‫تخطيط األطباق ‪Streak plating‬‬

‫==================‬

‫عندما نضع المزارع البكتيرية علي سطح األجار بواسطة أبرة التزريع ذات العقدة ‪ Loop‬أو منحنية الطرف ‪bent-‬‬
‫‪ needle‬فإن هذا يسمي تخطيطا ً ‪. Streaking‬‬

‫يمكن عمل األطباق المخطوطة بأكثر من طريقة وهنا طريقتان مشروحتان ومصورتان وكلتا الطريقتين تعطيان نتائج ممتازة‬
‫إذا أجريتا بدقة‪،‬وإن الهدف األطباق المخطوطة هو الحصول علي معلق البكتريا المركز علي مستعمرات‪ 7‬منفصلة تماما وعند‬
‫التلقيح فإن الخاليا الكثيرة المتزاحمة الموجودة في بداية التخطيط تكون مستعمرات‪ 7‬قريبة جدا من بعضها ولكن باستمرار‬
‫التخطيط فإن أعداداً أقل فأقل تبقي بالقطيرات الموجودة علي أبرة التزريع ‪.‬‬

‫طريقة التخطيط األولي ‪:‬‬

‫=============‬

‫‪ .1‬عقم إبرة التزريع في اللهب حتى االحمرار ثم أتركها لتبرد ‪ 30-20‬ثانية ‪.‬‬

‫‪ .2‬أغمس إبرة التزريع في المزرعة السائلة المراد التزريع منها أو ألمس ‪ touch‬أو أقطف المستعمرة ‪ ))Pick colony‬في‬
‫حلة التزريع من طبق آخر‪.‬‬

‫‪ .3‬أبدأ بالتخطيط بادئا من الجهة البعيدة عنك في الطبق ثم سر باإلبرة في أتجاهك مالمسا سطح األجار ذهابا وإيابا من حافة‬
‫الي حافة مكونا خطوطا متوازية تبعد عن بعضها حوالي نصف سنتيمتر‪.‬‬

‫‪ .4‬عندما تصل الي منتصف الطبق لف الطبق ‪ 180‬درجة واستمر في التخطيط متجها الي الجهة البعيدة عنك هذا التغير في‬
‫االتجاه لتجنب تعارض اإلبرة مع حافة الطبق‪.‬‬

‫‪ .5‬غط الطبق بغطائه الممسوك بيدك األخرى‪.‬‬

‫‪ .6‬حضن الطبق في درجة الحرارة المطلوبة لمدة ‪ 24‬ساعة‪.‬‬

‫طريقة التخطيط الثاني ‪:‬‬

‫============‬

‫‪ .1‬عقم إبرة التزريع في اللهب حتى االحمرار ثم أتركها لتبرد ‪ 30-20‬ثانية ومن ثم اعمل خطين أو ثالثة أو أربعه خطوط‬
‫متوازية‪.‬‬

‫‪ .2‬عقم مرة أخري باللهب ثم أعمل خطوط عمودية علي الخطوط األولي‪.‬‬

‫‪ .3‬عقم وكرر العملية وبهذا أنك تحقق نفس النتيجة الطريقة األولي وهي تخفيف المزرعة‪.‬‬

‫‪ .4‬غط الطبق بغطائه الممسوك بيدك األخرى‪.‬‬

‫‪ .5‬حضن الطبق في درجة الحرارة المطلوبة لمدة ‪ 24‬ساعة‪.‬‬

‫يجب تحضين األطباق وهي مقلوبة والغرض من ذلك تجنب تكاثف الماء علي الغطاء من الداخل ثم سقوطه علي المجاميع‬
‫البكتيرية النامية فيسبب انتشارها وتداخلها مما يصعب عملية الفصل في أشكال المستعمرات‪.‬‬

‫صبغ الكائنات الدقيقة‬

‫===========‬
 ‫البكتريا الحية عديمة اللون تقريبا وتباينها مع الوسط المائي المعلقة به ال يكفي لويتها بوضوح فلذلك فإن الصبغ البكتيريا‬
‫يجهلها تتباين ‪ Contrast‬في اللون عن الوسط الموجودة به فتصبح مرئية ويسهل تمييزها وباإلضافة الي ذلك فإنه كي‬
‫تستخدم العدسة الزيتية في الفحص للوصول الي أكبر درجة من التكبير فإنه من األنسب استعمال الصبغ البكتيري‪.‬‬

‫طريقة العمل ‪procedure‬‬

‫===============‬

‫‪.1‬تحضير وتثبيت التحضير البكتيري للصبغ ‪:‬‬

‫========================‬

‫قبل إجراء عملية الصبغ عليك أن تثبت المادة التي ستفحصها‪ ،‬بمعني أن تلصق المادة بسطح الشريحة التي ستصبغ عليها ‪،‬‬
‫وإذا لم يتم تثبيت التحضير فإن غشاء الخاليا سيزول من علي الشريحة أثناء عملية الصبغ ‪.‬‬

‫‪ .1‬ضع قطرة ماء نظيفة في وسط الشريحة‬

‫‪ .2‬بواسطة اإلبرة ذات العقدة خذ مستعمرة بكترية وأمزجها مع قطرة الماء جيدا‪.‬‬

‫‪ .3‬أنشر باإلبرة مزيج المزرعة الصلبة (أو غمسه المزرعة السائلة) علي مساحة‪1 7‬سم‪ 2‬لتكون غشاءا رقيقا ‪thin film‬‬
‫ومعظم المتدربين يقعون في خطأ تحضير غشاء سميك‪.‬‬

‫‪ .4‬أترك الشريحة لتجف في الهواء أو أمسك الشريحة أعلي اللهب بحوالي ‪ 20‬سم بحيث ال يغلي الغشاء‪ 7‬الموجود علي‬
‫الشريحة‪.‬‬

‫‪ .5‬بعد ذلك ثبت الغشاء‪ 7‬المتكون بتمرير الشريحة في اللهب ثالث مرات مراعيا وجود الغشاء في األعلى ويراعي في هذه‬
‫الخطوة أن استعمال الحرارة أكثر من الالزم سيشوه شكل وتركيب الخلية المصبوغة لذا يجب أن تكون الشريحة دافئة وليست‬
‫ساخنة ويعرف ذلك أذا وضعت الشريحة علي ظهر اليد‪.‬‬

‫‪ .2‬الصبغ بواسطة صبغة جرام ‪:‬‬

‫================‬

‫‪ .1‬ضع الشريحة التي عليها الغشاء الذي سبق تحضيرها علي الحامل المخصص للصبغ ‪.‬‬

‫‪ .2‬أغمر الغشاء‪ 7‬حوالي ‪ 5‬نقط من صبغة الميثلين األزرق لمدة ‪ 60-30‬ثانية‬

‫‪ .3‬أغسل بالماء‪.‬‬

‫‪ .4‬غط الشريحة بمحلول اليود وأتركه لمدة ‪ 30‬ثانية للتفاعل‪.‬‬

‫‪ .5‬أغسل بالماء‪.‬‬

‫‪ .1‬ضف كحول ‪ %95‬إلزالة اللون‪ ،‬الغشاء‪ 7‬الرقيق يكفيه من ‪ 20-10‬ثانية مع إمالة الشريحة‪.‬‬

‫‪ .2‬أغسل بالماء‪.‬‬

‫‪ .3‬اصبغ بالصبغة المضادة وهي الصفرانين لمدة ‪ 30‬ثانية‬

‫‪ .4‬أغسل بالماء ومن ثم جفف الشريحة بورقة التنشيف أو اتركها تجف بالهواء‪.‬‬

‫‪ .5‬أفحص بالعدسة الزيتية‪.‬‬

‫االختبارات البيوكيميائية‬
‫============‬

‫كثيرة هي االختبارات البيوكيميائية لكننا سنتناول بشئ من االختصار الشديد تلك التي نجريها في المختبر في شكل خطوط‬
‫عريضة بينما نتناولها كاملة في الشرح أثناء التدريب والتي البد أن يتعرض لها المدرب المسئول بشئ من التفصيل‪.‬‬

‫لقد ساعدت االختبارات البيوكيميائية كثيرا في التفريق بين أنواع البكتريا المختلفة‬

‫====================================‬

‫وتجري هذه االختبارات بعد نمو الميكروب علي الوسط فيتم عزل مستعمرة نقية ومالحظة التفاعل الكيميائي الذي قد ينتج‬
‫عنة إنزيم أو يتغير لون المؤشر ‪ Indicator‬ومن هذه االختبارات اختبار ‪IMVic test‬‬

‫و‪ Api20‬والذي تستخدم علي مدي واسع في العالم للتفريق بين أنواع البكتريا المعوية الجدول التالي يوضح اختبار ‪IMVic‬‬
‫والتفاعل الكيميائي الذي يحدث والتفاعل البيوكيمائي الناتج‪.‬‬

‫جدول يفصل أهمية اختبار ‪.IMVic test‬‬

‫االختبار‬

‫االستعمال الرئيسي‬

‫التفاعل البيوكيمائي‬

‫االختبار االيجابي‬

‫أندول ‪Indol‬‬

‫للتفريق بين البكتريا العصوية السالبة الجرام خاصة ‪E.coli‬‬

‫===============================‬

‫يتكسر التربتوفان مع تحرر اإلندول‬

‫يتحول الوسط أو المؤشر الي اللون األحمر‬

‫احمر الميثيل‬

‫‪Methyl red‬‬

‫للتفريق بين البكتريا المعوية‬

‫===============‬

‫يقوم الكائن بتخمر الجلوكوز ويتغير لون الوسط‬

‫وسط أحمر فاتح‬

‫فوجس بروسكاور ‪Voges Proskauer‬‬

‫للتفريق بين البكتريا المعوية‬

‫===============‬

‫يقوم الكائن بتخمر الجلوكوز مع إنتاج الـ ‪acetoin‬‬

‫لون بنفسجي يكون ببطء في الوسط‬

‫الســـــيتريز ‪citrase‬‬

‫للتفريق بين البكتريا المعوية‬

‫تستعمل البكتريا السترات كمصدر وحيد للكربون ويغير اللون‬

‫يتحول الوسط الي أزرق معكر‪.‬‬

‫‪ >'"oman‬حضن الطبق في درجة الحرارة المطلوبة لمدة ‪ 24‬ساعة‪.‬‬

‫يجب االلتزام والعمل بهذه اإلرشادات لضمان جودة العمل داخل المختبر والسالمة الشخصية ألفراد المختبر ولتعم الفائدة‬
‫قمنا بكتابة هذه اإلرشادات باللغة اإلنجليزية بصوره أكثر وضوحا وشمولية واإلرشادات هي‪:‬‬

‫‪ .1‬اعتبار وجود خطر كامن في جميع المواد الكيميائية واألوساط الغذائية ويجب التعامل معها‪ 7‬حسب توصيات الصانعين‬

‫‪ .2‬االلتزام بارتداء المعطف (‪ ( lab coat‬واألقنعة الواقية والقفازات أثناء العمل ويجب تركه دائما في المختبر وعدم أخذه‬
‫إلي أماكن تناول الطعام أو مكان السكن‪.‬‬

‫‪ .3‬يجب عدم األكل أو الشرب داخل المختبر أو وضع مأكوالت أو مشروبات في ثالجة المعمل‪.‬‬

‫‪ .4‬يجب عدم استخدام الفم أو لمس العينين أثناء العمل داخل المختبر‪.‬‬

‫‪ .5‬أتبع االسلوب السليم في التخلص من أي مواد (حيوية أو كيمائية)‪.‬‬

‫‪ .6‬يجب تطهير وتنظيف مكان أجراء التحاليل المعملية بمطهر قبل وبعد أجراء التحاليل‪.‬‬

‫‪ .7‬يجب توضيح أسماء وأرقام العينات بشكل واضح علي األطباق قبل إدخالها الحضانات ‪.( )Incubators‬‬

‫‪ .8‬يجب التعامل مع المنابت المحتوية علي الميكروبات بحرص وعدم حملها خارج المختبر‪.‬‬

‫‪ .9‬في حالة استخدام القفازات الواقية يجب االمتناع كلية عن لمس كافة‪ 7‬محتويات المختبر حتى ال تتلوث وتصبح مصدرا‬
‫للعدوى‪.‬‬

‫‪ .10‬غسل اليدين جيدا بالماء والصابون ومسحها بالمطهر قبل مغادرة المختبر‪.‬‬

‫األجهزة والمتطلبات ‪Materials & Requires‬‬

‫========================‬

‫قد تتباين المختبرات في تجهيزاتها ويعتمد ذلك علي حجم العمل المطلوب وهدفه ولكن هنالك معدات أساسيه يجب توفرها في‬
‫جميع مختبرات األحياء الدقيقة وهي‪:‬‬

‫‪ .1‬حضانات ‪Incubators‬‬

‫‪ .2‬جهاز تعقيم ‪Auto calve‬‬

‫‪ .3‬فرن الهواء الساخن ‪Hot air oven‬‬

‫‪ .4‬جهاز عد المستعمرات البكترية ‪Colony counter‬‬

‫‪ .5‬كيمياويات مختلفة (أوساط غذائية‪ -‬محاليل)‬

‫‪ .6‬الكابينة الواقية ‪Safety Cabinet‬‬

‫‪ .7‬جهاز حمام مائي ‪water bath‬‬

‫‪ .8‬مجهر ‪Microscope‬‬

‫‪ .9‬مبردات ومجمدات ‪Refrigerators &freezers‬‬

‫‪ .10‬مرطمان الحيهوائي ‪An aerobic jar‬‬

‫‪ .11‬جهاز هضم العينات ‪Stomacher‬‬

‫‪ .12‬موقد بنزن ‪Bunsen burner‬‬

‫‪ .13‬جهاز الطرد المركزي ‪Centrifuge‬‬

‫‪ .14‬زجاجات‪ 7‬مختلفة ‪( Glass ware‬أطباق‪ -‬أنابيب‪ -‬ماصات‪– 7‬الخ‪)...‬‬

‫يجب عند استالم العينات مرعاه مايلي ‪:‬‬

‫====================‬

‫· أن تسجل جميع البيانات المدونة علي البطاقة (االسم التجاري‪ ،‬تاريخ الصالحية‪،‬بلد المنشأ الخ‪)..‬‬

‫· أن ترفق مع العينة نسخة من تقرير أخذ العينة وتغلق رسميا‪.‬‬

‫· أن يجري الفحص الظاهري علي عبوات العينات لتبين أي عيوب طبيعية‪.‬‬

‫· أن تفحص األكياس البالستيكية والقوارير بعناية للتأكد من عدم وجود تمزق أو ثقوب‪.‬‬

‫· أن تسجل درجة حرارة العينة إذا كانت سريعة التلف وغير مجمدة‪.‬‬

‫· أن تكون العينات المجمدة في حالة متجمدة حين استالمها في المختبر‪.‬‬

‫· أن تجري االختبارات علي العينة فور وصولها للمختبر وفي حالة تعذر ذلك تخزن العينات‪ .‬المجمدة عند درجة حرارة (‪-‬‬
‫‪°)18‬س حتى وقت االختبار علي أال تؤجل أكثر من ‪ 24‬ساعة‪.‬‬

‫· أن تخزن العينات غير المجمدة سريعة التلف عند درجة حرارة تتراوح بين صفر الي ‪ °5‬س بحيث ال تزيد مدة التخزين‬
‫علي ‪ 24‬ساعة‪.‬‬

‫· أن تخزن العينات غير سريعة التلف والمعلبة أو األغذية منخفضة الرطوبة عند درجة الغرفة حتى وقت االختبار‪.‬‬

‫إعداد العينة ‪:‬‬

‫العينات السائلة ‪:‬‬

‫========‬

‫ترج العينة السائلة غير اللزجة التي يمكن أخذها باستخدام الماصة أو التي يكون توزيع الكائنات الدقيقة فيها متجانسا عن‬
‫طريق تحريكها ‪ 25‬مرة في االتجاه األعلى واألسفل في مدي حوالي ‪ 30‬سم لمدة ‪ 7‬ثوان وفي حالة استخدام جهز رج‬
‫ميكانيكي ترج العينات لمدة ‪ 15‬ثانية‪.‬‬

‫العينات في شكل مسحوق‪:‬‬

‫تخلط العينة جيدا باستخدام ملعقة معقمة أو ملعقة أخذ العينات حتى تصبح العينة متجانسة‪.‬‬

‫العينات الصلبة‪:‬‬
‫تؤخذ عينة ممثلة باستخدام أداة مناسبة لذلك‪.‬‬

‫العينات المجمدة‪:‬‬

‫========‬

‫ترفع درجه حرارة العينات المجمدة إلزالة تجمدها في عبواتها األصلية أو في الوعاء الذي تم استالمها فيه في المختبر مع‬
‫تفادي نقل العينة بقدر اإلمكان الي وعاء آخر‪ ،‬وترفع درجة حرارة العينة الي ‪ ° 2‬الي ‪ °5‬وفي حالة الرغبة في اإلسراع في‬
‫عملية التسييح ترفع درجه حرارة العينات الي درجة أقل من ‪°45‬س لمدة ال تزيد علي ‪ 15‬دقيقة ‪.‬‬

‫عند رفع درجة الحرارة العينة المجمدة الي درجة الحرارة العادية تحرك العينة بحركة ترددية ويفضل أن يكون ذلك بصورة‬
‫مستمرة‪.‬‬

‫ملحوظة ‪:‬‬

‫=====‬

‫في حالة العينات التي يمكن تداولها بسهولة وهي مجمدة كاآليس كريم فال داع الي إزالة تجميدها‬

‫العينات المعلبة ‪:‬‬

‫========‬

‫· تنزع البطاقة من العبوة وتفحص العلب لمالحظة أي عيوب خارجية وتدون المالحظات‪.‬‬

‫· يغمر الجزء العلوي بمحلول مطهر ومن ثم يجفف بواسطة قطن صوفي معقم ‪.‬‬

‫· يمرر اللهب فوق سطح العبوة ويجب أال تعرض أي عبوة منتفخة للهب(يراعي أن يكون الجزء القفل الجانبي للعبوة في‬
‫اتجاه بعيد وجه القائم بالتحليل‪.‬‬

‫· يثقب السطح العلوي المعقم من غطاء العبوة باستخدام أداة معقمة ثم يوسع الثقب بحيث يكون قطرة ‪ 2.5‬سم ثم يغطي بطبق‬
‫بتري معقم‪.‬‬

‫· في حالة العلبة المزودة بغطاء سهل الفتح تفتح العبوة من الجهة األخرى مع مراعاة عدم التأثير علي الغطاء سهل الفتح‪.‬‬

‫العينات المعبأة في األكياس‪:‬‬

‫=============‬

‫· ينظف ويطهر الكيس بمحلول مطهر ثم يجفف جيدا باستخدام منشفة معقمة‪.‬‬

‫· تقطع نهاية الكيس أسفل مكان القفل باستخدام مقص معقم وفي حالة األكياس الكبيرة يمكن عمل فتحة بمقدار ‪ 5‬سم الي ‪7.5‬‬
‫سم وذلك عن طريق القطع في لركن العبوة في اتجاه مائل ثم يفتح الكيس مع مراعاة عدم لمس نهاية الكيس‪.‬‬

‫عينات المياه المختلفة‪:‬‬

‫==========‬

‫· عند سحب عينات من مياه شبكة أو مياه معالجة يجب استعمال زجاحيات معقمه وفي حاله المياه المعالجة بالكلور يجب‬
‫أضافه ‪ 0.1‬مل من محلول هايدروكسيدي لمعادلة الكلور الذي قد يقوم بقتل ماتبقي من البكتريا الحية المراد كشفها‪ 7‬أثناء نقل‬
‫العينة الي المختبر؟‬

‫· في مثل هذه العينات يتوجب وضع العينات في حافظه مبرده علي أن تصل الي المختبر في غضون ساعتين علي األقل ذلك‬
‫لضمان وصول الميكروبات حيه الي المختبر ومن ثم اجراء التحاليل المطلوبة مثل اختبار ال ‪.Coliform‬‬
 ‫� الذي تم استالمها فيه في المختبر مع تفادي نقل العينة بقدر اإلمكان الي وعاء آخر‪ ،‬وترفع درجة حرارة العينة الي ‪° 2‬‬
‫الي ‪ °5‬وفي حالة الرغبة في اإلسراع في عملية التسييح ترفع درجه حرارة العينات الي درجة أقل من ‪°45‬س لمدة ال تزيد‬
‫علي ‪ 15‬دقيقة ‪.‬‬

‫‪Manual LAB‬‬

‫ينقسم العمل في مختبر األحياء الدقيقة إلي‬

‫ثالث محاور هامة يعتمد كل منهما علي اآلخر في إنجاح العمل داخل المختبر وهي‪:‬‬

‫=================================‬

‫‪ .1‬تحضير األوساط الغذائية ‪Preparation Of media‬‬

‫‪ .2‬التعقيم ‪Sterilized‬‬

‫‪ .3‬التزريع ‪Culturing‬‬

‫تحضير األوساط الغذائية ‪Preparation Of media‬‬

‫===========================‬

‫ابُتدعت طريقة لتنمية البكتريا علي منابت (بيئات مزرعية‪ Culture media(-‬اصطناعية وهذه البيئات المزرعية ليست‬
‫متماثلة تماما مع البيئة االعتيادية التي تعيش فيها البكتريا إال أنه روعي في تكوينها االحتياجات والمتطلبات الغذائية الالزمة‬
‫لنمو األجناس المختلفة من البكتريا وبما ال يؤثر في خواصها المورفولوجية والبيولوجية‪.‬‬

‫تزرع البكتيريا علي المنابت ألغراض كثيرة أهمها ‪:‬‬

‫==========================‬

‫· الحصول علي نوع واحد من البكتريا (‪ )Single species‬في هيئة مستعمرة بكتريـة نقية (‪.)Pure colony‬‬

‫· الحفاظ علي البكتريا داخل المختبرات لفترة طويلة قد تصل لسنوات ‪.‬‬

‫· للتعرف علي أشكالها وخواصها المختلفة وأعدادها المحتمل وجودها في المـنتج‬

‫( ‪.)Plate count‬‬

‫أنواع األوساط المزرعية ‪:‬‬

‫==============‬

‫‪ .1‬أوساط صلبه ‪:Solid media‬‬

‫وهي تصب في األطباق أو األنابيب ثم تترك حتى تجمد ومن ثم يتم التزريع وتستخدم في أغلب األحيان لعزل البكتريا‬
‫ومعرفة خواص النمو وتستخدم أبرة التزريع ذات العقدة ‪ wire loop‬في التخطيط‪.‬‬

‫‪ .2‬أوساط نصف صلبه ‪:Semi solid media‬‬

‫وهذه تصب في األنابيب ومن خواصها أنها نصف صلبة ويتم عن خاللها التعرف عن خواص البكتريا من حيث الحركة في‬
‫اختبار الحركة ‪. motility test‬‬

‫‪ .3‬أوساط سائله ‪:Liquid media‬‬

 ‫وهي أوساط تساعد كثير في أنماء البكتريا وتعمل البعض منها في تنشيط النمو البكتيري والبعض اآلخر يستخدم في تثبيط‬
‫النمو وعزل مجموعة بكترية عن أخرى‪.‬‬

‫طريقة التحضير ‪: Preparation Of media method‬‬

‫=============================‬

‫يتم وزن الوسط المراد تحضيره بميزان حساس‪ ) )Sensitive balance7‬وحسب إرشادات الـوصف ‪Directions‬‬
‫الموجودة علي علبة الوسط المغذي وهي تختلف من شركة إلي أخري فمثال شركة ‪ Oxoid‬يختلف فيها عدد تحضير‬
‫جرامات ‪ peptone water‬عن شركة ‪ Mast‬اإلنجليزية‪.‬‬

‫إضافة الماء المقطر ‪ distilled water‬الي الوسط الذي تم وزنه ومزجه جيدا بتحريك الدورق ‪ ))flask‬عدة مرات بغرض‬
‫التذويب األولي للوسط‪.‬‬

‫إذابة الوسط بواسطة التذويب باللهب ‪ flame‬ويفضل التذويب بالحمام المائي ‪ Water bath‬ألن حرارة اللهب الشديدة قد‬
‫تؤدي ضرر يلحق ببعض مكونات الوسط لذا عند استعمال اللهب المباشر يوضع جهاز قياس حراري لمتابعة درجة حرارة‬
‫الوسط وتحريك الدورق بين الحين واآلخر لضمان عدم احتراق الوسط‪.‬‬

‫بعد التذويب يحول الوسط الي جهاز التعقيم المسمي بالضغط البخاري(األتوكالف (‪Autoclave‬‬

‫يجب مراجعه إرشادات الوسط الخاص بدرجة التعقيم فهي تختلف من وسط إلي آخر فهنالك أوساط ال تعقم باألتوكالف ‪Do‬‬
‫‪.no autoclave‬‬

‫حفظ الوسط في مكان مظلم وبارد في حالة عدم استخدامه وذلك للحفاظ علي مكوناته وعند صبة في األطباق يجب استخدامه‬
‫مابين ‪ 5-2‬أيام علي األقل‪.‬‬

‫مراجعة وضبط األس الهيدروجيني للوسط قبل التعقيم وذلك لضبط تأثير البيئة والحصول علي النمو األمثل للبكتريا وتكون‬
‫قراءه األس الهيدروجيني عند درجة ‪ C25°‬ويتم ضبط حمضية وقلوية الوسط بإضافة ‪ 1N-NaOH‬أو ‪1N-HCl‬‬

‫يجب تغطية األنابيب بالقطن أو السدادة دائما قبل إدخالها إلي جهاز التعقيم ‪.‬‬

‫أهم الوسائل الفيزيائية المستخدمة في عملية التعقيم ما يلي ‪:‬‬

‫=============================‬

‫الحرارة ‪ Heat‬تستخدم الحرارة في تطبيقات مختلفة في التعقيم وذلك في صورتين ‪:‬‬

‫· الحرارة الرطبة ‪Moist heat‬‬

‫================‬

‫وهي عبارة عن استخدام بخار الماء الساخن وهي أفضل الطرق المستخدمة‪ 7‬في التعقيم ومثال لذلك استخدام جهاز‬
‫‪. Autoclave‬‬

‫· الحرارة الجافة ‪ Dry heat‬وهي استخدام الهواء الساخن ومتمثلة في جهاز ‪ Oven‬والتعقيم باللهب المباشر‪.‬‬

‫يجب في التعقيم بجهاز ‪ autoclave‬مرعاه زمن ومدة التعقيم وأال يتجاوز المدة والحرارة المعروفة علي حسب كل وسط‬
‫وما هو موجود في وصف تحضير الوسط ‪. Directions‬‬

‫يجب مراجعة الماء الموجود داخل جهاز ‪ autoclave‬ألن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدال من‬
‫الرطبة التي يفرها بخار الماء‪.‬‬
‫التزريع ‪:Culturing‬‬

‫==========‬

‫القصد من عملية زراعة البكتريا في المختبر هو الحصول علي مستعمرة بكترية نقية ((‪ Pure colony‬للتعرف علي‬
‫الميكروب النامي كما ذكرنا في أغراض تحضير األوساط الغذائية ولذلك البد من أن نكون قادرين علي تعقيم البيئة‬
‫واالحتفاظ بها في صورة معقمة ودون حدوث أي تلوث من الخارج‪.‬‬

‫هنالك إرشادات يجب اإللزام بها من مسئول المختبر الي المتدربين معه في المختبر وقد تم ذكرها سالفا إضافة إلي بعض‬
‫التوجيهات وهي ‪:‬‬

‫· االمتناع عن الحديث أثناء عملية التزريع لتالفي حصول تلوث من رزاز الفم ‪.‬‬

‫· كتابة تاريخ دخول العينة واالختبارات المطلوبة لها‪.‬‬

‫· التأكد من كتابة رقم العينة علي الطبق((‪ Plate‬أو األنبوب ( (‪Tube‬بوضوح شديد‪،‬وفي بعض المختبرات يلزم المحلل‬
‫بكتابة أسمه وأسم العينة ودرجة التحضين‪.‬‬

‫* ‪Be sure to label the bottom of your plate with your name(s), date, temperature of‬‬
‫‪incubation, and specimen‬‬

‫· تسجيل النتائج التي تم الحصول عليها في دفتر العينات مع ذكر التاريخ وإمضاء المحلل الذي قام بإجراء التحاليل‪.‬‬

‫· التخلص الفوري من األطباق التي تمت قراءتها ثم تدوين نتائجها بإرسالها إلي غرفة التعقيم وإبادتها لمنع أي تلوث قد‬
‫تتسبب فيه الميكروبات النامية علي تلك المزارع‪.‬‬

‫· التزريع وفتح المستنبتات البكترية دوما يكون بالقرب من اللهب منعا لتلوث الوسط الغذائي ولسالمة المحلل من اإلصابة‬
‫ببعض الميكروبات الممرضة النامية علي المستنبت‪.‬‬

‫يقوم مختبر األحياء الدقيقة بالكشف علي كثير من أنواع البكتريا التي تقوم بالتسبب في التسمم الغذائي ‪Food poisoning‬‬
‫في المنتجات والسلع المختلفة في الوقت الراهن ‪،‬‬

‫حيث تسعي في تطوير قسم األحياء الدقيقة وإدخال آخر التقنيات الحديثة‬

‫وتحت إشراف خبراء إضافة إلي توسيع القسم بإنشاء مختبر حديث وهو مختبر األحياء الدقيقة الطبية ‪Medical‬‬
‫‪ Microbiology Lab‬ألجراء التحاليل الميكروبيولوجية الطبية التي تتمثل في التأكد من سالمة المحاليل الوريدية‬
‫ومستلزمات المرضي المختلفة مدة التعقيم وأال يتجاوز المدة والحرارة المعروفة علي حسب كل وسط وما هو موجود في‬
‫وصف تحضير الوسط ‪. Directions‬‬

‫‪ Ø‬يجب مراجعة الماء الموجود داخل جهاز ‪ autoclave‬ألن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدال من‬
‫الرطبة التي يفرها بخار الماء‪.‬‬

‫التي تتطلب أن تكون ذات تعقيم عالي وخالية من الميكروبات مثل( الضمادات الطبية التي توضع علي العين)‪ ،‬واألهم من‬
‫ذلك هو إدخال جهاز الـ ‪ PCR‬الذي يختص بالوراثة الجزئية حيث يتم التعرف علي الميكروب عن طريق الحمض النووي‬
‫الخاص به (‪ )DNA‬في ساعات‪ 7‬قليلة‪.‬‬

‫االختبارات المعملية ‪:‬‬

‫============‬
 ‫االختبارات والتحاليل التي يجريها المختبر تكون كلها ضمن المواصفة السودانية التي تحدد مسار االختبار والحدود‬
‫المايكروبيولوجية لكل منتج فالحليب المجفف مثال لديه خمس تحاليل والسمك والقشريات تحليلين فقط وعلي كل حال التحاليل‬
‫تشمل الكشف عن ‪:‬‬

‫‪ .1‬العد الكلي للبكتريا الهوائية )‪Aerobic Plate Count (APC‬‬

‫‪ .2‬مجموعة القولون ‪Coliform group‬‬

‫‪ .3‬بكتريا السالمونيال ‪Salmonella Sp‬‬

‫‪ .4‬العد الكلي للفطريات والخمائر ‪Mould & Yeast Count‬‬

‫‪ .5‬بكتريا اإلشريشيا كوالي ‪E.coli‬‬

‫‪ .6‬بكتريا اإلستافيلوكوكس ‪Staphylococcus aureus‬‬

‫‪ .7‬بكتريا الكلوستدرديوم بيرفرنجس ‪Clostridium perferngnes‬‬

‫‪ .8‬بكتريا الليستريا مونوسايتوجنس ‪Listeria monocytognes‬‬

‫‪ .9‬بكتريا الغالل ‪Bacillus cereus‬‬

‫‪ .10‬بكتريا الكلوستدرديوم بولتينيوم ‪bolotinum‬‬

‫‪ .11‬بكتريا الكوليرا ‪Vibrio parahaemolyticus‬‬

‫‪ .12‬بكتريا حمض الالكتيك ‪Lactobacillus Sp‬‬

‫‪-anguage:EN-US;mso-fareast-language:EN-US;mso-bidi‬‬

‫‪ >'language:AR-SA‬ألجراء التحاليل الميكروبيولوجية الطبية التي تتمثل في التأكد من سالمة المحاليل الوريدية‬
‫ومستلزمات المرضي المختلفة مدة التعقيم وأال يتجاوز المدة والحرارة المعروفة علي حسب كل وسط وما هو موجود في‬
‫وصف تحضير الوسط ‪. Directions‬‬

‫‪ Ø‬يجب مراجعة الماء الموجود داخل جهاز ‪ autoclave‬ألن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدال من‬
‫الرطبة التي يفرها بخار الماء‪.‬‬

‫التخفيف التسلسلي ‪Serial Dilution‬‬

‫يعتبر عزل البكتريا من العينات من أهم الطرق المتبعة لتشخيص األمراض البكترية‬

‫ويكون ذلك بزرعها علي المستنبتات المناسبة والتخفيف التسلسلي يعتبر ذات أهمية كبري حيث أن كثير من العينات البد من‬
‫تخفيفها قبل البدء في زراعتها علي البيئات الغذائية وللحصول علي عدد الخاليا البد بالضرب علي مقلوب التخفيف‪،‬‬
‫ونستخدم وسط ‪ Peptone water‬للتخفيف لمميزاته الخاصة كوسط مغذي ‪ Enrichment Broth‬وقدرته علي االحتفاظ‬
‫بالبكتريا حية لفترة طويلة عكس المحلول الملحي المعقم ‪ Normal saline‬أو الماء المقطر المعقم الذي ال يحتفظ بالمجاميع‬
‫البكترية لفترات طويلة‪ ،‬وذلك بالطبع ألن المكونات في المحلول الملحي أو الماء المعقم ليس بالتي توفر المواد الالزمة للعيش‬
‫لساعات طويلة والمحاور التالية توضح خطوات التخفيف التسلسلي‪:‬‬

‫‪ .1‬يتم وزن ‪ 25‬جرام من العينة وتضاف الي التخفيف األول ‪ 110-‬قدرة ‪ 255‬مل في حاله أختبار السلمونيال ويتم‬
‫تحريكها أو ‪ 50‬جرام الي ‪ 450‬مل وهزها جيدا عدة مرات لضمان تجانس العينة مع الوسط المخفف‪.‬‬

‫‪ .2‬يتم نقل ‪ 10‬مل من التخفيف األول الي التخفيف الثاني الذي حجمه ‪ 90‬مل‪.‬‬
‫‪ .3‬يتم نقل ‪ 2‬مل من التخفيف الثاني الي التخفيف الثالث الذي حجمه‪ 18‬مل‪.‬‬

‫‪ .4‬يتم نقل ‪ 1‬مل من التخفيف الثالث الي التخفيف الرابع الذي حجمه ‪ 9‬مل‪.‬‬

‫‪ .5‬ويمكن االستمرار في التخفيفات بعد ذلك حسب متطلبات العمل‪.‬‬

‫الرسم التالي يوضح كيفية التخفيف التسلسلي باستخدام ماء معقم في عينة مقدارها واحد جرام‬

‫وهي من التحاليل الهامة تستخدم لمعرفة األعداد البكترية الموجودة في العينة أو المنتج وبالتالي معرفة مدي جودة المنتج‬
‫وخصوصا في المنتجات الغذائية‪ ،‬فهو مؤشر واضح في حاالت األغذية المتلوثة بالبكتريا أن المنتج لم يتم معاملته جيدا في‬
‫المصانع أو في حالة األلبان المبسترة عندما يكون مثال عدد المستعمرات البكتريا أكثر من ‪ 104‬لكل خلية‪/‬ملي للتر‪.‬‬

‫ويستخدم فيها وسط ‪ t Nutrient Agar‬أو ‪ Plate count agar‬أو ‪Plate standard agar‬‬

‫وتعتبر من األوساط التي العامة (‪ )General Media‬التي تنمو عليها معظم أنواع البكتريا وهي كذلك وسط جيد للنمو كما‬
‫تستخدم في أغراض التقدير الكمي لتعداد المستعمرات البكترية‪.‬‬

‫لدينا أكثر من‬

‫ولكل خاصيتها وميزتها ومثال لذلك‪:‬‬

‫ٍ‬ ‫طريقة للعد‬

‫· )‪:Pour plate count(PPC‬‬

‫وهي طريقة صب األطباق وفيها ينقل واحد مل من العينة المخففة الي الطبق ومن ثم تضاف‪ 15-20‬مل‬

‫من ‪ Agar Nutrient‬أو‬

‫‪Plate count agar‬‬

‫وهي في درجة حرارة ‪ C45‬ثم تترك تجف وبعد ذلك تخلط مع العينة بواسطة التحريك أو الهز الخفيف للطبق ثم يترك‬
‫ليتصلب الوسط ويتم تحضينها في درجة حرارة ‪ C 37‬لمدة ‪ 48‬ساعة ومن ثم تعد األطباق التي نمت عليها المستعمرات‪،‬‬
‫ومن القواعد المتبعة للعد هي اختيار األطباق التي تحوي بين (‪ )250-25‬مستعمرة فمثال إذا كان التخفيف في الطبق األول‬
‫يحوي ‪ 20‬مستعمرة فإنا ال نقوم بعملية العد ألنها أقل من ‪ 25‬مستعمرة وكذلك حينما نجد أن التخفيف األول أو أي تخفيف‬
‫أكثر من ‪ 250‬مستعمرة ال نقوم بعد هذا الطبق وإنما نذهب للتخفيف الذي بعدة وهكذا ‪ ،‬والقاعدة الثانية قانون عدد الخاليا‬
‫البكتيرية ‪..‬‬

‫عدد الخاليا البكترية مل‪/‬لتر = عدد المستعمرات × مقلوب التخفيف‬

‫فإذا كان عدد المستعمرات‪ 7‬في التخفيف الرابع ‪ 80‬مستعمره فإن العدد الكلي = ‪104 ×80‬‬

‫· )‪:Spread plate count(SPC‬‬

‫وهي الطريقة الثانية من طرق العد الكمي للبكتريا‬

‫=====================‬

‫وتختلف في أن يتم صب األطباق بالوسط المغذي ثم يترك ليجف ومن ثم يسحب ‪ 0.5‬مل من التخفيف بالماصة وينشر‬
‫بواسطة قضيب زجاجي ‪ were glass‬بسرعة‪ ،‬وهذه الطريقة تختلف عن األولي بأن نسبة الكثافة البكترية أقل ويرجع ذلك‬
‫ألن توزيع التخفيف يكون علي السطح فقط بينما األخرى يكون التخفيف ‪ or:maroon'>Ø‬يجب مراجعة الماء الموجود‬
‫داخل جهاز ‪ autoclave‬ألن قلة الماء ستؤدي الي تعرض الوسط الي حرارة جافة بدال من الرطبة التي يفرها بخار الماء‪.‬‬

‫تمازجت وانتشرت بصورة واسعة في سطح وأسفل الوسط مما يعطي نتائج حقائق العدد البكتيري ولذلك تفضل الطريقة‬
‫األولي ‪.Plate count‬‬
‫· )‪Plate loop count (PLC‬‬

‫=================‬

‫وهذه هي الطريقة الثالثة‬

‫التي تستخدم في العد البكتيري للمستعمرات وإن كانت هي الطريقة األقل استعماال في المختبر وتتم عن استخدام إبرة التزريع‬
‫بدال عن الماصة في النقل بدال عن الماصة من محاسن هذه الطريقة يمكن تزر يع عدد من العينات ومن المساوئ لهذه‬
‫الطريقة أن التخفيف غير منتظم أو غير دقيق بمعني أن عدد المستعمرات‪ 7‬في اإلطباق غير مدرج بترتيب تنازلي فالتخفيف‬
‫األول والثاني والثالث في كثير من األحيان يكون الفرق غير محسوس والرسوم التوضيحية قد تشرح ذلك جيدا‪.‬‬

‫)‪:Membrane filtration (MF‬‬

‫================‬

‫وهي الطريقة الرابعة التي تستخدم في العد البكتيري للمستعمرات وفيها تستخدم عينة سائلة أو شبه سائلة ‪liquid or semi-‬‬
‫‪ liquid samples‬مثال لذلك (الماء – العصائر‪ -‬األلبان ) وورقة ترشيح وبعض المتطلبات األخرى ‪.‬‬

‫وعموما هي أكثر استخداما لعد مجموعة الكوليفورم أو بكتريا األستافيلوكوكس‪ ،‬ويستخدم في هذه الطريقة فلتر ترشيح خاص‬
‫ودقيق يبلغ حجم مسامه‪ µm 0.45 7‬بحيث يسمح بنفاذية العينة ويمنع البكتريا ويبقي البكتريا علي ورقة الترشيح ويتم‬
‫وضعها علي طبق بتري علية وسط مغذي ويحضن لمدة ‪ 24-18‬ساعة في درجة ‪ 37‬ومن مميزات هذه الطريقة أن حجم‬
‫العينة المستخدمة‪ 25 7‬مل وهي نسبة كبيرة قياسا بالطرق األخرى حيث يستخدم ‪ 1‬مل أو‪ 0.1‬مل وهذا جيد من الناحية‬
‫العملية إذ الحجم يعبر عن العينة بشكل جيد وكذلك من ناحية زمن التحضين وهذا ملخص عن الطرق المختلفة للعد البكتيري‬
‫للمستعمرات‪.‬‬

‫‪ .2‬مجموعة القولون ‪: Coliform group‬‬

‫=====================‬

‫تعتبر عائلة البكتريا المعوية ‪ Enterobacteriaceae‬من الكائنات الدقيقة التي توجد في أمعاء اإلنسان والحيوان وتتكون‬
‫من أعداد كبيرة ومتباينة وهي عصوية سالبة لصبغة جرام وتشمل هذه العائلة أعداد كبيرة من أجناس البكتريا مثل‬
‫‪ E.coli ,Salmonella, Shigella Klebsiella,proteus,Enterobacter,Serratia‬وهذه الكائنات الموجودة طبيعيا‬
‫في األمعاء‪ 7‬ولكنها تسبب في كثير من األحيان أمراضا لإلنسان‪ ،‬أما البعض اآلخر مثل ‪ Salmonellae‬و ‪ Shigellae‬فهي‬
‫من الميكروبات المرضية الهامة ولهذا فإن التعرف السريع والدقيق لهذه الميكروبات ضروري للعالج السليم لألمراض التي‬
‫تسببها‬

‫وتنتج هذه العائلة الكثير من السموم وهي تسمي بالعصويات السالبة لصبغة جرام أو‬

‫( البكتريا المعوية) أو (الكوليفورم) والطريقة التقليدية للتعرف عليها تتم باستخدام سلسلة من اختبارات تخمر السكريات‬
‫واختبارات بيوكيميائية تتم في أنابيب بيئات‪ ،‬سيتم ذكرها تباعا بقليل من االختصار‪.‬‬

‫للكشف عن هذه المجموعة يتم التزريع في وسط ‪ MacConkey‬ويحتوي علي بعض المواد‬

‫الكربوهيدرتيه‬

‫والتي يفرق بها بين مخمرات الالكتوز‪ Lactose-fermentation‬وغير مخمرات الالكتوز ‪Lactose fermentation‬‬
‫‪ Non‬والتي توضح التعرف األفتراضى عن وجود البكتريا المعوية ويكون التخمر واضحا بتغير الوسط ‪MacConkey‬‬
‫‪ broth‬وتحول اللون الي األصفر وعند استخدام أنبوب درهام ‪ Durham tube‬يالحظ وجود الغاز من عدمة ألن وجود‬
‫الغاز يؤكد افتراضية وجود ‪ Coliform‬ويستخدم وسط آخر يسمي ‪ Lauryl tryptose broth‬ويتم الكشف عن وجود الـ‬
‫‪Coliform‬بواسطة الغاز المتجمع في أنبوب درهام ويتم التحضين لمدة ‪ 48‬ساعة في درجة ‪ C37‬ويتم بعد ذلك حساب‬
‫مجموعة بكتريا رطبة التي يفرها بخار الماء‪.‬‬
‫القولون بواسطة طريقة العدد االحتمالي )‪ The Most probable Number (MPN‬لألنابيب الموجبة وهي أن تقوم‬
‫بحساب األنبوب الذي تجمع فيه الغاز من كل تخفيف علي حدي مثال أن لدي ثالث تخفيفات ولكل تخفيف يتم التزريع في‬
‫ثالث أنابيب أو خمس علي حسب العمل المطلوب لديك‪ ،‬نتيجة التخفيف األول كانت الثالث أنابيب موجبة أي وجود غاز‬
‫وتخمر والثاني والثالث أنبوبين وبالرجوع إلي جدول طريقة العدد االحتمالي يتم استخراج النتيجة كما هو موضح في الشرح‬
‫التفصيلي الموضح في األسفل‬

‫طريقة عد بكتريا الكلورفوم بواسطة األطباق ‪:‬‬

‫وفيها تسختدم وسط ‪ VRB)) Violet Red Broth‬ويتم التزريع بنقل ‪ 0.1‬مل من التخفيفات المختلفة والتحضين في درجة‬
‫‪ 37‬لمدة ‪ 24‬ساعة ومن قراءه النتائج وذلك بمشاهدة مستعمرات‪ 7‬وردية اللون الي أحمر فاتح ‪ .‬ويتم عدها بطريقة قانون عد‬
‫البكتريا المعروف‪.‬‬

‫بكتريـا‬

‫**هي من مجموعة بكتريا القولون التي تعيش فيه بصورة طبيعية ومع ذلك وتعتبر ‪ E.coli‬من أكثر أنواع العائلة المعوية‬
‫وجودا في كائنات األعداء وتكون البكتريا ممرضة فقط عند وصولها الي األنسجة خارج منطقة تواجدها الطبيعية في األمعاء‬

‫· تعتبر البكتريا المعوية السامة من نوع ‪ E.coli‬مسئولة من معظم االسهاالت التي تحدث أثناء السفر أو تناول األطعمة‬
‫الملوثة حيث تنتج بعض األنواع سموم خارجية ‪. Exeo toxins‬‬

‫· إصابة الجهاز البولي )‪ Urinary Tract Infection (UTI‬حيث تعتبر من أكثر األنواع التي تسبب إصابات الجهاز البولي‬
‫حيث نجد أن ‪ %90‬من اإلصابات األولية لهذا الجهاز في النساء صغار السن ومعظم هذة اإلصابات تسببها ‪ E.coli‬ذات‬
‫المولد المضاد )‪ O)) Antigen (O‬أما التي تحتوي علي أنتجين (‪ )K‬فهي التي تتسبب في إصابة الجزء العلوي من الجهاز‬
‫البولي‪.‬‬

‫· تسبب في تسمم الدم‪ Sepsis‬عند وصولها إلي مجري الدم خاصة عندما تكون أجهزة المقاومة للعائل ضعيفة وغير كافية‪.‬‬

‫· تعتبر الـ ‪ E.coli‬والمجموعة ‪ B‬من السبحيات ‪ Streptococcus SP‬من األنواع المعروفة في أحداث االلتهاب السحائي‬
‫في األطفال وهي تتسبب في حوالي ‪ %40‬من حاالت السحائي مع الوالدة الحديثة ( ‪. )neonatal meningitis‬‬

‫طريقة التحليل ‪:‬‬

‫يتم الكشف عن ‪ E.coli‬من األنابيب الموجبة في مجموعة الـ ‪ Coliform‬حيث يتم نقل واحد مل منها بالماصة أو عن طرق‬
‫إبرة التزريع إلي وسط ‪ brilliant green broth‬ويستخدم في أنبوب درهام للكشف عن إنتاج غاز لمدة ‪ 24-18‬ساعة في‬
‫درجة حرارة ‪ c44-45 °‬وهي الدرجة المثلي لنمو ‪ E.coli‬حيث يقل نمو األخريات عندها ومن ثم التزريع في وسط ‪EMB‬‬
‫أو أوساط ‪ MacConkey’s‬ومشاهدة نمو المستعمرات‪ 7‬بعد ‪ 24‬ساعة في درجة تحضين ‪ 37‬يالحظ تخمر الالكتوز وتكون‬
‫مستعمرات محدبة ذات سطح معدني المع ‪ ) )Metalic Sheen‬علي أوساط التزريع‪.‬‬

‫قد يشاهد علي هذه األوساط نمو أجناس أخري مثل ‪ Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp‬التفاصيل التالية‬
‫قد توضح مقارنة في شكل المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من األخرى‪.‬‬

‫يالحظ وجود مستعمرات خضراء المعة وذلك بسبب ‪ methylene blue‬الذي في الوسط نتيجة للتخمر الناتج من حمض‬
‫الالكتوز وهي مستعمرات‪ 7‬صغيرة عير لزجة ومسطحه وتمثل سـاللة ‪. E. coli‬‬

‫يشاهد وجود مستعمرات‪ 7‬شفافة سوداء في المنتصف وهي مستعمرات مخاطية و لزجة جدا وأخري لزجة قليال تشبه عين‬
‫السمكة‪ 7‬في شكلها وهي مخمرة لالكتوز وتمثل في أغلب األحيان ساللة ‪Klebsiella and Enterobacter‬‬

‫‪.‬‬

‫يشاهد وجود مستعمرات‪ 7‬فاتحة اللون وغير مخمرة لالكتوز تميل الي األزرق وتتألأل يشتم منها رائحة الحلوى‪.‬‬
‫[‪file:///C:/DOCUME~1/kj/LOCALS~1/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image001.gif[/IMG] ]IMG‬‬
‫ويتم بعد ذلك التأكد من ‪ E. coli‬باالختبارات البيوكيميائية مثل أختبار ‪IMViC‬‬

‫‪I =Indol‬‬

‫‪M= Methyl red‬‬

‫‪V = Voges Proskauer‬‬

‫‪C = Citrate‬‬

‫وهو عبارة عم مجموعة أختبارات مشتركه تجري معا والتي يتم تناولها في شئ من التفصيل في الجزء الخاص بها ‪.‬‬

‫و أجناس أخري مثل ‪ Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp‬التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل‬
‫المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من األخرى‪.‬‬

‫‪ .4‬بكتريا الـ‪: Salmonella‬‬

‫هي بكتريا ممرضة لإلنسان والحيوان تدخل عن طريق الفم ( ‪ )Oral Route‬وتنتقل لإلنسان عن طريق الحيوان والمنتجات‬
‫الحيوانية ( لحوم حمراء ‪ ،‬دواجن ‪ ،‬أسماك الخ ‪ )...‬وتسبب االلتهاب المعوي واإلصابات الجهازية والحمي المعوية (‬
‫‪)Enteric Fever‬‬

‫تنمو السالمونيال في األوساط البسيطة ولكنه إطالقا ُ ال تخمر الالكتوز أو السكروز‪ ،‬تكون الحامض وأحيانا الغاز عند‬
‫تخميرها الجلوكوز أو المانوز وعادة تنتج غاز كبريتيد األيدروجين‬

‫( ‪ )H2 S‬الذي يشبة رائحة البيض الفاسد ويمكن للسالمونيال العيش في الماء المجمد لفترات طويلة وهي كذلك مقاومة لبعض‬
‫الكيمياويات مثل ٍ‪, Sodium brilliant green‬‬

‫‪ Sodium teterathionate Deoxchococlate ,‬ولذلك يمكن إضافة هذه الكيماويات لألوساط المزرعية عند عزل‬
‫السالمونيال‪.‬‬

‫طريقة التحليل ‪:‬‬

‫=========‬

‫‪ .1‬يتم أضافة ‪ 25‬جرام من العينةفي وسط ‪ Lactose Broth‬أو وسط ‪Buffer peptone water‬لمدة ‪ 24‬ساعة في‬
‫درجة حرارة ‪ 37‬مئوية‪.‬‬

‫‪ .2‬يتم نقل ‪10‬مل من وسط ‪Bpw‬أو ‪LB‬الي ‪ 90‬مل الي وسط ‪ Rappaport-Vassilidis‬ويحضن الي ‪ 24‬ساعة في درجة‬
‫حرارة ‪ 37‬مئوية‪.‬‬

‫‪ .3‬يتم نقل ‪10‬مل من الوسط السابق الي وسط ‪broth teterathionate‬أو‪ Selenite cysteine broth -‬ويحضن لمدة‬
‫‪ 24‬ساعة في درجة حرارة ‪ 37‬مئوية‪.‬‬

‫‪ .4‬يتم التزريع في أوساط مثل ‪ SSA ,XLD ,HE, DCL, BS,‬وهي أوساط تفريقية اختيارية ( & ‪Differential‬‬
‫‪ ) Selective‬لعائلة المعويات صبغة سالبة جرام ومثبطة لمعظم البكتريا موجبة صبغة جرام وتميز بين البكتريا المخمرة‬
‫لالكتوز والغير مخمرة لالكتوز‪.‬وأما السالمونيال فيتم توضيح خصائص النمو وتميزها عن غيرها في النقاط القادمة موضحة‬
‫بالصور لتعميق الفهم ‪.‬‬

‫‪ .5‬تعطي السالمونيال مستعمرة حمراء اللون لون وسوداء في الوسط وهذا السواد ناتج من غاز ‪ H2 S‬الناتج من مخلفات‬
‫البكتريا وهو السبب إلعطاء هذا اللون في مختلف األوساط‪.‬‬
‫في وسط ‪ XLD‬تنمو مجموعة من المعويات ويمكن التمييز بينها أوليا بالشكل الظاهري للمستعمرة وذلك ألن البكتريا المخمرة‬
‫لالكتوز تعطي اللون األصفر والغير ‪l dir=RTL style='margin-right:54.0pt;text-align:justify; text-‬‬
‫‪ ] :indent:-18.0pt;mso-list:l0 level1 lfo1;tab-stops:list 54.0pt;direction‬وهو عبارة عم مجموعة‬
‫أختبارات مشتركه تجري معا والتي يتم تناولها في شئ من التفصيل في الجزء الخاص بها ‪.‬‬

‫و أجناس أخري مثل ‪ Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp‬التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل‬
‫المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من األخرى‪.‬‬

‫‪ .1‬مخمرة تعطي اللون األحمر أو الوردي ولكن هذا غير كافيا للتأكد من نوع الميكروب ‪.‬‬

‫‪ .2‬القيام باالختبارات البيوكيميائية للتعرف علي السالمونيال‪.‬‬

‫األوساط التفريقية واالختيارية ‪Differential & Selective media‬‬

‫)‪: XLD Agar Xylose Lysine Desocholate (1‬‬

‫يقوم هذا الوسط بتثبيط نمو البكتريا موجبة صبغة جرام وتسمح بنمو البكتريا سالبة صبغة جرام ومن مكونات هذا الوسط‬
‫‪ amino acid L-lysine, sodium thiothsulfate, phenol red‬ويستخدم الفينول األحمر كمؤشر ‪Indicator‬‬
‫تكشف عن البكتريا المخمرة لالكتوز أو السكروز عن طريق التخمر الناتج من الحمض األميني ‪amino acid L-lysine‬‬
‫ويعطي اللون األصفر واذا كانت البكتريا غير مخمرة لالكتوز أو السكروز‪ Lactose or sucrose not ferments‬فهي‬
‫تعطي اللون األحمر دالله علي عدم التخمر‪.‬‬

‫في بعض األحيان تكون هنالك مستعمرات سوداء اللون وهي ناتجة من تفاعل ‪ thiothsulfate‬ونعرض لخصائص‬
‫المستعمرات‪ 7‬النامية علي ‪ XLD‬في توضيح اللون‪.‬‬

‫‪ E.coli : flat yellow colonies‬تعطي مستعمرات مسطحه‪ 7‬صفراء اللون‬

‫‪ Enterobacter & Klebsiella : mucoid yellow colonies‬مستعمرات صفراء مخاطية‬

‫‪ : Proteus‬مستعمرات حمراء الي صفراء وتعطي لون أسود في الوسط‬

‫‪: Salmonella‬عادة تعطي اللون األحمر مع لون أسود في الوسط‬

‫‪ Shigella‬مستعمرات وردية الي حمراء اللون ‪:‬‬

‫في حال وجود المستعمرات‪ 7‬ذات اللون األسود فيجب التأكد باالختبارات البيوكيميائية لتشابه ‪ Salmonella‬و ‪Proteus‬‬

‫(‪Hekton Enteric Agar(HE) )2‬‬

‫يقوم هذا الوسط بعزل بكتريا ‪ Salmonella‬و ‪ Shigella‬وبعض بكتريا سالبة صبغة جرام‬

‫وتوضيح الخصائص كالتالي ‪:‬‬

‫‪ Salmonella & Proteus‬مستعمرات زرقاء الي خضراء اللون مع وجود سواد في الوسط ‪:‬‬

‫مستعمرات خضراء اللون رطبة( ‪ )Moist‬ومرتفعه قليال ‪Shigella :‬‬

‫‪ Coliforms : Salmon- pink to Orange‬برتقالي الي وردي اللون‬

‫‪ .5‬العد الكلي للفطريات والخمائر ‪Mould & Yeast Count‬‬

 ‫ال يخفي علينا الدور الذي تلعبه بعض الفطريات والخمائر في الكثير من الصناعات حيث هنالك بعض أنواع من الفطريات‬
‫مثل الفطر ‪ Penicillium roquefoti‬الذي ينمو علي سطح الجبن مكسبا إياها صفاتها المميزة ومثل الخميرة التي تستخدم‬
‫في صناعه الخبز ومن ناحية أخرى فبعض الفطريات والخمائر تسبب المتاعب الصناعية في صناعة األلبان ومنتجاتها حيث‬
‫تقوم بتغيير قوامها الطبيعي ومنتجات أخري عديدة‪.‬‬

‫طريقة التحليل ‪:‬‬

‫‪ .1‬يتم التزريع بنقل ‪ 0.1‬مل من التخفيفات السابقة علي كل طبق من األطباق المجهزة بوسط التزريع ‪Malt Exert agar‬‬
‫وهو وسط يمكن أن تنمو فيه الفطريات والخمائر والذي أضيف إليه مضاد حيوي (‪ )Antibiotic‬لمنع نمو البكتريا‪.‬‬

‫‪ .2‬تحضن في درجة حرارة ‪ 30‬درجة مئوية لمدة ‪ 72-48‬ساعة ‪.‬‬

‫‪ .3‬يتم حساب الخمائر أو الفطريات النامية ثم الضرب في مقلوب التخفيف ‪.‬‬

‫‪ .4‬في منتج خميرة الخباز قد تختلف الحسابات قليال فيتم عد الخميرة النامية علي الوسط حتى التخفيف التاسع فأكثر وذلك‬
‫يدل علي جودة الخميرة وإنتاجها ونشاطها‪.‬‬

‫‪ .5‬يتم إضافة المضاد الحيوي بعد التعقيم وبعد أن تصل درجة الوسط الي ‪ 45‬درجة‪.‬‬

‫‪ .6‬بكتريا الكلوستدرديوم بيرفرنجس ‪Clostridium perferngnes‬‬

‫بكتريا ‪ Clostridium perferngnes‬موجبة لصبغة جرام وتحتوي علي غالف(‪ ) Capsule‬وهي ال هوائية لذي تنمي في‬
‫جو منعدم من األوكسجين وهي من البكتريا التي تسبب بالتسمم الغذائي ويتم الكشف عنها في العديد من المنتجات المختلفة‪.‬‬

‫طريقة التحليل ‪:‬‬

‫‪ .1‬يتم نقل ‪ 1.0‬مل من التخفيفات السابقة الي طبق بتري و يضاف الوسط ‪Agar perferngnes‬‬

‫‪ .2‬توضع األطباق في مرطمان الحيهوائي ‪ An aerobic jar‬ويتم ضبط درجة الحرارة والتأكد من طرد الهواء منه‪.‬‬

‫‪ .3‬تتم قراءة النتيجة بعد ‪ 48‬ساعة‪.‬‬

‫‪>'"span lang=AR-SA style='font-size:14.0pt;font-family:"Simplified Arabic‬‬

‫و أجناس أخري مثل ‪ Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp‬التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل‬
‫المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من األخرى‪.‬‬

‫‪ .1‬يشاهد مستعمرات شديدة السواد ورائحة ‪ H2 S‬الكريهة‪.‬‬

‫‪ .2‬يتم حساب‪ 7‬نمو المستعمرات علي المزرعة ومقارنتها مع الحدود الميكروبيولوجية السودانية‪.‬‬

‫‪ .7‬بكتريا ‪Staphylococcus aureus‬‬

‫أفـراد هـذا الجنس كروية موجبة لصبغة جرام وهي ذات شكل عنقودي ليس لهـا بوغيــات (‪ )Non spores‬يوجد منها‬
‫حوالي ‪ 32‬نوع وهي هوائية أو ال هوائية قي وجود بعض الكربوهيدرات الممكن تخميرها ومن أهم أنواع الـ ‪Staph‬‬
‫‪Staphylococcus aureus‬‬

‫لدي هذا النوع العديد من األنزيمات والسموم التي يفرزها وتسبب اإلمراضيه ومثال لذلك‬

‫وأما عن اإلمراضيه التي يحدثها هذا النوع فيسبب التسمم الغذائي والتهاب األوعية الدموية وتفرز أفراد ‪ .aureus S‬بعض‬
‫السموم التي تقاوم درجة الحرارة المستخدمة‪ 7‬عادة في البسترة وحقيقة تناول مثل هذا السم غير مميت عادة إال أن تناوله‬
‫يصحبه بعض األعراض ض كالقئ واإلسهال واآلم في الظهر وال تستمر هذه األعراض أكثر من يوم واحد‪.‬‬
‫طريقة التحليل ‪:‬‬

‫من التخفيفات التسلسلية يتم التزريع بطريقة ‪ Spread plate count‬وهي نشر ‪ 0.5‬مل علي وسط ‪ Baird parker‬الذي‬
‫أضيف إليه بعدعقيم وعند درجه ‪ 50C-45‬يضاف ‪ 10‬مل من صفار البيض ‪ egg yolk emulsion‬وإضافة‬
‫‪ Supplement‬لمنع نمو ألجناس الغير مرغوب فيها‬

‫‪ .1‬يتم التحضين لمدة ‪ 48‬ساعة في درجة ‪ 37C‬ومن تم التعرف علي الخصائص المورفولوجية للمستعمرة ‪.‬‬

‫‪ .2‬يتم التعرف علي مستعمرات رمادية الي سوداء ‪ grey-black‬ومنطقة واضحة ‪ a clear zone‬وذات لمعان يتم تحويلها‬
‫الي وسط ‪Brain heart infusion (BHI) broth‬‬

‫يتم التأكد منها باختبار بالزما الدم‪test Coagulase‬‬

‫‪ .1‬يوجد العديد من االختبارات التي يمكن الكشف عن ‪ S. aureus‬بواسطة الفحص الـ ‪ Kits‬متخصص في ذلك‪.‬‬

‫‪.8‬بكتريا الليستريا مونوسايتوجنس ‪Listeria monocytognes‬‬

‫تسبب تسمم األغذية والتلوث وهي من أخطر أنواع الليستريا حيث تسبب الكثير من المشاكل الصحية للنساء الحوامل التي قد‬
‫تسبب لهم اإلجهاض واألطفال حديثي الوالدة وكبار السن ألن جهاز المناعة لديهم ضعيف ‪The disease affects‬‬
‫‪.primarily pregnant women, newborns, and adults with weakened immune systems‬‬

‫ومن األعراض التي تعتري المريض المصاب بها هي الحمي الشديدة والقئ واإلسهال المتكرر والشعور بالصداع واآلم في‬
‫العنق والتهابات الدم‪ ،‬وفي الواليات المتحدة أصيب حوالي ‪ 2500‬شخص توفي منهم ‪ 500‬مريض بهذه البكتريا منهم‬
‫شيوخ وأطفال حديثي الوالدة ونساء في مراحل الحمل المختلفة ‪.‬‬

‫توجد الليستريا في العديد من األطعمة أهمها منتجات األلبان حيث يكون مصدرها األبقار المصابة بمرض ‪listeriosis‬والتي‬
‫بدورها تنقل البكتريا المسببة لهذا المرض وأكل الخضروات دون طهيا جيدا‪.‬‬

‫األوساط المطلوبة ‪:‬‬

‫يوجد هناك الكثير من األوساط التي تساعد في عزل ونمو هذه البكتريا ويستخدم أيضا ً االختبارات السريولوجية‬
‫والبيوكيميايئة لذا نحن في المختبر نستخدم المتوفر منها وحسب المتطلبات التي تفرضها اإلمكانيات‪. 7‬‬

‫‪PALCAM agar (M118a) .1‬‬

‫‪Carageenan (Sigma type II) .2‬‬

‫‪BCM agar (M17a) .3‬‬

‫‪MOX agar (M103a) .4‬‬

‫‪ALOA agar (M10a) .5‬‬

‫‪Chromogenic Listeria Agar (M40b) .6‬‬

‫‪Rapid L'mono (M131a) .7‬‬

‫‪CHROMagar Listeria (M40a) .8‬‬

‫‪Tryptose broth and agar (Difco) (M167 .9‬‬

‫‪Oxford medium (OXA) (M118) .10‬‬

‫)‪Physiological saline solution, 0.85% (R63‬‬

‫‪Listeria Selective Agar& broth‬‬

‫‪CAMP test‬‬

‫تتم قراءة النتيجة بعد ‪ 48‬ساعة‪.‬‬

‫و أجناس أخري مثل ‪ Klebsiella Enterobacter, Pseudomonas Sp‬التفاصيل التالية قد توضح مقارنة في شكل‬
‫المستعمرة البكتيرية والخصائص التي تميز كل واحدة من األخرى‪.‬‬

‫طريقة التحليل ‪:‬‬

‫‪ .1‬أضافه ‪ Supplement‬بعد أن يصل الوسط الي درجة حرارة ‪ 50-45‬درجة مئوية لمنع نمو األنواع األخرى ‪.‬‬

‫‪ .2‬نقل ‪ 10‬مل من التخفيفات الي وسط ‪ enrichment‬مثل ‪ Listeria broth‬ويحضن في درجة ‪ 30‬لمدة ‪ 24‬ساعة‪.‬‬

‫‪ .3‬التزريع في وسط ‪ Listeria Agar‬أو ‪ PALCAM agar‬أو ‪. Oxford medium‬‬

‫‪ .4‬تسجل النتائج ومالحظة نمو المستعمرات‪ 7‬صغيرة الحجم بنية اللون وذات خافية سوداء اللون ‪.‬‬

‫‪ .5‬مشاهدة البكتريا بالمجهر الضوئي لمالحظة الشكل الخاص بـ ‪.Listeria monocytognes‬‬

‫‪ .6‬تجري االختبارات البيوكيميائية للتأكد من جنس ‪Listeria monocytognes‬‬

‫للتعرف علي المزيد من الخصائص المورفولوجية واالختبارات وأوساط األخرى الرجوع الي ملف ‪Listeria‬‬
‫‪ monocytognes‬في القرص المدمج‪.‬‬

‫‪.9‬بكتريا الغالل ‪Bacillus cereus‬‬

‫موجبة صبغة جرام وهي هوائيا اختياريا و ذات أبواغ ‪ facultative aerobic spore former‬وهي عصوية الشكل‬
‫‪,‬وأغلب األنواع متحركة‪ .‬وهي تتسبب في تسمم األطعمة ‪ food poisoning‬وينتج عن ذلك إسهاال شبيه بالذي تسببه بكتريا‬
‫‪Clostridium perfringens‬‬

‫حيث يحدث تشنجا وتقلص في منطقة البطن ويصحب ذلك أآلم شديدة والشعور بالغثيان بعد ‪ 15-6‬ساعة استهالك الطعام‬
‫الملوث بالبكتريا ‪.Bacillus cereus‬‬

‫وجود أعداد كبيرة منها ‪ 104‬فأكثر فهذا مثيرا للتحفظ علي المعاملة‪ 7‬أو الطريقة التي أنتج بها ذلك المنتج وذلك يرسخ أن‬
‫الميكروب في زيادة مطردة‪ .‬ومن األطعمة التي يتضمن وجوده فيها اللحوم واللبن والخضروات واألسماك ( ‪including‬‬
‫‪ ) meats, milk, vegetables, and fish‬وكذلك والنشويات مثل البطاطس واألرز والجبن المصنعة ‪.‬‬

‫األوساط والمحاليل ‪: media and reagents‬‬

‫هنالك العديد من المتطلبات للكشف عن هذة البكتريا وهي حسب الترتيب كالتالي ‪:‬‬

‫‪.Nutrient agar for B. cereus .1‬‬

‫‪.Trypticase soy-polymyxin broth .2‬‬

‫‪.Mannitol-egg yolk-polymyxin .3‬‬

‫‪.Motility medium (B. cereus) .4‬‬

‫‪.Voges-Proskauer test reagents .5‬‬

‫‪ e='mso-spacerun:yes'> a clear zone‬وذات لمعان يتم تحويلها الي وسط )‪Brain heart infusion (BHI‬‬
‫‪broth‬‬

‫يتم التأكد منها باختبار بالزما الدم‪test Coagulase‬‬

‫‪.Gram stain reagents .1‬‬

‫طريقة التحليل ‪method : Analysis:‬‬

‫‪ .1‬تحضير العينة ‪: Sample preparation‬‬

‫يوزن ‪ 50‬جرام من العينة تضاف الي ‪ 450‬مل من الوسط المخفف ‪ peptone water‬وإجراء التخفيف التسلسلي‬
‫المعروف‪.‬‬

‫‪ .2‬عد األطباق‪plate count of B.cereuse :‬‬

‫يتم نقل ‪ 0.1‬مل بواسطة الماصة الي األطباق ومن ثم نشرها علي الوسط ‪ MYP agar‬بواسطة قضيب زجاجي معقم‬
‫‪sterile glass spreading rod‬وتحضن لمدة ‪ 24‬ساعة في درجة حرارة ‪ 30‬درجة مئوية‪.‬‬

‫يالحظ نمو مستعمرات‪ 7‬تحيط بها منطقة شفافة أذا ‪ B. cereus‬تقوم بعمل ‪ Zone‬حول نفسها وهي عادة تعطي لون وردي‬