DNA extraction
1. 세포 파괴
목적: 세포로부터 DNA 를 방출 시키기 위해
방법
물리적 파괴
1) 동식물 조직이나 세균 등의 세포를 기계적으로 잘게
부수어 걸쭉한 액체 상태로 만들 수 있는
Homogenizer 사용.
2) Bead 를 넣어 beading beater 나 vortexing
참고사항: 샘플이 너무 크면 잘게 다져주는 것이 좋다.
화학적 파괴
CTAB buffer, SDS buffer 같은 계면활성제 사용.
계면활성제의 역할: 물과 기름처럼 서로 섞이지 않은 경계면을 활성화 하여 섞일 수 있게 만든다.
이 때문에 인지질(phospholipid)로 구성된 세포막을 녹이고 분해할 수 있다.
CTAB(cetyl trimethylammonium bromide) buffer 의 특징: 계면활성제로써 세포막과 핵막을
녹여주고, 다당류(polysaccharide)를 제거시켜준다. 다당류를 제거 시켜주는 메커니즘은 다당류와
DNA 는 NaCl 농도에 따라 용해도가 다른데 DNA 는 낮은 농도에서 녹고, 다당류는 높은 농도에서
녹는다. 이 점을 이용하여 CTAB 이 NaCl 이 높을 때 다당류랑 결합하여 용액에서 다당류를 제거
시켜준다.
NaCl 대신 Ammonium acetate(NH4CH3CO2(s) ⇔ NH4+(aq)+CH3CO2-(aq))를 사용할 수 있다. NH4+
가 Na+ 역할을 할 수 있고, CH3CO2-가 Cl- 역할을 할 수 있기 때문이다. NH4+나 Na+ 같은 양전하가
DNA 의 backbone 을 따라 음전하를 띤 인산염 그룹을 보호해준다. 또한, 결합하면서 무색인 DNA
가 흰색을 띄게 된다.
2. DNA 추출 및 정제
I. DNA 외 cell debris 제거하기 (더 깨끗한 DNA 샘플 얻기 위해)
(1) Protease(protein enzyme)이나 proteinase K 같은 효소를 사용해 단백질 가수 분해 유도
여기서, proteinase K 는 곰팡이 Engyodontium album 의 추출물이며, 이를 첨가하면 DNA
정제 과정에서 DNA 또는 RNA 를 분해할 수 있는 Nuclease 가 비활성 된다.
Extra: RNA 를 제거하려 할 경우 ribonuclease(RNase)를 첨가하여 RNA 를 ribonucleotide 로
만들어 RNA 를 제거
(2) 샘플을 여과하여 일부 cell debris 를 제거할 수 있다
II. DNA 침전
(1) 용액 내에 녹아 있는 DNA 를 추출하기 위해 차가운 알코올(ethanol or isopropanol)을
넣어준다. 넣어주는 이유는 ethanol or isopropanol 을 넣어 물에 녹아있는 DNA 의 용해도 즉,
물에 대한 친화력을 낮춰주기 때문이다. 또한, 차가운 상태인 것을 이용해야 DNA 침전이 더 잘
이뤄진다.
(2) 이후 멸균 피펫 등으로 부드럽게 저어주면 흰색 침전물이 생긴다.
III. DNA 정제
(1) DNA 정제를 위해 탈수 과정을 거친다. 탈수 방법으로는 70% 농도 이상의 에탄올을 통해 세척
후 튜브에 담아 에탄올의 휘발성을 이용하여 자연건조 시키거나 그냥 자연건조 시키면 된다.
전자의 경우는 cell debris 를 제거하기 위해 chloroform 이나 isopropanol 같은 유기용매들을
에탄올을 통해 녹아 나오게 하기 위한 작업이다. 단, 건조 시 overdry 가 되지 않도록 주의한다.
(2) 이후 건조된 DNA 를 TE buffer(10mM Tris-HCl + 1mM EDTA [pH8])에 녹여준다.
TE buffer(Tris, EDTA)의 역할: pH 8.0 에서 pH 가 shift 하는 것을 방지하는 역할을 해준다. Cell 을
파쇄하면서 나온 cell debris 들이 pH 의 변화를 만든다. DNA 의 pH 에 민감하기 때문에 pH 8.0
으로 적정한 Tris 용액을 넣어주는 것이다. EDTA 는 2+ 전하와 결합하는 특성을 가지고 있어서
DNase 나 Protease 같은 효소들이 금속이온과 결합하지 못하여 효소 활성이 떨어지게 되고 이
작용으로 DNA 의 분해를 방지할 수 있다. 또한, EDTA 는 pH 8 이하에서 녹지 않기 때문에 Tris 를
첨가하여 pH 를 높여서 EDTA 를 녹여야 한다.
3. 참고사항
DNA 보관 온도
단기 사용: 4℃ // 장기 사용: -20℃
이유: -20℃에 보관하면 안정적으로 오랫동안 보관 가능할 뿐만 아니라 장기간 보관 시 발생하는
DNase 등에 의한 DNA 분해 혹은 오염을 막을 수 있기 때문. 이를 위해 Free nuclease 에 녹이거나 -
20 냉동고 혹은 deep frezzer 에 보관하고, 작은 볼륨으로 여러 개 나누어서 보관하는 것이 좋다. 단,
냉동 보관을 하더라도 냉동과 해동을 반복적으로 할 경우에는 DNA 에 손상이 가기 때문에 유의가
필요하다. 또한, 여기서 TE buffer 의 중요성을 알 수 있는데, Tris 와 EDTA 가 상기 언급한
메커니즘으로 인해 DNA 의 stability 를 유지 시켜주는데 중요한 역할을 하기 때문에 장기 보관을 할
때에는 TE buffer 의 사용도 필수적이다.
