Master Mention Bioinformatique

BCC1 : Omics 1
Spectrométrie de masse
TD
DETERMINATION DE MASSES MOLECULAIRES

Exercise I:
A mixture of compounds is analyzed by LC-MS using an ESI MS instrument. Several peaks are
separated and observed on the chromatogram. Corresponding MS spectra for compounds 1 and 2
are presented Figure 1A and 1B respectively.

1. Using the given m/z on the two MS spectra determine the type of ions, its charge state and
calculate the Molecular weights of the 2 compounds.

charge state formula : n= [M2-1]/[M1-M2]

Mw formula : Mw= (m/z * n) - (n * M(H))

Compound1 : n= [466.25-1]/[931.50-466.25] = 1
so peak at 931.50 cationic ion [M+H]+ : n=1, peak at 466.25 [M+2H]2+ : n=2
Mw of compound1 = (931.50*1)-(1*1) = 930.50

Compound2 : n= [396.87-1]/[594.80-396.87] = 2
so peak at 594.80 [M+2H]2+: n=2, peak at 396.87 [M+3H]3+ : n=3,
peak at 1188.5 [M+H]+: n=1
Mw of compound2 = (1188.5*1)-(1*1) = 1187.5
best Mw= (396.87*3)-(3*1) = 1187.61

2. Knowing that the peak width at half maximum of the peak at m/z 594.80 (compound 2, Figure 1B)
is 0.25, determine the spectral resolution.
R= M/∆M1/2
R=594.8/0.25=2379.2

3. In a second step, LiCl is added to the solution prior to the LCMS analysis. For compound 1, ion at
m/z 466.25 is shifted to respectively m/z 469.23 and 472.20, and ion at 931.50 to m/z 937.45 and
943.41. Interpret the peak shifting observed under LiCl addition condition. (Mavg(Li)=6.94 u., Mavg
(Cl)=35.45 u.).

4 peaks are now visible : 469.23; 472.20; 937.45; 943.41

Li add 6.94 and Cl add 35.45 also Li is positive and Cl negative as Li+Cl-, in this exercice positive
ion are observed so only adding Li+,
Mw compound1 = 930.5
multiple adduct :
[M+Li+H]2+= (930.5+6.94+1)/2=469.22
[M+2Li]2+= (930.5+6.94+6.94)/2= 472.19
[M+Li]+= (930.5+6.94)/1= 937.44

943.41-937.44=5.96 => Li-H :6.94-1

[M+2Li-H]+= (930.5+6.94+6.94-1)/1 = 943.38

1
Figure 1. ESI MS spectra of compound 1 and 2.

1(%)
---------- 466.25
100

80

60.

40
466 467 468 930 932 934 936

20 MS spectrum of
931.50
compound 1

0
200 400 600 800 1600 m/z
1(%)
396.87
100

80

40

594 595 596 597

20.
MS spectrum of
compound 2
1188.5
1
0
200 400 600 8 1000 1200 m/z
Exercise II:
Ravindra Babu, J. Am. Soc. Mass Spectrom, (2001), 12, 317
A small protein, the bovine Ubiquitin is analyzed using ESI-MS on triple quadrupole instrument to get
the MW of the compound. The analysis is performed in the positive mode and the corresponding MS
spectrum is shown Figure 2. The MS Spectrum show a distribution of peaks.

855.8
778.3 951.2
1069.85
713.5
1222.3

1426.2
658.75 1711.1
611.6

Figure 2: MS spectrum in the positive of the Bovine Ubiquitin.

1. using the MS spectrum of Figure 1, determine the charge state of each peak and the type of
ion.
charge state formula : n= [M2-1]/[M1-M2]
Mw formula : Mw= (m/z * n) - (n * M(H))
n=[778.3-1]/[855.8-778.3]=10
855.8 : [M+10H]10+
Mw= (855.8*10)-(10*1)=8548

2. For each signal calculate the MW of the protein. In your opinion what
can explain the difference in the MW.
611.6 : (611.6*14)-(14*1)=8548.4
658.75 : (658.75*13)-(13*1)=8550.75
713.5 : (713.5*12)-(12*1)= 8550
778.3 : (778.3*11)-(11*1)= 8550.3
855.8 : (855.8*10)-(10*1)=8548
951.2 : (951.2*9)-(9*1)=8551.8
1069.85 : (1069.85*8)-(8*1)=8550.8
1222.3 : (1222.3*7)-(7*1)=8549.1
1426.2 : (1426.2*6)-(6*1)=8551.2
1711.1 : (1711.1*5)-(5*1)=8552.5

3. Deduce the average value of the MW.

Mwavg = 8550.285

Exercise III:
Gorshkov, J. Am. Soc. Mass Spectrom, (1998), 9,692
FT-ICR MS instruments have the particularity hat they can reach very high spectacles resolution
(>106). Carbonic anhydrase was studied using an ESI-FTICR instrument in the positive mode. The
recorded full MS spectrum of carbonic anhydrase is shown Figure 3.
1. Using Figure 3, attribute the charge state to the signals and recalculate the MW of
thecarbonic anhydrase
Q ·   
Mw= (1384.09 * 21) - 21 = 29044.89

2. Explain what this distribution corresponds to. Determine the charge state of the peak using
this distribution. The m/z values of the peaks are given in the enclosed table.
the figure 2 distribution is the isotopic distribution
calcul of the charge state : n= 1/∆M
n= 1/(1384.1524-1384.1048) = 1/0.0476 = 21

3. Using Figure 4, calculate the monoistopic (Mmono) and the average (Mavg) MW of carbonic
anhydrase.
Mmono = mass of the first peak = (1383.8190 * 21)-(21*1) = 29039.199
Mavg = (1384.1524*21)-(21*1) = 29046.2004

2
Figure 3: ESI-FTICR MS spectrum in the positive mode of carbonic anhydrase.

Pic N° M/z

7 1 1383,8190
8 9 2 1383,8667
10 3 1383,9143
6
11
5 4 1383,9619
4 12

3 13 5 1384,0095
2 14
1 15 6 1384,0571
16
7 1384,1048

8 1384,1524

9 1384.2001

10 1384,2476
Figure 4: Agrandissement du pic à m/z 1384.09 présent dans le spectre de la Figure 1 (spectre ESI-
FTICR en mode positif de la carbonic anhydrase de boeuf.

3
Exercice IV
A. G. Marshall, J. Prot Res. 2004, 3: 61
Certaines mutations peuvent impliquer une variation ponctuelle de la séquence en acides aminés des
protéines. La variation d’un seul acide aminé sur la séquence protéique peut être difficile à déterminer pour
certains acides aminés de masse proches. A ce titre, les analyses par spectrométrie de masse avec un
analyseur de type FT-ICR permet de caractériser ces mutations grâce à la résolution que peut atteindre ces
analyseurs.
La buforine est un peptide issu de la maturation de l’histone H2A. Ce peptide peut être présent sous deux
formes, une forme classique et une forme variante, correspondant à une variation ponctuelle dans la
séquence en acides aminés. Ce peptide est analysé sur un spectromètre de masse de type FT-ICR couplé à
une source ESI. Un agrandissement du spectre obtenu est présenté Figure 5. Sur l’agrandissement présenté
deux massifs de pics sont observés l’un autour de m/z 487 et le deuxième autour de m/z 609. Pour le
premier massif, le 1er pic de la distribution pour la Buforine II est observé à m/z 487,693865 alors que ce
même pic est observé à m/z 487,686585 pour la forme variante. Pour le deuxième massif, ces mêmes pics
sont observés à m/z 609,365375 et m/z 609,356275. Pour le premier massif, les 5 pics de la distribution
correspondant à la Buforine II sont présentés Tableau 1.
Buforine II Observed m/z
1ère
487.693865 487.894 488.1 488.29 488.5
distribution
2ème
609.3654 609.6154 609.86 610.115375 610.3654
distribution
Tableau 1 : m/z observés sur le spectre nano-ESI/FT-ICR pour la forme classique de la Buforine II

Figure 5 : Agrandissement du spectre nano-ESI/FT-ICR de la buforine 2 et de sa variante.

 1. Utiliser deux méthodes pour déterminer les états de charge des deux formes de la
buforine.

Buforine non mutée :

n = (487,693865 - 1)/(609,365375 - 487,693865) = 4
Buforine non muté est majoritaire dans le massif à 487 :
n = 1/∆M = 1/(487.894 - 487.693865) = 5

Buforine mutée :
n = (487,686585 - 1)/(609,356275 - 487,686585) = 4
Buforine mutée est majoritaire dans le massif à 609 : n=1/∆M = 1/(609.6154-609.3654) = 4
Buforine muté à 487 = [M+(n+1)(H)]n+1 = +5

2. En déduire la masse monoisotopique des deux formes de la buforine. Vous

prendrez 1,007825 pour la masse de H

Buforine non mutée plus représentative à 487 donc à n= +5

Mmono= (m/z * n) - (n * M(H)) = (487,693865 * 5) - (5 * 1,0078) = 2 433,4302

Buforine mutée plus représentée à 609 donc à n= +4

Mmono=(609,356275 * 4) - (4 * 1,007825) = 2 433,3938

3. A partir de la différence de masse entre les deux formes, en déduire l’acide aminé
substitué.

différence de masse = 2433,4302 - 2433,3938 = 0,0364

Lysine - Glutamine = 128.094963050 - 128.058577540 = 0,03638551

EXERCICE VI
Dyachenko and al., Anal Chem. 2015 87(12): 6095-6102

Les anticorps occupant une place centrale dans la pharmacologie moderne. Actuellement
différents conjugués médicament-anticorps thérapeutiques sont à l’étude et montrent des résultats
prometteurs pour le traitement de différents types de cancer. Ces conjugués augmentent
l’applicabilité thérapeutique de petits composés organiques hautement toxiques en les couplant sur
des anticorps monoclonaux visant les cellules cibles. Les médicaments sont couplés à l’anticorps par
des lysines ou des cystéines naturellement présentes sur les chaînes des anticorps. La réaction de
couplage donne naissance à des espèces hétérogènes relativement au nombre de composés
organiques fixés sur l’anticorps. C’est le cas du Brentuximab Vedotin qui est un conjugué anticorps-
médicament indiqué dans le traitement du lymphome hodgkinien. Le Monomethyl auristatin E
(MMAE) est un agent antimitotique hautement toxique qui ne peut être utilisé seul du fait de sa toxicité
et est donc conjugué à un anticorps monoclonal antiCD30 permettant de cibler les cellules atypiques
présentes dans les lymphomes hodgkinien qui portent l’antigène CD30 à leur surface. La forme
complète du MMAE avec son groupement photoclivable et son groupe de liaison est nommée Vedotin
(Figure 6).

4
Figure 6 : Représentation schématique du couplage d’une molécule de Vedotin sur l’anticorps
Brentuximab qui est un anticorps monoclonal anti-CD30.

Il est important de pouvoir contrôler le nombre de médicaments conjugués au Brentuximab afin

de caractériser les formes les plus actives. Des études sont réalisées par spectrométrie de masse
sur les conjugués entiers sur un instrument équipé d’une source ESI couplé à un analyseur hybride
de type Q-Orbitrap permettant d’accéder à la haute résolution spectrale et la haute précision de
mesure. Les analyses sont réalisées en mode positif après la réaction de couplage sur le mélange
produit soit l’anticorps avec un nombre variable de molécules de Vedotin. Il faut préciser que les
espèces générées présentent un nombre pair de molécules de Vedotin (Mw=1318.20 u.) et que
l’anticorps seul sans Vedotin est également observé. Le spectre du mélange de conjugués est
présenté Figure 2. Cinq séries de pics (représentées par des symboles et des couleurs différentes)
sont observés sur le spectre MS. La Figure 3 présente le spectre MS de l’un des conjugué particulier
qui a été isolé (série représentée par le symbole §).

Le Tableau 2, reprend l’ensemble des signaux observés pour chaque série

Série orange Série verte Série rouge Série violette Série bleue
(*) (%) (#) (@) (§)
m/z
5788.44 5889.82 5991.15
5808.98 5914.43 6019.94 6125.37 6230.75
6050.98 6160.82 6270.73 6380.55 6490.32
6314.03 6428.64 6543.33 6657.93 6772.47
6600.98 6720.80 6840.70 6960.51 7080.26
6915.26 7040.79 7166.40 7291.92
7260.98 7392.78 7524.67
Tableau 2 : m/z extraits de cinq séries de pics observées pour le mélange des 5 conjugués anticorps-
médicament présentant un nombre de Vedotin différent couplé à l’anticorps.
1. Expliquer à quoi correspondent les cinq séries de pics observées Figure 2 compte-tenu
de l’instrument utilisé pour les analyses.

on observe dans les 5 série la répartition de charge de chaque forme de l’anticorps conjugé

2. Quelle aurait été l’allure du spectre sur un instrument équipé d’une source MALDI.

En MALDI peu ou pas de multichargé pour 5 molécule nous aurions donc eu 5 pics
principaux représentant le pic monochargé
il faut toutefois considérer la possibilité de retrouver quelques multi-chargée [M+2H]2+ et des
adduits de matrice [M+m+H]+

3. Expliquer comment à partir de ces séries de signaux il est possible de

remonter à l’attribution des pics puis au calcul de la masse.

grâce à la répartition des charges nous pouvons appliquer la formule n=(M2-1)/(M2-M1)

une fois "n" déterminé on peut retrouvé Mw=(m/z*n)-(n*H)

4. Calculer la masse moléculaire Mw de chacun des conjugués à l’aide des données

du Tableau 1 et des Figure 2 et 3.

série orange : n=(5808,98-1)/(6050,98-5808,98) = 24 ; Mw = (6050,98*24)-(24*1) =

145 199,52
Série Verte : n=(5914,43-1)/(6160,82-5914,43) = 24 ; Mw = (6160,82*24)-(24*1) =
147 835,68
Série rouge : n=(5788,44-1)/(6019,94-5788,44) = 25 ; Mw = (6019,94*25)-(25*1) =
150 473,5
Série violette : n=(5889,82-1)/(6125,37-5889,82) = 25 ; Mw = (6125,37*25)-(25*1) =
153 109,25
Série bleue : n=(5991,15-1)/(6230,75-5991,15) = 25 ; Mw = (6230,75*25)-(25*1) =
155 743,75

5. Déterminer pour chaque espèce le nombre de molécules de Vedotin conjuguée.

l'Ac seul doit être la masse la plus petite donc la série orange Mw= 145199,52
la série verte présente une différence de masse de 2636.16 = (2*1318.08) avec l'Ac seul
donc = Ac+2Vedotin
La série rouge présente une différence de 5 273,98 avec l'Ac seul, 5 273,98/1318,20 = 4
donc = Ac+4Vedotin
la série violette présente une différence de masse de 7 909,73 avec l'Ac seul,
7 909,73/1318,20 = 6 donc = Ac+6Vedotin
La série bleue présente une différence de masse de 10 544,23 avec l'Ac seul,
10 544,23/1318,20 = 8 donc = Ac+8Vedotin

6. En déduite à quel nombre de molécules de Vedotin correspond le conjugué le

plus représenté après la réaction de couplage