TRƯỜNG NÔNG NGHIỆP

KHOA SINH LÝ SINH HÓA

Bài giảng môn học

NUÔI CẤY MÔ & TẾ BÀO
THỰC VẬT
Cán bộ giảng dạy
Nguyễn Văn Ây, PhD.

Cần Thơ, 2022 1

 CHƯƠNG 2

CÁC NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ

VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT

2
 2.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO

2.1.1 Định nghĩa

Là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực
vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; việc
nuôi cấy được duy trì dưới các điều kiện được kiểm
soát.

3
 2.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO (tt)

2.1.2 Kiến thức sinh học thực vật cần

thiết cho nuôi cấy mô và tế bào
☼ sự hiểu biết các kiến thức cơ bản về
thực vật:
- Sinh trưởng và phát triển của TB
- Chu kỳ của TB
- Sinh lý
- Sinh hóa
4
 2.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO (tt)

2.2.3 Các kiểu nuôi cấy

✓Các cơ quan xác định (determinate organs): cơ quan
có cấu trúc, hình dạng và kích thước rõ ràng.

✓Các cơ quan chưa xác định (indeterminate organs):

cơ quan chưa hình thành cấu trúc, hình dạng rõ ràng

✓Cấy các tế bào chưa có tổ chức (unorganised cells):

callus (mô sẹo) 5
2.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO (tt)

6
Micropropagation vs Plant tissue culture
vs In vitro culture

7
In vitro culture:
From Latin- “within the glass” performing an experiment in a test
tube.
All types of culture including animal/plant cells, in vitro
fertilization, etc.

Micropropagation:
The production of whole plants from small sections of a plant,
called an “explant”.
- Apical bud
- Axillary bud
- Meristem

Tissue culture:
Inclusive term for growth of cells and tissues in a sterile
environment
- Undifferentiated plant cells
- Plant callus
- Plant tissue 8
 2.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO (tt)

2.2.3.2 Sự phát sinh hình thái (morphogenesis): biến đổi

các cấu trúc của mô cấy thành một cây hoàn chỉnh với đầy
đủ cấu trúc.
- Tính chất và sự kích thích: Các cơ quan mới (các mô,
chồi bất định-adventitious) được kích thích để thành
lập từ các mô được nuôi cấy.
✓ tạo ra chồi (caulogenesis)
✓ rễ (rhizogenesis)
✓ tạo phôi vô tính

9
 2.1 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO (tt)

- Sự phát sinh hình thái:

✓Sự tạo thành trực tiếp: sự hình thành các
cơ quan mới như chồi rễ từ mẫu cấy không
thông qua giai đoạn callus.
✓Sự hình thành gián tiếp: sự tạo thành các
cơ quan mới thông qua giai đoạn callus.

10
 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

2.2.1 Thực vật

✓ Chế độ dinh dưỡng của cây mẹ

✓ Tình trạng sạch bệnh của cây mẹ

✓ Thời gian lấy mẫu

11
 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

2.2.2 Mẫu nuôi cấy

(explants)

12
 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

Phẩm chất của mẫu cấy:

✓Các vị trí thực vật được sử dụng làm mẫu nuôi cấy ở
trên mặt đất sạch hơn các vị trí thực vật dưới đất

✓Mẫu nuôi cấy càng nhỏ càng dễ tránh các vấn đề về

nhiễm bệnh thực vật (virus, microplasma, bacteria)
nhưng giảm mức độ sống sót sau khi khử trùng

✓Mô bên trong ít nhiễm hơn mô bên ngoài 13

 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

Tuổi của mẫu nuôi cấy tuỳ thuộc vào tuổi của cành
được lấy mẫu

14
 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

• Ảnh hưởng của vị trí trên cây mẹ (topophysis,

cyclophysis và periphysis)

15
 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

• Topophysis: sư khác nhau của các phản ứng sinh lý

ở các vị trí khác nhau.
• Cyclophysis: các thay đổi của các phản ứng sinh lý
do tuổi.
• Periphysis: các đặc tính phân biệt được cho thấy
các phần có cùng tuổi và cùng vị trí mà chịu ảnh
hưởng của các điề̀u kiện vật lý khác

16
 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

Phần non ở một dạng cây hình nón:

✓ Độ non (trẻ hóa) của một phân sinh
mô tỉ lệ với khoảng cách (dọc theo
thân và nhánh) giữa sự liên kết chồi
và rễ (A) tới phân sinh mô.
✓ Các phân sinh mô có khoảng cách
xa chồi và rễ thì càng già.

17
 2.2 THỰC VẬT VÀ MẪU CẤY (tt)

• Sự trẻ hóa và sự nhân giống

Sinh trưởng hướng nghiêng

(plagiotropic growth)

Hình: Nhân giống in vitro của cây hình chóp (Bonga & Durzan, 1982)
18
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG

✓Sự vô trùng (asepsis): Tránh nhiễm bằng cách sử

dụng phương pháp tiệt trùng.
✓Axenic: Làm sạch quan hệ với các sinh vật sống
khác.
✓Tiệt trùng (sterilization): Giết hoặc loại vi sinh
vật hoặc bào tử của nó bằng nhiệt, lọc, hóa chất
hoặc các chất tiệt trùng khác.

19
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

2.3.1 Khử trùng bề mặt mẫu cấy

✓Các sản phẩm rẻ tiền
✓Không độc với mẫu vật và người thao
tác
✓Hiệu quả lọai các vi sinh vật trong một
phạm vi rộng

20
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

Hình. Phương pháp vô trùng mẫu cấy (George, 1993)

21
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

2.3.1.1. Hóa chất khử trùng

Hóa chất khử trùng bề mặt
Hóa chất Nồng độ áp dụng Thời gian áp
dụng (phút)
Chlorin [Ca(OCl)2] 9-10% 5-30
Nước Javel hoặc Clorox 2% dung dịch tẩy rữa (20% 50-30
(NaOCl) NaOCl)
Oxi già (H2O2) 10-12% 5-15
Nước Brome (Bromide Water) 1-2% 2-10
Nitrat bạc (AgNO3) 1% 5-30
Clorua thủy ngân (HgCl2) 0,1-1% 2-10
Kháng sinh (Antibiotic) 4-50 mg/l 30-6022
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

2.3.2 Khử trùng môi trường và dụng cụ nuôi cấy

2.3.2.1 Các kiểu nồi hấp khử trùng

23
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

2.3.2.2 Tiệt trùng bằng lọc

✓Màng lọc một lần trước hết được hấp khử trùng;
✓Kích thước lỗ không lớn hơn 0.22m

24
2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

25
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

Tiệt trùng keo/lọ nuôi cấy, dụng cụ làm việc và môi

trường làm việc
✓ Dụng cụ thủy tinh: hấp khử trùng, nhiệt khô (180oC
một vài giờ), bức xạ
✓ Dụng cụ chứa sử dụng một lần: bức xạ
✓ Giấy: nhiệt khô
✓ Dụng cụ làm việc: đèn cồn, hộp nhiệt (lửa, hạt thủy
tinh)
✓ Bề mặt tủ nuôi cấy: lau bằng cồn
26
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

2.3.2.3 Tủ cấy vô trùng

➢ Tủ cấy đơn giản tự chế:
➢ Tủ cấy vô trùng có màng vi lọc (HEPA-filtered)

27
Hình. Sơ đồ mô tả chi tiết một tủ cấy vô trùng (George, 1993)
2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

28
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

2.3.2.4 Khử trùng nhiệt khô

➢ Tủ sấy cao độ: được sử dụng để tiệt trùng dụng cụ cấy,
chai lọ và giấy

29
 2.3 SỰ VÔ TRÙNG (tt)

Tiệt trùng dụng cụ cấy: có thể sử

dụng đèn cồn hoặc hộp nóng có
hạt thuỷ tinh,…

Hiện nay, nhiều PTN nuôi cấy mô

sử dụng hộp nóng vì nó có nhiều
lợi ích như tránh được sự cố do
dùng đèn cồn.

30
 2.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Thành phần (Ingredients)

CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CÁC THÀNH PHẦN TỰ CHỌN
• Nước • Chelates
• Các nguyên tố khoáng • Chất thẩm thấu
• Nguồn carbohydrate • Than
• Vitamins • Amino acid
• Chất tạo gel • Đạm hữu cơ
• Chất điều hòa sinh trưởng

31
2.4.2. Các nguyên tố khoáng

32
2.4.3 Nguồn carbohydrate, đường sucrose
✓Đường sucrose thường được sử dụng trong
khoảng 2-5%.
✓Trong môi trường nuôi cấy, nó được thủy
phân hoàn toàn hoặc một phần thành: glucose
và fructose.

33
2.4.4 Vitamin
✓Nicotinic acid
✓ Pyridoxine (vit B6)
✓ Thiamine (vit B1)
✓ Myo inositol
✓ Vit C thường được sử dụng như là antioxidant

34
2.4.5 Chất tạo gel
Agar: trích từ tảo
Gelrite: một gellan gum (hetero-polysaccharide) được
tạo ra bởi vi khuẩn Pseudomonas elodea
Cần lưu ý đến:
✓ Độ tinh khiết của agar
✓ Hàm lượng ẩm chứa trong agar
✓ Sự sinh trưởng của mẫu cấy trong môi trường
có agar theo từng loại thương hiệu
35
Nồng độ Agar ảnh hưởng đến:
✓ Thế năng nước trong môi trường nuôi cấy
✓ Độ cứng của môi trường
✓ Sự sinh trưởng của mẫu cấy
✓ Các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa
nước (hyperhydricity)
✓ Sự hoạt động của cytokinin trong môi trường
có agar
36
 2.4.6 Chất điều hòa sinh trưởng

Tương tác auxin/cytokinin (Debergh, 2003)

37
 Auxin Tác dụng chính trong Các chất điều tiết biến dưỡng, tác
hệ thống mô động hoặc vận chuyển
Indol acetic acid (IAA) - Tạo rễ bất định (ở -2,3,4-triiodobenzoic acid (TIBA)
Indol butyric acid (IBA) nồng độ cao) -1-N naphthyl phthalamic acid (NPA) ức
1-Napthalene acetic acid - Tạo chồi bất định (ở chế sự vận chuyển auxin hữu cực.
(NAA) nồng độ thấp) p-chlorophenoxy isobutyric (PCIB) ức
Phenylacetic acid (PAA) - Kích thích phôi sinh chế hoạt động của auxin.
dưỡng -Hợp chất phenolic (vd: ferulic acid,
2,4-Diclorophenoxy acetic
acid (2,4-D) - Phân chia tế bào phloroglucinol) ức chế oxy hoá auxin
Dicamba - Thành lập mô sẹo và - Riboflavin kích thích mạnh sự quang
tăng trưởng oxy hóa của IBA và IAA
P-chloro phenoxy acetic
(CPA) - Ức chế sự phát triển
chồi nách
- Ức chế sự phát triển
rễ
38
2,3,5-Tri-iodobenzoic acid (TIBA) thì được sử dụng như chất ngăn cản auxin.
Cytokinin Tác dụng chính trong Các chất điều tiết biến dưỡng,
hệ thống mô tác động hoặc vận chuyển
Zeatin (Z) 1. Tạo chồi phụ Các hợp chất được mô tả mà ức
Zeatin riboside (ZR) (ở nồng độ cao) chế tổng hợp cytokinin
(lovastatin),
isopentenyladenine (iP) 2. Ức chế tạo rễ
Sự phân giải và tác động. Tuy
isopentenyladenosine 3. Phân chia tế bào
nhiên, các tác dụng khác thì chưa
(iPA) 4. Thành lập mô sẹo và được nghiên cứu hay còn nghi
6-benzylaminopurine tăng trưởng vấn
(BAP) 5. Kích thích mọc chồi
Kinetin nách
Thidiazuron (TDZ) 6. Ức chế sự vươn dài
N-(2 chloro-4-pyridyl)- chồi
N’-phenylurea (CPPU) 7. Ức chế sự lão hóa lá.
39
GIBBERELINS Tác dụng chính trong hệ thống Các chất điều tiết biến
mô dưỡng, tác động hoặc vận
chuyể̉n
Gibberelic acid (GA3) 1. Kéo dài chồi Paclobutrazol, flurimidol và
Gibberelin 1 (GA1) 2. Khử miên trạng hạt, phôi ancymidol
Gibberelin 4 (GA4) sinh dưỡng, ức chế sự tổng hợp gibberelin
chồi ngọn và thân củ vì vậy làm chồi ngắn lại
Gibberelin 7 (GA7)
3. Ức chế việc thành lập rễ bất
định
4. Các chất chế sự tổng hợp
việc thành lập rễ
5. Các chất ức chế sự tổng hợp
kích thích sự tạo thân củ, rễ
củ, gốc củ
6. Chất ức chế tổng hợp thúc 40
đẩy sự thích nghi
ABSCISIC ACID Tác dụng chính Các chất điều tiết, biến dưỡng, tác
trong hệ thống mô động hoặc vận chuyển

1. Làm trưởng thành phôi Fluridone ức chế tổng hợp thông

sinh dưỡng qua sự ức chế tổng hợp
2. Thúc đẩy sự thích nghi carotenoid, cây không thể tổng
hợp chlorophyll.
3. Tạo thân củ và rễ củ
Tuy nhiên, Fluridone không độc
4. Kích thích sự phát triển
Paclobutrazol cũng ức chế tổng
miên trạng
hợp

41
ETHYLENE Tác dụng chính Các chất điều tiết, biến dưỡng
trong hệ thống mô hoặc tác động
1. Lão hóa lá 1. 1-aminocyclopropane-1-
2. Làm chín trái carboxylic acid (ACC) là tiền chất
của ethylene và được chuyển hóa
3. Kích thích hoặc ức thành ethylene bởi mô
chế sự tái sinh phụ
(tùy vào thời điểm 2. Aminothoxyvinylglycine (AVG) ức
xử lý hoặc kiểu gen) chế tổng hợp ethylene
3. Ag ức chế hoạt động của
ethylene. Ag được áp dụng tốt hơn
là Ag-thiosulphate (STS)

42
JASMONIC ACID (JA) Tác dụng chính trong Các chất điều tiết, biến dưỡng
hệ thống mô hoặc tác động

METHYLJASMONATE 1. Kích thích tạo thân

(MEJA) củ và rễ củ
Gia tăng sự thành lập
mô phân sinh

43
POLYAMINES Tác dụng chính Các chất điều tiết, biến dưỡng hoặc tác
trong hệ thống môđộng
Putrescine 1. Kích thích tạo rễ
1. DL-adifloromethylarginine (DFMA) và
Spermidine bất định adifloromethylornithine (DFMO) ngăn

Spermine 2. Kích thích tạo chặn sự tổng hợp Putrescine.

chồi 2. Methylglyoxal bis guanylthyrazone
3. Kích thích tạo (MGBG) và cyclohexylamine (CHA) ngăn
mầm phôi sinh chặn sự tổng hợp Spermidine và
dưỡng Spermine
3. Amino guanidine (AG) ngăn chặn sự
phân giải Putrescine

44
2.4.7 Chelate
Chelate là chất có khả năng thành lập phức chất với
các cation kim loại (chủ yếu sắt) và giúp giữ chúng
trong dung dịch. Các chelate như EDTA:
(Ethylenediaminetetraacetic acid), EDDHA:
(Ethylenediamine-di (o-hydroxyphenyl) acetic acid)
thường rất phổ biến trong nuôi cấy mô.

45
2.4.8 Tác nhân thẩm thấu (Osmotic agent)
✓Sự hiện diện của nước và khoáng
✓Hiệu quả của đường 2% thường được quy
cho là hiệu quả thẩm thấu và không kể
chức năng của nó như là nguồn năng
lượng
✓Mannitol là một alcohol đường không biến
dưỡng và chỉ có hiệu quả thẩm thấu.
46
2.4.9 Than hoạt tính (Activated charcoal)
- Làm tối môi trường nuôi cấy
- Hấp thu các phân tử, các phân tử có cấu trúc
dạng vòng
- Có thể chứa các Tp kích thích: polyamines

47
2.4.10. pH
- 5.5 và 6 trước khi hấp khử trùng.
- Quyết định sự hòa tan của khoáng
- Ảnh hưởng sự hấp thu khoáng trong môi
trường
- Ảnh hưởng trên sự tạo gel của agar khi
hấp khử trùng.

48
2.4.11 Acid hữu cơ
Acid hữu cơ, acid citric, malic… cũng được
thêm vào môi trường. Hiệu quả của chúng
khá rõ rệt nhưng chức năng thật sự chưa
được biết.

49
2.4.12 Thành phần bổ sung không xác
định
✓Dịch chiết nấm men (Yeast extract)
✓Dịch trích Khoai tây,
✓Chuối nghiền,
✓Nước Dừa,
✓Dịch trích trái cây như Cà chua, Khóm,…

50
2.5. CÁC KIỂU BÌNH CHỨA & NẮP ĐẬY

51
 Phải thỏa một số điều kiện sau:

✓ Phải chịu đựng nhiệt độ hấp khử trùng

✓ Phải cho ánh sáng xuyên qua
✓ Hầu như không còn vi sinh vật sống sót sau khi khử
trùng
✓ Phải có giá thành rẻ
✓ Dễ tìm
✓ Hiện nay, có thể sử dụng các chai lọ đựng thực
phẩm.
✓ Trong công nghiệp sản xuất, các bình nuôi cây bằng
nhựa sử dụng 1 lần cũng được áp dụng ở các nước
công nghiệp phát triển. 52
 2.6 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

2.6.1 Chuẩn bị hóa chất:

Gồm các bước sau:
✓ Chuẩn bị hóa chất để pha môi trường
✓ Nấu môi trường thường sử dụng nồi nấu bằng thép không
gỉ, hoặc trong các đồ chứa bằng ̣ plastic chịu nhiệt sử dụng
lò vi sóng (microwave).
✓ Đo pH.
✓ Rót vào ống nghiệm hoặc keo lọ
✓ Cho vào nồi hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt độ và áp suất
mong muốn
✓ Lấy môi trường ra để nguội
53
2.6.2 Chuẩn bị dung dịch gốc (stock
solution)

54
 Pha các dung dịch gốc (stock solutions) của môi
trường MS (1962)

Đa lượng MS Hóa chất (g/l) Stock solution x10

(g/l)
1 MS1 NH4NO3 1,65 16,5
KNO3 1,9 19
MgSO4 7H2O 0,37 3,7
2MS2 CaCl2 0,33 3,3
3MS3 KH2PO4 0,17 1,7
FeEDTA FeSO4 7H2O 27,8 mg/l Đậm đặc 100 lần
EDTA 37,3 mg/l 2,78g FeSO4 7H2O
3,73g EDTA → 10ml/l môi
trường
55
Vi lượng MS (mg/l) Stock x 1000 (mg/l)
H3BO3 6,2 6200
MnSO4 22,3 22300
ZnSO4 7H2O 11,5 11500
Na2MoO4 2H2O 0,25 250
CuSO4 5H2O 0,025 25
KI 0,83 830
CoCl2 0,025 25

56
2.6.3 Nấu môi trường

2.6.4 Đo pH: 5.5-6

57
 2.7 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

2.7.1 Nhiệt độ
➢Thường được điều chỉnh 22  2oC
➢Giữ nhiệt độ phòng ổn định trong suốt quá
trình nuôi cấy.
➢Cần cài đặt một dụng cụ ổn định nhiệt độ
(thermostat), khi nhiệt độ phòng quá cao có
thể kiểm soát bằng cách tắt bớt đèn.

58
 2.7.2 ÁNH SÁNG

Thường sử dụng đèn huỳnh quang. Các thông số ánh sáng rất
quan trọng:
✓ Quang kỳ
✓ Cường độ ánh sáng
✓ PAR = số moles photon giữa 400 và 700 nm mỗi m2 mỗi
giây (s)
✓ Lux không là đơn vị thích hợp vì nó dựa trên cơ sở sự mẫn
cảm của mắt con người
✓ Quang phổ. Quang phổ ảnh hưởng đến hình thái
✓ Tỉ lệ quan trọng là xanh/đo đỏ /cuối đỏ (blue/red; red/far-
red)
✓ Quang phổ tùy thuộc vào kiểu đèn 59
2.7.3 Quang kỳ (photoperiod)
Trong hầu hết trường hợp quang kỳ không
quan trọng. Thường sử dụng ngày dài là
16 giờ.

60
2.7.4 Cường độ ánh sáng (light intensity)
Cường độ thích hợp: 30 mol m-2 s-1. Dưới điều
kiện này, sự nuôi cấy còn trong giai đoạn tạp
dưỡng (mixotrophic).
Đối với mô tự dưỡng (autotrophic tissue culture)
cường độ ánh sáng lên đến 250 mol m-2 s-1.

61
• Tùy thuộc vào nắp đậy của keo nuôi cấy mà làm giảm
cường độ ánh sáng
• Bức xạ quang hợp hửu hiệu (PAR = Photosynthetic
active radiation,  mol.m2.s-1)
• Phổ ánh sáng (light spectrum)
• Phổ ảnh hưởng đáp ứng cho hiệu quả hình thái (chiều
cao, sự phát triển lá)
• Các tỉ lệ quan trọng là: blue/red và red/far red
• Phổ tùy thuộc vào kiểu đèn
62
2.7.5 Ẩm độ (Humidity)
✓Ẩm độ tương đối thường không được kiểm
soát trong phòng nuôi cấy
✓Bình đựng cây tiêu chuẩn, khoảng trống bên
trên thường được bão hòa hơi nước.
✓Ẩm độ tương đối trong bình chứa có thể được
kiểm soát bởi các phương tiện khác nhau như
sự thông khí, làm lạnh dưới đáy, nồng độ
agar. 63
64