20211282 김성호

1) Title: 전기영동

2) Purpose

전기영동의 원리를 이해하고 이를 이용하여 DNA 의 크기를 확인해 본다.

3) Theory

(1) 전기영동(Electrophoresis)

전기영동이란 전극 사이의 전기장 내에서 용액 속의 전하가 반대 전하의 전극을 향하여 이동하는 화학현상으로 이 실험에서 DNA 조각을 분리하는데
사용되는 방법이다. 크기, 전하, 구조의 차이로 인해 전기영동이 일어날 때 입자의 이동속도가 다르기 때문에 물질이 분리되게 된다.

(2) Agarose Gel

Agarose 는 해초에서 추출되는 물질로 선형중합체이다. Agarose 를 완충용액(TAE buffer)에 녹여 원하는 크기의 틀에 부은 후 굳히게 되면
Agarose Gel 을 만들 수 있다. 이렇게 만들어진 Agarose Gel 은 그물형태(matrix)를 가지며 구멍의 크기가 일정하지 않다는 특징을
가지게 된다. 이 구멍을 통해 DNA 나 단백질의 분자들이 전기영동으로 이동하게 되고 구멍의 크기는 Agarose Gel 의 농도의 영향을 받는다.

(3) DNA

DNA 란 인산, 당, 염기가 [Link] 비율로 이루어진 뉴클레오타이드를 구조단위로 가지는 중합체이며,
유전물질을 가지고 있는 핵산의 일종이다. 인산의 화학식은 H3PO4 으로 뉴클레오타이드에서 인산의 3
개의 하이드록시기(-OH) 중 2 개는 당과 결합하고 남은 하나의 하이드록시기에서 H+가 빠져나가
DNA 는 전기적으로 (-)전하를 가지게 된다.

전기영동 실험에서 DNA 가 (-)전하를 띄기 때문에 (+)극 쪽으로 이동하게 된다.

뉴클레오타이드에서의 당은 탄소가 5 개로 이루어진 5 탄당이며, 염기는 사이토신(C), 구아닌(G),

아데닌(A), 티민(T)으로 4 종류가 존재한다. 사이토신과 구아닌은 3 개의 수소결합을 통해서, 아데닌과 Figure 1. 뉴클레오타이드의 구조
티민은 2 개의 수소결합을 통해서 서로 상보적으로 결합을 한다.

DNA 의 구조는 이중나선구조로 이루어져 있는데 이중나선구조가 만들어지는 이유는 인산-당 골격이 5’ → 3’ 방향으로 서로 반대로 뻗어있는 역평행
배열을 하기 때문이다.

(4) DNA 의 이동속도에 영향을 주는 요인

DNA 의 이동속도에 영향을 주는 요인으로는 앞서 간략히 말한 것처럼 DNA 분자의 크기, Agarose Gel 의 농도, DNA 의 구조가 존재하고
추가적으로 전기장 내에서의 이온이 받는 전기력의 크기가 존재한다.

1. DNA 분자의 크기

DNA 분자의 크기가 작을수록 Agarose Gel 의 구멍을 통해 이동하기 용이하다.

따라서 DNA 분자의 크기가 작을수록 DNA 의 이동속도가 빠르다.

2. Agarose Gel 의 농도

Agarose Gel 의 농도가 높을수록 그물형태의 구멍이 조밀하게 만들어진다.

따라서 Agarose Gel 의 농도가 낮을수록 DNA 의 이동속도가 빠르다.

3. DNA 의 구조(형태)

DNA 의 크기가 작을수록 전기영동에서의 이동속도가 더 빠르다.

따라서 supercoiled DNA > Linear DNA > open circular DNA 순으로 빠르게 이동한다.
 4. 전기력의 크기

이온은 용액 내에서 전기력으로 인해 가속을 받게 되고 속력이 점점 증가하나, 주변 용액으로 인한 마찰력 때문에 자유낙하 운동에서의 종단
속력처럼 일정한 속력에서 이동하게 된다. 이 일정한 속력은 운동 마찰력과 전기력으로 인해 입자에 가해지는 힘이 동일할 때 만들어지게 된다.

위의 내용을 모두 종합하여 관계식을 만들어 주면 다음과 같은 관계식이 나온다.

E
F= q=6 πΥηv (Υ : 구형 물질의 반지름 , η: 용액의 점성도 , v :물질의 이동속도)
d
Eq
위의 공식을 v 에 관하여 정리하면 v= 로 이온의 크기 대비 전하량이 클수록 이동속도가 빠르다는 것을 알 수 있다.
6 πΥη
(5) TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer

TAE buffer 는 Tris, Acetate, EDTA 의 세가지 성분으로 이루어져 있다. Tris 는 양이온을 공급하여 (-)전하를 띄고 있는 DNA 를
끌어주는 역할을 한다. Tris 의 pH 는 11 정도로 높기 때문에 DNA 가 해리될 수 있기 때문에 이를 막기 위해서 Acetate 가 존재한다. 다음으로
EDTA 는 전기영동 중에 DNA 가 분해되는 것을 막는 역할과 DNA 의 (-)전하를 유지시키는 역할을 한다.

(6) EtBr, Red safeTM

1. EtBr

얇은 판 구조의 고리화합물로 DNA 나선 염기 사이에 들어가 결합을 한다. 이 과정에서 돌연변이를 유도한다. 또한 UV 에 노출될 경우 결합한 DNA 를
통해 가시광선(주황색)으로 빛이 나기 때문에 위치를 찾을 수 있다.

2. Red safeTM

위에서 서술한 EtBr 의 문제를 해결하기 위해 대체된 물질로 핵산을 염색시키는 시약이다. EtBr 과는 다르게 돌연변이를 거의 일으키지 않는 것으로
알려져있고, DNA 와 RNA 와 결합할 때 녹색형광을 만들어 핵산의 위치를 확인하는데 도움을 준다.

(7) Micropipette

미량의 시료를 가지고 성분 분석을 하는 미량 분석에서 사용되는 피펫이다. 미량 액체의 부피를 정확하게 채취하거나 배출하는데 사용되며 사용 목적에 따라
일정 부피 피펫, 메스 피펫, 칭량 피펫이 존재한다.

4) Chemicals & Apparatus

· Chemicals

Agarose, 50X TAE Buffer, 10X loading buffer (Takara, 9157), 100bp DNA ladder
(Bioneer,D-1030), 1 kb DNA ladder (Komabiotech, K0170315), RedsafeTM, DW

· Apparatus

Gel electrophoresis tank, 직류공급장치, casting tray, gel comb, micropipette, microwave range,
UV transilluminator, Erlenmeyer flask, Eppendorf tube

5) Procedure

A. 1X TAE 100 mL 만들기

1. 삼각플라스크에 50X TAE 2mL 를 넣는다.

2. 증류수 98 mL 를 넣고 섞는다.
B. Agarose Gel 만들기

1X TAE 50mL
Agarose 0.5g
1. 표의 조성과 같이 100 mL 삼각플라스크에 혼합한 후 Microwave range 3 분 정도 가열한다.

2. 혼합 용액에 RedSafeTM 2.50 μL 를 넣는다.

3. Gel 틀에 기포가 생기지 않게 천천히 용액을 붓고, gel comb 을 끼우고 20 분간 굳힌다.

C. Agarose Gel Electrophoresis

1. 굳힌 agarose gel 의 well 이 (-) 극을 향하도록 gel 틀을 전기영동기구에 넣는다.

2. 1X TAE 용액을 젤이 잠길 정도로 붓는다.

3. Eppendorf tube 에 준비된 DNA sample 27 μL 과 10x Loading Dye 3 μL 를 넣고 섞는다.

4. 3 번에서 준비한 sample 30 μL 를 well 에 차례대로 loading 한다.

5. Well 에 100 bp ladder 와 1 kb ladder 를 각각 5 μL 씩 loading 한다.

6. Full Voltage 로 25 분간 전압을 걸어준다.

7. UV transilluminator 로 DNA 의 크기를 확인한다.

『실험 시 주의사항』

1. Loading 할 때, pipette tip 을 홈 높이의 절반 정도 위치에 놓은 후 버튼을 천천히 눌러 용액을 내보낸다.

2. 전기영동 중에는 buffer 에 손을 집어넣지 않는다.