Rekayasa genetika

Untuk mempelajari kloning gen dibutuhkan penge -

tahuan tentang konsep biologi molekuler dan peng -
gunaan tehnik-tehnik dalam laboratorium

⚫ Teknologi DNA telah meluncurkan revolusi

dalam bidang bioteknologi yaitu manipulasi
organisme atau komponen organisme untuk
melakukan tugas tugas praktis untuk
menghasilkan produk yang bermanfaat.
⚫ Semuanya melibatkan para peneliti dari
bidang a.l; biologi, mikrobiologi, biologi
molekuler,dan para teknisi peralatan untuk
menunjang kerja para peneliti.
KEMAMPUAN YANG REVOLUSIONER DARI
REKAYASA GENETIKA

Teknik ini menjanjikan berbagai kemampuan yang

revolusioner, antara lain :
– Cepat
– Dapat diterapkan secara universal
– Dapat dilakukan pengendalian yang ketat
terhadap proses manipulasi
– Dapat membentuk berbagai kombinasi genetik
baru yang belum diseleksi sebelumnya dengan
metode laboratorium
Rekombinasi genetik

⚫ Menghasilkan strain bakteri baru

⚫ Menghasilkan keaneka ragaman genetik.
⚫ Bila 2 strain bakteri yang berbeda dikulturkan
dalam media cair dan diinkubasi selama 1
jam kemudian dipindahkan dengan cara
disebarkan diatas media sederhana, inkubasi
semalaman. Maka akan terlihat pertumbuhan
koloni bakteri yang dimulai dari kemampuan
membuat triptopan dan arginin sekaligus
Metode rekombinan
⚫ Penggabungan DNA dari sumber yang
berbeda.

⚫ Ada 3 :
– 1. Transformasi
– 2. Transduksi
– 3. Konjugasi

⚫ Transformasi
– Merupakan perubahan suatu genotip sel
bakteri dengan cara mengambil DNA
asing telanjang dari sekitarnya.
Transformasi

– Merupakan perubahan suatu genotip sel bakteri dengan cara

mengambil DNA asing telanjang dari sekitarnya.

– Transformasi terjadi ketika sel nonpatogenik hidup mengambil

DNA yang kebetulan mengandung alel patogenesitas (gen
untuk lapisan sel yg melindungi bakteri dari sel inang). Alel ini
kemudian dimasukkan kedalam kromosom bakteri menggan
tikan alel aslinya( tanpa lapisan). Pertukaran segmennya
secara” crossing over”(pindah silang).

– Sel yang ditransformasi memiliki satu kromosom yang

mengandung DNA yang berasal dari 2 sel yang berbeda.
Transformasi

⚫ Proses perpindahan genetik di mana sel

resipien membutuhkan molekul DNA bebas (
DNA yang berada diluar sel atau yang telah
dimurnikan.
⚫ Dalam laboratorium transformasi dapat
dilakukan dengan mengisolasi DNA donor
kemudian menambahkannya pada suspensi
selresipien.
⚫ Transformasi dapat terjadi secara alami.
⚫ Pada prinsipnya transformasi akan terjadi
bila sel resipien mampu menerima DNA yang
telah diisolasi dari sel donor.
⚫ Transformasi dapat terjadi pada bakteri
Gram positif ataupun Gram negatif
⚫ Transformasi dapat dipindahkan dari sel
bakteri kepada sel tanaman.
Transduksi
⚫ Adalah proses membawa bacteri dari satu sel inang kepada sel inang
lainnya.
⚫ Ada 2 tipe transduksi
– Transduksi umum
– Transduksi khusus
Keduanya berasal dari penyimpangan pada siklus reproduksi
faga( virus yang menginfeksi bakteri ).

⚫ Transduksi umum
– Faga akan menginfeksi sel bakteri kemudian masuk kedalam sel
inang. Molekul asam nukleat virus akan terbungkusdidalam kapsid
dan pada saat sel inang lisis maka faga lengkap akan dilepaskan.
– Kadangkala sebagian kecil DNA sel inang ikut terdegradasi dan
terbungkus dalam kapsid faga menggantikan genom faga. Virus ini
cacat ( nongenetik),
– Tetapi bila faga ini kemudian menempel pada bakteri lain
dan menginjeksikan bagian DNA bakteri yang didapat dari
sel pertama
– Beberapa DNA ini kemudian dapat menggantikan daerah
homolog dari dua sel. Rekombinasi genetik telah terjadi.
– Jenis transduksi ini disebut dengan transduksi umum
karena gen gen bakteri ditransfer secar acak.
– Transduksi umum : gen gen inang yang berasal
dari suatu genom akan menjadi bagian dari
partikel DNA virus yang sudah matang darisuatu
tempat atau penambahan pada genom virus.
– Virus yang telah mengalami transduksi tidak
mampu melisiskan inang. Hal ini disebabkan sel
bakteri telah menggantikan tempat penting pada
gen virus.
Transduksi

⚫ Adalah transfer genetik dari sel ke sel oleh

virus dari sel inang .
⚫ Transduksi terbagi 2
– Tranduksi Khusus : hanya terjadi pada beberapa
virus tertentu.gen inang langsung diintegrasi
kedalam genomvirus.lalu ditransfer ke resipien
selama proses lisogenisasi (pembentukan lisogen )
– Lisogen adalah bakteri yang mengandung faga
lengkap
⚫ Transduksi khusus
– Bentuk transduksi ini memerlukan infeksi oleh
faga temperat.

– Genom faga temperat berintegrasi sebagai

profaga kedalam kromosom bakteri inang,
biasanya disuatu tempat yang spesifik .
– Ketika genom faga dipisahkan dari kromosom
yang kadangkala membawa DNA dari bakteri
yang berdampingan dengan profaga.
– Ketika suatu virus yang membawa DNA bakteri
seperti ini menginfeksi sel inanglain, gen gen
bakteri ikut terinjeksi bersama sama dengan
genom faga.
– Transduksi khusus hanya mentransfer gen-gen
yang berada didekat tempat profaga pada
kromosom tersebut.
Konjugasi
⚫ Merupakan transfer langsung materi genetik antara
dua sel bakteri yang berhubungan sementara

(reproduksi seksual ala bakteri).

⚫ Transfer DNA satu arah :
– Satu sel sebagai donatur gen /DNA ( jantan)
– Satu sel sebagai penerima gen/DNA ( betina)
– Jantan akan menggunakan pili seks untuk menempel
pada resipien ( betina)
– Kemudian akan terbentuk jembatan sitoplasmik
semen tara diantara kedua sel.
– Kegiatan donor dan penggunaan pili seks disebabkan
adanya pengaruh sepotong DNA khusus yang disebut
faktor F (Fertilitas).
– Kegiatan donor dan penggunaan pili seks
disebabkan adanya pengaruh sepotong

– DNA khusus yang disebut faktor F

(Fertilitas).
– Kemudian akan terbentuk jembatan
sitoplasmik semen tara diantara kedua sel.
– Kegiatan donor dan penggunaan pili seks
disebabkan adanya pengaruh sepotong
DNA khusus yang disebut faktor F
(Fertilitas).
Gene cloning
Cara / Garis besar kloning gen :

1. Membuka sel hidup. Untuk ini terdapat beberapa cara,

yang popular adalah dengan memblender sel dan kemudi-
an menambahkan deterjen ( untuk sel mamalia ).
2. Mengambil informasi genetic ( DNA ) dari sel. Karena mole-
kul DNA ratusan kali lebih panjang dari molekul lain dalam
sel, maka tehnik pemurnian DNA mudah dikembangkan.
3. Salah satu metodanya adalah dengan menggulung DNA
pada sebatang gelas. Batang gelas yang membawa DNA
kemudian diangkat dari campuran sel-sel pecah, dengan
cara seperti kita mengangkat bakmi dengan sumpit.
–
4. Memotong gen khusus yang diinginkan.
Metode ini dilakukan dengan cara seperti meng -
edit film. Seperti halnya film, DNA juga terdiri atas
”frame” untuk menunjukkan urutan yang tepat.
Dalam DNA ”frame” ini merupakan susunan huruf
kode genetik. Bila frame-frame ini disusun pada
kombinasi tertentu, akan menjadi cerita pada film
atau menjadi DNA pada gen. Gunting molekuler
untuk memotong DNA adalah suatu enzim yang
disebut restriction enzym ( enzim pemotong ).
5. Menempatkan potongan khusus DNA ke dalam perantara yang

disebut cloning vehicles yang akan membawa potongan DNA ke

dalam sel hidup lain.
o. Cloning vehicles adalah molekul DNA yang relatif pendek yang
dapat memasuki sel dan memperbanyak diri di dalam sel.
o. Menempatkan gen khusus pada kloning vehicle mi rip seperti
menyambung adegan cerita dalam film pendek.
o. Proses penyambungan menghasilkan chimeric DNA molekul
( molekul DNA kimera ), Sebagian adalah gen khusus dan
bagian lainnya adalah gen dari cloning vehicle tersebut.
o. Molekul DNA tersebut juga disebut recombinant DNA molekul
( molekul DNA rekombinan).
⚫ Cloning vehicle yang mengandung potong-
an khusus DNA tadi dimasukkan ke dalam
sel inang yang biasanya adalah organisme
sel tunggal ( seperti bakteri atau ragi ).
⚫ membiarkan sel inang untuk memperbanyak
diri membentuk klon dengan kandungan
bermilyar milyar sel yang identik.
⚫ Pada umumnya kloning sederhana dari sepotong
DNA berlangsung baik. Seperti halnya film yang
menjadi berguna setelah diproyeksikan. Demikian
juga informasi dalam DNA yang harus dirubah
kedalam produk yang berguna.
⚫ Untuk membuat produk, informasi dalam DNA
ditransfer dari gen ke tempat molekul protein
diproduksi.
⚫ Pembuatan produk berdasar informasi yang
disimpan dalam DNA disebut ekspresi gen.
⚫ Yang harus kita ketahui, protein adalah
rangkaian molekul yang terdiri dari ratusan
mata rantai asam nukleat.
⚫ Suatu tipe dari fungsi protein sebagai balok
penyusun struktur sel, dan tipe lain yang
berfungsi untuk mengontrol reaksi-reaksi
kimia dalam sel.
⚫ Contoh tehnik rekombinan : pembuatan insulin
dengan perantara bakteri.
⚫ Insulin adalah hormon yang dibutuhkan untuk
mengontrol metabolisme gula dalam tubuh kita.
⚫ Pada penderita penyakit kencing manis (diabetict)
terjadi kegagalan dalam mensintesa hormon ini
sehingga diperlukan penambahan insulin dari luar
untuk kelangsungan metabolisme gula dalam tubuh.
⚫ Sebelumnya, insulin didapatkan dengan cara
memurnikan protein pankreas babi.
⚫ Tetapi sekarang dengan tehnik kloning gen,
yaitu : memindahkan gen insulin manusia ke
dalam sel bakteri. Dengan demikian akan
didapatkan produksi insulin dalam jumlah
besar oleh bakteri, cara ini lebih mudah
⚫ TINGKAT KEBERHASILAN KLONING :

Dipengaruhi oleh :
⚫ Pemilihan Vektor
⚫ Pemilihan sistem kloning, tergantung pada
penentuan tujuan yang ingin dicapai.
⚫ Tujuan dari kloning fragmen DNA
– Isolasi dan perbanyakan fragmen DNA murni
– Preparasi pelacak DNA atau RNA dari urutan spesifik
– Sequencing daerah penting pada berbagai genom
– Ekspresi dan pemurnian sejumlah protein biologis
– Modifikasi genetik species
– Modifikasi in Vitro dari urutan DNA yang bermanfaat
Perangkat Teknik DNA Rekombinan
/ Rekayasa Genetika

:
⚫ Enzim restriksi
⚫ Vektor / wahana kloning

⚫ Konstruksi dan pengklonan

⚫ Konjugasi, transformasi, transduksi

Enzim Restriksi
▲ Adalah :
Enzim yang dapat mengkatalisasi pembelahan /

pemotongan DNA dibeberapa tempat / lokasi

spesifik dengan jumlah yang terbatas & dapat
direproduksi.
▲ Enzim ini disebut juga dengan nama endonuklease
restriksi ( Russell, 1980).
▲ Semua enzim ini mampu memecah ikatan fosfodiester
asam nukleat umumnya berupa tangga, karena urutan
target umumnya sering muncul berkali kali.
▲ fragmen enzim restriksi berupa DNA untai ganda
dengan sedikitnya satu ujung untai tunggal.
Sejarah penemuan enzim restriksi
⚫ Stewart Linn & Werner Arber (1960)

Menemukan : Enzim modifikasi maupun enzim

nuklease “restriksi” dalam bakteri E.coli galur B yang
dapat menguraikan DNA yang tidak termetilkan.

⚫ Hamilton Smith (1970)

– Pertama kali menemukan enzim nuklease
restriksi spesifik yang memutus DNA pada
tempat- tempat tertentu dan dapat
diidentifikasikan, dari Haemophilus influenzae
yang dikenal dengan nama HindII,
⚫ Watson dkk, (1983)
Menemukan nuklease restriksi & metilase
modifikasi dalam dua galur E.coli lain yang
membuka kemungkinan adanya banyak
nuklease yang spesifik untuk suatu tempat
Enzim Restriksi terdiri dari 2 golongan

⚫ Enzim gol 1
❖ Memecah DNA pada tempat yang tidak spesifik,
jauh dari tempat pengolahan.
❖ Mengenal urutan pasangan nukleotid spesifik.
❖ Antara lain : enzim-enzim yang terlibat
dalam sistem restriksi K dan B ( termasuk
E.Coli)
⚫ Enzim gol 2
❖ Memecah DNA pada tempat yang spesifik.
❖ Telah banyak diisolasi dari mikroorganisme
(Russell, 1980).

Enzim yang pertama kali ditemukan pada tahun

1970 oleh Hamilton Smith dari Universitas John
Hopkens yaitu : Haemophyllus influenza, yang
dapat segera menguraikan pemakan DNA asing.
Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi
 Encyclopædia Britannica, Inc.

⚫ DNA sequences can be cut in two ways. One type of cut produces two
DNA strands with blunt ends; that is, there is no overhang on one
strand or the other. A second type of cut produces two strands with
sticky ends; because of the site of cleavage, each strand extends
beyond the complementary region of the strand pair. The ends are not
actually sticky; rather, the term denotes that the overhang allows these
fragments to bind more readily with other strands. Blunt ends are more
difficult to join.
Vektor / Wahana kloning

♦ Seutas molekul DNA tunggal tempat

dilekatkannya material genetik yang kita
inginkan sebelum di injeksikan ataupun
ditransformasikan kedalam bakteri tertentu.
♦ Wahana kloning yang paling sering di
gunakan adalah plasmid.
Plasmid

⚫ Adalah unsur genetik diluar kromosom ( ekstrakromosomal),

yang mengadakan replikasi secara autonom di dalam sel
bakteri.
⚫ DNAnya berbentuk lingkaran dan beruntai ganda.
⚫ Mendukung gen yang diperlukan untuk replikasi ataupun fungsi
lain yang dipikulnya.
⚫ Plasmid mudah dipisahkan dan dimurnikan dari DNA inang
⚫ Pada Rhizobium sp. plasmid berguna karena terlibat dalam
proses fiksasi dan untuk mengikat nitrogen.
⚫ Adalah molekul yang dapat diturunkan secara stabil
tanpa mengkaitkannya dengan kromosom.
⚫ Sangat berarti bagi bidang kedokteran , farmasi, dan
pertanian , karena plasmid membawa resisten terha
dap antibiotik yang berguna bagi manusia dan hewan.
⚫ Selain itu dapat menjandikan toksin dan protein lain
yang dapat meningkatkan virulensi patogen.
Jenis plasmid
⚫ Plasmid F :
– Berfungsi dalam proses konjugasi dan dikenal pada
berbagai bakteri.
⚫ Plasmid faktor R :
– Plasmid yang membawa gen-gen penyebab resistensi
terhadap antibiotik, misal ampR (resisten terhadap
ampisilin)
⚫ Plasmid Ti :
– Pada berbagai Agrobacterium
– Fungsi berhubungan dengan tumbuhan inang, yaitu
dengan cara mentransfer satu fragmen DNA (DNA-T)
kedalam sel inang, yang kemudian akan menyebabkan
tumbuhnya tumor pada inang.
Fungsi plasmid

⚫ Mendukung replikasi
⚫ Sebagai vektor untuk pengklonan DNa
⚫ Pembawa gen resisten antibiotik ( plasma resisten )
– Contoh : plasmid resisten → p BR. 322.( plasmid R.E Coli ,
yaitu : plasmid yang memberi resisten terhadap
ampicilin dan tetrasiklin. )
♦ DNA plasmid dapat diisolasi dengan cara “melisiskan”
sel bakteri dan memisahkan DNA plasmid dari DNA
kromosom.
♦ Plasmid p.BR.322 : merupakan suatu determinan replikasi
plasmid pMBI yang berkaitan dengan col.E.I. gen plasmid
RI ( TN3) resisten dan gen resisten tetrasiklin plasmid pS
(101) sebagai penanda seleksi.
Plasmid
Plasmid resisten
Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui
perbanyakan bakteri
Cloning
into a
plasmid
Vektor plasmid
& Ciri plasmid
 Kuliah ke11

Konstruksi dan Pengklonan

¤.Pengisolasian DNA sumber gen dan vektor

– Isolasi DNA sebagai sumber gen menggunakan enzim
endonuklease. diperoleh dari gen yang diinginkan yang
kemudian ditumbuhkan / dikultur kan dalam laboratorium.
– Isolasi plasmid dari bakteri (E.coli ) yang membawa 2 gen
penanda e.g.
– 1. Resistensi terhadap antibiotik ampisilin,
– 2. Lac Z yang mengkode β.galaktosidase yang dapat
– menghidrolisis laktosa.
¤.Penyelipan DNA kedalam vektor ( 3 langkah)
1. Memotong DNA yang ingin diselipkan dan
DNA plasmid dengan enzim restriksi yang

sama. Pada saat pemotongan enzim restrik

si membuat / menciptakan ujung ujung leng-
ket dari kedua DNA.
2. Menyatukan kedua utas DNA dimana ke 2
ujung lengket akan berpasangan
3. Menggabungkan molekul molekul DNA
secara ikatan kovalen menggunakan enzim
Ligase.
¤. Pemasukan vektor kedalam sel
– Sel bakteri akan mengambil plasmid dengan
cara trans formasi (penyerapan DNA dari
– larutan disekelilingnya).

¤. Pengklonan sel- sel ( gen DNA asing)

– Dalam proses ini bakteri yang telah

mengandung plasmid rekombinan ditempatkan
dalam nutrien agar yg mengandung ampisilin
dan x- gal ( gula).
– Bakteri akan bereproduksi yang membentuk
koloni sel rekombinan.
yang mengandung sel rekombinan resisten
antibiotik ampisilin dan gen lak Z.
¤. Identifikasi klon gen rekombinan.

– Dengan metode hibridisasi asam nukleat :

menggunakan utas DNA / RNA yang
pendek dapat diketahui urutan basanya
disebut probe asam nukleat.

– Probe asam nukleat diberi label radio

isotop sehingga pada saat penelusurun
dapat dilihat DNA klon yang komlementr
dengan DNA probe yang berikatan
hidrogen secara spesifik.
PCR ( Polymerase Chain Reaction)

⚫ Adalah suatu teknik / metode dimana setiap

fragmen DNA dapat diamplifikasi atau
diperbanyak berkali-kali,dengan cepat tanpa
menggunakan sel.
⚫ PCR dapat melipat gandakan DNA milyaran
kali dalam beberapa jam. Peristiwa ini harus
ada primer karena DNA polimerase akan
menambahkan nukleotida hanya pada rantai
nukleotida yang sudah ada sebelumnya
dengan bantuan primer.
Polymerase chain reaction "reaksi
berantai polimerase", (PCR)

⚫ Polymerase chain reaction ("reaksi [be]rantai

polimerase", PCR) merupakan teknik yang sangat
berguna dalam membuat salinan DNA. PCR
memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu
disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga
dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu.
⚫ Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk
menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk
memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA.
⚫ PCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi
keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel.
⚫ PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase
yang secara alami memang berperan dalam
perbanyakan DNA pada proses replikasi.
Namun, tidak seperti pada organisme hidup,
proses PCR hanya dapat menyalin fragmen
pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb
(kb=kilo base pairs=1.000 pasang basa).
Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen
tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen
⚫ Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan
serangkaian siklus temperatur yang berulang dan
masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan.
Tahapan yang pertama adalah denaturasi cetakan
DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 °C,
yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas
tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan
temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 °C yang
memungkinkan terjadinya penempelan (annealing)
atau hibridisasi antara
⚫ oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan DNA.
Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-
nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang
ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang
hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau
elongasi (elongation), yaitu pemanjangan primer menjadi suatu
utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada
tahap ini bergantung pada jenis DNA polimerase yang
digunakan. Pada akhirnya, satu siklus PCR akan
menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target,
sebab setiap utas baru yang disintesis akan berperan sebagai
cetakan pada siklus selanjutnya.
The steps of PCR

⚫ The key ingredients of a PCR reaction are

Taq polymerase, primers, template DNA, and
nucleotides (DNA building blocks).
⚫ The ingredients are assembled in a tube,
along with cofactors needed by the enzyme,
and are put through repeated cycles of
heating and cooling that allow DNA to be
synthesized.
The steps of PCR

The basic steps are:

⚫ Denaturation (96°C): Heat the reaction strongly to
separate, or denature, the DNA strands. This provides
single-stranded template for the next step.
⚫ Annealing (55 - 65°C): Cool the reaction so the primers
can bind to their complementary sequences on the
single-stranded template DNA.
⚫ Extension (72°C): Raise the reaction temperatures
so Taq polymerase extends the primers, synthesizing
new strands of DNA.
Manfaat PCR

⚫ Memperkuat gen spesifik sebelum diklon.

⚫ Membuat fragmen Gen DNA secara berlimpah
⚫ Kerjanya sangat spesifik dan ampuh.
⚫ Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk
dideteksi
⚫ Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrio -
nik yang mengalami kelainan sebelum dilahirkan.
Analisis DNA Hasil Klon

⚫ Electroforesis
⚫ Southern Blotting
⚫ Metode Sanger.
 Electroforesis

⚫ Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik

utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar
teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein
dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini,
molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan
laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di
dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut
bergantung pada ukuran molekul bersangkutan.
⚫ . Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk
tujuan analisis, namun dapat pula digunakan
sebagai teknik preparatif untuk memurnikan
molekul sebelum digunakan dalam metode-
metode lain seperti spektrometri massa,
PCR, kloning, sekuensing DNA, atau
immuno-blotting yang merupakan metode-
metode karakterisasi lebih lanjut.
⚫ Gel yang digunakan biasanya merupakan
polimer bertautan silang (crosslinked) yang

porositasnya dapat diatur sesuai dengan

kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau
asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA,
atau oligonukleotida), gel yang digunakan
biasanya merupakan gel poliakrilamida,
dibuat dengan dengan konsentrasi berbeda-
beda antara akrilamida dan zat yang
memungkinkan pertautan silang (cross-
linker),
⚫ Akan menghasilkan jaringan poliakrilamida
dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk
memisahkan asam nukleat yang lebih besar
(lebih besar dari beberapa ratus basa), gel
yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak
rumput laut) yang sudah dimurnikan
⚫ Dalam proses elektroforesis, sampel molekul
ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel
yang ditempatkan di dalam larutan
penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.

⚫ Molekul-molekul sampel tersebut akan

bergerak di dalam matriks gel ke arah salah
satu kutub listrik sesuai dengan muatannya.
Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan
adalah menuju elektrode positif, disebabkan
oleh muatan negatif alami pada rangka gula-
fosfat yang dimilikinya.
⚫ Untuk menjaga agar laju perpindahan asam
nukleat benar-benar hanya berdasarkan

ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti

natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat
berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya
natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat
protein tersebut berbentuk lurus dan
bermuatan negatif.
⚫ Setelah proses elektroforesis selesai,
dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat

dilihat.
• Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru
Coomassie" (Coomassie blue) dapat
digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul
sampel berpendar dalam sinar ultraviolet
(misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium
bromida), gel difoto di bawah sinar
ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung
atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut
dibuat
⚫ Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang
berbeda pada gel akan tampak setelah

proses pewarnaan; satu lajur merupakan

arah pergerakan sampel dari "sumur" gel.
Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel
pada akhir elektroforesis mengandung
molekul-molekul yang bergerak di dalam gel
selama elektroforesis dengan kecepatan
yang sama,
⚫ yang biasanya berarti bahwa molekul-
molekul tersebut berukuran sama. "Marka"
atau penanda (marker) yang merupakan

campuran molekul dengan ukuran berbeda-

beda dapat digunakan untuk menentukan
ukuran molekul dalam pita sampel dengan
meng-elektroforesis marka tersebut pada
lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-
pita pada lajur marka tersebut dapat
dibandingkan dengan pita sampel untuk
menentukan ukurannya. Jarak pita dari
sumur gel berbanding terbalik terhadap
logaritma ukuran molekul.
Using gel electrophoresis to
visualize the results of PCR

⚫ Gel electrophoresis is a technique in which fragments of

DNA are pulled through a gel matrix by an electric
current, and it separates DNA fragments according to
size.
⚫ A standard, or DNA ladder, is typically included so that
the size of the fragments in the PCR sample can be
determined.
⚫ DNA fragments of the same length form a "band" on the
gel, which can be seen by eye if the gel is stained with a
DNA-binding dye.
Southern Blotting (Edward M. Southern)
⚫ Adalah : Proses perpindahan fragmen DNA
yang telah terpisah secara electroforesis

dengan gel kemembran.

Prinsipnya adalah kapilaritas yaitu :
Fase geraknya adalah buffer yang diasumsikan
akan membawa fragmen DNA dari gel kemembran.
Hal ini disebabkan karena DNA yang bermuatan
negatif sedangkan membran bermuatan positif
sehingga DNA akan menempel ( blot) pada
membran.
Membran yang digunakan biasanya adalah : Membran
Nitrosellulosa
TAHAPAN ;

⚫ 1. DNA didigesti dengan enzim

restriksi (terbentuk Fragmen DNA )
⚫ 2. kemudian DNA dipisahkan sesuai
ukurannya dengan electroforesis agarose.
⚫ 3. Kemudian lakukan pemindahan DNA ke
membran nitrosellulosa ( tahap blotting)
⚫ 4. Membran sellulosa diletakkan dibagian
atas dari gel agarose.
⚫ Pada proses ini harus diberi tekanan merata
pada gel agar terjadi kontak antara gel &
membran.
⚫ Proses transfer berlangsung dengan

memanfaatkan daya kapilaritas

⚫ 5. Setelah DNA ditransfer kegel, membran
nitrosellulosa dipanaskan pada suhu 60-
1000 C
⚫ 6. lalu membran diberi radiasi UV agar
terbentuk ikatan Kovalen yang Permanen
antara pita pita DNA dengan membran
⚫ 7. Membran kemudian dicampur dengan probe
( pelacak yang sudah dilabel) radioaktif. Probe
yang digunakan biasanya adalah DNA utas
tunggal.yang memiliki sukuen yang sama

dengan sekuan yang akan dideteksi. .( Probe

diinkubasi dengan membran agar dapat
berhibridisasi.
⚫ 8. Lalu dilakukan pencucian agar yang diperoleh
hanya DNA yg telah terhibridisasi dengan probe
pada membran.
⚫ 9. Pola hibridisasi dideteksi dengan
visualisasi pada film X-Ray melalui
Aplikasi DNA Rekombinan

⚫ Dalam Bidang Kedokteran

⚫ Dalam Bidang Farmasi
⚫ Dalam Bidang Forensik
⚫ Dalam Bidang Lingkungan
⚫ Dalam Bidang Pertanian
⚫ Dalam Bidang pangan