Machine Translated by Google

Bản thảo được chấp nhận

Tiêu đề: Ứng dụng phương pháp HPLC/UV/MS để tách các

Axit obeticholic và các hợp chất liên quan trong quá trình phát
triển và kiểm soát chất lượng

ˇ ´ ´ ˇ
Tác giả:
ˇ Michal Dousa, Mark eta Slav ´ıkova, Tom a´s Kubelka,
´
Josef Cern y, Petr Gibala, Josef Zezula

PII: S0731-7085(17)32068-X
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jpba.2017.11.018
Thẩm quyền giải quyết: PBA 11592

Để xuất hiện trong: Tạp chí phân tích dược phẩm và y sinh

Ngày nhận: 15-8-2017

Ngày sửa đổi: 1-11-2017

Ngày chấp nhận: 2-11-2017

ˇ ´ ´ ˇ
Vui lòng
ˇ trích dẫn bài viết này như: Michal Dousa, Mark eta Slav ´ıkova,Tom a´s
´
Kubelka, Josef
táchCern
axity,Obeticholic
Petr Gibala,
và Josef Zezula,
các hợp Ứng dụng
chất liên quan phương pháp được
của nó đang HPLC/UV/MS
phát để
triển quy trình và kiểm soát chất lượng, Tạp chí Phân tích Dược phẩm và Y sinh
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2017.11.018

Đây là một tệp PDF của một bản thảo chưa chỉnh sửa đã được chấp nhận để xuất bản.
Là một dịch vụ cho khách hàng của chúng tôi, chúng tôi đang cung cấp phiên bản đầu tiên của bản thảo này.

Bản thảo sẽ trải qua quá trình sao chép, sắp chữ và xem xét bằng chứng thu được trước khi nó
được xuất bản ở dạng cuối cùng. Xin lưu ý rằng trong quá trình sản xuất, các lỗi có thể được
phát hiện có thể ảnh hưởng đến nội dung và tất cả các tuyên bố từ chối trách nhiệm pháp lý áp
dụng cho tạp chí đều có liên quan.
Machine Translated by Google

Ứng dụng phương pháp HPLC/UV/MS để tách Obeticholic

axit và các hợp chất liên quan của nó trong quá trình phát triển và chất lượng

điều khiển

Michal Douša*, Markéta Slavíková, Tomáš Kubelka, Josef Černý, Petr Gibala và Josef

Zezula

Zentiva, ks Praha, a Sanofi Company, U Kabelovny 130, 102 37 Praha 10, Cộng hòa Séc

*Đồng tác giả:

Email: michal.dousa@seznam.cz

Điện thoại: +420 720520506

Trừu tượng đồ họa

Machine Translated by Google

Điểm nổi bật

• Một phương pháp HPLC/UV mới để xác định axit obeticholic và các tạp chất của nó

đã được trình bày

• Các hợp chất liên quan của axit obeticholic được phân thành ba nhóm dựa trên

khối phổ

+ và [M+H+2H3PO4] +
• Các ion cộng mạnh của axit photphoric ([M+H+H3PO4] )

đã được mô tả

• Phương pháp HPLC/UV được đề xuất đã được xác nhận theo hướng dẫn của ICH

trừu tượng

Một phương pháp HPLC với tia cực tím và ion hóa phun điện - khối phổ (ESI-MS)

phát hiện đã được phát triển để tách và xác định axit obeticholic (OBE) và

các hợp chất liên quan của nó trong quá trình phát triển và kiểm soát chất lượng. OBE và liên quan của nó

các hợp chất được phân loại thành ba nhóm chính dựa trên cấu hình khối phổ: (A)

những chất chứa nhóm hydroxyl ở vị trí 3 và 7, (B) những chất chứa nhóm hydroxyl

và/hoặc nhóm carbonyl ở vị trí 3, nhóm hydro, etyl hoặc etyliden ở vị trí 6 và một

nhóm hydroxyl và/hoặc nhóm carbonyl ở vị trí 7, và (C) nhóm chứa nhóm carbonyl

ở vị trí 3 và 7. Quá trình ion hóa ESI-MS của OBE và các hợp chất liên quan của nó thường được tạo ra

ion cộng mạnh [M+H+98]+ và/hoặc [M+H+196]

+ được xác định là các ion cộng của

+ và [M+H+2H3PO4] +
axit photphoric ([M+H+H3PO4] ) bắt nguồn từ pha động.

Quá trình phân tách trên hệ thống HPLC được thực hiện bằng cách sử dụng pha tĩnh dựa trên XSelect

CSH C18 (3,0 x 150 mm x 2,5 μm) và rửa giải gradient tuyến tính bằng acetonitril và 0,05 %

của axit o-photphoric. Điều kiện của hệ thống sắc ký được thiết lập như sau: tốc độ dòng chảy

0,7 ml/phút, nhiệt độ 45°C và phát hiện UV ở bước sóng 192 nm. Cuộc chia ly của 19
Machine Translated by Google

các hợp chất được hoàn thành trong vòng chưa đầy 18 phút (bao gồm cả thời gian cân bằng). Các

Phương pháp HPLC/UV đã được xác nhận một phần theo Hội đồng quốc tế về

Hài hòa hóa các yêu cầu kỹ thuật đối với dược phẩm sử dụng cho người (ICH)

hướng dẫn về độ lặp lại, độ chọn lọc, độ tuyến tính và giới hạn định lượng và

phát hiện.

Từ khóa: axit obeticholic, phát hiện khối lượng, tách LC, cộng khối lượng với photphoric

axit

1. Giới thiệu

Axit mật tự nhiên (BA), axit chenodeoxycholic, được xác định là hoạt động mạnh nhất

phối tử sinh lý cho thụ thể farnesoid X (FXR), có liên quan đến nhiều

quá trình sinh lý và bệnh lý. Một loạt các chất tương tự axit mật được alkyl hóa đã được

được thiết kế và nghiên cứu như một chất chủ vận FXR mạnh nhất [1]. Các quy trình phụ thuộc vào FXR trong

gan và ruột được đề xuất là mục tiêu điều trị trong các bệnh ở người [2,3]. bệnh béo phì

axit (OBE), axit 6α-ethyl-chenodeoxycholic, là một chất tương tự axit mật bán tổng hợp mới.

OBE là chất chủ vận FXR mạnh nhất và sự hiện diện của nhóm ethyl ở vị trí 6α cho phép

tăng hoạt động trong các quy trình phụ thuộc vào FXR làm mục tiêu điều trị bệnh ở người [1].

Cho đến nay, nhiều phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã

đã được áp dụng để phân tích BAs trong chất lỏng sinh học. Các phương pháp HPLC được báo cáo đã được thiết lập

để phân tích các BA liên hợp tự do và/hoặc glycine/taurine. Một nhược điểm lớn của truyền thống

Các phương pháp HPLC có độ nhạy phát hiện tia cực tím thấp do thiếu các chất mang màu mạnh

trong các phân tử của nó. Phát hiện tia cực tím đã được sử dụng ở bước sóng tia cực tím <210nm dẫn đến

giảm độ chọn lọc của phát hiện [4,5,6,7]. Việc tạo dẫn xuất tiền cột được thực hiện trên

Nhóm 3 -OH hoặc trên nhóm cacboxylic ở mạch nhánh của BA được sử dụng để tăng
Machine Translated by Google

độ nhạy phát hiện. Ghi nhãn huỳnh quang được thực hiện với việc sử dụng 2-bromoacetyl

6-methoxynaphthalene [8], 1-bromoacetylpyrene [9], 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin

[10] và N-(9-acridinyl)-bromoacetamide [11]. HPLC kết hợp với điện hóa

phát hiện đại diện cho một sự thay thế tốt để tăng độ nhạy cung cấp cũng nâng cao

độ chọn lọc phát hiện [12]. Gần đây, các kỹ thuật gạch nối như HPLC kết hợp với khối lượng

quang phổ (LC-MS) đã được phát triển để xác định cả tự do và liên hợp

BA [13,14,15].

Kỹ thuật HPLC cung cấp nhiều thông số để kiểm soát quá trình tách và

độ chọn lọc của BA bao gồm độ pH, bản chất hóa học và nồng độ của chất di động

đệm pha, loại chất điều chỉnh dung môi hữu cơ và chất nhồi cột. Một loạt các

hệ thống sắc ký đã được đề xuất để tách BA trên C18 đảo ngược

pha silica gel. Loại chất điều chỉnh hữu cơ như metanol, acetonitril và 2-propanol

ảnh hưởng đến độ chọn lọc sắc ký, metanol được ưu tiên hơn acetonitril hoặc

2-propanol [16,17]. Methanol thể hiện khả năng hòa tan cao hơn đối với các BA kỵ nước hơn,

trong khi acetonitril có ngưỡng UV thấp hơn, điều này có lợi hơn cho phép đo quang phổ

phát hiện [16,18]. Việc tách BAs bị ảnh hưởng bởi độ pH của dung dịch đệm nước của

dung dịch rửa giải nằm trong khoảng từ 2,5 đến 7,5 [16]. Sự giữ lại tự do (pKa ≈ 5,5), glycine liên hợp

(pKa ≈ 4,5) và BA liên hợp taurine (pKa ≈ 1,5) tăng khi pH giảm có thể

do ức chế ion, giúp tăng cường đặc tính ưa mỡ [16]. Do đó, trung lập hoặc

pha động có tính kiềm yếu không thích hợp để tách BAs [19]. Hơn nữa

tham số quan trọng để kiểm soát đối xứng cực đại và thứ tự rửa giải trong RP-LC là

cường độ ion của pha động [20]. Với việc tăng nồng độ muối/đệm trong

pha động, việc lưu giữ các BA không phân ly không thay đổi, trong khi đó

khả năng giữ lại các loài bị ion hóa tăng theo mức độ ion hóa [21].
Machine Translated by Google

Mối quan hệ giữa cấu trúc BA và hành vi lưu giữ của nó trên C18

silica gel pha đảo ngược đã được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt là liên quan đến hydroxyl

và các nhóm thế oxo trong bộ xương steroid [22,23]. Nói chung, quá trình rửa giải diễn ra theo thứ tự

liên hợp taurine < liên hợp glycine < BA tự do trong pha động có tính axit [20,24]. Ở trong

mỗi chuỗi, khả năng lưu giữ BA tăng lên khi giảm số lượng nhóm hydroxyl trên

khung xương steroid, nhưng việc thay đổi thứ tự rửa giải này là do sự có mặt của các nhóm OH

[17,25].

Mục đích của công việc được trình bày là để phát triển và xác nhận một phương pháp HPLC cho

đồng thời xác định và định lượng nguyên liệu thô, sản phẩm trung gian và các sản phẩm liên quan

các hợp chất của OBE với phát hiện UV và MS. Trong nghiên cứu này, phương pháp đã được xác nhận trong

hoạt chất dược phẩm (API) theo hướng dẫn của ICH [26] và thêm vào đó,

khả năng ứng dụng đã được chứng minh trong một quá trình phát triển. Những lợi ích và hạn chế của

Phương pháp HPLC được thảo luận chi tiết.

2. Thực nghiệm

2.1 Thuốc thử và hóa chất

Cấp độ dốc HPLC axetonitril và cấp độ dốc HPLC metanol (JT Baker,

USA) và nước tinh khiết bằng hệ thống Milli-Q (Merck/Millipore, Cộng hòa Séc) đã được sử dụng cho

chuẩn bị mẫu, dung dịch đối chiếu và pha động. Axit fomic, axit photphoric

và Imp 5 đạt chất lượng phân tích (Sigma-Aldrich, Cộng hòa Séc). sự khác biệt

các lô OBE thô và tinh khiết cũng như các tiêu chuẩn tham chiếu của các hợp chất và

các chất trung gian của OBE (Bảng 1) đã được chuẩn bị ở Zentiva ks (Cộng hòa Séc).

2.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu

Machine Translated by Google

Dung dịch chuẩn gốc của dược phẩm được chuẩn bị trong metanol. Các

nồng độ của dung dịch gốc và dung dịch mẫu là 10 mg/mL đối với OBE và

diastereoisomers hoặc 1 mg/mL đối với các chất khác.

2.3 Thiết bị và điều kiện sắc ký

Các thí nghiệm sắc ký được thực hiện bằng Acquity UPLC H-Class

hệ thống bao gồm Trình quản lý dung môi bậc bốn, Trình quản lý mẫu xác thực, UV

máy dò, Trình quản lý dung môi Isocrates (ISM) và máy dò QDa (QDa) nhỏ gọn

máy dò khối lượng bốn đơn được trang bị giao diện ion hóa phun điện (ESI) (Waters,

Cộng hòa Séc). ISM với mô-đun hạn chế chia luồng từ cột

giữa máy dò UV và máy dò khối lượng QDa sử dụng bộ chia. Một cột sau 10:1

Tỷ lệ phân chia máy dò UV/máy dò QDa đã được sử dụng, cùng với việc bổ sung sau cột của

hỗn hợp metanol + nước + axit fomic (theo tỷ lệ 25:75:0,1) hoặc axetonitril + nước + formic

hỗn hợp axit (theo tỷ lệ 25:75:0,1) với tốc độ dòng 0,3 mL/min đến phần đi đến QDa.

QDa được vận hành ở chế độ ion dương bằng cách đặt điện áp 1,5 kV vào ESI

mao quản và điện áp hình nón được đặt ở 10 V. Nhiệt độ khử được đặt ở 600 ° C.

Phổ khối quét toàn bộ được thu thập ở chế độ trọng tâm với phạm vi quét là 200–700 m/z.

Việc phát hiện UV được thực hiện ở bước sóng 192 nm. Hệ thống được điều khiển bởi

trạm dữ liệu bằng phần mềm Empower (Waters).

Tách sắc ký gradient của OBE và các chất liên quan của nó đã được thực hiện

trên Waters 150 x 3.0mm HPLC XSelect CSH C18 (2.5 µm), Acquity UPLC BEH Shield

RP18 (150 x 3,0 mm; 1,7µm), Độ chính xác CSH Phenyl-Hexyl (100 x 3,0 mm; 1,7µm), Độ chính xác

UPLC BEH C18 (150 x 3,0 mm; 1,7µm) và Acquity CSH C18 (100 x 3,0 mm; 1,7µm). Các

thể tích tiêm là 5 µL và nhiệt độ lò cột được đặt ở 45°C. Pha động

A là axit o-photphoric 0,05 % (v/v) và pha động B là axetonitril. Rửa giải gradient

đối với kích thước cột 150 x 3,0 mm được thực hiện với 35 % B trong 1,0 phút, một tuyến tính
Machine Translated by Google

tăng lên 70% B cho đến 11,0 phút, lần tăng tuyến tính tiếp theo lên 90 % B đến 13,0 phút, tiếp theo là

bước đẳng tích ở 90 % B từ 13,0 đến 15,0 phút và cân bằng lại từ 15,5 đến 19,0 phút với

35 % B. Tốc độ dòng chảy được đặt thành 0,7 mL/phút. Độ dốc HPLC được chia tỷ lệ theo

kích thước cột và tốc độ dòng gradient được điều chỉnh theo chế độ UHPLC.

3. Kết quả và thảo luận

3.1 Sự hình thành tạp chất OBE

Quy trình điều chế OBE tinh khiết bao gồm OBE kết tinh dưới dạng

chất trung gian tổng hợp và các phương pháp phân tích để xác nhận độ tinh khiết của OBE là

được trình bày trong bằng sáng chế và được sao chép để có được các tiêu chuẩn về chất trung gian và API [27].

Quá trình tổng hợp được báo cáo bắt đầu bằng việc chuyển đổi axit ketolithocholic OBE 2 thành axit tương ứng

metyl este, lần lượt trong quy trình một nồi được chuyển đổi thành dẫn xuất bis(trimetylsilyl)

OBE 5. Dung dịch khô thô của OBE 5 sau đó được phản ứng với axit Lewis để tạo ra tại chỗ

enolate phản ứng với acetaldehyde để tạo thành aldol adduct. Phản ứng quan trọng này phải được

được thực hiện ở nhiệt độ cực thấp và dưới sự loại bỏ tỉ mỉ độ ẩm và

ôxy. Làm nóng hỗn hợp phản ứng dẫn đến mất nước, thu được enone OBE 6 (như

hỗn hợp các đồng phân E/Z-), Hình 1. Xà phòng hóa trong điều kiện kiềm và axit hóa

tạo ra dẫn xuất OBE 7, được phân lập ở dạng tinh thể. Hydro hóa cung cấp

ban đầu là C6 anomer, chất này đã được epime hóa thành công khi đun nóng trong môi trường kiềm để

cung cấp OBE 8 - alpha cần thiết. Cuối cùng, quá trình khử gốc ketone trên C7 bằng natri

borohydride trong dung dịch natri hydroxit cung cấp OBE [27].

Hầu hết các bước quan trọng về mặt tạo ra tạp chất là bước 3 và 4 (Hình 1), bất kỳ

nước dư ở bước 3 dẫn đến proton của enolate để tạo ra OBE 2 ở hạ lưu,

đó là khó khăn để loại bỏ. Ngoài ra, kiểm soát nhiệt độ, thứ tự và tốc độ bổ sung thuốc thử

rất quan trọng trong bước này, vì phản ứng aldol có thể đảo ngược và bản thân acetaldehyd dễ bị
Machine Translated by Google

suy thoái. Cũng trong bước 4, enones OBE 7 có thể được hoàn nguyên về OBE 2 bằng cách

trình tự phản ứng ngược Michael và aldol nếu lượng natri hydroxit dư quá cao và

thời gian phản ứng kéo dài. Ở giai đoạn này cũng xảy ra phản ứng epime hóa giữa (Z)- và (E)- đồng phân

xảy ra, (E)-đồng phân ổn định hơn và kết tinh hơn. Quá trình hydro hóa diễn ra tương đối

rõ ràng, quá trình epime hóa của trung tâm lập thể C6 cần phải được thúc đẩy để hoàn thành, nếu không nội dung

của diastereomers tăng trong bước cuối cùng.

3.2 Phát hiện UV và MS

Các nguyên liệu thô, sản phẩm trung gian của OBE và các hợp chất liên quan của nó (quy trình

tạp chất) chỉ có độ hấp thụ tia cực tím yếu do đó phát hiện tia cực tím ở bước sóng 192nm được sử dụng để

đạt đủ độ nhạy cần thiết để xác định tất cả các hợp chất có liên quan trong

mẫu. Do phát hiện tia cực tím ở bước sóng 192nm, việc lựa chọn dung môi được sử dụng cho pha động là

giới hạn ở các dung môi có giá trị ngưỡng UV thấp như acetonitril và nước với

cộng các muối vô cơ, axit và bazơ.

Phát hiện khối lượng QDa được sử dụng để mô tả đặc tính khối lượng của OBE và các liên quan của nó

hợp chất của OBE. Đầu tiên, việc phân tích các dạng khử proton ở chế độ ion âm là

đã thử nghiệm nhưng tất cả các hợp chất trung tính từ tập hợp các chất trung gian của OBE và các hợp chất liên quan của nó

các hợp chất cho thấy không có ion sản phẩm nổi bật. Thứ hai, nhóm axit có mặt trong

các chất trung gian có liên quan của OBE và các hợp chất liên quan của nó cho phép chúng được sử dụng hiệu quả

bị khử kích hoạt ở chế độ ESI âm. Thật không may, phản ứng của máy dò khối lượng là tiêu cực

chế độ thấp hơn so với chế độ tích cực. Do đó tất cả các sản phẩm trung gian của OBE và của nó

các hợp chất liên quan được phân tích bằng chế độ ion hóa dương mặc dù hầu hết các tác giả

đã sử dụng chế độ ion hóa âm [28,29].

Kỹ thuật thêm một mẫu liên quan đến việc bổ sung một tham chiếu đã biết

tiêu chuẩn cho một ma trận mẫu đã được sử dụng, để xác nhận danh tính của mẫu

các thành phần.

Machine Translated by Google

3.3 Phát hiện MS - ion phân tử cộng với axit photphoric

Phép đo khối phổ ion hóa Electrospray (ESI-MS), đặc biệt là khi kết hợp với

sắc ký lỏng được sử dụng rộng rãi như một công cụ linh hoạt để chuyển đổi các loại pha dung dịch

thành các ion pha khí. Bản chất mềm của quy trình ESI tạo ra quang phổ trong đó các ion phân tử

phần lớn còn nguyên vẹn với ít mảnh vỡ. Tuy nhiên kỹ thuật này có một số

nhược điểm và một trong số đó là sự hình thành các ion giả phân tử, cũng thường

được gọi là các ion cộng, được tạo ra giữa các chất phân tích và các loại dung dịch khác

có thể làm phức tạp quá trình phân tích định tính và giải thích quang phổ [30]. ESI-MS ion hóa của

OBE và các chất liên quan của nó thường tạo ra các ion cộng mạnh [M+H+98]+ và/hoặc

+ +
[M+H+196] được xác định là các ion cộng của axit photphoric ([M+H+H3PO4] Và

+
[M+H+2H3PO4] ) bắt nguồn từ pha động. Các ion cộng với axit photphoric trong

Khối phổ ESI đã được mô tả trước đó [31]. Quan sát này đã được xác nhận mà không có

axit photphoric được quan sát thấy trong hồ sơ sắc ký khi axit photphoric trong

pha động được thay thế bằng axit formic. Mặt khác, việc sử dụng axit formic trong

pha động không cho phép phát hiện UV ở bước sóng 192 nm. Bên cạnh các chất phụ gia photphoric,

+ +
ion cộng ([M+H+H3PO4+14] và ([M+H+H3PO4+28] ) đã được tìm thấy. Người ta nghi ngờ rằng

nghiện của
+ Và
monometyleste [M+H+H2PO3OCH3] đimetyl este

([M+H+HPO2(OCH3)2] +) của axit photphoric được hình thành do sự có mặt của metanol trong

dung môi ISM. Khi metanol trong dung môi ISM được thay thế bằng acetonitril, những chất gây nghiện này

đã không được phát hiện. Một số ví dụ được chọn được hiển thị trong Hình 2. Sự hình thành của các chất gây nghiện này

dẫn đến giảm đáng kể độ nhạy của phép đo khối phổ và một kết quả không mong muốn

tăng độ phức tạp của khối phổ. Do đó dung môi ISM có chứa

acetonitril với axit formic bổ sung đã được chọn để nghiên cứu thêm.

3.4 Phát hiện MS – khối phổ

Machine Translated by Google

Các ion đặc trưng quan sát được trong phổ ion dương của các chất trung gian của OBE và của nó

các hợp chất liên quan được phân tích trong nghiên cứu này được tóm tắt trong Bảng 2. Khối phổ

thu được (xem Bảng 2) sử dụng axetonitril/0,05 % o-axit photphoric làm pha động là

tương đối đơn giản như mong đợi đối với kỹ thuật ion hóa này.

Các chất trung gian của OBE và các chất liên quan của nó có thể được chia thành ba loại chính

nhóm theo cấu hình phổ khối của chúng. Trong nhóm đầu tiên (nhóm A) thuộc về

các hợp chất có nhóm hydroxyl ở vị trí 3 và 7. Trong phạm vi khối lượng được quét,

các ion chiếm ưu thế do mất nước liên tiếp ([M+H-H2O]+ và [M+H-2H2O]+ )

đã được quan sát. Việc mất nước đã được dự kiến đối với các loài chứa hydroxy này và

ion phân tử được proton hóa [M+H]+ chưa được quan sát thấy. Đối với các hợp chất có hydro hoặc

etyl ở vị trí 6 (OBE, Imp 1, Imp 2, Imp 3, Imp 5 và Imp 10), mất 2 nước

các phân tử đã được quan sát (các ion chiếm ưu thế [M+H-2H2O]+ đối với OBE, Imp 1, Imp 2 và Imp 3).

Hơn nữa, khối phổ được đặc trưng bởi sự hình thành các chất cộng với o

+
axit photphoric: [M+H+H3PO4] (các ion chiếm ưu thế đối với Imp 5 và Imp 10) và [M+H

+
H2O+H3PO4] (đối với tất cả các hợp chất của nhóm ngoại trừ Imp 5; 7 – 20% của pic cơ sở). Hai

các hợp chất từ nhóm này có etyl ở vị trí 6 và nhóm hydroxyl ở vị trí 7

với cấu hình 7S (Imp 1 và Imp 3) cũng cung cấp cả các chất phụ gia axit photphoric

+
([M+H+2H3PO4] ; 15 – 39% của đỉnh cơ sở). Hiện tượng này đã không được quan sát thấy cho khác

các chất trong nhóm này ngay cả đối với OBE và Imp 2 có cấu trúc giống nhau và khác nhau

chỉ trong cấu hình của nhóm OH ở vị trí 7 (Hình 3). Đối với hợp chất chứa

nhóm etyliden (=CH-CH3) ở vị trí 6 (E-Imp 4) loại bỏ một phân tử nước

(100% pic bazơ), hai phân tử nước (30% pic bazơ) và đoạn =CH-CH3

(20% của đỉnh cơ sở) đã được quan sát.

Trong nhóm B, các hợp chất chứa một nhóm hydroxyl và/hoặc nhóm carbonyl tại

vị trí 3, nhóm hydro, etyl hoặc etyliden ở vị trí 6 và một nhóm hydroxyl và/hoặc
Machine Translated by Google

nhóm carbonyl ở vị trí 7. Khối phổ của các hợp chất trong nhóm này chứa 7-one

nhóm liên hợp với nhóm 6-ene được đặc trưng bởi một phân tử proton chiếm ưu thế

ion [M+H]+ với rất ít sự phân mảnh. Quan sát này về cơ bản tương tự như quan sát

thu được bởi Kobayashi et.al. [32]. Các hợp chất có nhóm etyliden với E

cấu hình (E-OBE 6 và E-OBE 7) chỉ tạo ra phân tử được proton hóa chiếm ưu thế

quan sát thấy các ion [M+H]+ và không mất nước ([M+H-H2O]+ ). Các hợp chất với

Cấu hình Z của nhóm etyliden tạo ra các ion [M+H]+ và ít hơn 6 % [M+H-H2O]+

+
các ion (Z-OBE 6 và Z-OBE 7). Hơn nữa, các chất cộng với axit o-photphoric ([M+H+H3PO4] )

đã được quan sát với số lượng ít hơn 15% (Z-OBE 6 và Z-OBE 7). Khối phổ của

các hợp chất chứa nhóm hydro hoặc etyl ở vị trí 6 phức tạp hơn. Các

+
cộng với axit o-photphoric [M+H+H3PO4] là những ion chính quan sát được. nhỏ hơn

phần trăm các ion [M+H]+ (20 – 60 % của pic bazơ) và các ion sinh ra từ

thất thoát nước liên tiếp [M+H-H2O]+ (19-29 % pic bazơ) và [M+H-2H2O]+ (2 – 8

% của đỉnh cơ sở) luôn được phát hiện (OBE 2, OBE 3, OBE 8 – alpha). Các trường hợp ngoại lệ của

nhóm này là OBE 8 – beta và Imp 7. OBE 8 – beta tạo thành proton chiếm ưu thế

ion phân tử [M+H]+ . Ngoài ion phân tử [M+H]+ , chất cộng với axit photphoric

+
[M+H+H3PO4] (53 % của đỉnh cơ sở) và các ion do sự mất mát liên tiếp của

nước [M+H-H2O]+ (25 % pic gốc) và [M+H-2H2O]+ (5 % pic gốc) là

+
Được Quan sát. Các ion chiếm ưu thế [M+H+H3PO4] và các ion kết quả từ liên tiếp

thất thoát nước [M+H-H2O]+ (51 – 59 % của pic bazơ) và [M+H-2H2O]+ (10 – 12 % của

đỉnh cơ sở) đã được quan sát cho Imp 7 và Imp 12. Trong những trường hợp này, không có ion phân tử proton nào

[M+H]+ đã được phát hiện.

Cuối cùng, nhóm C thứ ba chứa các nhóm carbonyl ở vị trí 3 và 7 và không có

+
nhóm hydroxyl trong cấu trúc của chúng. Sản phẩm cộng [M+H+H3PO4] trong nhóm này luôn luôn
Machine Translated by Google

đáng kể và độ phong phú tương đối thấp (dưới 10 %) của ion phân tử được proton hóa

[M+H]+ đã được quan sát (Imp 8, Imp 9, Imp 11 – alpha và Imp 11 - beta).

Trái ngược với Ma và Kim [33], các ion cộng natri [M+Na]+ chưa được

được quan sát trong quang phổ thu được khi sử dụng axetonitril/axit o-photphoric 0,05 % làm chất di động

giai đoạn.

3.5 Tách sắc ký

Các pha tĩnh được thử nghiệm bao gồm các pha tĩnh UHPLC và HPLC khác nhau về

tính chọn lọc và phân cực. Các pha tĩnh được thử nghiệm được biểu diễn bằng phép lai etyl bắc cầu

pha (BEH) và lai bề mặt tích điện (CSH) liên kết C18 và liên kết Phenyl-Hexyl

cột. Việc lưu giữ trên các cột đảo ngược pha bị ảnh hưởng bởi cả hạt nhân

và chuỗi bên của cấu trúc steroid. Lựa chọn chất điều chỉnh hữu cơ và phụ gia được sử dụng trong

pha động đã bị hạn chế chủ yếu do bước sóng phát hiện tia cực tím thấp (<195 nm) và

khả năng tương thích với phát hiện hàng loạt. Pha động với acetonitril là chất điều chỉnh hữu cơ và hai

các chất phụ gia như 0,05% axit o-photphoric cho pH axit (pH = 2) và 0,05% amoniac

hydroxit cho pH cơ bản (pH = 10) đã được nghiên cứu để tối ưu hóa sắc ký

tách biệt. Nhiệt độ bắt đầu của quá trình phân tách là 30°C. Lưu giữ và rửa giải

trật tự của các hợp chất khác nhau trong pha động axit và bazơ. Như mong đợi, không

việc duy trì các hợp chất axit đã đạt được bằng cách sử dụng pha động cơ bản. Do đó, tính axit

pha động đã được sử dụng để tối ưu hóa hơn nữa quá trình phân tách.

Sắc ký trên cột XSelect CSH C18 và cột Acquity UPLC BEH C18

đã chứng minh khả năng lưu giữ và phân giải tốt nhất của OBE và các hợp chất liên quan của nó khi sử dụng

phụ gia pha động có tính axit (0,05 % axit o-photphoric) và acetonitril. Cả hai cột

cung cấp cùng thứ tự rửa giải và độ chọn lọc tương tự. Quỷ Lùn 2/Imp 11 - alpha và Imp

1/Imp 5 không tách biệt hoàn toàn và OBE 8 – alpha/Imp 11 – beta tách biệt một phần

tách biệt trên cả hai cột điều tra. Sự khác biệt nhỏ nhất đã được quan sát thấy giữa
Machine Translated by Google

XChọn cột CSH C18 và Acquity CSH C18, trong đó thứ tự rửa giải vẫn giữ nguyên.

Tuy nhiên, độ chọn lọc trên cột Acquity CSH C18 là khác nhau và sự kết hợp

giữa OBE/Imp 7 và Imp 1/Imp 5 đã được quan sát. Hơn nữa, độ phân giải thấp hơn cho

cặp quan trọng E-OBE 7/OBE 8 – đã đạt được phiên bản beta. Sự tách biệt trên UPLC BEH Shield

Cột RP18 được đặc trưng bằng cách thay đổi thứ tự rửa giải của Imp 4 và Imp 5. Đối với UPLC

Cột BEH Shield RP18 tất cả các hợp chất được thử nghiệm khác được rửa giải theo cùng một thứ tự nhưng với

thời gian lưu khác nhau. Sự phân tách trên cột Acquity CSH Phenyl-Hexyl đã cho một

thứ tự rửa giải các hợp chất hoàn toàn khác so với cột XSelect CSH C18.

Sự phân tách một phần của Imp 4 và Imp 5, Imp 9 và OBE, sự đồng rửa giải của E-OBE 7 và

OBE 8–
beta được quan sát thấy trên cột Acquity CSH Phenyl-Hexyl. Cuối cùng, XSelect

CSH C18 đã được chọn để điều tra thêm.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lưu giữ và độ chọn lọc trong khoảng 25 - 65°C là

nghiên cứu trong điều kiện thành phần không đổi của pha động. Nhiệt độ tối ưu của

sự phân tách được tìm thấy là 45 ° C như được hiển thị trong Hình 4. Chỉ tách một phần Imp1 khỏi

Imp5 đã được quan sát trong các điều kiện này. Việc tách một phần không gây bất lợi cho

xác định Imp 5 vì Imp 1 chưa được phát hiện trong OBE thuần túy.

3.6 Tham số xác thực

Phương pháp này đã được xác thực một phần theo hướng dẫn ICH Q2(R1) [26] về

độ lặp lại, độ chọn lọc, độ tuyến tính và giới hạn định lượng, phát hiện đối với phương pháp HPLC

với phát hiện UV ở bước sóng 192 nm. Việc xác nhận về độ chính xác và độ bền của phương pháp là

không nhằm mục đích nghiên cứu này.

3.6.1 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) và độ tuyến tính
Machine Translated by Google

LOD và LOQ được tính toán cho tất cả các tạp chất dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên tạp âm (S/N). Các

tiếng ồn cơ bản được đo bằng cách tiêm mẫu trắng trong vùng thời gian lưu của các chất có liên quan

tạp chất bằng phần mềm sắc ký. LOD và LOQ tính toán được liệt kê trong Bảng 3.

Tập hợp tất cả các tạp chất và dung dịch OBE ở dải nồng độ từ LOQ đến 200 % của

giới hạn thông số kỹ thuật chung (0,15 % đối với API) đối với các tạp chất được chỉ định (LOQ –

30 µg/ml) đã được chuẩn bị và phân tích. Các đường chuẩn được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị

diện tích pic so với nồng độ của chất có liên quan. Các phương trình hiệu chuẩn là

tính toán bằng cách sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính. Các thông số của đường chuẩn a, b là

thể hiện trong Bảng 3. Độ tuyến tính của các đường chuẩn được nghiên cứu bằng cách sử dụng hệ số tương quan

hệ số r và hệ số chất lượng QC [34]. Nếu hệ số chất lượng QC thỏa mãn

tiêu chí QC<5% và hệ số tương quan r > 0,99 thì độ tuyến tính của mô hình hiệu chuẩn có thể là

coi như được thành lập. Hệ số tương quan r và QC chỉ ra một thỏa đáng

tuyến tính (Bảng 3). Hệ số đáp ứng hiệu chỉnh (CRF) của tạp chất đối với OBE

ở bước sóng 192nm thu được từ tỷ lệ độ dốc của các đường chuẩn thích hợp (Bảng 3).

3.6.2 Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng cách phân tích hai lô API (Zentiva)

trong sáu phân tích lặp đi lặp lại. Các mẫu được chuẩn bị trong cùng điều kiện như mô tả

trên (đoạn 2.2). Độ chính xác của phương pháp được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối

(RSD) và các kết quả được tóm tắt trong Bảng 4. RSD thấp hơn 10%, đó là một

giá trị chấp nhận được đối với các mức nồng độ tạp chất này. Độ chính xác trung gian của

phương pháp chưa được nghiên cứu.

4. Kết luận

HPLC/UV/MS là một công cụ hữu ích, đáng tin cậy có thể được áp dụng để phân tách tốt

và xác định OBE và các hợp chất liên quan mà không cần bước tạo dẫn xuất.
Machine Translated by Google

Phương pháp đề xuất đơn giản, tương đối nhanh, chọn lọc và đủ nhạy cho tất cả các

các hợp chất liên quan của OBE so với các phương pháp đã được công bố trước đây.

Việc sử dụng phát hiện UV ở bước sóng 192 nm là cần thiết để đạt được độ nhạy thỏa đáng.

Việc lựa chọn bước sóng này đã hạn chế thành phần của pha động do sự cần thiết của

sử dụng bộ điều chỉnh hữu cơ và bộ đệm có giá trị giới hạn thấp. kỹ thuật LC/MS, cùng với

kiến thức tổng hợp về khối phổ của hợp chất liên quan đã biết do ESI tạo ra

khối phổ, có thể cực kỳ hữu ích để xác định các tạp chất chưa biết của

OBE. Mối quan hệ của hành vi lưu giữ với cấu trúc của OBE và các hợp chất liên quan của nó

đã được điều tra. Tuy nhiên, không dễ hiểu được hành vi giữ chân của họ trong

về cấu trúc hoặc tính chất hóa lý của chúng. Nó đã phát hiện ra rằng không có chung

mối quan hệ giữa cấu trúc và hành vi lưu giữ cho một hỗn hợp phức tạp của

Các hợp chất. Phương pháp thiết lập này đã được áp dụng thành công trong quá trình phát triển và

kiểm soát chất lượng.

Người giới thiệu

[1] R. Pellicciari, S. Fiorucci, E. Camaioni, C. Clerici, G. Costantino, PR Maloney, A.

Morelli, DJ Parks, TM Willson, axit 6alpha-ethyl-chenodeoxycholic (6-ECDCA), một loại thuốc mạnh

và chất chủ vận FXR chọn lọc có khả năng chống tĩnh điện, J. Med. hóa học. 45 (2002)

3569–
3572.

[2] G. Rizzo, B. Renga, A. Mencarelli, R. Pellicciari, S. Fiorucci, Vai trò của FXR trong việc điều tiết

cân bằng nội môi axit mật và sự liên quan đối với các bệnh ở người, Curr. Mục tiêu thuốc Endocr miễn dịch.

trao đổi chất. Bất hòa. 5 (2005) 289–

303.

[3] AH Ali, KD Lindor, Obeticholic acid trong điều trị viêm đường mật nguyên phát,

Chuyên gia. ý kiến. Dược sĩ 17 (2016) 1809-1815.

Machine Translated by Google

[4] S. Scalia, P. Pazzi, xét nghiệm HPLC của axit mật liên hợp trong dịch người sử dụng trực tuyến

tiền xử lý mẫu trên máy sắc ký đẳng tốc tiêu chuẩn, Clin. Chim. Acta. 224 (1994)

181-190.

[5] S. Scalia, U. Cova, M. Fogagnolo, S. Lanci, A. Medici, Xác định axit mật tự do trong

nguyên liệu thô và sản phẩm số lượng lớn bằng HPLC và GC, Anal. Hãy để. 27 (1994) 1789-1804.

[6] CN Carducci, M. Matejka, H. Ergüven, N. Labonia, A. Mamianetti, Hiệu suất cao

phân tích sắc ký lỏng của axit mật trong mật chuột đồng, J. Chromatogr. 337 (1985) 91-

97.

[7] YH Yeh, DF Hwang, Xác định mật bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

thành phần trong cá, gà và vịt, J. Chromatogr. B. Quần xã sinh vật. Khoa học. ứng dụng 751 (2001) 1-8.

[8] V. Cavrini, R. Gatti, A. Roda, C. Cerrè, P. Roveri, HPLC-Huỳnh quang xác định

axit mật trong dược phẩm và mật sau khi tạo dẫn xuất với 2-bromoacetyl-6-

methoxynaphthalene, J. Pharm. sinh học. hậu môn. 11 (1993) 761-70.

[9] T. Momose, Y. Yamaguchi, T. Iida, J. Goto. T. Nambara, Tương quan duy trì cấu trúc

của axit mật đồng phân trong sắc ký lỏng hiệu năng cao với methyl β

cyclodextrin, Lipid 33 (1998) 101-108.

[10] GF Wang, NH Stacey, J. Earl, Xác định nồng độ axit mật riêng lẻ trong huyết thanh bằng nồng độ cao

sắc ký lỏng hiệu năng, Biomed. Sắc ký đồ 4 (1990) 136-40.

[11] S. Allenmark, M. Chelminska-Bertilsson, RA Thompson, N-(9-acridinyl)-

bromoacetamide - Một thuốc thử mạnh để ghi nhãn huỳnh quang xúc tác chuyển pha của

axit cacboxylic cho sắc ký lỏng, Anal. hóa sinh. 185 (1990) 279–285.

[12] S. Scalia, S. Tirendi, P. Pazzi, E. Bousquet, Xét nghiệm axit mật tự do trong dược phẩm

chuẩn bị bằng HPLC với phát hiện điện hóa, Int. J.Pharm. 115 (1995) 249-253.

[13] X. Qiao, M. Ye, DL Pan, WJ Miao, C. Xiang, J. Han,DA Guo, Sự khác biệt của

nhiều loại thuốc truyền thống của Trung Quốc có nguồn gốc từ mật động vật và sỏi mật: đồng thời
Machine Translated by Google

xác định axit mật bằng sắc ký lỏng kết hợp với khối ba tứ cực

phép đo phổ. J Chromatogr A 1218 (2011) 107-117.

[14] J. Huang, SP Bathena, IL Csanaky, Y. Alnouti, Đặc tính đồng thời của mật

axit và các chất chuyển hóa sulfat của chúng trong gan chuột, huyết tương, mật và nước tiểu bằng cách sử dụng LC-MS/MS, J.

dược phẩm. sinh học. hậu môn. 55 (2011) 1111-1119.

[15] M. Sergi, C. Montesano, S. Napoletano, D. Pizzoni, C. Manetti, F. Colistro, R. Curini, D.

Compagnone, Phân tích hồ sơ axit mật trong huyết thanh người bằng cách làm sạch siêu lọc và

LC-MS/MS, Sắc ký 75 (2012) 479-489.

[16] DS Lu, J. Vialle, H. Tralongo, R. Longeray, Hành vi lưu giữ axit mật trong ion

ức chế và sắc ký cặp ion trên các pha liên kết, J. Chromatogr. A 268 (1983) 1-

18.

[17] R. Shaw, M. Rivetna, WH Elliott, Axit mật: LXIII. Mối quan hệ giữa tính di động

về sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo và cấu trúc của axit mật, J.

Sắc ký đồ A 202 (1980) 347-361.

[18] W. Swobodnik, U. Kliippelberg, JG Wechsler, M. Volz, G. Normandin, H. Ditschuneit,

Xác định sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo nhanh chóng và chính xác

của axit mật liên hợp trong mật người cho các ứng dụng lâm sàng thông thường. kiểm soát trị liệu

trong liệu pháp hòa tan sỏi mật, J. Chromatogr. 339 (1985) 263-271.

[19] WH Elliott, R. Shaw, Sắc ký lỏng hiệu năng cao của axit mật, Phương pháp

enzim. 111 (1985) 51-63.

[20] AD Reid, PR Baker, Hệ số khả năng tương đối của một số axit mật keto trên đảo ngược

pha hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, J. Chromatogr. A 268 (1983) 281-

284.

[21] S. Scalia, Xác định đồng thời axit mật tự do và liên hợp trong dạ dày người

nước ép bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, J. Chromatogr. 431 (1988) 259-269.
Machine Translated by Google

[22] T. Iida, T. Shinohara, T. Momose, FC Chang, J. Goto, T. Nambara, Tách keto

và các đồng phân axit mật keto-hydroxy bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, J.

Sắc ký đồ 438 (1988) 423-428.

[23] T. Iida, FC Chang, J. Goto, T. Nambara, Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hành vi của các đồng phân lập thể axit mật 2-,4- và 6-hydroxyl hóa, J. Liq. Sắc ký đồ 14

(1991) 2527–2539.

[24] YK Zhang, N. Chen, RH Zao, T. Li, ZY Wang, PC Lu, Hành vi lưu giữ của

axit mật liên hợp trong sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo ngược, Biomed.

Sắc ký đồ 6 (1992) 255-227.

[25] AK Batta, SK Aggarwal, G. Salen, Sắc ký lỏng hiệu năng cao của mật

axit. Ảnh hưởng của các nhóm hydroxyl ở C-3, 6, 7 và 12 đối với tính di động của axit mật, J. Liq.

Sắc ký đồ 15 (1992) 467–478.

[26] ICH Q2(R1), Xác nhận các quy trình phân tích; Phiên bản Bước 4, 2005.

[27] Bằng sáng chế WO 2013/192097 A1, Chuẩn bị, sử dụng và các dạng rắn của axit obeticholic.

[28] K. Li, TJ Buchinger, U. Bussy, SD Fissette, NS Johnson, W. Li, Định lượng 15

axit mật trong phân than hồ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao–khối song song

quang phổ, J. Chromatogr. B 1001 (2015) 27–34.

[29] H. Wang , C.-Y. Yeh, K. Li, Y.-W. Chung-Davidson, W. Li, Phương pháp UPLC–
MS/MS

để định lượng axit mật trong huyết tương cá mút đá biển và các mô, J. Chromatogr. b

980 (2015) 72-78.

[30] K. Schug, HM McNair, Sự hình thành chất cộng trong phép đo khối phổ ion hóa phun điện

II. Dẫn xuất axit benzoic, J. Chromatogr. A 985 (2003) 531-539.

[31] SK Chowdhury, V. Katta, RC Beavis, BT Chait, Nguồn gốc và loại bỏ chất gây nghiện

(khối lượng phân tử = 98 u) được gắn với các ion peptide và protein trong khối ion hóa phun điện

quang phổ, J. Am. Sóc. Khối lượng. Quang phổ. 1 (1990) 382-388.
Machine Translated by Google

[32] Y. Kobayashi, K. Saiki, F. Watanabe, Đặc tính phân mảnh khối lượng của steroid

bằng phép đo khối phổ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển, Biol. dược phẩm. Bò đực. 16 (1993)

1175-1178.

[33] Y.-C. Ma, H.-Y. Kim, Xác định steroid bằng sắc ký lỏng/khối lượng

quang phổ, J. Am. Sóc. Khối phổ. 8 (1997) 1010–

1020.

[34] J. Van Loco, M. Elskens, Ch. Croux, H. Beernaert, Tính tuyến tính của đường cong hiệu chuẩn: sử dụng

và sử dụng sai hệ số tương quan, Accredit. phẩm chất. đảm bảo. 7 (2002) 281-285.
Machine Translated by Google

Chú thích hình ảnh

Hình 1. Sơ đồ tổng hợp OBE. Điều kiện phản ứng: a) Axit metansulfonic

(cat.)/methanol/ , b) trimethylsilyl clorua / Lithi Diisopropyl Amide

/toluene/tetrahydrofuran -25 °C, c) Acetaldehyde/BF3*acetonitril/dichloromethane/-60 đến -65

°C, sau đó là 28 °C, d) aq. NaOH/metanol, e) H2 (3 atm)/5% Pd/C/NaOH/H2O/Phòng

Nhiệt độ, f) , g) aq. NaOH/NaBH4

Hình 2. Phổ khối phun điện của OBE 2 và OBE 11 - alpha thu được bằng ISM

dung môi hỗn hợp metanol + nước + axit fomic (theo tỷ lệ 25:75:0.1) (A) và dung môi ISM của

hỗn hợp axetonitril + nước + axit formic (theo tỷ lệ 25:75:0,1) (B). quang phổ chứa

+ +
[M+H]+ , [M+H+H2PO3OCH3] , [M+H+HPO2(OCH3)2] + , và [M+H+H3PO4] ion. số liệu trong

dấu ngoặc đơn đại diện cho sự phong phú tương đối.

Hình 3. So sánh phổ khối phun điện của Imp 1 (A), Imp 2 (B), Imp 3 (C)

và OBE (D) thu được bằng cách sử dụng dung môi ISM của hỗn hợp acetonitril + nước + axit formic (trong

+ Và
tỷ lệ 25:75:0,1). Quang phổ chứa [M+H-2H2O]+ , [M+H+H3PO4] ,

+ ion.
[M+H+2H3PO4]

Hình 4. Quá trình tách OBE và các hợp chất liên quan của nó trên XSelect CSH C18 bằng cách sử dụng

hệ thống rửa giải gradient tuyến tính của acetonitril – 0,05 % o-axit photphoric (tốc độ dòng chảy 0,7

ml/phút) ở nhiệt độ 45°C với đầu dò UV ở bước sóng 192 nm.

Machine Translated by Google
Machine Translated by Google
Machine Translated by Google

Bảng 1. Tên hóa học và tiêu chuẩn tham chiếu độ tinh khiết của OBE và các chất liên quan

vật liệu xây dựng

Tiêu
chuẩn tham
Các hợp chất Tên
chiếu độ

tinh khiết (%)

(4R)-4-((3R,5S,10S,13R)-3-hydroxy-10,13-dimetyl-7-
OB 2 95.1
oxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)axit pentanoic metyl
(4R)- 4-((3R,5S,10S,13R)-3-hydroxy-10,13-dimetyl-7- oxohexadecahydro-1H-
OB 3 99,4
xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoat metyl (4R)-4-((3R ,5R,10R,13R,E)-6-
etyliden-3-hydroxy-10,13- dimetyl-7-oxohexadecahydro-1H-
(E)-OBE 6 xyclopenta[a]phenanthren-17- yl)pentanoat metyl (4R)-4- 98,8

(( 3R,5R,10R,13R,Z)-6-etyliden-3-hydroxy-10,13-
dimetyl-7-oxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17- yl)pentanoat
(Z)-OBE 6 97.1

(4R)-4-((3R,5R,10R,13R,E)-6-etyliden-3-hydroxy-10,13-dimetyl-7-
(E)-OBE 7 91,8
oxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit
(4R)-4-((3R,5R,10R,13R,Z)-6-etyliden-3-hydroxy-10,13-dimetyl-7-
(Z)-OBE 7 96,2
oxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit
OBE 8 – (4R)-4-((3R,5S,6R,10S,13R)-6-etyl-3-hydroxy-10,13-dimetyl-7-
94,6
alpha oxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit
OBE 8 – phiên bản
(4R)-4-((3R,5S,6S,10S,13R)-6-etyl-3-hydroxy-10,13-dimetyl-7-
92,7
thử nghiệm
oxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit
(4R)-4-((3R,5S,6R,7S,10S,13R)-6-etyl-3,7-dihydroxy-10,13-
Hiển thị 1 dimetylhexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit 96,8

(4R)-4-((3R,5S,6S,7R,10S,13R)-6-etyl-3,7-dihydroxy-10,13-
hiển thị 2 dimetylhexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit 93,8

(4R)-4-((3R,5S,6S,7S,10S,13R)-6-etyl-3,7-dihydroxy-10,13-
Imp 3 dimetylhexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit 91,5

(4R)-4-((3R,5R,7S,10R,13R,E)-6-etyliden-3,7-dihydroxy-10,13-
Imp 4 dimetylhexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit 93,8

(4R)-4-((3R,5S,7S,10S,13R)-3,7-dihydroxy-10,13-
Imp 5 dimetylhexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)axit pentanoic 97,8

(4R)-4-((5S,6R,7R,10S,13R)-6-etyl-7-hydroxy-10,13-dimetyl-3-
Imp 7 90,6
oxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit
(4R)-4-((5S,10S,13R)-10,13-dimetyl-3,7-dioxohexadecahydro-1H
Imp 8 82,6
xiclopenta[a]phenanthren-17-yl)axit pentanoic metyl (4R)-4-
((5S ,10S,13R)-10,13-dimetyl-3,7-dioxohexadecahydro
Imp 9 96,5
1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoat
Machine Translated by Google

metyl (4R)-4-((3R,5S,6R,7R,10S,13R)-6-etyl-3,7-dihydroxy-10,13- dimetylhexadecahydro-1H-

Imp 10 98,9
xyclopenta[a]phenanthren-17-yl) ngũ hành

(4R)-4-((5S,6R,10S,13R)-6-etyl-10,13-dimetyl-3,7-
Imp 11 –
dioxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)axit pentanoic 80,6
alpha

(4R)-4-((5S,6S,10S,13R)-6-etyl-10,13-dimetyl-3,7-
Imp 11– phiên bản
dioxohexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)axit pentanoic 89,7
thử nghiệm

(4R)-4-((5S,6S,7R,10S,13R)-6-etyl-7-hydroxy-10,13-dimetyl-3- oxohexadecahydro-1H-
Imp 12 99,8
xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit

(4R)-4-((3R,5S,6R,7R,10S,13R)-6-etyl-3,7-dihydroxy-10,13-
axit béo phì
dimetylhexadecahydro-1H-xyclopenta[a]phenanthren-17-yl)pentanoic axit 99,4

Bảng 2. Cấu trúc và khối phổ ESI của các chất chuẩn tham chiếu của OBE và các chất liên quan

vật liệu xây dựng. Sự phong phú tương đối được liệt kê trong ngoặc đơn.

Tên Mẹ [M+H] [M+H [M+H [M+H+ [M+H Kết cấu

+ H2O]+ 2H2O]+ H3PO4] H2O+H3PO
(Nhóm)
+ 4]+

OBE 420.3 403.4 385.4 519.3 501.34

(MỘT) 2 (6) (100) (61) (7)

Machine Translated by Google

OB 2 390.2 391.4 373.4 355.4 489.3

(B) 7 (55) (17) (6.0) (100)

OB 3 404.2 405.4 387,4 369,4 503.3

(B) 9 (29) (13) (2) (100)

(E)-
430.3 431.4
OB 6
0 (100)
(B)

(Z)-
430.3 431.4 413.4 529.3
OB 6
0 (100) (6) (15)
(B)

(E)- 417.4
416.2
OB 7 (100)
9
(B)

Z-OBE 7
416.2 417.4 399.4 515.3
9 (100) (4) (9)
(B)
Machine Translated by Google

OBE 8-
418.3 401.4 419.4 383.3 517.3
alpha
0 (39) (23) (2) (100)
(B)

OB 8-
418.3 419.4 401.4 383.3 517.3
phiên bản thử nghiệm

0 (100) (25) (5) (53)

(B)

385.4
Hiển thị 1
420.3 403.6 519.3 501.4
(100)
(MỘT) 2 (9) (<1) (6)

hiển thị 2
420.3 403.4 385.4 519.3 501.34

(MỘT) 2 (10) (100) (13) (9)

Imp 3 420.3 403.4 385.4 501.34

(MỘT) 2 (15) (100) (14)

E-Imp 4
418.3 401.4 383.3
0 (100) (30)
(MỘT)
Machine Translated by Google

519.3
Imp 5 392.2 375.3 357.3
(491.4)
(MỘT) 9 (8) (93)
(100)

401.3
Imp 7 418.3 383.3 517.3
(51)
(B) 1 (11) (100)

Imp 8 388.2 389.4 487.3

(C) 6 (3) (100)

Imp 9 402.2 403.3 501.3

(C) 7 (3) (100)

Imp 10 434.3 417.3 399.3 533.3 515.4

(MỘT) 4 (9) (92) (100) (20)

Imp 11 417.3
416.2 515.3
- alpha (4)
9 (100)
(C)
Machine Translated by Google

Imp 11 - phiên

bản thử nghiệm 416.2 417.3 515.3

(C) 9 (8) (100)

Imp 12 418.3 401.4 383.4 517.3

(B) 1 (59) (12) (100)

Machine Translated by Google

Bảng 3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), hệ số chất lượng

(QC), Các thông số của đường chuẩn và hệ số đáp ứng hiệu chỉnh (CRF) của

tạp chất đối với OBE.

đánh chặn,
Các hợp chất LOD *) LOQ *) Dốc, br QC CRF
Một

OB 2 0,19 0,57 -209,4 1 489,9 0,9996 1,8 0,16

Imp 8 0,11 0,34 857.6 1 862,6 0,9997 1,4 0,13

Imp 4 0,05 0,14 2 279,0 3 986,3 0,9992 2,3 0,06

Hiển thị 1
1,32 4,00 -141,5 192,6 0,9993 2,4 1,22

Imp 5 1,40 4,25 -155,7 223,8 0,9990 2,8 1,05

Imp 3 1.18 3,59 -200,8 268,2 0,9992 2,6 0,87

E - OBE 7 0,14 0,42 -1 334,2 1 802,6 0,9989 2,9 0,13

OBE 8 – phiên bản thử nghiệm 0,22 0,65 -689.2 1 349,6 0,9996 1,7 0,17

Z - OBE 7 0,14 0,42 -1 409,1 2 165,8 0,9995 2,0 0,11

Imp 11 - phiên bản thử nghiệm

0,18 0,56 -1 031,7 1 707,1 0,9997 1,5 0,14

OBE 8 – alpha 0,18 0,55 114,4 1 257,6 0,9988 3,0 0,19

OB 3 0,23 0,71 -36,8 1 171,3 0,9991 2,5 0,20

Imp 11 - alpha 0,13 0,40 116,4 1 687,5 0,9996 1,7 0,14

hiển thị 2
1,50 4,54 -200.0 232.3 0.9994 2.2 1,01

Imp 9 0,29 0,87 -984,6 1 348,2 0,9990 2,8 0,17

Imp 12 0,40 1,20 -587.7 1 000,5 0,9989 2,2 0,23

axit béo phì 1,61 4,87 -259,5 234,6 0,9997 1,6 1,00

Imp 7 0,35 1,07 -925,3 743,1 0,9991 2,7 0,32

E - OBE 6 0,11 0,32 539.8 1 516,3 0,9998 1,0 0,15

Z - OBE 6 0,12 0,36 502.4 1 472,3 0,9999 0,9 0,16

Imp 10 1.10 3,34 -169,8 231,1 0,9993 2,4 1,01

*) mg/L
Machine Translated by Google

Bảng 4. Kết quả HPLC về độ chụm của phương pháp

Đợt 1 Đợt 2
tạp chất
Nội dung (%) RSD (%) Nội dung (%) RSD (%)

Imp 5 0,072 5,7 0,10 5.0

Imp 11 - alpha 0,032 9,8 0,036 8,5

Imp 12 0,038 8,7 0,044 5.6