TRƯỜNG NÔNG NGHIỆP

KHOA SINH LÝ SINH HÓA

CHƯƠNG 2
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ:
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ
PHƯƠNG PHÁP CHUẨN BỊ
Cán bộ giảng dạy:
Nguyễn Văn Ây, PhD.

Cần Thơ, 2022 1

 3.1 NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH

Gieo hạt lan?

2
3
 3.2 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH – VI NHÂN GIỐNG

Why is it possible to regenerate in vitro?

Totipotency
✓ Initial state
✓ Competence
✓ Determination
✓ Differentiation

4
 Only occurs in a few cells in culture.
Why?

✓Pre-determination prior to culture

✓Newly formed meristems may act as sinks
✓Meristematic centers might actually produce
compounds that inhibit neighboring cells.

5
 3.2 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH – VI NHÂN GIỐNG (tt)

3.2.1 Mục đích

Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-
type) của một kiểu gene được tuyển chọn bằng
cách sử dụng kỹ thuật in vitro.
3.2.2 Lợi và bất lợi của vi nhân giống

6
 3.2.3. Các giai đoạn của vi nhân giống

In vivo Giai đoạn 0: sự chuẩn bị của cây mẹ

In vitro Giai đoạn 1: bắt đầu tiệt trùng
Giai đoạn 2: nhân
Giai đoạn 3a: kéo dài
Giai đoạn 3b: tạo rễ và tiền thuần dưỡng
In vivo Giai đoạn 4: Thuần dưỡng
(Nguồn: Debergh và Zimmerman, 1991)

7
Hình. Các bước cơ bản của vi nhân giống (George, 1993) 8
Giai đoạn 0: Sự chuẩn bị của cây mẹ
(Mother plant preparation)

Hình. Ghép nhiều tầng 9

 Giai đoạn 1: Tiệt trùng mẫu cấy
(Initiation)

✓ Mục đích là thực hiện thao tác cấy.

✓ Là một sự kết hợp giữa một phương pháp tiệt
trùng đầy đủ và một tỉ lệ sống cao của mẫu cấy
và không bị nhiễm.
✓ Thông thường khó đạt thành công 100% trong kỹ
thuật vô trùng mẫu.

10
Hình. Các thao tác cấy hoa Hồng ở GĐ 1 (Debergh, 2003)
11
 Giai đoạn 2: Nhân chồi
(Multiplication)

Hình. Cấy một hoặc nhiều mắt (George, 1993) 12

 Giai đoạn 2: Nhân chồi (tt)

Hình. Cấy chồi hoặc đỉnh sinh trưởng (George, 1993)13

 Giai đoạn 2: Nhân chồi (tt)

✓ Kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh

sinh trưởng, chồi chính, chồi bên.
✓ Sự gia tăng số chồi phụ thuộc nhiều vào việc sử
dụng cytokinin.
✓ Sử dụng hàm lượng cytokinin cao: sự thừa
nước, tạo thành bụi rậm, biến dị vô tính, các
vấn đề về rễ và chậm ra hoa..

14
Hiện tượng biến dạng của chồi tre Rồng in vitro khi nuôi cấy trên môi
trường MS +10 mg/l BA sau 30 ngày nuôi cấy
15
Hình. Các bước của kỹ thuật nhân chồi cây hoa Hồng ở giai đoạn 2 16
(Debergh, 2003)
 Giai đoạn 3 (Rooting and pre-
acclimatization)
Giai đoạn 3a: Kéo dài
✓ Tạo điều kiện cho sự tạo rễ đầy đủ;
✓ Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc
một cytokinin yếu hơn cytokinin đã được sử dụng trong
giai đoạn 2;
✓ Có thể cần thiết thêm than để trung hòa hiệu quả
cytokinin còn lại trong giai đoạn 2;
✓ Tùy thuộc vào kiểu cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên
các chồi đơn hoặc cụm.
17
Giai đoạn 3b: Kích thích rễ & tiền thuần dưỡng
✓ Auxin thường được sử dụng
✓ Tạo rễ tốt nhất thường đạt được trên môi trường
với hàm lượng khoáng thấp
✓ Các rễ phát triển trong in vitro thì luôn không thích
nghi với điều kiện nhà lưới và các rễ quá dài sẽ
gặp khó khăn khi trồng.
✓ Kích thích rễ có thể xảy ra trên chồi đơn và cụm.
✓ Tăng khả năng tự dưỡng: cung cấp carbohydrate, làm
thấp ẩm độ tương đối trong bình chứa,... 18
 Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng
(acclimatization)

Mục đích: làm giảm tối thiểu sự

chết cây con, khi chuyển từ in
vitro sang nhà lưới hoặc điều
kiện ngoài đồng. Cần chú ý:
✓Tình trạng cây con khi
chuyển ra môi trường trồng;
✓Các yếu tố về môi trường
như nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng.
19
 3.2.4 Một số kỹ thuật giúp gia tăng sự sinh
trưởng và giảm giá thành

✓Càng nhiều giai đoạn cấy truyền, càng tốn

nhiều chi phí và công sức.
Để giảm chi phí, hai kỹ thuật được áp dụng là:
- Kỹ thuật hai lớp (Double layer technique)
- Tự động hóa (Robotization)

20
3.3 NHÂN GIỐNG TỪ PHÔI VÔ TÍNH
(Somatic embryo)

21
 3.3.1. Organogenesis

The formation of organs (such as leaves,

shoots, roots) on a plant organ, usually of
a different kind.
Rule of thumb (Auxin/cytokinin)
✓ 10:1-100:1 induces roots.
✓ 1:10-1:100 induces shoots
✓ Intermediate ratios around 1:1
favor callus growth.
22
 Indirect organogenesis

Explant → Callus → Meristemoid → Primordium

• Dedifferentiation
– Less committed, more plastic developmental
state
• Induction
– Cells become organogenically competent and
fully determined for primordia production
– Change in culture conditions?
• Differentiation 23
24
Direct Organogenesis

25
26
27
3.3.2 Phôi vô tính là gì?
Phôi được hình thành từ các tế bào dinh
dưỡng (somatic cells) mà không có sự dung
hợp hai tế bào sinh dục và cũng không có
phôi nhũ.

28
3.3.3 Các giai đoạn hình thái tiêu biểu trong
quá trình phát triển phôi vô tính

29
 Somatic Embryos

✓Bipolar
✓Not connected to explant or callus cells
by vascular tissue
✓In most woody plants, tissue must be
juvenile or reproductive

30
 Indirect Somatic Embryogenesis

➢ Auxins required for induction

✓Proembryogenic masses form
✓2,4-D most used
✓NAA, Dicamba also used

31
 Development of Indirect Somatic
Embryogenesis

• Auxin must be removed for embryo development

• Continued use of auxin inhibits embryogenesis
• Stages are similar to those of zygotic
embryogenesis
– Globular
– Heart
– Torpedo
– Cotyledonary
– Germination (conversion)

32
In vitro somatic embryogenesis

33
 Maturation of Indirect Somatic
Embryogenesis

✓Require complete maturation with apical

meristem, radicle, and cotyledons
✓Often obtain repetitive embryony
✓Storage protein production necessary
✓Often require ABA for complete maturation
✓ABA often required for normal embryo
morphology

34
 Germination of Indirect Somatic
Embryogenesis
✓ May only obtain 3-5% germination
✓ Sucrose (10%), mannitol (4%) may be required
✓ Drying (desiccation)
ABA levels decrease
Woody plants
Final moisture content 10-40%
✓ Chilling
Decreases ABA levels
Woody plants

35
 Factors that Influence SE

✓Genotype

✓Growth regulators

✓Carbon source

✓Nitrogen
36
37