T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT HYPOXANTHIN

TỪ BÀI THUỐC TRÚNG PHONG
Phạm Văn Hiển*, Trịnh Thanh Hùng**, Lê Đức Hùng***
TÓM TẮT
Mục tiêu: khảo sát lựa chọn các điều kiện chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong.
Đối tượng: bài thuốc Trúng phong. Phương pháp: khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất
chiết hypoxanthin, gồm: phương pháp chiết, dung môi, tỷ lệ dung môi, nhiệt độ, thời gian và số
lần chiết; định lượng hypoxanthin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả và kết luận:
đã khảo sát và tìm được các điều kiện cho chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong
gồm: sử dụng phương pháp chiết siêu âm gia nhiệt với dung môi là nước, tỷ lệ dược liệu/dung
0
môi 1/12, nhiệt độ 60 C, thời gian 60 phút/lần, số lần chiết: 02 lần. Từ các thông số khảo sát
được, đã xây dựng được quy trình chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong quy mô
phòng thí nghiệm. Kết quả đánh giá cho thấy quy trình lặp lại với hiệu suất chiết xuất đạt 97 - 98%.
* Từ khoá: Bài thuốc Trúng phong; Chiết xuất hypoxanthin; Quy trình.

Process of Extracting Hypoxanthine from Trung phong Remedy

Summary
Objectives: To investigate the conformity condition for extracting hypoxanthine from Trung
phong remedy. Objects: Trung phong remedy. Methods: To evaluate factors of extracting
hypoxanthine from Trung phong remedy including extraction method, solvent of extraction, ratio
of feed per solvent (F/S), temperature, time and frequency of extraction; To determinate
hypoxanthine content by HPLC. Results and conclusions: The optimal condition to extract
hypoxanthine from Trung phong remedy was established including: extraction under ultrasonic
0
in water at 60 C for 60 minutes/times x 2 times with F/S of 1/12. Under this condition,
hypoxanthine-extraction from Trung phong remedy was 97 - 98%.
* Key words: Trung phong remedy; Hypoxanthine extraction; Process.

ĐẶT VẤN ĐỀ tiện sử dụng [3, 6]. Trong nghiên cứu

Hiện nay, thuốc y học cổ truyền (YHCT)
đang ngày càng được quan tâm và là
hướng phát triển tiềm năng trong nghiên
cứu dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm
chức năng. Tuy nhiên, với phương pháp
bào chế truyền thống, thuốc YHCT, đặc
biệt dạng thuốc sắc có nhiều nhược điểm
như: cồng kềnh, khó bảo quản và không
hiện đại hóa YHCT, vấn đề được đặt lên
hàng đầu là chứng minh tác dụng của
hoạt chất, chiết xuất từ hoạt chất đó bằng
phương pháp hiện đại, đánh giá hiệu quả
của các hoạt chất đó (bằng các mô hình
dược lý thực nghiệm) trước khi chuyển
sang dạng bào chế mới (viên nén, viên
nang, thuốc cốm…) [6, 7].

* Học viện Quân y

** Bộ Khoa học Công nghệ
*** Viện Y học Cổ truyền Quân đội
Người phản hồi (Corresponding): Phạm Văn Hiển (phamvanhien181288@gmail.com)
Ngày nhận bài: 20/01/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/03/2017
Ngày bài báo được đăng: 22/03/2017

14

Bài thuốc Trúng phong gồm các vị
thuốc Địa long (Pheretima), Đậu đen
(Semen Vignae cylindricae), rau Ngót
(Herba Sauropi androgyni), Trần bì
(Pericarpium Citri reticulatae) được sử
dụng trên lâm sàng cho thấy có tác dụng
tốt trong điều trị đột quỵ, nhồi máu não.
Tuy nhiên, bài thuốc quý này vẫn đang sử
dụng chủ yếu dưới dạng viên hoàn hoặc
thuốc sắc, do đó gặp phải những hạn chế
chung của thuốc YHCT. Vì vậy, để góp
phần nâng cao hiệu quả sử dụng bài
thuốc này, cần có nghiên cứu hiện đại
hóa bào chế thành các chế phẩm tiện sử
dụng như viên nén, viên nang, thuốc
cốm... Bước đầu tiên của quá trình này là
chiết xuất hoạt chất từ bài thuốc. Trong
bài báo này, chúng tôi thông báo kết quả
nghiên cứu chiết xuất hypoxanthin (hoạt
chất có trong Địa long và rau Ngót) từ bài
thuốc Trúng phong.
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu hóa chất, thiết bị.
Các vị dược liệu trong bài thuốc Trúng
phong gồm Địa long (Pheretima), Đậu
đen (Semen Vignae cylindricae), rau Ngót
(Herba Sauropi androgyni), Trần bì
(Pericarpium Citri reticulatae) đạt tiêu
chuẩn cơ sở (rau Ngót) và tiêu chuẩn
DĐVN IV [1]. Trong đó, Địa long và rau
Ngót chiếm lần lượt 13,2% và 52,6% tổng
khối lượng bài thuốc.
Hóa chất: hypoxanthin chuẩn (≥ 99,0%)
(Hãng Sigma); các hóa chất, dung môi
đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
Thiết bị: máy chiết siêu âm gia nhiệt
Sineo Ultrawave 1.000; hệ thống phân
tích HPLC gồm bơm cao áp Waters
1.525, detector UV Water 2.874 và các
thiết bị khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017
2. Phương pháp nghiên cứu.
- Phương pháp chiết xuất: cân chính
xác 5,0 g bột bài thuốc Trúng phong đã
nghiền mịn vào bình nón chiết xuất với
dung môi nhất định trong khoảng thời
gian, nhiệt độ khảo sát với số lần chiết
phù hợp. Gộp các dịch chiết, ly tâm ở
3.500 vòng/phút x 5 phút. Lọc qua màng
lọc 0,22 µm được dung dịch tiêm sắc ký.
Định lượng hàm lượng hypoxanthin trong
dịch chiết bằng sắc HPLC theo tài liệu
tham khảo [2] có thẩm định lại.
- Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng tới hiệu suất chiết xuất gồm:
phương pháp chiết, loại dung môi, tỷ lệ
dược liệu/dung môi, thời gian chiết, số lần
chiết, nhiệt độ chiết.
- Chỉ tiêu đánh giá: hiệu suất chiết xuất
hypoxanthin từ bài thuốc.
m hypoxanthin
Hiệu suất = × 100
m BT
Trong đó:
mhypoxanthin: khối lượng hypoxanthin chiết
được; mBT: khối lượng hypoxanthin có
trong bài thuốc (2 dược liệu).
Trong đó hàm lượng hypoxanthin
trong 2 dược liệu được định lượng bằng
HPLC trong dịch chiết 4 lần (đến khi
không còn phát hiện hoạt chất).
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả thẩm định phương pháp
định lượng hypoxanthin trong bài thuốc
Trúng phong.
Trong công bố trước đây [2], chúng tôi
đã định lượng được hypoxanthin trong
dược liệu Địa long (Pheretima). Ở nghiên
cứu này, chúng tôi nhận thấy có thể áp
dụng phương pháp trên để xác định hàm
lượng hypoxanthin trong bài thuốc Trúng
phong. Chúng tôi tiến hành thẩm định lại
phương pháp.
15
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017

Bảng 1: Kết quả thẩm định phương pháp định lượng hypoxanthin trong bài thuốc
Trúng phong bằng phương pháp HPLC.

Chỉ tiêu thẩm định Kết quả thẩm định

Tính chọn lọc đặc Thời gian lưu của hypoxanthin trên mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của píc
hiệu hypoxanthin chuẩn. Píc này cân đối, sắc nét và tách hoàn toàn khỏi píc tạp (hình 1)

Tính tương thích hệ Ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (1 µg/ml):
thống Spic = 220.700 ± 2.983 (µV*s); RSD (%) = 1,35%
2
Đường chuẩn và Đường chuẩn: Y = 21.526X + 10.960; R = 0,9999
khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính: 1 - 10 µg/ml (hình 2)

Chiết bài thuốc (0,38 g) tương tự như [2]. Sử dụng phương pháp thêm chuẩn ở
Độ đúng 3 mức: thấp (LQC; 1,1 µg), vừa (MQC; 5,5 µg), cao (HQC; 11 µg). Độ thu hồi lần
lượt là (% thu hồi ± SD, n = 3): 93,2 ± 1,9%; 95,2 ± 1,5%; 96,5 ± 1,1%

- Trong ngày: phân tích 6 mẫu thử ở cùng một nồng độ. Hàm lượng hypoxanthin
tính toán (n = 6): 7,35 ± 0,10 µg/ml; RSD (%) = 1,40%
Độ chính xác
- Khác ngày: phân tích 6 mẫu thử ở 3 ngày liên tiếp. Hàm lượng hypoxanthin
tính toán (n = 18): 7,34 ± 1,42 µg/ml; RSD (%) = 1,93%.

Hình 1: Kết quả đánh giá tính chọn lọc đặc hiệu của phương pháp.

16
 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017

Hình 2: Đường chuẩn định lượng hypoxanthin trong bài thuốc Trúng phong.

2. Kết quả xác định hàm lượng
hypoxanthin trong bài thuốc Trúng
phong.
Cân chính xác các dược liệu trong bài
thuốc theo đúng tỷ lệ (mỗi mẻ 5,0 g,
tương đương với Địa long 0,66 g, Đỗ đen
1,32 g, rau Ngót 2,63 g, Trần bì 0,39 g)
vào bình chiết của thiết bị chiết siêu âm,
thêm 50 ml nước chiết siêu âm trong
2 giờ ở nhiệt độ 600C, ly tâm với tốc độ
3.500 vòng/phút trong 5 phút. Gạn riêng
dịch chiết. Bã dược liệu chiết tiếp hai lần
như trên. Tập trung toàn bộ dịch chiết vào
bình định mức 200 ml. Bổ sung vừa đủ
thể tích, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm
để thu được dung dịch tiêm sắc ký. Ngoài
ra, bã dược liệu tiếp tục được chiết lần
thứ 4, bổ sung vừa đủ thể tích vào bình
định mức 100 ml để định lượng riêng
nhằm kiểm tra hoạt chất đã được chiết
kiệt hay chưa. Kết quả cho thấy, sau 3 lần
hoạt chất đã được chiết kiệt. Lần chiết 4
không còn phát hiện hoạt chất hypoxanthin
trong dịch chiết. Kết quả: đã xác định
được hàm lượng hypoxanthin trong bài
thuốc Trúng phong là 195,6 ± 3,0 µg/g
tính theo khối lượng dược liệu khô kiệt.
3. Khảo sát lựa chọn phương pháp
chiết.
Cân chính xác 5,0 g bài thuốc Trúng
phong đã được nghiền mịn, tiến hành
chiết xuất bằng các phương pháp siêu
âm, vi sóng và chiết nóng ở nhiệt độ
600C, chiết bằng dung môi nước, tỷ lệ
dược liệu/dung môi là 1/10 (g/ml), thời
gian 30 phút, chiết một lần.

Bảng 2: Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hiệu suất (n = 3).

Chỉ tiêu đánh giá Chiết siêu âm Chiết vi sóng Chiết nóng

Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g) 132,27 ± 3,94 84,02 ± 1,21 87,23 ± 2,51

Hiệu suất chiết (%) 67,63 42,96 44,64

Khi chiết bài thuốc bằng phương pháp chiết siêu âm, hiệu suất thu được cao nhất
(67,63%). Do vậy, lựa chọn phương pháp chiết siêu âm để thực hiện các khảo sát
tiếp theo.

17
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017

4. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết.

Tiến hành chiết suất bằng thiết bị que siêu âm Sineo Ultrawave 1.000 ở nhiệt độ
0
60 C, thời gian 30 phút, tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/10 (g/ml), chiết một lần với các
dung môi nước, EtOH 30%, EtOH 40%, EtOH 50%, EtOH 60%, EtOH 70%.

100
150 132,27 luong hypoxanthin
Hieu suat chiet
Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g)

100
67,63

Hiệu suất chiết (%)

50

50

14,6
6,33 4,36 3,7 1,71

0
7,47 0
3,24 2,23 1,89 1,71

nuoc EtOH 30% EtOH 40 % EtOH 50% EtOH 60% EtOH 70%

Dung môi chiết

Hình 3: Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất hypoxanthin
từ bài thuốc Trúng phong.

Chiết bài thuốc Trúng phong bằng dung môi nước cho hiệu suất cao nhất (67,63%).
Khi sử dụng EtOH để chiết xuất, độ cồn càng cao, hiệu suất thu được càng giảm, điều
này phù hợp với nghiên cứu của Lu Qiwen và CS (2007) [8]. Do vậy, lựa chọn dung
môi là nước để tiếp tục tiến hành các khảo sát tiếp theo.
5. Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất chiết.
Tiến hành chiết xuất với nước, tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/10 (g/ml), nhiệt độ 600C,
thời gian chiết 30 phút. Chiết 3 lần, mỗi lần định lượng riêng.
Bảng 3: Ảnh hưởng số lần chiết đến hiệu suất (n = 3).

Thông số Lần 1 Lần 2 Lần 3

Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g) 132,27 ± 3,94 51,50 ± 0,57 7,48 ± 0,08

Hiệu suất chiết từng lần (%) 67,62 26,32 3,82

Hiệu suất tổng gộp (%) 67,62 93,94 97,76

Sau 02 lần chiết, hiệu suất chiết đạt 93,94%. Nếu chiết thêm lần 3, hiệu suất cũng
chỉ tăng thêm 3,82%, hơn nữa gây tốn kém về thời gian cũng như dung môi, năng
lượng. Vì vậy, lựa chọn chiết xuất 02 lần cho các khảo sát tiếp theo.

18
 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017

6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết xuất.

Tiến hành chiết xuất bài thuốc 2 lần với tỷ lệ dược liệu/dung môi 1/10 (g/ml), nhiệt
độ 600C, trong khoảng thời gian 15 phút, 30 phút, 60 phút và 90 phút.

200 98,25
100
91,45
88,9
Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g)

180
192,18
178,88
160

Hiệu suất chiết (%)

173,89

140
51,56

120 50

100
luong hypoxanthin
100,84 Hieu suat chiet
80

60

15 30 45 60 75 90
Thời gian chiết (phút)

Hình 4: Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong.
Thời gian có ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất hoạt chất. Cụ thể, với thời gian
chiết 15 phút, hiệu suất chiết đạt 51,56%, thời gian chiết 30 phút hiệu suất là 88,90%.
Khi tăng thời gian chiết lên 60 phút, hiệu suất chiết tăng lên 98,25%, nhưng tiếp tục
tăng lên 90 phút, hiệu suất chiết lại giảm chỉ đạt 91,45%. Chứng tỏ hypoxanthin bị phá
hủy một phần do kéo dài thời gian tác động của nhiệt với hoạt chất có trong dược liệu.
Vì vậy, lựa chọn thời gian chiết 60 phút cho các khảo sát tiếp theo.
7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết xuất.
Chiết xuất với dung môi nước, thời gian chiết xuất 30 phút, tỷ lệ dược liệu/dung môi
1/10 (g/ml), chiết 2 lần ở các khoảng nhiệt độ khác nhau.

250 100

93,7
Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g)

90,26
83,5
77,19
Hiệu suất chiết (%)

200

50
183,45
176,55
150
163,32
150,99 Luong hypoxanthin
Hieu suat chiet

50 60 70 80 90 100
Nhiệt độ chiết (0C)

Hình 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong.

19
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017

Khi tăng nhiệt độ từ 500C lên 600C, hiệu suất tăng từ 77,19% lên 90,26%. Tăng
nhiệt độ lên 800C, hiệu suất tăng lên không đáng kể (3,44%). Khi tăng lên 1000C, hiệu
suất lại giảm xuống 83,50%. Điều này có thể giải thích do hypoxanthin bị phá hủy một
phần bởi nhiệt độ trong quá trình chiết xuất. Vì vậy, lựa chọn nhiệt độ chiết 600C cho
khảo sát tiếp theo.
8. Kết quả khảo sát lựa chọn tỷ lệ dược liệu/dung môi.
Chiết xuất với dung môi nước, thời gian chiết 60 phút, nhiệt độ chiết 60oC, chiết 02
lần với các tỷ lệ dược liệu/dung môi (g/ml) 1/5, 1/7, 1/10 và 1/12.

97,78
200 90,26 100
Lượng hypoxanthin chiết được (µg/g)

191,25
180 70,05
64,76

Hiệu suát chiết (%)

176,55
160

50

140

137,01
Hieu suat chiet
120 126,67 Luong hypoxanthin

1:5 1:7 1:10 1:12

Tỉ lệ dược liệu/dung môi

Hình 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ dược liệu/dung môi đến chiết xuất hypoxanthin từ bài
thuốc Trúng phóng.
Tỷ lệ dược liệu/dung môi càng tăng, hiệu suất chiết càng tăng cao. Cụ thể, chiết
với tỷ lệ 1/5, hiệu suất chỉ đạt 64,76%, khi chiết ở tỷ lệ 1/7, hiệu suất tăng lên 70,05%,
với tỷ lệ 1/10 là 90,26%, đến tỷ lệ 1/12 hiệu suất tăng thêm 7,52% và đạt cao
nhất (97,78%).
Từ các kết quả khảo sát được, lựa chọn các thông số phù hợp cho chiết xuất
hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong ở quy mô phòng thí nghiệm gồm:
- Phương pháp chiết: siêu âm.
- Dung môi chiết: nước.
- Số lần chiết: 02.
- Thời gian chiết: 60 phút.
- Nhiệt độ chiết: 600C.
- Tỷ lệ dược liệu/dung môi (g/ml): 1/12.

20
 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017

9. Kết quả xây dựng quy trình chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong.
Tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong ở
quy mô phòng thí nghiệm như sau.

Hình 7: Sơ đồ quy trình chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc Trúng phong quy mô
phòng thí nghiệm.

Quy trình chiết xuất trên được đánh giá trên 3 mẻ cho thấy kết quả lặp lại và ổn định
với hiệu suất chiết xuất đạt từ 97 - 98%.

KẾT LUẬN chiết có thể ứng dụng trong nghiên cứu

Đã lựa chọn được các thông số tối ưu
trong chiết xuất hypoxanthin từ bài thuốc
Trúng phong bằng phương pháp chiết
siêu âm gồm: dung môi chiết là nước với
tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/12, thời gian
chiết 60 phút, nhiệt độ chiết 600C. Với các
điều kiện đã lựa chọn, hiệu suất chiết thu
hồi hoạt chất đạt 97 - 98%. Quy trình
hiện đại hóa bài thuốc Trúng phong.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam 4. NXB Y
học. Hà Nội. 2009.
2. Phạm Văn Hiển, Lê Đức Hùng, Vũ Bình
Dương. Xây dựng phương pháp định lượng
hypoxanthin trong Địa long (Pheretima

21
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017
aspergillum) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC). Tạp chí Dược học. 2016, số 6, tr.27-30.
3. Fabricant D.S, Farnsworth N.R. The
value of plants used in traditional medicine for
drug discovery. Environmental Health Perspectives.
2001, 109 (Suppl 1), p.69.
4. Liu D, Zeng X.A, Sun D.W, Han Z.
Disruption and protein release by ultrasonication
of yeast cells. Innovative Food Science &
Emerging Technologies. 2013, 18, pp.132-137.
5. Pumure I, Renton J.J, Smart R.B.
Accelerated aqueous leaching of selenium
and arsenic from coal associated rock
samples with selenium speciation using
22
ultrasound extraction. Environmental Geology.
2009, 56 (5), pp.985-991.
6. Sofowora A. Research on medicinal
plants and traditional medicine in Africa. The
Journal of Alternative and Complementary
Medicine. 1996, 2 (3), pp.365-372.
7. Waldram J.B. The efficacy of traditional
medicine: Current theoretical and methodological
issues. Medical Anthropology Quarterly. 2000,
14 (4), pp.603-625.
8. Lu Qi-wen, Li Jian, He Lin. Determination
of hypoxanthine in pheretima compounding
granules by HPLC. Lishizhen Medicine and
Materia Medica Research. 2007, 09.