EtNA ERAUZKETA

METODOA
E.Coli bakterioaren DNA-ren erauzketa eta kalitate kontrola egin EtNA
erauzketa metodoa erabiliz.

MATERIALAK EKIPOAK
Nanodrop
Prezipitatu ontziak Bloke termikoa
Hagaxka Eppendorf zentrifuga
Erloju beira txikia eta handia Saihodietarako zentrifuga
Espatula Balantza
Pipeta pasteur
Saihodiak (Falcon) ERREAKTIBOAK
Mikropipeta (10-100μL)
Mikropipeta (100-1000μL) EtNA disoluzioa: PBS disoluzioa:
Mikropipeta puntak NaOH NaCl
Eppendorf-ak Ethanol 96% KCl
EDTA Na2HPO4
Analisi ura KH2PO4

PROZEDURA

Zentrifugatu: Ganjalkina kendu 1mL

E.Coli kultibo batetik
4400 rpm-tara Pellet 1,5mL

1
1,5 mL falcon sahiodira
bota
30 minutuz
2 ganjalkinarekin
berreski 3
2,5mL 1mL 1,5mL

Eppendorf batera Zentrifugatu:

Gainjalkina kendu eta
pasatu eta zentrifugatu: 13000g-tara
pelleta berresiki PBS
13000g-tara
5 minutuz 4 1X pH 7,4 1ml-tan
5 5 minutuz
6
PBS

Gainjalkina kendu. Pelleta berresiki: Bloke termikoan:

PBS 1X-ko 100μL-tan 80ºC / 10 minutuz

7 Etna 455μL-tan

PBS
8 9
EtNA

Zentrifugatu: Gainjalkina kendu NanoDrop-ean

16060g-tara eta ur analisi 100μL- neurtu.
10 minutuz
10
tan berresiki.
11 Kalitate kontrola
12

EMAITZAK

260/280 260/230 Kontzentrazioa

LAGINA 1 1,72 A 0,52 A 68,7 ng/μL

LAGINA 2 1,74 A 0,50 A 75,7 ng/μL

KALITATE KONTROLA EMAITZEN INTERPRETAZIOA

-Absorbantzia 260/ Absorbantzia 280=kutsatzaile nagusiak
- ≥ 1,8 - 2,1 → Purutasun optimoa
- ≥ 1,6 - 1,7 → Purutasun egokia
- < 1,6 → DNA kutsatua konposatu aromatikoekin
- > 2,1 → DNA kutsatua RNA-arekin
Nanodropean bi laginen absorbantziak neurtuz gero, esan
dezakegu, 260/280 absorbatzia ikusita, biek purutasun
egokia dutela, absorbantzia ≥1,6 - 1,7 baino gehiago
dutelako (1,72 eta 1,74), beraz ez daude kutsatuta
kutzatzaile nagusiekin.

-Absorbantzia 260/ Absorbantzia 230= kutsatzaile ahulak
- > 2-2,2 → Purutasun optimoa
- > 1,8 → Purutasun egokia
- < 1,8 → DNA kutsatua (gatzak,fenol eta karbohidratoekin)
- < 1,5 → DNA kutsatua (gatzak,fenol eta karbohidratoekin)
260/230 absorbatzian aldiz, biek DNA gatz, fenol eta
karbohidratoekin kutsatuta daude, absorbantzia < 1,5
baino gutxiago dutelako (0,52 eta 0,50). Ziurrenik, hau
gertatu da, PBS-a gatz disoluzioa delako, beraz hau
gehitzerakoan arraztoak laginean geratu daitezke.

LKB2_G1_R1_E5.5
Imanol Pérez - Naroa Ferro - Bego Gonzalez- Irati Salutregui