Doc.dr.sc.

Branka Lončar

UVOD U KLINIČKU CITOLOGIJU

Klinička citologija/citopatologija je interdisciplinarna dijagnostička struka medicine koja

objedinjuje kliniku, laboratorijsku obradu, analizu i završno mišljenje specijaliste citologa,
odnosno na temelju mikroskopske analize stanica različitih bioloških uzoraka prepoznaje
fiziološka stanja,otkriva i dijagnosticira benigne, premaligne i maligne patološke procese.
Ili jednostavnije:
Klinička citologija/citopatologija je morfološka grana medicine koja proučava i dijagnosticira
bolesti na staničnoj razini.
Osobine se stanica i staničnih struktura mogu promatrati u nativnom ili supravitalno
obojenom razmazu (pregled sedimenta urina, određivanje podrijetla eritrocita u urinu),
standardno obojenom razmazu (po May-Grünwald-Giemsi ili Papanicolaou) te selektivno
obojenom razmazu (citokemijske i imunocitokemijske metode), metodama citogenetike i
molekularne dijagnostike, kinetičkim metodama (određivanje proliferacijskih antigena,
količine DNA i osobina AgNORA-a) kao i elektronskim mikroskopom.
KRATKA POVIJEST RAZVOJA CITOLOGIJE U SVIJETU I HRVATSKOJ
Nastanak mikroskopa i otkriće stanice u 17. stoljeću je označio početak istraživanja stanica.
1665. godine Robert Hooke je u izvješću Znanstvenoj akademiji kraljevskog društva u
Londonu iznio svoja zapažanja do kojih je došao, pomoću mikroskopa kojeg je sam napravio,
o „CELLS“ u tankim presjecima komadića pluta. Hook je otkrio biljne stanice toćnije
stanične stijenke u biljnom tkivu pluta i nazvao ih stanicama.
Svega nekoliko godina kasnije Antony van Leeuwenhoek je izgradio mikroskop koji se
sastojao dvije konveksne leće koje su povećavale 300 puta, povećanje koje je bilo daleko
moćnije od do tada napravljenih mikroskopa. 1674. godine je dao prvi točan opis crvenih
krvnih zrnaca, bakterijskih stanica.... On se danas smatra ocem mikroskopije i mikrobiologije.
Ali je do shvaćanja mogućnosti mikroskopskog promatranja stanica ljudskog organizma u
medicini prošlo ni manje ni više nego puna dva stoljeća.
1838. Müller je postavio temelje citologije, objavivši rad - Über den feineren Bau und die
Formen der krankhaften Geschwülste - O prirodi i strukturnim karakteristikama raka i
karateristikama bolesnih stanja sa kojima se on može zamijeniti - u kojem je opisao stanice
karcinoma te ih razlikovao od stanica sarkoma.
Podrijetlo stanica je prvi pravilno protumačio i objavio 1855. Rudolf Virchow, njemački
fiziolog, zaključio da stanice nastaju samo iz već postojećih živućih stanica – diobom iz

1
druge, prethodno postojeće stanice. Poznata je njegova izreka Omnis cellula ex cellula, koja
u prijevodu postaje treće načelo suvremene stanične teorije: „Sve stanice nastaju iz stanica“.
1854. Beale, profesor Fiziologije i Opće i patološke anatomiju na Kraljevskom koledžu u
Londonu, je objavio knjigu „The microscope and its application to clinical medicine“ sa
crtežima neobojanih stanica raka.
1843. - Julius Vogel - prvi uveo analizu stanica spontano deskvamiranih sa tkivnih površina
– začetnik eksfolijativne citodijagnostika.
1851. Walshe je opisao kako se stanice raka pluća mogu ponekad naći i u sputumu - prvi put
se citologija spominje kao dijagnostička metoda.
1926. su Ellis i Martin opisali svoja iskustvima s uzorcima aspiracione citologije na
bolesnicima sa rakom Memorial Hospital u New Yorku.
1928. G.N. Papanicolaou je shvatio važnost alkoholne fiksacije i razvio tehniku finog
bojenja stanica analizirajući uzorke iz vagine zamoraca, koju je opisao u članku „New cancer
diagnosis“. To prvo izvješće o mogućnosti primjene citologije u otkrivanju karcinoma nije
naišlo na razumijevanje kliničara i posebice patologa.

Tek nakon objave djela G. N. Papanicolaoua i H. F. Trauta pod nazivom “Diagnosis of

Uterine Cancer by Vaginal Smear” 1943. godine priznata je vrijednost citologije u
ginekologiji u Americi. Potom je uspješno uvedena kao morfološka dijagnostika sa mnogim
prednostim i u druga medicinska područja.

Klinička citologija u Hrvatskoj – razvoj

1926. g. hematologija (koštana srž - F. Mihaljević, V. Boić, - uveli osnovne hematološke
pretrage krvi i KS)
1939. g. Beata Brausil (hematologija i ostalo)
1948. g. Erik Hauptman (začetnik i utemeljitelj aspiracijske dijagnostičke punkcije;
usmjerio je specijaliste raznih struka u uputio ih na značenje citoloških nalaza i njihovih
interpretacija u postavljanju dijagnoze nekog patološkog procesa.), dalje Inga Črepinko i
ostali
1953. g. Eduard Baršić -osniva prvi Citološki laboratorij za ginekološku citodijagnostiku –
Petrova – dalje Jasna Ivić
1954. g. Inga Črepinko – osniva osniva Citološki laboratorij za hematologiju i citologiju –
KB Merkur
1959. g. Jasna Ivić (ginekologija)

I u Hrvatskoj su citodijagnostiku počeli razvijati kliničari. Utemeljiteljicom hrvatske kliničke

citološko laboratorijske struke mogu se smatrati prof. dr. Beata Brausil (1039.) čiji su učenici
budući osnivači citologije u pojedinim područjima medicine. Erik Hauptmann je bio zaslužan
da su i ostale struke prihvatile citološke pretrage.Citodijagnostika u ginekologiji razvila se
neovisno i to ponajviše zaslugom Jasne Ivić, prvog liječnika koji se u nas potpuno posvećuje
citologiji.
2
Kako se citološka dijagnostika razvijala u rukama kliničara, mahom entuzijasta, koji su
citologiju radili najčešće uz svoje osnovne specijalizacije, osjetila se potreba za sistematskom
edukacijom koja bi rezultirala većim brojem citodijagnostičara. Krajem 60-tih godina uviđa se
potreba za sistematskom izobrazbom citologa i citotehničara te je 1967.g. osnovan
poslijediplomski studij “Medicinska citologija” na Medicinskom fakultetu Sveučilišta u
Zagrebu. A iste 1967.g. organizira se i dokvalifikacija zdravstvenih tehničara za citotehničare.
1974. g. odobrena je specijalizacija iz “Medicinske citologije” (kasnije “Kliničke citologije”)
za liječnike.

Tijekom 1970. g. osnovana je Sekcija za citologiju i citodijagnostiku ZLH sa svrhom da

Klinička citologija postane samostalna interdisciplinarna dijagnostička struka te da se regulira
status stručnjaka koji se njome bave. 1974. godine osnovana je specijalizacija iz medicinske
citologije – kao trogodišnja specijalizacija, koja 1994. godine prerasta u četverogodišnju
specijalizaciju.

Stremljenje prema ujedinjenoj Europi dovelo je do novog programa specijalizacije

morfoloških struka (patologije, citopatologije) u trajanju od 5 godina koji se sastoji od
temeljne i usmjerene specijalizacije – Specijalist patologije i citologije - listopad 2015.
godine.

ORGANIZACIJA KLINIČKO-CITOLOŠKOG LABORATORIJA

Kod nas i u svijetu citološki laboratoriji djeluju kao samostalne jedinice ili u sklopu kliničkih
ili patohistoloških službi.
Neovisni citološki laboratoriji obično pokrivaju cjelokupnu citologiju: dijagnostičku i skrining
službu (aspiracijsku i eksfolijacijsku citodijagnostiku). Glavna karakteristika citologije kao
kliničke struke je dobra komunikacija s kliničarima s jedne strane te histopatolozima s druge
strane.
KADROVSKA STRUKTURA I NORMATIVI
U citološkim laboratorijima rade specijalisti citolozi (voditelj citološkog laboratorija je
isključivo specijalist citolog), inženjeri laboratorijskog smjera, citoskrineri, zdravstveni
tehničari laboratorijskog smjera, administratori te pomoćno osoblje. Broj i struktura
ovise o tipu laboratorija (klinički ili neklinički) te vrsti citodijagnostike (eksfolijacijska ili
aspiracijska).

ODJEL ZA CITOLOGIJU
Idealno je da odjel uključuje:

3
 prostor za mikroskopiranje
 prostor za preuzimanje, upis, protokoliranje, bojenje i obilježavanje uzoraka
 zaštitni kabinet za uzorke visokog rizika (TBC, hepatitis, HIV)
 administrativni dio s kompjutorskim terminalom
 prostor za odlaganje preparata i nalaza
 ambulantu za uzimanje materijala
VRIJEDNOST I MJESTO CITOLOGIJE U KLINIČKOM RADU
Što se može očekivati od citološkog nalaza?
Iz citološkog nalaza (ako je materijal bio adekvatan) možemo dobiti opisanu analizu i
citološko mišljenje:
● decidiranu dijagnozu
● vrste morfoloških promjena
● diferencijalnu dijagnozu
● preporuke za ponavljanje citoloških i drugih dijagnostičkih pretraga
Za postavljanje citološke dijagnoze nije uvijek dovoljna samo morfološka pretraga
stanica. Uz rutinsku svjetlosnu mikroskopiju (citodijagnostika) u pojedinim se slučajevima
primjenjuju i dodatne tehnologije (citokemija, imunocitokemija, morfometrija, protočna
citometrija, citogenetika i dr.).
Klinički citolog mora imati uvid u podatke o bolesniku, bilo izravnim kontaktom prilikom
uzimanja materijala za citološku pretragu ili putem iscrpno ispunjenih uputnica.
Osim citologa, pri donošenju konačne citološke dijagnoze važnu ulogu imaju i kliničari, tj
liječnici drugih medicinskih struka koji surađuju sa citologom u indiciranju citoloških
pretraga, sudjelovanjem pri uzimanju materijala za citološku pretragu i na kraju
interpretiranjem citoloških nalaza.
Poznati nizozemski citolog Paul Lopez Cardozo rekao: ″Točnost citološke dijagnoze je
obrnuto proporcionalna sa kvadratom udaljenosti između kliničara i citologa″. A udaljenost
obićno znači nedovoljnu informiranost o citologiji.
Koliko citolog treba znati o kliničkim podacima bolesnika?
Tijekom analiziranja citoloških razmaza citolog promatra kvalitativne i kvantitativne
promjene stanica, a da se pri tome ne oslanja ni na koji drugi podatak. Budući da razni
etiopatogenetski faktori mogu uzrokovati iste ili vrlo slične morfološke promjene, važno je da
i citolog zna osobne podatke bolesnika i kliničke manifestacije bolesti i prilikom uzimanja
materijala i pri donošenju zaključka o citološkom mišljenju.
4
Zašto citolog mora biti ″bed side″ liječnik?
1. Zato što je veća vjerojatnost dobivanje prikladnog materijala za citološku analizu
2. Zato što može provjeriti postavljeno citološko mišljenje te zajedno s kliničarom
rješavati diferencijalno-dijagnostičke probleme
3. Zato što neposredno sudjeluje u praćenju liječenja i može indicirati i savjetovati
dodatne citološke i ostale laboratorijske pretrage.
Koliko kliničar treba znati o citologiji?
Citološke pretrage spadaju u skupinu morfoloških pretraga, neagresivnih i jednostavnih za
izvođenje i za bolesnika. Osjetljivost im je visoka, a često je znatna specifičnost. One se mogu
ponavljati i njima se može pratiti učinak liječenja. Zato se citološke pretrage rabe u početku
dijagnostičkog postupka prije kompliciranih, skupih i agresivnih analiza koje su indicirane tek
onda kada citološke pretrage ne mogu dati dijagnozu.
Liječnici različitih kliničkih struka koji rabe citološke pretrage za svoje bolesnike moraju
biti upućeni u:
1. način odabiranja pretrage: što, zašto, kada i kako je najbolje uzeti materijal te s
pomoću kojeh se dodatnih pretraga (ehografske, rendgnenološke, razne endoskopske
metode) može dobiti uzorak ciljano i time povećati pouzdanost citološke pretrage
2. prednosti i nedostatke citološke pretrage te način interpretacije citoloških nalaza
U nalazu se može očekivati:
a) da je dobiveni materijal neprikladan za citološku analizu
b) da su u citološkim razmazima vidljive morfološke promjene u stanicama i
njihovom međusobnom odnosu
c) tada citolog može dati decidiranu dijagnozu ili samo opis morfoloških
promjena (npr. odvojiti tumorske od netumorskih lezija i postaviti
diferencijalnodijagnostičke mogućnosti). Mogu slijediti preporuke za
ponavljanje citoloških i/ili drugih dijagnostičkih pretraga.

KOMUNIKACIJA CITOLOG – PATOLOG - KLINIČAR

Kliničko-citološka korelacija predstavlja bitni element u citodijagnostici. Kao što liječnik-
necitolog mora biti informiran o temeljnim značajkama citodijagnostike, mora i citolog biti
informiran o kliničkim podacima. U svom radu s bolesnikom mora imati anamnestičke
podatke, poznavati opći status bolesnika, a posebno lokalni status, tj. organ-mjesto iz kojeg se
uzima materijal za citološku pretragu. Zato je najbolje da citolog sam uzima materijal i pri
tome neposredno kontaktira sa bolesnikom, ili da prisustvuje uzimanju materijala, primjeric

5
pri endoskopskim pregledima. U Hrvatskoj je takva praksa u citološkim odjelima, a i u stranoj
literaturi se naglašava potreba izravnog kontakta citolog/bolesnik.
Kako bi citolog mogao izdavati nalaze razumljive i upotrebljive svim ostalim kiničarima, a i
pacijentima, neophodno je da poznaje kliničke manifestacije bolesti, kao i da raspolaže svim
relevantnim podacima o pacijentu, sadašnjoj bolesti i ranijim bolestima. To zahtijeva blisku
suradnju citološkog i kliničkog odjela, odnosno citologa, bolesnika i kliničara.Klinički citolog
ne može zadovoljavajuće funkcionirati bez tijesne suradnje s kliničarima.
Misao velikog citologa P.L. Cardoza „Točnost citološke dijagnoze je obrnuto proporcionalna
s kvadratom udaljenosti između kliničara i citologa“ govori kako je klinička citologija
neraskidivo povezana sa klinički strukama.
Ništa nije manje važna i suradnja s ostalim dijagnostičkim strukama: patologijom,
laboratorijskom, molekularnom i citogenetskom dijagnostikom.U takvom okruženju citologije
daje optimalne rezultate, u najkraćem vremenu i uz najmanje troškove.

6
Koliko citolog treba znati o klinici?
Sam naziv "klinički citolog" uključuje osobu koja vlada citološkim vještinama, potrebnim da
se postavi klinička dijagnoza.
Baza za poznavanje, izvođenje i razumjevanje citoloških vještina je poznavanje patologije i
patohistologije, a za učinkovitost citoloških nalaza treba poznavati kliničke manifestacije
simptoma i sindroma bolesti.
Razni etiopatogenetski faktori mogu očitovati iste ili vrlo slične morfološke (pa tako i
citološke) promjene. Poznavanje kliničkih manifestacija bolesti važno je za citologa prilikom
uzimanja materijala i pri izdavanju citološkog mišljenja. Tijekom izvođenja analiza i
mikroskopiranja citolog opisuje kvalitativne i kvantitativne promjene stanica, a da se pri tome
ne oslanja ni na koji drugi podatak. Kada nakon završene citološke analize taj nalaz dopuni s
ostalim laboratorijskim i kliničkim podacima, može citološko mišljenje biti potpunije i jasnije
za kliničara. Ako citolog poznaje patogenezu procesa, brzo će informirati kliničara o ishodu
pretrage.
Svi ovi brojni parametri potrebni za međusobno razumijevanje najbolje se mogu razjasniti
izravnim kontaktima u TIMSKOM RADU, u obliku kliničko-citoloških sastanaka i
konzilijarnih vizita liječnika kurativne medicine sa citolozima, ali i sa stručnjacima drugih
laboratorijskih struka.

7
KONTROLA KVALITETE RADA
Unutar svakog laboratorija vrlo je važno nadgledanje i protokol kao dio dobre laboratorijske
prakse, a odnosi se na:
 kontrolu skupljanja uzoraka
 kontrolu pripreme preparata i bojenja
 skrining (primarni, selektivni, dvostruki)
 pregled prethodnog citološkog nalaza
 kontrolu spremanja preparata i nalaza
 cito-histološku korelaciju
 kliničko-citološku korelaciju
 konzultacije (diskusijski mikroskop)

Vanjska kontrola kvalitete - do sada nema formalne sheme za stručno citološko testiranje bilo
koje vrste. Najčešće je u vidu izmjene preparata.
Hrvatsko durštvo za kliničku citologiju organizira stručne sastanke različitih oblika i sadržaja,
među ostalim i u pojedinim zdravstvenim ustanovama širom Hrvatske uz mikroskope, u
obliku slide-seminara ili rasprava o zanimljivim citološkim slikama. To je jedan od načina
tzv. vanjske kontrole rada – tehnike pripremanja razmaza, načina interpretiranja i
izražavanja citoloških nalaza.
U svakom citološkom odjelu rutinski se provodi unutrašnja kontrola rada- stariji
citotehničar kontrolira rad mlađih citotehničara, citolog svakodnevno kontrolira rad
citotehničara, a pri ponovnom dolasku istih bolesnika citolozi se međusobno kontroliraju ili
pak kontroliraju vlastite nalaze. Povratne informacije o bolesnicima (patohistološki nalaz,
praćenje tijeka bolest) služe također za kontrolu kvalitete rada citologije.
OSIGURANJE KVALITETE:
● Potpis citoskrinera
● Potpis citologa
● Potpis voditelja laboratorija

Netočne dijagnoze mogu se podijeliti u lažno negativne i lažno pozitivne. Lažno negativna
dijagnoza odnosi se na osobu koja ima bolest, ali ona nije dijagnosticirana ili je ocijenjena
8
manjom nego što zapravo jest. Lažno negativan citološki nalaz (npr. normalan citološki nalaz
u žene s displazijom, ca. insitu ili invazivnim karcinomom) može biti posljedica grješke
uzimanja materijala, pogrješne laboratorijske obrade i netočne ocjene stanica prisutnih u
razmazu.
Uz proporciju lažno negativnih nalaza za ocjenu dijagnostičke vrijednosti citologije koristi se
još određivanje osjetljivosti, specifičnosti i prediktivnihvrijednosti te dijagnostičke točenosti.
Osjetljivost je testa indikator pouzdanosti da test otkrije bolest (pozitivnost u bolesti).
Izračunava se po formuli TP / TP+ LN; TP = test je točno odredio da bolest postoji, LN = test
je netočno utvrdio da bolest ne postoji.
Specifičnost je testa indikator sposobnosti testa da zdrave osobe označi nalazom bez
abnormalnosti (negativnost u zdravlju). Izračunava se po formuli TN / TN+ LP; TN = test je
točno odredio da bolest ne postoji, LP = test je netočno utvrdio da bolest postoji. Specifičnost
određuje postotak lažno pozitivnih dijagnoza koje su obično grješke interpretacije nastale na
osnovi pomanjkanja znanja o interpretaciji abnormalnosti.
Pozitivna prediktivna vrijednost je proporcija točno prepoznatih osoba s bolesti u odnosu
na sve osobe s pozitivnim nalazom. Računa se po formuli TP / TP+ LP.
Negativna prediktivna vrijednost je proporcija točno prepoznatih osoba bez bolesti u
odnosu na sve osobe s negativnim nalazom. Računa se po formuli TN / TN+ LN.
Dok osjetljivost i specifičnost ovise samo o dijagnostičkom kvalitetu testa, prediktivne
vrijednosti ovise i o prevalenciji, tj. Do broju osoba s bolesti u cijeloj populaciji.
Dijagnostička točnost označava ukupan broj ispravnih dijagnoza, i pozitivnih i negativnih, u
ispitivanoj populaciji (TP + TN / TP +LP + TN + LN), a obrnuto je proporcionalna broju
lažno pozitivnih i lažno negativnih nalaza.

9
MORFOLOŠKI IZGLED STANICA U STANDARDNO OBOJENIM RAZMAZIMA
Osim morfologije normalnih stanica u materijalu raznih organa mogu se uočiti i promjene
kod upalnih i degenerativnih stanja, proliferacija, malignih i nemalignih bolesti.
Kriterije zloćudnosti moguće je prepoznati na osnovi
● promjena jezgre
● poremećenog odnosa jezgre i citoplazme
● karakteristika citoplazme
● rasporedu stanica u razmazu (rozete, papilarne formacije)
Biološko ponašanje tumora (dobroćudni ili zloćudni) ovisi o:
● morfološkom izgledu,
● staničnom prodrijetlu,
● stupnju diferenciranosti
● proliferacijskom statusu
Između benignog tumora i dobro diferenciranog zloćudnog tumora često postoji morfološka
sličnost pa je ponekad nemoguće te tumore odvojiti u jednu ili drugu skupinu (granično
maligni tumori – engl. borderline).
Stanično podrijetlo dobro diferenciranih tumora morfološki se prepoznaje i klasificira kao
karcinom, sarkom, embrionalni tumor, limfom. Međutim i tada je teško, u slučaju da tumor
otkrijemo u metastazi, otkriti njegovo primarno ishodište. Tako npr. tumor dobro
diferenciranog pločastog epitela može potjecati iz orofaringealnog područja, pluća, vrata
maternice, rektalnog područja, itd. Tumori žljezdanog epitela mogu imati ishodište u
probavnom traktu (želucu, debelom crijevu, pankreasu) prostati, jajniku, maternici, itd.
U tim je slučajevima od velike važnosti određivanje organ -i/ili tumor-specifičnih
staničnih biljega (npr. prostatični specifični biljeg – PSA, tireoidni transkripcijski faktor –
TTF) imunocitokemijskim metodama na samim stanicama u citološkom razmazu.
Kod malog broja tumora može se iz metastatskih lezija prepoznati ishodišni organ na osnovi
same morfologije (tumor bubrega – hipernefrom, dobro diferencirani karcinom debelog
crijeva, karcinom malih stanica bronha, itd.).
Kod slabo diferenciranih tumora nije problem utvrđivanje maligniteta, ali kako slabo
diferencirani tumori sliče jedni drugima često je nemoguće odrediti stanično podrijetlo i
primarno ishodište. U tim je slučajevima potrebno obradu dopuniti i za tkivo i tumor
specifičnim biljezima.

CITOKEMIJA – dokazivanje staničnih struktura i ennzima

10
Pojedine stanične strukture i enzimi mogu se dokazati u raznim vrstama stanica te se takve
reakcije koriste ili za identifikaciju stanica, ocjenu njihovog funkcionalnog stanja ili
određivanje proliferacijskog statusa stanica.
Citokemijske reakcije mogu biti neenzimske kao što su PAS reakcija za dokazivanje
polisaharida, glikolipida i glikoproteina; specifično dokazivanje raznih pigmenata, kao što su
željezo i melanin; dokazivanje lipida sudan reakcijom i oil-redom; prikazivanje regije
nuklearnog organizatora - AgNOR; bojenje po Feulgenu za određivanje količine DNA;
dokazivanje masti oil-redom itd.
Enzimskim rakcijama prikazujemo mijeloperoksidazu, fosfatazu (kisela i alkalna),
nespecifičnu esterazu, beta glukuronidazu itd.
Citokemijska analiza se temelji na interpretaciji ishoda reakcije, interpretaciji rezultata te
kliničkoj interpretaciji nalaza.
Priprema uzorka za citokemijsku analizu

Uzorci za citološku analizu mogu biti: tanki razmazi punktata, razmazi periferne krvi, limfni
čvor, pleuralni izljev, obrisak krvi, koštane srži

Citokemijske analize - neenzimske

● sudan, Fe, PAS, hemosiderin u urinu, oil red-masti, melanin

Citokemijske analize - enzimske

● MPO, ALP, KP, esteraza, beta glukuronidaza

Tipovi fiksativa za citokemijske reakcije

● metanol, formalin, etanol-formalin.

PAS (fiksiranje, interpretacija rezultata)

● preparati najmanje stari 48h, fiksiraju se u metanolu 10 min

● dokazuju se polisaharidi i glikoproteini i glikolipidi, a ishod je difuzna zrnata ili
grudasta obojenost u citoplazmi (crvena zrnca)
● PAS je marker za B-ALL
MPO (značaj, fiksiranje, interpretacija rezultata)

● peroksidazu sadrže mijeloidne stanice u primarnim zrncima (lizosomima) koji se

nalaze u citoplazmi već u ranim različitim oblicima stanice granulocitopoeze
● pozitivna reakcija je značajna za dokaz stanica mijeloidnog podrijetla pa se to koristi u
dijagostici i razlikovanju pojedinih tipova akutnih leukemija
● fiksacija preparat u otopini etanol formalina 30 sekundi
● npr: AML: blasti su MPO pozitivni u M1, M2, M3, M5; ANAE pozitivni, MPO
pozitivni u M4,M5; ostali tipovi AML i ALL su MPO negativni

11
Nespecifične esteraze

● ANAE (smeđa obojenost citoplazme ili smeđa zrnca)

● NASDAE (crvena zrnca ili difuzno crvena obojenost citoplazme)
enzimi pripadaju skupini hidrolitičkih enzima i pretežno se nalaze u lizosomima
(stanicama granulocitopoeze u primarnim zrncima)

Kisela fosfataza (fiksiranje, interpretacija rezultata)

● ne starije preparate od 24h fiksirati u etanol formalinu

● skup enzima koji se nalazi u stanicama prostate, slezene, stanicama hematopoeze (u
lizosomima), serumu
● rezultat: izrazito crveni homogeni ili granulirani talog
● marker za T ALL, blasti u T-ALL su izrazito pozitivni na KF

Kvalitativna i kvantitativna citokemijska analiza

● kvalitativna analiza se odnosi na uočavanju pozitivne odnosno negativne reakcije u

uzorku
● kvantitativna - odnosi se na određivanje postotka pozitivnih stanica

Određivanje ALP u leukocitima

● pozitivna reakcija u obliku smeđih zrnaca ili difuzno smeđe obojenosti citoplazme
● ALP je pozitivna samo u zrelim stanicama granulocitpoeze, a ostale su stanice
hemocitopoeze negativne
● broji se na 100 segmentiranih i nesegmentiranih stanica
● svrstavaju se po intenzitetu obojenja od 0 do 5
● normalne vrijednosti score 10 - 100
● klinički značaj određivanja ALP u leukocitima
❖ snizena ALP - kod KML, u kroničnoj fazi mijelodispalzija,
❖ povišena ALP - kod PRV i PMF (primarne mijelofibroze)

IMUNOCITOKEMIJA
Stanični biljezi predstavljaju različite molekule kojima se utvrđuje:
 podrijetlo stanica (naročito u slabo diferenciranim tumorima)
 stupanj diferencijacije (razvojni oblici hematopoetskih stanica)
 procjenjuje proliferacijski status stanice (određivanje proliferacijskih antigena).
12
Stanični biljezi mogu biti membranski ili intracitoplazmatski, a po sastavu proteini,
glikolipidi, glikoproteini, enzimi ili hormoni.
Većina staničnih biljega su tkivno specifični antigeni koji su prisutni i u normalnim i
tumorskim stanicama istog podrijetla (CD 45, vimentin, dezmin, EMA, citokeratini itd).
Postoje i tumor specifični antigeni (CEA, HCG, PSA, AFP) različite specifičnosti i
osjetljivosti u različitim tumorima. Međutim niti jedan biljeg sam za sebe ne može biti
dijagnostički zbog ograničene specifičnosti, te se u tu svrhu upotrebljava kombinacija
monoklonalnih antitijela koji pomažu u razlikovanju pojedinih tipova tumora.
Stanični biljezi predstavljaju antigene na koje su proizvedena antitijela.
Imunocitokemijska reakcija temelji se na reakciji antigen-antitijelo i vizualizaciji reakcije.
Na stanicama u citološkom razmazu ili histološkom rezu vizualizacija se postiže vezanjem
antijela na enzim (peroksidazu ili alkalnu fosfatazu), a u staničnoj suspenziji na protočnom
citometaru obilježavanjem fluorokromom.
Osim tipizacije slabo diferenciranih tumora imunocitokemijska analiza se primjenjuje i pri:
● klasifikaciji hematoloških bolesti,
● određivanju hormonskih receptora tumorskih stanica
● prikazivanju mikrobioloških uzročnika.

PROTOČNA CITOMETRIJA
Protočnom citometrijom se mogu analizirati strukturne, fiziološke i funkcijske osobine
stanica, a u širem smislu i drugih bioloških čestica.

U kliničke svrhe protočna citometrija se koristi za ispitivanje strukturnih osobina

stanica, tj. za fenotipske analize i analize sadržaja nukleinskih kiselina.
Fenotipskim analizama se najčešće određuju leukocitni diferencijacijski antigeni
(svrstani prema CD - klasifikaciji) te je vezanjem specifičnih monoklonskih protutijela i
fluorokroma na stanice moguće odrediti:
● Imunofenotip subpopulacija limfocita (T i B st., NK st) - što pomaže u dijagnostici
bolesti s poremećajima imunološkog sustava
● Imunofenotip zloćudno promijenjenih krvotvornih stanica koje su "zaustavljene" u
jednom od stadija normalnog diferencijacijskog puta te posjeduju antigene
karakteristične za taj diferencijacijski stadij.

Imunofenotipizacijom se dobiju podaci o podrijetlu stanica, stupnju diferencijacije i

klonalnosti što omogućuje klasifikaciju kroničnih limfoproliferativnih bolesti, limfoma,
akutnih limfatičnih leukemija i postojanje miješanih leukemija. Kod akutnih mijeloidnih
leukemija nije moguća točna klasifikacija na temelju ekspresije biljega (izuzetak čine AML
eritroidne, megakariocitne loze i AML-Mo oblik).

Imunofenotipizacija stanica je od velike koristi pri određivanju morfološki dvojbenih

slučajeva, kao što su nediferencirane leukemije te razlikovanje reaktivnih hiperplazija od
13
limfoma, ali se sve veći značaj pridaje prognostičkoj važnosti određivanja imunofenotipa
stanica u sklopu s ostalim prognostičkim čimbenicima (citogenetski nalazi i dr.).

CITOGENETIKA I MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA

Konvencionalna citogenetika je grana genetike koja proučava kromosome i kromosomske
promjene u stanicama, primjenom G-pruganja kao i drugih citognetskih tehnika pruganja.
Kromosomski poremećaji mogu biti numerički i strukturni.
Molekularna citogenetika je kombinacija molekularne biologije i citognetike, a uključuje in
situ hibridizaciju vizualiziranu fluorescentnim bojama ( fluorescent in situ hybridization –
FISH) ili kromogenom (chromogenic – CISH), koja procjenjuje cjelokupni genom u svrhu
analize neuravnoteženosti kromosomske mase.

Princip in situ hibridizacije

Razne preuredbe gena malignih stanica mogu se analizirati i lančanom rakcijom polimeraze
(polymerase chain reaction PCR). Kao primjer, vrlo je korisna informacija o preuredbi gena
za imunoglobulinske lance: teške (immunoglobulin high chain – IgH) ili lake
immunoglobulin light chain – IgL) , ili pak preuredba gena za receptore T limfocita (T –
cell receptor – TCR) što govori u prilog B ili T klonalnosti limfatičnih stanica, odnosno
dijagnozi malignih limfoma.

Molekularne metode u citiodijagnostici - ISH, PCR, PCR in situ

In situ hibridizacija:
● pruža preciznu informaciju o specifičnoj DNA sekvenci na razini pojedine stanice

14
 ● uzorci: svježe stanice ili tkivo, fiksirane stanice ili tkivo, smrznuti uzorci, parafinski
rezovi
PCR in situ
● umnažanje specifične sekvence DNA uz DNA polimerazu u velikom broju ciklusa
● ciklus uključuje denaturaciju, nalijeganje početnica i elongaciju
- tip uzorka - suspenzija stanica, tkivni rezovi, citološki razmaz (citospin, razmaz)
PCR i PCR in situ (razlike
● PCR umnožava pojedine genske sekvence do razine koju je moguće analizirati putem
gel elektroforeze ili pomoću southern blot hibridizacije
● pri izolaciji DNA ili RNA iz staničnog uzorka uništava se stanica te rezultat nije
moguće pridružiti tipu stanica. Postupak se odvija u epruveti.
PCR in situ omogućuje umnažanje genske sekvence unutar stanice koja time ostaje
neoštećena te su stanice prepoznatljivog citološkog tipa.

KOMPJUTORSKA ANALIZA SLIKE

Kompjutorska analiza slike omogućava numeričku objektivizaciju najsuptilnijih
promjena nedostupnih vizualnoj inspekciji te umjesto subjektivne procjene dolazi do
objektivne kvantifikacije određenih parametara.
Mnogi parametri i osobitosti stanica su prihvatljivi za digitalnu analizu:
morfometrijske karakteristike, određivanje količine DNA, kvantifikacija
imunocitokemijskog bojenja (denzitometrija), određivanje proliferacijskog
statusa (Ki-67, osobine AgNOR-a), kariometrija te određivanje kromatinskih biljega.
Morfometrija je kvantitativni opis geometrijskih karakteristika struktura. Za rutinu se
obično koristi interaktivni sistem s automatskim ili ručnim obilježavanjem objekata,
dok se mjerenja i sve ostale računske operacije vrše automatski.
Morfometrijski parametri se mogu podijeliti u četiri grupe:
 jednostavni parametri (površina, promjer, opseg, najduža os, najkraća os)
 faktori oblika (pravilnost i konveksitet)
 dvofazni parametri (nukleo-citoplazmatski odnos, ekscentričnost)
 kontekstualni parametri (površina nakupina unutar stanice ili jezgre, broj
elemenata po nakupini, oblik nakupine, udaljenost između nakupina)

Regije nukleolarnog organizatora - Ag-NOR-i predstavljaju petlje ribozomalne DNA

(Rdna, koje se nalaze se na kratkim krajevima pet parova akrocentričnih kromosoma.
Tu dolazi do prepisivanja gena za ribosomalnu RNA uz djelovanje RNA polimeraze I,
što je preduvjet za sintezu ribosoma. NOR-ovi zapravo predstavljaju substrukturu
nukleola, iako se mogu naći i kao "satelitske" strukture izvan nukleola. Prikazuju se

15
vezanjem Ag na intranuklearne nehistonske proteine u obliku crnih točkica u
interfaznim jezgrama.
Maligna transformacija stanica karakterizirana je povećanjem sinteze proteina i
bazofilijom citoplazme, povećanjem broja i veličine nukleola. Visoko maligne
novotvorine imaju brojnije, sitnije AgNOR-e od benignih ili nižeg stupnja malignosti
(povezanost s proliferacijskim statusom stanice). Postoji linearna korelacija između
AgNOR-a i ekspresije proliferacijskih antigena (Ki-67).
Statička („image“) DNA citometrija temelji se na činjenici da stanice koje se ne
dijele (u fazi mirovanja-G0) sadrže diploidan broj kromosoma (2N). G1 faza
predstavlja pripremnu fazu za sintezu DNA (S-faza). Nakon završene sinteze stanica
ima dvostruku količinu DNA (4N) i nalazi se u G2 fazi, nakon čega slijedi mitoza.
Abnormalni sadržaj DNA, odosno aneuploidija, je karakteristika maligniteta, te
određivanje količine DNA ima važnu primjenu u onkologiji u poboljšanju sigurnosti u
tumorskoj dijagnozi kao i u prognozi. Količina DNA u stanicama ovisi o
proliferacijskom ciklusu; tako da tkiva s jačom proliferacijom imaju više stanica u S
fazi. Količina DNA može se odrediti statičnom DNA citometrijom. Na uzorku in situ s
prednošću u morfološkoj vizualizaciji ispitivanih stanica (malignih i referentnih).
Druga (praktički rutinska) metoda je protočni citometar, čija je prednost u analizi
daleko većeg broja stanica.
Protočnom citometrijom može se analizirati i sadržaj nukleinskih kiselina u stanicama
različitih tumora. Bojanjem stanica spojevima koji se specifično vežu za DNA (npr.
propidij jodid, etidij bromid) dobivaju se podaci o ploidnom statusu (diploidni ili
aneuploidni) i o proliferacijskoj aktivnosti tumorskih stanica koji se sve više ubrajaju u
prognostičke pokazatelje kod određenih zloćudnih tumora te se otkrivaju nove
spoznaje o biološkim osobitostima i kliničkom ponašanju tumora. Određivanje
količine DNA koristi se pri dijagnozi, kada postojanje abnormalne količine DNA,
naročito u prekanceroznim stanjima upućuje na neoplazmu.
CITOLOGIJA VS. HISTOLOGIJA
Citološka dijagnoza počiva na sposobnosti promatrača da poveže uočene stanične (nuklearne
i citoplazmatske) promjene s kompleksnom arhitekturom lezije. Pri tome je komparacija
citoloških i histoloških karakteristika vrlo korisna. Najvažniji preduvjet kvalitetne
interpretacije citološkog nalaza je pravilna edukacija, s kontinuiranom, svakodnevnom
provjerom ispravnosti postavljenih dijagnoza.
Citodijagnostika je analiza stanica u standardno obojenom razmazu, a histopatološka
dijagnostika temelji se na analizi međusobnog odnosa tkiva sa raznovrsnim stanicama u
standardno obojenom histološkom rezu.
Citodijagnostika je neinvazivna, jednostavna za uzimanje materijala, moguće je ciljano
uzimanje materijala uz druge pretrage, može se ponavljati, jeftina je, brza, za pacijenta
neškodljiva.

16
Histološka dijagnostika je invazivna, ovisna o načinu dobivanja materijala, koristi složeniju
tehnologiju, teško se ponavlja, skupa.
Citologija ne može zamijeniti histološku dijagnozu, ali nije moguće niti obrnuto. Citologija i
histologija su metode koje se upotpunjuju

UZIMANJE MATERIJALA ZA CITOLOŠKE PRETRAGE

Kvaliteta citološke dijagnoze podjednako ovisi o:
● uzimanju materijala za analizu
● pripremi i bojenju
● analizi.
Materijali za citološku analizu su preparati (citološki razmazi) dobiveni prilikom
pregleda pacijenta ili su to tekućine, endoskopski i drugi materijali koji se šalju u laboratorij.
S obzirom na način dobivanja stanica za analizu, citologija se dijeli na eksfolijativnu i
aspiracionu, te citologiju otiska.
➢ Eksfolijativna citodijagnostika
Proučava deskvamirane, odljuštene stanice (slobodno ili pomoću štapića, četkice ili skalpela)
kod različitih patoloških procesa koji se razvijaju na koži, sluznicama i seroznim opnama.
Tom metodom se proučavaju stanice s površinskog sloja tvorbe ili sluznice, koje se ljušte
spontano i zamjenjuju mlađima stanicama iz dubine epitela u procesu kontinuiranog rasta
epitela. Te se stanice mogu spontano skupljati u tjelesnim šupljinama npr. (ascites),
organima (npr. urin), cistama ili stvaraju sekret sluznice (npr. zglobna tekućina) ili se skidaju
nekim instrumentom (npr. bris nosne sluznice štapićem ili bris bronha četkicom).
➢ Aspiraciona citodijagnostika
Proučava stanice dobivene punkcijom iz patoloških tvorbi (npr. tumora) ili patološki
izmijenjenih organa. Punkcija se vrši što tanjom iglom (promjera 0,3 do 0,6 mm) da se
izbjegnu komplikacije (npr. krvarenje) i da se stanice što bolje očuvaju. Dok je igla u tvorbi,
mora stalno vladati negativan tlak u igli i štrcaljki, a prednost punkcije je što se iglom ide u
više smjerova i dubina (iznimke su jetra, testisi kod kojih se punktira samo u jednom pravcu).
Punkcija (engl. fine needle aspiration biopsy) se može izvoditi "na slijepo", tj. bez pomoći
drugih dijagnostičkih metoda, te ciljano pod nadzorom slikovnih metoda, ultrazvuka (UZ)
(npr. štitnjača, jetra), rentgena (npr. tvorbe u kostima, transtorakalna punkcija) ili
kompjuterizirane tomografije (npr. kralježak, tvorbe u retroperitoneumu). Prednosti punkcije
pod nadzorom vizualnih dijagnostičkih postupaka su: mogućnost punkcije nepalpabilnih
lezija, biranje mjesta punkcije unutar lezije, te određivanje pripadnosti lezije nekom organu.
Punkciju obavlja citolog uz asistiranje tehničara, a ako je pod nadzorom UZ, u timu je
i rendgenolog ili drugi stručnjak za UZ. Točnost citološke dijagnoze je veća ako punkciju
provodi sam citolog nego netko drugi koji šalje razmaze citologu. Prije punkcije citolog se
informira o anamnestičkim podacima (npr. terapiji, krvnim nalazima i dr.), te klinički
pregleda pacijenta (npr. kod povećanih čvorova na vratu obavezno se pregleda jetra i slezena).
17
Pregledom lezije odabire mjesto punkcije, utvrđuje karakteristike punktirane lezije
(konzistencija, povezanost uz podlogu ili kožu, veličina).
Na temelju vrste materijala koju dobije punkcijom odabire vrstu bojenja što je važno jer je
fiksacija različita (za MGG se preparati suše na zraku, a za Papanicolaou se vlažni preparati
odmah moraju uroniti u 95 % etilni alkohol), te odlučuje da li će biti dostatne standardne
citodijagnostičke pretrage ili su potrebne i neke druge npr. imunofenotipizacija protočnim
citometrom (tada se dio aspiriranog materijala ištrca na predmetno staklo za citodijagnostičku
analizu, a dio se stavi u kivetu s PBS- om). M
➢ Metoda "otiska" (imprint tehnika)
Jedan dio bioptičkog materijala (dobiven ekscizijom sluznice pri endoskopijama ili komadić
operiranog tumora) se otisne i razmaže na predmetno staklo. Ovaj način se najčešće
upotrebljava za intraoperativnu dijagnostiku.
Za sve vrste materijala važno je dobiti adekvatan uzorak s dovoljnom količinom očuvanih
stanica. Ako uzimanje, kao prva karika u dijagnostičkom lancu, nije dobro napravljeno, lanac
puca i sav daljnji trud je uzaludan.
Ako je svaki korak u citološkom dijagnostičkom postupku dobro napravljen, tada je citologija
točna, isplativa i brza, a uz postavljanje dijagnoze često omogućuje i određivanje prognoze,
praćenje uspjeha terapije, te nadzor i u zdravoj populaciji, tj. odabir asimptomatskih
pacijenata.
Citologiju ima visoku dijagnostičku točnost, metode prikupljanja materijala su
jednostavne, s malo ili bez agresivnosti, jeftine. Dijagnoza se često može se dati u vrlo
kratkom vremenskom roku, čak intraoperacijski. Citologija može uštedjeti vrijeme i novac,
izbjeći hospitalizaciju pacijenta – a to su sve prednosti primjene citodijagnostike koje se u
stvarnom okruženju ne koriste dovoljno. Možda je glavni razlog zanemarivanja dijagnostičke
citologiju u suvremenoj medicinskoj praksi i obrazovanju, nedostatak financijske isplativosti
ove dijagnostičke grane.

18
LITERATURA:
1. Znidarčić Z, Jeren T, Kaić G, Kardum-Skelin I, Knezević-Obad A, Smojver-Jezek S, i
ostali. Clinical cytology and primary health care of children and adults. Coll Antropol.
jun 2010.;34(2):737–48.

2. Kardum-Skelin I, Fabijanić I, Jelić-Puskarić B, Siftar Z, Kardum Paro MM, Trcić RL,

i ostali. Single cell--definitive diagnosis! Where the profession ends and the art
begins?. Acta Medica Croat Časopis Hravatske Akad Med Znan. oktobar
2008.;62(4):343–9.

3. Znidarčić Z, Crepinko I, Jeren T, Roglić M, Nakić M, Markov-Glavas D, i ostali. Role

of the clinician in cytologic diagnosis. Liječnički Vjesn. decembar 2002.;124(11-
12):360–5.

4. Znidarčić Ž. Klinička (neginekološka) citologija u svakodnevnoj praksi. Priručnik za

tečaj trajnog medicinskog usavršavanja MF Sveučilišta u Zagrebu, 1988.

5. Znidarčić Ž, Pajtler M. Klinička citologija u Hrvatskoj danas i sutra. U: Štulhofer M,

Kurjak A. Klinička medicina u Hrvatskoj danas i sutra. Zagreb: Akademija
medicinskih znanosti Hrvatske. 2002, 275-87.

6. Pajtler M, Audy Jurković, Škopljanac Mačina L. Rapid cervicovaginal smear

screening: method of quality control and assessing individual cytotechnologist
performance. Cytopathology. 2006 Jun;17(3):121-6.

19