Professional Documents
Culture Documents
التقرير الخامس عزل الفطريات من الثمار
التقرير الخامس عزل الفطريات من الثمار
عالية المري
1
المحتويات
.............................................................................................................................................3األدوات:
.......................................................................................................................................4طريقة العمل:
2
الهدف من التجربة:
تستخدم الفطريات في العديد من العمليات الصناعية ،مثل إنتاج اإلنزيمات ،والفيتامينات ،والسكريات المتعددة ،والكحول
المتعدد الهيدروجين ،واألصباغ ،والدهون ،والجليكوليبيدات والمضادات الحيوية ,يتم إنتاج بعض هذه المنتجات تجارًيا في
حين أن البعض اآلخر يحتمل أن تكون له قيمة في مجال التكنولوجيا الحيوية .المستقلبات الثانوية الفطرية مهمة للغاية لصحتنا
وتغذيتنا ولها تأثير اقتصادي هائل .باإلضافة إلى تسلسل تفاعالت التخمر المتعددة ،تعد الفطريات مفيدة للغاية في تنفيذ عمليات
التحول األحيائي ()1
نستعرض في هذه التجربة عزل الفطريات من مصادر مختلفة من الثمار والحصول على عزالت فطرية نقية بهدف اجراء
الدراسات والتقنيات الحيوية عليها
األدوات:
مواد مثبطة لنمو البكتيريا على األوساط الزراعية الفطرية مثل (.)rose Bengal
طريقة العمل:
عزل الفطريات
-وزن 39جرام لكل لتر من الماء المقطر مع إضافة القليل من مادة rose bengalتركيز 0.005لكل لتر ,للحد من نمو
البكتيريا
3
-تعقيم الميديا على درجة 121لمدة 15دقيقة وتوزيعها على اطباق بتري حتى تتصلب.
-تعليم كل من االطباق بالبيانات التالية (اسم الميديا – مصدر العزل – التاريخ – اسم الباحث)
-استخدام طبق يحتوي على بيئة PDAفقط الستخدامه (كنتيجة سلبية ) الشكل ()1
تحضير العينة.
تم احضار العينة وشملت (طماطم) ثم وضعها بمادة الهيبوكلوريت المخفف %/5الشكل ( )2وتم تحضيره بإضافة 5مل من
مادة الهيبوكلرويت الى 95مل من الماء المقطر في بيكر لتطهير العينات لمدة 5دقائق ثم غسلها عدة مرات بالماء المعقم
إلزالة آثار المادة المطهرة قبل تلقيحها على اطباق بتري .والهدف من التعقيم السطحي التخلص من الميكروبات النامية على
السطح باإلضافة الى التخلص من البكتيريا.
)1 الشكل (
نتيجة
سلبية
)2 الشكل (
نموذج
لتتعقيم
الثمار
قبل العزل
تلقيح االطباق.
بعد التطهير السطحي للعينات ،تم تجفيف الثمار بواسطة ورق ترشيح معقم وبواسطة ملقط معقم بالتلهيب الكحولي تم اخذ جزء
من البذور وتلقيحها في منتصف الوسط الغذائي المحضر سابقًا
تحضين االطباق.
4
تم تحضين االطباق في حضان فطري لمدة 7-5أيام في درجة 27درجة مئوية لتنقية العازالت الفطرية .ثم ُسجلت النتائج
العزل الثاني:
تم اجراء خطوات العزل االولي باختالف نوع الثمار (فراولة – عنب – تين) للحصول على عزالت فطرية متنوعة.
تنقية الفطريات
بعد مرور 5أيام من تحضين الفطريات تم تحضير اطباق PDAمعقمة يمكن أن يظهر لدينا أكثر من مستعمرة فطرية ،لذلك
نقوم بتنقية هذه الفطريات عن طريق نقل جزء من المستعمرة الى منتصف الوسط الغذائي وتحضينها في حضان فطري على
درجة 25درجة مئوية من 7-5أيام تم تسجيل النتائج وفحصها في المجهر الضوئي للتعرف على نوع الفطر والتأكد من
نقاوته.
بعد االنتهاء من عملية العزل والحصول على المزرعة يتم تعريف الميكروبات المعزولة بشكل مبدئي من خالل الخصائص
المورفولوجية والخصائص المجهرية للمزرعة الميكروبية.
الخصائص المورفولوجية :يتم فحص مزرعة الميكروب (على البيئة الصلبة) مورفولوجيًا وتسجل الخصائص
المورفولوجية المميزة مثل لون المزرعة ـ طبيعة نمو الميكروب على البيئة ـ كثافة النموـ شكل الحافة.
الخصائص المجهرية :حيث تحضر شرائح من النمو الميكروبي ثم تفحص تحت المجهر ويتم تسجيل الخصائص المجهرية
للمزرعة (شكل الميكروب).
األدوات
اطباق NA
ابر تلقيح
5
انابيب تحتوي على ماء مقطر معقم
طريقة التخفيف:
يتم تخفيف عينة التربة المراد عزل البكتيريا منها وذلك بوزن (1جرام) وتوضع في أنبوبة معقمة تحتوي على ( 9مل) ماء
مقطر وترج لمدة عشر دقائق تقريبًا ويكون التخفيف 1/10.
يترك األنبوب لعدة دقائق حتى يتم ترسيب حبيبات التربة الكبيرة.
يؤخذ (1مل) من هذا المحلول وينقل إلى أنبوبة تحتوي على (9مل) من الماء المقطر وترج جيدُا فيتكون التخفيف , ..1/100
يتم تكرار نفس طريقة التخفيف إلى أن نحصل على عدد من التخفيفات ( . )100000\1 , 10000\1 , 1000\1
تغطى األطباق ثم تحضن في الحاضنة عند درجة حرارة 35م °لمدة 24ساعة.
طريقة العمل:
اختيار مستعمرة ذات خصائص واضحة بناء على الشكل الظاهري وذلك من خالل أخذ جزء من المستعمرة ومن ثم تلقيحها في
االطباق الجديدة بطريقة التخطيط للحصول على عزالت بكتيرية نقية ثم فحصها بالمجهر الضوئي للتأكد من نوعها
بعد االنتهاء من عملية العزل والتنقية والحصول على مزرعة نقية يتم تعريف الميكروبات المعزولة بواسطة الفحص المجهري
6
خطوات الفحص المجهري الضوئي وصبغ الشرائح المجهرية للفطريات:
تصبغ شريحة زجاجية معقمة تحتوي على قطرة من صبغة lactophenol blueثم بواسطة ابرة التلقيح المعقمة بالتلهيب
الكحولي يؤخذ طرف من المزرعة وتمزج جيدًا بالصبغة مع المحافظة على خصائص الفطر في وسط الشريحة ثم تغطية
الشريحة بغطاء زجاجي وفحص الشرائح عند قوة 10لتحديد المجال ثم قوة 40لتحديد الصفات المجهرية للفطريات
تحضير شريحة زجاجية معقمة تحتوي على قطرة من صبغة الماء المقطر ثم بواسطة ابرة التلقيح المعقمة بالتلهيب الكحولي
يؤخذ طرف من المزرعة وتمزج جيدًا بالماء مع المحافظة على خصائص البكتيريا في وسط الشريحة ثم صبغ الشريحة بصبغة
غرام وفحص الشرائح عند قوة 10لتحديد المجال ثم قوة 100لتحديد الصفات المجهرية للبكتيريا
تم أجراء خطوات صبغة غرام على العينة النقية للتأكد من نقاوة العينة ولمعرفة خصائص البكتيريا المعزولة مجهريًا.
أخذ عقدة بكتيرية بواسطة ابرة التلقيح وفردها في وسط الشريحة الزجاجية باالستعانة بقطرة ماء مقطر ثم تثبيت البكتيريا عن
طريق تمريرها خالل اللهب 3مرات ،ترك لتجف تمامًا لبدء الصبغ
إزالة االصباغ المتبقية بواسطة ( decolorizer )ethyl alcoholوتركها لمدة 10الى 30ثانية ثم تغسل مرة أخرى بماء
مقطر.
في الخطوة االخيرة تضاف صبغه ال safranineوهي عبارة عن صبغة تفريقيه counter stainوتركها لمدة 30ثانية
ثم تغسل وتترك الشريحة لتجف لفحصها بالمجهر الضوئي
تمم تقسم االطباق الى نصفين وبواسطة ابرة التلقيح تم تلقيح النصف األول من االطباق بواسطة بكتيريا الشعاعيات
7
والنصف االخر تم تلقيحه بواسطة قرص من الفطر المعزول ( طماطم ,تين ,فراولة )
.6فحص العالقة ما بين الفطريات المعزولة وبكتيريا الشعاعيات بواسطة المجهر االلكتروني الماسح
تم تحضير معلق بكتيري في انابيب ابن دورف من الدوارق السابقة لفحصها بالمجهر االلكتروني الماسح في المختبر المركزي
وشملت العينات; عينة تحتوي على زيت نفطي صورة ( )10,11,12وعينة بال زيت نفطي صورة ( )13,14لمقارنة اختالف
النمو والشكل الظاهري للخلية البكتيرية عند اختالف ظروف التنمية.
tupeeppendroخاص عند استالمنا لعينات سائلة البد من مزج محتوى العينة باستخدام vortexثم نضع كل عينه في
فيه ونكتب عليه االسم.
التثبيت األول:
نأخذ العينات ونضعها في mini spineلمدة خمس دقائق 5minوسرعة rpm 14.5وبعد ذلك يتكون لنا رائق
supernatentوراسب .pellet
ممكن اعادتها مرتان وذلك باستخدام العينة مره اخرى حتى يظهر لنا pelletواضحه.
نزيل الرائق ونضع المثبت األول %3,5جلوتر الدهيد لمدة ليلة كاملة( .نحفظ في الثالجة درجه حرارتها .c 5
مرحلة الغسيل:
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع
فوق pelletمحلول الفوسفات المنظم PH = 7.2ثم نرج العينة وننتظر ربع ساعة min 15تكرر العملية ثالث مرات.
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع فوق pellet
المثبت الثاني %1رابع اوكسيد االوزميوم ثم نرج العينة وننتظر لمدة ساعة.
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق 5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع
فوق pelletمحلول الفوسفات المنظم PH = 7.2ثم نرج العينة وننتظر ربع ساعة min 15تكرر العملية ثالث مرات.
مرحلة التجفيف:
8
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع فوق pellet 50
%غسول االيثانول ثم نرج وننتظر لمدة ربع ساعة.
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع فوق pellet 60
%غسول االيثانول ثم نرج وننتظر لمدة ربع ساعة
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع فوق pellet 70
%غسول االيثانول ثم نرج وننتظر لمدة ربع ساعة
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع فوق pellet 80
%غسول االيثانول ثم نرج وننتظر لمدة ربع ساعة.
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع فوق pellet 90
%غسول االيثانول ثم نرج وننتظر لمدة ربع ساعة.
نمزج العينة ثم نضعها في mini spinلمدة خمس دقائق ,5minوسرعة rpm 14.5نزيل الرائق ونضع فوق pellet 100
%غسول االيثانول ثم نرج وننتظر لمدة ربع ساعة( .تغسل مرتين)
بعد االنتهاء من التجربة يجب أن تحفظ الميكروبات حية وبصورة نقية طوال فترة الدراسة او لدراستها الحقًا ،ومن طرق حفظ
الميكروبات هي نقل المستعمرات الى بيئة جديدة ومعقمة في أنبوبة اختبار (أنابيب األجار المائل )slant agarويمكن حفظ
االنابيب في درجات حرارة منخفضة (في الثالجة) حيث أن الميكروبات تظل حية إذا ما وفرت لها درجات حرارة مناسبة،
كذلك جفاف المستعمرة ال يحدث إال بعد فترة طويلة.
9
النتائج:
الشكل ( )5نمو فطري لعينة بذور الطماطم بعد تنقيتها على بيئة PDAبعد مرور 5أيام من تحضين العينة
10
الشكل ( )6الفحص المجهري للعزل الفطري شكل ( )5من بذور الطماطم بعد التنقية
الشكل ( )7نمو فطري من عزل بذور التين على بيئة PDAبعد مرور 3أيام من تحضين العينة وقبل تنقيتها
11
الشكل ( )8نمو فطري لعينة بذور التين بعد تنقيتها على بيئة PDAبعد مرور 5أيام من تحضين العينة
الشكل ( )9الفحص المجهري للعزل الفطري شكل ( )8من بذور التين بعد التنقية
12
الشكل ( )10نمو فطري من عزل بذور الفراولة على بيئة PDAبعد مرور 3أيام من تحضين العينة وقبل تنقيتها
الشكل ( )11نمو فطري لعينة بذور الفراولة بعد تنقيتها على بيئة PDAبعد مرور 5أيام من تحضين العينة
13
الشكل ( )12الفحص المجهري للعزل الفطري شكل ( )11من بذور الفراولة بعد التنقية
14
الشكل ( )13نمو فطري لعينة معزولة من الهواء بعد تنقيتها على بيئة PDAبعد مرور 5أيام من تحضين العينة
الشكل ( )14الفحص المجهري للعزل الفطري شكل ( )13لعينة معزولة من الهواء بعد التنقية
15
الشكل ( )15نمو فطري لعينة معزولة من الهواء بعد تنقيتها على بيئة PDAبعد مرور 5أيام من تحضين العينة
16
الشكل ( )16الفحص المجهري للعزل الفطري شكل ( )15لعينة معزولة من الهواء بعد التنقية
الشكل ( )17نمو فطري من عزل بذور العنب على بيئة PDAبعد مرور 3أيام من تحضين العينة وقبل تنقيتها
17
18
الشكل ( )19تنقية عزل بكتيريا االكتينومايسيتس من الشكل ( )18تنقية عزل بكتيريا االكتينومايسيتس من
الشكل ( )21الفحص المجهري لعينة البكتيريا الشكل ( )20الفحص المجهري لعينة البكتيريا
الشكل ( )22العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesعلى بيئة
PDA
19
الشكل ( )23العالقة مابين الفطريات 4المعزولة من ثمار الطماطم وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesعلى
بيئة PDA
الشكل ( )24العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار التين وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesعلى بيئة
PDA
20
الشكل ( )25العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
الشكل ( )26العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
21
المجهر االلكتروني الماسح
الشكل ( )27العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
الشكل ( )28العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
22
المجهر االلكتروني الماسح
الشكل ( )29العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
23
الشكل ( )30العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
الشكل ( )31العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
24
الشكل ( )32العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
الشكل ( )33العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
25
المجهر االلكتروني الماسح
الشكل ( )34العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
الشكل ( )35العالقة مابين الفطريات المعزولة من ثمار الفراولة وبكتيريا الشعاعيات ( )actinomycetesتحت
26
المجهر االلكتروني الماسح
المناقشة:
يسبب فطر Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsiiالعديد من االمراض الفطرية في الطماطم (
)3من خالل الفحص المجهري والظاهري تم تعريف نوع الفطر المعزول من الطماطم مبدئيًا الشكل ( ) 6,5على
انه فطر Rhizoctonia solaniبسبب تشابه خصائصه الظاهرية والمجهرية كما أوضحت الدراسات السابقة
بإنه تم تحديد ثمانية عشر نوًع ا تنتمي إلى 7أجناس فطرية ( Alternaria ، Aspergillus ، Fusarium ،
Alternaria alternataاألنواع الفطرية األكثر انتشارا )2( .لذلك ستجرى المزيد من الدراسات األخرى
للتعرف على نوع الفطر المعزول إلجراء الدراسات والتنقية الحيوية بين األنواع المعزولة .في الشكل ( ) 8,9يرجع
نوع الفطر الى جنس Alternaria alternataمن خالل التعرف على المظهر المجهري للفطر حيث تم اإلبالغ
في الدراسات السابقة عن إصابات ثمار التين بفطر ) Alternaria alternate (4في الشكل ( )16-10سيتم
التعرف على نوع الفطر بعد اجراء الدراسات التعريفية األخرى .
المراجع:
27
2. Determination of Fungi Associated with Tomatoes (Lycopersicum
https://scialert.net/fulltextmobile/?doi=ppj.2005.146.149
4. https://pubag.nal.usda.gov/catalog/5492015
28