ED0085 - EN - 0 TS EN ISO 10993-5 Biological Evaluation of Medical Devices - Part 5 Tests For in Vitro

ICS 11.100.
20 TÜRK STANDARDI TS EN ISO 10993-5/Temmuz 2010
TÜRK STANDARDI
TURKISH STANDARD
TS EN ISO 10993-5
Temmuz 2010
ICS 11.100.20
TIBBİ CİHAZLARIN BİYOLOJİK DEĞERLENDİRİLMESİ –

BÖLÜM 5: VÜCUT DIŞI SİTOTOKSİSİTE DENEYLERİ
Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in

vitro cytotoxicity
TS EN ISO 10993-5 (2010) standardı, EN ISO 10993-5 (2009) standardı ile birebir aynı olup, Avrupa
Standardizasyon Komitesi’nin (CEN, rue de Stassart 36 B-1050 Brussels) izniyle basılmıştır.
Avrupa Standardlarının herhangi bir şekilde ve herhangi bir yolla tüm kullanım hakları Avrupa
Standardizasyon Komitesi (CEN) ve üye ülkelerine aittir. TSE kanalıyla CEN’den yazılı izin alınmaksızın
çoğaltılamaz.
TÜRK STANDARDLARI ENSTİTÜSÜ

Necatibey Caddesi No.112 Bakanlıklar/ANKARA
− Bugünkü teknik ve uygulamaya dayanılarak hazırlanmış olan bu standardın, zamanla ortaya çıkacak
gelişme ve değişikliklere uydurulması mümkün olduğundan ilgililerin yayınları izlemelerini ve standardın
uygulanmasında karşılaştıkları aksaklıkları Enstitümüze iletmelerini rica ederiz.
− Bu standardı oluşturan İhtisas Grubu üyesi değerli uzmanların emeklerini; tasarılar üzerinde görüşlerini
bildirmek suretiyle yardımcı olan bilim, kamu ve özel sektör kuruluşları ile kişilerin değerli katkılarını
şükranla anarız.
Kalite Sistem Belgesi

İmalât ve hizmet sektörlerinde faaliyet gösteren kuruluşların sistemlerini TS EN ISO 9000 Kalite
Standardlarına uygun olarak kurmaları durumunda TSE tarafından verilen belgedir.
Türk Standardlarına Uygunluk Markası (TSE Markası)

TSE Markası, üzerine veya ambalâjına konulduğu malların veya hizmetin ilgili Türk Standardına uygun
olduğunu ve mamulle veya hizmetle ilgili bir problem ortaya çıktığında Türk Standardları Enstitüsü’nün
garantisi altında olduğunu ifade eder.
TSEK
Kritere Uygunluk Belgesi (TSEK Markası Kullanma Hakkı)
Kritere Uygunluk Belgesi; Türk Standardları bulunmayan konularda firmaların ürünlerinin ilgili uluslararası
standardlar, benzeri Türk Standardları, diğer ülkelerin milli standardları, teknik literatür esas alınarak Türk
Standardları Enstitüsü tarafından kabul edilen Kalite Faktör ve Değerlerine uygunluğunu belirten ve
akdedilen sözleşme ile TSEK Markası kullanma hakkı verilen firma adına düzenlenen ve üzerinde TSEK
Markası kullanılacak ürünlerin ticari Markası, cinsi, sınıfı, tipi ve türünü belirten geçerlilik süresi bir yıl olan
belgedir.
DİKKAT!
TS işareti ve yanında yer alan sayı tek başına iken (TS 4600 gibi), mamulün Türk Standardına uygun
üretildiğine dair üreticinin beyanını ifade eder. Türk Standardları Enstitüsü tarafından herhangi bir
garanti söz konusu değildir.
Standardlar ve standardizasyon konusunda daha geniş bilgi Enstitümüzden sağlanabilir.
TÜRK STANDARDLARININ YAYIN HAKLARI SAKLIDIR.

ICS 11.100.20 TÜRK STANDARDI TS EN ISO 10993-5/Temmuz 2010
Ön söz
− Bu standard, CEN tarafından kabul edilen EN ISO 10993-5(2009) standardı esas alınarak, TSE Sağlık
İhtisas Grubu’nca TS EN ISO 10993-5(2008)’in revizyonu olarak hazırlanmış ve TSE Teknik Kurulu’nun
13 Temmuz 2010 tarihli toplantısında Türk Standardı olarak kabul edilerek yayımına karar verilmiştir.
− Bu standardın daha önce yayımlanmış bulunan baskıları geçersizdir.
− Bu standardda kullanılan bazı kelime ve/veya ifadeler patent haklarına konu olabilir. Böyle bir patent
hakkının belirlenmesi durumunda TSE sorumlu tutulamaz.
İçindekiler
Giriş.....................................................................................................................................................................
1 Kapsam...................................................................................................................................................... 1
2 Atıf yapılan standard ve/veya dokümanlar ............................................................................................ 1
3 Terimler ve tarifler .................................................................................................................................... 1
3.1 Kültür kapları...................................................................................................................................... 1
3.2 Pozitif kontrol malzemesi ................................................................................................................... 1
3.3 Kör numune ....................................................................................................................................... 1
3.4 Negatif kontrol malzemesi ................................................................................................................. 2
3.5 Deney numunesi................................................................................................................................ 2
3.6 Sub-konfluens.................................................................................................................................... 2
4 Numune ve kontrol malzemenin hazırlanması ...................................................................................... 2
4.1 Genel ................................................................................................................................................. 2
4.2 Malzemenin sıvı özütlerinin hazırlanması.......................................................................................... 2
4.3 Doğrudan temasla yapılan deneyler için malzeme hazırlanması ...................................................... 3
4.4 Kontrol numunelerin hazırlanması .......................................................................................................... 4
5 Hücre hatları.............................................................................................................................................. 4
6 Kültür vasatı.............................................................................................................................................. 5
7 Stok hücre kültürünün hazırlanması ...................................................................................................... 5
8 Deney işlemleri ......................................................................................................................................... 5
8.1 Kopya sayısı ...................................................................................................................................... 5
8.2 Özütler üzerindeki deney ................................................................................................................... 5
8.3 Doğrudan temasla yapılan deneyler.................................................................................................. 6
8.4 Dolaylı temasla yapılan deney........................................................................................................... 7
8.5 Sitotoksisitenin tespit edilmesi ........................................................................................................... 8
9 Deney raporu ............................................................................................................................................ 9
10 Sonuçların değerlendirilmesi ........................................................................................................... 10
Ek A (Bilgi için) - Nötral kırmızısı alımı (NKA) sitotoksisite deneyi .......................................................... 11
Ek B (Bilgi için) - Koloni oluşumu sitotoksisite deneyi ............................................................................. 17
Ek C (Bilgi için) - MTT sitotoksisite deneyi ................................................................................................. 21
Ek D (Bilgi için) - XTT sitotoksisite deneyi.................................................................................................. 25
Kaynaklar........................................................................................................................................................ 29
Ek ZA (Bilgi için) - Bu standardın AB direktifi 93/42/EEC’nin) temel gerekleri ile ilişkili maddeleri...... 30
Ek ZB (Bilgi için) - Aktif implante edilebilir tıbbi cihazlarla ilgili 90/385/EEC) direktifinin temel gerekleri
ile ilişkili olan bu standardın maddeleri ...................................................................................................... 31
Giriş
Vücut dışı sitotoksisite deneylerinin genel uygulanabilir olmasından ve tıbbi cihazların büyük bir bölümünü
değerlendirmede yaygın kullanımlarından dolayı, bu standardın amacı tek bir deneyin belirlenmesinden
ziyade seçilecek deney için kararların birkaç adımda alınmasını sağlayan bir plan sunmaktır. Böylece en
uygun deneyin seçimi sağlanır.
Bu standardda üç farklı deney kategorisi verilmiştir: Özüt deneyi, doğrudan temasla yapılan deney, dolaylı
temasla yapılan deney.
Bu deney kategorilerinden bir veya daha fazlasının seçimi, değerlendirilecek olan örneğin yapısına,
muhtemel kullanma yeri ile kullanma türüne bağlıdır.
Bu seçim, deneye tabi tutulacak olan örneğin hazırlanması, kültürü yapılmış hücrelerin hazırlanması ve
hücrelerin hangi yoldan numunelere veya özütlerine maruz bırakıldığı ile ilgili ayrıntıları tayin eder.
Maruz kalma süresinden sonra, sitotoksik etkinin varlığının ve derecesinin değerlendirilmesi yapılır.
Değerlendirme türü seçiminin açık bırakılması bu standardın amacıdır. Bu tür bir strateji, vücut dışı biyolojik
deneyleri savunan birçok grubun yaklaşımını yansıtan deneyleri ortaya koyar.
Sitotoksisite tayininde kullanılan birçok yöntem ve ölçülen son hedefler, değerlendirme türü kategorileri
şeklinde gruplandırılabilir.
a) Morfolojik yollarla hücre hasarının değerlendirilmesi,

b) Hücre hasarının ölçülmesi,
c) Hücre çoğalmasının ölçülmesi,
d) Hücre metabolizmasının belirli özelliklerinin ölçülmesi.
Bu nedenle bu dört kategorinin her birinde sonuç üretmenin birçok yolu vardır. Araştırmacı, diğer sonuçlarla
benzer tıbbi cihazlar veya malzemeler üzerinde karşılaştırmaların yapılabilmesi ve laboratuvarlar arası
deneylerin yürütülebilmesi için deney kategorilerinin ve belirli bir tekniğin hangisine uyduğunu da bilmelidir.
Tıbbi cihazların biyolojik değerlendirilmesi -

Bölüm 5: Vücut dışı sitotoksisite deneyleri
1 Kapsam
Bu standard, tıbbi cihazların vücut dışı (in vitro) sitotoksisitesini (hücresel zehirlilik) değerlendirmek için
deney yöntemlerini kapsar.
Bu yöntemler kültürü yapılmış hücrelerin inkübasyonunu ve bir cihazla ve/veya bir cihazın özütleriyle
doğrudan veya difüzyon yoluyla temas eden kültür hücrelerinin inkübasyonunu kapsar.
Bu yöntemler, uygun biyolojik parametreler kullanılarak memeli hücrelerin vücut dışı ortamda biyolojik
cevabını tayin etmek için tasarımlanmıştır.
2 Atıf yapılan standard ve/veya dokümanlar

Bu standardda, tarih belirtilerek veya belirtilmeksizin diğer standard ve/veya dokümanlara atıf yapılmaktadır. Bu
atıflar metin içerisinde uygun yerlerde belirtilmiş ve aşağıda liste hâlinde verilmiştir. Tarih belirtilen atıflarda daha
sonra yapılan tadil veya revizyonlar, atıf yapan bu standardda da tadil veya revizyon yapılması şartı ile uygulanır.
Atıf yapılan standard ve/veya dokümanın tarihinin belirtilmemesi hâlinde en son baskısı kullanılır.
EN, ISO, IEC Adı TS No1) Adı

vb. No (İngilizce) (Türkçe)
ISO 10993-1 Biological evaluation of medical TS EN ISO 10993-1 Tıbbî cihazların biyolojik
devices - Part 1: Evaluation and değerlendirilmesi – Bölüm 1:
testing Değerlendirme ve deney
ISO 10993-12 Biological evaluation of medical TS EN ISO 10993-12 Tıbbî cihazların biyolojik
devices - Part 12: Sample değerlendirilmesi – Bölüm 12:
preparation and reference Numune hazırlama ve referans
materials malzemeler
3 Terimler ve tarifler
Bu standardın amaçları bakımından aşağıdakilerle birlikte ISO 10993-1’de verilen terimler ve tarifler
uygulanır.
3.1 Kültür kapları

Cam petri kapları, plastik kültür kapları veya plastik çok kuyucuklu kaplar ve mikrotitre kapları dâhil hücre
kültürü için uygun kaplar.
Not – Bu kaplar, doku kültür türünün gereklerini karşıladığı ve memeli hücreleri ile birlikte kullanımı uygun
olduğu takdirde bu yöntemlerde dönüşümlü olarak kullanılabilir.
3.2 Pozitif kontrol malzemesi

Bu standarda uygun olarak deneye tabi tutulduğunda tekrarlanabilir sitotoksik bir cevap oluşturan malzeme.
Not – Pozitif kontrolün amacı, uygun bir deney sisteminin cevabını göstermektir. Örneğin, organotin ile
kararlı hale getirilmiş poliüretan2), katı malzemeler ve özütler için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.
Örneğin, seyreltik fenol çözeltileri özütler için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Bir malzemeye ilave
olarak, deney sisteminin performansını göstermek amacıyla saf kimyasal maddeler kullanılabilir.
3.3 Kör numune

Deney numunesini içeren kaba benzer bir kap içinde tutulan ve deney numunesinin özütlenmesi esnasında
tabi tutulduğu şartların aynısına tabi tutulan, deney numunesini içermeyen özütleme aracı.
Not – Kör numunenin amacı, özütleme kabı, özütleme aracı ve özütleme sürecinden kaynaklanan muhtemel
bozucu etkileri değerlendirmektir.
1)
TSE Notu: Atıf yapılan standardların TS numarası ve Türkçe adı 3. ve 4. kolonda verilmiştir. * işaretli
olanlar bu standardın basıldığı tarihte İngilizce metin olarak yayımlanmış olan Türk Standardlarıdır.
2)
ZDEC and ZDBC poliüretanlar, Gıda ve İlaç Güvenliği Merkezi, Hatano Araştırma Enstitüsünden (Ochiai
729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257 - Japan) elde edilebilir.
1
3.4 Negatif kontrol malzemesi

Bu standarda uygun olarak deneye tabi tutulduğunda sitotoksik bir cevap oluşturmayan malzeme.
Not – Negatif kontrolün amacı, hücre cevabının arka planını göstermektir. Örneğin, sentetik polimerler için
yüksek yoğunluklu polietilen3) ve diş malzemesi için alüminyum oksit seramik çubuklar negatif kontrol
olarak kullanılmıştır.
3.5 Deney numunesi

Biyolojik veya kimyasal deneye veya değerlendirmeye tabi tutulan malzeme, cihaz, cihazın bir kısmı, bileşen,
özüt veya bunların bir parçası.
3.6 Sub-konfluens
Hücrelerin yaklaşık % 80 sıkışık olma durumu, örneğin, logaritmik çoğalma fazının sonu.
4 Numune ve kontrol malzemenin hazırlanması

4.1 Genel
Deney,
a) Deney numunesinin bir özütü ve/veya
b) Deney numunesinin kendisi
üzerinde yapılmalıdır.
Numune hazırlanması ISO 10993-12’ye uygun olmalıdır.
Her bir analizde negatif ve pozitif kontroller olmalıdır.
4.2 Malzemenin sıvı özütlerinin hazırlanması
4.2.1 Özütlemenin esasları

Özütleme şartları, muhtemel toksikolojik tehlikeyi tayin edecek şekilde deney malzemesinde füzyon, erime
veya kimyasal yapının değişmesi gibi önemli değişikliklere yol açmadan (klinik uygulama esnasında
beklenmiyorsa) klinik kullanım şartlarının benzeştirilmesini veya arttırılmasını sağlamaya çalışmalıdır. Bazı
malzemelerin (örneğin, biyolojik bozunabilir malzemeler) yapısından dolayı özütleme süreci esnasında
kimyasal yapı değişikliği olabilir.
Not – Özütteki endojen veya yabancı maddelerin derişimi ve böylelikle deney hücrelerine maruz bırakılan
miktar, ara yüzey alanına, özütleme hacmine, pH’ya, kimyasal çözünürlüğe, difüzyon hızına,
ozmolariteye, karıştırmaya, sıcaklığa, süreye ve diğer etkenlere bağlıdır.
Hastada iki veya daha fazla bileşen karıştırılarak elde edilen malzemeler için (örneğin, kemik çimentosu),
son malzeme özütlemeden önce yıkanmamalıdır. Deney numunesinin yıkanması cihaz üzerinde bulunan
kalıntıları azaltabilir veya uzaklaştırabilir. Deney numunesi steril bir ortamda kullanılacaksa, kimyasal
bileşenleri özütlemek için steril edilmiş deney numunesi kullanılmalıdır.
4.2.2 Özütleme aracı

Deney numunesinin kimyasal özelliklerinin dikkate alındığı özütleme aracının/araçlarının seçimi doğrulanmalı
ve doküman hâline getirilmelidir. Memeli hücre analizleri için aşağıda verilen özütleme araçlarından bir veya
daha fazlası kullanılmalıdır.
a) Serumlu kültür vasatı,

b) Fizyolojik tuz çözeltisi,
c) Diğer uygun çözücüler.
3)
Yüksek yoğunluklu polietilen U.S. Pharmacopeia (Rockville, Maryland, USA) ve Gıda ve İlaç Güvenliği
Merkezi, Hatano Araştırma Enstitüsü’nden (Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257 - Japan) elde
edilebilir. 1. ve 2. dipnotta verilen bilgiler, bu standardının kullanıcılarına yararlı olması amacıyla verilmiş
olup bu ürünlerin TSE, CEN veya ISO tarafından onaylandığını göstermez. Aynı sonuçları verdiği
gösterildiği takdirde eşdeğer ürünler kullanılabilir.
2
Özütleme aracının seçimi, özütlemenin amacını yansıtmalıdır. Polar ve polar olmayan özütleme aracının her
ikisinin de kullanılması dikkat edilmesi gereken önemli bir husustur. Serumlu kültür vasatı, tercih edilen
özütleme aracıdır. Özütleme için serumlu kültür vasatının tercih edilmesinin nedeni, polar ve polar olmayan
maddeleri özütlemesinin yanısıra hücre çoğalmasını desteklemesidir. Serumlu kültür vasatına ilave olarak,
özellikle polar maddelerin (örneğin, iyonik bileşikler) özütlenmesi için serumsuz kültür vasatının kullanılması
dikkate alınmalıdır. Diğer uygun özütleme araçları saf su ve dimetil sülfoksittir (DMSO). DMSO, seçilen
analiz sistemlerinde % 0,5’ten (hacimsel olarak) daha yüksek derişimlerde sitotoksiktir. Daha yüksek
seyreltmeden dolayı hücreye maruz bırakılan DMSO içerisindeki özütlerin derişimi serumlu kültür vasatında
yapılan özütlemeye kıyasla daha düşük olur.
Not 1 – Farklı serum tipleri (örneğin, cenin, sığır/dana serumu, buzağı serumu) kullanılabilir ve serum
seçimi hücre tipine bağlıdır.
Not 2 – Serumun/proteinlerin bir dereceye kadar özütlenebilir maddelere bağlanabildiğinin bilinmesi

önemlidir.
4.2.3 Özütleme şartları
4.2.3.1 Özütleme, ISO 10993-12’ye uygun olacak şekilde aseptik teknikler kullanılarak steril ve kimyasal
olarak tepkimesiz kapalı kaplarda yapılmalıdır.
4.2.3.2 Aşağıda verilen istisnai şartlarla birlikte, özütleme işlemi aşağıdaki şartların birinde yürütülmeli ve
cihazın özelliklerine ve belirli kullanım şartlarına göre uygulanmalıdır:
a) (37 ± 1) oC’ta (24 ± 2) h,

b) (50 ± 2) oC’ta (72 ± 2) h,
c) (70 ± 2) oC’ta (24 ± 2) h,
d) (121 ± 2) oC’ta (1 ± 0,2) h.
Cihaz veya malzemenin risk değerlendirmesi için tehlike potansiyelinin ölçülmesini sağlamak amacıyla
kullanılan yukarıdaki özütleme şartları, geçmişteki numune durumlara dayanır. Klinik kullanım esnasında
meydana gelen özütlemeyi benzeştiren veya tehlike potansiyelinin yeterli bir ölçümünü sağlayan diğer
şartlar, örneğin, 37 °C’ta uzatılmış veya kısaltılmış özütleme süreleri kullanılabilir, ancak bu şartlar
doğrulanmalı ve doküman hâline getirilmelidir. Sağlam cilt veya mukoza ile kısa süreli temas eden (toplam
temas süresi 4 h’den daha fazla olmayan) ve vücut içine yerleştirilmeyen tıbbi cihazlar için özütleme süreleri,
Madde a) ila Madde c)’de verildiği gibi 4 h’den daha az olmamak şartıyla 24 h’nin altında olabilir.
(37 ± 1) °C’tan daha yüksek özütleme sıcaklıkları, kültür vasatında bulunan serum ve diğer bileşenlerin
kimyasını ve/veya dayanaklılığını olumsuz yönde etkileyebileceğinden dolayı serumlu hücre kültürü vasatı
sadece Madde a)’da belirtilen şartlarda kullanılabilir.
Daha yüksek sıcaklık özütlenen madde bileşimini değiştirebileceğinden dolayı, polimer deney numuneleri
için özütleme sıcaklığı camsı geçiş sıcaklığını geçmemelidir.
4.2.3.3 Hücrelere uygulanmadan önce özüt; süzülür, santrifüj edilir veya diğer yöntemlerle işlemden
geçirilirse, bu ayrıntılar ilave deney basamakları için mantıksal değerlendirme ile birlikte son raporda
kaydedilmelidir (Madde 9). Özütle ilgili herhangi bir pH ayarlaması raporda belirtilmelidir. Sonucu
etkileyebileceğinden dolayı, pH ayarlaması gibi özüte müdahale edilmesinden sakınılmalıdır.
4.3 Doğrudan temasla yapılan deneyler için malzeme hazırlanması
4.3.1 Deney numunelerinin yapısı

Değişik şekillere, büyüklüklere veya fiziksel hallere (örneğin; sıvı, jel, katı vb.) sahip malzemeler, sitotoksisite
analizlerinde herhangi bir değişiklik yapılmadan deneye tabi tutulabilir.
Tercih edilen katı deney numunesi, en az bir düz yüzeye sahip olmalıdır. Değilse, numunede düz yüzey
oluşturulmalıdır.
4.3.2 Deney numunelerinin sterilliği
4.3.2.1 Deney numunesinin sterilliği dikkate alınmalıdır.

3
4.3.2.2 Steril cihazlardan alınan deney numuneleri deney işlemi boyunca aseptik olarak taşınmalıdır.
4.3.2.3 Normalde steril olmayan şekilde tedarik edilen, ancak kullanmadan önce steril edilen cihazdan
alınan deney numuneleri, imalatçının önerdiği yöntem ile steril edilmeli ve deney işlemi boyunca aseptik
olarak taşınmalıdır.
Sterilizasyon yöntemlerinin veya steril edici maddelerin cihaz üzerindeki etkisi, deney sisteminde
kullanılmadan önce deney numunesinin hazırlanması tarif edilirken dikkate alınmalıdır.
4.3.2.4 Kullanım esnasında steril olması gerekmeyen cihazdan alınan deney numuneleri, tedarik edildiği
şekilde kullanılmalı ve deney işlemi boyunca aseptik olarak taşınmalıdır. Hücre kültürünün kontamine
olmasını engellemek amacıyla deney numunesinin steril edilmesi uygun olabilir, ancak sterilizasyon işlemi
deney malzemelerinin özelliklerini değiştirmemelidir.
Bulaşma yanlış bir sitotoksisite değerlendirmesine yol açabildiğinden dolayı steril olmayan deney numuneleri
kullanılıyorsa, bunlar bakteri bulaşmasının olup olmadığı açısından kontrol edilmelidir.
4.3.3 Sıvı deney numuneleri

Sıvı deney numuneleri;
a) Doğrudan çöktürme veya

b) Biyolojik olarak tepkimesiz emici matriks üzerine çöktürme
ile deneye tabi tutulmalıdır.
Filtre disklerin tepkimesiz emici matriks olarak kullanılması uygun bulunmuştur.
4.3.4 Emici deney numuneleri

Uygun ise, kültür vasatının deney kabında emilmesini önlemek amacıyla emici olan deney numuneleri
deneye tabi tutulmadan önce kültür vasatıyla ıslatılmalıdır.
4.4 Kontrol numunelerin hazırlanması

Kontrol numuneleri, deney numunesiyle aynı işlemle hazırlanabilecek şekilde seçilmelidir.
5 Hücre hatları
Belirlenmiş hücre hatları tercih edilir ve kullanılacağı yerde kabul edilen havuzlardan elde edilmelidir4).
Belirli bir duyarlılığın gerekli olduğu yerde doğrudan canlı dokulardan elde edilen birincil hücre kültürleri,
hücre hatları ve organo-tipik kültürler, sadece hücre cevabının tekrarlanabilirliği ve doğruluğu gösterilebilirse
kullanılabilir.
Bir hücre hattının stok kültürü depolanırsa, dimetilsülfoksit veya gliserol gibi donmaya karşı koruyucu madde
içeren uygun kültür vasatı içerisinde - 80 oC’ta veya daha düşük sıcaklıkta depolanmalıdır. Uzun süreli
depolama (birkaç aydan birkaç yıla kadar) sadece -130 oC’ta veya daha düşük sıcaklıkta mümkündür.
Deney için sadece, mikoplazma içermeyen hücreler kullanılmalıdır. Kullanmadan önce stok kültürler,
mikoplazma olmadığının belirlenmesi için deneye tabi tutulmalıdır.
Deneylerdeki duyarlılık pasaj sayısına göre değişebileceğinden, hücrelerin düzenli olarak kontrol edilmesi
(örneğin, morfolojisi, bölünme süresi, model kromozom sayısı) önemlidir. Uygun hücre kültürü uygulamaları
kullanılmalıdır [5].
4)
Örneğin, American Type Culture Collection CCL 1 (NCTC clone 929), CCL 163 (Balb/3T3 clone A31), CCL
171 (MRC-5) and CCL 75 (WI-38), CCL 81 (Vero) ve CCL 10 BHK-21 (C-13) ve V-79 379A hücre
hatlarının uygunluğu ISO uzmanlarınca belirlenir. Bu bilgi, bu standardın kullanıcılarına yararlı olması
amacıyla verilmiş olup söz konusu ürünlerin ISO tarafından onaylandığını göstermez. Aynı veya benzer
sonuçları verdiği gösterildiği takdirde diğer hücre hatları da kullanılabilir.
4
6 Kültür vasatı
Kültür vasatı steril olmalıdır.
Serumlu veya serumsuz kültür vasatı, seçilmiş hücre hattının çoğalması için gerekli şartları sağlamalıdır.
Analizleri olumsuz etkilememesi şartıyla ortama antibiyotikler eklenebilir.
Depolama şartları doğrulanmalıdır.
Not - Kültür vasatının dayanıklılığı bileşimine ve depolama şartlarına göre değişir. Kültür vasatının pH’sı 7,2
ile 7,4 arasında olmalıdır.
7 Stok hücre kültürünün hazırlanması

Deneyi tamamlamak için, seçilen hücre hattı ve kültür vasatı kullanılarak yeterince hücre hazırlanır. Hücreler
depodan alınan kültürlerden çoğaltılacaksa, varsa donmaya karşı koruyucu madde uzaklaştırılır. Hücreler
kullanılmadan önce en az bir defa pasajlanır.
Hücreler pasajlanırken, hücre hattı için uygun yöntem kullanılarak enzimatik ve/veya mekanik ayırma ile
hücreler kaldırılır ve yeniden süspansiyon haline getirilir.
8 Deney işlemleri
8.1 Kopya sayısı
Deney numuneleri ve kontrolleri için en az üç kopya kullanılmalıdır.
8.2 Özütler üzerindeki deney
8.2.1 Bu deney, sitotoksisitenin nitel ve nicel olarak değerlendirilmesini sağlar.
8.2.2 Özütlere maruz bırakmak amacıyla yeterli sayıdaki kapların her birine sürekli karıştırılan hücre
süspansiyonundan bir kısım pipetle alınır. Her bir kap yavaşça döndürülerek hücrelerin, kabın yüzeyine eşit
olarak yayılması sağlanır.
8.2.3 Kültürler, kültür vasatı için seçilen tampon sistemine uygun olacak şekilde karbondioksitli veya
karbondioksit içermeyen havayla (37 ± 1) oC’ta inkübe edilir.
Deney, konfluent olmamış tek katman veya yeni süspansiyon haline getirilmiş hücreler üzerinde
uygulanmalıdır.
Koloni oluşturma analizinde sadece uygun düşük hücre yoğunluğu kullanılmalıdır.
8.2.4 Deneye başlamadan önce kültürlerin konfluens olduğu ve morfolojisi mikroskopla doğrulanır.
İstisnai durumlarda, üstel olarak çoğalan hücreler (örneğin, primer hücreler, hızlı çoğalan hücreler) deneyin
başlangıç noktasında ekilebilir.
8.2.5 Deney;
a) Orijinal özüt üzerinde ve/veya

b) Orjinal özüt ve özütleme aracının seyreltici olarak kullanıldığı bir dizi özüt seyreltisi üzerinde
gerçekleştirilir.
Alternatif olarak, sınırlı çözünürlüğe sahip malzemelerin var olduğu biliniyorsa veya varlığından
şüpheleniliyorsa, deney numunesinin orjinal özütü/özütleme vasatı oranı değiştirilerek seyreltme yapılmalıdır.
Deney için tek katmanlı hücre kültürleri kullanılıyorsa, kültür vasatı kültürlerden uzaklaştırılır ve her bir
kuyucuğa özütün bir kısmı veya seyreltik özüt eklenir.
Deney için süspansiyon hâlindeki hücreler kullanılıyorsa, hücre süspansiyonunun hazırlanmasından hemen
sonra her bir kopya kuyucuğa özüt veya seyreltik özüt eklenir.
5
8.2.6 Fizyolojik olmayan bir özüt kullanıldığında (örneğin, su), özüt, kültür vasatıyla seyreltildikten sonra
fizyolojik olarak en yüksek uygun derişimde deneye tabi tutulmalıdır.
Not – Derişik kültür vasatı, örneğin, 2x, 5x, sulu özütleri seyreltmek için tavsiye edilir.
8.2.7 Kör numune, negatif ve pozitif kontrollerin bilinen alikotları ilave kopya kaplarına eklenir.
Not – Uygulanabilirse, taze kontrol kültür vasatı da deneye tabi tutulabilir.
8.2.8 Kaplar, Madde 2.8.3’te belirtilen aynı şartlar kullanılarak seçilmiş belirli analizle ilgili uygun bir süre
boyunca inkübe edilir.
8.2.9 En az 24 h’lik bir inkübasyon periyodundan sonra sitotoksik etkiler Madde 8.5’e uygun olarak tayin
edilir.
8.3 Doğrudan temasla yapılan deneyler
8.3.1 Bu deney, sitotoksisitenin nitel ve nicel olarak değerlendirilmesine imkan sağlar.
8.3.2 Deney numunesine doğrudan uygulamak için sürekli olarak karıştırılan hücre süspansiyonunun bir
alikotu, yeterli sayıdaki kapların her birine pipetle alınır. Kaplar yatay konumda yavaşça döndürülerek
hücrelerin her bir kabın yüzeyine eşit olarak yayılması sağlanır.
8.3.3 Kültürler, sub-konfluens gösterinceye kadar kültür vasatı için seçilen tampon sistemine uygun olacak
şekilde karbondioksitli veya karbondioksitsiz havada, (37 ± 1) oC’ta inkübe edilir.
8.3.4 Deneye başlamadan önce kültürlerin sub-konfluens olduğu ve morfolojisi mikroskopla doğrulanır.
İstisnai durumlarda, üstel olarak çoğalan hücreler (örneğin, primer hücreler, hızlı çoğalan hücreler) deneyin
başlangıç noktasında ekilebilir.
8.3.5 Kültür vasatı çekilir ve atılır. Daha sonra her bir kaba taze kültür vasatı ilave edilir.
8.3.6 Deney numunesinden alınan örneklerin her biri, her bir kopya kabın ortasındaki hücre katmanı üzerine
dikkatlice yerleştirilir. Örneğin hücre katmanı yüzeyinin yaklaşık onda birini kapladığından emin olunur.
Doğrulandığı takdirde, örnek yüzeyinin hücre katman yüzeyine olan diğer oranları kullanılabilir.
Hücreler üzerinde fiziksel travmaya neden olabileceğinden dolayı numunelerin gereksiz hareketini önleme
konusunda dikkatli davranılır. Örneğin, gereksiz hareket ettirme sonucu hücreler yerlerinden kalkabilir.
Not – Uygun olduğunda, örnek, hücrelerin ekilmesinden önce kültür kabına yerleştirilebilir.
8.3.7 Negatif kontrol ve pozitif kontrol malzemeleri içeren kopya kaplar hazırlanır.
8.3.8 Kaplar, Madde 8.3.3’te belirtilen aynı şartlar kullanılarak seçilmiş belirli bir analize karşılık gelen uygun
bir süre boyunca (en az 24 h) inkübe edilir.
8.3.9 Sitotoksik etkileri belirlemek amacıyla Madde 8.5’e uygun olarak kimyasal maddeler/boyalar
eklenmeden önce üstte kalan kültür vasatı atılır.
6
8.4 Dolaylı temasla yapılan deney
8.4.1 Agar difüzyon deneyi
8.4.1.1 Bu deney, sitotoksisitenin nitel olarak değerlendirilmesine imkan sağlar. Bu analiz, agar katmanı
içerisine nüfuz etmeyen veya agar ile tepkimeye girebilen süzülebilir maddeler için uygun değildir.
Sitotoksisitenin değerlendirilmesi için agar difüzyon deneyinin kullanılması doğrulanmalıdır.
8.4.1.2 Deney için, sürekli olarak karıştırılan hücre süspansiyonunun bilinen bir alikotu, yeterli sayıdaki
kapların her birine pipetle alınır. Kaplar yatay olarak yavaşça döndürülerek hücrelerin her bir kabın yüzeyine
eşit olarak yayılması sağlanır.
8.4.1.3 Kültürler, kültür vasatı için seçilen tampon sistemine uygun olarak çoğalma eğrisinin logaritmik
fazının sonunda sub-konfluens gösterinceye kadar karbondioksitli veya karbondioksitsiz havada (37 ± 1)
o
C’ta inkübe edilir.
8.4.1.4 Deneye başlamadan önce kültürlerin sub-konfluens olduğu ve morfolojisi mikroskopla doğrulanır.
8.4.1.5 Kültür vasatı kaplardan çekilir ve atılır. Daha sonra serumlu taze kültür vasatı ile erimiş agar
karıştırılarak % 0,5 ila % 2’lik bir agar kütle derişimi elde edilir ve her bir kaba uygun miktarda pipetle alınır.
Memeli hücrelerinin kültür ortamında çoğalmaları için sadece, uygun olan agar kullanılır. Agar kültür vasatı
karışımı sıvı hâlde ve memeli hücreleri için uygun sıcaklıkta olmalıdır.
Not – Agar, çeşitli moleküler ağırlıklarda ve saflıklarda elde edilebilir.
8.4.1.6 Deney numunesinden alınan örneklerin her biri, her bir kaptaki katılaşmış agar katmanına dikkatlice
yerleştirilir. Örneğin hücre katmanı yüzeyinin yaklaşık onda birini kapladığından emin olunur.
Doğrulandığı takdirde, örnek yüzeyinin hücre katmanı yüzeyine olan diğer oranları kullanılabilir.
Agarın suyunu kaybetmesini önlemek için emici herhangi bir malzeme, agar üstüne yerleştirilmeden önce
kültür vasatı ile ıslatılır.
8.4.1.7 Negatif kontrol ve pozitif kontrol numunelerini içeren kopya kaplar hazırlanır.
8.4.1.8 Kaplar, Madde 8.4.1.3’te belirtilen aynı şartlar kullanılarak 24 h - 72 h boyunca inkübe edilir.
8.4.1.9 Hücreler, sitotoksik etkileri belirlemek için numuneler agardan dikkatlice çıkarılmadan önce ve sonra
incelenir.
Nötral kırmızı gibi vital boya kullanılması sitotoksisitenin tayin edilmesinde yardımcı olabilir. Vital boya,
numuneyle inkübe edilmeden önce veya sonra ilave edilebilir. Boya inkübasyondan önce ilave edilirse,
boyanın fotoaktivasyonu sonucu oluşan hücre hasarını önlemek için kültürler ışıktan korunur.
8.4.2 Filtre difüzyon deneyi
8.4.2.1 Bu deney sitotoksisitenin nitel olarak değerlendirilmesine imkan sağlar.
8.4.2.2 Deney için yüzey aktif madde (sürfaktan) içermeyen 0,45 µm gözenek büyüklüğüne sahip bir filtre
her bir kaba yerleştirilir ve sürekli olarak karıştırılan hücre süspansiyonunun bilinen bir alikotu yeterli sayıdaki
kopya kapların her birine ekilir. Kaplar yatay olarak yavaşça döndürülerek hücrelerin her bir filtre yüzeyine
eşit olarak yayılması sağlanır.
8.4.2.3 Kültürler, kültür vasatı için seçilen tampon sistemine uygun olacak şekilde büyüme eğrisinin
logaritmik fazının sonunda konfluens gösterinceye kadar karbondioksitli veya karbondioksitsiz havada, 37 ±
1 oC’ta inkübe edilir.
8.4.2.4 Kültür vasatı kaplardan çekilir ve atılır. Daha sonra filtreler, hücre ekilen tarafı aşağı gelecek şekilde
katılaşmış agar katmanı üzerine yerleştirilir (Madde 8.4.1.5).
7
8.4.2.5 Deney numunesinden alınan örneklerin her biri filtrenin hücre içermeyen üst yüzeyine dikkatlice
yerleştirilir. Sıvı özütler ve taze olarak karıştırılmış bileşikler, filtre üzerine yerleştirilen reaktif olmayan
halkalar içinde tutulur.
8.4.2.6 Negatif kontrol ve pozitif kontrol örneklerini içeren kopya filtreler hazırlanır.
8.4.2.7 Kaplar, Madde 8.4.2.3’te belirtilen aynı şartlar kullanılarak 2 h ± 10 min boyunca inkübe edilir.
8.4.2.8 Numuneler filtreden dikkatlice çıkartılır ve filtre agar yüzeyinden dikkatli bir şekilde ayrılır.
8.4.2.9 Uygun boyama işlemi kullanılarak sitotoksik etkiler tespit edilir.
8.5 Sitotoksisitenin tespit edilmesi
8.5.1 Sitotoksik etkiler nitel veya nicel yöntemlerle tespit edilir. Sitotoksisitenin nicel değerlendirmesi tercih
edilir. Nitel yöntemler tarama amaçlı uygulamalar için uygundur.
Nitel değerlendirme: Hücreler, istendiği takdirde sitokimyasal boyama kullanılarak mikroskopla incelenir.
Örneğin, genel morfoloji, vakuol oluşması, hücrenin yüzeyden kalkması, hücre yıkımı ve membran
bütünlüğündeki değişiklikler değerlendirilir. Normal morfolojideki değişiklik deney raporunda tanımlayıcı veya
sayısal olarak kaydedilmelidir. Çizelge 1 ve Çizelge 2’de deney numunelerini derecelendirmek için uygun bir
yol verilmiştir.
Çizelge 1 – Özütlerin sitotoksisitesinin nitel morfolojik derecelendirilmesi
Derece Reaksiyon Kültürlerin durumları
Ayrık sitoplazma içi granüller, hücre yıkımı yok, hücre çoğalmasında azalma
0 Yok
yok
Hücrelerin % 20’sinden daha fazlası yuvarlak olmayan, zayıf tutunmuş ve
sitoplazma içi granül içermeyen veya morfolojide değişiklikler gösteren,
1 Çok az nadiren yıkıma uğramış hücreler var, sadece hafif büyüme inhibisyonu
gözlemlenebilir
Yuvarlak hücre sayısı % 50’den daha az, sitoplazma içi granül yok, aşırı hücre
2 Hafif yıkımı yok, gözlemlenebilir hücre inhibisyonu % 50’den daha fazla değil
Yuvarlak veya yıkıma uğramış hücre sayısı hücre katmanının % 70’inden daha
fazlası değil, hücre katmanları tamamen parçalanmış değil, gözlemlenebilir
3 Orta
hücre inhibisyonu % 50’den daha fazla
4 Şiddetli Hücre katmanların tamamı veya tamamına yakını yıkıma uğramış
Çizelge 2 – Agar ve filtre difüzyon deneyi ile doğrudan temasla yapılan deney için reaksiyon dereceleri
Reaksiyon zonunun tanımlanması

Derece Reaksiyon
0 Yok Numune etrafında veya altında saptanabilir bir zon yok
1 Çok az Numune altında bazı şekli bozuk veya parçalanmış hücreler var
2 Hafif Sadece numune altında zon oluşumu var
3 Orta Zon oluşumu numune sınırlarını 1 cm’e kadar aşmış
4 Şiddetli Zon oluşumu numune sınırlarını 1 cm’den daha fazla aşmış
Değerlendirme yöntemi ve değerlendirme sonuçları deney raporuna eklenmelidir.

Çizelge 1 ve Çizelge 2’de belirtilen 2’den daha büyük derecelendirme değerinin bulunması sitotoksik etki
olarak kabul edilir.
8
Nicel değerlendirme: Hücre ölümü, hücre gelişiminin baskılanması, hücre çoğalması veya koloni oluşması
parametreleri ölçülür. Hücre sayısı, protein miktarı, enzimlerin salınması, vital boyaların salınması, vital
boyanın indirgenmesi veya diğer ölçülebilir parametreler objektif yollarla hesaplanabilir. Objektif ölçüm ve
cevap, deney raporuna kaydedilmelidir.
Hücre canlılığının % 30’dan daha fazla azalması sitotoksik etki olarak kabul edilir. Diğer ölçütler farklı kesim
noktaları veya kabul edilebilir bir deney/kontrol oranının sonucu dâhil, alternatif hücre hatları veya çok
katmanlı doku yapıları için doğrulanmalıdır. Bu ölçütler doğrulanmalı ve doküman hâline getirilmelidir.
Ek A ila Ek D’de tarif edilen protokoller özütlerin nicel tayini için kullanılabilir.
Not – A ve B protokollerinin uluslararası geçerli kılma çalışmalarında kimyasal maddeler ve karşılıklı kabul
görmüş uluslararası bir deneyde tıbbi cihazlar için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokoller
sitotoksik malzemeler için IC50 değerinin (söz konusu ulaşılacak hedefi % 50 oranında etkileyen
inhibe edici derişim) hesaplanmasıyla sitotoksik etkinin derecelendirilmesine imkan sağlar. Ek C ve
Ek D, sitotoksisitenin nicel değerlendirilmesi için yaygın olarak kulanılan diğer protokolleri tarif eder.
Sitotoksisitenin tespit edilmesinde kullanılan belirli yöntemler için başlangıç noktasındaki durum veya temel
alınan hücre kültürünün kontrolü gerekli olabilir.
8.5.2 Deney numunesi, deney sistemini veya ölçümü bozacak maddeler saldığında deney sonuçları
geçersiz olabileceğinden dolayı, değerlendirme yöntemlerinin seçimine dikkat edildiğinden emin olunmalıdır.
Formaldehit salabilen malzemeler sadece, hücre canlılığı değerlendirildiğinde güvenilir şekilde deneye tabi
tutulabilir.
8.5.3 Kopya kültür kapları ile ilgili deney sonucunda belirli farklılıklar varsa, deney uygun değildir veya
geçersizdir. Bu durumda, deney tekrarlanmalı veya alternatif bir yöntem kullanılmalıdır.
8.5.4 Negatif, pozitif ve diğer kontroller (referans, vasat, kör, reaktif vb.) deney sisteminde beklenen cevabı
vermezse, analiz/analizler tekrarlanır.
9 Deney raporu5)
Deney raporunda en az aşağıdaki ayrıntılar bulunmalıdır.
a) Deneyi yapan kuruluşun adı ve adresi,

b) Deneyi yürüten kişinin/kişilerin adı,
c) Deneyin başlangıç ve bitiş tarihleri,
d) Numunenin tanımlanması,
e) Hücre hattı, seçimin ve hücre kaynağının/kaynaklarının doğrulanması,
f) Vasatın, ilave edilirse serumun ve antibiyotiğin firma adı ve parti numarası,
g) Analiz yöntemi ve mantıksal değerlendirme,
h) Uygulanabilirse, özütleme işlemi ve mümkünse, süzülen maddenin/maddelerin türü ve derişimi,
i) Negatif, pozitif ve diğer kontroller,
j) Hücre cevabı ve diğer gözlemler,
k) Sonuçların değerlendirilmesi için gereken diğer ilgili veriler.
5)
TSE Notu: Deney Raporu burada istenilen bilgilere ilâveten, TS EN ISO/IEC 17025’ de verilen bilgileri de
ihtiva edecek şekilde düzenlenebilir.
9
10 Sonuçların değerlendirilmesi
Sonuçların toplam değerlendirilmesi, deney verilerine dayanarak güvenilir kararlar verebilme yeteneğine
sahip bir kişi tarafından yapılmalıdır. Sitotoksisite, diğer biyouyumluluk verileriyle ve mamulün tasarımlanan
amacıyla ilgili olarak değerlendirilmelidir.
Sitotoksisite deney sonuçlarının yorumlanmasında, ISO 10993-1’de verildiği gibi cihazın sınıfı dikkate
alınmalıdır.
Sitotoksik bir etki varsa, daha ileri değerlendirme yapılabilir, örneğin:
a) İlave deneyler (serum var/yok, kültür vasatında serum seviyesinin değiştirilmesi),

b) Özüt analizi (örneğin, sterilizasyon ve diğer üretim süreçlerinden kaynaklanan kalıntılar), uygun olduğu
yerde,
c) Seyreltilerin derişimlerine karşı oluşan cevabın analizi,
d) Süzülebilir bileşenlerin kimyasal tanımlanması,
e) Diğer deney işlemleri.
Herhangi bir sitotoksik etki endişe konusu olabilir. Ancak, bu durum esas olarak in vivo toksisitenin muhtemel
bir göstergesidir ve sadece sitotoksik verilere dayanan bir klinik uygulama için uygun olmadığı takdirde tespit
edilmesi gerekli değildir.
10
Ek A
(Bilgi için)
Nötral kırmızısı alımı (NKA) sitotoksisite deneyi
A.1 Genel
Aşağıdaki deney protokolü, bu deneyle ilgili Ek C’de verilen bölümlere dayanır ve sadece bu bölümleri tarif
eder [1].
A.2 Deney işlemi
A.2.1 Temel işlem

BALB/c 3T3 hücreleri 96 kuyucuklu kaplara ekilir ve yarı konfluent tek bir katman oluşturmak amacıyla 24 h
boyunca (< 1 bölünme periyodu) inkübe edilir (hücre inkübasyonu ve kültür işlemleri hakkında daha fazla
bilgi için Kaynak [5]’e bakınız). Daha sonra hücreler 24 h boyunca farklı derişimlerdeki deney bileşiklerine
maruz bırakılarak her bir derişim uygulaması için NKA belirlenir ve kontrol kültürlerinde belirlenen değerlerle
karşılaştırılır. Özüt, hücreler üzerinde sitotoksik bir etki gösteriyorsa her uygulama için (örneğin, deney
maddesinin derişimi) büyüme yüzdesinin inhibisyonu hesaplanır. IC50, (örneğin, NRA’nın % 50 azalmasına
yol açan derişim) derişime karşı oluşan cevaptan hesaplanır ve özütün seyrelti yüzdesi olarak ifade edilir.
Saf özüt, % 100 özüt olarak gösterilir.
A.2.2 Malzeme
A.2.2.1 Hücre hattı

BALB/c 3T3 hücreleri, klon 31 (örneğin, ECACC86110401, Avrupa Hücre Kültürü Koleksiyonu, Salisbury,
Wiltshire SP4 0JG, UK; CCL-163, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu [ATCC], Manassas, VA, USA) ve JCRB
9005, CCL-163 [ATCC] hazırlanmış, İnsan Araştırma Kaynakları Bankası, Osaka, Japan.
A.2.2.2 Teknik donanım
A.2.2.2.1 İnkübatör, 37 °C, nemli, % 5 CO2/hava [alternatif olarak, hücre kültürü vasatında uygun bir
tamponun yokluğunda, hücreler pH değişikliklerine çok duyarlı olduğundan % 7,5 CO2/hava kullanılabilir;
ancak bir çok laboratuvarda % 5 daha yaygın olarak kullanılır ve daha iyi tamponlama için HEPES [asit 4-(2-
hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit] eklenir.
A.2.2.2.2 Laminer akış kabini, standard: “mikrobiyolojik güvenlik kabini”.
A.2.2.2.3 Su banyosu, 37 °C.
A.2.2.2.4 Ters faz kontrast mikroskobu.
A.2.2.2.5 Laboratuvar beki.
A.2.2.2.6 Santrifüj, tercihe bağlı olarak mikrotitre rotor kaplar.
A.2.2.2.7 Laboratuvar terazisi.
A.2.2.2.8 96- kuyucuklu kap fotometresi, 540 nm filtreli.
A.2.2.2.9 Çalkalayıcı, mikrotitre kaplar için.
A.2.2.2.10 Hücre sayıcı veya hemasitometre.
A.2.2.2.11 Pipetleyici..
A.2.2.2.12 Pipetler, 8-kanallı pipetler, seyreltme bloğu.
11
A.2.2.2.13 Kriyotüpler.
A.2.2.2.14 Doku kültürü kapları, 80 cm2, 25 cm2.
A.2.2.2.15 96- kuyucuklu doku kültürü mikrotitre kapları.
A.2.2.3 Kimyasal maddeler, vasatlar ve serum.
A.2.2.3.1 Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium (DMEM), L-glutamin içermeyen.
A.2.2.3.2 L-glutamin, 200 mM, veya glutamaks.
A.2.2.3.3 Yeni doğmuş buzağı serumu (NBCS).
ÖNEMLİ - Fötal buzağı serumu (FCS) kullanılmamalıdır. FCS, hücrelerde vakuol oluşumundan dolayı
absorbans değerlerinde ciddi bir düşüşe neden olur.
NBCS’nin parti değişkenliğinden dolayı ilk önce 3T3 hücrelerinde (20 -25 h arasında bölünme hızı) büyüme
uyarıcı özellikleri kontrol edilir ve yeterli miktarda NBCS depolanır.
A.2.2.3.4 Tripsin/EDTA çözeltisi.
A.2.2.3.5 Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), Ca2+ and Mg2+ içermeyen (tripsinizasyon için).
A.2.2.3.6 HEPES (Madde A.2.2.2.1).
A.2.2.3.7 PBS, Ca2+ve Mg2+ içeren (yıkama için).
A.2.2.3.8 Penisilin/streptomisin çözeltisi.
A.2.2.3.9 Nötral kırmızısı (NK).
A.2.2.3.10 Dimetil sülfoksit (DMSO), analitik saflıkta.
A.2.2.3.11 Etanol (EtOH), analitik saflıkta.
A.2.2.3.12 Saf asetik asit, analitik saflıkta.
A.2.2.3.13 Damıtık su veya hücre kültürü için uygun herhangi bir şekilde saflaştırılmış su.
A.2.2.4 Hazırlıklar
A.2.2.4.1 Genel
Bütün çözeltiler, (NK stok çözeltisi, NK vasatı ve NK geri çıkarma vasatı hariç), cam malzeme vb. steril olmalı
ve bütün işlemler aseptik şartlar altında laminer akış kabininde (mikrobiyolojik güvenlik kabini) steril bir
ortamda yapılmalıdır.
A.2.2.4.2 Vasatlar
DMEM (sodyum karbonatla tamponlanmış) aşağıdakileri içerir (DMEM içinde son derişimler verilmiştir):
(A) Dondurma için
− % 20 NBCS
− % 7 - % 10 DMSO
(B) Rutin kültür için
− % 10 NBCS
− 4 mM L-glutamin veya glutamaks
12
− 100 IU/mL penisilin

− 100 µg/mL streptomisin
− 20 mM HEPES
(C) Deney numuneleri ile muamele etmek için
− %5 NBCS
− 4 mM L-glutamin or glutamaks
− 20 mM HEPES
Tamamlanmış vasatlar 4 °C’ta depolanmalı ve iki haftadan daha uzun süre tutulmamalıdır. Serumdaki
proteinler deney maddesinin toksisitesini maskeleyebileceğinden numune ile muamele etmek için
kullanılacak olan vasatın serum derişimi % 5’e düşürülür. Serum yokluğunda hücre çoğalması önemli
derecede azalacağından vasattan tamamen çıkartılamaz.
A.2.2.4.3 Nötral kırmızısı (NK) stok çözeltisi
− 0,4 g NK boyası
− 100 mL H2O
NK stok çözeltisi, hazırlandıktan sonra oda sıcaklığında karanlık ortamda iki aya kadar saklanır. Ticari olarak
hazır satılan nötral kırmızısı stok çözeltisi, etiket bilgilerine uygun olarak depolandığında son kullanma
tarihine kadar kullanılabilir.
A.2.2.4.4 Nötral kırmızısı (NK) vasatı
1 mL NK stok çözelti
79 mL DMEM
NK vasatı hücrelere eklenmeden önce 37 °C’ta gece boyunca inkübe edilmeli ve 600 g’de 10 dakika santrifüj
edilmelidir (NK kristallerini uzaklaştırmak için). NK vasatının kristal içermediği garanti edildiği takdirde
alternatif işlemler (örneğin, milipor filtreden geçirme) kullanılabilir. NK vasatı alikotları hücrelere eklenmeden
önce 37 °C’ta tutulmalıdır (örneğin, su banyosu içerisinde). Bu alikotlar hazırlandıktan sonra 30 dakika
içerisinde ve 37 °C’tan alındıktan sonra 15 dakika içerisinde kullanılmalıdır.
A.2.2.4.5 Etanol/asetik asit çözeltisi (NK geri çıkarma vasatı)
− %1 saf asetik asit çözeltisi

− % 50 etanol
− % 49 H2O
NK geri çıkarma vasatı, kullanılmadan hemen önce hazırlanır. Bir h’den daha fazla saklanmaz.
A.2.2.4.6 Numune özütünün hazırlanması

Numuneler ISO 10993-12’ye uygun olarak hazırlanır.
A.2.3 Yöntemler
A.2.3.1 Genel
Rutin hücre kültürü yöntemleri için Kaynak [1]’in Ek C’sine bakınız.
A.2.3.2 Deney (I) ve pozitif kontrol (PK) için kalite kontrol

Her sitotoksisite deneyinde bir pozitif kontrol bulunmalıdır.
13
Geçmişte veya laboratuvar içi veya laboratuvarlar arası yeterince tekrarlanan deneylerle desteklenmiş birçok
kimyasal madde ile ilgili olarak, sodyum laurel sülfat (SLS, CAS # 151-21-3) en sık deneye tabi tutulanlardan
biridir ve bu nedenle pozitif kontrol olarak tavsiye edilir. SLS’in dört farklı derişimde deneye tabi tutulması
tavsiye edilir: 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,15 mg/mL, 0,2 mg/mL.
SLS’nin geçmişteki ortalaması, IC50, (Spielmann ve ark., 1991 [10]) 0,093 mg/mL’dir.
% 95 GA (güven aralığı) 0,070 mg/mL - 0,116 mg/mL’dir.
Bir deney, SLS’in IC50 değeri % 95 GA içindeyse, kabul ölçütlerini karşılar.
Pozitif ve negatif referans malzemelerinin kullanılması tavsiye edilir [örneğin, ZDEC ve ZDBC (dipnot 1’e ve
Madde 3.2 ile Madde 3.4’e bakınız)].
A.2.3.3 Analizin (II) kalite kontrolü; kör okuma

Muamele edilmemiş kör numuneden okunan optik yoğunluğun mutlak değeri (NKA’nın OD540 değeri) her bir
kuyucuğa ekilen 1x104 hücrenin, analizin ilk iki gününde normal bölünme süresiyle birlikte üstel olarak
çoğalıp çoğalmadığını gösterir.
Bir deney, kör numunelerin ortalama OD540 değeri ≥ 0,3 olduğunda kabul ölçütlerini karşılamış olur.
Sistematik hücre ekimi hatalarını kontrol etmek için kör numuneler özüt şartları altında muameleye tabi
tutulur (Madde A.2.2.4.6) ve 96 kuyucuklu kapların soluna (2. sıra) ve sağına (11. sıra) yerleştirilir (2. sıra ve
11. sıra kullanılmamalıdır; kuyucuk yerleşimi için Kaynak [1]’in Ek E’sine bakınız).
Bir deney, kör numunelerin solundaki ve sağındaki ortalaması bütün kör numunelerin ortalamasının %
15‘inden daha fazla farklılık göstermediği durumda kabul ölçütlerini karşılar.
Hücre sayısının tutarlı olduğundan emin olmak için her bir kültür kabı faz kontrast mikroskobunda
incelenerek de hücre ekimi hataları kontrol edilebilir. Mikroskobik değerlendirme iki sıra kör numune
kullanılması ihtiyacını ortadan kaldırır.
A.2.3.4 Derişime bağlı oluşan cevabın kalite kontrolü

Derişime bağlı oluşan cevaptan elde edilen IC50 değeri, NKA inhibisyonunun % 10 - % 90’ı arasındaki en az
iki, mümkünse üç cevapla desteklenmelidir. Böyle değilse, derişim artış faktörü kolaylıkla düşürülebilir, deney
reddedilir ve daha küçük bir artış faktörü ile tekrarlanır.
A.2.3.5 Deney numunesi özütlerinin derişimleri
A.2.3.5.1 Aralık belirleme deneyi

Stok çözelti, sabit bir faktörle seyreltilerek geniş aralıkta (örneğin, yarı logaritmik aralıklarda) numune
özütünün sekiz derişimi deneye tabi tutulur. En yüksek numune özütü derişimini içeren hücre kültürünün
canlılığındaki azalma % 30 veya daha azsa, malzemenin toksik olmadığı kabul edilir ve daha fazla ana
deneyin yapılmasına gerek yoktur.
A.2.3.5.2 Ana deney

Aralık belirleme deneyinden hesaplanan derişime bağlı oluşan cevap eğrisinin eğimine dayanarak ana
deneyin derişim dizilerindeki seyreltme/artış faktörü daha küçük olmalıdır (örneğin, 6 10 = 1,47). İlgili derişim
aralığının (% 10 ile % 90 aralığında etki) dereceli etkinin en az üç noktası ile birlikte kapsanmasına dikkkat
edilir. Çok fazla sitotoksik olmayan ve/veya % 100 sitotoksik derişimlerden kaçınıılr.
A.2.3.6 Deney işlemi
ÖNEMLİ – Stoktan çözüldükten sonra hücreler deneyde kullanılmadan önce iki veya üç defa pasajlanır.
14
Çizelge A.1 – Deney işleminin iş akışını gösterir.
1. gün
Kültür vasatı içerisinde 1x105 hücre/mL yoğunlukta hücre süspansiyonu hazırlanır. Çok kanallı bir pipet
kullanılarak 100 µL hücre içermeyen kültür vasatı, 96 kuyucuklu doku kültürü mikrotitre kabın sadece
kenarındaki kuyucuklara pipetlenir (kör numuneler için Kaynak [1]’in Ek E’sine bakınız). Geri kalan
kuyucuklara, 1x105 hücre/mL yoğunluktaki hücre süspansiyonundan 100 µL eklenir (=1x104 hücre/kuyucuk).
Deneye tabi tutulacak her numune özütü, pozitif kontrol ve negatif kontrol malzemesi (varsa) için ayrı birer
kültür kabı hazırlanır.
Hücreler yarı konfluent bir katman oluşturuncaya kadar 24 h boyunca inkübe edilir (% 5 CO2, 37 °C, > % 90
nem). Bu inkübasyon periyodu hücrelerin toparlanmasını, yapışmasını ve üstel çoğalma fazına doğru
gelişmesini sağlar.
Hücre çoğalmasının mikrotitre kapta nispeten eşit yayıldığını kontrol etmek için her hücre kabı faz kontrast
mikroskobunda incelenir. Bu kontrol, deneysel hataları belirlemek için yapılır.
2. gün
24 h inkübasyondan sonra kültür vasatı çekilir ve atılır.
Her kuyucuğa uygun derişimde numune özütü veya negatif kontrolü veya pozitif kontrolü içeren 100 µL
deney vasatı veya kör vasat eklenir.
Hücreler 24 h boyunca inkübe edilir (% 5 CO2, 37 °C, > % 90 nem).
3. gün
24 h’lik inkübasyondan sonra sistematik hücre ekimi hatalarını ve kontrol ve muamele edilmiş hücrelerin
çoğalma karakteristiklerini belirlemek amacıyla her kültür kabı faz kontrast mikroskobunda incelenir. Deney
numunesi özütünün sitotoksik etkilerinden dolayı hücrelerin morfolojisinde oluşan değişiklikler kaydedilir.
Ancak bu kayıtlar kabul edilebilir en yüksek dozun veya sitotoksisitenin diğer herhangi bir nicel ölçümü için
kullanılmaz. Kontrol hücrelerinin istenmeyen çoğalma karakteristikleri deneysel hatayı gösterebilir ve deneyin
reddedilmesi için bir neden olabilir.
NKA’nın ölçümü Ellen Borenfreund ölçümüne dayanır (Borenfreund ve Puerner [3]). NK’nin canlı hücrelerde
lizozomların/endozomların ve vakuollerin içine girmesi, hücre sayısının ve canlılığının nicel bir göstergesi
olarak kullanılabilir.
Hücreler, 150 µL önceden ısıtılmış PBS ile yıkanır. Hafifçe tıklatarak PBS çekilir ve atılır. 100 µL NK vasatı
eklenir ve % 5 CO2’li nemli ortamda 37 °C’ta 3 h inkübe edilir.
İnkübasyondan sonra NK vasatı çekilir ve hücreler 150 µL PBS ile yıkanır.
PBS tamamen çekilir (isteğe bağlı olarak, ters çevrilmiş kap santrifüj edilir).
Bütün kuyucuklara, kör kuyucuklar dâhil 150 µL NK çıkartma çözeltisi eklenir (EtOH/asetik asit).
Mikrotitre kap çalkalayıcıda NK hücrelerden çıkarılana ve homojen bir çözelti oluşturuncaya kadar 10 dakika
boyunca hızlıca çalkalanır.
Elde edilen renkli çözeltinin absorpsiyonu mikrotitre kap okuyucuda 540 nm’de ölçülür ve kör vasatlar
referans olarak alınır. Ham veri, derişime bağlı oluşan cevabın ileri analizi ve IC50 değerinin hesaplanması
için uygun dosya biçiminde kaydedilir (örneğin, ASCII, TXT, XLS).
A.2.4 Verilerin analizi

Her deney derişimi için ortalama NKA değeri kullanılarak, her deney numunesi özütünün derişimi için hücre
canlılığının NKA ile ifade edilen bir ölçümü yapılır. Bu değer, bütün körlerin ortalama NKA değerleriyle
karşılaştırılır (kör numuneler, kör numune kabul ölçütlerini karşıladığı takdirde). Nispi hücre canlılığı,
muamele edilmemiş kör numunenin yüzdesi olarak ifade edilir.
Mümkünse, deneye tabi tutulan her bileşiğin sekiz derişimi, etki olmayan aralık ile hücre canlılığının tam
inhibisyonuna kadar olan aralığı kapsamalıdır.
15
Çizelge A.1 - 3T3 NKA sitotoksisite deneyinin iş akışı
Süre İşlem
(h)
96 kuyucuklu kaplara ekim: 1×104 hücre/100 µL DMEM kültür vasatı/kuyucuk
00:00 İnkübasyon (37 °C, % 5 CO2, 22 h - 24 h)
Kültür vasatı çekilir ve atılır

24:00
Kültür vasatı içinde deney numunesi özütünün sekiz farklı derişimi uygulanır (100 µL)
24:00 (muamele edilmemiş kör kuyucuk = kültür vasatı)
Morfolojik değişikler mikroskobik olarak değerlendirilir

Kültür vasatı çekilir ve atılır
150 µL PBS ile bir kere yıkanır
48:00
100 µL NK vasatı eklenir
İnkübasyon (37 °C, % 5 CO2, 22 h - 24 h)
NK vasatı çekilir ve atılır

150 µL PBS ile bir kere yıkanır
51:00
150 µL NK’yı geri çıkaran tespit maddesi eklenir (EtOH/asetik asit çözeltisi)
Kaplar 10 dakika boyunca çalkalanır

51:40
NK absorpsiyonu 540 nm’de okunur (örneğin, hücre canlılığı)
51:50
Numune özütünün (% 100 özüt) en yüksek derişimi için nispi hücre canlılığı, kontrol grubunun % 70’inden
daha düşükse, hücre canlılığının % 50 inhibisyonunu yansıtan bir deney maddesinin derişimi (örneğin, IC50),
derişime bağlı oluşan cevapla belirlenir. Bu işlem aşağıdakiler uygulanarak yapılabilir:
Manuel bir grafiğe geçirme yöntemiyle,
“X = log” ve “Y = probit” ölçüleriyle birlikte bir olasılık kağıdının kullanılması tavsiye edilir. Bir çok durumda,
derişime bağlı cevabın fonksiyonu ilgili aralıkta yaklaşık olarak doğrusal olur. Bu teknik için yarı logaritmik
kağıt.
veya
Derişime bağlı oluşan cevap verileri için doğrusal olmayan uygun bir regresyon işlemi (tercihen bir Hill
fonksiyonu6) veya bir lojistik regresyon) kullanılabilir.
Daha ileri hesaplama için IC50 değeri kullanılmadan önce uygunluğun kalitesi doğru şekilde kontrol
edilmelidir. Numune özütünün (% 100 özüt) en yüksek derişimi için nispi hücre canlılığı, kontrol grubunun ≥
% 70’i ise malzemenin toksik olmadığı kabul edilir.
6)
Hill fonksiyonları şekil olarak monoton ve sigmoidal olup doza bağlı oluşan bir çok cevap eğrileri için kabul
edilebilir bir model oluşturur.
16
Ek B
(Bilgi için)
Koloni oluşumu sitotoksisite deneyi
B.1 Genel
Deney protokolü, tıbbi malzeme ve tıbbi cihazların temel biyolojik deneyleri ile ilgili Japon kılavuzlarında yer
alan sitotoksisite deneyi, Bölüm 1’e dayanır [2].
Not – Aşağıdaki protokol, Bölüm 1’in sadece sitotoksisite deneyi ile ilgili kısımlarını verir.
B.2 Deney işlemi
B.2.1 Temel işlem

V79 hücreleri, altı kuyucuklu kültür kaplarına ekilir ve logaritmik fazda çoğalmaları için kültür vasatında 24 h
inkübe edilir. Hücreler daha sonra farklı derişimlerde deney bileşiğine maruz bırakılır. Kolonilerin
sayılabilecek büyüklüğe gelmesi için altı gün inkübe edilir. Koloniler metanol ile tespit edilir, Giemsa çözeltisi
ile boyanır ve sayılır. Özüt hücreler üzerinde sitotoksik bir etki gösteriyorsa, IC50 değeri (kültür etkinliğini %
50 inhibe eden derişim) hesaplanır ve özütün yüzde değeri olarak ifade edilir.
B.2.2 Malzeme
B.2.2.1 Hücre hattı

V79 hücreleri (JCRB 0603, Human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan, ABD ve AB’nin diğer
hücre bankalarından elde edilebilir).
Not – Büyük ve belirgin koloniler oluşturduklarından dolayı V79 hücreleri tavsiye edilir.
B.2.2.2 Teknik donanım
B.2.2.2.1 İnkübatör, 37 °C, nemli, 5 % CO2/hava.
B.2.2.2.2 Laminer akış kabini, standart: “mikrobiyolojik güvenlik kabini”.
B.2.2.2.3 Su banyosu, 37 °C.
B.2.2.2.4 Ters faz kontrast mikroskobu.
B.2.2.2.5 Stereomikroskop.
B.2.2.2.6 Laboratuvar beki.
B.2.2.2.7 Laboratuvar terazisi.
B.2.2.2.8 Hücre sayıcı veya hemositometre.
B.2.2.2.9 Pipetleyici.
B.2.2.2.10 Pipetler.
B.2.2.2.11 Doku kültürü kapları, 75 cm2, 25 cm2 veya 100 mm çapında diğer kültür kapları,
B.2.2.2.12 6-kuyucuklu doku kültürü mikrotitre kapları.
B.2.2.3 Kimyasal maddeler, vasatlar ve serum.
B.2.2.3.1 Eagle minimum essential medium (MEM), dengelenmiş tuz çözeltisi içeren.
B.2.2.3.2 Fötal buzağı serumu (FCS).

17
Not - FCS’nin lot değişkenliğinden dolayı ilk once bir lota ait FCS’nin V79 hücrelerinde büyüme uyarıcı
özellikleri kontrol edilir ve yeterli miktarda FCS depolanır.
B.2.2.3.3 Tripsin/EDTA çözeltisi.
B.2.2.3.4 Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), Ca2+ and Mg2+ içermeyen (tripsinizasyon için).
B.2.2.3.5 Penisilin/streptomisin çözeltisi.
B.2.2.3.6 Dimetil sülfoksit (DMSO), analitik saflıkta.
B.2.2.3.7 Metanol, analitik saflıkta.
B.2.2.3.8 Giemsa çözeltisi.
B2.2.3.9 Fosfat-tampon çözeltisi.
B.2.2.3.10 Hücre kültürü için uygun damıtık su veya saf su.
B.2.2.3.11 Sodyum bikarbonat.
B.2.2.3.12 L-glutamin.
B.2.2.3.13 MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi.
B.2.2.3.14 Sodyum piruvat, 100 mM.
B.2.2.4 Hazırlıklar.
B.2.2.4.1 Genel
Bütün çözeltiler, (Giemsa çözeltisi hariç), cam malzeme vb. steril olmalı ve bütün işlemler aseptik şartlar
altında laminer akış kabininde (mikrobiyolojik güvenlik kabini) steril bir ortamda yapılmalıdır.
B.2.2.4.2 Vasatlar
1000 mL Eagle MEM aşağıdakileri içerir:
(A) Dondurma ve rutin kültür için % 10 FCS içeren vasat (MEM 10) kullanılır:
− 111 mL FCS
− 2,2 gr sodyum bikarbonat
− 0,292 gr L-glutamin
(B) Özütleme ve özütle muamele etmek için % 5 FCS içeren vasat (MEM 05) kullanılır:
− 53,5 mL FCS
− 5 mL MEM esansiyel olmayan amino asit çözeltisi
− 10 mL sodyum piruvat, 100 mM
− 0,292 g L-glutamin
− 2,2 g sodyum bikarbonat
Tamamlanmış vasatlar 4 °C’ta depolanmalı ve bir aydan daha uzun süre tutulmamalıdır.
Serumdaki proteinler deney maddesinin toksisitesini maskeleyebileceğinden, numune ile muamele etmek
için kullanılacak olan vasatın serum derişimi % 5’e düşürülür. Serum yokluğunda hücre çoğalması önemli
derecede azalacağından vasattan tamamen çıkartılamaz. Analizi olumsuz yönde etkilemediği takdirde
uygun miktarda antibiyotik eklenebilir.
B.2.2.4.3 Giemsa çözeltisi, % 5
5 mL Giemsa çözeltisi
18
95 mL Fosfat tampon çözeltisi, her türlü, pH 6,5 - pH 7,5
Kullanmadan hemen önce hazırlanır.
B.2.2.4.4 Numune özütünün hazırlanması

Numuneler ISO 10993-12’ye uygun olarak özütlenir, ancak her özütleme hacmi için yüzey alanın özütleme
oranının 6 cm2/mL ve her özütleme hacmi için ağırlık oranının 0,1 g/mL olması tavsiye edilir (bakınız [6], [7]
ve [11]). Özüt süzülerek ayrılır ve % 100 özüt olarak adlandırılır. % 100 özüt, farklı yüzdelerde özüt elde
etmek için MEM05 vasatı ile seyreltilir.
B.2.3 Yöntemler
B.2.3.1 Genel
Rutin hücre kültürü yöntemleri için Kaynak [1]’de Ek C’ye bakınız.
B.2.3.2 Analiz (I) için kalite kontrol, pozitif kontrol (PK) ve negatif kontrol (NK)
Her sitotoksisite deneyinde pozitif ve negatif kontrol bulunmalıdır. Pozitif ve negatif referans malzemeler
tavsiye edilir, örneğin, ZDEC ve ZDBC (Sayfa 2’deki dipnot 1’e bakınız).
ZDEC ve ZDBC için aşağıdaki kabul ölçütleri kullanılmalıdır.
a) ZDEC için IC50 değeri % 7’yi aşmamalıdır.

b) ZDBC için IC50 değeri % 80’i aşmamalıdır.
B.2.3.3 Analiz (II) için kalite kontrol; kör deney

Bir deney, kör kuyucuktaki ortalama koloni sayısı bir kuyucuğa ekilen hücre sayısının en az % 70’i olduğu
takdirde kabul ölçütlerini karşılamış olur.
B.2.3.4 Derişime bağlı oluşan cevabın kalite kontrolü

Derişime bağlı oluşan cevaptan türetilen IC50 değeri, kontrol inhibisyonunun % 10 - % 90’ı arasında en az iki,
mümkünse üç cevapla desteklenmelidir. Değilse, derişim artışı faktörü kolaylıkla azaltılabilir, deney reddedilir
ve daha küçük bir artış faktörü ile tekrarlanır.
B.2.3.5 Deney numunesi özütlerinin derişimleri
B.2.3.5.1 Aralık bulma deneyi

Stok çözelti bir sabit faktörle seyreltilerek geniş aralıkta (örneğin, 1 ≥ 1/10 ≥ 1/100 ≥1/1000) numune
özütünün dört derişimi deneye tabi tutulur. En yüksek numune özütü derişimini içeren hücre kültürünün
canlılığındaki azalma, % 30 veya daha azsa, malzemenin toksik olmadığı kabul edilir ve daha ileri ana
deneyin yapılmasına gerek yoktur.
B.2.3.5.2 Ana deney

Aralık bulma deneyinden hesaplanan derişime bağlı oluşan cevap eğrisinin eğimine dayanarak, ana deneyin
derişim dizilerindeki seyreltme/artış faktörü daha küçük olmalıdır. Ilgili derişim aralığında (% 10 ile % 90
aralığında etki) dereceli etkinin en az üç noktasının kapsanmasına dikkkat edilir. Çok fazla sitotoksik
olmayan ve/veya % 100 sitotoksik derişimlerden kaçınılır.
B.2.3.6 Deney işlemi
ÖNEMLİ – Stoktan çözüldükten sonra hücreler deneyde kullanılmadan önce iki veya üç defa pasajlanır.
1. gün
MEM05 vasatı içerisinde 33,3 hücre/mL derişiminde hücre süspansiyonu hazırlanır. 6 kuyucuklu kültür
kabının her bir kuyucuğuna 3 mL hücre süspaniyonu eklenir.
2. gün
24 h’lik inkübasyondan sonra her kuyucuktaki kültür vasatı çekilir. 2 mL % 100 özüt veya MEM05 vasatıyla
seyreltilmiş özüt eklenir. Her özüt derişimi üç kopya çalışılır. Inkübatörde 6 gün daha inkübe edilir.
19
8. gün
Her kuyucuktaki vasat çekilir, hücreler PBS ile yıkanır, koloniler metanol ile tespit edilir ve % 5 Giemsa
çözeltisi ile boyanır. Her kuyucuktaki koloni sayısı sayılır.
B.2.3.7 Sonuçların sunulması
− Hücreler stereomikroskop ile incelenir ve her kuyucukta 50 veya daha fazla hücre içeren koloni sayısı
sayılır.
− Bir kuyucuktaki koloni sayısı kaydedilir.
− Her özüt derişimi için ortalama koloni sayısı hesaplanır.
− Bu sayı kontrol grubunda hesaplanan sayıya bölünür ve bölüm (ekim etkinliği) yüzde olarak ifade edilir.
− Numune özütünün en yüksek derişimi için (% 100 özüt) ekim etkinliği, kontrol grubu ekim etkinliğinin %
70’inden daha azsa, malzemenin potansiyel olarak sitotoksik olduğu kabul edilir ve deney numunelerinin
sitotoksisitesi IC50 değeriyle yüzde olarak ifade edilir.
− IC50 değeri (ekim etkinliğini % 50 inhibe eden derişim), % 50’nin üstünde canlılık değerine denk gelen
doz ile % 50’nin altında canlılık değerine denk gelen doz noktalarından geçen bir doğrudan hesaplanan
% 50 nispi canlılık oranının elde edildiği doz olarak belirlenir.
− Ekim etkinliği kontrol grubunun ekim etkinliğinin ≥ % 70’i ise malzemenin toksik olmadığı kabul edilir.
Not – En yüksek derişimde ekim etkinliği % 50 ile % 70 arasında olduğu zaman, en yüksek derişimin
üzerinde IC50 değerinin hesaplanması mümkün olmayabilir.
B.2.4 Deney raporu

Deney raporu Madde 9’a uygun olarak hazırlanmalı, ilave olarak aşağıdakiler verilmelidir:
a) Belirtilen şartlarda kontrolün ekim etkinliği,

b) Deney numuleri için elde edilen koloni sayısı, koloni oluşumu inhibisyonunun eğrileri ve mümkünse, IC50
değerleri dâhil bütün deney verileri.
20
Ek C
(Bilgi için)
MTT sitotoksisite deneyi
C.1 Genel
Aşağıdaki deney protokolü, hücre canlılığının metabolik aktivite yoluyla hesaplanmasına dayanır [9]. Sarı
renkli, suda çözünür MTT (3-(4,5-dimetilltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyumbromür), canlı hücrelerde
metabolik olarak mavi-mor renkte, suda çözünmeyen formazana indirgenir. Canlı hücre sayısı, formazanın
alkolde çözüldükten sonra fotometrik ölçümlerle tayin edilen renk yoğunluğu ile ilişkilidir.
C.2 Deney işlemi
C.2.1 Temel işlem

L929 hücreleri, 96 kuyucuklu kültür kaplarına ekilir ve yarı-konfluent bir katman oluşturuncaya kadar (hücre
inkübasyonu ve hücre kültürü işlemleri ile ilgili daha fazla bilgi için referans [9]’a bakınız) 24 h boyunca
inkübe edilir ikiye katlanma süresi). Daha sonra hücreler farklı derişimlerdeki deney bileşiğine maruz bırakılır.
24 h’lik inkübasyondan sonra, her derişim için formazan oluşumu tayin edilir ve kontrol kültürlerinde elde
edilen değerlerle karşılaştırılır. Her derişim uygulaması için çoğalma inhibisyonunun yüzdesi hesaplanır.
C.2.2 Malzeme
C.2.2.1 Hücre hattı

L929 hücreleri (NCTC clone 929: CCL 1, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu [ATCC], Manassas, VA, USA;
ECACC No. 88102702, Avrupa Hücre Kültürü Koleksiyonu, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK). Hücre
kültürleri mikoplazma içermemelidir.
C.2.2.2 Teknik donanım
C.2.2.2.1 İnkübatör, 37 °C, nemli, 5 % CO2/hava.
C.2.2.2.2 Laminer akış kabini, standart “mikrobiyolojik güvenlik kabini”.
C.2.2.2.3 Su banyosu, 37 °C.
C.2.2.2.4 Ters faz kontrast mikroskobu.
C.2.2.2.5 Laboratuvar beki.
C.2.2.2.6 Santrifüj, isteğe bağlı olarak mikrotitre kap rotorlu.
C.2.2.2.7 Laboratuvar terazisi.
C.2.2.2.8 96-kuyucuklu kap fotometresi, 570 nm filtreli (referans 650 nm).
C.2.2.2.9 Çalkalayıcı, mikrotitre kaplar için.
C.2.2.2.10 Hücre sayıcı veya hemositometre.
C.2.2.2.11 Pipetleyici
C.2.2.2.12 Pipet, 8 kanallı pipet, seyreltme bloğu.
C.2.2.2.13 Kriyotüpler.
C.2.2.2.14 Doku kültürü kapları veya doku kültürü petri kapları.
C.2.2.2.15 96-kuyucuklu doku kültürü mikrotitre kaplar.

21
C.2.2.3 Kimyasal maddeler, vasatlar ve serum.
C.2.2.3.1 Eagle minimum essential medium (MEM), fenol kırmızısı, glutamin ve NaHCO3 içermeyen.
C.2.2.3.2 Fötal buzağı serumu (FCS).
C.2.2.3.3 Tripsin/EDTA çözeltisi.
C.2.2.3.4 Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
C.2.2.3.5 MTT (3-(4,5-dimetilltiyazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolyumbromür).
C.2.2.3.6 İzopropanol, analitik saflıkta.
C.2.2.4 Hazırlıklar
C.2.2.4.1 Genel
Bütün çözeltiler, cam malzeme vb. steril olmalı ve bütün işlemler aseptik şartlar altında laminer akış
kabininde (mikrobiyolojik güvenlik kabini) steril bir ortamda yapılmalıdır.
C.2.2.4.2 Vasatlar
MEM (sodyum bikarbonatla tamponlanmış) aşağıdakileri içerir (MEM içinde son derişimler verilmiştir):
(A) Dondurma için
− % 20 FCS
− % 7 - % 10 DMSO
− % 10 FCS
Tamamlanmış vasatlar 4 oC’ta depolanmalı ve iki haftadan daha uzun süre saklanmamalıdır.
C.2.2.4.3 MTT çözeltisi

MTT, ilave madde ve fenol kırmızısı içermeyen MEM içinde 1 mg/mL derişim elde edilecek şekilde taze
olarak çözülür. Çözelti, steril şırınga filtrelerinden (gözenek büyüklüğü ≤ 0,22 µm) geçirilerek steril edilir.
Hazırlanan çözelti aynı gün kullanılmalıdır.
C.2.2.4.4 Numune özütünün hazırlanması

Numuneler ISO 10993-12’ye uygun olarak özütlenir.
C.2.3 Yöntemler
C.2.3.1 Genel
C.2.3.2 Analiz (I) için kalite kontrol: Pozitif kontrol (PK) ve negatif kontrol (NK)
tavsiye edilir, örneğin, ZDEC ve ZDBC (Sayfa 2’deki dipnot 1’e bakınız).
C.2.3.3 Analiz (II) için kalite kontrol: Kör deney

Muamele edilmemiş kör numunelerden elde edilen optik yoğunluğun mutlak değeri, OD570, 1x104/ kuyucuk
oranında ekilen hücrelerin deneyin ilk iki günü süresince normal katlanma süresiyle birlikte üstel olarak
Bir deney, kör numunelerin ortalama OD570 değerleri ≥ 0,2 olduğunda, kabul ölçütlerini karşılamış olur.
22
Sistematik hücre ekimi hatalarını kontrol etmek için kör numuneler 96-kuyucuklu kapların soluna (2. sıra) ve
sağına (11. sıra) yerleştirilir (1. sıra ve 12. sıra kullanılmamalıdır; kuyucuk yerleşimi için Kaynak [1]’de Ek
E’ye bakınız).
Bir deney, kör numunelerin sol ve sağdaki ortalaması bütün kör numunelerin ortalamasının % 15‘inden daha
fazla farklılık göstermediği durumda kabul ölçütlerini karşılar.
Hücre sayısının tutarlı olduğundan emin olmak için her bir kültür kabı faz kontrast mikroskobunda
incelenerek de hücre ekimi hataları kontrol edilebilir. Mikroskobik değerlendirme, iki sıra kör numune
C.2.3.4 Deney işlemi
ÖNEMLİ – Stoktan çözüldükten sonra hücreler, deneyde kullanılmadan önce iki veya üç defa pasajlanır.
Çizelge C.1’de deney işleminin iş akışı verilmiştir.
Dondurulmuş stoktan çözdükten sonraki 1. gün
− Hücreler kültür kaplarından enzimatik (tripsin/EDTA) yolla kaldırılır ve hücre süspansiyonu santrifüj edilir
(200 g, 3 dakika). Daha sonra hücreler kültür vasatı içinde tekrar süspansiyon haline edilir ve
süspansiyonun hücre yoğunluğu 1x 105 hücre/mL olacak şekilde ayarlanır. Çok kanallı bir pipet
kullanılarak 100 µL hücre içermeyen kültür vasatı (kör), 96-kuyucuklu doku kültürü mikrotitre kabın
kenarındaki kuyucuklara eklenir (körler için Kaynak [1]’de Ek E’ye bakınız). Geri kalan kuyucuklara 1x105
hücre/mL yoğunluktaki hücre süspansiyonundan 100 µL eklenir (=1x104 hücre/kuyucuk).
− Hücreler yarı konfluent bir katman oluşturuncaya kadar 24 h boyunca inkübe edilir (% 5 CO2, 37 °C, > %
90 nem). Bu inkübasyon periyodu hücrelerin toparlanmasını, yapışmasını ve üstel çoğalma fazına doğru
− Hücrelerin mikrotitre kapta nispeten eşit yayıldığını kontrol etmek için her hücre kabı faz kontrast
2. gün
− 24 h’lik inkübasyondan sonra kuyucuklardaki kültür vasatı uzaklaştırılır.
− Her kuyucuğa uygun derişimde numune özütü veya negatif kontrolü veya pozitif kontrolü içeren 100 µL
vasat veya kör amacıyla vasat eklenir. Deney numunesi özütünün en az dört farklı derişimi veya pozitif
kontrol özütü deneye tabi tutulmalıdır. Kullanılan en yüksek derişim % 100 özüt olmalı ve diğer derişimler
tek bir logaritmik aralıkta birbirinden yeterince uzaklıkta olmalıdır. Kör olarak kültür vasatı kullanılır.
− Hücreler 24 h boyunca inkübe edilir (% 5 CO2, 37°C, > % 90 nem)
3. gün
24 h’lik inkübasyondan sonra sistematik hücre ekimi hataları ile kontrol ve muamele edilmiş hücrelerin
numunesi özütünün sitotoksik etkilerinden dolayı hücrelerin morfolojisinde oluşan değişiklikler kaydedilir;
ancak bu kayıtlar sitotoksisitenin herhangi bir nicel ölçümü için kullanılmaz. Kontrol hücrelerinin istenmeyen
çoğalma karakteristikleri deneysel hatayı gösterebilir ve deneyin reddedilmesi için bir neden olabilir.
Kültür kaplarındaki hücreler mikroskopla incelendikten sonra her kuyucuktaki kültür vasatı dikkkatli bir şekilde
çekilir. Özütteki indirgeyici maddeler MTT’yi de indirgeyebileceğinden bu önemli bir adımdır ve bu durum
yanlış negatif sonuçlara neden olur. Her kuyucuğa 50 µL MTT çözeltisi (Madde C.2.2.4.3) eklenir ve kaplar
inkübatörde 37 °C’ta iki h daha inkübe edilir. Daha sonra MTT çözeltisi çekilir ve her kuyucuğa 100 µL
izopropanol eklenir. Kaplar el yardımıyla yatay olarak çalkalanır ve bekletilmeden 570 nm filtreye sahip bir
mikrokap okuyucuya yerleştirilerek absorbans okunur (referans dalgaboyu 650 nm).
23
Çizelge C.1 – MTT sitotoksisite deneyinin iş akışı
Süre İşlem
(h)
96-kuyucuklu kaplara ekim: 1×104 hücre/100 µL MEM kültür vasatı/kuyucuk
00:00 İnkübasyon (37 °C, % 5 CO2, 22 h - 26 h)
Kültür vasatı uzaklaştırılır

24:00
Kültür vasatı içinde deney numunesi özütünün ≥ 4 farklı derişimi uygulanır (100 µL)
(Muamele edilmemiş kör = kültür vasatı)

24:00
İnkübasyon (37 °C, % 5 CO2, 24 h)

Deney vasatı uzaklaştırılır
48:00 50 µL MTT çözeltisi eklenir
MTT çözeltisi uzaklaştırılır

51:00 Her kuyucuğa 100 µL izopropanol eklenir
Kültür kabı çalkalanır
570 nm’de absorbans okunur (referans 650 nm)
51:30
C.2.4 Verilerin kaydedilmesi

Elde edilen veriler ham veri dosyasına kaydedilir. Sonuçlar, deney numunesi, negatif, kör ve pozitif
kontrollerden oluşan deney grupları dâhil çizelge hâlinde verilmelidir.
C.2.5 Verilerin analizi

Canlı hücre sayısındaki azalma numunenin metabolik aktivitesinde de bir azalmayla sonuçlanır. Bu azalma,
570 nm’de optik yoğunluk olarak okunan, mavi-mor renkte oluşan formazanın miktarıyla doğrudan ilişkilidir.
Kör değere kıyasla canlılıktaki azalma, aşağıdaki eşitlik (C.1) kullanılarak hesaplanır:
100 × OD570 e
% canlılık = (C.1)
OD570b
Burada:
OD570 e deney numunesinin % 100 özütlerinin ölçülen optik yoğunluğunun ortalama değerini
OD570b kör numunelerin ölçülen optik yoğunluğunun ortalama değerini
gösterir.
% canlılık değeri azaldıkça deney numunesinin sitotoksisite potansiyeli artar.
Canlılık, kör numuneden elde edilen değerin % 70’nin altındaysa, deney numunesinin sitotoksik potansiyeli
vardır. Deney numunesinin % 50 özütü, % 100 özütle en azından aynı veya daha yüksek bir canlılık
göstermelidir. Aksi takdirde deney tekrarlanmalıdır.
24
Ek D
(Bilgi için)
XTT sitotoksisite deneyi

D.1 Genel
Aşağıdaki deney protokolü, hücre canlılığının mitokondriyal dehidrogenazlar yoluyla ölçümüne dayanır [9].
XTT (2,3-bis[2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil]-2H-tetrazolyum-hidroksit) canlı hücrelerde metabolik olarak, suda

çözünen formazana indirgenir. Canlı hücre sayısı, fotometrik ölçümlerle tayin edilen renk yoğunluyla ilişkilidir.
D.2 Deney işlemi
D.2.1 Temel işlem

L929 hücreleri, 96-kuyucuklu kültür kaplarına ekilir ve yarı-konfluent bir katman oluşturuncaya kadar (hücre
inkübasyonu ve hücre kültürü işlemleri ile ilgili daha fazla bilgi için referans [5]’e bakınız) 24 h boyunca
inkübe edilir (ikiye katlanma süresi). Daha sonra hücreler farklı derişimlerdeki deney bileşiğine maruz
bırakılır. 24 h’lik inkübasyondan sonra, her derişim için formazan oluşumu tayin edilir ve kontrol kültürlerinde
elde edilen değerlerle karşılaştırılır. Her derişim uygulaması için çoğalma inhibisyonunun yüzdesi hesaplanır.
D.2.2 Malzeme
D.2.2.1 Hücre hattı

L929 hücreleri (NCTC clone 929: CCL 1, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu [ATCC], Manassas, VA, USA;
ECACC No. 88102702, Avrupa Hücre Kültürü Koleksiyonu, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK). Hücre
kültürleri mikoplazma içermemelidir.
D.2.2.2 Teknik donanım
D.2.2.2.1 İnkübatör, 37 °C, nemli, 5 % CO2/hava.
D.2.2.2.2 Laminer akış kabini, standard: “mikrobiyolojik güvenlik kabini”.
D.2.2.2.3 Su banyosu, 37 °C.
D.2.2.2.4 Ters faz kontrast mikroskobu.
D.2.2.2.5 Laboratuvar beki.
D.2.2.2.6 Santrifüj, isteğe bağlı olarak mikrotitre kap rotorlu
D.2.2.2.7 Laboratuvar terazisi.
C.2.2.2.8 96-kuyucuklu kap fotometresi, 450 nm filtreli (referans 650 nm).
D.2.2.2.9 Çalkalayıcı, mikrotitre kaplar için.
D.2.2.2.10 Hücre sayıcı veya hemositometre.
D.2.2.2.11 Pipetleyici.
D.2.2.2.12 Pipet, 8 kanallı pipet, seyreltme bloğu.
D.2.2.2.13 Kriyotüpler.
D.2.2.2.14 Doku kültürü kapları veya doku kültürü petri kapları.
D.2.2.2.15 96-kuyucuklu doku kültürü mikrotitre kaplar
25
D.2.2.3 Kimyasal maddeler, vasatlar ve serum
D.2.2.3.1 Eagle minimum essential medium (MEM), fenol kırmızısı, glutamin ve NaHCO3 içermeyen.
D.2.2.3.2 Fötal buzağı serumu (FCS).
D.2.2.3.3 Tripsin/EDTA çözeltisi.
D.2.2.3.4 Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
D.2.2.3.5 XTT (2,3-bis[2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil]-2H-tetrazolyum-5-karboksianilin inner salt).
D.2.2.3.6 İzopropanol, analitik saflıkta.
D.2.2.4 Hazırlıklar
D.2.2.4.1 Genel
Bütün çözeltiler, cam malzeme vb. steril olmalı ve bütün işlemler aseptik şartlar altında laminer akış
kabininde (mikrobiyolojik güvenlik kabini) steril bir ortamda yapılmalıdır.
D.2.2.4.2 Vasatlar
MEM (sodyum bikarbonatla tamponlanmış) aşağıdakileri içerir (MEM içinde son derişimler verilmiştir):
(A) Dondurma için
− % 20 FCS
− % 7 - % 10 DMSO
− % 10 FCS
Tamamlanmış vasatlar 4 oC’ta depolanmalı ve iki haftadan daha uzun süre saklanmamalıdır.
D.2.2.4.3 XTT/PMS çözeltisi

XTT, fenol kırmızısı içermeyen MEM içinde 1 mg/mL derişim elde edilecek şekilde çalkalayıcı yardımıyla
taze olarak çözülür. Çözelti, steril şırınga filtrelerinden (gözenek büyüklüğü ≤ 0,22 µm) geçirilerek steril edilir.
PMS (fenazin metosülfat), PBS içinde çözülerek 5 mM çözelti hazırlanır ve steril şırınga filtrelerinden
(gözenek büyüklüğü ≤ 0,22 µm) geçirilerek steril edilir.
PMS çözeltisi, kullanmadan hemen önce 25 µM olacak şekilde XTT çözeltisine eklenir (5 µL, 5 mM PMS/mL
XTT çözeltisi). Hazırlanan XTT/PMS çözeltisi bekletilmeden deney kuyucuklarına eklenir.
D.2.2.4.4 Numune özütünün hazırlanması

Numuneler, fenol kırmızısı içermeyen FBS’li MEM kullanılarak ISO 10993-12’ye uygun olarak özütlenir.
D.2.3 Yöntemler
D.2.3.1 Genel
D.2.3.2 Analiz (I) için kalite kontrol: Pozitif kontrol (PK) ve negatif kontrol (NK)
tavsiye edilir; örneğin, ZDEC ve ZDBC (Sayfa 2’deki dipnot 3’e bakınız).
26
D.2.3.3 Analiz (II) için kalite kontrol: Kör deney

Muamele edilmemiş kör numunelerden elde edilen optik yoğunluğun mutlak değeri, OD450, 1x104/kuyucuk
oranında ekilen hücrelerin deneyin ilk iki günü süresince normal katlanma süresiyle birlikte üstel olarak
Bir deney, kör numunelerin ortalama OD450 değerleri ≥ 0,2 olduğunda kabul ölçütlerini karşılamış olur.
Sistematik hücre ekimi hatalarını kontrol etmek için kör numuneler 96-kuyucuklu kapların soluna (2. sıra) ve
sağına (11. sıra) yerleştirilir (1. sıra ve 12. sıra kullanılmamalıdır; kuyucuk yerleşimi için Kaynak [1]’de Ek
E’ye bakınız).
Bir deney, kör numunelerin sol ve sağdaki ortalaması bütün kör numunelerin ortalamasının % 15‘inden daha
fazla farklılık göstermediği durumda kabul ölçütlerini karşılar.
Hücre sayısının tutarlı olduğundan emin olmak için; her bir kültür kabı, faz kontrast mikroskobunda
incelenerek de hücre ekimi hataları kontrol edilebilir. Mikroskobik değerlendirme, iki sıra kör numune
D.2.3.4 Deney işlemi
ÖNEMLİ – Stoktan çözüldükten sonra hücreler, deneyde kullanılmadan önce iki veya üç defa pasajlanır.
Çizelge D.1’de deney işleminin iş akışı verilmiştir.
Dondurulmuş stoktan çözüldükten sonraki 1. gün
− Hücreler kültür kaplarından enzimatik (tripsin/EDTA) yolla kaldırılır ve hücre süspansiyonu santrifüj edilir
(200 g, 3 dakika). Daha sonra hücreler kültür vasatı içinde tekrar süspansiyon haline edilir ve
süspansiyonun hücre yoğunluğu 1x105 hücre/mL olacak şekilde ayarlanır. Çok kanallı bir pipet
kullanılarak 100 µL hücre içermeyen kültür vasatı (kör), 96-kuyucuklu doku kültürü mikrotitre kabın
kenarındaki kuyucuklara eklenir (kör numuneler için Kaynak [1]’de Ek E’ye bakınız). Geri kalan
kuyucuklara 1x105 hücre/mL yoğunluktaki hücre süspansiyonundan 100 µL eklenir (=1x104
hücre/kuyucuk).
− Hücreler yarı-konfluent bir katman oluşturuncaya kadar 24 h boyunca inkübe edilir (% 5 CO2, 37 °C, > %
90 nem). Bu inkübasyon periyodu hücrelerin toparlanmasını, yapışmasını ve üstel çoğalma fazına doğru
− Hücrelerin mikrotitre kapta nispeten eşit yayıldığını kontrol etmek için her hücre kabı faz kontrast
2. gün
− 24 h’lik inkübasyondan sonra kuyucuklardaki kültür vasatı uzaklaştırılır.
− Her kuyucuğa uygun derişimde numune özütü veya negatif kontrolü veya pozitif kontrolü içeren 100 µL
vasat veya kör amacıyla vasat eklenir. Deney numunesi özütünün en az dört farklı derişimi veya pozitif
kontrol özütü deneye tabi tutulmalıdır. Kullanılan en yüksek derişim % 100 özüt olmalı ve diğer derişimler
tek bir logaritmik aralıkta birbirinden yeterince uzaklıkta olmalıdır. Negatif kontrol için sadece % 100 özüt
deneye tabi tutulur. Kör olarak kültür vasatı kullanılır.
− Hücreler 24 h boyunca inkübe edilir (% 5 CO2, 37 °C, > % 90 nem)
3. gün
24 h’lik inkübasyondan sonra sistematik hücre ekimi hataları ile kontrol ve muamele edilmiş hücrelerin
numunesi özütünün sitotoksik etkilerinden dolayı hücrelerin morfolojisinde oluşan değişiklikler kaydedilir;
ancak bu kayıtlar sitotoksisitenin herhangi bir nicel ölçümü için kullanılmaz. Kontrol hücrelerinin istenmeyen
çoğalma karakteristikleri deneysel hatayı gösterebilir ve deneyin reddedilmesi için bir neden olabilir.
27
Kültür kaplarındaki hücreler mikroskopla incelendikten sonra her kuyucuğa 50 µL XTT/PMS çözeltisi eklenir
ve hücreler 3 - 5 h daha 37 °C’ta inkübe edilir. Kültür kapları karanlık bir ortamda tutulmalıdır. Daha sonra
kaplar dikkatli bir şekilde çalkalanır ve her kuyucuktan 100 µL alikot çekilerek yeni bir kabın ilgili kuyucuğuna
aktarılır. Bu kap bekletilmeden 450 nm filtreye sahip mikrokap okuyucuya yerleştirilerek absorbans okunur
(referans dalgaboyu 630 nm).
Çizelge D.1 – XTT sitotoksisite deneyinin iş akışı
Süre İşlem
(h)
96-kuyucuklu kaplara ekim: 1×104 hücre/100 µL MEM kültür vasatı/kuyucuk
00:00
İnkübasyon (37 °C, % 5 CO2, 22 h - 26 h)
Kültür vasatı uzaklaştırılır

24:00
Kültür vasatı içinde deney numunesi özütünün ≥ 4 farklı derişimi uygulanır (100 µL)
(Muamele edilmemiş kör = kültür vasatı)

24:00
50 µL XTT/PMS çözeltisi eklenir

48:00
İnkübasyon (37 °C, % 5 CO2, 3 h – 5 h)
Kap çalkalanır
51:00
Her kuyucuktan 100 µL çekilerek yeni bir kaba aktarılır
450 nm’de absorbans okunur (referans 630 nm)

51:30
D.2.4 Verilerin kaydedilmesi

Elde edilen veriler ham veri dosyasına kaydedilir. Sonuçlar, deney numunesi, negatif, kör ve pozitif
kontrollerden oluşan deney grupları dâhil, çizelge halinde verilmelidir.
D.2.5 Verilerin analizi

Canlı hücre sayısındaki azalma, numunenin mitokondriyal dehidrogenazların toplam aktivitesinde de bir
azalmayla sonuçlanır. Bu azalma, 450 nm’de optik yoğunluk olarak okunan, turuncu renkte oluşan
formazanın miktarıyla doğrudan ilişkilidir. Kör değere kıyasla canlılıktaki azalma, aşağıdaki eşitlik (D.1)
kullanılarak hesaplanır:
100 × OD450 e
% canlılık = (D.1)
OD450b
Burada:
OD450 e deney numunesinin % 100 özütlerinin ölçülen optik yoğunluğunun ortalama değerini,
OD450b körlerin ölçülen optik yoğunluğunun ortalama değerini
gösterir.
% canlılık değeri azaldıkça deney numunesinin sitotoksisite potansiyeli artar.
Canlılık, körden elde edilen değerin % 70’inin altındaysa deney numunesinin sitotoksik potansiyeli vardır.
Deney numunesinin % 50 özütü, % 100 özütle en azından aynı veya daha yüksek bir canlılık göstermelidir.
Aksi takdirde deney tekrarlanmalıdır.
28
Kaynaklar
1. Guidance Document on Using In Vitro Data to Estimate In Vivo Starting Doses for Acute Toxicity, 2001.
NIH Publication No. 01-4500 available under
(http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/acutetox_docs/guidance0801/iv_guide.pdf).
2. Guidelines for preclinical biological evaluation of medical materials and devices. MHLW (Ministry of
Health, Labour and Welfare, Japan) memorandum, JIMURENRAKU Iryokiki-Shinsa, 36, 2003
3. BORENFREUND, E. and PUERNER, J.A. Toxicity determination in vitro by morphological alterations

andneutral red absorption, Toxicological Letters, 24, pp. 119-124, 1985
4. United States Pharmacopeia
5. COECKE, S., BALLS, M., BOWE, G., DAVIS, J., CSTRAUNTHALER, G., HARTUNG, T., HAY, R.,
MERTEN, O.,PRICE, A., SCHECTMAN, L., STACEY, G. and STOKES, W. Guidance on Good Cell
Culture Practice, AReport of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33,
pp. 261-287, 2005
6. ISAMA, K., MATSUOKA, A., HAISHIMA, Y. and TSUCHIYA, T. Proliferation and differentiation of
normalhuman osteoblasts on dental Au-Ag-Pd casting alloy: Comparison with cytotoxicity using
fibroblastL929 and V79 cells. Mater. Trans., 43, pp. 3155-3159, 2002
7. TSUCHIYA, T. Studies on the standardization of cytotoxicity tests and new standard reference
materialsuseful for evaluating the safety of biomaterials. J. Biomaterials Applications, 5, pp. 139-157,
1994
8. MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and
cytotoxicity assays. J. Immun. Methods, 65, pp. 55-63, 1983
9. SCUDIERO, D.A., SHOEMAKER, R.H., PAULL, K.D., MONKS, A., TIERNEY, S., NOFZIGER,
.H.,CURRENS, M.J., SENIFF, D. and BOYD, M.R. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay
for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res., 48,pp.
4827-4833, 1988
10. SPIELMANN, H, et al., Interlaboratory assessment of alternatives to the Draize eye irritation test in
Germany, Toxicol. In Vitro, 5, pp. 539-542, 1991
11. HEXIG, B., NAKAOKA, R. and TSUCHIYA, T. Safety evaluation of surgical materials by cytotoxicity
testing. J. Artif. Organs, 11, pp. 204-211, 2008
29
Ek ZA
(Bilgi için)
Bu standardın AB direktifi 93/42/EEC’nin7) temel gerekleri ile ilişkili

maddeleri
Bu standard, Avrupa Komisyonu ve Avrupa Serbest Ticaret Birliği (EFTA) tarafından CEN’e verilmiş bir
görevlendirmeyle tıbbi cihazlarla ilgili yeni yaklaşım direktifi 93/42/EEC’nin temel gereklerine uyum sağlamak
amacıyla hazırlanmıştır.
Bu standard ilgili direktif altında Avrupa Birliği Resmi Gazetesinde yer aldıktan ve üye devletlerin en az
birinde ulusal standard olarak uygulandıktan sonra Çizelge ZA.1’de verilen maddelere uygunluk, standardın
kapsam sınırları içerisinde direktif ve EFTA düzenlemelerinin ilgili temel gereklerine uygunluk varsayımı ile
müzakere edilir.
Çizelge ZA.1 - Bu standard ile 93/42/EEC direktifi arasındaki ilişki
Bu standardın ilgili maddesi 93/42/EEC direktifi Yorumlar
Ek I:
Madde 4, Madde 5, Madde 6, Madde
Madde 7.1, Madde 7.2 ve
7, Madde 8, Madde 9, Madde 10
Madde 7.5
Uyarı: Diğer özellikler ve diğer AB Direktifleri bu standardın kapsamına giren mamüle/mamüllere

uygulanabilir.
7)
TSE Notu: Bu direktif T.C. Sağlık Bakanlığı tarafından 9 Ocak 2007 tarihinde 26398 sayı ile Tıbbi Cihaz
Yönetmeliği adı altında yayınlanmıştır.
30
Ek ZB
(Bilgi için)
Aktif implante edilebilir tıbbi cihazlarla ilgili 90/385/EEC8) direktifinin

temel gerekleri ile ilişkili olan bu standardın maddeleri
Bu standard, Avrupa Komisyonu ve Avrupa Serbest Ticaret Birliği (EFTA) tarafından CEN’e verilmiş bir
görevlendirmeyle vücuda yerleştirilebilir aktif tıbbi cihazlarla ilgili yeni yaklaşım direktifi 90/385/EEC’nin temel
gereklerine uyum sağlamak amacıyla hazırlanmıştır.
Bu standard ilgili direktif altında Avrupa Birliği Resmi Gazetesinde yer aldıktan ve üye devletlerin en az
birinde ulusal standard olarak uygulandıktan sonra Çizelge ZB.1’de verilen maddelere uygunluk, standardın
kapsam sınırları içerisinde direktif ve EFTA düzenlemelerinin ilgili temel gereklerine uygunluk varsayımı ile
müzakere edilir.
Çizelge ZB.1 - Bu standard ile 90/385/EEC direktifi arasındaki uygunluk
Bu standardın ilgili maddesi 93/42/EEC direktifi Yorumlar
Madde 4, Madde 5, Madde 6, Madde Ek I:

7, Madde 8, Madde 9, Madde 10 Madde 9
Uyarı: Diğer özellikler ve diğer AB Direktifleri bu standardın kapsamına giren mamüle/mamüllere

uygulanabilir.
8)
TSE Notu: Bu direktif T.C. Sağlık Bakanlığı tarafından 09 Ocak 2007 tarihinde 26398 sayı ile Vücuda
Yerleştirilebilir Aktif Tıbbi Cihazlar Yönetmeliği adı altında yayınlanmıştır.
31

ED0085 - EN - 0 TS EN ISO 10993-5 Biological Evaluation of Medical Devices - Part 5 Tests For in Vitro

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

ED0085 - EN - 0 TS EN ISO 10993-5 Biological Evaluation of Medical Devices - Part 5 Tests For in Vitro

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

ICS 11.100.

20 TÜRK STANDARDI TS EN ISO 10993-5/Temmuz 2010

TIBBİ CİHAZLARIN BİYOLOJİK DEĞERLENDİRİLMESİ –

Biological evaluation of medical devices – Part 5: Tests for in

TÜRK STANDARDLARI ENSTİTÜSÜ

Kalite Sistem Belgesi

Türk Standardlarına Uygunluk Markası (TSE Markası)

Standardlar ve standardizasyon konusunda daha geniş bilgi Enstitümüzden sağlanabilir.

TÜRK STANDARDLARININ YAYIN HAKLARI SAKLIDIR.

− Bu standardın daha önce yayımlanmış bulunan baskıları geçersizdir.

a) Morfolojik yollarla hücre hasarının değerlendirilmesi,

Tıbbi cihazların biyolojik değerlendirilmesi -

2 Atıf yapılan standard ve/veya dokümanlar

EN, ISO, IEC Adı TS No1) Adı

3.1 Kültür kapları

3.2 Pozitif kontrol malzemesi

3.3 Kör numune

3.4 Negatif kontrol malzemesi

3.5 Deney numunesi

4 Numune ve kontrol malzemenin hazırlanması

Numune hazırlanması ISO 10993-12’ye uygun olmalıdır.

Her bir analizde negatif ve pozitif kontroller olmalıdır.

4.2 Malzemenin sıvı özütlerinin hazırlanması

4.2.1 Özütlemenin esasları

4.2.2 Özütleme aracı

a) Serumlu kültür vasatı,

Not 2 – Serumun/proteinlerin bir dereceye kadar özütlenebilir maddelere bağlanabildiğinin bilinmesi

4.2.3 Özütleme şartları

a) (37 ± 1) oC’ta (24 ± 2) h,

4.3 Doğrudan temasla yapılan deneyler için malzeme hazırlanması

4.3.1 Deney numunelerinin yapısı

4.3.2 Deney numunelerinin sterilliği

4.3.2.1 Deney numunesinin sterilliği dikkate alınmalıdır.

4.3.3 Sıvı deney numuneleri

a) Doğrudan çöktürme veya

ile deneye tabi tutulmalıdır.

Filtre disklerin tepkimesiz emici matriks olarak kullanılması uygun bulunmuştur.

4.3.4 Emici deney numuneleri

4.4 Kontrol numunelerin hazırlanması

Analizleri olumsuz etkilememesi şartıyla ortama antibiyotikler eklenebilir.

Depolama şartları doğrulanmalıdır.

7 Stok hücre kültürünün hazırlanması

8.2 Özütler üzerindeki deney

8.2.1 Bu deney, sitotoksisitenin nitel ve nicel olarak değerlendirilmesini sağlar.

Koloni oluşturma analizinde sadece uygun düşük hücre yoğunluğu kullanılmalıdır.

a) Orijinal özüt üzerinde ve/veya

Not – Uygulanabilirse, taze kontrol kültür vasatı da deneye tabi tutulabilir.

8.3 Doğrudan temasla yapılan deneyler

8.3.1 Bu deney, sitotoksisitenin nitel ve nicel olarak değerlendirilmesine imkan sağlar.

8.4 Dolaylı temasla yapılan deney

8.4.1 Agar difüzyon deneyi

Not – Agar, çeşitli moleküler ağırlıklarda ve saflıklarda elde edilebilir.

8.4.2 Filtre difüzyon deneyi

8.4.2.1 Bu deney sitotoksisitenin nitel olarak değerlendirilmesine imkan sağlar.

8.4.2.9 Uygun boyama işlemi kullanılarak sitotoksik etkiler tespit edilir.

8.5 Sitotoksisitenin tespit edilmesi

Çizelge 1 – Özütlerin sitotoksisitesinin nitel morfolojik derecelendirilmesi

Derece Reaksiyon Kültürlerin durumları

4 Şiddetli Hücre katmanların tamamı veya tamamına yakını yıkıma uğramış

Reaksiyon zonunun tanımlanması

Değerlendirme yöntemi ve değerlendirme sonuçları deney raporuna eklenmelidir.

a) Deneyi yapan kuruluşun adı ve adresi,

Sitotoksik bir etki varsa, daha ileri değerlendirme yapılabilir, örneğin: