‫التقرير الرابع ‪ :‬عزل الفطريات من الثمار وتنقيتها وعزل بكتيريا الشعاعيات من التربة‬

‫عالية المري‬

‫مقرر تقنية الكائنات الدقيقة حدق ‪566‬‬

‫المحتويات‬
‫الهدف من التجربة‪2......................................................................... :‬‬
‫األدوات‪2..................................................................................... :‬‬
‫طريقة العمل‪3............................................................................... :‬‬
‫‪ .1‬عزل الفطريات ‪3.......................................................................‬‬
‫العزل االولي ‪3......................................................................... :‬‬
‫العزل الثاني‪4........................................................................... :‬‬
‫‪ .2‬تنقية الفطريات ‪5........................................................................‬‬
‫‪ .3‬عزل وتنقية بكتيريا الشعاعيات ( ‪5..........................) actinomycetes‬‬
‫طريقة العمل‪6.......................................................................... :‬‬
‫‪ .4‬فحص العينات تحت المجهر الضوئي‪6.............................................. :‬‬
‫خطوات الفحص المجهري الضوئي وصبغ الشرائح المجهرية للفطريات‪6.........:‬‬
‫خطوات الفحص المجهري الضوئي وصبغ الشرائح المجهرية للبكتيريا ‪7.........:‬‬
‫النتائج‪8....................................................................................... :‬‬
‫المناقشة‪17................................................................................... :‬‬
‫المراجع‪17................................................................................... :‬‬
‫الهدف من التجربة‪:‬‬

‫‪1‬‬
 ‫تستخدم الفطريات في العديد من العمليات الصناعية‪ ،‬مثل إنتاج اإلنزيمات ‪ ،‬والفيتامينات ‪،‬‬
‫والسكريات المتعددة ‪ ،‬والكحول المتعدد الهيدروجين ‪ ،‬واألصباغ ‪ ،‬والدهون ‪ ،‬والجليكوليبيدات‬
‫والمضادات الحيوية ‪ ,‬يتم إنتاج بعض هذه المنتجات تجارًيا في حين أن البعض اآلخر يحتمل أن‬
‫تكون له قيمة في مجال التكنولوجيا الحيوية‪ .‬المستقلبات الثانوية الفطرية مهمة للغاية لصحتنا‬
‫وتغذيتنا ولها تأثير اقتصادي هائل‪ .‬باإلضافة إلى تسلسل تفاعالت التخمر المتعددة‪ ،‬تعد الفطريات‬
‫مفيدة للغاية في تنفيذ عمليات التحول األحيائي (‪)1‬‬

‫نستعرض في هذه التجربة عزل الفطريات من مصادر مختلفة من الثمار والحصول على عزالت‬
‫فطرية نقية بهدف اجراء الدراسات والتقنيات الحيوية عليها‬

‫األدوات‪:‬‬
‫مصادر مختلفة من الثمار (طماطم‪ ،‬فراولة‪ ،‬عنب‪ ،‬تين)‪.‬‬ ‫‪.1‬‬

‫أوساط غذائية للنمو مثل ‪.PDA‬‬ ‫‪.2‬‬

‫مواد مثبطة لنمو البكتيريا على األوساط الزراعية الفطرية مثل (‪.)rose Bengal‬‬ ‫‪.3‬‬

‫حضان فطريات بدرجة حرارة ‪ 25‬درجة مئوية‪.‬‬ ‫‪.4‬‬

‫أدوات تعقيم (ديتول‪ ،‬ورق ترشيح‪ ،‬ملقط‪ ،‬كحول‪ ،‬قطن‪ ،‬لهب)‪.‬‬ ‫‪.5‬‬

‫‪5‬مل من مركب هيبوكلوريت و‪ 95‬مل ماء مقطر‪.‬‬ ‫‪.6‬‬

‫ماء معقم وبيكر للتطهير السطحي للثمار‪.‬‬ ‫‪.7‬‬

‫‪2‬‬
 ‫طريقة العمل‪:‬‬

‫عزل الفطريات‬ ‫‪.1‬‬

‫العزل االولي ‪:‬‬

‫تحضير األوساط الغذائية‪.‬‬ ‫‪.1‬‬

‫‪-‬وزن ‪ 39‬جرام لكل لتر من الماء المقطر مع إضافة القليل من مادة ‪ rose bengal‬تركيز‬
‫‪ 0.005‬لكل لتر ‪ ,‬للحد من نمو البكتيريا‬

‫‪-‬تعقيم الميديا على درجة ‪ 121‬لمدة ‪ 15‬دقيقة وتوزيعها على اطباق بتري حتى تتصلب‪.‬‬

‫‪-‬تعليم كل من االطباق بالبيانات التالية (اسم الميديا – مصدر العزل – التاريخ – اسم الباحث)‬

‫‪ -‬استخدام طبق يحتوي على بيئة ‪ PDA‬فقط الستخدامه (كنتيجة سلبية ) الشكل (‪)1‬‬

‫تحضير العينة‪.‬‬ ‫‪.2‬‬

‫تم احضار العينة وشملت (طماطم) ثم وضعها بمادة الهيبوكلوريت المخفف ‪ %/5‬الشكل (‬
‫‪ )2‬وتم تحضيره بإضافة ‪ 5‬مل من مادة الهيبوكلرويت الى ‪ 95‬مل من الماء المقطر في‬
‫بيكر لتطهير العينات لمدة ‪ 5‬دقائق ثم غسلها عدة مرات بالماء المعقم إلزالة آثار المادة‬
‫المطهرة قبل تلقيحها على اطباق بتري‪ .‬والهدف من التعقيم السطحي التخلص من‬
‫الميكروبات النامية على السطح باإلضافة الى التخلص من البكتيريا‪.‬‬

‫‪3‬‬
 ‫الشكل (‪ )1‬نتيجة سلبية‬
‫الشكل (‪ )2‬نموذج لتتعقيم الثمار قبل‬
‫العزل‬

‫تلقيح االطباق‪.‬‬ ‫‪.3‬‬

‫بعد التطهير السطحي للعينات‪ ،‬تم تجفيف‬

‫الثمار بواسطة ورق ترشيح معقم وبواسطة ملقط معقم بالتلهيب الكحولي تم اخذ جزء من‬
‫البذور وتلقيحها في منتصف الوسط الغذائي المحضر سابقًا‬

‫تحضين االطباق‪.‬‬ ‫‪.4‬‬

‫تم تحضين االطباق في حضان فطري لمدة ‪ 7-5‬أيام في درجة ‪ 27‬درجة مئوية لتنقية‬
‫العازالت الفطرية‪ .‬ثم ُسجلت النتائج‬

‫العزل الثاني‪:‬‬
‫تم اجراء خطوات العزل االولي باختالف نوع الثمار (فراولة – عنب – تين) للحصول على‬
‫عزالت فطرية متنوعة‪.‬‬

‫تنقية الفطريات‬ ‫‪.2‬‬

‫بعد مرور ‪ 5‬أيام من تحضين الفطريات تم تحضير اطباق ‪ PDA‬معقمة يمكن أن يظهر لدينا أكثر‬
‫من مستعمرة فطرية‪ ،‬لذلك نقوم بتنقية هذه الفطريات عن طريق نقل جزء من المستعمرة الى‬
‫منتصف الوسط الغذائي وتحضينها في حضان فطري على درجة ‪ 25‬درجة مئوية من ‪ 7-5‬أيام تم‬
‫تسجيل النتائج وفحصها في المجهر الضوئي للتعرف على نوع الفطر والتأكد من نقاوته‪.‬‬

‫‪4‬‬
 ‫بعد االنتهاء من عملية العزل والحصول على المزرعة يتم تعريف الميكروبات المعزولة بشكل‬
‫مبدئي من خالل الخصائص المورفولوجية والخصائص المجهرية للمزرعة الميكروبية‪.‬‬

‫‪ ‬الخصائص المورفولوجية‪ :‬يتم فحص مزرعة الميكروب (على البيئة الصلبة) مورفولوجيًا‬
‫وتسجل الخصائص المورفولوجية المميزة مثل لون المزرعة ـ طبيعة نمو الميكروب على البيئة ـ‬
‫كثافة النموـ شكل الحافة‪.‬‬

‫‪ ‬الخصائص المجهرية‪ :‬حيث تحضر شرائح من النمو الميكروبي ثم تفحص تحت المجهر ويتم‬
‫تسجيل الخصائص المجهرية للمزرعة (شكل الميكروب)‪.‬‬

‫عزل وتنقية بكتيريا الشعاعيات ( ‪) actinomycetes‬‬ ‫‪.3‬‬

‫األدوات‬

‫تربة من مناطق مختلفة وتم تسمية كل منطقة ب (‪ )1‬و (‪)2‬‬ ‫‪.1‬‬

‫اطباق ‪NA‬‬ ‫‪.2‬‬
‫ظروف تعقيم (لهب‪ ،‬ديتول)‬ ‫‪.3‬‬
‫ابر تلقيح‬ ‫‪.4‬‬
‫انابيب تحتوي على ماء مقطر معقم‬ ‫‪.5‬‬

‫طريقة التخفيف‪:‬‬

‫يتم تخفيف عينة التربة المراد عزل البكتيريا منها وذلك بوزن (‪1‬جرام) وتوضع في أنبوبة معقمة تحتوي على ( ‪9‬مل)‬ ‫‪.1‬‬
‫ماء مقطر وترج لمدة عشر دقائق تقريبًا ويكون التخفيف ‪1/10.‬‬
‫يترك األنبوب لعدة دقائق حتى يتم ترسيب حبيبات التربة الكبيرة‪.‬‬ ‫‪.2‬‬
‫يؤخذ (‪1‬مل) من هذا المحلول وينقل إلى أنبوبة تحتوي على (‪9‬مل) من الماء المقطر وترج جيدُا‬ ‫‪.3‬‬
‫فيتكون التخفيف ‪ , ..1/100‬يتم تكرار نفس طريقة التخفيف إلى أن نحصل على عدد من التخفيفات ( ‪\1 , 1000\1‬‬
‫‪. )100000\1 , 10000‬‬
‫تلقيح كل من تخفيف على اطباق ‪ NA‬وتكرر مرتين ‪.‬‬ ‫‪.4‬‬
‫تغطى األطباق ثم تحضن في الحاضنة عند درجة حرارة ‪35‬م‪ °‬لمدة ‪ 24‬ساعة‪.‬‬ ‫‪.5‬‬

‫‪5‬‬
 ‫تنقية المستعمرات البكتيرية‪.‬‬

‫طريقة العمل‪:‬‬

‫تعقيم السطح بالديتول وإشعال اللهب لتوفير ظروف التعقيم‪.‬‬ ‫‪-1‬‬

‫تحضير بيئة ‪NA‬‬ ‫‪-2‬‬
‫اختيار مستعمرة ذات خصائص واضحة بناء على الشكل الظاهري وذلك من خالل أخذ‬ ‫‪-3‬‬
‫جزء من المستعمرة ومن ثم تلقيحها في االطباق الجديدة بطريقة التخطيط للحصول على‬
‫عزالت بكتيرية نقية ثم فحصها بالمجهر الضوئي للتأكد من نوعها‬

‫فحص العينات تحت المجهر الضوئي‪:‬‬ ‫‪.4‬‬

‫بعد االنتهاء من عملية العزل والتنقية والحصول على مزرعة نقية يتم تعريف الميكروبات المعزولة‬
‫بواسطة الفحص المجهري‬

‫خطوات الفحص المجهري الضوئي وصبغ الشرائح المجهرية للفطريات‪:‬‬

‫تصبغ شريحة زجاجية معقمة تحتوي على قطرة من صبغة ‪ lactophenol blue‬ثم بواسطة ابرة‬
‫التلقيح المعقمة بالتلهيب الكحولي يؤخذ طرف من المزرعة وتمزج جيدًا بالصبغة مع المحافظة على‬
‫خصائص الفطر في وسط الشريحة ثم تغطية الشريحة بغطاء زجاجي وفحص الشرائح عند قوة ‪10‬‬
‫لتحديد المجال ثم قوة ‪ 40‬لتحديد الصفات المجهرية للفطريات‬

‫خطوات الفحص المجهري الضوئي وصبغ الشرائح المجهرية للبكتيريا ‪:‬‬

‫تحضير شريحة زجاجية معقمة تحتوي على قطرة من صبغة الماء المقطر ثم بواسطة ابرة التلقيح‬
‫المعقمة بالتلهيب الكحولي يؤخذ طرف من المزرعة وتمزج جيدًا بالماء مع المحافظة على خصائص‬
‫البكتيريا في وسط الشريحة ثم صبغ الشريحة بصبغة غرام وفحص الشرائح عند قوة ‪ 10‬لتحديد المجال‬
‫ثم قوة ‪ 100‬لتحديد الصفات المجهرية للبكتيريا‬

‫‪6‬‬
 ‫صبغ العينات بصبغة غرام‪:‬‬ ‫‪‬‬
‫تم أجراء خطوات صبغة غرام على العينة النقية للتأكد من نقاوة العينة ولمعرفة خصائص البكتيريا‬
‫المعزولة مجهريًا‪.‬‬
‫تم تحضير شريحة زجاجية بالطريقة التالية‪:‬‬

‫أخذ عقدة بكتيرية بواسطة ابرة التلقيح وفردها في وسط الشريحة الزجاجية باالستعانة‬ ‫‪.1‬‬

‫بقطرة ماء مقطر ثم تثبيت البكتيريا عن طريق تمريرها خالل اللهب ‪ 3‬مرات‪ ،‬ترك لتجف‬

‫تمامًا لبدء الصبغ‬

‫تضاف صبغة ‪ crystal violet‬وهي الصبغة االساسية (‪)primary stain‬‬ ‫‪.2‬‬

‫على شريحة عليها المحضرة مسبقًا وبتترك الصبغة مدة دقيقة واحدة‪ .‬بعد ذلك تغسل بمياه‬

‫مقطرة إلزالة الصبغة‪.‬‬

‫اضافة االيودين(‪ ..)mordant iodine‬وتركه لمدة دقيقة ثم تغسل مرة أخرى‪.‬‬ ‫‪.3‬‬

‫إزالة االصباغ المتبقية بواسطة (‪ decolorizer )ethyl alcohol‬وتركها لمدة ‪10‬‬ ‫‪.4‬‬

‫الى ‪ 30‬ثانية ثم تغسل مرة أخرى بماء مقطر‪.‬‬

‫في الخطوة االخيرة تضاف صبغه ال ‪ safranine‬وهي عبارة عن صبغة تفريقيه‬ ‫‪.5‬‬

‫‪ counter stain‬وتركها لمدة ‪ 30‬ثانية ثم تغسل وتترك الشريحة لتجف لفحصها‬

‫بالمجهر الضوئي‬

‫‪7‬‬
 ‫النتائج‪:‬‬

‫الشكل (‪ )4‬نمو فطري من عزل بذور الطماطم على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 5‬أيام من تحضين العينة‬
‫وقبل تنقيتها‬

‫الشكل (‪ )5‬نمو فطري لعينة بذور الطماطم بعد تنقيتها على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 5‬أيام من تحضين‬
‫العينة‬
‫(خيطية – النمو متوسط – بيضاء الصبغة)‬

‫‪8‬‬
 ‫الشكل (‪ )6‬الفحص المجهري للعزل الفطري شكل (‪ )5‬من بذور الطماطم بعد التنقية‬

‫الشكل (‪ )7‬نمو فطري من عزل بذور التين على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 3‬أيام من تحضين العينة‬
‫وقبل تنقيتها‬
‫(خيطية – النمو ضعيف – خضراء الصبغة)‬

‫‪9‬‬
‫الشكل (‪ )8‬نمو فطري لعينة بذور التين بعد تنقيتها على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 5‬أيام من تحضين‬
‫العينة‬

‫‪10‬‬
 ‫الشكل (‪ )9‬الفحص المجهري للعزل الفطري شكل (‪ )8‬من بذور التين بعد التنقية‬

‫الشكل (‪ )10‬نمو فطري من عزل بذور الفراولة على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 3‬أيام من تحضين‬
‫العينة وقبل تنقيتها‬
‫(خيطية قطنية – النمو متوسط – خضراء فاتح الصبغة)‬

‫‪11‬‬
‫الشكل (‪ )11‬نمو فطري لعينة بذور الفراولة بعد تنقيتها على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 5‬أيام من‬
‫تحضين العينة‬

‫‪12‬‬
 ‫الشكل (‪ )12‬الفحص المجهري للعزل الفطري شكل (‪ )11‬من بذور الفراولة بعد التنقية‬

‫الشكل (‪ )13‬نمو فطري لعينة معزولة من الهواء بعد تنقيتها على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 5‬أيام من‬
‫تحضين العينة‬

‫‪13‬‬
 ‫الشكل (‪ )14‬الفحص المجهري للعزل الفطري شكل (‪ )13‬لعينة معزولة من الهواء بعد التنقية‬

‫الشكل (‪ )15‬نمو فطري لعينة معزولة من الهواء بعد تنقيتها على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 5‬أيام من‬
‫تحضين العينة‬

‫‪14‬‬
‫الشكل (‪ )16‬الفحص المجهري للعزل الفطري شكل (‪ )15‬لعينة معزولة من الهواء بعد التنقية‬

‫‪15‬‬
‫الشكل (‪ )17‬نمو فطري من عزل بذور العنب على بيئة ‪ PDA‬بعد مرور ‪ 3‬أيام من تحضين العينة‬
‫وقبل تنقيتها‬
‫(ال يوجد نمو واضح)‬

‫الشكل (‪ )19‬تنقية عزل بكتيريا االكتينومايسيتس‬ ‫الشكل (‪ )18‬تنقية عزل بكتيريا االكتينومايسيتس‬
‫من التربة ‪2‬‬ ‫من التربة ‪1‬‬

‫الشكل (‪ )21‬الفحص المجهري لعينة البكتيريا‬ ‫الشكل (‪ )20‬الفحص المجهري لعينة البكتيريا‬
‫(االكتينومايسيتس شكل (‪)19‬‬ ‫(االكتينومايسيتس شكل (‪)18‬‬

‫‪16‬‬
 ‫المناقشة‪:‬‬
‫يسبب فطر ‪ Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii‬العديد من االمراض‬
‫الفطرية في الطماطم (‪ )3‬من خالل الفحص المجهري والظاهري تم تعريف نوع الفطر المعزول‬
‫من الطماطم مبدئيًا الشكل (‪ ) 6,5‬على انه فطر ‪ Rhizoctonia solani‬بسبب تشابه‬
‫خصائصه الظاهرية والمجهرية كما أوضحت الدراسات السابقة بإنه تم تحديد ثمانية عشر نوًعا‬
‫تنتمي إلى ‪ 7‬أجناس فطرية ( ‪Alternaria ، Aspergillus ، Fusarium ، Mucor ،‬‬
‫‪ Penicillium ، Rhizopus‬و ‪ )Trichoderma‬تتواجد في الطماطم وقشور الطماطم حيث‬
‫كانت ‪ Alternaria alternata‬األنواع الفطرية األكثر انتشارا‪ )2( .‬لذلك ستجرى المزيد من‬
‫الدراسات األخرى للتعرف على نوع الفطر المعزول إلجراء الدراسات والتنقية الحيوية بين األنواع‬
‫المعزولة‪ .‬في الشكل (‪ ) 8,9‬يرجع نوع الفطر الى جنس ‪ Alternaria alternata‬من خالل‬
‫التعرف على المظهر المجهري للفطر حيث تم اإلبالغ في الدراسات السابقة عن إصابات ثمار التين‬
‫بفطر ) ‪ Alternaria alternate (4‬في الشكل ( ‪ )16-10‬سيتم التعرف على نوع الفطر بعد‬
‫اجراء الدراسات التعريفية األخرى ‪.‬‬

‫المراجع‪:‬‬
‫‪1. Adrio, J. L., & Demain, A. L. (2003, September). Fungal‬‬
‫‪biotechnology. Retrieved from‬‬
‫‪https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12898399‬‬

‫‪2. Determination of Fungi Associated with Tomatoes‬‬

‫‪(Lycopersicum esculentum M.) and Tomato Pastes. (n.d.).‬‬
‫?‪Retrieved from https://scialert.net/fulltextmobile/‬‬
‫‪doi=ppj.2005.146.149‬‬

‫‪17‬‬
3. De Curtis, F., Lima, G., Vitullo, D. and De Cicco, V.
(2019). Biocontrol of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii
on tomato by delivering antagonistic bacteria through a drip
irrigation system.
4. https://pubag.nal.usda.gov/catalog/5492015

18