Advances in Protein Chemistry and

Structural Biology: Protein Misfolding

Donev
Visit to download the full and correct content document:
https://ebookmass.com/product/advances-in-protein-chemistry-and-structural-biology-
protein-misfolding-donev/
Advances in Protein Chemistry
and Structural Biology

Protein Misfolding

Editor

Rossen Donev
Head of Research MicroPharm Ltd, Newcastle Emlyn, Carmarthenshire,
United Kingdom
Table of Contents

Cover image

Title page

Copyright

Contributors

Chapter One. Theoretical and computational advances in protein

misfolding

1. Introduction

2. Mechanism of protein misfolding

3. Simulations: atomistic and coarse grained models

4. Atomistic simulations of early-stages monomers, small

oligomers and end products of aggregation

5. Coarse grained models

6. Conclusions
Chapter Two. Combining molecular dynamics simulations and
experimental analyses in protein misfolding

1. Introduction

2. Basic concepts of protein misfolding and aggregation

3. Biophysical analyses of protein misfolding

4. Molecular simulations of misfolding proteins

5. Integrative approaches in understanding misfolding and

aggregation

6. Open questions and challenges

Chapter Three. Mass spectrometric approaches for profiling protein

folding and stability

1. Introduction

2. Terminology

3. Quantitation in mass spectrometry

4. Fractionation methods for characterizing the destabilized

proteome

5. Enzymatic methods for identifying protein stability

6. Exploiting chemical reactivity to characterize protein stability

7. Summary

Chapter Four. The intrinsic and extrinsic factors that contribute to

proteostasis decline and pathological protein misfolding
 1. The proteostasis network

2. Genetic variation underlies differences in cellular proteostasis

3. Errors in transcription and translation are a source of

proteotoxic stress

4. Proteostasis and disease

5. The inflammatory response and proteostasis

6. Environmental effects on proteostasis and disease

7. Discussion and outlook

Chapter Five. Functional and dysfunctional folding, association and

aggregation of caseins

1. Introduction and overview

2. Linear functional motifs in caseins

3. Caseins are not hydrophobic proteins

4. Caseins are intrinsically disordered proteins

5. Caseins bind to and sequester calcium phosphate

6. Caseins can act as molecular chaperones

7. Caseins can form amyloid fibrils

8. Caseins can form dynamic, fuzzy complexes

9. Casein micelles are non-stoichiometric, fuzzy complexes

10. Functional and dysfunctional interactions of caseins in the

casein micelle
 11. Concluding remarks

Chapter Six. Protein misfolding in endoplasmic reticulum stress with

applications to renal diseases

1. Introduction

2. ER stress in renal diseases

3. Therapeutic options for the treatment of kidney diseases

involving protein misfolding

Chapter Seven. Misfolding of vasopressin receptors: biased agonist

pharmacochaperones as potential therapeutics

1. Biased ligands and pharmacological chaperones for G

protein-coupled receptors

2. Misfolded arginine-vasopressin V2 receptors and congenital

nephrogenic diabetes insipidus (cNDI): an avenue for
pharmacological chaperone therapy

3. Biased agonist pharmacochaperones: promising therapeutics

for treating cNDI

4. Insights from pharmacochaperone high-throughput screening

studies and V2 structural studies

5. Conclusions

Chapter Eight. LOXL1 folding in exfoliation glaucoma

1. Introduction

2. Macroscopic, structural and biochemical features of XFG

 3. LOXL1 variants and XFG risk

4. LOXL1 autophagy and LOXL1 in XFG patient cells

5. LOXL1 and intrinsic disorder

6. The role of the IDR in LOXL1 aggregation

7. Summary

Chapter Nine. Liquid-liquid phase transitions and amyloid

aggregation in proteins related to cancer and neurodegenerative
diseases

1. Introduction

2. Phase separation terminology in biomolecular systems

3. Molecular determinants involved in PS/transition and

regulation

4. The functionalities of PS/transitions in physiology and disease

5. Methodological approaches to detect PS

6. Perspectives

Chapter Ten. Cytotoxic species in amyloid-associated diseases:

Oligomers or mature fibrils

1. Introduction

2. Protein folding misfolding and aggregation

3. Structural features of amyloid fibrils and oligomers

4. Techniques used to characterize oligomer and mature fibrils

 5. Cytotoxicity of Oligomer and mature fibril

6. Mechanism of cytotoxicity

7. Conclusion

Chapter Eleven. Misfolded proteins as a therapeutic target in

Alzheimer's disease

1. Alzheimer's disease

2. Forms of Alzheimer's dementia

3. Amyloid-β

4. The amyloid hypothesis: fact or folly

5. Tau protein

6. Conclusions & future outlook

Chapter Twelve. Influence of the reducing environment in the

misfolding of wine proteins

1. Introduction

2. Protein instability

3. A case study: effects of reducing agent on VVTL1

4. Outlook
Copyright
Academic Press is an imprint of Elsevier
125 London Wall, London EC2Y 5AS, United Kingdom
525 B Street, Suite 1650, San Diego, CA 92101, United States
50 Hampshire Street, 5th Floor, Cambridge, MA 02139, United States
The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GB, United
Kingdom

First edition 2020

Copyright © 2020 Elsevier Inc. All rights reserved.

No part of this publication may be reproduced or transmitted in any

form or by any means, electronic or mechanical, including
photocopying, recording, or any information storage and retrieval
system, without permission in writing from the publisher. Details on
how to seek permission, further information about the Publisher’s
permissions policies and our arrangements with organizations such
as the Copyright Clearance Center and the Copyright Licensing
Agency, can be found at our website:
www.elsevier.com/permissions.

This book and the individual contributions contained in it are

protected under copyright by the Publisher (other than as may be
noted herein).

Notices
Knowledge and best practice in this field are constantly changing.
As new research and experience broaden our understanding,
changes in research methods, professional practices, or medical
treatment may become necessary.

Practitioners and researchers must always rely on their own

experience and knowledge in evaluating and using any
information, methods, compounds, or experiments described
herein. In using such information or methods they should be
mindful of their own safety and the safety of others, including
parties for whom they have a professional responsibility.

To the fullest extent of the law, neither the Publisher nor the
authors, contributors, or editors, assume any liability for any injury
and/or damage to persons or property as a matter of products
liability, negligence or otherwise, or from any use or operation of
any methods, products, instructions, or ideas contained in the
material herein.

ISBN: 978-0-12-817750-1

ISSN: 1876-1623

For information on all Academic Press publications visit our

website at https://www.elsevier.com/books-and-journals

Publisher: Zoe Kruze

Acquisition Editor: Ashlie Jackman
Editorial Project Manager: Leticia M. Lima
Production Project Manager: Abdulla Sait
Cover Designer: Greg Harris

Typeset by TNQ Technologies

Contributors
Parvez Alam Interdisciplinary Biotechnology Unit, Aligarh
Muslim University, Aligarh, India

Sara Amidian
Department of Biochemistry, University of Alberta, Edmonton,
Canada
Centre for Prions and Protein Folding Diseases, University of
Alberta, Edmonton, Canada

Alan Bakalinsky Department of Food Science and Technology,

Oregon State University, Corvallis, Oregon, United States

Audrey M. Bernstein SUNY Upstate Medical University,

Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Syracuse, NY,
United States

Parbati Biswas Department of Chemistry, University of Delhi,

Delhi, India

John A. Carver Research School of Chemistry, The Australian

National University, Acton, ACT, Australia

Yraima Cordeiro Faculty of Pharmacy, Federal University of Rio

de Janeiro, Rio de Janeiro-RJ, Brazil

Andrea Curioni
Department of Agronomy, Food, Natural Resources, Animals and
Environment (DAFNAE), University of Padua, Legnaro (PD), Italy
Centre for Research in Viticulture and Enology (CIRVE), Conegliano
(TV), Italy

Guilherme A.P. de Oliveira

Programa de Biologia Estrutural, Instituto de Bioquímica Médica
Leopoldo de Meis, Instituto Nacional de Biologia Estrutural e
Bioimagem, Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri
Jonas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ,
Brazil
Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of
Virginia, Charlottesville, VA, United States

Jeffrey G. Dickhout Department of Medicine, Hamilton Centre

for Kidney Research, McMaster University and St. Joseph's
Healthcare Hamilton, Hamilton, ON, Canada

Lyudmyla Dorosh Department of Electrical and Computer

Engineering, University of Alberta, Edmonton, Canada

Joseph C. Genereux Department of Chemistry, University of

California, Riverside, CA, United States

Carl Holt Institute of Molecular, Cell and Systems Biology,

University of Glasgow, Glasgow, United Kingdom

Claudia Honisch
Institute of Biomolecular Chemistry of CNR, Padua Unit, Padova,
Italy
Department of Chemical Sciences, University of Padua, Padova, Italy

Rizwan Hasan Khan Interdisciplinary Biotechnology Unit,

Aligarh Muslim University, Aligarh, India

Elise A. Kikis Biology Department, The University of the South,

Sewanee, TN, United States
S. Imindu Liyanage Krembil Research Institute, University
Health Network, Toronto, ON, Canada

Nabeela Majid Interdisciplinary Biotechnology Unit, Aligarh

Muslim University, Aligarh, India

Sadia Malik Interdisciplinary Biotechnology Unit, Aligarh

Muslim University, Aligarh, India

Matteo Marangon
Department of Agronomy, Food, Natural Resources, Animals and
Environment (DAFNAE), University of Padua, Legnaro (PD), Italy
Centre for Research in Viticulture and Enology (CIRVE), Conegliano
(TV), Italy

Christiane Mendre Institut de Génomique Fonctionnelle, CNRS,

INSERM, Université de Montpellier, Montpellier, France

Bernard Mouillac Institut de Génomique Fonctionnelle, CNRS,

INSERM, Université de Montpellier, Montpellier, France

Samera Nademi Department of Medicine, Hamilton Centre for

Kidney Research, McMaster University and St. Joseph's Healthcare
Hamilton, Hamilton, ON, Canada

Robert Ritch Einhorn Clinical Research Center, New York Eye

and Ear Infirmary of Mount Sinai, New York, NY, United States

Paolo Ruzza Institute of Biomolecular Chemistry of CNR, Padua

Unit, Padova, Italy

Gerold Schmitt-Ulms Laboratory Medicine and Pathobiology,

University of Toronto, Toronto, Canada

Mohammad Khursheed Siddiqi Interdisciplinary Biotechnology

Unit, Aligarh Muslim University, Aligarh, India
Jerson L. Silva Programa de Biologia Estrutural, Instituto de
Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Instituto Nacional de Biologia
Estrutural e Bioimagem, Centro Nacional de Ressonância Magnética
Nuclear Jiri Jonas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de
Janeiro, RJ, Brazil

Maria Stepanova Department of Electrical and Computer

Engineering, University of Alberta, Edmonton, Canada

Tuane C.R.G. Vieira Programa de Biologia Estrutural, Instituto

de Bioquímica Médica Leopoldo de Meis, Instituto Nacional de
Biologia Estrutural e Bioimagem, Centro Nacional de Ressonância
Magnética Nuclear Jiri Jonas, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazil

Simone Vincenzi
Department of Agronomy, Food, Natural Resources, Animals and
Environment (DAFNAE), University of Padua, Legnaro (PD), Italy
Centre for Research in Viticulture and Enology (CIRVE), Conegliano
(TV), Italy

Donald F. Weaver
Krembil Research Institute, University Health Network, Toronto,
ON, Canada
Departments of Medicine (Neurology), Chemistry and
Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, Toronto, ON,
Canada

Holger Wille
Department of Biochemistry, University of Alberta, Edmonton,
Canada
Centre for Prions and Protein Folding Diseases, University of
Alberta, Edmonton, Canada
Neuroscience and Mental Health Institute, University of Alberta,
Edmonton, Canada
J. Mario Wolosin Eye and Vision Research Institute, Department
of Ophthalmology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New
York, NY, United States
CHAPTER ONE

Theoretical and computational

advances in protein misfolding
Parbati Biswas ∗ Department of Chemistry, University of Delhi, Delhi, India
∗ Corresponding author: E-mail: pbiswas@chemistry.du.ac.in

Abstract
Misfolded proteins escape the cellular quality control
mechanism and fail to fold properly or remain correctly folded
leading to a loss in their functional specificity. Thus misfolding
of proteins cause a large number of very different diseases
ranging from errors in metabolism to various types of complex
neurodegenerative diseases. A theoretical and computational
perspective of protein misfolding is presented with a special
emphasis on its salient features, mechanism and consequences.
These insights quantitatively analyze different determinants of
misfolding, that may be applied to design disease specific
molecular targets.

Keywords
Energy landscape; Amyloid fibril; Self-assembly; Aggregation;
Coarse-grained models; Simulation

1. Introduction
Protein misfolding is a natural consequence of protein folding where
the polymeric sequence of amino acids fold into a well-defined three
dimensional functional native state in the cellular environment. For
globular proteins, the native state represents the most stable
structure under physiological conditions. Protein folding is vital for
executing proper cellular functions. Folding of a polypeptide chain
involves a directed search through the vast conformational space to
reach the native state. The process of folding relies on the correct
interactions involving a small subset of the residues of a protein.
Intrinsic conformational fluctuations in a protein enable different
residues, which are far apart in the polypeptide chain, to come in
contact with one another. The native contacts stabilize the protein
relative to the non-native ones, as the favorable enthalpy of such
contacts, arising from the decrease in internal energy, balances the
decreasing entropy and helps the protein to achieve the desired
native conformation. Experimental and theoretical studies have
established that most proteins fold via funnel-like rugged free-
energy landscapes, that are encoded in the amino acid sequence of
the protein, constrained by the rules of natural selection
(Frauenfelder, Sligar, & Wolynes, 1991; Wolynes et al., 1995).
The energy landscape theory provides a statistical description of
the thermodynamics and kinetics of protein folding. The folding
energy landscape comprises all accessible protein conformations
present in the folding pathway. Due to the restricted covalent
connectivity of the protein backbone, various non-covalent
interactions (Dill, 1990) present in the protein are not simultaneously
optimized making the energy surface frustrated (Wolynes et al.,
1995). Frustration in proteins arises from these competing
interactions that are not satisfied simultaneously. The native state
represents the minimally frustrated (Bryngelson & Wolynes, 1987;
Ferreiro, Hegler, Komives, & Wolynes, 2007) conformation which
lies at the global free energy minimum (Anfinsen, 1973). Under
native conditions, a protein has a complex conformational manifold
with innumerable near-native conformations residing at various
local minima close to the native conformation, molding a dauntingly
rugged landscape (Fig. 1). However, naturally occurring proteins are
minimally frustrated and surmount this rugged energy terrain to
fold reversibly to their unique native states.
 y q

FIG. 1 A schematic representation of the energy landscape

of protein folding, misfolding and aggregation.

The partly unfolded near-native conformations differ from the

native fold only at some positions of the amino acid residues. While
the native states of most globular proteins are well characterized,
little is known about the rarely populated near-native ensemble. This
is partly due to the fact that each of these individual conformations
hardly affects the macroscopic properties and it is difficult to assess
their respective contributions experimentally (Mello & Barrick,
2004). Recent experimental techniques like hydrogen exchange (Bai,
Sosnick, Mayne, & Englander, 1995; Chamberlain, Handel, &
Marqusee, 1996; Englander, 2000) and NMR relaxation (Volkman,
Lipson, Wemmer, & Kern, 2001; Yang & Kay, 1996) and molecular
dynamics (MDs) simulations (Alonso, DeArmond, Cohen, &
Daggett, 2001; Voelz, Bowman, Beauchamp, & Pande, 2010) confirm
the existence of such conformational states. The ensemble of
partially folded conformations, which are thermodynamically
distinct, but are comparable to the energy of the native state, may be
transiently populated under native conditions (Tang & Dill, 1999).
Folding or refolding to such conformations has important
implications in drastically altering protein functions, particularly
responsible for allosteric regulation of enzymes and site-to-site
communication in the cell. Characterizing the nature of these
partially formed native-like structures constitutes the first step in
understanding the relative stability of the misfolded states,
mechanism of misfolding and the factors which promote misfolding.
Partly or completely misfolded proteins are often involved in
various cellular functions like signal transduction, translocation
across membranes, transcription and cell cycle regulation. These
near-native conformational states reside at various local minima in
the free energy landscape, separated from the native state by a
relatively low-energy barrier as shown in Fig. 1. Due to changes in
solution conditions such as low pH, changes in temperature and
pressure or an unwanted mutation in the amino acid sequence or
any changes resulting from an inherited or acquired gene variation,
a protein may fold into any of these conformations, instead of the
native one. Such proteins are recognized as misfolded because of
improper folding and are subsequently targeted to a degradation
pathway.
The specificity of misfolding depends on the nature of the protein,
the efficacy of folding and degradation mechanisms, cellular and
environmental conditions and various interacting genetic factors.
Mutations in the amino acid sequence also alter the folding ability by
changing the folding energetics (Cohen & Kelly, 2003). Most proteins
fold primarily in the cytoplasm, while others fold in the
mitochondria or endoplasmic reticulum after translocation via
membranes. The endoplasmic reticulum contains molecular
chaperones, which assist in folding proteins either by non-specific
binding to the protein or by catalyzing folding at later stages, while
the respective proteins are evaluated by a stringent quality control
mechanism before it is released in the extracellular environment
(refer to Fig. 2). Eukaryotic cells possess an extensive network of
components to maintain protein homeostasis (or proteostasis) that
governs the cellular concentration, folding and localization of
proteins (Labbadia & Morimoto, 2015), However, when the
intracellular proteins or the newly synthesized proteins are unable to
fold efficiently, the cell activates protein quality control system that
facilitates the refolding of misfolded proteins or degradation of
incorrectly folded proteins through molecular chaperones and
proteasomes (Hipp, Park, & Hartl, 2014). Degradation in cells
involve an alternative way of eliminating protein aggregates through
molecular chaperones (see Fig. 2).

FIG. 2 Schematic diagram of the different stages in protein

folding and misfolding.

Typically, the long-lived proteins are degraded by lysosomes,

while proteosomes are responsible for the degradation of short-lived
proteins (Jackson & Hewitt, 2016). However, if the generation of the
misfolded proteins exceeds the cellular degradative or refolding
capacity causing an imbalance in the protein homeostasis (imbalance
of correctly and incorrectly folded proteins), they assemble as
aggregates. Thus, the successive failure to degrade misfolded
proteins or dysfunction of the degradation pathways may result in
aggregated assemblies that are associated with various human
disorders, aging, perturbed cellular functions eventually leading to
cell death (Koike et al., 2010). Thus a large number of very different
diseases ranging from errors in metabolism to various types of
complex neurodegenerative diseases may be attributed to protein
misfolding (Dobson, 2002, 2003). Some of the common misfolding
diseases include amyloidosis, Alzheimer's disease, Parkinson's
disease, Creutzfeldt-Jakob disease, type II diabetes and some forms
of cancer. While some maladies like cystic fibrosis result from the
incorrect folding of the protein, others like amyloidoses, Parkinson's
and Alzheimer's disease occur due to the deposition of specific
proteins in some organs and tissues. Such misfolding diseases
caused by the accumulation of soluble proteins outside the cell
culminates in protein aggregation associated with toxic effects
which, in some cases, lead to biochemical dysfunction and cell death
(Cohen & Kelly, 2003; Selkoe, 1999).

2. Mechanism of protein misfolding

When proteins are exposed to specific environmental changes like
high temperature and concentration, acidic or basic pH, elevated
glucose levels or oxidative agents, their native structure is disrupted
with a loss of functionality. Such a protein may be either misfolded
or unfolded depending upon the number of non-native interactions
between residues that differ from that of the native state. Most
experimental studies suggest that protein misfolding follows
‘nucleation growth’ mechanism (Bitan et al., 2003; Scherzinger et al.,
1999). The exposure of hydrophobic residues in an incompletely
folded chain may induce inappropriate contacts with other
molecules in the local environment. In such cases, transient non-
native interactions may arise to bury these hydrophobic residues in
the protein core. This process of aggregation is initiated by the
exposed hydrophobic residues on the protein surface, β-sheet
propensity and low net charge. These localized segments form
oligomers as intermediates, which comprise either amorphous
clusters or crystalline fibrils that act as precursors anchoring
aggregation (refer to Fig. 3). The precursors may be generated either
due to incomplete or incorrect proteolysis or a mutated protein,
which generates an ensemble of oligomers that form aggregates
(Herczenik & Gebbink, 2008). Often these aggregates possess well-
defined crystalline structures comprising intermolecular β-sheets,
known as amyloid fibrils.

FIG. 3 Schematic diagram illustrating various stages of

aggregation.
Modified from Fig. 2 of Morriss-Andrews, A., & Shea, J.-E. (2015).
Computational studies of protein aggregation: Methods and
applications. Annual Review of Physical Chemistry, 66, 643–666.

Amyloid fibril formation occurs through nucleation-dependent

polymerization (Harper & Lansbury, 1997; Soto, Estrada, & Castilla,
2006), which explains the formation of oligomers via a slow lag
phase followed by polymerization. The templated assembly (Esler et
al., 2000; Nguyen, Li, Stock, Straub, & Thirumalai, 2007) process
comprises a series of unfavorable interactions between monomers in
the slow lag phase to yield an oligomeric nucleus with minimal
thermodynamic stability, which subsequently acts as a scaffold for
the formation of larger aggregates. The initial association of
monomers in the slow lag phase is energetically unfavorable,
however once the oligomeric seed of a critical size is formed, rapid
aggregation becomes thermodynamically favorable. The nucleation
rate depends partly on the change in the free energy of nucleation,
. However, the order of the overall nucleation reaction depends
on each constituent second order association reactions, which may
contribute cumulatively to the formation of the critical nucleus, since
some of these individual reactions are expected to be rate controlling
(Eigen, 1996). An oligomer of a critical size passes through a
maximum value of to form a nucleus. The number of molecules
in the critical nucleus depends on the monomer concentration, the
equilibrium rate constant of monomer-monomer and monomer-fibril
association and the protein solubility (Bader, Bamford, Zurdo, Luisi,
& Dobson, 2006). The slow lag phase may be eliminated by seeding,
where the preformed aggregates are added to the protein solution.
In some cases, aggregation is triggered by the chemically modified
forms of proteins that results from deamidation or oxidative stress
(Nilsson, Driscoll, & Raleigh, 2002).
The conversion from the normal to the abnormal prion proteins in
prion diseases usually follow this nucleation growth mechanism
(Soto, 2012; Soto et al., 2006). Another model proposed for protein
misfolding is the ‘nucleated conformational conversion’ model. The
first step involves the conversion of the native monomer to a
misfolded conformation that initiates self-assembly and forms
molten oligomers (Serio et al., 2000). These oligomers then
reorganize themselves to undergo structural changes yielding
amyloid-like oligomers that act as the nucleus. This nucleus then
triggers the formation of aggregates like other molten oligomers,
which acquire amyloid conformations through the induced-fit
 q y g
mechanism (Serio et al., 2000), subsequently yielding higher order
oligomers and fibrils. Unlike the nucleation growth mechanism,
where the rate limiting step is the formation of the nucleus, the
nucleated conformational conversion is characterized by the rapid
formation of oligomers, where the rate limiting step involves the
conversion of the misfolded oligomer into amyloid oligomers.

3. Simulations: atomistic and coarse grained

models
Characterizing various structural and dynamical properties of
misfolded proteins and aggregates is a major challenge of structural
biology. Despite significant experimental advances in understanding
the misfolding mechanism and fibril formation (Bemporad & Chiti,
2012; Williams & Pukala, 2013), other structural and dynamical
aspects of aggregated proteins are often difficult to measure as
experimental techniques are limited by the size of proteins and the
time required to form aggregates. Computer simulations are also
fraught with limitations with respect to the time and length scales
associated with these processes. Nevertheless, they are particularly
useful in probing the initial stages and the end-product of protein
misfolding and aggregation in a detailed manner with fully
atomistic protein models (Dupuis, Wu, Shea, & Bowers, 2011). A
detailed study of the entire protein misfolding process, starting from
small oligomers to the formation of large aggregates (or mature
fibrils), is computationally too expensive to permit sufficient
sampling at longer times.
Simulations of the detailed pathways of misfolding are mostly
limited to small peptide segments (Matthes, Gapsys, & de Groot,
2012; Thirumalai, Reddy, & Straub, 2011) and have not been
observed for large proteins due to high computational cost and
sparse conformational sampling. However, it is necessary to
simulate a sufficient number of complete protein chains to
comprehend both mechanism of formation of oligomers in early
stages and aggregation or fibril formation (Li, Uversky, & Fink,
2001). Several studies also point out the fact that the native structure
predictions during the protein folding are reliable for shorter
proteins rather than the longer ones due to restricted conformational
sampling (Lindorff-Larsen, Piana, Dror, & Shaw, 2011; Nguyen,
Maier, Huang, Perrone, & Simmerling, 2014; Shaw et al., 2007).
Atomistic simulation studies of predicting the native structures of
long proteins with time scales varying between to hours, is a
daunting task with present-day computational resources, as the
folding time exponentially increases with the protein size
(Naganathan & Muñoz, 2005). Thus, investigating protein
misfolding and aggregation of full length proteins with a wide
window of time scale, varying between to years, poses a
formidable challenge for simulations, which is beyond the scope of
existing computing facility. In this regard, coarse grained models
(high resolution models with less details) compromise atomistic
details (by neglecting some of the atomistic degrees of freedom) and
accuracy at the expense of simplified calculations with a significantly
faster convergence (Ingólfsson et al., 2014), with a deeper insight into
the generic features of aggregation/fibril formation.
Coarse-grained models yield qualitatively similar folding free
energy landscapes, as compared to those obtained through detailed
atomistic simulations (Coluzza, Muller, & Frenkel, 2003; Shaw et al.,
2010). However, coarse grained models are less accurate relative to
the fully atomistic models, as most of these models use a
combination of knowledge-based and physics-based potentials.
However, such models allow the study of much larger systems by
accessing a broad range of length and time scales that are
inaccessible to the atomistic models. Different coarse-grained and
atomistic models that are adapted in theory and simulations are
schematically shown in Fig. 4. In following sections, some of the key
findings in protein misfolding embodied in coarse grained and
traditional all atom models are discussed.
 FIG. 4 Different coarse-grained and atomistic models in
theory and simulations.

4. Atomistic simulations of early-stages

monomers, small oligomers and end products of
aggregation
Since aggregation originates from monomers, understanding
monomers and small oligomers in atomic details may reveal the
mode of self-assembly of nontoxic monomers to form disease-
causing toxic species. Structural analysis of the monomer, initiation
of aggregation and oligomerization is typically achieved through
enhanced sampling techniques such as Replica Exchange Molecular
Dynamics (REMD), simulated tempering and metadynamics. While
REMD (Sugita & Okamoto, 1999) involves running multiple replicas
of a system at different temperatures with periodic exchange of
configurations among these replicas based on a Metropolis criterion,
metadynamics (Laio & Parrinello, 2002) uses a history dependent
bias, which compels the system to sample the rarely visted regions of
the free energy landscape. Initial studies on protein misfolding were
performed with implicit solvent models (Khandogin & Brooks, 2007;
Lam, Teplow, Stanley, & Urbanc, 2008; Santini, Mousseau, &
Derreumaux, 2004), on small protein segments, which included the
classical MD simulations of the peptide segment 21–30 of amyloidβ
(Aβ) peptide (Fawzi et al., 2008), Replica-Exchange Molecular
Dynamics (REMDs) simulations of the fragment 15–28 of Aβ peptide
(Baumketner, Krone, & Shea, 2008), REMD simulations of the 41
residue peptide with the non amyloid component region of α-
synuclein with various force fields and solvent conditions (Yoon,
Park, Jang, Lee, & Shin, 2008) and REMD simulations of the peptide
fragment 21–31 of -microglobulin (Nishino, Sugita, Yoda, &
Okamoto, 2005). However, with the recent advances in
computational algorithms and efficiency, atomistic simulations with
explicit water models were used to explore the conformational
changes and structural arrangements of the β-strand in amyloids
(Carballo-Pacheco & Strodel, 2016; Tsai et al., 2005), as exemplified
by multiple all-atom MD simulations of Aβ protein in explicit water
(Lee & Ham, 2011) and REMD simulations of the prion protein
(Baillod, Garrec, Colombo, Tavernelli, & Rothlisberger, 2012). A
detailed account of the recent advances in the atomistic simulation
studies of protein aggregation may be found in some current
reviews (Carballo-Pacheco & Strodel, 2016; Nasica-Labouze et al.,
2015).
All-atom REMD simulation studies of Aβ (Rosenman, Connors,
Chen, Wang, & García, 2013) (see review (Nasica-Labouze et al.,
2015) for details) and human Islet Amyloid Polypeptide (Dupuis,
Wu, Shea, & Bowers, 2009; Qiao, Bowman, & Huang, 2013; Reddy et
al., 2010) predicted β-hairpin structures of peptides that may act as a
nucleus for self-assembly. The β-sheet enriched structure of the
human islet amyloid polypeptide ( ) was amply demonstrated
through different REMD simulations, i) with force field and
the generalized-Born model (Dupuis et al., 2009), ii)
force field with water model (Qiao et al., 2013) and iii)
force field with water model (Reddy et al., 2010).
However, classical MD and REMD simulations of the same protein
performed with - force field with water model (Andrews
& Winter 2011) and force field with water model
(Miller, Zerze, & Mittal, 2013) respectively, hardly displayed any β-
sheet content. This discrepancy may be attributed to the choice of
 p y y
force fields, which stabilize the secondary structures in proteins and
hence are better optimized for globular proteins as compared to the
misfolded and disordered proteins. Another view that emerged from
the analysis of the free-energy landscape of the segment 25–35 of the
Aβ peptide, depicts the participation of both α-helix and β-sheet in
the formation of oligomers (Tran & Ha-Duong, 2015). Along similar
lines, REMD simulation of Aβ peptides (Sgourakis, Yan, McCallum,
Wang, & Garcia, 2007) suggested a strong correlation between the
amyloid fibrils and the hydrogen bond forming propensity of the
backbone polypeptide chain.
Prion diseases caused by the aggregation of the prion protein
involves a conformational transition from the soluble cellular
isoform to the insoluble β rich . REMD simulations of the
monomeric C-terminal domain reveals β enriched folds with
exposed β-sheet edges and increased hydrophobic solvent accessible
surface area (Baillod et al., 2012), which contradicts the earlier
findings of a spiral (DeMarco & Daggett, 2004) and β-helix fibril
(Govaerts, Wille, Prusiner, & Cohen, 2004; Wille et al., 2009). While
some simulation studies suggested the disruption of antiparallel β-
sheets of prion proteins under pathogenic conditions with parallel β-
helix structure in the misfolded monomer (Barducci et al., 2006;
Wille et al., 2002), other works established the evidence for the
antiparallel β-sheet structure in oligomeric fibrils (Alonso et al., 2001;
DeMarco & Daggett, 2004). Also the effect of mutations on disease
related misfolding investigated by either classical MD simulations
(Alonso et al., 2001; DeMarco & Daggett, 2004) or other advanced
simulation methods such as REMD simulations (Sugita & Okamoto,
1999) and non-Markovian metadynamics (Barducci et al., 2006, 2011)
revealed the stability of the β-sheet structure or the β-sheet motif in
mouse prion protein and its mutant under pathological conditions.
Atomistic simulations are also employed to characterize the
structural aspects of amyloid fibrils apart from exploring early stages
of protein misfolding. Structural analysis of fibrils revealed a strand-
loop-strand motif, as demonstrated by the work of Ma and Nussinov
(2002) and Luca, Yau, Leapman, and Tycko (2007). Discrete and
discontinuous molecular dynamics simulations probed the detailed
Another random document with
no related content on Scribd:
silloin hän löytäisi sinut täältä. Paetkaamme! Matkasuunnitelmamme
muuttuu taas», jatkoi Mrs. Edgecombe nauraen. »Puolison takaa-
ajaminen ja kummitätiä pakeneminen ei ole helpoimmin suoritettavia
matkoja!»
XXVIII.

Frankfurtissa, jonne molemmat naiset matkasivat, he saivat sen

tiedon, että Ballmann oli nostanut perintönsä ja matkustanut
Hampuriin sekä sieltä jatkanut matkaansa Amerikkaan lähtevässä
laivassa. Sinne saakka he eivät halunneet häntä seurata saamatta
tarkempia tietoja. Mrs. Edgecombe jätti sentakia erään asianajajan
toimeksi jatkaa tiedusteluja. Laivan nimi saatiin pian selville, mutta jo
New-Yorkissa, jossa hän astui maihin, hukkuivat kaikki jäljet. Minne
mahtoi tämä vieras matkailija mennä tuossa jättiläiskaupungissa? —
Kukaan ei tiennyt sitä. Saksalaisesta konsulivirastosta,
poliisilaitoksesta, useista hotelleista kyseltiin, mutta turhaan, joten
Mrs. Edgecomben lähettiläällä ei ollut muuta neuvoa kuin jättää
tiedustelujen jatkaminen amerikkalaiselle virkaveljelleen, jonka tuli
vähänväliä lähettää tietoja, olivatko hänen yrityksensä onnistuneet
tai oliko hän sattuman kautta saanut joitakin tietoja Ewald
Ballmannin oleskelupaikasta.

»Maapallo on niin pieni ja pyöreä, joten me kyllä vielä joskus

tapaamme pakolaisen», sanoi Mrs. Edgecombe lohduttaen Hannaa.

»Mutta rakas täti — saanko olla avomielinen?»

 »Ole aina, lapseni.»

»Ei minulla ole niinkään suurta halua tavata petettyä, kaikesta

päättäen hyvin vihastunutta miestäni. Hän on rikas ja matkustelee
maita ja meriä, mikä aina on ollutkin hänen hartain toivonsa, ja
luultavasti hän on onnellinen. Hän ehkä rakastaa vapautta, ja kukapa
tietää, tahtoisiko hän vielä kerran uhrautua minun takiani?…»

»Joutavia — hän olisi liiankin onnellinen saadessaan sinut

takaisin.
Mutta sinä itse — etkö enää rakastakaan häntä?»

»Minä — minä en tiedä», sanoi Hanna huoaten. »Minä pidän

hänestä kylläkin — mutta — me emme ymmärrä toisiamme.»

»Se on suuri onnettomuus. Mutta tässä eivät auta saarnat; meidän

täytyy odottaa. Sinä esiinnyt edeskinpäin veljentyttärenäni. Anna
tukkasi vaan olla mustana, se sopii sinulle erinomaisesti, eikä
kukaan sinua tunne — ei edes miehesikään, jos me joskus vielä
tapaamme hänet.»

Hanna oli tyytyväinen. Hän viihtyi vanhan ystävättärensä parissa

hyvin eikä toistaiseksi muuta toivonutkaan kuin saada viettää
elämänsä tässä rauhallisessa kodissa uutena ihmisenä, toisella
nimellä, ulkomuodoltaan muuttuneena, olematta missään
tekemisissä karanneen ja panetellun Hanna Ballmannin kanssa.

Eräänä päivänä Mrs. Edgecombe ilmoitti saaneensa kylliksi

matkustamisesta ja aikovansa panna täytäntöön tuumansa asettua
asumaan Saksaan.
 »Otahan paperia ja lyijykynä, Hanna», sanoi hän. »Me teemme nyt
valmiiksi suunnitelmamme ja laskelmamme. Siitä tuleekin jättiläistyö,
jota saat ihmetellä.»

Molemmat naiset istuivat »Westendhall»-hotellin

seurusteluhuoneessa.
Noin kaksi kuukautta oli kulunut heidän saapumisestaan Frankfurtiin.
Viimeinen tiedonanto New-Yorkista oli ollut: »Tiedustelut toistaiseksi
tuloksettomia; niitä jatketaan innokkaasti.»

Hanna toi paperia ja kynän ja istuutui tyytyväisesti hymyillen

vastapäätä Mrs. Edgecombea.

»Nyt olen valmis. Mistä alotamme?»

»Menoarviosta. Se on hyvin tärkeä osa tulevaisuuden

suunnittelussa.
Siitä riippuu, onko köyhä vai rikas.»

»Sen täytyy riippua tietenkin omaisuuden suuruudesta», keskeytti

Hanna.

»Niinkö luulet? Sinä olet yhtä erehtynyt kuin monet muutkin. Minun
tulee siis käännyttää sinut. Olen rakentanut kokonaisen järjestelmän
ja koetan nyt opettaa sen sinulle. Sanohan, mitä tarkoitat sanalla
'rikas'?…»

»Minä pitäisin itseäni rikkaana, jos minulla olisi — sanokaamme —

kolmenkymmenentuhannen taalerin tulot.»

»Tein äsken saman kysymyksen kamarineitsyelleni, joka vastasi

olevansa rikas, jos hänellä olisi kahdeksansataa markkaa vuodessa.
Eräs nuori herra sanoi minulle kerran tyytyvänsä Norfolkin herttuan
tuloihin, jotka nousevat kahteenmiljoonaan puntaan. Rikkaus on siis,
katsoen omaisuuden suuruuteen, hyvin vaihtelevainen käsite. Mutta
todellisesti rikas on se, jonka tulot ovat suuremmat kuin menot. Jos
asetan menoni niin, että ne tekevät yhteensä viisituhatta markkaa
tulojeni noustessa kuuteentuhanteen, olen varakas. Jos tuloni ovat
menojani puolta suuremmat, olen rikas, ja kuta suurempi ero näiden
summien välillä on, sitä rikkaampi olen. Ja päinvastoin, jos tuloni
ovat satatuhatta, mutta järjestän elämäni niin, että menot nousevat
sataantuhanteen, olen niukoissa varoissa, siksi että minulla on
alituisia huolia siitä, että saisin menoni ja tuloni menemään yhteen.
Jos taasen järjestän niin, että menoni ovat tulojani suuremmat,
vaikka kuinkakin vähän, olen vaikeissa olosuhteissa. Ymmärrätkö?»

»Kyllä, mutta nautinnot kai riippuvat niistä summista, joita voi niihin
käyttää?…»

»Eivät suinkaan. Suurin nautinto on siinä, mikä on poikkeavaa

jokapäiväisestä elämästä. Todellinen rikkaus on ylellisyyttä, ja
ylellisyyttä esiintyy kaikkialla, missä menoarvio on tehty tuloarviota
pienemmäksi.»

»Mutta jos minulla ei ole minkäänlaista omaisuutta?» puuttui

Hanna puheeseen.

»Silloin et myöskään tee laskelmia. Sellaiset ihmiset, joilla ei ole

kerrassaan mitään, tuntevat useinkin ylellisyyden tunnetta, sillä
missä he vähimmin odottavat, tuntuu jokainen tilapäinen ansio
ylellisyydeltä. Niin ei ole kuitenkaan minun laitani. Minä en ole
ainoastaan jokseenkin, vaan — suurienkin vaatimusten mukaan —
todellisesti hyvin rikas. Mutta minä tahdon myöskin nauttia tästä
rikkaudestani. Tahdon joka päivä iloita siitä, ja siksi me nyt teemme
laskelmamme, jossa kaksi kolmasosaa tuloistani varataan
odottamattomia menoja varten. Juuri ne tuottavat iloa. Tähän
ryhmään kuuluvat tyydytetyt toiveet, hullutukset, korkealentoisten
mielitekojen täyttymiset, rohkeimpien päähänpistojen toimeenpano.»

»Ja hyväntekeväisyys — sitä te, jalomielinen lahjoittaja, ette

mainitse!»

»Ole huoletta, sen olisin kyllä maininnut, sillä se on suurin iloni.

Vuosittainen niin ja niin suurien summien suorittaminen laitoksille on
huonoa iloa; mutta itse saada lieventää ihmisten hätää, sellaisten
ihmisten, jotka eivät ole sitä odottaneet, saada täyttää hartaasti
haluttuja toiveita, yllättää lahjoilla, jotka herättävät ilohuutoja: etkö
luule siitä olevan iloa? Ja useimmat rikkaat ihmiset joutuvat sellaisiin
tilaisuuksiin, jolloin heidän sydämensä vuotaa verta, kun he eivät voi
auttaa, jolloin he sanovat: 'Miten mielellään auttaisin, jos voisin!
Mutta he eivät sitä voi; heidän oma elämänsä nielee kaiken
omaisuuden, ja siten heiltä puuttuu monta ilonhetkeä. Heillä on
monastikin rahahuolia, sillä yksi meno vaatii toisen. Kertomus
miehestä, joka joutui perikatoon saadessaan lahjaksi kultakirjaillut
tohvelit, ei ole niinkään hullu, kuin miltä se näyttää, sillä tohveleihin
ei sopinut hänen vanha yönuttunsa; uusi yönuttu vaati uuden
lepotuolin; se taas uuden huonekaluston, mikä taasen vaati
hienomman huoneiston j.n.e. Ja mikään näistä menoista ei tuottanut
iloa, sillä ne olivat välttämättömiä. Minä aion tehdä aivan
päinvastoin: ostan yksinkertaisen talon, johon kelpaavat
yksinkertaiset huonekalut, mutta kun minulla on varaa ostaa hienoja
huonekaluja, aion huvitella itseäni sillä. Niihin taasen sopisi hieno
yönuttu, mutta aion ostaakin kallisarvoisen…»

»Mutta silloinhan ovat kultakirjaillut tohvelit välttämättömät?»

keskeytti Hanna.
 »Hopeakirjaillut kelpaisivat kylläkin, mutta ollessani säästäväinen
taloa ostaessani, voin nyt ostaa kultakirjaillut. Ja nyt, selitettyäni
järjestelmäni, voimme alkaa tehdä laskelmia. Kirjoita siis: Tuloja
kymmenentuhatta puntaa: se on jotenkin kaksisataatuhatta
Saksanmarkkaa.» Hanna hätkähti.

»Sehän on ääretöntä!» huudahti hän. »Silloinhan voi hankkia

itselleen linnan, vaunuja ja…»

»Niin, niin, jatka vaan! — hovimestarin, puuteroituja lakeijoja ja

ranskalaisen kokin sekä taulukokoelman, tanssiaisia ja — ikävyyksiä
jos jonkinlaisia… ja sitten jossain epäonnistuneessa yrityksessä
menettää kaiken. Ei, me järjestämme vallan toisella lailla
ollaksemme satumaisen rikkaita. Me ostamme pienen, kauniin
huvilan, joka edustaa neljäntuhannen Saksanmarkan korkoa. Kirjoita
siis: Asunto — neljätuhatta markkaa.»

»Entä sisustus?»

»Sen me hankimme ensi vuoden säästöillä. Sitäpaitsi on minulla

Englannissa koko joukko huonekaluja, perhemuistoja, tauluja,
taideteoksia ynnä muuta, jotapaitsi meillä on äärettömän paljon
matkoilla ostettuja kalleuksia. Niin pian kuin olemme saaneet
huvilan, lähetytän tänne kirstut, ja niiden purkaminen tulee olemaan
kuin päiväkirjan selailemista. Mutta palatkaamme jälleen
menoarvioomme! Kirjoita edelleen: Palveluskunta: kaksi
kamarineitsyttä, keittäjätär ja hänelle apulainen, kaksi palvelijaa,
kuski.»

»Siis kuitenkin vaunut?» sanoi Hanna.

 »Niin, mutta sinun linnassasi tarvittaisiin vaunuja kymmenittäin
ynnä kaikenlaisia muitakin ajopelejä sekä paljon hevosia. Minun
huvilassani on yhdet vaunut, pari kunnollista hevosta ja
ratsuhevonen sinua varten aivan kylliksi.»

»Minua varten? Ratsuhevonen? Miten hauskaa… sitä olen aina

toivonut… Miten hyvä te olette!»

»Katsohan nyt, miten paljon iloa yksi ainoa ratsuhevonen saa

aikaa ja miten hienolta se näyttää huvilamme puitteissa, kun sinun
linnasi tallissa olisi varmaan toistakymmentä englantilaista juoksijaa
marmoripilttuissa. Palvelijakuntamme lisääntyy ratsupalvelijalla.
Oletko kirjoittanut?»

»Kyllä, mutta nyt kai tulee palkkojen vuoro. Mitenkä korkeiksi ne

määrätään? Me kai pidämme Minetten ja teidän englantilaisen
Lizzienne?»

»Tietysti sekä Gustavin, nykyisen palvelijamme. Hänestä tehdään

hovimestari ja kamaripalvelija ja hän saa kaksi palvelijaa avukseen.
Entä palkat? Gustav saa kaksisataa markkaa kuukaudessa, Minette
saman,
Lizzie sataviisikymmentä, keittäjätär sata…»

Hanna keskeytti kirjoittamisensa.

»Mutta, rakas täti, saanko tehdä yhden muistutuksen: nämä palkat

soveltuvat englantilaisiin oloihin, mutta Saksassa ei makseta
palvelijoille niin hyvin…»

»Ne ovat minun palkkojani, rakas lapsi, ja osana järjestelmääni.

Kuten tulet näkemään, olen seuraava järjestelmääni vallan
turhantarkasti. Maksan palvelijoilleni puolta enemmän kuin mitä he
pyytävät. Sillä tavoin minulla on kahden palvelijan sijasta yksi, joka
tekee työtä kolmen ja iloitsee neljän edestä. Sellainen laskutapa on
kylläkin hiukan mutkallista, mutta siitä on paljon hyötyä. Etkö ole
huomannut, millä innolla määräykseni toimitetaan?»

»Rehellisesti puhuen, en ole koskaan kuullut teidän vielä antavan

määräyksiä. Te sanotte aina näin: 'Gustav, olkaa ystävällinen ja
toimittakaa vaunut portaiden eteen', tai 'Lizzie, ole niin kiltti ja pura
tuo matkalaukku', tai 'Minette, teetkö minulle palveluksen
herättämällä minut huomenna kello kuusi'… ja joka tuotua vesilasia
kohti kohtelias 'kiitos', hyvin tehdyn työn jälkeen joitakuita kiittäviä
sanoja, ja kun jokin menee hullusti, niin te hymyilette anteeksi
antaen. Kuuluuko sekin järjestelmään, täti?»

»Ei, sillä se on niin luonnollista. Minun täytyisi toimia vasten

luontoani, ellen kiittäisi, kun minulle jotain tuodaan, ellen lausuisi
muutamia ylisteleviä sanoja mielestäni hyvin tehdystä työstä, ellen
nauraisi, jos jokin on tehnyt pienen tyhmyyden. Mutta nyt olemme
selvillä palvelijoista. Mikä on seuraava osasto?»

»Ruoka kai.»

»Olet oikeassa. Ruoka on talouden tärkeimpiä puolia.»

»Niin, mutta te ette ole suuri herkkusuu.»

»Minäkö? Siinä erehdyt. En tosin ole kova herkuttelija — mutta

pidän hyvästä ruuasta. Ei tarvitse välttämättä olla aina parsaa,
tryffeliä, kravunpyrstöjä, madeirakastiketta tai muita suurenmoisia
laitoksia, mutta pöydässämme tarjotut hyvät ruuat maistuvat
erinomaiselta. Siis — kyökki — kuukausittain… sitä on vaikea
arvioida, kun emme tunne täkäläisiä hintoja.»

»Mutta suunnilleen?»

Molemmat naiset arvioivat sinne ja tänne. Laskelman teko veti

monta tuntia. Siihen otettiin ravinto, valaistus, lämpö, hevosten hoito,
vaatteet, kotilääkäri y.m.

»Vielä puuttuu», sanoi Hanna, »osasto: 'Odottamattomia

menoja'.»

»Sepä on juuri meidän rikkaus-osastomme. Laske yhteen saadut

summat, niin jäännös, vähennettyäsi siten saadun summan
tuloistani, on 'Odottamattomia menoja varten.»

Hanna laski.

»Neljäkymmentäviisituhatta markkaa», sanoi hän.

»Siis on meillä sataviisikymmentäviisituhatta käytettävänämme.

Sillä tavalla tehdään minusta Kroisos, rakas lapsi.»
XXIX.

Mrs. Edgecombe valitsi huvilansa Wiesbadenista. Tässä ihanassa

Taunus-laaksossa sijaitsevassa kylpypaikassa oli tilaisuutta
kaupunki- ja maalaiselämään sekä suuren maailman huvituksiin.

Täällä tapaamme molemmat naisemme kahdeksan vuoden

kuluttua. Heidän suhteensa oli tullut yhä läheisemmäksi; he
rakastivat toisiaan kuin äiti ja tytär. Kumpikin ajatteli sisäisellä
vavistuksella Ewald Ballmannin tapaamista. Mitenkä sitten, kun hän
palaisi, tapaisi rouvansa ja vaatisi hänet takaisin? Mrs.
Edgecombelle se olisi suuri tappio ja Hannalle vielä suurempi.
Hanna oli jo melkein unohtanut miehensä, joten hänen paluuseensa
olisi yhdistynyt jotain kauheaa, salaperäistä, ikäänkuin jos kuollut,
jota ei kaipaa, heräisi unestaan ja vaatisi entisten aikojen jatkamista.
Hehän olivat jo hänen elinkautenaan — heidän avioliittonsa aikana
— olleet niin vieraita toisilleen, mitenkä nyt sitten? Sen ajan jälkeen
Hanna oli oppinut ja nähnyt niin paljon, hänen näköpiirinsä oli
laajentunut, ja kun hän ajatteli hiljaista koulunopettajaa, jonka
ajatukset ja tunteet eivät eksyneet hänen pienen kirjavarastonsa
ulkopuolelle, niin hän ei voinut ymmärtää, että tämä opettaja joskus
oli ollut hänen miehensä.
 Mutta peljätty kummitus ei ainakaan vielä ollut näyttäytynyt. Yhä
harvemmin saapuvat tiedonannot Amerikasta olivat aina
samanlaiset: »Herra Ewald Ballmannin olinpaikka yhä tuntematon»,
ja vihdoin ei tietoja enää tullutkaan. Kaikesta päättäen oli Ewald
Ballmann toisella nimellä asettunut johonkin kaukaiseen kaupunkiin
Amerikassa eikä enää koskaan aikonut palata, ajatteli Hanna. Tämä
vakaumus rauhoitti häntä. Hän oli niin onnellinen nykyisissä
oloissaan, ettei mitenkään olisi tahtonut luopua niistä. Hän ei tosin
tuntenut yliluonnollista onnea, mutta hänen elämänsä oli niin täynnä
iloa, ettei hän voinut muuta ajatella, kuin että kohtalo oli häntä
hellävaroin pidellyt.

Mrs. Edgecombe tahtoi kasvattaa hänestä todellisen, ylevän

ihmisen ja työskenteli järjestelmällisesti rikastuttaakseen hänen
sielunelämäänsä. Tämä ei tapahtunut opettavaisten esitelmien tai
siveyssaarnojen kautta, vaan opinnoilla, jotka ovat ainoa keino
näköpiirin laajentamiseksi. Kaksikymmenvuotias Hanna luuli
olevansa hyvin sivistynyt, kun puhui monta kieltä ja helposti otti osaa
erilaisiin seurapiirin keskusteluihin sekä tunsi kirjallisuutta. Hänellä ei
ollut aavistustakaan, miten rajoitettu hänen maailmankatsomuksensa
oli. Mrs. Edgecombe ei sanonut mitä häneltä puuttui, vaan koetti
antaa hänelle sen. Mrs. Edgecombe ei ilmaissut, mitä kaikkea
korkea katsantokanta näkee ympärillään — sillä alempana oleva ei
olisi sitä käsittänyt — vaan hän vei Hannan mukanaan vuorelle
omana seuranaan. Hannan täytyi lukea ystävälleen erilaisia
tieteellisiä teoksia ja kirjoitelmia päivän polttavista kysymyksistä ynnä
sitäpaitsi jokapäiväisten sanomalehtien hallinnollisia tiedonantoja.
Tämä tuntui nuoresta esilukijattaresta alussa hyvin kuivalta ja
ainoastaan velvollisuuksiensa täyttämiseltä. Uusi ajatussuunta on
kuin vieras kieli, joka täytyy oppia, — ensin se tuntuu aivan
mahdottomalta ymmärtää, sitten käsittää jo jonkun sanan sieltä
täältä, kohta kokonaisen lauseen, eikä aikaakaan, ennenkuin jo
ymmärtää kaiken yksityiskohtia myöten. Näin kävi Hannankin. Mitä
hän luki, se sai hänet innostumaan. Mrs. Edgecombe osasi sitäpaitsi
kiihottaa hänen tiedonhaluaan. Hän teki kysymyksiä, alotti
keskusteluja pakottaakseen oppilaansa itsenäisesti ajattelemaan ja
ilostui joka kerta nähdessään uusien ajatusten kypsyvän Hannan
mielessä.

Jonkun ajan kuluttua Hannasta tuntui aivan mahdottomalta, että

hän niin kauan oli voinut elää aavistamattakaan niitä asioita, joita
hän nyt tunsi.

Mrs. Edgecombe herätti eloon vielä hänen soittoharrastuksensa.

Hän pakotti suojattinsa harrastelijan tasolta taiteilijan tasolle. Kaksi
tuntia päivässä hänen täytyi harjoitella; hän sai soittaa mestarien
edessä; käymällä teattereissa ja konserteissa hän sai tilaisuuden
kuulla mestariteoksia, joten hänen synnynnäinen soitannollisuutensa
sai uutta virikettä, ja hän alkoi rakastaa taidetta ja sen harjoittamista.
Pian ei kaksi harjoitustuntia päivittäin ollut enää kylliksi. Sisäisellä
tyydytyksellä hän näki taitonsa kasvavan — koko maailma oli hänelle
avoinna?… Hanna ei aikonut esiintyä konserteissa, mutta hän
unelmoi mestaruudesta, joka asettaisi hänet ihailtujen taiteilijain
rinnalle. Hänen edistyksensä hämmästytti häntä ja hän kyseli
ihmetellen itseltään, mihin saakka voisikaan päästä.

Molempien naisten elämä oli hyvin virkistävää. Heidän pieni

kotinsa oli täynnä mukavuuksia ja hienoa makua; kolme kuukautta
he oleskelivat matkoilla, ja alkuperäisen suunnitelman mukaisesti
käytettiin äärettömät tulot iloatuottaviin tarkoituksiin. Mrs.
Edgecombe rakasti seuraa, mutta ei välittänyt n.s. maailmallisesta
elämästä. Hänen kodissaan seurusteli mieltäkiinnittäviä henkilöitä:
oppineita, taiteilijoita, eteviä ulkomaalaisia. Kaikki Wiesbadenin
kautta matkustavat suuruudet pitivät suurena kunniana tulla
esitetyiksi Mrs. Edgecomben kodissa. Mutta tanssiaisia ja iltamia
hän vältti. Hän itse oli liian vanha sellaisiin huvituksiin, joissa
kiemailu oli pääasiana, ja Hanna taas ei halunnut »hakkailla», mikä
olisi ollut hänelle sekä alentavaa että vaarallista. Hänen
kauneutensa herätti kylläkin ihailua, mutta kokemuksiensa jälkeen
hän pelkäsi kaikenlaisia runollisia seikkailuja, joten hän aina ymmärsi
vetäytyä syrjään. Tämä oli helppoa sentähden, ettei hän ottanut
osaa maailmallisiin huveihin. Sitäpaitsi hän pelkäsi aina, että ihailu
koski hänen luuloteltua rikkauttaan, ja se teki hänet
välinpitämättömäksi. Häntä pidettiin upporikkaan Mrs. Edgecomben
naimattomana veljentyttärenä, ja tämän häntä kohtaan osoittama
hellyys sai ihmiset ajattelemaan, että Hanna oli rikas perijätär.

Näin oli Hanna viettänyt kahdeksan vuotta ilman sydänsuruja,

ilman runollisia lemmenhetkiä, työskennellen kehittyäkseen,
tuntematta muuta kuin ääretöntä rakkautta hyväntekijäänsä kohtaan,
jota hän oppi tuntemaan yhä paremmin. Huvinhaluista,
ymmärtämätöntä, runollista Hannaa, joka niin epäselvästi oli nähnyt
sen maailman, jossa luuli olevansa luotu elämään, vaikkei tiennyt
miten, ei enää ollut olemassa; hän oli kehittynyt levollisesti ja selvästi
ajattelevaksi naiseksi. Hänen ulkomuotonsakaan ei ollut enää sama.
Hänen solakka, notkea ruumiinsa oli pulskistunut; veikeä hymyily oli
muuttunut vakavaksi, sielukkaaksi ilmeeksi. Hanna oli yhä
edelleenkin kaunis, ehkä kauniimpi kuin ensi nuoruutensa aikoina,
mutta hän oli muuttunut niin, ettei häntä olisi voinut tuntea.
XXX.

Mrs. Edgecombe ja Hanna palasivat kävelyltään Nero-laaksosta

takaisin huvilaan. Hämärsi jo. Salissa, jonka molemmat lasiovet
olivat auki, ei oltu vielä sytytetty valoja heidän sinne astuessaan.
Köynnösruusut ja kuusamat levittivät voimakasta tuoksua, ja kaukaa
kuuluivat kylpylaitoksen orkesterin sävelet. Palvelija tuli sytyttämään
lamppuja.

»Ei vielä», sanoi Mrs. Edgecombe, »minä soitan, kun tarvitaan

valoa.
Ja jos joku tulee vielä tänä iltana niin emme ole kotona», hän jatkoi.
Palvelijan mentyä hän lisäsi:

»Olkaamme tänään yksin ja juokaamme rauhassa teemme

jutellessamme. Onko sinulla mitään sitä vastaan?»

»Ei ensinkään», vastasi puhuteltu; »meillä on koko viikko ollut

iltaisin vieraita, joten on oikein hauskaa taasen saada olla
kahdenkesken — ja lukea jotain yhdessä.»

»Ei, tänään emme lue, vaan juttelemme. Minulla on sinulle jotain

sanottavana — minun täytyy kysyä sinulta erästä asiaa…»
 »Te teette minut oikein uteliaaksi, rakas täti. Miksi ette sanonut
mitään kävelyllämme?»

»Olin koko ajan niin kahden vaiheilla. Muuten on helpompi jutella

hämärässä. Silloin en ainakaan näe sinun punastuvan…»

»Punastuvan? Mitä olen sitten tehnyt?»

»Tehnyt? Sitä en tiedä — mutta ehkä ajatellut, tuntenut…»

»En koskaan luullut tädin voivan olla sellainen yli-inkvisiittori…»

»Minä lykkäänkin inkvisitsionin tuonnemmaksi. Ensin kerron

sinulle jotain: Paroni Theken on pyytänyt kättäsi.»

»Todellakin?… Entä minkä vastauksen olette antanut?»

»Sen, minkä aina tällaisissa tapauksissa olemme antaneet: ettet

tahdo mennä naimisiin. On vahinko, ettet ole esiintynyt naimisissa-
olevana veljentyttärenäni. Se olisi säästänyt meiltä monta ikävyyttä.
Minua surettaa, että tuo hauska, nuori paroni nyt tulee vihamieliseksi
meitä kohtaan, kuten aina rukkaset saanut. Oletko antanut hänelle
aihetta? Oletko kiemaillut hänen edessään, vai onko omatuntosi
puhdas?»

»On, totta totisesti. Hänhän onkin kääntynyt tädin puoleen eikä

suorastaan minun, sillä olen aina keskeyttänyt sellaiset puheet, jotka
ovat vähänkään menneet siihen suuntaan. Sitäpaitsi olen kerran
maininnut, että minulla ei ole kättä eikä sydäntäkään
poisannettavana.»

»Kättä tosin… mutta sydäntä, mitenkä on, Jane? Nyt alkaa

inkvisiittorintoimeni, eikö sinulla todellakaan ole sydän vapaana?»
 »Minullahan ei pitäisi olla, täti.»

»Sen tiedän varsin hyvin, olenhan siitä sinulle aina saarnaillut ja

koettanut suojella sinua sellaisista vaaroista. Mutta olen alkanut
epäillä, että olenkohan vaatinut sinulta liikaa? Sillä jos 'intohimon
punainen ruusu', kuten runoilijamme Storm sanoo, jälleen putoaisi
syliisi, onko minulla silloin oikeutta riistää sinulta sitä kukkaa? Olen
aina ollut kylmä, ajatteleva luonne… enkä ole joutunut kiusauksiin,
joten minulla ei ole siinä suhteessa kokemuksia. Sitäpaitsi olen
vanha, ja samaten kuin terve unohtaa kestetyt tuskat, unohtaa
vanhus nuoruuden hehkun… Mistä saatan tietää, mitä liikkuu sinun
kaltaisesi nuoren, tulisen ja kauniin naisen sydämessä?»

»Täti — te hämmästytätte minua! Ette kai te neuvo minua…

ottamaan miestä itselleni?»

»Neuvo? Älä käsitä minua väärin, lapsi! Olen puhunut intohimosta,

joka ei kysy neuvoa, vielä vähemmin velvollisuuksien täyttämistä,
vaan joka vaatii — lopulta joko voittaen tai häviten — taisteluun.
Minä tahdon vain saada selville, onko sinulla sellaisia taisteluita, ja
tunnen, miten suuri edesvastuu minulla on siinä, voitatko vai
joudutko häviöön… Ole minulle avomielinen, Jane — minussa näet
totisen ystäväsi. Jos järkisyyt voivat sinua suojella vaarasta, olen
valmis ne sinulle esittämään… Sillä useimmiten tämmöisessä
tapauksessa on parasta tarkastaa sitä joka puolelta ja siten
vapautua lumouksesta. Luota minuun. Rakkauden liekki, joka
loimuaa niin kirkkaana, että se näyttää kohoavan taivaisiin ja
saattavan varjoon helvetin tuskat… sammuu aikaisemmin tai
myöhemmin… entä miten sitten käy? Kun ei enää ole
omantunnonrauhaa, oman arvon tunnetta, maailman kunnioitusta —
mihin silloin voi ryhtyä?… Sinä olet sen jo kerran kokenut… löysit
rauhanmajan kodissani… mutta jos sinä toisen kerran pakenisit
maailmalle?… Jane, miksi et vastaa mitään?»

»Koetan koota ajatuksiani, voidakseni vastata aivan avomielisesti

ylevään myötätuntoonne. Mutta sallikaa minun ensin kysyä erästä
asiaa. Mitä syitä tädillä on tuollaisiin ajatuksiin? Onko joku lausunut
epäilyttäviä ajatuksia minusta, tai onko käytökseni antanut aihetta
niihin?»

»Ei käytöksesi, mutta koko olentosi. Jonkun aikaa on minusta

tuntunut, että sinä olet hajamielinen — enemmänkin kuin
hajamielinen: levoton, mielesi ei ole tasapainossa. Usein näen sinun
äkkiä punastuvan ja sitten kalpenevan, ikäänkuin veri suonissasi
polttaisi; kuulen sinun huokaavan — ja katseesi on kaivaten ollut
suunnattuna etäisyyksiin… Kaiken tämän olen huomannut, ja nyt
vielä tämä kosinta — se antaa minulle syytä kysyä: oletko rakastunut
paroni Thekeniin?»

»En, täti, en ole. Paroni Theken on minulle aivan yhdentekevä —

hän ei minua edes miellytä.»

»Kenestä sitten pidät?»

»Sen sanon teille aivan heti — avaan teille sydämeni kokonaan.

Mikään ei ole niin vaikeata kestää kuin ihanat päivät toisensa
jälkeen. Minähän elän, tädille siitä kiitos, mitä huolettomimmissa
olosuhteissa; elämä tarjoo minulle niin paljon kaunista ja hauskaa;
olen oppinut ja nähnyt niin paljon ihanaa ja mielenkiintoista — minun
pitäisi siis olla maailman onnellisin ihminen ja iloita aamusta iltaan…
teitä kiittää vuodesta toiseen. Ja kun ajattelen näitä kahdeksaa, tädin
luona asumaani vuotta, ajattelen niitä kadehtien… sillä se aika on
ollut niin onnellinen. Vasta nyt viime aikoina on surumielisyys saanut
minussa vallan… kaipaan jotain… en voi sitä selittää. Rakkauden
onnea… perheonnea… kukaan ei minua tarvitse… kukaan ei
minusta välitä…»

»Minähän pidän sinusta, Jane… vaikka olenhan niin monta vuotta

sinua vanhempi. On luonnollista, että sinä joskus jäät yksin tänne
maailmaan, mutta muista, että se on useiden muidenkin kohtalo.
Minäkin olen yksin, ilman perhettä; lapseni otettiin minulta. Ja miten
monta vaimoa on, jotka ovat miestensä takia onnettomia! Perheonni
on ihaninta maailmassa, mutta miksi uneksia saavuttamatonta,
olematta tyytyväinen siihen, mitä on?»

»Täti, te olette oikeassa kuten aina. Tämä tunnustus on tehnyt

minulle hyvää. Olen nyt huomannut, miten turhat ja tukea vailla
unelmani ovat olleet. Jos minua taas alkaa vaivata surumieliset
ajatukset, tulen tädin luokse saamaan virkistävän saarnan.»

»Tulehan antamaan minulle suukko!… Soita nyt, niin saamme

valoa!»
XXXI.

Myöhään seuraavan päivän iltana Mrs. Edgecombe istui yksin

salissaan.
Hanna oli mennyt ulos erään ystävättären kanssa.

Edgecomben huvilan sali oli kaunein, komein ja hauskin huone

mitä saattoi ajatella. Le style c'est l'homme, mutta kodin sisustus,
c'est la femme. Kaikkialla kuvastui älykkäisyys, taideaisti ja hyvä
maku. Sali oli suuri, mutta niin komeasti ja taidolla kalustettu, että se
erinäisine huonekalustoineen ja varjostimineen vaikutti monelta
pieneltä huoneelta. Huonekalut olivat vaihtelevia, siellä oli matalia
lepotuoleja, nojatuoleja, vielä matalampia jakkaroita, jotka olivat
päällystetyt erilaisilla kankailla ja neulomuksilla. Sitäpaitsi oli siellä
pieniä pöytiä kaikenlaisine pikkutavaroineen, kallisarvoisia kaappeja,
maljakkoja kukkineen; seinillä riippui mestarimaalauksia ja siellä
täällä taideteoksia jaspiskivestä, norsunluusta ja porsliinista. Suuri
Bechstein-flyygeli oli melkein aina auki, ja nuottitelineellä oli nuotteja;
keskellä lattiaa oli pyöreä pöytä, jolla oli valokuvia ja kuvitettuja
loistoteoksia; kirjoituspöydän molemmin puolin oli kaksiosainen
murattiteline ja sen vieressä hyvinvarustettu kirjahylly; eräässä
nurkassa oli jättiläisteline lukuisine valokuvineen, toisessa oli
koruompelukehys alotettuine töineen, työkori silkki- ja