Professional Documents
Culture Documents
สัตวแพทย์มหานครสาร
JOURNAL OF MAHANAKORN VETERINARY MEDICINE
Available online: www.tci-thaijo.org/index.php/jmvm/
ความหลากหลายทางชีวภาพของแมลงวันดูดเลือดสัมพันธ์กับความชุกของเชื้อ
Anaplasma marginale ในฟาร์มโคนม จังหวัดราชบุรี
1สาขาสัตวศาสตร์,
คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏหมู่บ้านจอมบึง, จ.ราชบุรี 70150
2ภาควิชาพยาธิชีววิทยาทางสัตวแพทย์, มหาวิทยาลัยมิสซูรี, โคลัมเบีย, 65211, สหรัฐอเมริกา
บทคัดย่อ: การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างความหลากหลายทางชีวภาพของ
แมลงวันดูดเลือดและความชุกของเชื้อ Anaplasma marginale ที่พบในแมลงวันดูดเลือดในฟาร์มโคนม
จังหวัดราชบุรี โดยเก็บตัวอย่างแมลงวันดูดเลือดจํานวน 1,419 ตัวอย่าง จากฟาร์มโคนม จังหวัดราชบุรี
ประกอบด้วยพื้นที่ในอําเภอโพธาราม (375 ตัวอย่าง) อําเภอบ้านโป่ง (652 ตัวอย่าง) และอําเภอจอมบึง (392
ตัวอย่าง) โดยทําการจําแนกชนิดและตรวจหาการติดเชื้อ A. marginale โดยเทคนิคปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส
(Polymerase chain reaction; PCR) จากการศึกษาพบแมลงวันดูดเลือด ประกอบด้วย 2 วงศ์ 3 ชนิด ได้แก่
วงศ์ Muscidae พบ 2 ชนิดคือ ชนิด Stomoxys (Stomoxys calcitrans, S. indicus และ S. sitiens) และ
ชนิ ด Haematobia และ วงศ์ Tabanidae พบ 1 สกุ ล คื อ ชนิ ด Tabanus (Tabanus rubidus และ T.
striatus) โดยพบว่าการที่แมลงวันดูดเลือดมีจํานวนเพิ่มมากขึ้นสัมพันธ์กับปริมาณน้ําฝน และพบมากที่สุด
ในช่วงระหว่างเดือนมิถุนายน ถึงเดือนสิงหาคม สําหรับการตรวจหาเชื้อ A. marginale พบเชื้อร้อยละ 4.75
(68/1,419) ผลจากการศึกษาพบว่าปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อการติดเชื้อ A. marginale ในแมลงวันดูดเลือด คือ
ชนิดของแมลงวันดูดเลือด ฤดูกาลและปริมาณน้ําฝน (P<0.05) ดังนั้น ในการควบคุมปริมาณของแมลงวันดูด
เลือด แนะนําให้กําจัดแหล่งเพาะพันธุ์ของแมลงวันดูดเลือดบริเวณรอบฟาร์มโคนมก่อนเข้าฤดูฝน และควรเฝ้า
ระวังการระบาดของโรคที่มีแมลงวันดูดเลือดเป็นพาหะในพื้นที่
1Division of Animal Science, Faculty of Science and Tecnology Muban chombueng rajabhat university, Ratchaburi 70150
Abstract: The objective of this research was to study the association between the biodiversity
of blood sucking flies and prevalence Anaplasma marginale infections in dairy cattle in
Ratchaburi Province. A total of 1,419 samples of blood sucking flies was collected from dairy
farms of Ratchaburi Province, including 375 samples from Photharam District, 652 samples
from Ban Pong District, and 392 samples from Jom Bueng District. The flies were classified by
taxonomy and A. marginale was detected, using Polymerase chain reaction (PCR). The blood
sucking flies were characterized into 2 families and 3 genus including Muscidae family: genus
Stomoxys (Stomoxys calcitrans, S. indicus, and S. sitiens) and genus Haematobia, and
Tabanidae family: genus Tabanus (Tabanus rubidus and T. striatus). Blood sucking flies were
including associated with the amount of rain and they are mostly found during June to August.
According to A. marginale detection, the percentage of A. marginale infection in blood sucking
flies 4.75% (68/1,419). Factors influenced the infection of A. marginale in blood sucking flies
were diversity of blood sucking flies, season, and the amount of rain (P<0.05). Therefore, for
the control, the breeding habitat of these flies should be modified which is around the dairy
farms, before the rain season while the surveillance should be arranged to prevent the
epidemic caused by blood sucking flies in the area.
172
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
173
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
เชื้ อ A. marginale ในแมลงวั น ดู ด เลื อ ด เพื่ อ เป็ น เริ่ ม ตั้ ง แต่ เ ดื อ นธั น วาคม 2559 ถึ ง เดื อ นสิ ง หาคม
แนวทางในการวางแผนการควบคุมและการป้องกัน 2560 โดยในทุกๆ เดือนๆ ละ 7 วัน ติดต่อกันจะทํา
เพื่อลดจํานวนประชากรของแมลงวันดูดเลือดซึ่งเป็น การเก็บ แมลงโดยติ ด ตั้ ง กับ ดั ก โดยจะติ ด ตั้ง กั บ ดั ก
พาหะนํ า โรคให้ อ ยู่ ใ นระดั บ ที่ ไ ม่ ก่ อ ให้ เ กิ ด ความ ตั้งแต่เวลา 6.00 ถึง 18.00 นาฬิกา
เสียหายทางเศรษฐกิจ 1.3 การจํ า แนกชนิ ด ของแมลงวั น คอก นํ า
ตัวอย่างแมลงวันดูดเลือดที่เก็บได้จากกับดัก มาแยก
อุปกรณ์และวิธีการ ออกจากแมลงอื่น ๆ โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสเตอ
1. สถานที่ทําการศึกษาและการเก็บตัวอย่าง ริโอ (stereo microscope) เพื่อจัดจําแนกชนิดและ
1.1 ฟาร์ ม โคนมในจั ง หวั ด ราชบุ รี จํ า นวน 6 นับจํานวน การจําแนก ชนิดของแมลงถึงระดับวงศ์
ฟาร์ม โดยแบ่งฟาร์มออกเป็น 3 ขนาด การแบ่งขนาด สกุ ล และชนิ ด โดยใช้ key ของ Zumpt (1973)
ของฟาร์ ม ใช้ต ามประกาศระเบี ย บมาตรฐานฟาร์ ม และ Tumrasvin and Shinonaga (1978) ภายหลัง
สัตว์ของประเทศไทย พ.ศ. 2542 “ฟาร์มขนาดเล็ก” การจํ า แนกตั ว อย่ า งแล้ ว เก็ บ ตั ว อย่ า งใน 95% เอ
หมายถึงฟาร์มที่มีจํานวนสัตว์ไม่เกิน 20 ตัว จํานวน 2 ทานอล และเก็บไว้ที่ -20 องศาเซลเซียสจนกว่าจะ
ฟาร์ม “ฟาร์มขนาดกลาง” หมายถึงฟาร์มที่มีจํานวน นําไปศึกษา
สัตว์อยู่ระหว่าง 21-100 ตัว จํานวน 2 ฟาร์ม และ
“ฟาร์มขนาดใหญ่” หมายถึงฟาร์มที่มีจํานวนสัตว์เกิน
กว่า 100 ตัว จํานวน 2 ฟาร์ม
ทํ า การเก็ บ ตั ว อย่ า งเป็ น ระยะเวลา 1 ปี ซึ่ ง
ภายใน 1 ปีลักษณะของภูมิอากาศของประเทศไทย
แบ่ ง ออกเป็ น 3 ฤดู ก าล คื อ ฤดู ฝ นเริ่ ม ตั้ ง แต่ เ ดื อ น
มิถุนายนถึงกลางเดือนกันยายน โดยเดือนที่มีฝนตก
มากที่สุดคือ เดือนกันยายน ฤดูแล้งเริ่มตั้งแต่เดือน
ตุลาคมถึงเดือนมกราคม และฤดูร้อน เริ่มตั้งแต่เดือน ภาพที่ 1 กับดักแบบ NZI
กุมภาพันธ์ถึงเดือนพฤษภาคม
1.2 การเก็บตัวอย่าง เก็บตัวอย่างแมลงวันดูด 1.4 ก า ร ต ร ว จ ห า เ ชื้ อ A. marginale ใ น
เลือดโดยติดตั้งกับดักที่เรียกว่า Nzi trap เก็บตัวอย่าง แมลงวันดูดเลือด
แมลงวันคอกสัตว์ โดยการติดตั้งกับดักที่เรียกว่า Nzi 1.4.1 ขั้ น ตอนการเตรี ย มตั ว อย่ า ง นํ า
Trap ซึ่ ง มี ข นาดความกว้ า ง 2 เมตร ความยาว 2 ตัวอย่างแมลงภายหลังจากการจําแนกชนิดแล้ว บด
เมตร ความสูงของเสากลาง 1.5 เมตร และความสูง ใน CTAB buffer ปริมาณ 0.25 มิลลิลิตรต่อแมลง 1
ของเสาข้างจากพื้นดิน 6 เซนติเมตร (mihok et al., ตั ว เมื่ อ บดจนละเอี ย ดเติ ม CTAB buffer ปริ ม าณ
2006) (ภาพที่ 1) กับดักจะวางใกล้กับคอกสัตว์ห่าง 0.75 มิลลิลิตรและนําไปบ่มที่ 60 องศาเซลเซียสนาน
จากขอบรั้ ว คอกไม่ เ กิ น 1 เมตร ฟาร์ ม ละ 1 กั บ ดั ก 30 นาที ระหว่างนั้นนําออกมาเขย่าทุก 3 นาที
174
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
1.4.2 การสกัดสารพันธุกรรม (DNA) เติม เพื่ อ เปรี ย บเที ย บค่ า ความเหมื อ นของเชื้ อ (%
500 ไมโครลิ ต ร ของ lysis buffer (10 mM Tris- identity)
HCl, 400 mM NaCl และ Na2EDTA pH 8.2) แยก 2. การวิเคราะห์ทางสถิติ
สกัด DNA โดยใช้ Phenol/Chloroform ในปริมาตร ค ว า ม ชุ ก ข อ ง ช นิ ด แ ม ล ง วั น ดู ด เ ลื อ ด
1:1 ผสมให้ เ ข้ า กั น และปั่ น เหวี่ ย งเพื่ อ แยกส่ ว น ที่ (Prevalence rate) คํานวณเป็นร้อยละ และ การติด
ความเร็ ว 13,000 รอบ/นาที นาน 5 นาที เก็ บ เชื้ อ A. marginale คํ า นวณจากอั ต ราส่ ว นของ
สารละลายส่วนบนสกัดอีกครั้งด้วย Chloroform ใน ตัวอย่างที่ positive ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ กับจํานวน
ปริมาตร 1:1 ผสมสารทั้งสองชั้นด้วยการเขย่าเบาๆ ตัวอย่างทั้งหมด โดยใช้ Chi-square tests วิเคราะห์
และนําไปปั่นเพื่อแยกชั้นที่ความเร็วและเวลาเท่าเดิม โดยใช้โปรแกรมสําเร็จรูป ทั้งนี้ p<0.05 แสดงถึงการ
เก็ บ สารละลายส่ ว นบนเพื่ อ นํ า มาตกตะกอน DNA มีนัยสําคัญทางสถิติ และเปรียบเทียบปัจจัยเสี่ยงของ
โดยใช้ absolute ethanol ที่ เ ย็ น แล้ ว ล้ า งด้ ว ย 70 การติดเชื้อในแมลงวันดูดเลือดโดยใช้ odds ratio ที่
เปอร์เซ็นต์ เอทานอล ทิ้งไว้ให้แห้ง และละลาย DNA ระดับความเชื่อมั่น p<0.05 ปัจจัยเสี่ยงที่ศึกษาได้แก่
ในสารละลาย TE (10 mM Tris-HCl , pH 7.4, 1 M พื้ น ที่ ชนิ ด ของแมลงวั น ดู ด เลื อ ด ระบบการเลี้ ย ง
EDTA) เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส ขนาดของฟาร์ม ฤดูกาลและปริมาณน้ําฝน
1.4.3 การตรวจหาเชื้อ A. marginale ใน
แมลงวันดูดเลือด การเพิ่มจํานวนยีน msp4 โดยใช้ ผลการทดลอง
primers คื อ MSP43 (5’-CCGGATCCTTAGCTG การวิจัยครั้งนี้ได้ศึกษาในฟาร์มโคนมในจังหวัด
AACAGGAATCTTGC-3’) แ ล ะ MSP45 (5’-GGG ราชบุ รี ซึ่ ง ในพื้ น ที่ มี จํ า นวนเกษตรกรผู้ เ ลี้ ย งสั ต ว์
AGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3’) 28,509 ครั ว เรื อ น โดยมี อ าชี พ ในการเลี้ ย งโคนม
(de la Fuente et al., 2005) ส ภ า ว ะ แ ล ะ อ ง ค์ 2,175 ครัวเรือนคิดเป็นร้อยละ 7.63 โดยระบบการ
ประกอบสําหรับการทําพีซีอาร์ เพื่อเพิ่มจํานวน ยีน เลี้ ย งโคนมในพื้ น ที่ จั ง หวั ด ราชบุ รี พ บการเลี้ ย ง 2
msp4 ใช้ ต ามวิ ธี ข อง de la Fuente et al. (2005) รูปแบบคือ การเลี้ยงแบบยืนโรง และการเลี้ยงแบบ
ผลผลิ ต ของพี ซี อ าร์ จะมี ข นาดประมาณ 849 เบส ยืนโรงร่วมกับการเลี้ยงปล่อย
แ พ ร์ แ ล ะ นํ า ม า วิ เ ค ร า ะ ห์ โ ด ย เ ท ค นิ ค gel จากการศึ ก ษาการกระจายตั ว และความ
electrophoresis (1% agarose gel) ทําผลผลิตพีซี หลากหลายของแมลงวันดูดเลือดในจังหวัดราชบุรี
อ า ร์ ใ ห้ บ ริ สุ ท ธิ์ โ ด ย ใ ช้ HiYield Gel/PCR DNA พบว่าแมลงวันดู ดเลื อดที่สํารวจจํานวน 1,491 ตัว
Fragments Extraction Kit (RBC BIOSCIENCE) นํา พบแมลงวันใน 2 วงศ์ 3 สกุล (วงศ์ Tabanidae และ
ผลผลิ ต พี ซี อ าร์ ที่ ทํ า ให้ บ ริ สุ ท ธิ์ แ ล้ ว ไปวิ เ คราะห์ ห า Muscidae) ได้แก่ 1) วงศ์ Muscidae พบ 2 สกุลคือ
ลํ า ดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ โ ดยใช้ บ ริ ก ารของ Macrogen สกุ ล Stomoxys (Stomoxys calcitrans,
sequencing service (Seoul, Korea) และนําผลนิ Stomoxys indicus และ Stomoxys sitiens) และ
วคลีโอไทด์ที่ได้เปรียบเทียบกับฐานข้อมูล GenBank สกุล Haematobia 2) วงศ์ Tabanidae พบ 1 สกุล
175
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
176
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
พบจากแมลงวั น ดู ด เลื อ ด พบว่ า ปริ ม าณน้ํ า ฝนมี ด้วยเทคนิค PCR โดยการวิเคราะห์ลาํ ดับนิวคลีโอไทด์
ความสัมพันธ์กับจํานวนแมลงวันดูดเลือดโดยจํานวน จากยีน msp4 พบว่าคู่ไพรเมอร์และปฏิกิริยาดังกล่าว
แมลงวันดูดเลือด มีแนวโน้มเพิ่มขึ้นตามปริมาณน้ําฝน สามารถเพิ่ ม ปริ ม าณชิ้ น ส่ ว นดี เ อ็ น เอของเชื้ อ
(2=58.66, P= 0.01) แต่ จํ า นวนการติ ด เชื้ อ A. Anaplasma spp. เป้าหมายได้ ปรากฏแถบดีเอ็นเอ
marginale ในแมลงวั น ดู ด เลื อ ดพบมากที่ สุ ด เมื่ อ มี ขนาด 849 bp และเมื่อนํา PCR product ดังกล่าว
ปริมาณน้ําฝน 35.1-90 มิ ลลิเมตร โดยช่วงปริมาณ ไปทํ า การวิ เ คราะห์ ลํ า ดั บ นิ ว คลี โ อไทด์ ด้ ว ยวิ ธี
น้ํ า ฝนดั ง กล่ า วแสดงปั จ จั ย เสี่ ย งในการติ ด เชื้ อ A. Sequence analysis (Biodesign) เปรียบเทียบกับนิ
marginale 5.77 เท่า เมื่อเทียบกับช่วงที่มีปริมาณ วคลีโอไทด์ ที่มีในฐานข้อมูล Genbank โดยโปรแกรม
น้ําฝนน้อยกว่า 10 มิลลิเมตร BLAST และ alignment ClustalW พบว่ า มี ลํ า ดั บ
ความชุกของเชื้อ Anaplasma marginale นิว คลิ โ อไทด์ใ กล้ เ คีย ง (similarity) มี ค วามจํา เพาะ
การตรวจหาเชื้ อ A. marginale ในแมลงวั น ระดับจีนัสกับ A. marginale (accession number:
ดู ด เลื อ ดในจั ง หวั ด ราชบุ รี โดยใช้ เ ทคนิ ค ทางโมเล AY 127073) ที่ค่าความเหมือน (% identity) เท่ากับ
กุล าร์ จากจํ า นวนตั ว อย่ า งทั้ ง หมด 1,419 ตั ว อย่ า ง ร้ อ ยละ 99 สํ า หรั บ การติ ด เชื้ อ A. marginale ใน
ตรวจด้ ว ยวิ ธี PCR พบเชื้ อ A. marginale ร้ อ ยละ จังหวัดราชบุรี
4.79 (68/1,419) ในแมลงวันดูดเลือด ในการศึกษา
ครั้ ง นี้ สํ า หรั บ การจํ า แนกชนิ ด Anaplasma spp.
177
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
ตารางที่ 2 ผลของความชุ ก ของการติ ด เชื้ อ A. marginale ที่ ต รวจผลในแมลงวั น ดู ด เลื อ ด (Musidae &
Tabanidae) จังหวัดราชบุรี
178
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
ภาพที่ 3 การเพิ่ ม ปริ ม าณของยี น msp4 โดยใช้ ไ พร์ เ มอร์ msp45/msp43 ; Lane Mk = 100 bp DNA
Ladder Marker, Lane 1 = Positive control, Lane 9 = Negative control, Lane 4 ตั ว อย่ า งที่ ติ ด เชื้ อ
A. marginale ขนาด 849 bp
179
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
180
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
181
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
182
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
183
นันทิยา แซ่เตียว และคณะ / สัตวแพทย์มหานครสาร. 2561. 13(2): 171-184.
184