클린
저항이 손실됩니다. 따라서 이러한 플라스미드 복제 DNA 구조를 가진 세포는 암피실린에
내성이 있고 테트라사이클린에 민감합니다. 그러나 재순환된 pBR322 DNA를 가진 세포는
온전한 Tetr 유전자를 가지며 암피실린과 테트라사이클린 모두에 내성을 갖습니다. 선택 계
획의 두 번째 단계에서는 이 두 가지 가능성을 구별합니다. 암피실린 함유 배지에서 성장한
세포는 테트라사이클린 함유 배지로 옮겨집니다. 테트라사이클린‑한천 플레이트로 옮겨진 세
포의 상대적 위치는 원래 암피실린‑한천 플레이트로 옮겨진 콜로니의 상대적 위치와 동일합
니다. 테트라사이클린‑한천 플레이트에서 콜로니를 형성하는 세포는 삽입 DNA 없이 재순환
된 pBR322를 가지고 있는데, 이는 위에서 언급한 바와 같이 이들 세포가 암피실린과 테트라
사이클린 모두에 내성이기 때문입니다. 그러나 테트라사이클린‑한천 플레이트에서 자라지
않는 세포는 테트라사이클린에 민감하고 pBR322‑클로닝된 DNA 구조물을 운반합니다(그
림 3.11).

테트라사이클린에 민감한 개별 배양이 확립됩니다.

암피실린‑한천 플레이트의 각 콜로니에서. 나중에, 형질전환체라고 불리는 이들 세포가 원하
는 pBR322 클로닝된 DNA 구조를 가지고 있는지 확인하기 위해 추가적인 스크리닝 절차
를 수행할 수 있습니다. 테트라사이클린 저항성 유전자의 HindIII 및 SalI 사이트와 PstI 사
이트
pBR322의 암피실린 저항성 유전자는 대체 가능한 클로닝 위치를 제공합니다. PstI 인식 사
이트가 클로닝에 사용될 때,
선택 계획의 원리는 동일하지만 항생제 민감도가 반대입니다. 따라서 첫 번째 플레이트 세트
에는 테트라사이클린이 포함되어 있고 두 번째 세트에는 암피실린이 포함되어 있습니다.

삽입된 DNA‑벡터 구조로 형질전환된 세포를 식별하기 위한 pBR322 선택 계획은 복제

플레이팅에 의존합니다. 이 기술은
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재조합 DNA 기술 63

다양한 목적을 위해 다양한 방식으로 사용될 수 있는 이 방법은 원래 성장을 위해 보충제

가 필요한 돌연변이 박테리아 콜로니, 즉 영양요구성 돌연변이를 분리하기 위해 고안되었
습니다(그림 3.12).

기타 플라스미드 클로닝 벡터
플라스미드 pBR322는 잘 고안된 클로닝 벡터였습니다. 그러나 고유한 복제 사이트가 거
의 없으며 선택 절차에 시간이 많이 걸립니다. 따라서 필연적으로 다른 시스템이 개발되었
습니다. 예를 들어,

그림 3.11 pBR322로 형질전환된 숙주 세포를 선택하기 위한 전략.

(1) 형질전환되지 않은 세포, 원래의 플라스미드가 온전한 세포, pBR322의 BamHI 사이트에 클로닝
된 DNA가 있는 세포 등 세 가지 세포 유형을 포함하는 형질전환 혼합물을 플레이팅합니다. 암피실린
이 포함된 완전한 배지. (2) The
한천에 별도의 콜로니가 형성되도록 혼합물을 미리 희석합니다.
형질전환되지 않은 세포(Amps )는 죽습니다. 온전한 플라스미드를 가진 세포와
복제된 DNA‑플라스미드 구조물은 Ampr 이므로 콜로니를 형성합니다. 암피실린 플레이트에서 살아남
은 콜로니의 샘플을 완전한 배지와 테트라사이클린이 있는 플레이트로 옮겨서 각 콜로니의 동일한 위
치를 유지합니다.
두 번째 판, 즉 복제 도금. 손상되지 않은 플라스미드(Tetr )를 가진 세포만이 테트라사이클린이 있는
경우 콜로니를 형성합니다. (3) 테트라사이클린 플레이트에서 자라지 않았지만(점선 원) 암피실린 플레
이트에서 자란 콜로니는 BamHI 사이트에 클로닝된 DNA가 포함된 pBR322를 가지고 있습니다. 복
제된 DNA
인서트는 원본 플레이트에서 선택되어 모아지고 성장됩니다. 빨간색 사각형 표현은 마스터와 복제본
을 유지하는 방향 마커를 나타냅니다. 플레이트가 정렬되었습니다.

플라스미드 없음 온전한 플라스미드 복제된 플라스미드

앰프 테츠 앰프 테트르 앰프 테츠

1 암피실린이 포함된 완전
배지에 플레이트

Ampr 셀만
생존하고 성장하다

2 복제판 켜짐 삼
선택하고, 모으고, 성장하세요
완전한 매체 Ampr Tets 의 세포
테트라사이클린과 함께 식민지

Tetr 셀만 pBR322가 복제된 세포

생존하고 성장하다 DNA 삽입물
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64 장 3

ㅏ
방향 마커 핸들

디스크

벨베틴

1 2

4 5

그림 3.12 복제 도금을 통해 돌연변이 균주에 대한 박테리아 콜로니를 스크리닝합니다. (ㅏ)

복제도금(콜로니이전) 장치; (B)→복제 도금→기술.→세포→에서→
마스터 플레이트(1)에서 분리된 각 콜로니를 한천 표면(2)에 부드럽게 누른 후 복제 도금 장치의 벨벳에 부착합니다. 부착된
세포는 연속적으로 완전 배지가 있는 페트리 플레이트(4)와 선택 배지가 있는 페트리 플레이트(5)로 옮겨집니다(3). 집락의 패
턴은 복제된 플레이트 사이에서 일관됩니다. 왜냐하면 방향 표시(빨간색 사각형)가 다음과 같기 때문입니다.

각 전송에 맞게 정렬됩니다. 이 예에서는 최소 매체가 선택적 매체입니다.

성장을 위해 영양 보충제가 필요한 군집, 즉 보조 영양 돌연변이체를 식별하는 데 사용됩니다. 최소 배지(5)에서 누락된 콜로
니(점선 원)는 영양요구 돌연변이를 나타냅니다. 전체 배지(4)와 플레이트의 동등한 위치는 다음과 같습니다. 선택할 수 있는
영양요구성 돌연변이가 있는 군체

그리고 성장한(6). 분리된 균주에 대한 추가 분석이 필요합니다.

영양요구성 돌연변이의 본질.

플라스미드 pUC19는 길이가 2,686bp이고 Ampr 유전자를 함유하고 있습니다. 조절 가

능한 lac 프로모터의 제어를 받는 E. coli 의 락토스 오페론의 β‑갈락토시다제 유전자
(lacZ') 세그먼트 ; lac 촉진자 로부터 lacZ' 유전자 의 발현을 조절하는 억제 단백질을 생
성하는 lacI 유전자 ; 많은 독특한 복제 부위를 가진 짧은 DNA 서열(예: EcoRI,

SacI, KpnI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI,
및 HindIII), 다중 복제 사이트라고 함
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재조합 DNA 기술 65

서열, 다중 클로닝 부위, 또는 폴리링커), 그리고 pBR322로부터의 DNA 복제의 기원(그

림 3.13).
pUC19 선택 절차에는 다음과 같은 이론적 근거가 있습니다. 변형되지 않은 pUC19
를 운반하는 세포 가 lac 오페론의 유도제인 isoprop‑β‑D‑thiogalactopyranoside(IPTG)
존재 하에서 성장할 때 , lacI 유전자 의 단백질 생성물은 더 이상 결합할 수 없습니다. lacZ'
유전자 의 프로모터‑작동자 영역에 위치 하므로 플라스미드의 lacZ' 유전자가 전사되고 번
역됩니다. LacZ' 단백질은 염색체 DNA에 의해 암호화된 단백질(LacZα)과 결합하여 활성
하이브리드 β‑갈락토시다제를 형성합니다.

pUC19에서 다중 클로닝 부위 는 기능성 하이브리드 β‑galactosidase의 생산을 방해하

지 않고 플라스미드의 lacZ' 유전자에 통합됩니다 . 마지막으로, 기질 5‑브로모‑4‑클로로‑3‑
인돌릴‑β‑D‑갈 락토피라노시드(X‑Gal)가 배지에 존재하는 경우, 이는 이 하이브리드 β‑갈
락토시다아제에 의해 파란색 생성물로 가수분해됩니다. 이러한 조건에서 변형되지 않은
pUC19를 포함하는 콜로니는 파란색으로 나타납니다.

pUC19 클로닝 실험의 경우, 소스 유기체의 DNA는 다중 클로닝 부위에 인식 부위가

있는 제한 엔도뉴클레아제 중 하나로 절단됩니다(그림 3.14). 이 소스 DNA는 동일한 제한
엔도뉴클레아제로 처리한 다음 알칼리성 포스파타제로 처리한 pUC19 플라스미드 DNA와
혼합됩니다. T4 DNA로 연결한 후

리가제, 반응 혼합물은 기능성 효소를 형성하기 위해 lacZ' 유전자의 생성물과 결합하는 β‑

갈락토시다제(LacZα)의 일부를 합성할 수 있는 숙주 세포로의 형질전환에 의해 도입됩니
다. 처리된 숙주 세포는 암피실린, IPTG 및 를 포함하는 배지에 도말됩니다.

엑스갈.
형질전환되지 않은 세포는 암피실린이 있는 경우 성장할 수 없습니다. 재순환된 플라스
미드가 있는 세포는 배지에서 암피실린과 함께 성장할 수 있으며 기능적인 β‑갈락토시다제
를 형성할 수 있기 때문에 파란색 콜로니를 생성합니다. 대조적으로 플라스미드 복제 DNA
를 운반하는 숙주 세포는 구성
동일한 배지에서 흰색 집락을 생성합니다. 그 이유는 일반적으로 다중 클로닝 부위 내의 제
한 엔도뉴클레아제 부위에 삽입된 DNA가 DNA 코돈의 올바른 서열을 파괴하기 때문입니
다.
프레임) lacZ' 유전자의 기능적 LacZ' 생성을 방지합니다.
단백질이므로 활성 하이브리드 β‑갈락토시다아제가 생성되지 않습니다(그림 3.14).

그림 3.13 플라스미드 클로닝 벡터 pUC19의 유전자 지도. 다중 복제 사이트에는 다음을 위해 사용

되는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 고유한 사이트가 포함되어 있습니다.
복제된 DNA 삽입. 플라스미드는 대장균 에서 기능하는 복제 기점인 Ampr 유전자 와 부재 시 lacZ'
유전자의 전사를 차단하는 억제인자를 생성하는 lacI 유전자를 포함합니다. IPTG의 유도자입니다.

pUC19의 완전한 DNA 서열은 2,686bp 길이입니다.

lacZ ' 유전자

앰프 다중 복제 시퀀스
유전자
pUC19
lacI 유전자

복제 원본
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66 장 3

돈 AvaI
Ecl136II 크리스마스 Sbf I
바지 작은 ikB PstI HindIII

agtgaattCGAGCTCGGTACCG GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaat catggt 고양이

에코RI KpnI 밤HI 살이 SpI
그 다음에 Acc65I HincII
AccI

BspMI
...AlaLeuSerAsnSerSerProValArgProAspGluLeuThrSerArgCysAlaHisLeuSerProThrIleMetThr
26 1

그림 3.14 플라스미드 pUC19 다중 클로닝 사이트. 다중 클로닝 부위(대문자 뉴클레오티드)가

lacZ' 유전자(소문자 뉴클레오티드)에 삽입됩니다. 다중 복제 사이트의 고유한 제한 엔도뉴클레아
제 사이트 중 일부는 다음과 같이 명명되었습니다.
수평선으로 구분됩니다. 이중 화살표는 lacZ'를 표시합니다. 하이브리드 의 첫 번째 26아미노산을
암호화하는 다중 복제 부위 DNA 서열입니다. LacZ' 단백질.
다중 복제 부위의 고유한 제한 엔도뉴클레아제 부위 중 하나에 DNA를 삽입하면 lacZ' 유전자의
판독 프레임이 변경되고 LacZ의 올바른 번역이 방지됩니다 . ' 단백질.

β‑갈락토시다제 활성이 없으면 배지의 X‑Gal이 파란색 화합물로 전환되지 않으므로 이러

한 콜로니는 흰색으로 유지됩니다. 이후 흰색(양성) 집락을 선별하여 다음과 같은 것을 식별
해야 합니다.
특정 표적 DNA 서열을 가지고 있습니다.
암피실린과 테트라사이클린 외에 다른 항생제도 다음과 같이 사용됩니다.
다양한 복제 벡터의 선택적 에이전트(표 3.5). 또한, 숫자
삽입‑벡터 구축물이 있는 세포를 식별하기 위해 수많은 독창적인 선택 시스템이 고안되었습
니다. 예를 들어, pUC 시리즈에서 파생된 벡터는 발현될 때 죽이는 단백질을 암호화하는 유
전자를 운반합니다.
세포(자살 단백질). 이 세포 살해 유전자는 올바른 세포에 융합되어 있습니다.
조절 가능한 lacZ ' 유전자 프로모터 로부터 전사되도록 lacZ' 유전자 에 대한 판독 프레
임 . 온전한 플라스미드가 있고 IPTG가 없는 A 세포
배지는 자살 단백질을 합성하지 않습니다. 플라스미드가 있고 삽입물이 없는 세포는 IPTG
가 있는 경우 자살 단백질을 합성합니다.
삽입물과 IPTG를 사용하면 비기능성 자살 단백질이 생성되는데, 그 이유는 삽입물이 판독
프레임을 방해하기 때문입니다. 의
자살 유전자. 형질전환되지 않은 세포는 항생제에 민감한 반면, 형질전환된 세포는 벡터의 일
부로 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 가지고 있습니다. 즉, 이 경우 유일한 생존
세포입니다. 에서
IPTG와 항생제의 존재는 DNA와 함께 플라스미드를 운반하는 것입니다.
끼워 넣다.

많은 벡터가 독창적인 디자인을 가지고 있지만 원칙적으로 그들은 모두 재조합 DNA 기

술의 두 가지 기본 요구 사항을 유지합니다.
이는 복제 부위를 선택하는 동시에 플라스미드 복제된 DNA 구성물로 세포를 식별하는 쉬운
방법입니다. 고유한 제한 사항이 있다는 점에 유의해야 합니다.
엔도뉴클레아제 부위는 재조합 DNA 연구에서 이중 기능을 가지고 있습니다. 이는 클로닝 벡
터에 DNA를 삽입하는 데 필요하며 다음을 허용합니다.
삽입된 DNA 서열은 벡터로부터 복구될 것입니다. 즉,
DNA 조각이 동일한 제한 엔도뉴클레아제로 절단된 플라스미드에 클로닝된 후, 해당 제한
엔도뉴클레아제로 정제된 플라스미드 클로닝된 DNA 구조를 절단하여 DNA 조각을 회수할
수 있습니다. 복제된 DNA 서열. 복구된 DNA 단편은 전문화된 DNA 서열로 복제될 수 있습
니다.

DNA 시퀀싱을 위한 벡터 클로닝 또는 특별히 처리된 벡터

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재조합 DNA 기술 67

복제된 유전자의 높은 수준의 발현(전사 및 번역)을 달성하도록 설계되었습니다. 실제로 수천

개의 벡터가 개발되었습니다.
다양한 목적과 다양한 유기체에 사용됩니다.
실험실 생물로 잘 알려진 대장균( E. coli)이 사실임에도 불구하고
모든 일상적인 분자 복제 과정에 사용되는 Bacillus subtilis 및 Agrobacterium
tumefaciens 와 같은 다른 박테리아가 최종 숙주 세포 역할을 하는 경우가 많습니다. 많은
응용 분야에서 E. coli 에서 기능하는 클로닝 벡터 에는 플라스미드가 대체 숙주 세포에서 복
제될 수 있도록 하는 두 번째 복제 원점이 제공될 수 있습니다. 이러한 셔틀 클로닝 벡터를 사
용하면 완전히 발달된 구조물이 다른 숙주 세포에 도입되기 전에 초기 클로닝 단계가 E. coli
를 사용하여 수행됩니다.

플라스미드 벡터는 좁은 숙주 범위의 복제 기점 대신에 단일의 넓은 숙주 범위의 DNA 복제 기

점을 사용하여 구성되었습니다. 이러한 벡터는 다양한 미생물과 함께 사용될 수 있습니다.

셔틀 벡터에는 몇 가지 단점이 있습니다.

두 번째 복제원점을 포함하는 DNA는 벡터의 크기를 증가시키고 삽입할 수 있는 DNA의 양을
감소시키며, 일부 경우 셔틀 벡터는 숙주세포 내에서 효율적으로 증식되지 못한다.

또한, 광범위한 숙주 범위의 클로닝 벡터는 불안정할 수 있으며 선호하는 숙주 세포에서 손실

될 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 DNA 삽입물을 대장균 기반 플라스미드에 클로
닝한 다음 클로닝된 DNA와 항생제 내성 유전자를 모두 운반하는 플라스미드 부분을 숙주 세
포 특이적인 부분과 결합하는 시스템이 고안되었습니다. 자신의 복제원점을 갖고 있는 플라스
미드. 이 셔틀 벡터 생성의 첫 번째 단계에는 제한 엔도뉴클레아제 SfiI에 대한 두 개의 서로 다
른 인식 사이트의 엔지니어링이 필요합니다. 이 사이트의 순서는 GGCCNNNNNGCC
CCGGNNNNNCCGG입니다 . 는 모든 염기쌍을 나타냅니다(그림 3.15A). 두 개의 서로 다
른 SfiI 사이트(SfiIx 및 SfiIy )는 서로 다른 변수 시퀀스를 갖도록 설계되었습니다. 여기서 N N
소화 후

SfiI의 경우 SfiIx 사이트의 확장은 SfiIy 사이트의 확장과 보완적이지 않습니다 (그림 3.15B).
다음으로 두 개의 SfiI 시퀀스가 삽입됩니다. 둘 다에
E. coli 기반 및 숙주 세포 특이적 플라스미드가 해당 영역의 측면에 위치하도록 합니다 .
항생제 내성 유전자와 대장균 기반 플라스미드 의 클로닝 부위 (그림 3.16A) 및 숙주 세포 특
이적 플라스미드의 복제 기원(그림 3.16A)을 포함합니다. 그림 3.16B). DNA 서열이 E에 클
로닝된 후. coli 기반 플라스미드 및 구조물은 E. coli에서 성장하며, E. coli 기반 플라스미드
와 숙주 세포 특이적 플라스미드는 별도로 정제, 혼합 및 SfiI 로 소화됩니다. 확장 염기 쌍
을 연결하고 연결 후에 여러 가지 다른 "키메라" 원형 DNA 분자가 형성됩니다.

표 3.5 선택제로 일반적으로 사용되는 일부 항생제

항생제(약어) 설명
암피실린(Ap, Amp) 세포벽 형성을 억제하고 β‑락타마제에 의해 비활성화됩니다.
히그로마이신 B(HygB) 아미노아실 부위에서 펩티딜 부위로의 전위를 차단하고 포스포트랜스퍼라제에 의해 비활성화됨
카나마이신(Km, 칸) 30S 서브유닛에 결합하여 아미노아실‑tRNA 부위에서 펩티딜 부위로의 전위를 방지합니다.
포스포트랜스퍼라제에 의해 비활성화됨
네오마이신(Nm, Neo) 30S 서브유닛에 결합하여 단백질 합성을 억제합니다. 포스포트랜스퍼라제에 의해 비활성화됨
스트렙토마이신(Sm, Str) 단백질 개시 복합체 형성을 차단하고 번역 중 오독을 유발합니다.
포스포트랜스퍼라제에 의해 영향을 받음
테트라사이클린(Tc, Tet) 아미노아실‑tRNA가 30S 리보솜 하위 단위에 결합하는 것을 방지합니다. 저항 유전자는
세포 밖으로 항생제를 통과시키고 통로를 차단하는 내부 세포막 단백질
항생제가 세포벽을 통해
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68 장 3

ㅏ 혼합물은 숙주 세포로 형질전환되고 항생제, 즉 클로람페니콜을 함유하는 배지에서 선택됩

GGC CNNNNNGGC C
니다. 플라스미드가 없는 세포와 클로람페니콜 저항성 유전자가 없는 플라스미드가 있는 세
C CGGNNNNNC CGG 포는 클로람페니콜이 있는 경우 성장할 수 없습니다. 또한 복제기점을 가지고 있지 않거나
대장균 기반 플라스미드 로부터 복제기점을 가지고 있는 플라스미드는 숙주세포 내에서 복
제되지 않으므로 유지되지 않는다. 클로람페니콜 내성 유전자가 있는 대장균 기반 플라스미
비 드 의 일부 와 숙주에서 기능하는 복제 기점을 포함하는 숙주 세포 특이적 플라스미드의 단
SfiIx 편에 결합된 클로닝된 유전자를 운반하는 키메라 플라스미드로 형질전환된 세포만 세포는
G GCCAC T GAGGC C
C CGG T GAC T C CGG 클로람페니콜에 저항성이 있고 결과적으로 성장할 수 있습니다(그림 3.16C).

수줍은

GGC CAC TG AGGC C 플라스미드가 있는 모든 숙주 세포에 적용할 수 있는 "SfiIx‑SfiIy" 절차를 벡터 백본 교환

C CGG T GAC T C CGG 이라고 합니다.

스파이
G GCCGGACGGGC C 라이브러리 생성 및 스크리닝
C CGGC CT GCC CGG
게놈 라이브러리 만들기
수줍은 분자 생명공학의 기본 목적 중 하나는 산업, 농업, 의료 응용을 위해 단백질을 암호화하는
유전자를 분리하는 것입니다. 원핵생물에서 구조 유전자는 연속적인 형태를 이룹니다.
GGC CGGAC GGGC C
C CVGC CT GCC CGG 게놈 DNA의 코딩 도메인, 진핵생물의 코딩 도메인
구조 유전자의 영역(엑손)은 비암호화 영역(인트론)으로 분리됩니다. 결과적으로, 서로 다른
그림 3.15 (A) SfiI 인식 사이트. The 복제 전략을 사용해야 합니다.
화살표는 절단 부위를 표시하고, 및 N N 원핵생물과 진핵생물 유전자를 복제합니다.
모든 염기쌍을 나타냅니다. (B) SfiIx
원핵생물에서 원하는 서열(표적 DNA 또는 관심 유전자)
그리고 SfiIy 인식 부위는 제한 엔도뉴클레아제 SfiI로 소화
한 후 SfiIx 확장자가 SfiIy와 염기쌍을 이루지 않도록 설 일반적으로 전체 염색체 DNA의 아주 작은 부분(약 0.02%)입니다. 그렇다면 문제는 표적
계되었습니다. DNA 서열을 어떻게 클로닝하고 선택하느냐이다. 이를 위해서는 유기체의 완전한 DNA, 즉
게놈이 필요하다.
확장. SfiIx (빨간색) 및 SfiIy (주황색) 인식 부위 사이의
제한 엔도뉴클레아제로 절단한 후 각 단편을 벡터에 삽입합니다. 그런 다음 표적 DNA 서열
뉴클레오티드 차이가 기록되어 있습니다.
을 운반하는 특정 클론이 있어야 합니다.
식별되고, 격리되고, 특성화됩니다. 게놈 DNA를 복제 가능한 요소로 세분화하고 이를 숙주
세포에 삽입하는 과정을 '라이브러리'(클론 은행, 유전자 은행, 또는 게놈 라이브러리) 생성
이라고 합니다.
완전한 라이브러리는 정의에 따라 소스 유기체의 모든 게놈 DNA를 포함합니다.

게놈 라이브러리를 생성하는 한 가지 방법은 먼저 4‑커터 제한 엔도뉴클레아제(예:

Sau3AI)를 사용하여 소스 유기체의 DNA를 처리하는 것입니다.
이는 이론적으로 매 256bp마다 대략 한 번씩 DNA를 절단합니다.
소화 반응의 조건은 완전한 소화가 아닌 부분적인 소화를 제공하도록 설정됩니다. 이러한
방식으로 가능한 모든 조각 크기가 생성됩니다(그림 1).
3.17). 부분 소화는 낮은 농도의 제한 엔도뉴클레아제 또는 단축된 배양 시간으로 수행됩
니다. 반응 기간이 길어질수록 조각은 작아집니다(그림 3.18). 전체 게놈 또는 그 대부분이
라이브러리 클론 내에 포함되도록 하려면 라이브러리 클론에 삽입된 DNA의 합계가 게놈에
있는 DNA 양의 3배 이상이어야 합니다. 예를 들어, 게놈이 4 × 106 bp이고 삽입물의 평
균 크기가 1,000 bp라면, 3중 적용 범위를 위해 12,000개의 클론이 필요합니다. 즉,
3[(4×106 )/ 103 ] . 인간 게놈(3.3 × 109 bp)의 경우 , 평균 삽입 크기가 150,000 bp
인 약 80,000개의 박테리아 인공 염색체(BAC) 클론이 4배 적용 범위, 즉, 4[(3.3×109 )/
를 갖는 라이브러리를 구성합니다. (15×104 )]. 통계적 관점에서 보면 N = ln(1 P)/
ln(1 f) 관계는 다음과 같습니다 (여기서 N 은 클론 수, P 는 특정 유전자를 찾을 확률, f
는 비율). 길이의
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재조합 DNA 기술 69

ㅏ 복제된 유전자 비

스파이 스파이

CMR 독수리
대장균 기반 숙주 세포 특정
플라스미드 플라스미드

SfiIx 오리 SfiIx 오리

SfiI와 혼합 및 소화
숙주 세포를 연결하고 변형

씨 복제된 유전자

스파이

CMR

SfiIx 오리

그림 3.16 벡터 백본 교환. 복제된 DNA 서열, 클로람페니콜 저항성 유전자(Cmr ) 및 E. coli 특정 복제 원점 (oriE )(A) 이
있는 E. coli 기반 플라스미드 가 표시됩니다. 숙주 특이적 복제 기원 (oriH) 과 에리스로마이신 저항성 유전자(Eryr )(B)가
있는 숙주 세포 특이적 플라스미드는 각각 SfiIx 와 SfiIy 인식 부위로 조작되었습니다. 패널 A와 B에 표시된 플라스미드를
SfiI로 처리하면 각각에서 두 개의 단편이 생성됩니다.

SfiIx 및 SfiIy 확장이 있는 플라스미드 . 여러 가지 다른 원형 키메라 DNA 분자는 상보적인 확장과 결찰 사이의 염기쌍 형
성 후에 형성됩니다(표시되지 않음). (C) 키메라 DNA 분자 혼합물을 숙주 세포로 형질전환시킨 후, 숙주 세포에서 기능하는
복제 기점을 갖는 키메라 플라스미드를 운반하는 세포만 복제된 DNA 서열 및

대장균 기반 플라스미드 의 클로람페니콜 저항성 유전자는 클로람페니콜이 포함된 배지에서 선택됩니다.

전체 게놈 크기에 대한 평균 삽입)은 포괄적인 게놈 라이브러리에 필요한 클론 수의 추정

치를 제공합니다. 이를 바탕으로 99%의 발견 확률을 위해서는 약 700,000개의 클론이
필요합니다.
평균 삽입이 있는 인간 게놈 라이브러리의 특정 서열
크기는 20kb입니다. 마지막으로 제한 엔도뉴클레아제 사이트가 무작위로 위치하지 않
기 때문에 일부 조각은 너무 커서 복제할 수 없습니다. 이런 일이 발생하면 라이브러리가
불완전하기 때문에 특정 표적 DNA 서열을 찾는 것이 어렵거나 심지어 불가능할 수도 있
습니다. 이 문제는 극복될 수 있습니다.
다양한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 라이브러리를 형성합니다. 분명히,
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70 제 3 장

RE1 RE1 RE1

대지 대지 대지

ㅏ 비 씨 디 원천
DNA

부분 소화
제한사항이 있는
엔도뉴클레아제

ㅏ 비 씨 디

a+b 씨 디

a+b+c 디

ㅏ b+c+d

a+b 씨+디

ㅏ b+c 디

ㅏ 비 씨+디

그림 3.17 유형 II 제한 엔도뉴클레아제가 있는 DNA 단편의 부분 소화. 부분 소화는 일반적으로

소화에 사용되는 효소의 양이나 시간을 변경하여 수행됩니다. 일부 DNA 분자에서는 제한 사항이
있습니다. 엔도뉴클레아제는 모든 부위에서 절단되었습니다(각각 RE1로 표시됨).

분자가 더 적게 절단되었습니다. 원하는 결과는 가능한 모든 길이의 DNA 분자가 포함된 샘플입니
다.

게놈 라이브러리의 클론 수는 유기체의 게놈 크기(표 3.6) 및 평균에 따라 달라집니다.

벡터의 삽입 크기입니다.
라이브러리가 생성된 후에는 대상 시퀀스가 있는 클론이 다음과 같아야 합니다.
확인되었습니다. 네 가지 널리 사용되는 식별 방법이 사용됩니다. 표지된 DNA 프로브를
사용한 DNA 혼성화에 이어 프로브 라벨에 대한 방사선 촬영 스크리닝, 단백질 제품에 대
한 면역학적 스크리닝, 단백질 활성 분석 및 기능적(유전적) 보완입니다.

DNA 혼성화에 의한 스크리닝

DNA 샘플에 표적 뉴클레오티드 서열의 존재는 다음과 같을 수 있습니다.
DNA 프로브로 결정됩니다. DNA 혼성화라고 불리는 이 절차는 프로브와 표적 서열 사이
의 안정적인 염기쌍 형성에 달려 있습니다. DNA 혼성화는 자연적으로 발생하기 때문에 가
능합니다.
이중 가닥 DNA는 열이나 알칼리 처리에 의해 단일 가닥 DNA로 전환될 수 있습니다.
DNA를 가열하면 DNA를 붙잡고 있는 수소 결합이 끊어집니다.

. 3.17
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재조합 DNA 기술 71

12345

그림 3.18 DNA 샘플의 제한 엔도뉴클레아제 분해 시간 증가 효과. (A) DNA 분자

의 제한 엔도뉴클레아제 부위(화살표)가 표시됩니다.

(B) 제한효소 처리 기간이 길어질수록 절단 부위가 증가합니다(lanes 1~5). 레인 1

은 제한효소 첨가 시 DNA 분자의 크기를 나타냅니다.

레인 2~5는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 노출이 증가한 후 DNA 절단 정도를 나타

냅니다.

표 3.6 다양한 유기체의 DNA 함량

유기체 게놈 크기(수백만 개의 염기쌍)

마이코플라스마 제니탈리움 0.58
메타노코커스 잔나스키이 1.66
헤모필루스 인플루엔자균 Rd 1.83
나이세리아 수막염 2.27
락토코커스 락티스 2.36
나병균 3.26
비브리오 콜레라 4.00
B. 서브틸리스 4.20
대장균 K‑12 4.60
대장균 O157:H7 5.50
녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 6.30
메소리조비움 로티 7.59
사카로마이세스 세레비지애 13
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 97
애기장대 125
초파리 melanogaster 165
복어 루브리페스 400
감자 840
제아 메이스 2,700
마우스 근육 3,000
현명한 사람 3,300
일반보리 5,500
여름밀 17,300
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72 장 3

1 타겟 DNA 준비

ㅏ 티씨G 티ㅏ G 티씨G 티ㅏ G G 티씨G G 티 티ㅏ G 씨 티 티G ㅏ ㅏ 씨 씨 TTTTCCCCAAAAGGGGGCCCCCTTTTAAAA

티ㅏ G 씨ㅏ 티씨ㅏ G 씨ㅏ 티씨 씨ㅏ G 씨 씨ㅏ ㅏ 티씨G ㅏ ㅏ 씨 티 티G G 아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아

발췌
변성
고정

ATCGTAGTCGTAGGTCGGT TAGCTTGAACC TTTTCCCCAAAAGGGGGCCCCCTTTTAAAA

태그CATCAGCATCCAGCCAATCGAACT TGG 아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아

2 프로브 DNA 준비

TAGGTCGG
ATCCAGCC

상표
변성

TAGGTCGG*

ATCCAGCC*

3 혼성화

ATCCAGCC*
ATCGTAGTCGTAGGTCGGT TAGCTTGAACC TTTTCCCCAAAAGGGGGCCCCCTTTTAAAA

TAGGTCGG*
태그CATCAGCATCCAGCCAATCGAACT TGG 아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아아

그림 3.19 DNA 혼성화. (1) 추정 표적 DNA를 포함하는 샘플의 DNA는 변성되고, 단일 가닥은 일반
적으로 니트로셀룰로오스와 같은 고체 지지체에 결합되어 분리되어 유지됩니다. 또는 나일론 막. (2) 길
이가 종종 100~1,000bp인 프로브를 표지하고 변성시킨 다음 혼성화 조건에서 변성된 추정 표적
DNA와 혼합합니다. (3) 혼성화 반응 후, 막을 세척하여 혼성화되지 않은 프로브 DNA를 제거하고 혼
성화된 표지된 태그의 존재 여부를 분석합니다. 프로브가 혼성화되지 않는 경우 , 라벨이 감지되지 않
았습니다. 별표는 프로브 DNA의 라벨이 붙은 태그(신호)를 나타냅니다.

염기가 함께 결합(변성)되지만 DNA 백본의 포스포디에스테르 결합에는 영향을 미치지 않습니

다. 가열된 용액을 급격하게 냉각하면 가닥이 단일 가닥으로 유지됩니다. 그러나 가열된 DNA
용액의 온도가 천천히 낮아지면 상보적인 뉴클레오티드의 염기쌍(재생)으로 인해 DNA의 이
중 가닥 나선형 구조가 다시 확립될 수 있습니다. 이중나선 DNA를 가열하고 천천히 냉각시키
는 과정을 어닐링(annealing)이라고 합니다. 일부 공유된(상동) 서열을 가진 서로 다른 소
스의 DNA 단편을 혼합하고 100°C로 가열한 다음 천천히 냉각하면 어닐링된 생성물 중에 일
부 하이브리드 DNA 분자가 있게 됩니다. , 가닥이 다른 출처에서 나오는 이중 가닥 DNA.

일반적으로 DNA 혼성화 분석의 경우 표적 DNA는 변성되고 단일 가닥은 매트릭스(예: 니

트로셀룰로오스 또는 나일론)에 비가역적으로 결합됩니다. 그런 다음 방사성 동위원소나 다
른 태깅 시스템으로 표지된 DNA 프로브의 단일 가닥을 다음과 같이 배양합니다.
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재조합 DNA 기술 73

결합된 DNA 샘플. DNA 프로브에 있는 뉴클레오티드의 서열이 다음과 같은 경우

샘플의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 다음 염기쌍을 형성합니다.
즉, 혼성화가 일어난다(그림 3.19). 혼성화는 프로브 라벨의 특성에 따라 자가방사선 촬영(상자 3.2) 또
는 기타 시각화 절차를 통해 감지할 수 있습니다. 프로브의 뉴클레오티드 서열이 다음과 같은 경우

샘플의 DNA 서열과 염기쌍이 일치하지 않으면 혼성화가 불가능합니다.

발생하고 분석 결과는 부정적인 결과를 나타냅니다. 일반적으로 프로브의 길이는 100bp에서 1,000bp 이
상까지 다양하지만 더 큰 프로브와 더 작은 프로브를 모두 사용할 수 있습니다. 혼성화 반응의 조건에 따
라 안정적인 염기쌍은 50개의 세그먼트 내에서 >80%의 일치가 필요합니다.

기지.
DNA 프로브는 다양한 방식으로 표지될 수 있습니다. 무작위 프라이머 방법이라고 불리는 한 가지
전략은 DNA에 대한 프라이머 역할을 하는 6개의 뉴클레오티드(육량체)의 가능한 모든 서열 조합을 포함
하는 합성 무작위 올리고뉴클레오티드(올리고머)의 혼합물을 활용합니다. 합성. 상보적인 서열의 발생 가
능성에 기초하여,

샘플의 올리고머 중 일부는 표지되지 않은 프로브 DNA 템플릿의 상보적인 서열에 혼성화됩니다(그림
3.20). 올리고머 샘플이 변성된 프로브 템플릿 DNA와 혼합된 후, 4개의 디옥시리보뉴클레오티드 (디옥
시리보뉴클레오시드삼인산 [dNTPs])및 a

Klenow 단편이라 불리는 E. coli DNA 중합효소 의 일부가 첨가됩니다.

dNTP는 데옥시아데노신 삼인산(dATP), 데옥시리보실티민 삼인산(dTTP), 데옥시구아노신 삼인산
(dGTP),

박스 3 .2

자가 방사선 촬영
방사선 사진표지의
방사성 촬영 위치
을 사용하여 감지합니다.
세포 또는 분수화된 거대분자 샘플의 실체입
니다. 원칙적으로,
자동 방사선 촬영은 브롬화은이 포함된 방사선
민감성 사진 필름 옆에 방사성 소스를 배치하
는 것으로 구성됩니다. 방사성 동위원소의 붕괴
로 인한 에너지는 사진 유제에 부딪혀 작은 반
점에 갇힌 전자를 생성합니다.
에멀젼에 브롬화은 결정이 있습니다. 음전하
를 띠는 반점
은 이온을 끌어당겨 금속성 은이 형성됩니다.
금속은 입자는 사진 필름을 현상하여 가시화됩니
다. 따라서 노출된 어두운 부분은
현상된 필름의 영역은 기본 물질이 방사성 표
지되었음을 나타냅니다. 괄호 안에, 형광학은 사
진 유제에서 은을 감소시키는 에너지원으로서 빛
을 직접 또는 간접적으로 생성하는 분자에 감
광성 사진 필름을 노출시키는 데 사용되는 용
어입니다.
단백질과 핵산은
방사성 표지 및 겔 전기영동으로 분
리된 물질은 건조된 겔에 X선 필름을
놓고 적절한 노출 시간 후에 필름을 현
상하여 시각화할 수 있습니다. 모든
자동 라디오 그래픽 단계는 의도하
지 않은 노출을 피하기 위해 어두운
곳에서 수행됩니다.
엑스레이 필름을 빛에 비추다. 다양한
자동 방사선 촬영 기술이 있습니다.
정량적인 방법을 위해 고안되었습니다.
단백질의 정성 분석 및
핵산.
자동방사선촬영의 주요 용도 중 하나는
전기영동으로 분별된 DNA 분자에 방사성 표
지된 DNA 프로브의 혼성화를 검출하는 것
입니다. 그러나 젤의 DNA 분자는 DNA 프로
브와의 혼성화에 접근할 수 없습니다.
겔 내의 DNA 분자는 블로팅 또는 전
기전달을 통해 니트로셀룰로오스 또는
나일론 막으로 전달됩니다.
전달 과정은 젤에 있는 DNA 분자와 동일한 위
치를 막에 유지합니다. 전달되는 DNA 분자
막은 변성되어 막에 결합되고 방사성 표지된
DNA 프로브와 혼성화됩니다. 막의 자동 방사
선 촬영을 통해 프로브가 특정 DNA 밴
드에 혼성화되었는지 여부가 드러납니다.
겔에서 막으로의 DNA 이동을 독창적인 DNA
블로팅 전략을 고안한 Edwin Southern의 이
름을 따서 서던 블로팅(Southern DNA
blotting)이라고 합니다. 노던 블롯팅과 웨
스턴 블롯팅은 각각 젤에서 멤브레인으로 RNA
와 단백질을 전달하는 방법입니다. 용어
"Northern" 및 "
"서양인"은 할 일이 없습니다.
방향은 겔에서 막으로 거대분자를 블로팅하
는 개념을 개발하고 전달되는 거대분자를
구별하는 에드윈 서던(Edwin Southern)의 공
로를 인정하기 위해 분자 생물학자들에 의해 만
들어졌습니다. "북부" 및 "서부"라는 명칭도
동일합니다.
분자 생물학 유머의 예.
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74 장 3

5' 삼'
원천
DNA
삼' 5'
변성

올리고뉴클레오티드
프라이머가 추가됨

이종 교잡

5' 삼'

삼' 5' 삼' 5' 삼' 5'

5' 삼' 5' 삼' 5' 삼' 5' 삼'

삼' 5'

DNA 합성
Klenow 단편 및
4개의 dNTP

5' 삼'

* *** ** 라벨이 지정됨

조사
** *** ** * DNA

삼' 5'

변성

** ***

**** ***

5' 삼'

그림 3.20 무작위 프라이머 방법에 의한 표지된 프로브 DNA의 생산. 프로브 역할을 하는 서열을
포함하는 이중 DNA는 변성됩니다.
6개의 뉴클레오티드 중 가능한 모든 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 샘플은 다음과 같습니다.
추가되었습니다. 올리고뉴클레오티드의 일부 분자가 통계적으로 확실하다는 것은 통계적 확실성입니다.
혼합물은 표지되지 않은 변성 프로브 DNA에 혼성화됩니다.
Klenow 단편과 4개의 dNTP(이 중 하나는 태그(*)로 표시됨), 염기쌍을 이룬 올리고뉴클레오티드
는 DNA 합성을 위한 프라이머 역할을 합니다. 합성된 DNA는 라벨링되어 특정 DNA 서열의 존재
를 검출하는 프로브로 사용됩니다.
DNA 샘플. 이 경우 라벨이 붙은 프로브는 여러 개의 별도 DNA로 구성됩니다.
라벨이 지정되지 않은 원본 주형 DNA의 거의 전체 서열을 함께 구성하는 분자입니다.
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재조합 DNA 기술 75

데옥시시티딘 삼인산(dCTP). Klenow 단편은 DNA 중합효소와 3'엑소뉴클레아제 활성

을 모두 보유하지만 일반적으로 E. coli DNA 중합효소 I와 관련된 5' 엑소뉴클레아제 활
성은 부족합니다 (그림 1).
3.21). 3' 엑소뉴클레아제는 새로운 DNA 가닥을 합성하는 동안 잘못된 dNTP의 잘못
된 결합을 줄이기 때문에 그대로 유지됩니다. 그러나 5' 엑소뉴클레아제 활성은 새로 합성
된 DNA의 일부를 분해하기 때문에 폐지됩니다. 염기쌍을 이룬 무작위 프라이머와 템플릿
으로서의 프로브 가닥에 의해 제공되는 이용 가능한 3' 하이드록실 그룹을 사용하면 새로
운 DNA 합성이 발생합니다(그림 3.20). 이다

사용된 경우 dNTP 중 하나는 α 위치 인산염에 동위원소 32P를 포함합니다. 자가방사

선촬영은 표지된 프로브 서열이 표적 DNA 샘플의 서열에 혼성화되는지 여부를 결정하는
데 사용됩니다.
표지된 dNTP를 포함한 데옥시리보뉴클레오티드는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하
여 프로브 서열에 통합되어 다음을 생성합니다.
높은 수율의 표지된 프로브 DNA(4장 참조).
비동위원소 혼성화 검출을 위해 비오틴은 DNA 합성 단계에서 통합되는 4개의 dNTP
중 하나에 부착될 수 있습니다. 비오틴으로 표지된 프로브가 샘플 DNA에 혼성화되면 검
출이 이루어집니다.

그림 3.21 E. coli DNA 중합효소 I의 효소 활성에 대한 도식적 표현. (A) 중합효소(빨간색)는 성장하는 사슬의 3' 수산기에
데옥시리보뉴클레오티드를 추가합니다. (B) 5' 엑소뉴클레아제(파란색)는 5' 인산염 말단에서 연속적인 뉴클레오티드를 제거
합니다. (C) 3' 엑소뉴클레아제(노란색)는 3' 하이드록실 말단에서 성공적인 뉴클레오티드를 제거합니다.

5'P

아 3'

P 5'
오

3' 오

아 3'

3' ~로

5'P

P 5'
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76 장 3

이는 중간 화합물(예: 스트렙타비딘)과 비오틴의 결합을 기반으로 합니다(9장 참조). 중간

화합물은 분석 시스템에 따라 직접 시각화할 수 있는 발색성(유색) 분자를 형성하거나 자
동방사선 촬영으로 검출할 수 있는 화학발광 반응을 생성할 수 있는 적절한 효소를 운반
합니다.

게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브 소스는 최소한 두 가지가 있습니다. 첫

째, 밀접하게 관련된 유기체(이종성 프로브)로부터 복제된 DNA를 사용할 수 있습니다.
이 경우 혼성화 반응의 조건은 상당한 허용을 위해 조정될 수 있습니다. 두 서열 사이의
자연적인 차이를 보상하기 위해 프로브와 표적 DNA 사이의 불일치를 제거합니다. 둘째,
프로브는 화학적 방법으로 생산될 수 있습니다.

합성. 합성 프로브의 뉴클레오티드 서열은 다음에 기초합니다.

알려진 아미노산으로부터 추론된 가능한 뉴클레오티드 서열
표적 유전자에 의해 코딩된 단백질의 서열.
게놈 라이브러리는 종종 마스터 플레이트의 성장 배지에서 형질전환된 세포를 플레이
팅한 다음 각 콜로니의 샘플을 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막과 같은 고체 매트릭스
로 옮겨 스크리닝됩니다. 막이 부러지고 열려 있고(용해됨), 단백질이

제거되고 DNA가 막에 결합됩니다. 이 단계에서 표지된 프로브가 추가되고 혼성화가 발생

하면 방사선 사진에서 신호가 관찰됩니다. 그런 다음 혼성화된 DNA를 포함하는 샘플에
해당하는 마스터 플레이트의 콜로니를 분리하고 배양합니다(그림 1).

3.22). 대부분의 라이브러리는 게놈 DNA의 부분 소화로 생성되므로 다수의 콜로니가 프

로브에 양성 반응을 보일 수 있습니다. 다음 작업은 어떤 복제본이 있는지 확인하는 것입
니다.
표적 유전자의 서열. 겔의 결과를 사용하는 예비 분석
전기영동 및 제한 엔도뉴클레아제 매핑을 통해 각 삽입물의 길이를 밝혀내고 동일한 삽입
물과 중복되는 서열을 공유하는 삽입물을 식별합니다. 클론 중 하나에 삽입물이 큰 경우
충분하다
전체 유전자를 포함하려면 DNA 시퀀싱 후에 전체 유전자를 인식할 수 있습니다. 왜냐하
면 시작 및 중지 코돈과 표적 단백질을 코딩하는 연속적인 뉴클레오티드 세트가 있기 때
문입니다. . 대안적으로, 유전자는 서로 다른 클론의 중첩 서열을 사용하여 조립될 수 있습
니다.
불행하게도 a의 완전한 순서가 보장되지는 않습니다.
표적 유전자는 특정 라이브러리에 존재할 것입니다.
유전자가 실패하면 다른 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 또 다른 라이브러리를 만들고
원래 프로브 또는 첫 번째 라이브러리에서 파생된 프로브로 스크리닝할 수 있습니다. 반면
에, 아래에서 논의된 것처럼, 평균 원핵생물 유전자보다 더 큰 DNA 조각을 포함하는 라이
브러리는 다음과 같습니다.
라이브러리의 일부 구성원이 완전한 버전의 표적 유전자를 보유할 가능성을 높이기 위해
특수 벡터로 생성되었습니다.

면역학적 분석에 의한 스크리닝

DNA 프로브를 사용할 수 없을 때 라이브러리를 스크리닝하는 데 대체 방법이 사용됩니
다. 예를 들어, 복제된 DNA 서열이 전사되고 번역되는 경우, 단백질의 존재 또는 심지어
그 중 일부는 면역학적 분석으로 결정될 수 있습니다. 기술적으로 이 절차는 DNA 혼성화
분석과 공통점이 많습니다. 라이브러리의 모든 클론은 여러 마스터 플레이트에서 재배됩니
다. 각 식민지의 샘플은 알려진 곳으로 전송됩니다.

세포가 용해되고 방출된 단백질이 매트릭스에 부착되는 매트릭스 상의 위치입니다. 단백질

이 결합된 매트릭스를 단백질에 특이적으로 결합하는 항체(1차 항체)로 처리합니다.
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재조합 DNA 기술 77

식민지 행렬
세포
마스터
그릇

1 세포를 옮기
다

2 세포 용해;
4 계대배양 세포 DNA를 변성시키다
그리고 매트릭스에 바인딩
마스터 플레이트

행렬 행렬
경계
조사 DNA

3 혼성화하다

혼성화
조사

그림 3.22 표지된 DNA 프로브를 사용하여 라이브러리 스크리닝(콜로니 혼성화).

형질전환 반응으로부터의 세포를 형질전환은 허용하지만 비형질전환은 아닌 세포의 성장을 허용하
는 조건 하에서 고체 한천 배지에 플레이팅합니다. (1)
마스터 플레이트에 형성된 각각의 개별 콜로니에서 샘플은 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막과 같
은 고체 매트릭스로 옮겨집니다. 마스터 플레이트의 콜로니 패턴이 매트릭스에 유지됩니다. (2) 매트
릭스 위의 세포가 용해되고, 방출된 DNA가 변성되고 단백질이 제거되어 매트릭스에 비가역적으로 결
합됩니다. (3) 혼성화 조건 하에서 표지된 DNA 프로브를 매트릭스에 첨가합니다. 혼성화되지 않은
프로브 분자가 세척된 후, 매트릭스는 자동방사선 촬영으로 처리되어 어떤 세포가 표지된 DNA와 결
합했는지 확인합니다. (4) X선 필름의 양성 반응 영역에 해당하는 마스터 플레이트의 콜로니가 식별
됩니다. 마스터 플레이트에 있는 양성 콜로니의 세포는 원하는 플라스미드 복제 DNA 구성물을 보유
할 수 있으므로 계대배양됩니다.

표적 유전자에 의해 암호화된다. 1차 항체와 표적 단백질(항원)의 상호작용에 따라 결합

되지 않은 항체는 씻어내고 매트릭스는 해당 단백질에 특이적인 2차 항체(2차 항체)로 처리
됩니다. 일차 항체. 많은 분석 시스템에서

2차 항체에는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소가 붙어 있습니다.

매트릭스를 세척한 후 무색의 기질을 첨가한다. 2차 항체가 1차 항체와 결합하면 무색의
기질은 부착된 기질에 의해 가수분해된다. 효소를 생성하고 반응 부위에 축적되는 유색 화
합물을 생성합니다(그림 3.23).

매트릭스의 양성 결과(유색 반점)에 해당하는 마스터 플레이트의 콜로니에는 온전한

유전자 또는 인식되는 단백질 생성물을 생성할 만큼 충분히 큰 유전자의 일부가 포함되어
있습니다.
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78 제 3 장

1차 항체에 의해 결정됩니다. 게놈 DNA 라이브러리의 면역분석법으로 검출한 후, 양성 클

론을 특성화하여 완전한 유전자를 갖고 있는지 확인해야 합니다.

단백질 활성에 의한 스크리닝

DNA 혼성화 및 면역학적 분석은 다양한 종류에 대해 잘 작동합니다.
유전자와 유전자 산물의 조합입니다. 표적 유전자가 다음과 같은 효소를 생산한다면
일반적으로 숙주 세포에 의해 만들어지지 않는 경우 직접(in situ) 플레이트 분석이 가능합니다.

그림 3.23 유전자 라이브러리의 면역학적 스크리닝(콜로니 면역 분석). 세포

형질전환 반응에서 나온 세포는 형질전환되었으나 비형질전환되지 않은 세포가 성장할 수 있는 조
건 하에서 고체 한천 배지에 도말됩니다. (1) 이 마스터 플레이트에 형성된 개별 콜로니에서 각 콜로
니의 샘플을 니트로셀룰로오스 또는 나일론 막과 같은 고체 매트릭스로 옮깁니다. (2) 매트릭스 위
의 세포가 용해되고, 그 단백질이 매트릭스에 결합됩니다. (3) 매트릭스는 목적 단백질에만 결합하
는 1차 항체로 처리됩니다. (4) 결합되지 않은 1차 항체는 씻어내고, 1차 항체에만 결합하는 2차 항
체로 매트릭스를 처리한다. (5) 결합되지 않은 2차 항체를 씻어내고 비색 반응을 수행합니다. 반응
은 반응을 수행하는 효소(E)에 부착된 2차 항체가 존재하는 경우에만 발생할 수 있습니다.(6) 해
당 마스터 플레이트의 콜로니 매트릭스에서 긍정적인 반응이 확인됩니다. 마스터 플레이트에 있는
양성 콜로니의 세포는 1차 항체에 결합하는 단백질을 코딩하는 플라스미드 삽입 DNA 구조물을 보
유할 수 있기 때문에 계대배양됩니다.

마스터 행렬 경계 행렬
그릇 단백질

1 세포를 옮기 2 세포를 용해하

다 고 결합
단백질
매트릭스로

6 마스터의 계대배
양 세포 3 매트릭스 처리 주요한
기본으로 항독소
그릇 항독소

단백질 제품
포지티브 콜로니에서 행렬 행렬
행렬 중고등 학년
그리고 그리고 항독소
그리고 그리고

그리고

그리고 그리고

5 씻어내다 4 씻어내라
매여 있지 않은 매여 있지 않은
중고등 학년 주요한
항독소 항독소
그리고 조사하다 그리고 치료하다
매트릭스 행렬
색상 반응 2차 항체
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재조합 DNA 기술 79

해당 효소를 암호화하는 특정 유전자를 보유하는 라이브러리의 구성원을 식별하기 위해 고 기능성을 발현하는 콜로니
안되었습니다. α‑아밀라아제, 엔도글루카나아제, β‑글루코시다아제 및 다양한 유기체의 기 복제된 유전자의 효소
착색된 제품을 생산한다
타 여러 효소에 대한 유전자가 이러한 방식으로 분리되었습니다. 이 접근법은 환경 표본에
존재하는 미생물로부터 생명공학적으로 유용한 효소를 암호화하는 유전자를 분리하는 데
효과적인 것으로 입증되었습니다. 이 표본에 포함된 대부분의 유기체는 실험실 외부에서 배
양할 수 없습니다. 자연 환 경. 그러나 이들 유기체의 전체 게놈 DNA는 시료, 예를 들어 토
양 시료에서 직접 추출할 수 있으며 대장균 과 같은 숙주 박테리아에서 발현될 수 있는 메
타지놈 라이브러리를 준비하고 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다 . 표적 단백질 활성을
위해 이 기술에는 다음이 포함됩니다.

자연 숙주 미생물을 먼저 배양할 필요 없이 흥미로운 특성을 지닌 많은 새로운 단백질을 분

리할 수 있었습니다. 함유 배지
어떤 경우에는 게놈 라이브러리의 세포가 배지에 플레이팅됩니다. 효소의 기질
특정 기질로 보충; 기질이 가수분해되면 비색 반응을 통해 표적 유전자를 운반하는 콜로니
그림 3.24 효소 활성에 대한 게놈 라이브
를 식별합니다(그림 1). 러리 스크리닝. 게놈 라이브러리의 세포는
3.24). 예를 들어, 복제된 박테리아 리파제 유전자를 검출하기 위해 형질전환된 세포는 트리 관심 있는 효소의 기질이 포함된 고체 배
올레오글리세롤과 형광 염료 로다민 B의 존재 하에서 성장합니다. 기질의 가수분해 결과, 양 지에 배양됩니다. 기능성 효소가 다음과
성 콜로니는 자외선 아래에서 볼 때 주황색 형광 후광을 갖습니다. 다른 검출 시스템은 특정 같은 경우
효소를 코딩하는 복제된 유전자를 운반하
유전자를 발견하기 위해 비색 반응에 의존하지 않습니다. 예를 들어, Lactobacillus
는 콜로니에 의해 생산된 기질은 쉽게 감지
plantarum 의 결합된 담즙산 가수분해효소 유전자로 형질전환된 세포는 담즙염이 있는 할 수 있는 유색 생성물로 전환됩니다.
상태에서 게놈 라이브러리의 구성원을 성장시킴으로써 검출되었습니다. a
배지에 있는 다른 무색 콜로니에도 게놈
라이브러리의 단편이 포함되어 있지만 관
심 있는 효소에 대한 유전자를 갖고 있지
가수분해효소 양성 집락은 침전된 유리 담즙산 고리로 둘러싸여 있기 때문에 쉽게 식별할
는 않습니다.
수 있습니다.
기능적(유전적) 보완은 효소를 암호화하는 유전자를 분리하는 또 다른 유용한 방법입
니다. 이 절차에서 숙주 세포에는 효소가 없습니다.
관심 있는 효소 활성은 효소를 코딩하는 유전자가 해당 효소의 활성을 없애는 돌연변이를
갖고 있기 때문입니다. 다음으로, 원하는 효소 활성을 갖는 유기체로부터의 게놈 DNA 단편
을 운반하는 DNA 라이브러리가 구축됩니다. 유전적 결함이 있는 숙주 세포를 DNA 라이브
러리의 플라스미드로 형질전환시키고, 정상적인 효소 기능을 회복한 형질전환 세포를 선별한
다(그림 3.25). 라이브러리를 준비하는 데 사용되는 게놈 DNA는 효소를 암호화하는 유전
자의 기능적 복사본을 운반하는 숙주 박테리아의 야생형 균주, 효소를 암호화하는 다른 유
기체와 같은 다양한 기증 유기체에서 유래할 수 있습니다. 환경 샘플에 존재하는 또 다른
원핵생물이거나 진핵생물이거나 배양되지 않은 유기체일 수 있습니다. 다양한 생화학적 경
로에 영향을 미치는 돌연변이가 있는 대장균 과 효모 세포가 자주 발견되었습니다.

기능적 보완 유전자 복제를 위한 숙주 세포로 사용됩니다.

이 실험에서는 복제된 유전자에서 유래한 단백질을 사용하여 숙주 세포가 최소 배지에서 성
장할 수 있게 했습니다. 반면 돌연변이 세포의 성장에는 배지에 특정 화합물을 첨가해야 합
니다.
항생제 생합성, 뿌리 결절 형성 및 기타 과정에서 역할을 하는 유전자가 이러한 방식으로 분
리되었습니다.
실제로, 수많은 게놈 서열의 가용성
단백질 코딩 영역이 확인되고 많은 경우에 알려지거나 예측된 기능이 할당된 유기체의 라이
브러리가 렌더링되었습니다.
일부 응용 분야에서는 스크리닝이 불필요합니다. 뉴클레오티드 서열이 어디에 있는지
관심 있는 유전자가 알려지면 짧은 디자인을 통해 해당 유전자를 복제할 수 있습니다.
상보적인 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머
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80 제 3 장

ㅏ‑ A+

B+ A+
C+
ㅏ‑
D+ E+

게놈 라이브러리

변환

ㅏ‑ ㅏ‑ A+ ㅏ‑ E+

성장
최소 매체

보완 없음 보완 없음
성장 없음 성장 없음
A – A+

보완 유전자 검색 및 특성화

그림 3.25 기능적 보완에 의한 유전자 클로닝. 특정 기능(예: A‑)에 결함이 있는 숙주 세포는 기능

A(예: A+)와 관련하여 정상적인 세포에서 파생된 게놈 라이브러리의 플라스미드로 형질전환됩니다.
A+ 기능을 부여하는 복제된 유전자를 가지고 있는 형질전환된 세포만이 최소 배지에서 자랄 것입니
다. 상보성을 보이는 세포를 분리하고 벡터 삽입물을 연구하여 돌연변이 숙주 세포의 결함을 수정하
는 유전자를 특성화합니다.

게놈 DNA 샘플의 표적 유전자 내에서 DNA 합성이 PCR로 알려진 반응에서 시작될 수
있습니다(4장 참조).

진핵생물 단백질을 암호화하는 DNA 서열 클로닝

복제 및 진핵세포 발현을 위해서는 특별한 전략이 필요합니다.
원핵세포의 코딩 영역. 기본적으로 진핵세포의 구조적 유전자
메커니즘이 없기 때문에 원핵생물에서는 기능하지 않습니다.
전사된 RNA에서 인트론을 제거하기 위한 것입니다. 또한, 진핵 DNA
서열에는 원핵생물의 전사 및 번역 조절이 필요합니다.
서열이 적절하게 발현되어야 합니다.
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재조합 DNA 기술 81

유전자는 또한 삽입물이 숙주 세포의 전사 및 번역 시스템과 호환되는 조절 서열을 가지고

있지 않는 한 동일한 제약을 갖습니다. 진핵 유전자의 경우, "인트론 문제"는 인트론이
부족한 정제된 메신저 RNA(mRNA) 분자의 이중 가닥 DNA 복사본(상보적 DNA
[cDNA])을 합성하여 극복됩니다.

cDNA 분자를 벡터로 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 생성하는 단계를 포함합니다.

cDNA 라이브러리는 단일 특정 조직의 mRNA 서열을 나타내는 경우가 많습니다.

기능성 진핵세포 mRNA는 인트론을 갖지 않습니다. 왜냐하면 인트론이 있기 때문입니다.

진핵세포의 접합 기계에 의해 제거되었습니다.mRNA는
5' 말단에 G 캡이 있고 일반적으로 3' 말단에 최대 200개의 아데닌 잔기[폴리(A)꼬리]로
구성된 문자열이 있습니다. 폴리(A) 꼬리는 보다 풍부한 리보솜 RNA(rRNA) 및 전달
RNA(tRNA)로부터 조직의 mRNA 분획을 분리하는 수단을 제공합니다. 15개의 티미딘
잔기의 짧은 사슬(올리고데옥시티미딜산[올리고(dT), 또는 dT15])이 셀룰로오스 비드에
부착되고, 올리고(dT)‑셀룰로오스 비드는 다음과 같습니다. 하나의 열에 포장되
어 있습니다.
진핵 세포 또는 조직에서 추출된 전체 RNA는 다음을 통해 전달됩니다.
올리고(dT)‑셀룰로오스 컬럼과 mRNA 분자의 폴리(A) 꼬리가 염기쌍을 통해 올리고(dT)
사슬에 결합합니다. 폴리(A) 꼬리가 없는 tRNA 및 rRNA 분자는 컬럼을 통과합니다.
mRNA가 제거됩니다.
A:T를 분해하는 완충액으로 처리하여 컬럼에서 (용출)
수소 결합을 통해 염기쌍을 이루는 mRNA가 방출됩니다(그림 3.26).
mRNA 분자가 벡터로 클로닝되기 전에 이중 가닥 DNA로 변환되어야 합니다. 이 합
성은 두 가지 다른 종류의 핵산 중합효소를 연속적으로 사용하여 수행됩니다.

역전사효소는 첫 번째 DNA 가닥을 합성하고, E. coli DNA 중합효소는 두 번째 DNA 가

닥을 합성합니다(그림 3.27).
정제된 올리고(dT) 분자의 부착되지 않은 짧은 서열이 추가됩니다.
효소 역전사 효소 및 4개의 dNTP와 함께 샘플. 올리고(dT) 분자는 mRNA의 폴리(A) 꼬
리의 아데닌 잔기와 염기쌍을 이루고 첫 번째 cDNA 가닥의 합성을 준비하기 위해 이용 가
능한 3' 수산기를 제공합니다.

특정 RNA 바이러스(레트로바이러스)에 의해 암호화되는 역전사효소는 RNA 가닥

을 주형으로 사용하면서 디옥시리보핵산을 성장하는 사슬로 유도합니다. 따라서, 주형
RNA 가닥의 A, G, C 또는 U 뉴클레오티드가 만나면 상보적인 데옥시리보 뉴클레오티드
(즉, T, C, G 또는 A)가 성장하는 DNA 가닥에 통합됩니다.

불행하게도, 전체 길이의 첫 번째 cDNA 가닥이 시험관 내 역전사 효소에 의해 항상 생성되는

것은 아닙니다. 불완전한 첫 번째 DNA 가닥은 다음과 같은 원인으로 인해 발생합니다.
역전사 효소가 긴 mRNA 템플레이트의 끝으로 진행하지 못함, 합성 중 효소의 빈번한 일
시 중지 및 내부 가닥
염기쌍 구성(2차 구조)이 합성을 방해합니다.
두 번째, 상보적인 DNA 가닥은 RNA‑DNA(헤테로듀플렉스) 분자를 리보뉴클레아
제 H(RNase H)로 처리하여 생성되며, 이는 mRNA 가닥에 흠집을 내고 그에 따라 유리
된 3' 하이드록실 그룹을 제공합니다. DNA 합성의 시작. 두 번째 가닥의 합성이 닉에서 진
행됨에 따라 DNA 중합효소의 5' 엑소뉴클레아제 활성이 제거됩니다.

만나는 모든 뉴클레오티드. 두 번째 가닥의 최종 길이는 첫 번째 DNA 가닥의 길이와 첫

번째 DNA 가닥의 3' 말단에 상대적인 mRNA 분자 내 틈의 위치에 따라 달라집니다.

두 번째 가닥의 합성은 종종 mRNA의 5' 말단으로부터 여러 뉴클레오티드에서 시작

됩니다. 그러나 클로닝을 위한 일부 전장 cDNA를 얻는 것은 일반적으로 문제가 되지
않습니다. 왜냐하면 대부분의 진핵생물 mRNA에는 다음이 있기 때문입니다.
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82 장 3

rRNA
G 아아아아아아아아아아아
mRNA
tRNA
rRNA

ㅏ 아아아아아아아아아아아 G
TTTTTTTTTT

G 아아아아아아아아아아아
TTTTTTTTTT 올리고(dT)‑셀룰로오스

씻다

G 아아아아아아아아아아아
TTTTTTTTTT

ㅏ 아아아아아아아아아아아 G
TTTTTTTTTT

변성

TTTTTTTTTT G 아아아아아아아아아아아

그림 3.26 전체 세포 RNA로부터 폴리아데일화된 mRNA의 올리고(dT)‑셀룰로오스 분리의 도식

적 표현.

길이가 40~80뉴클레오타이드 범위인 비코딩 리더 서열

그리고 코딩 순서보다 우선합니다. 즉, cDNA 중 소수는
완전한 단백질 코딩 서열과 잘린 리더 서열을 가지고 있습니다.
두 번째 DNA 가닥 합성이 종료된 후, cDNA 분자의 끝은 T4 DNA 중합효소에 의해 무딘
말단(말단 복구 또는 연마)이 되어 3' 연장 부분을 제거하고 3' 오목한 끝 부분을 채웁니
다.
제한 엔도뉴 분해 인식 서열을 위한 확장 기능을 갖춘 화학적으로 합성된 어댑터는 cDNA
분자의 끝 부분에 연결됩니다.
cDNA를 벡터로 클로닝하는 것을 촉진합니다(그림 3.27).
cDNA 라이브러리는 특정 플라스미드‑cDNA 구성을 운반하는 클론을 식별하기 위
해 DNA 혼성화를 통해 스크리닝됩니다. 어느 클론이 표적 단백질에 대한 완전한 코딩 서
열을 가지고 있는지 확인하기 위해 양성 클론을 추가로 검사해야 합니다. 일단 전체 길이
의 cDNA가 발견되면,
. 3.26
서열은 원핵 세포에서 발현을 지원하도록 설계된 벡터로 검색되어 복제될 수 있습니다.

위에서 언급한 바와 같이, 표준 cDNA 합성 프로토콜은 완전한(전체 길이) 분자와 불

완전한 분자를 모두 생성합니다. 불행하게도 전체 길이의 서열이 있는 cDNA 라이브러리
의 클론을 식별하는 데 많은 시간과 노력이 소요될 수 있습니다. 극복하기 위해 다양한 전
략이 고안되었습니다.
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재조합 DNA 기술 83

ㅏ 그림 3.27 cDNA 합성. (ㅏ)

mRNA Oligo(dT) 프라이머는 정제된 mRNA 제제에 추가
m7Gppp AAAA 되고, 4개의 dNTP가 포함된 역전사효소는 RNA
주형에서 상보성(cDNA) 가닥을 생성하는 데 사용
첫 번째 가닥 합성 역전사 효소 됩니다.

m7Gppp AAAA 역전사효소는 mRNA 2차 구조, 즉 헤어핀 루프 또

TTTTT 는 기타 요인으로 인해 모든 mRNA 주형에서 항상
전체 길이의 cDNA 복사본을 생성하지는 않습니다.
m7Gppp AAAA 두 번째 가닥 DNA 합성을 위해 mRNA는 RNase
TTTTT 에 의해 별명이 붙습니다.
올리고(dT)
첫 번째 대장균 의 시작 부위를 생성하는 H
DNA·중합효소 I. DNA·중합효소 I의 5' 엑
머리핀 고리 소뉴클레아제 활성은 다음을 제거합니다.
RNA 및 DNA 서열 모두
닉네임에서 합성으로 발생했습니다.
RNase H mRNA의 5' 말단에 가장 가까운 부분이 진행됩니
다. (B) cDNA 분자는 T4 DNA 중합효소로 최종
건강 상태
복구되고 제한 효소 인식 서열을 포함하는 어댑터가
AAAA 연결됩니다.
m7Gppp
TTTTT
클로닝 효율을 높이기 위해 종료됩니다.
m7Gppp AAAA
TTTTT

두 번째 가닥 합성 E. coli DNA 중합효소 I

m7Gppp AAAA
TTTTT

m7Gppp AAAA
TTTTT

T4 DNA 중합효소

비
AAAA
TTTTT
AAAA
cDNA
TTTTT

어댑터 T4 DNA 리가아제

AAAA
TTTTT
어댑터 어댑터
AAAA
TTTTT
Machine Translated by Google

84 장 3

이 불편함. PCR을 기반으로 전체 길이의 cDNA 분자를 생성하는 방법은 4장에 나와 있

습니다. 여기서는 두 번째 가닥 합성을 위한 주형으로 사용되는 전체 길이의 첫 번째 가닥
cDNA를 캡처하는 다단계 절차가 설명되어 있습니다(그림 1). 3.28). 간단히 말해서, 첫
번째 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머는 폴리데옥시티미딜산 [폴리(dT)]입니다.

제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위도 포함하는 합성 핵산 서열의 3' 끝 부분에 있는

서열입니다. 이 이중 기능 올리고뉴클레오티드를 프라이머‑어댑터라고 합니다. 역전사효
소 반응에 이당류 트레할로스를 첨가하여 효소를 안정화시키고 고온에서 DNA 합성이 진
행되도록 합니다. mRNA의 2차 구조(가닥 내 염기쌍으로 인해)는 고온에 의해 파괴되고
완전한 분자가 합성될 가능성이 증가합니다. 또한, 역트랜스크립타제 반응 혼합물의 4
개 dNTP 중 하나는 5‑메틸‑dCTP이며, 이는 성장하는 가닥에 통합됩니다. 이중 가닥
DNA의 한 가닥(헤미메틸화)에 메틸기가 존재하면 특정 제한 엔도뉴클레아제에 의해
DNA가 절단되는 것을 방지할 수 있습니다. 이 DNA 변형은 절차의 마지막 단계에서 중
요합니다.

첫 번째 가닥이 합성된 후 비오틴은 5' 말단의 캡 뉴클레오티드와 3'의 뉴클레오티드

의 리보스 당에 화학적으로 부착됩니다.
mRNA 분자의 끝. 디옥시리보스는 이러한 조건에서 비오티닐화되지 않습니다. 다음으로,
하이브리드 RNA‑DNA 분자는 RNase I으로 처리됩니다. 이 효소는 단일 가닥 RNA를 절
단하지만, 이는 RNA를 공격하지 않습니다.
DNA 또는 DNA 가닥과 염기쌍을 이룬다. 결과적으로, 불완전한 cDNA를 갖는 mRNA
의 5' 단일 가닥 영역과 mRNA 분자의 폴리(A) 꼬리의 쌍을 이루지 않은 부분이 모두 분
해됩니다. 완전히 합성된 cDNA 가닥의 mRNA 가닥은 이 효소의 영향을 받지 않습니다.
그런 다음 샘플을 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드와 혼합합니다. 비오틴은 스트렙타비딘
에 대해 높은 친화성을 갖습니다.RNase 처리 후,

남아 있는 유일한 비오틴화된 RNA‑DNA 하이브리드 분자는 비오틴화된 캡을 가진 분자

입니다. 즉, mRNA의 5' 끝이 다음과 같기 때문에 전체 길이의 cDNA만 캡처됩니다. 염
기는 cDNA와 쌍을 이루므로 RNaseI에 의한 절단으로부터 보호되어 비오틴 분자를 남
깁니다.
첨부된. 자석을 사용하여 용액에서 비드를 분리합니다. 다음으로, 스트렙타비딘 결합
RNA‑DNA 하이브리드의 RNA는 염기쌍 RNA를 절단하고 전체 길이의 cDNA 가닥을 용
액으로 방출하는 RNase H로 가수분해됩니다.

첫 번째 가닥 cDNA의 3' 말단에 있는 서열이 알려져 있지 않기 때문에 구아닌 뉴클

레오티드의 문자열이 3' 하이드록실 말단에 추가되어 다음을 제공합니다. 를 시작하는
DNA 프라이머에 대한 상보적 서열
두 번째 cDNA 가닥의 합성. 구아닌 뉴클레오티드의 첨가는 효소 말단 데옥시뉴클레오티
딜 트랜스퍼라제에 의해 수행되며, 이는 포스포디에스테르 결합 형성에 의해 dNTP를
3'에 순차적으로 첨가합니다.
템플릿 가닥이 없는 경우 폴리뉴클레오티드의 하이드록실 말단.
말단 트랜스퍼라제 반응 혼합물에는 한 가지 유형의 dNTP만이 존재하며, 이 경우
dGTP에서는 단독중합체 꼬리가 형성됩니다. 폴리데옥시‑이구아닐산 [폴리(dG)]
테일링 후, 폴리데옥시시티딜산 [폴리(dC)]
폴리(dG) 꼬리와 염기쌍을 이루는 프라이머‑어댑터가 추가되어 두 번째 가닥 cDNA 합
성을 위해 사용 가능한 3' 하이드록실 그룹을 제공합니다.
이 올리고뉴클레오티드의 어댑터 부분에는 다음 서열이 포함되어 있습니다.
또 다른 제한 엔도뉴클레아제 부위. 두 번째 가닥 cDNA 합성은 열안정화된 DNA 중합
효소, RNase H 및 DNA 리가아제를 사용하여 고온에서 수행됩니다. 첫 번째 cDNA 가
닥의 합성과 마찬가지로,
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G 아아아아아아아아아아아아아아 TTTTTT

1 프라이머 어댑터 7 폴리(dG) 테일

G 아아아아아아아아아아아아아아 GGGGGG TTTTTT

TTTTTT

8 프라이머 어댑터
2 역전사 효소

CCCCCCC
G 아아아아아아아아아아아아아아 GGGGGG TTTTTT
TTTTTT
첫 번째 가닥 완성
DNA 중합효소
9 RNase H
G 아아아아아아아아아아아아아아 DNA 리가제
TTTTTT
불완전한 첫 번째 가닥
CCCCCCC
3 비오티닐화 GGGGGG TTTTTT

제한 엔도뉴클레아제
비 아아아아아아아아아아아아아아 비
10
G 벡터로 복제
TTTTTT

CCCCCCC
비 G 아아아아아아아아아아아아아아 비 GGGGGG TTTTTT
TTTTTT

4 RNase I

그림 3.28 전체 길이 cDNA 분자를 선택하고 클로닝하는 방법의 도식적 표현. (1) 정제

BG _ 아아아아아아 된 mRNA(파란색)는 올리고뉴클레오티드(프라이머‑어댑터)와 올리고(dT) 서열과 혼합
TTTTTT 됩니다.
및 제한 엔도뉴클레아제 부위(노란색). (2) 역전사효소는 4개의 dNTP 중 하나인 5‑
비 BG _ methyl‑dCTP(빨간색 상자)를 사용하여 첫 번째 cDNA 가닥(빨간색)을 합성합니다.
불완전한 DNA 가닥과 완전한 DNA 가닥이 모두 합성됩니다. (3) 비오틴(B로 표시된
아아아아아아 하늘색 상자)은 mRNA 분자의 말단에 부착되어 있습니다. RNaseI에 민감한 영역은
TTTTTT 다음으로 표시되어 있습니다.
대괄호.(4)RNA의 단일 가닥 세그먼트는 다음과 같이 저하됩니다.
RNase I. (5) 비오티닐화된 분자는 스트렙타비딘 코팅된 자석 비드(분홍색)에 결합
5 스트렙타비딘에 결합
합니다. RNase I 처리 후 전체 길이 RNA–DNA
하이브리드는 비오티닐화되어 있으므로 스트렙타비딘에 결합합니다.
불완전한 cDNA는 비오티닐화되지 않으며 스트렙타비딘에 결합하지도 않습니다.
BG _ 아아아아아아
TTTTTT
(6) RNase H 처리는 스트렙타비딘 결합 RNA를 분해합니다.
RNA‑DNA 하이브리드는 전체 길이의 첫 번째 가닥 cDNA 분자를 방출합니다. (7) A
폴리(dG) 꼬리는 첫 번째 cDNA 가닥의 3' 하이드록실 끝에 추가됩니다. (8) 올리고드‑
비 G 비 옥시시티딜산[올리고(dC)] 서열 및 제한 엔도뉴클레아제가 있는 올리고뉴클레오티드
(프라이머‑어댑터)
사이트(녹색)는 올리고데옥시구아닐산[올리고(dG)]꼬리 및 과 쌍을 이룹니다.
6 RNase H DNA 중합효소에 의한 두 번째 DNA 가닥의 합성을 위한 3' 수산기를 제공합니다. (9)
DNA 중합효소에 의해 두 번째 cDNA 가닥이 합성되는 동안 어떤 dNTP도 메틸화되지
않습니다. RNase H는 남아 있는 염기쌍 RNA를 제거하고, DNA 리가아제는 분해되지
않은 mRNA 조각에서 내부적으로 합성된 DNA 세그먼트를 연결합니다. 올리고(dC) 프
라이머‑어댑터 서열은 다음과 같이 작동합니다.

폴리(dG) 꼬리 끝에 있는 3' 수산기로부터 DNA 합성을 위한 주형. (10) 최종 전장

cDNA는 각 말단에 하나씩 두 개의 제한 엔도뉴클레아제로 절단되고 상보적인 확장
이 있는 벡터로 클로닝됩니다. 헤미메틸화는 복제에 사용되는 제한 엔도뉴클레아제에 의
한 절단으로부터 cDNA를 보호합니다. 왜냐하면 이 효소는 메틸화된 제한 엔도뉴클레
아제 부위를 절단할 수 없기 때문입니다.
Machine Translated by Google

86 장 3

고온은 가닥 내부 접힘을 감소시키고 전체 길이 가닥의 합성 효율을 증가시킵니다. 두 번

째 가닥 합성에 사용되는 dNTP 혼합물의 dCTP는 메틸화되지 않습니다. RNase H는 이
전 치료에서 빠져나온 모든 RNA를 제거하고, DNA 리가아제는 남은 RNA 조각으로 프라
이밍된 세그먼트를 연결합니다. 최종 제품은 양쪽 끝에 비메틸화 제한 엔도뉴클레아제 인
식 부위가 있는 전체 길이의 이중 가닥 cDNA입니다. 이러한 부위는 적절한 제한 엔도뉴
클레아제로 절단되고 상보적인 확장이 있는 벡터로 복제됩니다. 첫 번째 cDNA 가닥이 합
성되는 동안 메틸화된 뉴클레오티드가 통합되어 생성되는 헤미메틸화는 제한 엔도뉴클레
아제가 메틸화된 부위에서 절단되지 않기 때문에 클로닝에 사용되는 것과 동일한 제한 엔
도뉴클레아제 부위를 포함하는 경우 cDNA가 절단되는 것을 방지합니다.

큰 DNA 조각 복제를 위한 벡터
박테리오파지 λ 벡터
DNA 분자 클로닝에 사용되는 플라스미드 기반 벡터는 일반적으로 삽입된 DNA를 최대
10kb까지 운반합니다. 그러나 라이브러리 형성을 위해서는
더 큰 DNA 조각을 유지할 수 있으면 도움이 되는 경우가 많습니다. 이를 위해 다양한 대
용량 복제 시스템이 개발되었습니다(표 3.7).
E. coli 바이러스 (박테리오파지 또는 파지) λ는 15kb에서 20kb 범위의 삽입물을
위한 벡터가 되도록 조작되었습니다.
박테리오파지 λ가 DNA 주입을 통해 대장균을 감염시킨 후 두 가지 가능성이 존재
합니다. 이는 20분 후에 용해 주기에 들어갈 수 있습니다.
숙주 세포의 용해 및 약 100개의 파지 입자 방출.
또는 주입된 박테리오파지 λ DNA를
E. coli 염색체는 프로파지로서, 연속적인 세포 분열을 통해 양성 게스트(용원)로서 거의
무한정 유지될 수 있습니다(그림 3.29). 그러나 영양학적 또는 환경적 스트레스 조건에서
는 염색체에 통합된 박테리오파지 람다 DNA가 절단되어 용해 주기에 들어갑니다. 박테리
오파지 λ DNA의 길이는 약 50kb입니다.

이는 약 20kb가 통합 절제(I/E)에 필수적입니다.

이벤트입니다. 게놈 라이브러리를 형성하기 위해 이 중 20kb가 필요하다고 판단되었습니다.
DNA는 복제된 DNA의 20kb로 대체될 수 있으며 결과적으로는 이
재조합된 DNA 분자는 필수 용해 주기를 통해 "재조합" 박테리오파지 λ로 영속될 수 있
습니다.
박테리오파지 람다 클로닝 시스템의 기능을 이해하려면 용해 주기의 분자적 측면에
대한 이해가 필요합니다. 안

표 3.7 일반적으로 사용되는 일부 벡터 시스템의 삽입 용량

벡터 시스템 숙주 세포 삽입 용량(kb)
플라스미드 대장균 0.1~10
박테리오파지 λ λ/E. 대장 10~20
코스미드 균 대장균 35~45
포스미드 대장균 35~45
박테리오파지 P1 대장균 80–100
BAC 대장균 50~300
P1 박테리오파지 유래 인공염색체 대장균 100~300

효모 인공 염색체 누룩 100~2,000
인간 인공 염색체 배양된 인간 세포 >2,000
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재조합 DNA 기술 87

전염병

용원성 용해주기

박테리오파지
완성 생산

용해

그림 3.29 박테리오파지 λ의 수명주기. 용원성은 박테리오파지 λ 게놈(빨간색)이 숙주 염색체

(파란색)에 통합될 때 발생합니다. 그렇지 않으면 용해 주기가 시작되어 감염 후 약 20분 후
에 약 100개의 박테리오파지 입자가 세포 용해에 의해 생성 및 방출됩니다.

감염성 박테리오파지 λ는 단백질 꼬리가 있는 관형 단백질 꼬리, 섬유질 및 50kbDNA

로 포장된 단백질 머리로 구성됩니다.생산
머리와 꼬리의 조립과 DNA의 포장이 매우 중요합니다.
람다 입자의 머리 부분에 있는 DNA는 12‑염기 단일 가닥 연장을 가진 50kb 선형 분자
입니다. 5′에서
각 가닥의 끝. 이러한 확장은 서로 상보적인 시퀀스를 포함하기 때문에 응집성(cos) 말단
이라고 합니다.
꼬리를 통해 λ DNA를 E. coli 에 주입하면 cos 말단 염기쌍이 원형 DNA 분자를 형성합
니다. 용해 주기의 초기 단계 동안 원형 분자로부터의 DNA 복제는 50kb 단위의 여러 연
속 길이로 구성된 선형 형태의 람다 DNA를 생성합니다. 메르스(그림 3.30A). 새로 조립
된 각 헤드는 50‑kb 유닛 1개로 채워져 있습니다.

마지막으로 꼬리 어셈블리가 추가되어 감염성 입자가 형성됩니다(그림 3.30B). 박테리오

파지 람다 헤드의 부피는 약 50kb 정도가 적당합니다. 38kb 미만의 DNA를 헤드에 담
는다면,
Machine Translated by Google

88 장 3

비감염성 박테리오파지 입자가 생성됩니다. DNA의 52kb 이상

머리에 들어갈 수 없습니다. cos 시퀀스의 위치는 50kb입니다.
다중 길이의 선형 λ DNA와 별도로 각 머리가 정확한 양의 DNA를 받도록 보장합니다.
머리의 입구에는 이중 가닥 cos 서열을 인식하고 이를 절단하는 효소가 있습니다.

DNA가 머리에 삽입될 때 이 부위의 DNA가 삽입됩니다. 정제된 빈 헤드, 박테리오파지

λ DNA (50 kb), 및 꼬리 어셈블리를 혼합하여 감염성
반응관에서 입자가 생성됩니다.
고안된 많은 박테리오파지 λ 클로닝 벡터 중 하나는 I/E 영역 옆에 있는 두 개의
BamHI 사이트를 가지고 있습니다. 정제될 때 DNA는
이 박테리오파지를 BamHI로 절단하면 세 개의 세그먼트가 생성됩니다.
왼쪽 팔(L 영역)에는 머리와 꼬리 생성에 대한 유전 정보가 포함되어 있고 오른쪽 팔(R 영
역)에는 DNA 복제 및 세포 용해 유전자가 포함되어 있으며 중간 부분(I/ E) 단편에는 다
음에 대한 유전자가 있습니다.
통합 및 절제 과정. 이번 유전공학의 목적은

그림 3.30 용해 주기 동안 박테리오파지 λ DNA를 헤드에 포장합니다.

(A) 원형 형태의 박테리오파지 람다에서 DNA 복제는 각 단위가 약 50kb인 박테리오파지 DNA의 연속된 여러 길이(연쇄체)
를 갖는 선형 형태를 생성합니다.(B) 새로 조립된 각 헤드는 다음과 같습니다. 꼬리 어셈블리가 부착되기 전에 50‑kb λ 단위
의 DNA가 채워져 있습니다.

박테리오파지 머리 엘

cosequence

다중 길이
박테리오파지 λ
DNA

DNA

머리

꼬리

꼬리섬유
Machine Translated by Google

재조합 DNA 기술 89

프로토콜은 람다 DNA의 중간 I/E 세그먼트를 길이가 약 20kb인 클로닝된 DNA로 대체

하는 것입니다(그림 3.31). . BamHI 처리된
박테리오파지 람다 DNA 샘플은 크기 분획 및 I/E 세그먼트 제거를 통해 L 및 R 암에 대
해 농축됩니다. 소스 DNA는 두 가지 중 하나로 절단됩니다.
BamHI 또는 Sau3AI, 그리고 길이가 15~20kb인 DNA 조각은 분리되어 있습니다. 소
화된 소스 DNA와 L 및 R 영역을 결합하고 T4 DNA 리가아제와 함께 배양합니다. 그런
다음 빈 박테리오파지 머리와 꼬리 어셈블리가 추가됩니다. 이러한 조건에서 DNA의 50‑
kb 단위는 다음과 같습니다.
코스엔드가 있는 L 및 R 영역 옆에 DNA를 삽입하면 로 포장됩니다.
머리와 감염성 박테리오파지 입자가 형성됩니다. 결찰 반응으로 인한 다른 제품은 둘 중
하나이기 때문에 포장할 수 없습니다.
크거나(>52kb) 너무 작거나(<38kb) 또한, 모든 50kb DNA 분자
기능적 복제 원점이 없으면 cos end가 영속될 수 없습니다. 재조합 박테리오파지 λ는
용해 주기를 거치며 E. coli 의 성장에 의해 유지됩니다 .

박테리오파지 λ라이브러리에서 목적 유전자를 운반하는 재조합 박테리오파지를 확

인하기 위해 각각의 개별 용해 구역(플라크)을 확인합니다.

박테리오파지 λ 소스 DNA 그림 3.31 박테리오파지 λ 클로닝 시스템. 박테

밤HI 밤HI 밤HI 밤HI
리오파지 λ는 I/E 옆에 있는 두 개의 BamHI 사
이트를 갖도록 설계되었습니다.
코사인
지역. 클로닝을 위해 소스 DNA를 BamHI로 절
엘 아르 자형

단하고 크기별로 분류합니다.

즉 코사인
약 15~20kb 규모의 조각을 분리하려면
긴. 박테리오파지 λ DNA도 BamHI 및 크기 분
밤HI 밤HI 별을 통해 절단됩니다.
I/E 세그먼트를 제거합니다. L 및 R
팔, 게다가 15~20kb 소스 DNA까지
분자는 T4 DNA 리가제와 혼합됩니다. 결찰 반응
즉
은 결찰된 소스 DNA만, 결합된 L 및 R 팔만, 측
면에 소스 DNA 분자가 있는 분자를 포함하여
엘
다양한 DNA 분자를 생성합니다.
아르 자형

분류 하다 분류 하다 L과 R 팔에 의해. 마지막 분자는 박테리오파지

헤드에 포장됩니다.
버리다 유지하다 유지하다 버리다 시험관에서는 꼬리 어셈블리를 추가한 후 감염성
입자가 형성됩니다. 재조합된 박테리오파지 λ는
E. coli의 감염에 의해 영속됩니다 . 일부는
엘 50‑kb
즉
소스 DNA 결찰 제품은 헤드에 포장될 수 있지만
아르 자형
이 DNA 이후
15~20kb 복제의 기능적 기원과 cos end가 모두 부족하
므로 영속될 수 없습니다. 다른 결찰 제품은 너
무 작거나 너무 커서 포장할 수 없습니다.
T4 DNA 리가아제
일부 박테리오파지 λ 클로닝 시스템(여기에는 표
시되지 않음)에서는 파지 헤드가 일반적으로 채
워지는 방식을 모방하기 위해 연쇄체 형성을 선
호하도록 결찰 조건을 설정하여 높은 포장 효율
성을 달성합니다.
팔만 엘 아르 자형 소스 DNA만

체외 포장

감염 E. 대장균

플라크
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90 장 3

그 중 재조합 박테리오파지가 포함된 박테리오파지를 매트릭스 위로 올려 DNA 프로브나

항체로 스크리닝합니다. DNA 혼성화의 경우 박테리오파지 단백질이 제거되고 DNA가 변
성되어 매트릭스에 결합됩니다. 면역학적 분석의 경우, 박테리오파지 및 박테리아 단백질과
함께 용균 주기 동안 합성된 복제된 유전자에 의해 암호화된 단백질은 플라크와 함께 전달
되어 하위에 순차적으로 결합됩니다. 매트릭스. 매트릭스에 있는 사이트를 기준으로

긍정적인 반응을 보이면 원본 플레이트에 있는 해당 플라크가 다음과 같습니다.

E. coli 에서 개별적으로 배양되는 선별된 재조합 박테리오파지의 공급원을 제공하기 위해
계대배양됩니다 .

코스미드
코스미드라고 불리는 클로닝 벡터는 복제된 DNA의 약 45kb를 운반할 수 있습니다.
E. coli 에서는 플라스미드로 유지됩니다 . 코스미드는 플라스미드와 박테리오파지 λ 벡터
의 특성을 결합합니다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 코스미드 pLFR‑5에는 박테리오파
지 λ flanking의 두 cos 사이트(cos 말단)가 있습니다.
ScaI 제한 엔도뉴클레아제 사이트, 6개의 고유한 다중 복제 사이트
인식 사이트(HindIII, PstI, SalI, BamHI, SmaI 및 EcoRI)
DNA 복제 및 Tetr 유전자(그림 3.32). 대략 길이가 약 45kb인 DNA 조각은 소스 DNA
의 부분 BamHI 소화를 통해 자당 밀도 구배 원심분리를 통해 정제됩니다. (그림 3.32).

pLFR‑5 DNA(~6kb)는 처음에는 ScaI로 절단된 다음 BamHI로 절단됩니다.

마지막 두 개의 DNA 샘플을 혼합하고 결찰합니다. 결찰된 제품 중 일부에는 두 조각 사이
에 ~45kb DNA 조각이 삽입되어 있습니다.
이는 pLFR‑5 DNA의 소화로부터 유래됩니다. 이 분자들은 길이가 약 50kb이고 서로 약
50kb 떨어진 코스코스 서열을 가지고 있습니다.
결과적으로, 이러한 DNA 구조물은 시험관 내에서 박테리오파지 람다 헤드에 성공적으로
포장되었습니다. DNA가 삽입되지 않은 재구성된 pLFR‑5는 포장되지 않습니다. 박테리오
파지 입자의 조립 후 DNA는 다음과 같습니다.
E. coli 에 감염되어 전달됩니다 (그림 3.32). 일단 숙주 세포 내부로 들어가면, 체외 포장
중에 절단된 코엔드, 염기쌍 및
선형 DNA가 원형화되도록 하십시오. 이 원형 형태는 안정적이며 복제된 DNA는 벡터 DNA
가 플라스미드 기능의 완전한 세트를 포함하고 있기 때문에 플라스미드 삽입 DNA 구조로
유지됩니다.
Tetr 유전자는 코스미드를 운반하는 콜로니가 테트라사이클린의 존재 하에서 성장하도록
허용합니다. 형질전환되지 않은 세포는 테트라사이클린에 민감하여 죽습니다.
Afosmid는 삽입물을 최대 40kb까지 전달하는 cosmid 벡터 종류입니다.
시험관 내 박테리오파지 λ포장을 위한 DNA 및 cos 사이트.차이점
코스미드와 포스미드 사이의 차이점은 포스미드의 복제 기원이 E. coli F 인자(성 플라스미
드)에서 파생된다는 것입니다. 따라서 이름이 붙여졌습니다. 포스미드의 장점은 매우 안정적
인 단일 복사 벡터인 반면, 코스미드는 더 높은 복사 수로 유지되어 종종 삽입 DNA 부분의
삭제 또는 재배열로 이어진다는 것입니다.

다른 E. coli 박테리오파지가 벡터 생성에 사용되었습니다. 예를 들어, P1 박테리오파

지의 게놈은 길이가 115kb입니다. P1 벡터
시스템은 삽입된 DNA의 80~100kb를 운반할 수 있습니다. 사용의 장점
박테리오파지에서 유래된 코스미드 및 기타 벡터는 두 가지입니다. 첫째, 이들 벡터의 용량
은 플라스미드의 용량보다 크기 때문에 유전자 클러스터 및 큰 유전자를 클로닝할 수 있습
니다. 둘째, 클로닝 차량에 더 큰 삽입물이 있다는 것은 특정 유전자에 대해 스크리닝해야
하는 게놈 라이브러리의 클론이 더 적다는 것을 의미합니다.
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코사인
벨크로
원천
밤HI 코사인
DNA

테트 r 유전자

또는

BamHI;
벨크로 분별하다
코사인 코사인
크기 ~45 kb
밤HI

밤HI

T4 DNA 리가아제
코사인 코사인

50kb

시험관 파지 그림 3.32 코스미드 복제 시스템. 코스미드는 E. coli에서

포장 코스미드가 플라스미드로 유지될 수 있도록 하는 E. coli
복제 기원 (ori) 을 포함합니다 . 2개의 손상되지 않은 cos
왜냐하면 끝 사이트가 밀접하게 측면에 붙어 있으며 고유한 사이트입니
다.
머리 ScaI 사이트는 근처에 있는 독특한 BamHI 사이트이지만,
외부, cos 사이트 중 하나; 그리고 테트라
유전자. 원본 DNA는 BamHI로 절단됩니다.
50kb·패키지 약 45kb 길이의 분자를 분리하기 위해 크기별로 분류했습
벡터 DNA
니다. 플라스미드
ScaI과 BamHI로 DNA를 절단합니다.
꼬리
DNA 샘플을 혼합하고 T4 DNA 리가제로 처리합니다. 연결
후, 결합된 DNA 분자 중 일부는 45‑kb를 갖게 됩니다.

꼬리섬유 BamHI 사이트에 삽입된 DNA 조각

플라스미드; 이런 일이 발생하면 두 cosequences는 약
50kb만큼 떨어져 있습니다.
분자는 박테리오파지로 포장됩니다.
시험관 내에서 λ 머리가 있고, 꼬리 집합체를 추가한 후에 감
염성 입자가 형성됩니다. 감염성 박테리오파지 λ는 cos
전염병 확장을 갖는 선형화된 DNA 분자를 E. coli에 전달합니다.
대장균 숙주 세포에 들어간 후 cos는 염기쌍을 말단하고 숙주 세포
의 DNA 리가아제는 닉을 밀봉합니다.
테트르 유전자
코사인

플라스미드 또는
이런 방식으로 생성된 원형 DNA 분자는 숙주 세포에서 플라
형태
스미드로 지속됩니다. 이 경우, 형질전환된 세포는 다음과 같
이 나타날 수 있습니다.
항생제인 테트라사이클린에 내성이 있기 때문에 확인되었습
니다.
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92 장 3

표 3.8 다양한 유기체 및 클로닝 벡터에 대한 게놈 라이브러리의 모든 DNA 영역을 표현할 확률 99%에 필요한 클론 수 추정

아니요. 클론
유기체 게놈 크기(bp)
pBr322(5kb) 박테리오파지 λ(17kb) 코스미드(35kb) BAC(150kb)
대장균 4.6× 106 4,234 1,243 602 138
누룩 1.23×107 11,326 3,329 1,616 375
초파리 1.2×108 110,529 32,501 15,787 3,681
쌀 5.7× 108 525,589 154,521 75,009 17,497
인간 3.3×109 3,090,475 898,392 434,053 101,258
개구리 2.3× 1010 19,315,480 6,438,493 2,971,610 708,822

클로닝 벡터의 경우 괄호 안의 크기는 삽입 DNA의 평균 크기입니다.

고용량 세균 벡터 시스템
매우 큰 삽입물(>100kb)을 전달하는 벡터 시스템은 다음 작업에 도움이 됩니다.
복잡한 진핵생물 게놈 분석. 예를 들어, 이러한 유형의
벡터 시스템은 게놈 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하고 단일 삽입물에 하나 이상의 온전
한 유전자를 운반하는 데 필수적입니다.
작은 삽입 라이브러리와 대조적으로, 큰 삽입 게놈 라이브러리는 유기체의 모든 유전 물질
을 더 적게 포함할 가능성이 더 높습니다.
유지할 클론입니다(표 3.8). P1 박테리오파지 클로닝 시스템을 기반으로 하는 낮은 카피
수 E. coli 플라스미드 벡터는 길이가 100kb에서 300kb까지인 DNA 분자를 클로닝하기
위해 고안되었습니다. DNA
이 시스템의 삽입 벡터 구성체를 박테리오파지 P1 유래 인공 염색체라고 합니다. 유사하
게, 세포당 1개 또는 2개의 카피로 존재하는 E. coli 의 F 플라스미드(F‑인자 레플리콘, 성
플라스미드 또는 생식력 플라스미드)가 pUC 벡터의 lacZ' 선택 시스템 과 함께 사용되었
습니다 . 길이가 50kb에서 300kb까지인 DNA 삽입물을 운반하는 매우 안정적인 클로닝
벡터를 구축합니다. F‑플라스미드 기반 DNA 삽입 벡터

광범위하게 사용되는 구조를 BAC라고 합니다.

원핵생물의 유전적 변형
DNA를 대장균 으로 옮기기
형질전환은 유리 DNA를 박테리아 세포에 도입하는 과정입니다.
재조합 DNA 연구를 위한 주요 숙주 세포인 E. coli의 경우, 플라스미드 DNA의 흡수는 일
반적으로 중간 로그 단계 세포를 처리하여 달성됩니다.
얼음처럼 차가운 염화칼슘(CaCl2 )을 넣은 다음 고온(42°C)에 2분간 노출시킵니다. 이
치료법은 DNA 분자가 세포질로 들어갈 수 있도록 세포벽에 일시적인 구멍을 만듭니다. 이
방법은 약 1%의 최대 변환 빈도를 갖습니다.

1,000개 셀당 셀(즉, 10 3)입니다. 형질전환 효율은 온전한 플라스미드 DNA 마이크로

그램당 약 107 ~108개의 형질전환된 콜로니입니다. 비록 100% 형질전환 빈도가 이상적이
기는 하지만 선택은 가능합니다.
플라스미드 형질전환 세포를 쉽게 식별할 수 있는 방식은 낮은 형질전환 빈도의 단점을 극
복합니다.
박테리아의 경우 능력은 자연적으로 발생하며 어떤 경우에는 특정 성장 배지나 성장 조건
을 사용하여 향상될 수 있습니다. 이 박테리아는 일반적으로 쉽게 변형됩니다. 화학적으로
유발된 능력에 반응하지 않거나 자연적으로 능력이 없는 박테리아에 대해서는 다른 DNA
전달 시스템을 사용해야 합니다.
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재조합 DNA 기술 93

전기천공
유리 DNA의 흡수는 DNA가 있는 상태에서 박테리아에 고전압 전기장을 가함으로써 유도
될 수 있습니다. 이 절차를 전기천공법(electroporation)이라고 하며, 이는 "전기장 매개
막 투과화"라는 설명 문구를 줄인 용어입니다.

전기천공법 프로토콜은 다양한 박테리아 종에 따라 다릅니다. E. coli 의 경우 , 세포(~50 마

이크로리터)와 DNA를 전극(그림 3.33A)이 장착된 챔버에 넣고 약 25 마이크로 패럿, ±2.5
킬로볼트 및 ±200°의 단일 펄스를 가합니다. 옴은 약 4.6밀리초 동안 관리됩니다. 이 처리
는 작은 플라스미드(~3kb)의 경우 DNA 마이크로그램당 109개의 형질전환 효율을, 큰 플
라스미드(~136kb)의 경우 106개의 형질전환 효율을 제공합니다.유사한 조건 BAC 벡터
DNA를 도입하는 데 사용됩니다.

대장균 에 . 따라서 전기천공법은 대장균을 형질전환하는 효과적인 방법입니다.

100kb보다 긴 삽입물을 포함하는 플라스미드를 사용합니다.
거의 모든 박테리아 종에 대해 적절한 전기천공 조건 세트를 찾을 수 있으며, 이 절차는 다양
한 유형의 박테리아를 변환하는 표준이 되었습니다.

전기 천공 중 DNA 흡수 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다(그림

3.33B). 이는 대략적으로 추론되었습니다. 화학적으로 유도된 변형을 설명하면, 전기 충격
의 결과로 세포벽에 일시적인 기공이 형성되고, 접촉 후에는 세포벽에 일시적인 기공이 형성된
다는 것입니다.
세포막의 지질 이중층, DNA가 세포 안으로 들어갑니다.

그림 3.33 전기천공. (A) 두 전극 사이에 세포 현탁액이 있는 전기천공 큐벳. (B) (1) 고전압 전기장(HVEF) 펄스를 투여하기
전 전기천공 큐벳에 현탁된 세포(노란색)와 DNA(빨간색). (2) HVEF 펄스는 DNA가 세포 안으로 들어갈 수 있도록 세포에
구멍(점선)을 유도합니다.(3)HVEF 펄스 후 일부 세포는 외래성 에너지를 획득합니다. DNA 및 HVEF에 의해 유도된 개구부
가 다시 밀봉됩니다.

큐벳
셀
보류

전극 전극

123
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94 장 3

동사 변화
일부 박테리아의 경우, 한 균주에서 다른 균주로 플라스미드를 전달하는 자연 시스템을
사용하여 플라스미드 삽입 DNA 구조물을 기증자 세포에서 쉽게 형질전환되지 않는 수
용자 세포로 운반했습니다.
일부 플라스미드는 세포 간 접합을 형성하도록 유전적으로 갖추어져 있습니다.
이를 통해 플라스미드 DNA가 한 세포에서 다른 세포로 전달됩니다.
기증자 세포와 수용자 세포 사이의 효과적인 접촉은 접합 기능을 암호화하는 플라스미드
유전자에 달려 있습니다. 더욱이, DNA의 기계적 전달에는 플라스미드 유전자가 필요합
니다. 인코딩 동원
기능. 재조합 DNA에 사용되는 대부분의 플라스미드
연구에는 활용 기능이 부족하여 통과되지 않습니다.
접합을 통해 수용자 세포. 그러나 일부 비접합 플라스미드 클로닝 벡터는 접합 기능이 동
일한 세포에 두 번째 플라스미드가 공급되는 경우 동원되어 전달될 수 있습니다.

동원 가능한 플라스미드 클로닝 벡터를 운반하는 박테리아 세포에 접합 기능을 가진 플라

스미드를 도입하면, 다른 수단으로는 형질전환이 어려운 수용 세포에 플라스미드 클로닝
벡터를 전달할 수 있습니다.

이 절차의 일반적인 실험 프로토콜은 세 가지 균주를 함께 혼합하는 것을 수반합니

다. 세포가 서로 가까이 있을 때, 동원 가능한 접합 플라스미드는 동원 가능한 플라스미
드 클로닝 벡터를 사용하여 세포로 자가 전달될 수 있습니다. 그런 다음 접합 플라스미드
의 도움으로 플라스미드 클로닝 벡터가 표적 수용 세포로 전달됩니다. 플라스미드 전달의
모든 가능한 조합은

그림 3.34 삼자 교배. 보조 세포는 Tetr 유전자가 있는 접합형 동원 플라스미드를 기증자 세포로

자가 전달합니다. 보조 세포의 플라스미드는 기증자 세포의 비접합, 동원 가능한 플라스미드에 대
한 접합 기능을 제공합니다. 이 플라스미드는 카나마이신 저항성(Kanr ) 유전자를 운반하고 후자
플라스미드를 수용 세포로 수송할 수 있습니다. 수혜자 세포와는 달리 도우미도 기증자도 아닙니
다.
세포는 최소한의 배지에서도 자랄 수 있고, 카나마이신에 내성이 있고 테트라사이클린에 민감합니
다. 선택 전략은 최소 배지에서 성장할 수 있는 세포를 식별합니다. 이 예에서 클로닝 벡터는 E에서
전송됩니다. 대장균 에
P. 푸티다. 표시되지는 않았지만 각 플라스미드에는 복제 원점이 있습니다. 기증자 세포의 플라스미
드는 수용자 세포에서 복제됩니다.

대장균 대장균 P. 푸티다

테트르 유전자 테트르 유전자

귀찮게 할 수 있다 귀찮게 할 수 있다

돕는 사람 기증자 받는 사람
결합형, 동원형 동원 가능한 플라스미드 옮겨진 플라스미드
플라스미드 최소한의 성장은 없습니다 최소한의 성장
최소한의 성장은 없습니다 중간 중간
중간
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재조합 DNA 기술 95

그러나 균주와 플라스미드의 유전적 특징은 클로닝 벡터를 받는 표적 수용 세포를 선택하도

록 설계되었습니다. 예를 들어, 한 가지 가능한 선택 절차는 Tetr 유전자가 있는 결합형 동
원 플라스미드를 유지 하고 최소 성장 배지에서는 자랄 수 없는 보조 세포 (E. coli) 를 사용
합니다. 최소 성장 배지에서도 성장할 수 없고 카나마이신 저항성 유전자를 가지고 있는 비접
합, 동원 가능한 플라스미드 클로닝 벡터를 운반하는 기증자 세포(대장균) 및 수혜자

최소 성장 배지에서 성장할 수 있는 세포 (Pseudomonas putida) 는 호환되지 않는 플라

스미드가 없으며 테트라사이클린과 카나마이신 모두에 민감합니다.
(그림 3.34). 접합이 발생한 후, 세포는 카나마이신이 포함된 최소 성장 배지로 옮겨지기 전
에 항생제가 없는 완전 성장 배지에서 잠시 성장됩니다.

성장 조건을 획득한 표적화된 수용자 세포만

플라스미드 클로닝 벡터가 성장할 수 있습니다. 헬퍼 세포나 기증자 세포 모두 최소 배지에서
는 성장할 수 없으며, 기증자 세포로부터 플라스미드를 받지 못한 수용자 세포는 카나마이
신의 존재 하에서 성장할 수 없습니다.
표적화된 수용자 세포는 두 가지 유형의 플라스미드를 모두 받을 수 있습니다. 그러나 이 드
문 현상은 테트라사이클린과 카나마이신이 모두 포함된 최소 배지에 복제 도금하여 감지할
수 있습니다. 두 가지 모두가 있는 상태에서 형성된 콜로니
항생제는 두 개의 서로 다른 플라스미드를 획득하고, 오직 다음의 경우에만 성장하는 플라스미드를 획득합니다.
카나마이신은 클로닝 벡터를 가지고 있습니다. 플라스미드의 전달 이후
DNA는 세 가지 박테리아 균주 사이의 접합이 필요하며, 그 과정은 다음과 같습니다.
삼자 교배로 지정되었습니다.

요약

재조합 DNA 기술은 다음의 배터리로 구성됩니다.

아르 자형
한 유기체의 DNA 세그먼트를 벡터(종종 박테리아 플라스미드)에 삽입
하고 숙주 세포에서 삽입 DNA‑벡터 DNA 조합을 영속시키는 데 사용되는
실험 절차입니다. 대량의 삽입물(복제됨)
DNA는 필요할 때 검색할 수 있습니다. 프로세스는 검색되지 않습니다.
II형 제한 엔도뉴클레아제 없이 가능합니다.
DNA 분자를 개별 크기의 조각으로 재현 가능하게 절단합니다. 이러한 효
소는 DNA 내의 특정 서열에 결합합니다.
분자와 인식 부위에서 각 가닥의 대칭적으로 절단된 포스포디에스테르 결
합. 게다가, 많은 다른 것들도
T4 DNA 리가제 및 DNA 폴리머라제와 같은 효소는 유전자 복제에 중요합
니다.
대표적인 유전자 복제 실험에는 여러 단계가 있습니다. (1) 목적 유전자
를 포함하는 유기체로부터 DNA를 분리하고 제한효소로 절단합니다. (2)
DNA 클로닝 벡터는 소스 DNA를 소화하는 데 사용된 것과 동일한 제한
엔도뉴클레아제로 절단됩니다. 클로닝 벡터에는 이러한 제한 엔도뉴클레
아제 부위 중 하나만 있습니다. (3) 두 개의 DNA 샘플을 T4 DNA 리가제
와 혼합하고, DNA 가닥의 끝 부분에 있는 포스포디에스테르 결합의 효소
적 형성에 의해 벡터 DNA와 소스 유기체의 DNA를 포함한 DNA 분자의
다양한 조합이 생성됩니다. (4) 숙주 세포(보통 E. coli) 는 리가제 반응에
서 나온 DNA 분자로 형질전환되는데, 이는 벡터 삽입 DNA 구성물을 운
반하는 일부 세포를 생성합니다. 벡터에는 DNA 서열(복제의 기원)이 있기
때문에
CaCl2–열충격치료, 전기천공법 또는 기타 방법.
플라스미드의 접합 및 동원 기능은 플라스미드‑유전자 구조를 쉽게 변형되
지 않는 박테리아에 전달하기 위해 일부 경우에 사용됩니다.
마지막으로, 벡터 삽입 DNA 구조를 사용하여 세포를 식별하는 데 선
택 계획을 사용할 수 있습니다. 형질전환된 세포는 특정 항생제에 대한 내
성을 테스트하거나 특정 색상의 콜로니를 관찰하여 형질전환되지 않은 세
포와 구별됩니다. 특정 클로닝된 표적 유전자를 가진 세포는 동종 또는 이
종 프로브와의 DNA 혼성화, 암호화된 재조합 단백질의 면역학적 결정, 특
정 효소 활성의 존재 또는 기능적(유전적) 보완을 통해 식별됩니다. 완전한
유전자를 클로닝할 가능성은 제한 엔도뉴클레아제로 소스 DNA를 부분적
으로 소화하고 중복되는 서열로 구성된 클론 라이브러리를 형성함으로써
증가합니다.
전체 게놈. 박테리오파지 람다, 박테리오파지 P1, P1 유래 플라스미드
(P1 인공 염색체) 및 F 플라스미드(BAC)를 기반으로 하는 벡터는 큰 조각
의 DNA를 운반하고 원핵 및 진핵 생물 모두의 게놈 라이브러리를 구축하
기 위해 개발되었습니다. .
진핵생물 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 얻으려면,
정제된 mRNA는 역전사효소의 주형으로 사용되어 cDNA 가닥을 합성합
니다. 차례로 이 가닥은 DNA 중합효소가 두 번째 cDNA 가닥을 생성하
는 주형 역할을 합니다. 효소 처리 후 이중 가닥 cDNA를 벡터로 클로닝할
수 있습니다. 다단계 전략에는 다음이 있습니다.

숙주 세포에서 복제가 가능해지면 전체 구조가 영속됩니다. E. coli 에 의 전체 길이만 나올 가능성을 높이기 위해 고안되었습니다.
한 DNA 흡수는 다음에 의해 촉진됩니다. cDNA 분자가 합성되고 복제됩니다.
Machine Translated by Google
96 장 3
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Machine Translated by Google

재조합 DNA 기술 97

질문 검토

1. II형 제한 엔도뉴클레아제란 무엇입니까? 왜 그러한가요? 6. 유전자 클로닝 실험에서 절단된 플라스미드 DNA를 연결 단계 이전에 알칼리성
재조합 DNA 기술에 중요한가요? 포스파타제로 처리하는 경우가 많은 이유는 무엇입니까?

2. 플라스미드 pCEL1의 원형 이중 가닥 DNA가 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및

이들의 조합에 의해 소화될 때 다음 밴드(길이는 킬로염기 쌍 단위)가 관찰됩니다: 7. 재조합 플라스미드가 대장균 과 같은 그람 음성 박테리아에 도입될 수 있는 몇
EcoRI, 6.0; BamHI, 6.0; HindIII, 가지 다른 방법을 제안하십시오 .

6.0; HaeII, 3.0, 2.0,및 1.0; EcoRI및 HaeII, 2.0및 1.0; EcoRI
HindIII, 3.5 및 2.5, EcoRI 및 BamHI, 4.5 및 1.5 8. E. coli 의 라이브러리 내에서 복제된 표적 유전자를 검출하는 데 사용되는 몇 가
BamHI and HindIII, 5.0 and 1.0; BamHI and HaeII, 3.0, 1.5, 1.0,
지 전략을 개략적으로 설명합니다 . 각 분석 유형에 대해 어떤 조건을 충족해야 합니
and 0.5; and HindIII and HaeII, 3.0, 1.5, 1.0, and 0.5. Construct
까?

이 정보가 포함된 제한 엔도뉴클레아제 효소 사이트 맵. 9. cDNA 라이브러리란 무엇인가요?

10. 플라스미드, 박테리오파지 λ, 코스미드 또는 BAC를 클로닝 벡터로 사용하는

3. 플라스미드 pBR322가 클로닝 벡터로 어떻게 사용되는지 설명하십시오. 이유는 무엇입니까?
특별한 기능은 무엇인가요?
11.IIS 제한 유형의 일반적인 작업 모드는 무엇입니까?
4. pUC 복제 시스템의 주요 특징을 설명하십시오. 엔도뉴클레아제?

5. 원핵 유기체의 게놈 라이브러리는 종종 Sau3AI의 부분 다이제스트 제품을 복제 12.복제 도금이란 무엇입니까? 이에 대한 기본 방법론의 개요

하여 구성됩니다. 복제 도금.
게놈 DNA를 벡터의 BamHI 사이트에 삽입합니다.
13. 포스미드는 무엇인가요?
ㅏ. 이 실험에서 두 가지 다른 효소를 사용하는 이유는 무엇입니까?
말? 14. 삼자 교배란 무엇입니까?
b. 부분 소화란 무엇이며 어떻게 수행됩니까? 15. cDNA 합성 과정에서 RNase H의 역할은 무엇인가요?
씨. 왜 부분 소화가 건설에 자주 사용됩니까?
게놈 라이브러리?
Machine Translated by Google

화학합성,
DnA의 화학적 합성
포스포라미다이트 방법
증폭 및
합성된 올리고뉴클레오티드의 용도
폴리 메라 제 연쇠 반응
전장 cDNA의 PCR 증폭
DnA의 서열분석
PCR에 의한 유전자 합성
DNA 서열 분석 기술
디데옥시뉴클레오티드 절차
DNA 시퀀싱
프라이머 워킹
파이로시퀀싱
가역 체인을 사용한 시퀀싱
터미네이터
결찰에 의한 시퀀싱
연구에 미치는 영향. 새로운 프로토콜은 새로운 실험을 낳고,
대규모 DNA 시퀀싱 과학의한때
모든실행하기
영역에서어려웠던
기술적 실험실
진보는절차가
심오한훨씬
영향을 미칩니다. 분자 생명공학의 본
더 쉬워졌습니다.
Shotgun 복제 전략
질은 광범위한 기술 개발에 뿌리를 두고 있으며, 그 중 다수는 일반화되었으며 크고 작은
게놈 시퀀싱
순환 배열 시퀀싱
연구 시설 모두에서 접근 가능해졌습니다. 예를 들어 DNA 분자를 화학적으로 합성하고,
요약
중합효소연쇄반응(PCR)을 이용해 DNA를 증폭하고, DNA의 염기서열을 얻는 것이 이제
는 표준이 됐다. 이러한 각 절차는 DNA 구조와 DNA 복제 메커니즘에 대한 기본 연구에서
참고자료
파생됩니다. 더욱이, 이러한 실험 방법은 복제된 유전자를 분리하고, 특성화하고, 발현하
질문 검토 는 데 필수적입니다.

DnA의 화학적 합성
특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 가닥을 쉽고 저렴하며 신속하게 화학적으로 합성하
는 능력은 분자 복제 및 DNA 특성화 방법론에 크게 기여해 왔습니다. 화학적으로 합성된
단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 전체 유전자 조립, 특정 DNA 서열 증폭, 복제된
유전자에 돌연변이 도입, 유전자 라이브러리 스크리닝, DNA 서열 분석 및 유전자 클로닝
촉진에 사용됩니다.

DNA 합성을 위한 화학 반응을 자동화하는 기계(DNA 합성기 또는 "유전자 기계")

는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(50개 이하의 뉴클레오티드) 생산을 다소 일상적인 절
차로 만들었습니다. 일반적으로 DNA 합성기는 특정 뉴클레오티드와 각 연속 뉴클레오
티드를 성장하는 사슬에 연결하는 데 필요한 시약을 올바른 순서로 도입하도록 프로그
래밍된 일련의 밸브와 펌프로 구성됩니다. 화학적 DNA 합성은 DNA 합성의 생물학적
방향을 따르지 않습니다. 오히려 화학적 과정 동안 들어오는 각 뉴클레오티드는 성장하
는 사슬의 5' 수산기 말단에 결합됩니다. 모든 반응은 단일 단계에서 연속적으로 수행됩
니다.

98
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DNA의 화학적 합성, 증폭, 서열분석 99

반응 컬럼, 각 반응 기간과 세척 단계는 모두 컴퓨터로 제어됩니다.

포스포라미다이트 방법
현재 화학적 DNA 합성의 포스포르아미다이트 방법이 선택 절차입니다. 반응 컬럼에 도입
되기 전에 아데닌, 구아닌 및 시토신 염기의 아미노 그룹은 각각 벤조일, 이소부티릴 및 벤
조일 그룹을 첨가하여 유도체화되어 사슬 성장 중 바람직하지 않은 부반응을 방지합니
다. 티민은 아미노기가 부족하기 때문에 처리되지 않습니다. 고체상 합성, 즉 성장하는
DNA 가닥을 고체 지지체에 부착하는 방법이 사용되어 모든 DNA 가닥이

그림 4.1 DNA 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 흐름도. n 이후

커플링 반응(사이클)을 통해 n + 1개의 뉴클레오티드 로 구성된 단일 가닥 DNA 조각이 생성됩니
다.

먼저 연결하기
뉴클레오티드를
열

세탁

탈삼중화

세탁

풀이 활성화 및
올리고뉴클레오티드 커플 링 n 사이클
열에서

세탁

캡핑
정화
올리고뉴클레오티드

산화
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100 제 4 장

DMT 영형 반응은 하나의 반응 용기에서 수행될 수 있고, 한 반응 단계의 시약은 다음 단계의 시약이
추가되기 전에 쉽게 세척될 수 있으며, 반응을 완료하기 위해 시약을 과량으로 사용할 수
CH2 베이스 1 초기의
뉴클레오시드
있습니다.
영형

시간 시간
DNA의 화학적 합성은 다단계 과정이다(그림 4.1). 합성된 가닥의 3' 말단 뉴클레오
시간 시간

영형 시간 티드가 될 초기 뉴클레오시드(염기와 당만)는 3' 하이드록실 말단에 의해 스페이서 분자에

부착되고, 스페이서 분자는 불활성 지지체에 공유결합으로 부착됩니다. CPG(Controlled‑
콜로라도 Pore Glass) 비드(균일한 크기의 기공을 가진 유리 비드)인 경우가 많습니다(그림 4.2).
첫 번째 뉴클레오시드의 5' 말단에는 디메톡시트리틸(DMT) 그룹이 부착되어 5' 결합을 방
(CH2 )2
지합니다.
콜로라도
두 번째 뉴클레오티드를 첨가하기 전에 수산기가 비특이적으로 반응하는 것을 방지합니
NH 다. 성장하는 사슬에 추가되는 각 뉴클레오티드에는 5' DMT 보호 그룹과 β‑시아노에틸
(CH2CH2CN) 그룹에 의해 보호되는 3' 포스파이트 그룹에 부착된 디이소프로필아민 그
(CH2 )6 룹도 있습니다(그림 4.3 ) . 이 분자 집합체를 포스포라미다이트(phosphoramidite)라
NH
고 합니다.
스페이서 첫 번째 뉴클레오시드가 CPG 비드에 결합된 후 주기가 시작됩니다.
콜로라도 먼저, 반응 컬럼을 무수 시약(예: 아세토니트릴)으로 광범위하게 세척하여 물과 존재할 수
있는 친핵체를 제거합니다. 아세토니트릴을 제거하기 위해 컬럼을 아르곤으로 세척합니다.
영형

(CH2 )2
다음으로, 트리클로로아세트산(TCA)으로 처리하여 부착된 뉴클레오시드에서 5' DMT
그룹을 제거하여 반응성 5' 하이드록실 그룹을 생성합니다(그림 4.4). 이 탈트리틸화 단
영형 계 후, 반응 컬럼을 아세토니트릴로 세척하여 TCA를 제거한 다음 아르곤으로 세척하여 아
세토니트릴을 제거합니다. 기계는 활성화 및 커플링 단계를 위해 다음으로 처방된 염기(포
(CH2 )3 스포르아미다이트)와 테트라졸을 동시에 도입하도록 프로그래밍되어 있습니다. 테트라졸
그리고
은 포스포라미다이트를 활성화하여 3'이 되도록 합니다.

포스파이트는 초기 뉴클레오사이드의 5' 하이드록실 그룹과 공유 결합을 형성합니다(그

CPG 비드
림 4.5). 통합되지 않은 포스포르아미다이트와 테트라졸은 컬럼을 아르곤으로 세척하여
제거됩니다.
그림 4.2 DNA 가닥의 화학적 합성을 위한 시 지지체에 결합된 뉴클레오시드 모두가 첫 번째 커플링 반응 동안 포스‑포라미다이트
작 복합체. 에 연결되지는 않기 때문에, 연결되지 않은 잔기가 다음 주기 동안 다음 뉴클레오티드에 연
초기 뉴클레오사이드는 데옥시리보스 잔기의
5' 하이드록실 그룹에 부착된 보호 DMT 그 결되는 것을 방지해야 합니다. 이를 위해 아세트산 무수물과 디메틸아미노피리딘을 첨가하
룹과 데옥시리보스의 3' 탄소의 하이드록실 여 반응하지 않은 5' 수산기를 아세틸화합니다(그림 4.6). 이 상한 단계라면
그룹에 부착된 스페이서 분자를 가지고 있습
니다. 스페이서 유닛은 일반적으로 CPG 비드
인 견고한 지지대에 부착됩니다.
그림 4.3 포스포르아미다이트의 구조. 포스포라미디트는 DNA 가닥의 화학적 합성에 사용되는
4가지 염기(A, C, G, T) 각각에 사용할 수 있습니다. 디이소프로필아민 그룹은 뉴클레오사이드
의 3' 포스파이트 그룹에 부착됩니다. β‑시아노에틸 그룹은 3' 포스파이트 그룹을 보호하고,
DMT 그룹은 디옥시리보스 당의 5' 하이드록실 그룹에 결합되어 있습니다.

DMT O

CH2 베이스

영형 뉴클레오시드
시간 시간

시간 시간

영형 시간

시간 CH2
메틸화 피 씨
3'‑포스파이트 영형
N CH2 디이소프로필아민
그룹 나
시간

씨 그룹

CH2 CH2
Machine Translated by Google

DMT 영형 에게

CH2 베이스 1 CH2 베이스 1

영형 영형

시간 시간 시간 시간

시간 시간 시간 시간
탈삼중화
영형 시간 영형 시간
TCA
스페이서 DMT 스페이서
그림 4.4 탈삼중화. 5' DMT 그룹은 TCA 처리로 제거
CPG CPG
됩니다. 이 예에서는 첫 번째 뉴클레오시드의 탈트리틸
비드 비드
화가 묘사됩니다.

그림 4.5 활성화 및 결합. 포스포르아미다이트의 활성화는 3' 포스파이트 그룹이 결합된 탈트

리틸화합물의 5' 하이드록실 그룹에 부착될 수 있게 합니다.
뉴클레오시드.

DMT 영형 DMT 영형 에게

CH2 베이스 2 CH2 베이스 2 CH2 베이스 1

영형 영형 영형
활성화
시간 시간 시간 시간 시간 시간

시간 시간 시간 시간 시간 시간

영형 시간 영형 시간 영형 시간

나 OP 나 OP 시간
스페이서
N CH2 N + CH2
시간 시간
CPG
씨 CH 씨 CH
비드
H2C H2C
CH2 CH2 CH2 CH2

커플 링

DMT 영형

CH2 베이스 2

영형

시간 시간

시간 시간

시간
영형

나 OP

영형

CH2 베이스 1

영형

시간 시간

시간 시간

시간
영형

스페이서

CPG
비드