LES 2

Validatie van methoden

Hoofdstuk 3 :
Validatie van methoden
1. Inleiding

2. Parameters

=> bespreking van de verschillende prestatiekenmerken

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 2

Vraag : Is de methode geschikt voor het
beoogde doel?

Analyseresultaat = uitkomst van een analysemethode

= benadering van de ware waarde

 Betrouwbaar en consistent zijn

 Gebruiker moet er vertrouwen in hebben
 Aantoonbaar zijn dat het resultaat “ juist is”
 Proces = validatie

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 3

Begrip validatie
Validatie : onderdeel van verificatieproces
validatie en evaluatie

Methode: nauwkeurig? Goed?

Status 0 = de methode is (nog) niet gevalideerd;

Status 1 = de methode is gevalideerd binnen het laboratorium
waar de methode gebruikt wordt
Status 2 = de methode is geëvalueerd d. m. v. een
ringonderzoek
Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 4
 Definitie “ Validatie” volgens ISO 17025
Aan geaccrediteerde labo’s :
“ Het laboratorium moet niet-standaardmethoden valideren om te bevestigen
dat die methoden geschikt zijn voor beoogd gebruik. Het betreft hier
methoden, die in het laboratorium werden ontworpen/ontwikkeld, of
genormaliseerde methoden die buiten hun toepassingsgebied worden
gebruikt en uitbreidingen of aanpassingen van genormaliseerde methoden.”

Een niet-standaardmethode = een methode die niet als norm is gedefinieerd

Bij implementatie van een standaardmethode = verificatie uitvoeren

Hoe? Validatie a.d.h.v. prestatiekenmerken

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 5

Parameters voor het “ valideren van methoden”
Toepasbaarheidsbereik (“range”)
Specificiteit
Selectiviteit
Kalibratielijn
Aantoonbaarheidsgrens (LOD)
Bepaalbaarheidsgrens ( LOQ)
Zuiverheid (juistheid) / terugvinding (“recovery”)
Standaardafwijking, gemeten
Relatieve standaardafwijking (variatiecoëfficiënt)
Herhaalbaarheid (r)
Binnen-laboratorium-reproduceerbaarheid (RL)

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 6

 Stroomschema voor validatie
Bepaal specificiteit en selectiviteit van de methode

Bepaal het lineair gebied van de respons van de meetopstelling

Stel een kalibratielijn op

Bepaal de aantoonbaarheids- en de bepaalbaarheidsgrens

* Bepaal de juistheid van het werkgebied

* Bereken de standaardafwijking en de herhaalbaarheid

* Bereken de binnen-laboratorium-reproduceerbaarheid

* Implementatievalidatie = beperkte validatie bv. gebruik van kits

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 7

Stap 1 : Selectiviteit / Specificiteit
Selectiviteit: Onderscheiding van het analyt t.o.v. van andere stoffen
Specificiteit: Methode meet uitsluitend wat beoogd wordt
Verstoring van de bepaling van het analyt :

Signaal
Signaal

Concentratie
Concentratie
Matrixeffect Interferentie-effect

Andere bestanddelen beïnvloeden het Andere bestanddelen

signaal m.a.w. de gevoeligheid G veroorzaken zelf een signaal

Oplossing: Matrixmatching of standaardadditiemethode

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 8
 Stap 2: Kalibratie van de bepaling
Kalibreren = vastleggen van de respons van de apparatuur in functie
van de concentratie van de standaardoplossingen,
Opzet :
• het bepalen van het aantal standaarden i.f.v. concentratiegebied

• gebruiken van de meer standaardmethode = 5 oplopende

standaarden gelijk verdeeld over het werkgebied.

• Schema : 3 maal standaard 1, éénmaal standaard 2

tweemaal standaard 3, éénmaal standaard 4
driemaal standaard
• Verkrijgen van 10 meetpunten en grafisch verwerken

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 9

Toepasbaarheidsbereik
= range

= gehaltegebied waar de analysemethode

toepasbaar is

= afhankelijk van het werkgebied of de

mogelijkheden van het toestel

= afhankelijk van de concentratie van het monster

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 10

Samenhang kenmerken range en lineariteit

1b
mogelijk- 2
heden
toestel

1a werkgebied

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 11

Voorbeeld: bepaling van Vitamine B2
Bepaling gebeurt via spectrofotometrie: meten van absorbanties

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 12

Voorbeeld: bepaling van Vitamine B2
Informatief: principe van het toestel

Straal van fotonen met E:h.v

 A = - log It/Io = - log T = 2 – log % T

A = a.b.c

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 13

 Oefening: Opstellen van een kalibratielijn
Range :meetbereik van het toestel :0 tot 2

Theoretisch :

- Opstellen van een verdunningsreeks ?

- Welke stockoplossingen maken?
- Bepaling van de onbekenden: hoe?

Praktijk:
- Meten van de oplossingen

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 14

Voorbeeld: bepaling van Vitamine B2
Opstellen van een kalibratielijn a.d.h.v.
standaardoplossingen:

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 15

 Voorbeeld: bepaling van Vitamine B2
Bereiding van de stockoplossingen:
Stock 1 :
0,5760 g afwegen op de analytische balans en oplossen in een
maatkolf van 1 liter
C = 0,5760 g/l

Stock 2 : 10 keer verdunnen

50,00 ml nemen en aanlengen tot 500,0 ml
C= 0,05760 g/l of 57,60 mg/l

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 16

Voorbeeld: bepaling van Vitamine B2
Opstellen van de kalibratielijn aan de hand van de meer
standaardmethode.
Concentratie stock riboflavine is 57,60 mg/l.
Maatkolf Stock (ml) AD (ml) conc. riboflavine Absorbantie
(mg/l)
1 10,00 0,182
2 10,00 0,181
3 10,00 0,181
4 20,00 0,356
5 30,00 aanlengen tot 100,0 ml 0,536
6 30,00 0,537
7 40,00 0,708
8 50,00 0,878
9 50,00 0,873
10 50,00 0,876

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 17

Voorbeeld: bepaling van Vitamine B2
Berekening van de standaarden
Concentratie stock riboflavine is 57,60 mg/l.
Maatkolf Stock (ml) AD (ml) conc. riboflavine Absorbantie
(mg/l)
1 10,00 0,182
2 10,00 0,181
3 10,00 0,181
4 20,00 0,356
5 30,00 aanlengen tot 100,0 ml 0,536
6 30,00 0,537
7 40,00 0,708
8 50,00 0,878
9 50,00 0,873
10 50,00 0,876

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 18

Voorbeeld: bepaling van Vitamine B2
Kalibratielijngrafiek met in de x-as de concentratie en in
de y-as de absorbantie

Kalibratielijngrafiek
1

0,9
y = 0,0302x + 0,0095
0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0
0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 19

Oefening: Opstellen van een kalibratielijn
Fotometrische bepaling van een gekleurde stof (Mr = 200),
De molaire absorptiviteit bedraagt 10 000 l / mol* cm,
de concentraties van de onbekenden zijn gelegen
tussen 500 en 600 µmol/l.

Doel: kalibratie uit te voeren van de fotometrische bepaling

m.a.w. welke stappen moet je allemaal uitvoeren?
Kalibratielijn
Grafische weergave
Doel : afleiden van de concentratie van een analyt
in een onbekend monster

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 21

Kalibratielijn via regressierekening
Verkrijgen van informatie:
Rechte y = ax + b (met r en sy/x) en de voorspellingsgrenzen

Confidence limits

Prediction limits

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 22

 Samenstelling van een kalibratielijn
• de meer standaardmethode
= 5 oplopende standaarden gelijk verdeeld over het
werkgebied volgens het schema S1 3x, S2 1x, S3 2x, S4 1x, S5 3x
of S1, S2, S3, S4, S5 1x maken en 3x meten

• Één puntskalibratie
als het intercept niet significant verschillend is van 0

• Standaardaddittiemethode: wegwerken van matrixeffecten

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 23

Standaardadditiemethode
• Wanneer toepassen?
bij een vermoeden van matrixeffecten (= andere stoffen
aanwezig in de oplossing die een invloed hebben op de
bepaling van de analyt)

• Praktisch?
aan een zelfde hoeveelheid onbekende worden stijgende
hoeveelheden standaardoplossing toegevoegd

• Voordeel: uitgevoerd in de matrix van het staal

• Nadeel: methode gebaseerd op extrapolatie

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 24

Standaardadditiemethode : praktisch

conb. = a0/a1
Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 25
Standaardadditiemethode
- Meten van de oplossingen aan het toestel
- Verzamelen van de meetgegevens
- Opstellen van een grafiek :
in de x-as : concentratie van de toegevoegde
hoeveelheid standaard
in de y-as: het signaal
- Uitvoeren van regressierekening

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 26

Standaardadditie: grafische weergave

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 27

Standaardadditie: berekening

conb. = b/a

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 28

 Oefening
De bepaling van kinine in tonic kan op twee
manieren worden uitgevoerd
- Via de kalibratielijnmethode
- Via de standaardadditiemethode

De bedoeling is dat je hetzelfde resultaat bekomt

via beide methoden. Aan de hand van volgende
oefening willen deze 2 manieren nagaan.
Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 29
 Oefening: Bepaling van kinine in tonic
Via de kalibratielijnmethode

• Stock I : 0,0997 g kinine ( M = 782,94 g/mol),

opgelost in 250,0 ml met H2SO4 => c = 509 mol/l

• Stock II : 2,00 ml Stock I wordt verdund in een maatkolf van 500,0 ml

Standaarden STOCK II Conc. Kolf IF

H2SO4
(ml) (µmol/l)
1 tot 3 1,00 89
4 2,00 171
Aanlengen tot 261
5 en 6 3,00
100,0 ml
7 4,00 346
8 tot 10 5,00 425

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 30

Grafische verwerking
Summary Confidence Ints.
Level 0,95 R2 0,99955
Estimate SE Lower Upper s 3,29632
Slope 4158,008 51,1727 3995,15 4320,86
Constant 4,17942 3,4586 -6,8274 15,1862
Correlation Coeff
Correlation 0,999773
500
450
IF = 4158,008 Conc. (µmol/l) + 4,179
400
350
300
IF

250
200
150
100
50
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Conc. (µmol/l)

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 31

Bepaling van de onbekende via de
kalibratielijnmethode
• Een monster van tonic wordt in tweevoud geanalyseerd.
De monsters hebben een totale verdunning van 2000x.

• De monsters worgen gemeten met de fluorimeter en

volgende waarden worden verkregen :

If-waarde = 225
If-waarde = 229

• Bereken de concentratie via de regressierechte:

Monster 1 =
Monster 2 =

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 32

Bepaling van het kininegehalte via
standaardadditie
In de tabel wordt de bereiding weergegeven van de reeks, te meten
voor de bepaling van kinine in tonic, via standaardadditiemethode :
Belangrijk aan de eerste kolf mag er nooit standaardoplossing
worden toegevoegd!!!

Kolf Tonic (100x) Stock II (ml) Conc. If

(ml) (µmol/l)
1 2,00 0,00 90
2 2,00 1,00 177
3 2,00 2,00 264
4 2,00 3,00 350
5 2,00 4,00 434

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 33

Grafiek verkregen via de standaardadditie

De oplossingen worden gemeten met het toestel

en de gegevens worden grafisch verwerkt.
500
400 If(links) = 4225,559 c (stock II) + 90,8
300
If(links)

200
100
0
-0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
c (stock II)

Bereken de concentratie van het monster:

Kwaliteitszorg in het labo Van Assche Caroline 34