Professional Documents
Culture Documents
TÓM TẮT
Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong thuốc đông dược, chúng
tôi tiến hành đề tài xây dựng phương pháp định lượng diclofenac natri lẫn trong chế phẩm đông
dược được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với detector UV-vis. Sau khi xử lý mẫu diclofenac natri được tiến hành định
lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với cột pha đảo (C8, 150 mm x 4,6 mm, 5
µm), pha động methanol/ đệm phosphat pH 2,5 (70:30 v/v) tốc độ dòng chảy là 1,0 ml/ phút, bước
sóng phát hiện 275 nm. Phương pháp phân tích có độ đặc hiệu; độ phù hợp của hệ thống với độ
lệch chuẩn tương đối (RSD%) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử là 0,0844 và
0,519; khoảng tuyến tính được xây dựng nồng độ diclofenac natri trong khoảng 20-60 µg/ml với
độ tuyến tính r ≈1; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp là 5 µg/ml và 16,5
µg/ml; độ thu hồi là 98,26% và độ lặp lại với RSD <2%. Như vậy phương pháp đã xây dựng phù
hợp đề xác định diclofenac natri trong dược liệu.
Từ khóa: định lượng, chế phẩm đông dược, diclofenac, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
ĐẶT VẤN ĐỀ* cứu phát hiện các thuốc tân dược trộn lẫn
Tại Việt Nam: Nhằm đảm bảo chất lượng trong thuốc đông dược, thực phẩm chức năng
dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ được triển khai nhu sắc ký lớp mỏng, sắc ký
dược liệu sử dụng trong phòng và điều trị lỏng hiệu năng cao, sắc ký khối phổ… Để góp
bệnh, Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản chỉ phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất
đạo tăng cường công tác quản lý chất lượng cấm trộn lẫn trong thuốc đông dược, chúng
dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ tôi sử dụng phương pháp HPLC với detector
dược liệu, đặc biệt Chỉ thị số 03/CT-BYT UV - vis để định lượng diclofenac natri trộn
ngày 24/02/2012 về việc tăng cường công tác lẫn trong chế phẩm đông dược được sử dụng
quản lý chất lượng dược liệu thuốc y học cổ điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương
truyền, thuốc từ dược liệu trong các cơ sở khớp lưu hành trên thị trường.
khám chữa bệnh bằng y học cổ truyền với NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
nhiều giải pháp đồng bộ [4]. NGHIÊN CỨU
Các tân dược được trộn lẫn gồm nhiều nhóm Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị
hợp chất khác nhau, trong đó các nhóm được Nguyên liệu: Chế phẩm đông dược dạng bào
sử dụng nhiều là nhóm thuốc glucocorticoid, chế viên nén, viên nang cứng được sử dụng
thuốc chống viêm không steroid, thuốc giảm điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về xương
béo, thuốc hạ huyết áp [3], [7], [9]… Những khớp, giảm đau đang lưu hành trên thị trường.
tác hại do thuốc đông dược có trộn tân dược
Dung môi hóa chất: Đạt độ tinh khiết phân
gây ra có thể là: Loét dạ dày, gây xốp xương,
tích (PA) và tinh khiết sắc ký (dùng cho
phù, tăng huyết áp, loét đường tiêu hóa, xuất
HPLC); chuẩn diclofenac natri của Viện kiểm
huyết, dị ứng. Hiện nay đã có một số nghiên
nghiệm thuốc Trung ương, SKS0517047.04,
hàm lượng 99,51%.
*
Tel: 0985 671586 Phương pháp nghiên cứu
31
Bùi Thị Luyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 31 - 37
Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: Tùy bản chất + Methanol: Nước = 70: 30 : pic của
của chất cần phân tích mà lựa chọn dung môi diclofenac natri được rửa giải sớm, thời gian
chiết cho phù hợp. Thông thường lựa chọn lưu khoảng 6. Tuy nhiên, pic không cân xứng,
dung môi chiết là methanol, ethanol, kết quả giữa các lần tiêm mẫu, sắc ký đồ
dicloromethan, nước… có thể sử dụng hai không ổn định, có thể chưa rửa giải được hết
dung môi khác nhau để hiệu suất chiết tốt hơn. ở lần tiêm trước.
Theo tài liệu tham khảo [8] chúng tôi đưa ra + Methanol: Đệm phosphat pH 2,5 = 50: 50:
quy trình xử lý mẫu thuốc tân dược chiết từ Sắc ký đồ xuất hiện nhiều pic nhiễu, khả năng
thuốc đông dược như sau: tách không rõ ràng.
Cân chính xác một lượng khoảng 0,5 g vào + Methanol: Đệm phosphat pH 2,5 = 70:30
ống ly tâm. Thêm 10 ml dung môi chiết là các thời gian lưu không quá dài, khoảng 9, pic
dung môi hoặc hệ dung môi chiết. Lắc xoáy cân đối, chân pic gọn, khả năng tách rõ ràng.
10 phút, siêu âm 20 phút ở nhiệt độ phòng, ly Như vậy, tỷ lệ pha động tốt nhất là methanol:
tâm 6000 vòng/ phút trong 20 phút, gạn lấy đệm phosphat 2,5 = 70 : 30.
dịch trong cô cách thủy hoặc pha loãng nếu
- Tốc độ dòng: Khảo sát lần lượt ở tốc độ 0,5
(cần thiết), lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến
ml/ phút; 1,0 ml/phút; 1,5 ml/phút thì thấy:
hành sắc kí.
Tốc độ dòng 1,5 ml/phút áp suất cột quá cao;
Phương pháp định lượng:
0,5 ml/phút thời gian lưu của chất phân tích quá
* Xây dựng phương pháp định lượng bằng dài. Với 1ml/phút thời gian lưu của chất phân
HPLC: Khảo sát pha động, tốc độ dòng, thể tích ngắn hơn và áp suất cột không quá cao.
tích tiêm.
- Thể tích tiêm mẫu: Tiêm 20 µl cho pic chất
* Thẩm định phương pháp đã xây dựng: Về phân tích gọn, đẹp hơn so với khi tiêm 15 µl.
độ đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống, độ
Từ các khảo sát trên, chúng tôi xây dựng quy
thu hồi và lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn trình sắc kí có khả năng phân tích tốt
định lượng, độ tuyến tính. diclofenac Na trong nguyên liệu như sau: Cột
* Ứng dụng phân tích mẫu chế phẩm đông Nucleosil C8 (250 × 0,6 nm, 5 µm); pha động
dược trên thị trường: Phân tích 5-10 mẫu. : methanol và đệm phosphat PH 2,5 (70:30);
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN tốc độ dòng: 1,0 ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl;
Detector UV: Bước sóng đo ở 275 nm; nhiệt
Lựa chọn điều kiện sắc ký
độ phân tích: Nhiệt độ phòng; Nồng độ dung
Chọn bước sóng phát hiện dịch chuẩn 60 µg/ml
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện Lựa chọn điều kiện xử lý mẫu
diclofenac natri, chúng tôi tiến hành quét phổ
Dung môi chiết: Tiến hành chiết chất phân
UV của dung dịch diclofenac natri 60 µg/ml tích trong mẫu chuẩn bằng các dung môi
trên máy quang phổ UV-Vis. Kết quả cực đại chiết, tiến hành 2 lần. Phân tích theo quy trình
hấp thụ của dung dịch này là 275 nm. đã nêu và phân tích bằng phương pháp HPLC.
Pha động Tính tỷ lệ đáp ứng phân tích (diện tích pic) và
- Dung môi: khối lượng mẫu thử (A/m). Kết quả tính trung
bình như sau:
Bảng 1. Kết quả khảo sát dung môi chiết diclofenac trong mẫu chế phẩm đông dược
Khối lượng (m) Dung môi chiết Thời gian lưu Diện tích pic A (mAU.min) Tỷ số A/m
0,5003 MeOH : H2O= 80:20 8,7995 94,524 188,935
0,5002 Acetonitril : H2O = 1:1 8,7992 97,346 194,614
0,5002 Ethanol 8,7759 151,849 303,577
0,5002 Methanol 8,8001 149,672 299,224
32
Bùi Thị Luyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 31 - 37
Dung
môi
Hình 1. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết
Diclofenac natri
Mẫu trắng
Mẫu dd (nền mẫu)
chuẩn
- Trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện các - Trên sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn có các
pic có cùng thời gian lưu với pic của các chất pic có thời gian lưu tương tự như trên sắc đồ
phân tích trên sắc đồ mẫu dung dịch chuẩn và của dung dịch chuẩn.
mẫu trắng thêm chuẩn.
Độ phù hợp của hệ thống
Phân tích lặp lại 7 lần dung dịch chuẩn phân tích trên hệ thống HPLC với các điều kiện đã nêu ở
trên. Kết quả thu được như sau:
Bảng 2. Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống HPLC
Trung
STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Lần 7 RSD
bình
Thời gian
lưu 8,7978 8,7929 8,7898 8,8001 8,8080 8,8104 8,7999 8,7998 0,0844
(phút)
Diện tích
49,49 49,72 49,86 50,17 50,21 49,77 49,72 49,85 0,519
(mAu.t)
Nhận xét kết quả khảo sát thích hợp của hệ thống cho thấy:
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của thời gian lưu và diện tích pic trong các phép thử là 0,0844
và 0,519 đều nhỏ hơn 2%. Như vậy, Hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng là thích hợp để định
lượng diclofenac natri trong dược liệu.
Tuyến tính
Pha dung dịch chuẩn diclofenac natri có nồng độ 20 µg/ml – 60 µg/ml từ dung dịch gốc rồi tiến
hành phân tích trên hệ thống HPLC. Xây dựng đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa
nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng. Từ kết quả thu được ở bảng trên chúng tôi
thiết lập mối tương quan giữa diện tích pic thu được trên sắc ký đồ và nồng độ dung dịch (tính
theo lượng diclofenac Na đưa vào)
Bảng 3. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của diclofenac natri
Nồng độ Phương trình hồi quy:
20 30 40 50 60
(µg/ml) y = 2,5465x- 2,3467
Diện tích hệ số tương quan: r = 0,9997
49,5918 73,207 98,4076 125,672 150,683
(mAu.t)
Diện tích
pic
Nồng độ
(µg/ml)
Hình 3. Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của diclofenac Na
Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan này là: y = 2,5465x – 2,3467 với hệ số tương quan
R2 = 0,9995. Điều này cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa diện tích pic với nồng độ của 2
chất phân tích.
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
34
Bùi Thị Luyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 31 - 37
Chúng tôi tiến hành xác định LOD như sau: Pha dung dịch chuẩn diclofenac natri có nồng độ
giảm dần cho đến khi S/N = 2-3. Từ kết quả LOD tính LOQ theo công thức: LOQ= LOD x 3,3.
Kết quả thực nghiệm thể hiện qua bảng sau:
Bảng 4. Kết quả phân tích giới hạn phát hiện của diclofennac natri
Nồng độ (µg/ml) H nhiễu Hpic S/N
10 0,39 2,63 6,7
5 0,39 1,187 3,04
Từ kết quả ở bảng cho thấy: LOD của diclofenac natri khoảng 5 µg/ml. Từ kết quả trên tính LOQ
theo công thức: LOQ khoảng 16,5 µg/ml.
Độ thu hồi và độ lặp lại
Độ thu hồi và lặp lại của phương pháp tiến hành trên nền mẫu chuẩn. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
có nồng độ 60 µg/ml. Thêm vào nền mẫu 60 µg/ml, tiến hành theo quy trình đã nêu. Làm 6 mẫu
song song. Lượng chuẩn tìm lại tính theo đường chuẩn. Kết quả thực nghiệm như sau:
Bảng 5. Kết quả phân tích độ thu hồi và độ lặp lại của diclofenac natri
STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 Trung bình
Lượng chuẩn thêm (µg) 60 60 60 60 60 60 SD =
Diện tích pic 1,174
149,44 147,14 149,59 147,67 142,26 150,57 58,955
(mAU.min)
Lượng chuẩn thu hồi 59,61 58,70 59,67 58,91 56,79 60,05
RSD
=1,99%
Theo AOAC, tại mức hàm lượng chất trong khoảng độ thu hồi của phương pháp phải đạt và độ
lặp lại của phương pháp RSD=1,99% < 2%. Như vậy độ thu hồi và lặp lại của diclofenac natri
nằm trong khoảng giới hạn cho phép, đạt yêu cầu của AOAC.
Ứng dụng phương pháp HPLC để phân tích mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường
Ứng dụng phương pháp HPLC trong 7 mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường. Chuẩn bị mẫu như
quy trình đã lựa chọn. Tiến hành sắc ký. Kết quả trong 7 mẫu trên không trộn lẫn diclofenac natri.
Bảng 6. Danh mục mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường
STT Mã SP Tên thuốc Nơi sản xuất
1 HC1 Tọa Cốt Hoàn vương Nhà thuốc đông y gia truyền Vạn Xuân Đường
2 HC2 Dưỡng Cốt Hoàn Công ty cổ phần Traphaco
3 HC3 Thống Cốt An Công ty thảo dược Difoco
4 VN1 Viên Vai Gáy Công ty cổ phần dược phẩm Quốc tế Abipha
5 VN2 Viên Xương Khớp Sen Việt Group
6 VN3 Uy Linh Phong Bảo Công ty cổ phần Bảo Thanh Đường
Thanh Đường
7 HC4 Thoái Phong Cốt Nhà thuốc Đông Y Gia truyền Ông Lang Hoán
Hình 4. Sắc ký đồ phân tích mẫu chế phẩm đông dược (VN1)
35
Bùi Thị Luyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 31 - 37
36
Bùi Thị Luyến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 187(11): 31 - 37
SUMMARY
STUDYING THE METHOD OF QUANTIFICATION OF DICLOFENAC
SODIUM IN TRADITIONAL HERBAL MEDICINES USED FOR TREATMENT
OR SUPPORT OSTEOARTHRITIS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY
Bui Thi Luyen*, Nguyen Thi Quynh, Bui Thi Thanh Cham, Do Thi Uyen
TNU - University of Medicine and Pharmacy
Ngày nhận bài: 07/8/2018; Ngày phản biện: 06/9/2018; Ngày duyệt đăng: 31/10/2018
*
Tel: 0985 671586
37