I.

Giới thiệu thành viên

1:Cấn Văn Luật -MSSV 2019
2:Ngô Thành Lực- MSSV 20190350
3:Nguyễn Xuân Lương MSSV 20190351
4: Lưu Quý Minh MSSV 20190354
5: Hoàng Tuấn Minh MSSV 20180349
II. Đề tài nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu
1. Đề tài : Phân tích hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật bằng phương pháp sắc kí lỏng cao
áp(HPLC)
2.Đối tượng nghiên cứu : XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CARBAMATE TRONG MẪU RAU,
MẪU GỪNG VÀ MẪU NƯỚC
a,Khái niệm
Thuốc trừ dịch hại, hay thuốc bảo vệ thực vật, thuốc bảo vệ cây trồng (tiếng
Anh: pesticide, crop protection agent) có thể là một hợp chất hoá học hay tác nhân sinh
học  có khả năng ngăn cản, tiêu diệt, xua đuổi hay hạn chế các loại dịch hại, trong đó dịch
hại có thể là vi khuẩn, virus, nấm, tuyến trùng, cỏ dại, động vật gặm nhấm, chim, cá v.v có
sự cạnh tranh với con người về một loại thức ăn nào đó
Thuốc trừ dịch hại thường được sử dụng như là một nhân tố đảm bảo sự phát triển của
nền nông nghiệp, đảm bảo tăng năng suất cây trồng, nhưng nếu sử dụng thái quá sẽ gây
độc cho con người do tiếp xúc, hay ăn phải nông sản có tồn dư thuốc hay môi trường xung
quanh nhiễm độc, có thể làm suy thoái môi trường, ô nhiễm không khí, đất, nước....
b,Đối tượng nghiên cứu
1,Nguồn gốc
Hiện nay tình trạng thực phẩm nhiễm dư lượng thuốc bảo vệ thực vật quá mức cho phép
vẫn diễn ra hết sức nghiêm trọng. Nhiều vụ ngộ độc thực phẩm theo báo cáo có liên quan
đến dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có trong thực phẩm. Và thành phần phổ biến trong
thuốc bảo vệ thực vật được cho là gây ra vấn đề trên là Carbamate. Carbamate được dùng
nhiều trong nông nghiệp như: thuốc trừ sâu, trừ nấm, diệt cỏ,… Có đến hơn 50 loại
Carbamate được biết tới và phần lớn là từ tổng hợp, chúng được sử dụng khá phổ biến
trong nông nghiệp. Carbamate là hợp chất không bền, dễ bị phân hủy dưới tác động của
môi trường. Carbamate đa số là những chất độc đối với con người và chúng được xếp vào
nhóm độc I hoặc II là những chất độc và cực độc theo tiêu chuẩn Việt Nam.
2,đặc điểm
Carbamate(CBM)là nhóm thuốc bảo vệ thực vật rất phổ biến và chúng có công thức chung

+ Trong đó R1 và R2 là aryl hoặc ankyl.

3, ứng dụng
a,Tổng hợp urê 
Muối amoni carbamate được sản xuất trên quy mô lớn như một chất trung gian trong sản
xuất urê hóa học hàng hóa từ amoniac và carbon dioxide . 
b,Sản xuất thuốc trừ sâu Carbamate
c,Sản xuất chất độc thần kinh carbamate
d,Sản xuất chất bảo quản và mỹ phẩm
e,Sản xuất thuốc carbamate 
III. Phương pháp HPLC
1. Định nghĩa
HPLC là một dạng sắc ký cột bơm ở áp suất cao một mẫu (chất phân tích) đã hòa
tan trong dung môi (pha động) qua cột có vật liệu đóng gói sắc ký cố định (pha
tĩnh). Các đặc tính của mẫu và dung môi, cũng như bản chất của pha tĩnh, xác định
thời gian lưu của các chất phân tích, hoặc tốc độ chúng đi qua cột. Khi mẫu đi qua
cột, các chất phân tích có tương tác mạnh nhất với pha tĩnh sẽ thoát ra khỏi cột chậm
nhất, có nghĩa là chúng có thời gian lưu lâu nhất. Ngược lại, các mẫu thể hiện ít
tương tác với vật liệu cột rửa giải nhanh chóng và do đó được đặc trưng bởi thời
gian lưu ngắn. Việc tách các hợp chất trong một mẫu có thể được thực hiện thông
qua rửa giải đẳng cấp, trong đó thành phần của pha động không đổi hoặc thông qua
rửa giải theo gradient, trong đó thành phần pha động được thay đổi trong quá trình
phân tách theo các điều kiện có lợi cho sự phân ly của chất phân tích khỏi pha tĩnh.
Khi ra khỏi cột, pha động sẽ đi qua mô-đun phát hiện, chẳng hạn như máy đo flo
hoặc detector hấp thụ tia cực tím. Việc lựa chọn đầu dò và bước sóng giám sát thích
hợp là điều cần thiết để tối ưu hóa độ nhạy của phát hiện HPLC. Máy dò tạo ra tín
hiệu tương quan với lượng chất phân tích xuất hiện từ cột, tín hiệu này sau đó được
chuyển đến và ghi lại bằng chương trình máy tính điều khiển HPLC, với dữ liệu có
sẵn cho các phân tích tiếp theo. Từ phương pháp này ta có thể phân tích được các
mẫu chuẩn để lập ra được các pic sắc ký, từ đó khi phân tích các mẫu chưa biết
 thành phần ta có thể dựa vào pic sắc ký chuẩn để đoán thành phần trong mẫu. Ta có
thể dựa vào diện tích hay chiều cao của phần đỉnh trong đồ thị sắc ký và so sánh với
đỉnh sắc ký chuẩn để dự đoán nồng độ.

Hình 2: Sơ đồ hệ thống HPLC

Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát quy trình xác định 10 loại carbamate phổ biến
thường dùng làm thuốc bảo vệ thực vật: Aldicard Sulfoxide; Aldicarb sulfone; Oxamyl;
Methomyl; 3-Hydroxycarbofuran; Aldicarb; Propoxur; Carbofuran; Carbaryl; Methiocard
bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đầu dò huỳnh quang (FD) có tạo dẫn xuất
sau cột. Nguyên tắc của phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột dựa vào đặc tính không
bền của nhóm Carbamate trong môi trường kiềm. Sau khi từng loại Carbamate tách trên
cột sắc ký pha đảo, được dung trong thủy phân trong môi trường bazơ sinh ra methyl amin,
sau đó methylamin phản ứng với thuốc thử O-phthalaldehyde (OPA) và 2-mercaptoethanol
tạo ra dẫn xuất huỳnh quang 1-hydroxytylthio-2- metylisoindol.
+ Phản ứng phân hủy Carbamate trong môi trường bazơ ( phản ứng xảy ra
nhanh hơn với xúc tác nhiệt độ ):

+ Phản ứng của methyl amin với thuốc thử sinh ra hợp chất huỳnh quang 1-
hydroxytythio-2-metylisoindol. Chất này có cực đại hấp thụ ở 340nm và cực đại
phát xạ 440-460nm.

1-hydroxyetylthio-2-metylisoindol

+ Phương pháp này được công nhận là phương pháp rất nhạy và khá chọn lọc
với Carbamate trong đất, nước và thực phẩm,…
IV. Cách chuẩn bị mẫu:
Mẫu rau và mẫu gừng được lấy tại chợ đem bảo quản trong tủ lạnh. Nhặt bỏ hết
là rau bị vàng, úa và gọt bỏ vỏ gừng sau đó tiền hành chiết tách và làm giàu mẫu
bằng hai phương pháp chiết pha rắn (SPE) và chiết lỏng lỏng (LLS) quy hai quy
trình bên dưới. Cột SPE C18 500mg của Varian. Dung môi dùng cho chiết lỏng
lỏng là dichloromethane (CH2Cl2) (b.p 40°C). Tiến hành chiết 3 lần làm sạch bằng
silica. Đuổi dung môi bằng khí N2 khan tinh khiết 99,99% sau đó lọc qua mạng lọc
0,2 µm trước khi phân tích. Thêm lần lượt chuẩn 100 ppb, 500ppb, 1500ppb để
đánh giá độ đúng và độ tin cậy của phương pháp.
Đối với quy trình này thì dung dịch sau khi cô quay phải đuổi được gần như hoàn toàn
MeOH. Nếu lượng MeOH còn lại nhiều thì sẽ làm tăng khả năng rửa giải của dung dịch,
khi cho qua cột C18 thì một số Carbamate tương đối phân cực sẽ bị rửa giải ra khỏi cột
gây mất mẫu làm cho hiệu suất thu hồi thấp
V. Điều kiện chạy sắc ký:
- Hóa chất và thiết bị
+ Hỗn hợp chuẩn 10 loại Carbamate 100 ppm được pha trong methanol . Tất cả các dung
môi là nước đều đạt tiêu chuẩn sử dụng cho HPLC và được lọc qua màng lọc 0,45 µm.
+ Hệ thống HPLC Shimadzu với hệ phản ứng sau cột, đầu dò huỳnh quang (FD), cột phân
tích C18, máy lọc nước và trao đổi ion millipore.
+ Hệ thống tiêm mẫu tự động SIL – 20A Shimadzu, đầu dò huỳnh quang RF-10 Axl có tạo
dẫn xuất sau cột.
+ Cột phân tích HRC – ODS AS0678 kích thước 20cm x 4,6mm x 5µm.
+ Cột bảo vệ GHRC – ODS FU3445. + Injector tiêm tự động SIL – 20A. + Bộ điều nhiệt
CRB – 6A. + Thêm một số thiết bị khác.
- Các thông số của hệ HPLC: Qua quá trình khảo sát và tối ưu hóa các thông số của hệ
HPLC, thu được các thông số tối ưu của hệ thống như sau:
+ Tiêm 10 µl mẫu.
+ Pha động MeOH và nước.
+ Tốc độ 1000ml/phút.
+ Vì chế độ đẳng dòng không thể phân tích 10 loại Carbamate nên ta dùng chế độ gradient
dòng như sau:

+ Bước sóng kích thích 340nm.

+ Bước song phát xạ 445nm.
+ Nhiệt độ lò phản ứng: 95-102°C.
+ VOPA: 0,15 ml/phút, VNaOH: 0,2ml/phút.
+ Nồng độ OPA: 0,25mM, nồng độ NaOH: 50mM.
+ Nồng độ β–mercapropionic: 125ppm, nồng độ đệm 80-100mM.
+ Tổng thời gian chạy là 60 phút để làm sạch cột.
VI.Kết quả và thảo luận:
1. Đánh giá độ nhạy và độ tin cậy của phương pháp:
Đầu dò FD chọn lọc với CBM, độ nhạy cao, giới hạn định lượng chỉ vài ppb.
Độ tuyển tính 0,9980-0,9995.

Bảng 1: giới hạn phát hiện của phương pháp

Chất phân tích S N S/N LOD LOQ
(ppb) (ppb)
Aldicard sulfoxide 413 7 59 0.51 1.69
Adicarb sulfone 337 16 21 1.43 4.76
Oxamyl 255 17 15 2.00 6.67
Methomyl 419 10 42 0.71 2.38
3-hydroxy carbofuran 284 18 16 1.88 6.25
Aldicarb 267 10 27 1.11 3.70
Popoxur 247 12 21 1.43 4.76
Carbofuran 208 14 15 2.00 6.67
Seven(carbaryl) 186 17 11 2.73 9.09
Methiocarb 109 19 6 5 -

Sắc kí đồ chuẩn 100ppb

1: Aldicard Sulfoxide; 2: Aldicarb sulfone; 3: Oxamyl; 4: Methomyl;
5: 3 – Hydroxycarbofuran; 6: Aldicarb; 7: Propoxur; 8: Carbofuran; 9: Carbaryl; 10:
Methiocarb
2. Đánh giá hiệu suất thu hồi:
Hiệu suất thu hồi tương đối cao từ 75-95%
Bảng 2: Hiệu suất thu hồi mẫu rau, gừng và nước thêm chuẩn 100ppb
 Hiệu suất thu hồi của các chất tương đối cao, hầu hết trên 80%. Riêng hiệu suất
thu hồi của Aldicard Sulfoxide khá thấp vì nó có độ tan trong nước tương đối lớn
vào khoảng 10 g/L nên nó phân bố trong nước tương đối nhiều làm cho hiệu suất
của quá trình chiết thấp.
- Kết quả phân tích một số mẫu:
Tiến hành phân tích mẫu thực tế thu được kết quả như sau:
a) Mẫu rau:
Bảng 3: Kết quả phân tích trên mẫu rau
Nơi lấy mẫu Phát hiện Nồng độ (ppb)
Chợ An Dương Vương Aldicarb Sulfoxide 54.3
Chợ An Lạc - -
Chợ Bình Chánh - -
Siêu thị Coop Mark - -
Kểt quả phân tích mẫu rau ¾ mẫu không phát hiện dự lượng Carbamate, ¼
mẫu có phát hiện tuy nhiên nồng độ tương đối thấp trong giới hạn cho phép.
b) Mẫu gừng:
Bảng 4: Kết quả phân tích trên mẫu gừng

Nơi lấy mẫu Phát hiện Nồng độ (ppb)

Chợ An Dương Vương - -
Chợ An Lạc Sevin 90.8
Chợ Bình Chánh - -
Siêu thị Coop Mark - -
 Kểt quả phân tích mẫu gừng ¾ mẫu không phát hiện dự lượng Carbamate, ¼
mẫu có phát hiện tuy nhiên nồng độ tương đối thấp trong giới hạn cho phép.
c) Mẫu nước:
Bảng 5: kết quả phân tích trên mẫu nước
Loại mẫu Nơi lấy mẫu Phát hiện Nồng độ(ppb)
Nước rửa rau Thủ Đức - -

Nước ao rau Thủ Đức 3-Hydroxy carbofuran 10.1

muống
Nước thải nơi Biên Hòa - -
trồng rau
Nước giếng nơi Biên Hòa - -
trồng rau
Nước thải khu Biên Hòa 3- Hydroxy carbofuran 7.3
công nghiệp

Mẫu nước thải khu công nghiệp tại Biên hòa phát hiện
3-Hydroxy carbofuran nồng độ 7.63ppb
 Kết quả khảo sát cho thấy 3/5 mẫu nước không phát hiện dư lượng Carbamate.
2/5 phát hiện dư lượng 3-Hydroxy Carbofuran tuy nhiên hàm lượng
tương đối nhỏ. Nhưng do nước tại Khu Công nghiệp đem phân tích là
chưa qua xử lý, nếu được xử lý đúng cách thì dư lượng Carbamate có
trong nước có thể sẽ phân hủy hết.
VII.Kết luận
+ Xây dựng thành công phương pháp phân tích dư lượng Carbamate.
+ Phương pháp HPLC đầu dò huỳnh quang để phân tích dư lượng Carbamate
được ứng dụng tốt đối với một số mẫu thực tế.
+ Giới hạn phát hiện với mỗi chất khác nhau khoảng vài chục ppb trên
mẫu thật Aldicard Sulfoxide 19.7 ppb; Adicarb sulfone 17.4 ppb; Oxamyl
23.5 ppb; Methomyl 29.8 ppb; 3-Hydroxy carbofuran 35.8 ppb; Aldicarb
24.0 ppb; Propoxur
23.1 ppb; Carbofuran 31.3 ppb; Sevin (carbaryl) 42.0 ppb; Methiocarb 46.9 ppb.
+ Ứng với quy trình làm giàu mẫu, ta có thể phân tích mẫu ở hàm lượng
vài ppb.
+ Cả 2 quy trình trên đều áp dụng tốt để phân tích dư lượng
Carbamate. Quy trình clean – up bằng silica có nhiễu nền lớn hơn C18 và
thao tác clean – up bằng C18 ít tốn công sức hơn khi dùng silica . Đối với
mẫu rau quả, thực phẩm do mẫu rất đa dạng và thành phần nền mẫu khá
phức tạp, vậy nên chọn quy trình xử lý mẫu dùng C18 để clean-up và làm
giàu.
+ Đầu dò huỳnh quang rất nhạy đối với Carbamate giới hạn phát hiện
một số Carbamate có thể đạt tới hàm lượng ppt trong mẫu nước tương ứng
với phương pháp làm giàu phù hợp. Chính vì chọn lọc cho Carbamate nên
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò huỳnh quang được các tổ
chức trên thế giới công nhận là phương pháp tiêu chuẩn phân tích dư lượng
Carbamate trong đất, nước, thực phẩm.