Hydrocarbon and Lipid Microbiology

Protocols: Microbial Quantitation,

Community Profiling and Array
Approaches 1st Edition Terry J.
Mcgenity
Visit to download the full and correct content document:
https://textbookfull.com/product/hydrocarbon-and-lipid-microbiology-protocols-microbi
al-quantitation-community-profiling-and-array-approaches-1st-edition-terry-j-mcgenity/
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols Microbial

Quantitation, Community Profiling and Array Approaches
Mcgenity

https://textbookfull.com/product/hydrocarbon-and-lipid-
microbiology-protocols-microbial-quantitation-community-
profiling-and-array-approaches-mcgenity/

Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols Synthetic

and Systems Biology Applications 1st Edition Terry J.
Mcgenity

https://textbookfull.com/product/hydrocarbon-and-lipid-
microbiology-protocols-synthetic-and-systems-biology-
applications-1st-edition-terry-j-mcgenity/

Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols Synthetic

and Systems Biology Tools 1st Edition Terry J. Mcgenity

https://textbookfull.com/product/hydrocarbon-and-lipid-
microbiology-protocols-synthetic-and-systems-biology-tools-1st-
edition-terry-j-mcgenity/

Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols: Genetic,

Genomic and System Analyses of Communities 1st Edition
Terry J. Mcgenity

https://textbookfull.com/product/hydrocarbon-and-lipid-
microbiology-protocols-genetic-genomic-and-system-analyses-of-
communities-1st-edition-terry-j-mcgenity/
Microbial Metabolomics Applications in Clinical
Environmental and Industrial Microbiology 1st Edition
David J. Beale

https://textbookfull.com/product/microbial-metabolomics-
applications-in-clinical-environmental-and-industrial-
microbiology-1st-edition-david-j-beale/

Lipid Signaling Protocols 2nd Edition Mark Waugh (Eds.)

https://textbookfull.com/product/lipid-signaling-protocols-2nd-
edition-mark-waugh-eds/

Microbial Metabolomics: Methods and Protocols Edward

E.K. Baidoo

https://textbookfull.com/product/microbial-metabolomics-methods-
and-protocols-edward-e-k-baidoo/

Biota Grow 2C gather 2C cook Loucas

https://textbookfull.com/product/biota-grow-2c-gather-2c-cook-
loucas/

Compact Slot Array Antennas for Wireless Communications

Alan J. Sangster

https://textbookfull.com/product/compact-slot-array-antennas-for-
wireless-communications-alan-j-sangster/
Terry J. McGenity
Kenneth N. Timmis
Balbina Nogales Editors

Hydrocarbon and
Lipid Microbiology
Protocols
Microbial Quantitation, Community
Profiling and Array Approaches
Springer Protocols Handbooks

More information about this series at http://www.springer.com/series/8623

Terry J. McGenity • Kenneth N. Timmis • Balbina Nogales
Editors

Hydrocarbon and Lipid

Microbiology Protocols
Microbial Quantitation, Community
Profiling and Array Approaches

Scientific Advisory Board

Jack Gilbert, Ian Head, Mandy Joye, Victor de Lorenzo,
Jan Roelof van der Meer, Colin Murrell, Josh Neufeld,
Roger Prince, Juan Luis Ramos, Wilfred Röling,
Heinz Wilkes, Michail Yakimov
Editors
Terry J. McGenity Kenneth N. Timmis
School of Biological Sciences Institute of Microbiology
University of Essex Technical University Braunschweig
Colchester, Essex, UK Braunschweig, Germany

Balbina Nogales
Department of Biology
University of the Balearic Islands
and Mediterranean Institute for Advanced
Studies (IMEDEA, UIB-CSIC)
Palma de Mallorca, Spain

ISSN 1949-2448 ISSN 1949-2456 (electronic)

Springer Protocols Handbooks
ISBN 978-3-662-52776-4 ISBN 978-3-662-52778-8 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-662-52778-8

Library of Congress Control Number: 2016938230

# Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2017

This work is subject to copyright. All rights are reserved by the Publisher, whether the whole or part of the material is
concerned, specifically the rights of translation, reprinting, reuse of illustrations, recitation, broadcasting, reproduction on
microfilms or in any other physical way, and transmission or information storage and retrieval, electronic adaptation,
computer software, or by similar or dissimilar methodology now known or hereafter developed.
The use of general descriptive names, registered names, trademarks, service marks, etc. in this publication does not imply,
even in the absence of a specific statement, that such names are exempt from the relevant protective laws and regulations and
therefore free for general use.
The publisher, the authors and the editors are safe to assume that the advice and information in this book are believed to be
true and accurate at the date of publication. Neither the publisher nor the authors or the editors give a warranty, express or
implied, with respect to the material contained herein or for any errors or omissions that may have been made.

Printed on acid-free paper

This Springer imprint is published by Springer Nature

The registered company is Springer-Verlag GmbH Berlin Heidelberg
Preface to Hydrocarbon and Lipid Microbiology
Protocols1

All active cellular systems require water as the principal medium and solvent for their metabolic and
ecophysiological activities. Hydrophobic compounds and structures, which tend to exclude water,
although providing inter alia excellent sources of energy and a means of biological compartmental-
ization, present problems of cellular handling, poor bioavailability and, in some cases, toxicity.
Microbes both synthesize and exploit a vast range of hydrophobic organics, which includes biogenic
lipids, oils and volatile compounds, geochemically transformed organics of biological origin
(i.e. petroleum and other fossil hydrocarbons) and manufactured industrial organics. The underlying
interactions between microbes and hydrophobic compounds have major consequences not only for
the lifestyles of the microbes involved but also for biogeochemistry, climate change, environmental
pollution, human health and a range of biotechnological applications. The significance of this
“greasy microbiology” is reflected in both the scale and breadth of research on the various aspects
of the topic. Despite this, there was, as far as we know, no treatise available that covers the subject.
In an attempt to capture the essence of greasy microbiology, the Handbook of Hydrocarbon and
Lipid Microbiology (http://www.springer.com/life+sciences/microbiology/book/978-3-540-77584-
3) was published by Springer in 2010 (Timmis 2010). This five-volume handbook is, we believe,
unique and of considerable service to the community and its research endeavours, as evidenced by
the large number of chapter downloads. Volume 5 of the handbook, unlike volumes 1–4 which
summarize current knowledge on hydrocarbon microbiology, consists of a collection of experimen-
tal protocols and appendices pertinent to research on the topic.
A second edition of the handbook is now in preparation and a decision was taken to split off
the methods section and publish it separately as part of the Springer Protocols program (http://
www.springerprotocols.com/). The multi-volume work Hydrocarbon and Lipid Microbiology
Protocols, while rooted in Volume 5 of the Handbook, has evolved significantly, in terms of
range of topics, conceptual structure and protocol format. Research methods, as well as
instrumentation and strategic approaches to problems and analyses, are evolving at an unprec-
edented pace, which can be bewildering for newcomers to the field and to experienced
researchers desiring to take new approaches to problems. In attempting to be comprehensive
– a one-stop source of protocols for research in greasy microbiology – the protocol volumes
inevitably contain both subject-specific and more generic protocols, including sampling in the
field, chemical analyses, detection of specific functional groups of microorganisms and com-
munity composition, isolation and cultivation of such organisms, biochemical analyses and
activity measurements, ultrastructure and imaging methods, genetic and genomic analyses,

1
Adapted in part from the Preface to Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology.
v
vi Preface to Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols

systems and synthetic biology tool usage, diverse applications, and the exploitation of bioin-
formatic, statistical and modelling tools. Thus, while the work is aimed at researchers working
on the microbiology of hydrocarbons, lipids and other hydrophobic organics, much of it will be
equally applicable to research in environmental microbiology and, indeed, microbiology in
general. This, we believe, is a significant strength of these volumes.
We are extremely grateful to the members of our Scientific Advisory Board, who have
made invaluable suggestions of topics and authors, as well as contributing protocols them-
selves, and to generous ad hoc advisors like Wei Huang, Manfred Auer and Lars Blank. We also
express our appreciation of Jutta Lindenborn of Springer who steered this work with profes-
sionalism, patience and good humour.

Colchester, Essex, UK Terry J. McGenity

Braunschweig, Germany Kenneth N. Timmis
Palma de Mallorca, Spain Balbina Nogales

Reference

Timmis KN (ed) (2010) Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology. Springer, Berlin, Heidelberg
Contents

Introduction to Microbial Quantitation, Community Profiling,

and Array Approaches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Josh D. Neufeld
A Cell Extraction Method for Oily Sediments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Michael Lappé and Jens Kallmeyer
Introduction to Microplate MPN Enumeration of Hydrocarbon Degraders . . . . . . . . . 17
Anders R. Johnsen
Primers for dsr Genes and Most Probable Number Method for Detection
of Sulfate-Reducing Bacteria in Oil Reservoirs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Yin Shen and Gerrit Voordouw
Real-Time PCR Approaches for Analysis of Hydrocarbon-Degrading
Bacterial Communities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Boyd A. McKew and Cindy J. Smith
Microbial Biomass and Community Composition Analysis Using
Phospholipid Fatty Acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Aaron D. Peacock and David C. White
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) for Microbial
Community Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Stefan J. Green, Mary Beth Leigh, and Josh D. Neufeld
Microbial Community Profiling: SSCP and T-RFLP Techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Christoph C. Tebbe, Anja B. Dohrmann, Michael Hemkemeyer, and Astrid N€ather
Clone Libraries of Ribosomal RNA Gene Sequences for Characterization
of Microbial Communities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Mary Beth Leigh, Lee Taylor, and Josh D. Neufeld
Microbial Community Analysis by Single-Amplicon High-Throughput Next
Generation Sequencing: Data Analysis – From Raw Output to Ecology . . . . . . . . . . . . 155
Alex J. Dumbrell, Robert M.W. Ferguson, and Dave R. Clark

vii
viii Contents

Multiplex Fluorescent Antibody Microarrays and Antibody Graphs

for Microbial and Biomarker Detection in the Environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207
Yolanda Blanco, Mercedes Moreno-Paz, Jacobo Aguirre, and Victor Parro
Studying Protistan Communities in Hydrocarbon-Contaminated
Environments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Julia Johnke and Antonis Chatzinotas
About the Editors

Terry J. McGenity is a Reader at the University of Essex, UK. His

Ph.D., investigating the microbial ecology of ancient salt deposits
(University of Leicester), was followed by postdoctoral positions at
the Japan Marine Science and Technology Centre (JAMSTEC, Yoko-
suka) and the Postgraduate Research Institute for Sedimentology (Uni-
versity of Reading). His overarching research interest is to understand
how microbial communities function and interact to influence major
biogeochemical processes. He worked as a postdoc with Ken Timmis at
the University of Essex, where he was inspired to investigate microbial
interactions with hydrocarbons at multiple scales, from communities to cells, and as both a source of
food and stress. He has broad interests in microbial ecology and diversity, particularly with respect
to carbon cycling (especially the second most abundantly produced hydrocarbon in the atmosphere,
isoprene), and is driven to better understand how microbes cope with, or flourish in hypersaline,
desiccated and poly-extreme environments.

Kenneth N. Timmis read microbiology and obtained his Ph.D. at

Bristol University, where he became fascinated with the topics of
environmental microbiology and microbial pathogenesis, and their
interface pathogen ecology. He undertook postdoctoral training at the
Ruhr-University Bochum with Uli Winkler, Yale with Don Marvin,
and Stanford with Stan Cohen, at the latter two institutions as a Fellow
of the Helen Hay Whitney Foundation, where he acquired the tools and
strategies of genetic approaches to investigate mechanisms and causal
relationships underlying microbial activities. He was subsequently
appointed Head of an Independent Research Group at the Max Planck
Institute for Molecular Genetics in Berlin, then Professor of Biochem-
istry in the University of Geneva Faculty of Medicine. Thereafter, he became Director of the
Division of Microbiology at the National Research Centre for Biotechnology (GBF)/now the
Helmholtz Centre for Infection Research (HZI) and Professor of Microbiology at the Technical
University Braunschweig. His group has worked for many years, inter alia, on the biodegradation of
oil hydrocarbons, especially the genetics and regulation of toluene degradation, pioneered the
genetic design and experimental evolution of novel catabolic activities, discovered the new group
of marine hydrocarbonoclastic bacteria, and conducted early genome sequencing of bacteria that

ix
x About the Editors

became paradigms of microbes that degrade organic compounds (Pseudomonas putida and Alcani-
vorax borkumensis). He has had the privilege and pleasure of working with and learning from some
of the most talented young scientists in environmental microbiology, a considerable number of
which are contributing authors to this series, and in particular Balbina and Terry. He is Fellow of the
Royal Society, Member of the EMBO, Recipient of the Erwin Schrödinger Prize, and Fellow of the
American Academy of Microbiology and the European Academy of Microbiology. He founded the
journals Environmental Microbiology, Environmental Microbiology Reports and Microbial Bio-
technology. Kenneth Timmis is currently Emeritus Professor in the Institute of Microbiology at the
Technical University of Braunschweig.

Balbina Nogales is a Lecturer at the University of the Balearic Islands,

Spain. Her Ph.D. at the Autonomous University of Barcelona (Spain)
investigated antagonistic relationships in anoxygenic sulphur photosyn-
thetic bacteria. This was followed by postdoctoral positions in the
research groups of Ken Timmis at the German National Biotechnology
Institute (GBF, Braunschweig, Germany) and the University of Essex,
where she joined Terry McGenity as postdoctoral scientist. During that
time, she worked in different research projects on community diversity
analysis of polluted environments. After moving to her current position,
her research is focused on understanding microbial communities in chronically hydrocarbon-polluted
marine environments, and elucidating the role in the degradation of hydrocarbons of certain groups of
marine bacteria not recognized as typical degraders.
Introduction to Microbial Quantitation, Community Profiling,
and Array Approaches
Josh D. Neufeld

Abstract
Since the discovery of Van Leeuwenhoek’s “wee animalcules,” microbiologists have explored microbial
communities to identify who is where, when, why, and how. Although microbial community analyses were
conducted with cultivation-based methods for most of microbiology’s history, molecular methods have
transformed this discipline over the past few decades. Specifically, the ability to extract and analyze
biomarkers from environmental samples, including lipids, RNA, and DNA, enable characterization of
microbial communities more completely, circumventing many cultivation-based limitations. Microbiolo-
gists now find themselves in an era of rapid experimentation and discovery because the diversity of microbial
communities no longer precludes effective experimental design and analysis. Microbial community analysis
is in a boom era and the protocols in this volume reflect the wide range of methods available for use by
microbiologists to better understand microbial communities in environmental samples.

Keywords: Antibody arrays, Clone library, Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), DNA,
Lipids, Microscopy, Most probably number (MPN), Nucleic acid, Protists, Quantitative PCR (qPCR),
RNA, Single-strand conformational polymorphism (SSCP), Terminal restriction fragment length
polymorphism (T-RFLP)

1 Main Text

Given that most recent developments in cultivation-independent

analysis of microbial communities have involved DNA-based
approaches, especially with the advent of high-throughput
sequencing, there is a tendency to overlook a strong foundation
of relatively standardized methods that are uniquely able to answer
specific questions posed by microbiologists. Cultivation is one of
these foundational and irreplaceable methods [1]. Without cultiva-
tion, the function and metabolic capabilities of a microorganism
cannot be determined conclusively. The methods that are high-
lighted in this volume are broad ranging because they are uniquely
capable of answering specific questions about microbial commu-
nities. As you will see, this volume includes protocols for rapid

T.J. McGenity et al. (eds.), Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols, Springer Protocols Handbooks, (2017) 1–5,
DOI 10.1007/8623_2016_195, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2016, Published online: 03 May 2016

1
2 Josh D. Neufeld

profiling of microbial communities, high-throughput sequencing

of specific genes, and both cultivation-dependent and cultivation-
independent methods that can be used for quantification of micro-
bial community members.
An important objective for many studies of microbial
communities is to quantify specific microorganisms, at multiple
taxonomic levels, within environmental samples. In these cases,
the objectives go beyond a summary of relative abundance data,
which are default in sequence-based analyses, and instead rely on
determining the actual abundance of specific organisms within a
sample of interest. For example, what happens to specific hydrocar-
bon degraders when a pristine environmental sample is exposed to
hydrocarbon contamination? How do these heterotrophic popula-
tions change in abundance with respect to a certain dry weight of
environmental sample? Because microbial biomass and its
corresponding activity is linked to overall biogeochemical cycling,
methods that count cells by microscopy, growth, or biomarker
analyses, can provide important measures of a microbial abundance
and corresponding functions. A protocol in this volume focuses on
cell extraction from oily sediments for microscopy applications [2].
This is important because one challenge of working with
hydrocarbon-contaminated samples is that oils can bind to probes
and stains that would be used for such analyses [3]. Another
protocol uses a most probable number (MPN) technique, adapted
to 96-well plates, to quantify degraders of mixed hydrocarbons,
alkanes, monoaromatic hydrocarbons, and diaromatic hydrocar-
bons [4]. Importantly, tracing 14C-hydrocarbon degradation to
14
CO2 helps confirm MPN enumeration results for growth-
positive wells. Another chapter explores how both cultivation-
dependent (i.e., MPN) and cultivation-independent approaches
(PCR) can be used simultaneously for detecting sulfate-reducing
bacteria in oil reservoirs [5].
As an alternative to quantifying cells by direct counting or
MPN-based approaches, measurements of overall microbial bio-
mass can be achieved by extraction and quantification of specific
biomarkers. An important biomarker for such applications are lipids
that are present as structural components of microbial membranes.
The abundance of these lipids is correlated with overall microbial
biomass, better so than DNA [6], and is a useful measure of the
potential for a community to contribute to biogeochemical cycling
and degradation of contaminant compounds. One advantage to
focusing on quantification of lipids is that their presence in an
environmental sample can reveal information about the composi-
tion of microbial communities in that sample. For example, archaea
possess unique lipids associated with repeating isoprene units that
are specific to archaea. In contrast, bacterial and fungal phospholi-
pids have differing chain lengths and degrees of saturation, which
can be characteristic of specific types of organisms. This volume
Introduction to Microbial Quantitation, Community Profiling, and Array Approaches 3

includes a protocol chapter on measuring microbial biomass using

lipid analysis. This is done for overall microbial communities [7]
and, as described in another volume in this series, for archaea
present within a sample [8].
Analyses of nucleic acids have become commonplace
cultivation-independent methods for profiling and quantifying
microbial communities. Methods for analysis of extracted nucleic
acids usually address either the abundance of specific target organ-
isms within microbial communities or overall microbial community
composition. This volume includes a chapter describing targeted
approaches for quantification of hydrocarbon-degrading bacterial
communities using real-time PCR with extracted community
nucleic acids as targets [9], which can be either DNA or RNA.
This protocol also provides important theoretical background
for quantitative PCR and provides a valuable comparison of both
TaqMan and SYBR Green assays.
For analyzing the composition of microbial communities, one
chapter focuses on high-throughput sequencing of single gene
amplicons, or “meta-genetics,” by presenting a comprehensive
protocol for such analysis pipelines, from sample preparation to
data handling and interpretation [10]. Although high-throughput
sequencing studies are commonplace today, hydrocarbon-
contaminated environments can be associated with lower overall
diversity [11]. With low alpha diversity, rapid profiling methods can
be powerful for comparison of multiple samples at the level of all
bacteria and archaea, or for a subset of the microbial community.
Specifically, fingerprint-based analysis of microbial community
composition can be conducted on the timeframe of days, rather
than weeks for sequence-based analyses. Such fingerprinting meth-
ods also have the advantage of being able to monitor enrichment
cultures, without the need for relatively expensive sequence-based
analysis. We include protocol chapters on denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE; [12]) and a single protocol chapter [13]
that describes both single-strand conformational polymorphism
(SSCP) and terminal restriction fragment length polymorphism
(T-RFLP).
This volume includes a protocol on clone library analysis [14].
As with fingerprinting approaches, clone libraries have become less
common with the advent of high-throughput sequencing. None-
theless, clone libraries are an useful for targeting individual
sequences from a mixture of PCR amplicons or for conducting
initial surveys of low-diversity samples prior to high-throughput
sequencing. In addition, sequence read lengths associated with
clone library analysis are still greater than most commonplace
high-throughput sequencing methods available for the analysis of
nucleic acids. In recent studies of novel phylogenetic diversity
associated with the rare biosphere [15,16], clone library analyses
4 Josh D. Neufeld

enabled the targeted collection of high-quality sequences clone

libraries were the optimal methodological choice for this analysis.
The techniques in this volume represent powerful molecular
approaches for microbial community analysis. The diversity of these
protocols reflects myriad specific questions microbiologists can ask
about microbial communities. Highlighting this diversity of meth-
ods and applications, this volume includes additional boutique
approaches for answering specific questions. For example, one
chapter focuses on the study of protistan communities within
hydrocarbon-contaminated environments [17]. Another approach
explores the use of antibody-based arrays for microbial and bio-
marker detection in the environment [18].
Although microbiologists have long been limited by a paucity
of suitable methods for studying complex microbial communities,
this is no longer the case. We are in an unprecedented era of
discovery and access to appropriate methodology is no longer a
barrier to conducting cutting-edge scientific research. Building on
rapid method development and standardization, the goal of this
volume on microbial quantitation and community profiling is to
assist with exploring the impact of hydrocarbon contamination on
microbial communities within environmental samples.

References
1. Nichols D (2007) Cultivation gives context to
the microbial ecologist. FEMS Microbiol Ecol
60:351–357
2. Lappé M, Kallmeyer J (2014) A cell extraction
method for oily sediments. In: McGenity TJ,
Timmis KN, Nogales Fernández B (eds)
Hydrocarbon and lipid microbiology proto-
cols. Springer Protocols Handbooks
3. Edgcomb VP, Kysela DT, Teske A, de Vera
Gomez A, Sogin ML (2002) Benthic eukary-
otic diversity in the Guaymas Basin hydrother-
mal vent environment. Proc Natl Acad Sci USA
99:7658–7662
4. Johnsen A (2014) Introduction to microplate
MPN-enumeration of hydrocarbon degraders.
In: McGenity TJ, Timmis KN, Nogales Fer-
nández B (eds) Hydrocarbon and lipid micro-
biology protocols. Springer Protocols
Handbooks
5. Shen Y, Voordouw G (2015). Primers for dsr
genes and most probable number method for
detection of sulfate-reducing bacteria in oil
reservoirs. In: McGenity TJ, Timmis KN,
Nogales Fernández B (eds) Hydrocarbon and
lipid microbiology protocols. Springer Proto-
cols Handbooks
6. Leckie SE, Prescott CE, Grayston SJ, Neufeld
JD, Mohn WW (2004) Comparison of
chloroform fumigation-extraction, phospho-
lipid fatty acid, and DNA methods to deter-
mine microbial biomass in forest humus. Soil
Biol Biochem 36:529–532
7. Peacock A, White D (2016) Microbial biomass
and community composition analysis using
phospholipid fatty acids. In: McGenity TJ,
Timmis KN, Nogales Fernández B (eds)
Hydrocarbon and lipid microbiology proto-
cols. Springer Protocols Handbooks
8. Wörmer L, Lipp J, Hinrichs K-U (2016) Com-
prehensive analysis of microbial lipids in envi-
ronmental samples through HPLC-MS
protocols. In: McGenity TJ, Timmis KN,
Nogales Fernández B (eds) Hydrocarbon and
lipid microbiology protocols. Springer Proto-
cols Handbooks
9. McKew B, Smith C (2015) Real-time PCR
approaches for analysis of hydrocarbon-
degrading bacterial communities. In: McGe-
nity TJ, Timmis KN, Nogales Fernández B
(eds) Hydrocarbon and lipid microbiology
protocols. Springer Protocols Handbooks
10. Dumbrell A (2016) Microbial community
analysis by single-amplicon high-throughput
sequencing (metagenetics) – preparation, data
handling and ecological analysis. In: McGenity
TJ, Timmis KN, Nogales Fernández B (eds)
 Introduction to Microbial Quantitation, Community Profiling, and Array Approaches
Hydrocarbon and lipid microbiology proto-
cols. Springer Protocols Handbooks
11. Sutton NB, Maphosa F, Morillo JA, Al-Soud
WA, Langenhoff AA, Grotenhuis T et al (2013)
Impact of long-term diesel contamination on
soil microbial community structure. Appl Envi-
ron Microbiol 79:619–630
12. Green S, Leigh M, Neufeld JD (2016) Dena-
turing gradient gel electrophoresis (DGGE) for
microbial community analysis. In: McGenity
TJ, Timmis KN, Nogales Fernández B (eds)
Hydrocarbon and lipid microbiology proto-
cols. Springer Protocols Handbooks
13. Tebbe C, Dohrmann A, Hemkemeyer M,
N€ather A (2016) Microbial community
profiling: SSCP and T-RFLP techniques. In:
McGenity TJ, Timmis KN, Nogales Fernández
B (eds) Hydrocarbon and lipid microbiology
protocols. Springer Protocols Handbooks
14. Leigh M, Taylor L, Neufeld JD (2015) Clone
libraries of ribosomal RNA gene sequences for
characterization of microbial communities. In:
McGenity TJ, Timmis KN, Nogales Fernández
5
B (eds) Hydrocarbon and lipid microbiology
protocols. Springer Protocols Handbooks
15. Lynch MD, Bartram AK, Neufeld JD (2012)
Targeted recovery of novel phylogenetic diver-
sity from next-generation sequence data. ISME
J 6:2067–2077
16. Lynch MD, Neufeld JD (2015) Ecology and
exploration of the rare biosphere. Nat Rev
Microbiol 13:217–229
17. Johnke J, Chatzinotas A (2015). Studying pro-
tistan communities in hydrocarbon-
contaminated environments. In: McGenity
TJ, Timmis KN, Nogales Fernández B (eds)
Hydrocarbon and lipid microbiology proto-
cols. Springer Protocols Handbooks
18. Blanco Y, Moreno-Paz M, Aguirre J, Parro V
(2016) Multiplex fluorescent antibody micro-
arrays and antibody graphs for microbial and
biomarker detection in the environment. In:
McGenity TJ, Timmis KN, Nogales Fernández
B (eds) Hydrocarbon and lipid microbiology
protocols. Springer Protocols Handbooks
A Cell Extraction Method for Oily Sediments
Michael Lappé and Jens Kallmeyer

Abstract
To get a first impression of the size of the microbial community present in a sediment sample, the
determination of cell abundances in sediments is of great importance for biogeochemical studies. One of
the most simple and reliable methods is direct counting, where the cells are stained with a DNA-binding
stain and counted under an epifluorescence microscope. However, in oily sediments, DNA-specific stains
and molecular probes bind to the hydrocarbons, causing massive background fluorescence, thereby ham-
pering cell enumeration. To overcome this problem, we developed an extraction method in which the
hydrocarbons are removed with organic solvents prior to cell extraction. Due to the reduced background
fluorescence, the microscopic image becomes clearer, making cell identification and enumeration much
easier.
A volumetric ratio of 1:2 to 1:5 between a formalin-fixed sediment slurry and solvent delivers highest cell
counts. n-Hexane delivers best results for samples containing less biodegraded oil, whereas methanol
turned out to be the most appropriate solvent for samples containing strongly biodegraded oil. The optimal
solvent to sample ratio has to be determined prior to analysis for each type of sample.
However, it has to be kept in mind that solvents also tend to lyse cells and that the given protocol has to
be adapted to the individual conditions in order to minimize cell lysis and maximize hydrocarbon removal.

Keywords: Cell enumeration, Cell separation, Hydrocarbons, Oily sediments, Subsurface

microbiology

1 Introduction

Oily sediments have received increased attention over the last few
years, especially because of their microbial richness and diversity
[1]. In order to obtain an accurate picture of the microbial
community in oily sediments, it is important first to quantify the
number of cells. Direct counting is fast, cheap and delivers reliable
results. Therefore, it is one of the most frequently used methods for
determination of microbial cell abundance in sediments. For direct
counting, the cells are stained with a DNA-binding stain and
counted under an epifluorescence microscope.
We tried to count cells directly from completely untreated oily
sediment samples similar to the protocol of Cragg et al. [2].

T.J. McGenity et al. (eds.), Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols, Springer Protocols Handbooks, (2017) 7–16,
DOI 10.1007/8623_2014_19, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014, Published online: 20 November 2014

7
8 Michael Lappé and Jens Kallmeyer

Fig. 1 Image of an oil sand sample under the fluorescence microscope. (a)
Sample processed according to the extraction procedure of Kallmeyer et al. [3]
without hydrocarbon extraction. Cells are difficult to identify due to strong
background fluorescence. (b) Sample after hydrocarbon extraction prior to cell
extraction. Background fluorescence is drastically reduced and cells are much
easier to detect. Figure was originally published in Lappé and Kallmeyer [4]

Unfortunately, the enumeration of cells in oily sediments is ham-

pered by the oil-derived hydrocarbons, which tend to interact with
the DNA-specific stains and molecular probes [1]. This causes high
background fluorescence under the microscope and thereby lowers
the number of detectable cells, making oily sediments hard to
analyse (Fig. 1). One possible way to overcome the problem of
strong background fluorescence is to extract the cells from the
sample. Such techniques are usually used in cases where cell abun-
dance is too low for direct cell counting [5, 6]. Kallmeyer et al. [3]
developed a method to efficiently extract cells from marine sedi-
ments and thereby lower the minimum detection limit from around
105 cells cm3 to 103 cells cm3. Morono et al. [7] further refined
this technique, lowering the detection limit even further to 101
cells cm3. The method works well with oil-free sediments from the
deep marine subsurface, but does not produce satisfactory results
 Cell Extraction from Oily Sediments 9

with oily sediments, as there was considerable background fluores-

cence (Fig. 1a) due to the hydrocarbons still being present.
To overcome the problem of oil-induced background fluores-
cence, we developed a method that in a first step extracts the
hydrocarbons from the sediment with organic solvents and in a
second step separates the cells from the sediment matrix prior to
counting, thereby drastically reducing background fluorescence
(Fig. 1b). Solvents do not only dissolve hydrocarbons, but they
also tend to lyse cells. Different solvents in a wide sample-to-solvent
ratio were tested in order to find the most effective solvent and the
optimal ratio at which cell lysis does not exceed the positive effect of
hydrocarbon removal.
To obtain satisfactory results, the different processing steps
have to be performed in a particular order: (1) sample fixation
and slurry preparation, (2) extraction of hydrocarbons, (3) carbonate
dissolution (if necessary), (4) first cell extraction, and (5) second cell
extraction followed by filter preparation and cell counting.

2 Materials

All materials used for the cell extraction have to be absolute cell-
free. To achieve this, all glassware used during the cell extraction
procedure is combusted before use. In order to increase turnover
time, the glass filter towers for the preparation of the filters are not
combusted but first washed in a sodium hypochlorite solution and
then rinsed first with distilled water and then ethanol, followed by a
final flaming with a blowtorch directly before use. Reagents are
autoclaved if possible and always filter sterilized (0.2 μm pore
size) immediately before use to remove all cells. The following
reagents are used:
l To avoid osmotic stress on the cells, the salinity of the slurry has
to be adjusted to in situ conditions. For the preparation of
primary slurries from marine samples, sodium chloride (NaCl)
solution is used, i.e. 25 g L1 NaCl for normal marine samples.
l For preparation of primary slurries from terrestrial samples,
phosphate buffered saline (PBS) is used: 8 g L1 NaCl,
0.2 g L1 KCl, 1.44 g L1 Na2HPO4, and 0.24 g L1
KH2PO4. For samples with extremely high or low salinity, the
concentration has to be adjusted accordingly. For samples from
salt lakes, we used up to 10 PBS.
When preparing primary slurries, a 20 mL L1 of formalin is
added to the abovementioned solutions. As formalin is not just
toxic but also forms volatiles, its use should be limited to the
preparation of primary slurries, where it is necessary to polymerize
and thereby stabilize the cell walls. For all further steps where the
10 Michael Lappé and Jens Kallmeyer

slurry is diluted or resuspended, 0.1% (w/v) sodium azide (NaN3)

can be used instead. A 0.1% NaN3 is a potent biocide to prevent
growth of accidentally introduced foreign cells. It has the advantage
over formalin of not forming any hazardous volatiles.
l TE buffer (Tris-aminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid
buffer): 1.211 g L1 Tris-aminomethane and 0.372 g L1 ethy-
lenediaminetetraacetic acid. TE buffer is used for further dilu-
tion of terrestrial samples. In principle it is possible to use PBS as
well, but we found that the results were better with TE buffer.
l Carbonate dissolution mix (CDM) for dissolution of carbonates:
20 mL L1 (0.43 M) glacial acetic acid and 35 g L1 (0.43 M)
sodium acetate. NaCl and PBS, respectively, are added to corre-
spond to the salinity of the samples. After autoclaving,
20 mL L1 of formalin is added.
l Detergent mix (DM) for detachment of the cells from sediment
particles: 37.2 g L1 (100 mM) disodium EDTA dihydrate,
44.6 g L1 (100 mM) sodium pyrophosphate decahydrate,
and 10 mL L1 Tween 80. After autoclaving, formalin is
added to a final concentration of 20 mL L1. The solution is
kept under constant stirring during cooling to avoid separation
of Tween 80.
l Nycodenz for the density separation: 500 g L1 Nycodenz,
resulting in a density of ca. 1.25 g mL1.
l Hydrofluoric acid (HF) (1%) to dissolve any remaining silicates
in the supernatant after the density centrifugation. HF is toxic
and has to be handled with great care.
l SYBR-I staining solution: 1 part 1/40 (v/v) diluted SYBR-I
stock solution (20,000x), 1 part 0.1% p-phenylenediamine, 1
part VECTASHIELD mounting medium H-1000 (Vector Lab.
Ltd., Peterborough, UK), and 1 part TE buffer. SYBR Green is
light sensitive so all preparations should be carried out under
dimmed lights. Direct sunlight has to be strictly avoided.
l Black polycarbonate track-etched membrane filters with 0.2 μm
pore size (Whatman Cyclopore). We usually use 25 mm diame-
ter filters, but larger or smaller sizes might also be appropriate,
depending on the specific task.

3 Methods

In order to prevent DNA-specific stains to interact with hydrocar-

bons and to increase the minimum detection limit for cell enumer-
ation, hydrocarbons and cells have to be separated from oily
sediments in five consecutive extraction steps. The cell extraction
method of Kallmeyer et al. [3] serves as basis for this method.
Figure 2 gives an overview of the complete procedure.
 Cell Extraction from Oily Sediments 11

Fig. 2 The flow chart shows the complete hydrocarbon and cell extraction procedure for oily sediments. The
method is based on the cell extraction procedure of Kallmeyer et al. [3]. The hydrocarbon extraction step is
shaded. Details about incubation times and amounts of reagents are provided in the text. Figure was originally
published in Lappé and Kallmeyer [4]
12 Michael Lappé and Jens Kallmeyer

3.1 Sample Fixation 1. The primary sediment slurry is prepared by suspending a sedi-
and Slurry Preparation ment sample in a fixative solution containing 2 vol.% formalin
at the same samples’ salinity. For marine and most terrestrial
samples, 2.5% (w/v) sodium chloride solution and 1 PBS
solution are used, respectively. Ratios between sediment and
fixative solution vary widely between different users. We rec-
ommend using slurries with a 1:5 (v:v) sediment to fixative
ratio. All reagent concentrations are given for 100 μL of a slurry
with a 1:5 ratio.
2. The sample is thoroughly shaken to form a homogenous slurry.

3.2 Extraction Prior to the actual cell extraction, hydrocarbons have to be

of Hydrocarbons removed from the oily sediments, because they interact with
DNA-specific stains used for marking the cells and cause high
background fluorescence under the microscope, thereby prevent-
ing exact cell enumeration.
1. For each type of sediment, the optimal solvent and the slurry to
solvent ratio has to be determined experimentally. We found
optimal ratios of slurry to solvent between 1:2 and 1:5, i.e.
one part of the slurry is combined with 2 to 5 parts of the
solvent. For heavy biodegraded oils, we recommend the use of
methanol, whereas for less biodegraded oils, n-hexane should
be used.
2. The slurry and solvent mixture is shaken (Vortex-Genie
2 shaker) for 20 min to allow for dissolution of oil compounds.
3. After the dissolution of the oil compounds in the solvent, the
sample is centrifuged for 15 min at 12,000g in order to
collect all free floating cells in the pellet.
4. The solvent with the dissolved oil compounds remains in the
supernatant, which is decanted off and discarded. The cells can
then be extracted from the remaining sediment pellet.

3.3 Carbonate Calcium interferes with the dissolution of the extracellular poly-
Dissolution mers that bind the cells to the mineral grains. Carbonate minerals
are the main source of calcium and therefore have to be dissolved
prior to cell detachment.
1. Slurry and CDM are mixed in a 1:5 ratio, so for 100 μL of
slurry, 500 μL of CDM is added.
2. The mixture is slowly shaken for 20 min. During shaking the
vials should be left open to allow the CO2 produced by the
carbonate dissolution to escape.
3. The sample is centrifuged at 3,000g, and the supernatant
carefully taken off and kept for further analysis.
 Cell Extraction from Oily Sediments 13

4. The pellet is resuspended in 300–500 μL of NaCl/NaN3 solu-

tion or in TE buffer, respectively, and centrifuged again to
remove last traces of dissolved calcium. This second
supernatant is added to the first one.

3.4 First Cell After extraction of hydrocarbons and dissolution of carbonates, the
Extraction cells can be extracted from the sediment.
1. The remaining pellet is suspended with 350 μL of either TE
buffer for terrestrial samples or with NaCl/NaN3 solution for
marine samples.
2. 50 μL each of DM and methanol (MeOH) are added.
3. The mixture of slurry, NaCl/NaN3 or TE buffer, DM and
MeOH is vortexed at maximum speed for 30 min.
4. A cushion of 500 μL 50% (wt/vol) Nycodenz is injected into
the bottom of the vial according to Kallmeyer et al. [3].
5. The mixture is centrifuged at 2,000g for 15 min in a swing-
out rotor. The cells are separated from the sediment particles by
density centrifugation.
6. The supernatant containing the detached cells and most of the
Nycodenz is carefully siphoned off using a syringe with a small
needle and stored in a separate vial.

3.5 Second Cell 1. The pellet is resuspended in 350 μL TE buffer or NaCl/NaN3

Extraction solution.
2. Again, 50 μL each of DM and MeOH are added.
3. The sample is sonicated for 10 min in a sonication bath
(Bandelin Sonorex Digitec) at room temperature to detach
the remaining cells.
4. The vials are vortexed for 15 min.
5. The density separation is performed as described above.
6. The supernatants from both density separation steps and the
carbonate dissolution step are pooled and can be used for cell
counting or other applications.
7. Prior to filtration, a 1% hydrofluoric acid (HF) is added to the
pooled supernatants to reach a final concentration of 0.1% and
left for 10 min to dissolve remaining sediment particles and
reduce non-specific background fluorescence.

3.6 Filter Preparation For cell counting, the supernatants are filtered onto 0.2 μm poly-
and Cell Counting carbonate filters (Whatman Cyclopore track-etched membrane)
[8, 9].
1. To ensure an even distribution of the cells on the filter, 5 mL of
0.2 μm filtered TE buffer or NaCl/NaN3 should be placed into
the filter tower prior to the addition of supernatant.
14 Michael Lappé and Jens Kallmeyer

2. After the supernatants have passed through the filters, they are
rinsed inside the filter towers with a few mL of TE buffer to
remove any remaining HF.
3. Staining and embedding of the cells is carried out according to
Morono et al. [10]. About 20 μL of the SYBR-I staining
solution is placed on a microscope glass slide, and then the
filter is placed on top of the droplet. A second 20 μL droplet of
SYBR-I staining solution is placed on the side of a cover slip,
which is carefully placed on top of the filter. Any air bubbles
trapped under the cover slip can then carefully be squeezed.
After about 10 min of incubation at room temperature in the
dark, the filter is ready for microscopic analysis. For longer
storage, the filter should be stored frozen in the dark until
use. Counting can be performed using a fluorescence micro-
scope. Our setup consists of a Leica DM2500 microscope, light
source Leica EL 6000, filter set L5 (excitation filter BP 480/
40, dichromatic mirror 505, suppression filter 527/30), 100x
objective.

4 Notes

4.1 Blank Samples Blank samples should be processed with each batch of samples to
check for possible contamination during processing. Instead of an
actual sediment sample, precombusted (5 h at 450 C) sediment
that is resuspended in 0.2 μm filtered saline solution is used and
processed like a normal sample.

4.2 Sample Fixation 1. It is of great importance to choose the salinity similar to the
and Slurry Preparation environment of the sample. Otherwise, cells might shrink or
inflate, due to osmotic stress. In the worst case, cells lyse and
cannot be counted.

4.3 Extraction of Extraction of hydrocarbons by solvents faces two major challenges:

Hydrocarbons selection of the right solvent and concentration of the solvent.
Although we can clearly say that for strongly biodegraded oils
methanol works best whereas for less biodegraded oils n-hexane
delivers best results, no sharp distinction between “strongly biode-
graded” and “less biodegraded” can be given in terms of API
gravity. Surprisingly, we found that a mixture of methanol and n-
hexane did not deliver satisfactory results in any sample. We do not
have any explanation for this observation. Furthermore, we found
that samples treated with n-octane also revealed high cell counts.
However, we do not recommend its use as the samples extracted
with n-octane and n-decane showed murky supernatants, contain-
ing small flocs of particulate (organic?) matter that settled on the
filter and made cell enumerations rather difficult. All solvents will
 Cell Extraction from Oily Sediments 15

eventually cause cell lysis, if the concentration is high enough.

While too little solvent will not dissolve all hydrocarbons, too
much will cause cell lysis; therefore the optimal solvent concentra-
tion has to be found by a concentration series. In our experience,
cell numbers will gradually increase with increasing solvent concen-
tration and then drop sharply after a certain threshold is reached.
This observation stresses the need for a test series to identify the
optimal solvent to slurry ratio.

4.4 Carbonate Before performing this time-consuming step, it is advisable to

Dissolution check all samples for their carbonate content under a low-
magnification stereomicroscope by adding some drops of HCl to
a small amount of slurry. If carbonate is present, characteristic
foaming or bubbling will be visible. If the sediment does not
contain any carbonates, the carbonate dissolution step will not be
necessary.
2. During the carbonate dissolution step, the vials should be left
open while on the shaker to allow the produced CO2 to escape.
Otherwise the vials might explode or the reaction will not run
to completion due to build-up of excess CO2.

4.5 Filter Preparation The supernatants from both density separation steps and the car-
and Cell Counting bonate dissolution step are pooled and can be used for cell counting
or other applications. In some cases the pooling of the supernatants
caused precipitation of minerals. In such cases the supernatants
from the carbonate dissolution step and the actual cell detachment
have to be kept separate and filtered consecutively onto the
membrane.
3. All handling of SYBR Green I should be carried out under
dimmed light, as the stain is highly sensitive to sunlight. Direct
sunlight has to be strictly avoided. Filters should be stored
frozen until immediately prior to analysis.

References
1. Edgcomb VP, Kysela DT, Teske A, Gomez AD,
Sogin ML (2002) Benthic eukaryotic diversity
in the Guaymas Basin hydrothermal vent envi-
ronment. Proc Natl Acad Sci U S A 99
(11):7658–7662. doi:10.1073/Pnas.
062186399
2. Cragg BA, Parkes RJ, Fry JC, Herbert RA,
Wimpenny JWT, Getliff JM (1990) Bacterial
biomass and activity profiles within deep sedi-
ment layers. Proc Ocean Drill Prog Sci Res
112:607–619
3. Kallmeyer J, Smith DC, Spivack AJ, D’Hondt S
(2008) New cell extraction procedure applied
to deep subsurface sediments. Limnol Ocea-
nogr Method 6:236–245
4. Lappé M, Kallmeyer J (2011) A cell extraction
method for oily sediments. Frontiers in Micro-
biology 2:233. doi:10.3389/fmicb.2011.
00233
5. Fry JC (1988) Determination of biomass. In:
Austin B (ed) Methods in aquatic bacteriology.
Wiley, Chichester, pp 27–72
6. Kallmeyer J (2011) Detection and quantifica-
tion of microbial cells in subsurface sediments.
Adv Appl Microbiol 76:79–103. doi:10.1016/
B978-0-12-387048-3.00003-9
16 Michael Lappé and Jens Kallmeyer
7. Morono Y, Terada T, Kallmeyer J, Inagaki F
(2013) An improved cell separation technique
for marine subsurface sediments: applications
for high-throughput analysis using flow cyto-
metry and cell sorting. Environ Microbiol 15
(10):2841–2849. doi:10.1111/1462-2920.
12153
8. Jones SE, Ditner SA, Freeman C, Whitaker CJ,
Lock MA (1989) Comparison of a new inor-
ganic membrane-filter (anopore) with a track-
etched polycarbonate membrane-filter
(nuclepore) for direct counting of bacteria.
Appl Environ Microbiol 55(2):529–530
9. Stockner JG, Klut ME, Cochlan WP (1990)
Leaky filters - a warning to aquatic ecologists.
Can J Fish Aquat Sci 47(1):16–23
10. Morono Y, Terada T, Masui N, Inagaki F
(2009) Discriminative detection and enumera-
tion of microbial life in marine subsurface sedi-
ments. ISME J 3(5):503–511. doi:10.1038/
Ismej.2009.1
Introduction to Microplate MPN Enumeration
of Hydrocarbon Degraders
Anders R. Johnsen

Abstract
The number of hydrocarbon-degrading microorganisms in environmental samples or liquid cultures can be
determined by the most probable number (MPN) methods. These procedures are based on serial dilution
of the sample and subsequent determination of the presence or absence of degrader cells for several
subsamples of each dilution. The 96-well format of the microplate is very suitable for such replicate
detection of growth of hydrocarbon degraders. Growth-positive wells can be distinguished from growth-
negative wells by several means, for instance, by increased optical density, by emulsification of a crude oil
film, by the metabolic conversion of colorless tetrazolium compounds into the corresponding colored
formazans, or by mineralization of 14C-labeled substrates. Detailed instructions are given for (1) the
preparation of dilution series; (2) MPN enumeration of total oil degraders, alkane degraders, monoaro-
matic hydrocarbon degraders, and diaromatic hydrocarbon degraders; (3) MPN enumeration of polycyclic
aromatic hydrocarbon (PAH) degraders; (4) a radiotracer MPN method based on the conversion of 14C-
labeled substrate into 14CO2 which is quantified by autoradiography and digital image analysis; and (5) how
to interpret results and calculate MPNs.

Keywords: Autoradiography, Dilution to extinction, Mineralization, Most probable number, Optical

density, Phase partitioning, Radiorespirometry, Tetrazolium, WST-1

1 Introduction

The most probable number (MPN) methods are used for deter-
mining the number of specific types of microorganisms in environ-
mental samples or liquid cultures. Most MPN methods are based
on growth in liquid medium under selective conditions that only
allow growth of the specific target organisms; this is conveniently
done in 96-well microplates. Hydrocarbon degraders are generally
MPN enumerated in minimal medium containing one or more
hydrocarbons. Cells that can use the hydrocarbons as the sole
source of carbon and energy will proliferate, whereas non-
degraders will starve and become metabolically inactive. It is there-
fore important to use very clean glassware so the medium is not
contaminated with non-hydrocarbon substrate.

T.J. McGenity et al. (eds.), Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols, Springer Protocols Handbooks, (2017) 17–33,
DOI 10.1007/8623_2014_28, © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014, Published online: 30 December 2014

17
18 Anders R. Johnsen

The MPN methods are based on the dilution-to-extinction

principle, where the sample is serially diluted until the target organ-
ism is no longer present in the highest dilutions. The presence or
absence of the target organism is then determined for several sub-
samples of each dilution followed by calculation of the MPN from
the distribution of positive and negative subsamples.
A single cultivable cell in the highest positive dilution should, in
principle, be able to give a positive well for the methods to work.
One should therefore incubate the plates long enough to allow a
single starter cell to multiply to a detectable level. Some people
advocate that MPN plates should be incubated under conditions
(temperature, pH, nutrient concentration, etc.) that are as similar as
possible to the conditions at the site where the sample originated.
This is not necessarily a good strategy as growth under seminatural
conditions in dilute media is often slow, leading to false negatives.
Instead, we should MPN enumerate hydrocarbon degraders under
fast-growth conditions as long as these conditions do not prevent
the growth of any subpopulations. Hydrocarbon degraders in arctic
soil samples, for instance, are better MPN enumerated at 10 C than
at 2 C because growth is much faster at 10 C, but the temperature
is still low enough to allow growth of most psychrophilic degraders.
Growth-positive wells are distinguished from negative wells in
many ways. A robust way of enumerating total oil-degrading micro-
organisms is the sheen screen method [1]. The basic assumption of
this method is that the majority of marine hydrocarbon degraders
have the ability to emulsify crude oil, an assumption that has not
been tested in detail. Tenfold dilution series of marine samples are
distributed in 24-well microplates, a thin layer of sterile crude oil is
added to each well, and the plates are incubated for 3 weeks. Wells
are scored as positive “when oil emulsification is clearly indicated by
disruption of the oil sheen” [1]. This method proved its’ value
during the Exxon Valdez oil spill when hundreds of samples were
enumerated at sea.
A second way of detecting growth is by increased respiration in
growth-positive wells. Respiration is often determined by adding a
tetrazolium compound that replaces oxygen as the terminal elec-
tron acceptor [2]. A colorless tetrazolium salt is thereby trans-
formed into a colored formazan by respiratory active cells. Not all
environmental isolates have the capability of transforming tetrazo-
lium compounds [3], which may lead to occasional false negatives.
Because reduction of tetrazolium compounds is an indirect
method, false positives may be seen when carbon sources other
than hydrocarbons are present in the microplate wells. For some
older tetrazolium salts, the colored formazan is difficult to dissolve.
For these compounds, the pattern of growth-positive and growth-
negative well is therefore scored visually, which is subjective to some
degree.
Introduction to Microplate MPN Enumeration of Hydrocarbon Degraders 19

Haines et al. [4] used the tetrazolium compound INT (2-(4-iodo-

phenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride) for
enumerating total hydrocarbon degraders. INT is converted into a
purple intracellular precipitate by active cells. Tenfold dilution series
were distributed in 96-well microplates, 2 μL of oil (F2) was added to
each well, the plates were incubated 2 weeks, and growth was then
determined visually after incubation with INT. The results from this
procedure were similar to results obtained in parallel experiments using
the sheen screen method.
Below, we present a method for enumerating degraders of
individual polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in a protocol
that uses the tetrazolium compound WST-1 for detection of
growth-positive wells. WST-1 has the advantage that it is soluble
both in the tetrazolium form and when reduced to a colored
formazan by active cells, which allows nonsubjective scoring of
positive wells by using a microplate photometer [5].
Oxidation of some oil aromatics may lead to accumulation of
colored metabolites, a principle that may be used to distinguish
positive from negative wells when enumerating PAH degraders. In
these methods, the PAHs are first added to the microplate wells
dissolved in an organic solvent; the solvent is then evaporated and
leaves the PAHs as a cover of crystals on the well surface. The wells
are inoculated with a dilution series and incubated, and positive
wells are identified by accumulation of yellow or brown
metabolites.
This principle was used by Stieber et al. [6] for enumerating
degraders of pure PAHs (naphthalene, 1-methylnaphthalene, 2-
methylnaphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, phenanthrene,
and pyrene) or a PAH mixture (naphthalene, phenanthrene, and
pyrene). It is a basic assumption in this method that most PAH
degraders should release colored metabolites during growth. To
my knowledge, it has not been investigated which percentage of
PAH degraders would actually release colored metabolites or
whether these metabolites are transient or remain in the wells.
The method was modified by Wrenn and Venosa [7] in a method
for estimating total PAH degraders grown on a mixture of PAHs
(phenanthrene, anthracene, fluorene, and dibenzothiophene). This
method probably mostly detects phenanthrene degraders because
the concentration of phenanthrene is tenfold higher than the other
PAHs and because the number of phenanthrene degraders greatly
exceeds the numbers of anthracene, dibenzothiophene, and fluorene
degraders in most environmental samples. Coloration of positive
wells is probably caused mostly by dead-end metabolites from come-
tabolization of dibenzothiophene, which would make the method
more robust than the Stieber et al. approach.
The most direct way is to detect increased optical density as a
result of growth. This approach can be problematic in hydrocarbon
MPN because the insoluble hydrocarbons may be present as
20 Anders R. Johnsen

crystals or colored liquids, which interfere with the optical density

measurements. Direct determination of growth by increased optical
density is, however, often superior when the hydrocarbons are
provided through gas phase [8] or dissolved in clear silicone oil.
Mixed oil substrates (crude oils, diesel, gasoline, etc.) com-
monly contain 20–25% light aromatics, a class of compounds that
is bacteriotoxic because they destabilize the cell membranes. This
may be the reason that a single cell often may not be capable of
initiating growth and producing a positive well when complex oil
fractions are used as MPN carbon sources [4]. The toxicity is a
much greater problem when one wants to enumerate degraders of
pure oil aromatics of relatively high solubility like xylenes and
naphthalenes. In microplates, the problem may be solved by apply-
ing the aromatics dissolved in solid silicone [9] or in silicone oil
[10]. The aromatics phase partition between the biologically inert
silicone and the water phase. Phase partitioning leads to low and
nontoxic aqueous concentrations, and when microorganisms
degrade the substrate from the water phase, more substrate is
dissolved from the silicone phase. A method for enumerating total
hydrocarbon degraders, alkane degraders, monoaromatic hydrocar-
bon degraders, and diaromatic hydrocarbon degraders based on
substrate phase partitioning and measurements of optical density is
presented below.
The most reliable principle for MPN enumeration of hydrocar-
bon degraders is probably the mineralization of 14C-labeled sub-
strates. In these methods, a 14C-hydrocarbon is mineralized to
14
CO2 in growth-positive wells, and the produced 14CO2 is cap-
tured in alkaline traps and quantified. The method has been used in
a traditional test-tube format where the 14CO2 was quantified by
liquid scintillation counting [11]. In the procedure described
below, we have modified the method for a 96-well microplate
setup, where the 14CO2 is quantified simultaneously from all wells
by autoradiography followed by digital image analysis.

2 Preparation of Dilution Series

The material used for dilution series can be soil, sediment, or water
samples, liquid enrichments, or liquid pure cultures. The samples
are serially diluted in half-strength Bushnell-Haas Broth [12] which
has the following composition (per liter): MgSO4, 0.10 g; CaCl2,
0.01 g; KH2PO4, 0.5 g; (NH4) 2HPO4, 0.5 g; KNO3, 0.5 g; and
FeCl3, 0.025 g. Premixed Bushnell-Haas Broth can be obtained
from Difco. When enumerating marine hydrocarbon degraders, the
Bushnell-Haas Broth is often supplemented with 20 g L1 of NaCl.
The pH of the medium is in the following protocol lowered from
the usual 7.2 to 6.8 because 14CO2-release from the medium is very
pH sensitive.
Another random document with
no related content on Scribd:
la poursuite devenait impossible: Constantin,
fuyant à toute bride, avait eu la précaution de faire Lact. de mort.
couper les jarrets à tous les chevaux de poste qu'il pers. c. 24.
laissait sur son passage; et la rage impuissante du
tyran ne lui laissa que le regret de n'avoir pas osé Praxag. ap.
faire le dernier crime. Photium, cod.
62.
Constantin traverse comme un éclair l'Illyrie et les
Alpes, avant que Sévère puisse en avoir des
nouvelles, et arrive au port de Boulogne (Bononia) AN 306.
lorsque la flotte mettait à la voile. A cette vue
inespérée on ne peut exprimer la joie de xii. Constantin
Constance: il reçoit entre ses bras ce fils que tant s'échappe des
de périls lui rendaient encore plus cher; et mêlant mains de
ensemble leurs larmes et toutes les marques de Galérius.
leur tendresse, ils arrivent dans la Grande-
Bretagne, où Constance, après avoir vaincu les Lact. de mort.
Pictes, mourut de maladie le 25 juillet de l'an 306. pers. c. 24.
Il avait eu de son mariage avec Théodora, trois fils:
Delmatius, Jule-Constance, Hanniballianus, et trois Anony. Vales.
filles, Constantia, qui fut femme de Licinius,
Anastasia qui épousa Bassianus, et Eutropia mère
de Népotianus, dont je parlerai ailleurs. Mais il Zos. l. 2, c. 8.
respectait trop la puissance souveraine, pour
l'abandonner comme une proie à disputer entre xiii. Il joint son
ses enfants; et il était trop prudent pour affaiblir ses père.
états par un partage. Le droit d'aînesse, soutenu
d'une capacité supérieure, appelait à l'empire Eumen. paneg.
Constantin, qui était déja dans sa trente-troisième c. 7 et 8.
année. Le père mourant couvert de gloire, au
milieu de ses enfants qui fondaient en larmes et
Anony. Vales.
qui révéraient ses volontés comme des oracles,
embrassa tendrement Constantin et le nomma son
successeur; il le recommanda aux troupes, et Till. note 5, sur
ordonna à ses autres fils de lui obéir. Constantin.

Toute l'armée s'empressa d'exécuter ces dernières dispositions de

Constance: à peine eut-il les yeux fermés, que les officiers et les
soldats, excités encore par Éroc, roi des Allemans
auxiliaires, proclamèrent Constantin Auguste. Ce xiv. Il lui
prince s'efforça d'abord d'arrêter l'ardeur des succède.
troupes; il craignait une guerre civile; et pour ne
pas irriter Galérius, il voulait obtenir son agrément Liban. in
avant que de prendre le titre d'empereur. Basilico.
L'impatience des soldats se refusa à ces
ménagements politiques: au premier moment que
Euseb. vit.
Constantin, encore tout en larmes, sortit de la Const. l. 1, c.
tente de son père, tous l'environnèrent avec de 21.
grands cris: en vain voulut-il leur échapper à
course de cheval; on l'atteignit, on le revêtit de la
pourpre malgré sa résistance; tout le camp xv.
Proclamation de
retentissait d'acclamations et d'éloges; Constance Constantin.
revivait dans son fils, et l'armée n'y voyait de
différence que l'avantage de la jeunesse.
Eumenius,
Le premier soin du nouvel empereur fut de rendre Paneg. c. 8.
à son père les derniers devoirs: il lui fit faire de
magnifiques funérailles, et marcha lui-même à la
tête avec un grand cortège. On décerna à Euseb. Vit.
Const. l. 1, c.
Constance, selon la coutume, les honneurs
22.
divins[5]. M. de Tillemont rapporte, sur le
témoignage d'Alford et d'Ussérius, qu'on montre
son tombeau en divers endroits de l'Angleterre, et Vict. epit.
particulièrement en un lieu appelé Caïr-Segeint ou
Sejont, quelquefois Caïr-Custeint, c'est-à-dire, Ville Zos. l. 2, c. 9.
de Constance ou de Constantin; et que, en 1283,
comme on prétendit avoir trouvé son corps dans Hist. misc. l. 11.
un autre lieu qui n'est pas loin de là, Edouard I, qui apud Muratori,
régnait alors, le fit transporter dans une église, T. I, p. 71.
sans se mettre beaucoup en peine si les canons
permettaient d'y placer un prince païen. Il ajoute
xvi. Sépulture
que Cambden raconte que peu de temps avant lui,
de Constance.
c'est-à-dire au commencement du seizième siècle,
en fouillant à York dans une grotte où l'on tenait
qu'était le tombeau de Constance, on y avait Euseb. Hist.
ecc. l. 8, c. 13 et
trouvé une lampe qui brûlait encore; et Alford juge Vit. Const. l. 1,
que selon les preuves les plus solides, c'était, en c. 22.
effet, le lieu de la sépulture de ce prince.
[5] Beaucoup de médailles frappées après la mort de ce Numism.
prince, portent les légendes: DIVO. CONSTANTIO. AVG. ou Mezzab.
DIVO. CONSTANTIO. PIO. PRINCIPI ou bien DIVVS.
CONSTANTIVS. Quelques-unes, frappées par les ordres de
Maxence, portent IMP. MAXENTIVS. DIVO. CONSTΑΝΤIΟ. Till., art. 7.
AD-FINI vel COGN.—S.-M.
Sa mort semblait favoriser les desseins de Alford, Ann.
Galérius: elle entrait dans le plan qu'il avait dressé Brit., an 306 §
6.
pour se rendre le seul monarque; mais elle était
arrivée trop tôt, et ce contre-temps rompait toutes
ses mesures. Son projet avait été de substituer à Usserius, Brit.
Constance, Licinius son ancien ami: il s'aidait de Eccl. Antiq. p.
ses conseils, et comptait sur une obéissance 60.
aveugle de sa part. Il lui destinait le titre d'Auguste,
et c'était dans cette vue qu'il ne lui avait pas fait [Eckhel, doct.
donner celui de César. Alors maître de tout, et ne num. vet. t. viii,
laissant à Licinius qu'une ombre d'autorité, il aurait p. 28-32.]
disposé à son gré de toutes les richesses de
l'empire; et après avoir accumulé d'immenses xvii. Projets de
trésors, il aurait quitté, comme Dioclétien, au bout Galérius.
de vingt ans la puissance souveraine, et se serait
ménagé une retraite assurée et tranquille pour une Lact. de mort.
vieillesse voluptueuse; en laissant pour empereurs pers. c. 20 et
Sévère avec Licinius, et pour Césars Maximin et seq.
Candidianus son fils naturel, qui n'avait encore que
neuf ans, et qu'il avait fait adopter par sa femme Valéria, quoique cet
enfant ne fût né que depuis le mariage de cette princesse.
Pour réussir dans ces projets il fallait exclure
Constantin: mais Galérius s'était rendu trop odieux xviii. Ses
par sa cruauté et par son avarice. Depuis sa cruautés.
victoire sur les Perses, il avait adopté le
gouvernement despotique établi de tout temps dans ce riche et
malheureux pays; et sans pudeur, sans égard pour les sentiments
d'une honnête soumission, à laquelle une longue habitude avait plié
les Romains, il disait hautement que le meilleur usage auquel on
pouvait employer des sujets, c'était d'en faire des esclaves. Ce fut
sur ces principes qu'il régla sa conduite. Nulle dignité, nul privilége
n'exemptait ni des coups de fouet, ni des plus horribles tortures les
magistrats des villes: des croix toujours dressées attendaient ceux
qu'il condamnait à mort; les autres étaient chargés de chaînes et
resserrés dans des entraves. Il faisait traîner dans des maisons de
force des dames illustres par leur naissance. Il avait fait chercher par
tout l'empire des ours d'une énorme grosseur, et leur avait donné
des noms: quand il était en belle humeur, il en faisait appeler
quelqu'un, et se divertissait à les voir non pas dévorer sur-le-champ
des hommes, mais sucer tout leur sang et déchirer ensuite leurs
membres: il ne fallait rien moins pour faire rire ce tyran sombre et
farouche. Il ne prenait guère de repas sans voir répandre du sang
humain. Les supplices des gens du peuple n'étaient pas si
recherchés: il les faisait brûler vifs.
Galérius avait d'abord fait sur les chrétiens l'essai
de toutes ces horreurs, ordonnant par édit, xix. Contre les
qu'après la torture ils seraient brûlés à petit feu. Chrétiens.
Ces ordres inhumains ne manquaient pas
d'exécuteurs fidèles, qui se faisaient un mérite d'enchérir encore sur
la barbarie du prince. On attachait les chrétiens à un poteau; on leur
grillait la plante des pieds, jusqu'à ce que la peau se détachât des
os; on appliquait ensuite sur toutes les parties de leur corps des
flambeaux qu'on venait d'éteindre; et pour prolonger leurs
souffrances avec leur vie, on leur rafraîchissait de temps en temps
d'eau froide la bouche et le visage: ce n'était qu'après de longues
douleurs que, toute leur chair étant rôtie, le feu pénétrait jusqu'aux
entrailles, et jusqu'aux sources de la vie. Alors on achevait de brûler
ces corps déja presque consumés, et on en jetait les cendres dans
un fleuve ou dans la mer.
Le sang des chrétiens ne fit qu'irriter la soif de
Galérius. Bientôt il n'épargna pas les païens xx. Contre les
mêmes. Il ne connaissait point de degré dans les païens mêmes.
punitions: reléguer, mettre en prison, condamner
aux mines, étaient des peines hors d'usage; il ne parlait que de feux,
de croix, de bêtes féroces: c'était à coups de lance qu'il châtiait ceux
qui formaient sa maison; il fallait aux sénateurs d'anciens services et
des titres bien favorables, pour obtenir la grace d'avoir la tête
tranchée. Alors tous les talents qui, déja fort affaiblis, respiraient
encore, furent entièrement étouffés: on bannit, on fit mourir les
avocats et les jurisconsultes; les lettres passèrent pour des secrets
dangereux, et les savants pour des ennemis de l'état. Le tyran,
faisant taire toutes les lois, se permit de tout faire, et donna la même
licence aux juges qu'il envoyait dans les provinces: c'étaient des
gens qui ne connaissaient que la guerre, sans étude et sans
principes, adorateurs aveugles du despotisme, dont ils étaient les
instruments.
Mais ce qui porta dans les provinces une
désolation universelle, ce fut le dénombrement xxi. Rigueur des
qu'il fit faire de tous les habitants de ses états, et impositions.
l'estimation de toutes les fortunes. Les
commissaires répandaient partout la même inquiétude et le même
effroi que des ennemis auraient pu causer; et l'empire de Galérius
d'une extrémité à l'autre ne semblait plus être peuplé que de captifs.
On mesurait les campagnes, on comptait les ceps de vignes, les
arbres, et, pour ainsi dire, les mottes de terre; on faisait registre des
hommes et des animaux: la nécessité des déclarations remplissait
les villes d'une multitude de paysans et d'esclaves; les pères y
traînaient leurs enfants. La justice d'une imposition proportionnelle
aurait rendu ces contraintes excusables, si l'humanité les eût
adoucies, et si les impositions en elles-mêmes eussent été
tolérables; mais tout retentissait de coups de fouets et de
gémissements; on mettait les enfants, les esclaves, les femmes à la
torture, pour vérifier les déclarations des pères, des maîtres, des
maris; on tourmentait les possesseurs eux-mêmes, et on les forçait,
par la douleur, de déclarer plus qu'ils ne possédaient: la vieillesse ni
la maladie ne dispensaient personne de se rendre au lieu ordonné;
on fixait arbitrairement l'âge de chacun; et comme, selon les lois,
l'obligation de payer la capitation devait commencer et finir à un
certain âge, on ajoutait des années aux enfants et on en ôtait aux
vieillards. Les premiers commissaires avaient travaillé à satisfaire
l'avidité du prince par les rigueurs les plus outrées: cependant
Galérius, pour presser encore davantage ses malheureux sujets, en
envoya d'autres, à plusieurs reprises, faire de nouvelles recherches;
et les derniers venus, pour enchérir sur leurs prédécesseurs,
surchargeaient à leur fantaisie, et ajoutaient à leur rôle beaucoup
plus qu'ils ne trouvaient ni dans les biens ni dans le nombre des
habitants. Cependant les animaux périssaient, les hommes
mouraient; et après la mort on les faisait vivre sur les rôles, on
exigeait encore la taxe des uns et des autres. Il ne restait d'exempts
que les mendiants: leur indigence les sauvait de l'imposition, mais
non pas de la barbarie de Galérius; on les rassembla par son ordre
au bord de la mer, et on les jeta dans des barques qu'on fit couler à
fond.
Telle est l'idée qu'un auteur contemporain, très-
instruit et très-digne de foi, nous a laissée du xxii. Les crimes
gouvernement de Galérius. Quelque méchant que de ses officiers
fût ce prince, une partie de ces vexations doit sans doivent lui être
doute être imputée à ses officiers. Mais telle est la imputés.
condition de ceux qui gouvernent; ils prennent sur leur compte les
injustices de ceux qu'ils emploient: ce sont les crimes de leurs
mains. Les noms de ces hommes obscurs périssent avec eux; mais
leurs iniquités survivent et restent attachées au supérieur, dont le
portrait se compose en grande partie des vertus et des vices de
ceux qui ont agi sous ses ordres.
Galérius était occupé de ces rapines et de ces
violences, quand il apprit la mort de Constance: xxiii. Il refuse à
bientôt après on lui présenta l'image de Constantin Constantin le
couronnée de laurier. Le nouvel empereur la lui titre d'Auguste,
envoyait, selon la coutume, pour lui notifier son et le donne à
Sévère.
avénement à l'empire. Il balança long-temps s'il la
recevrait: son premier mouvement fut de la jeter au
feu avec celui qui l'avait apportée; mais on lui Lact., de mort.
représenta ce qu'il avait à craindre de ses propres pers. c. 25.
soldats, déja mécontents du choix des deux
Césars, et tout disposés à se déclarer pour Till. art. 5.
Constantin, qui viendrait sans doute lui arracher
son consentement à main armée. Plus susceptible de crainte que de
sentiment de justice, il reçut à regret cette image; et pour paraître
donner ce qu'il ne pouvait ôter, il envoya la pourpre à Constantin.
Ses vues sur Licinius se trouvaient trompées; mais afin d'abaisser
du moins le nouveau prince, autant qu'il pourrait le faire, il s'avisa de
donner le titre d'Auguste à Sévère, qui était le plus âgé, et de ne
laisser à Constantin que le rang de César après Maximin, le faisant
ainsi descendre du second degré au quatrième. Le jeune prince,
dont l'ame était élevée et l'esprit solide, parut se contenter de ce
qu'on lui accordait, et ne jugea pas à propos de troubler la paix de
l'empire, pour conserver le titre d'un pouvoir dont il possédait toute la
réalité. En effet, c'est de cette année qu'on commença à compter
celles de sa puissance tribunitienne.
Sévère, qui commandait en Italie, fort satisfait de
cette nouvelle disposition, ne différa pas d'envoyer xxiv. Maxence
à Rome l'image de Constantin, pour l'y faire élevé à l'empire.
reconnaître en qualité de César. Mais le dépit d'un
rival méprisé jusques alors, et qui prétendait avoir Incert. Paneg. c.
plus de droit à l'empire que tous ces nouveaux 4.
souverains, renversa l'ordre établi par Galérius.
Marcus Aurelius Valerius Maxentius était fils de
Lact. de mort.
Maximien. Ses mauvaises qualités, et peut-être pers. c. 18 et
ses malheurs, ont fait dire qu'il était supposé; on 26.
prétend même que sa mère Eutropia avoua qu'elle
l'avait eu d'un Syrien. C'était un prince mal fait de
corps et d'esprit, d'une ame basse, et plein Anony. Vales.
d'arrogance, débauché et superstitieux, brutal
jusqu'à refuser le respect à son père. Galérius lui Eutrop. l. 10.
avait donné en mariage une fille qu'il avait eue de
sa première femme; mais ne voyant en lui que des
Till. note 12 et
vices dont il ne pouvait faire usage, il avait 13.
empêché Dioclétien de le nommer César. Ainsi
Maxence, oublié de son père, haï de son beau-père, avait, jusqu'à
ce temps, mené une vie obscure, enveloppé dans les ténèbres de la
débauche, tantôt à Rome, tantôt en Lucanie. Le bruit de l'élévation
de Constantin le réveilla: il crut devoir sauver une partie de son
héritage, qu'il se voyait enlever par tant de mains étrangères. La
disposition des esprits lui donnait de grandes facilités: l'insatiable
avidité de Galérius alarmait la ville de Rome; on y attendait des
commissaires chargés d'exercer les mêmes vexations qui faisaient
déja gémir les provinces; et comme Galérius craignait la milice
prétorienne, il en avait cassé une partie: c'était donner à Maxence
ceux qui restaient. Aussi les gagna-t-il aisément par le moyen de
deux tribuns nommés Marcellianus et Marcellus; et les intrigues de
Lucien, préposé à la distribution des viandes, qui se faisait aux
dépens du fisc, firent déclarer le peuple en sa faveur. La révolution
fut prompte; elle ne coûta la vie qu'à un petit nombre de magistrats
instruits de leur devoir, même à l'égard d'un prince odieux; entre
lesquels l'histoire ne nomme qu'Abellius, dont la qualité n'est pas
bien connue. Maxence, qui s'était arrêté à deux ou trois lieues de
Rome sur le chemin de Lavicum, fut proclamé Auguste le 28
octobre.
Galérius qui était en Illyrie, ne fut pas fort alarmé
de cette nouvelle. Il faisait trop peu de cas de xxv. Maximien
Maxence pour le regarder comme un rival reprend le titre
redoutable. Il écrit à Sévère, qui résidait à Milan, et d'Auguste.
l'exhorte à se mettre lui-même à la tête de ses
troupes et à marcher contre l'usurpateur. Maxence, Lact., de mort.
aussi timide que Sévère, n'osait s'exposer seul à pers. c. 26.
l'orage dont il était menacé. Il eut recours à son
père Maximien, qui peut-être était d'intelligence Baluzius in Lact.
avec lui, et qui se trouvait alors en Campanie. p. 315.
Celui-ci, qui ne pouvait s'accoutumer à la vie
privée, accourt à Rome, rassure les esprits, écrit à
Dioclétien pour l'engager à reprendre avec lui le Eutrop. l. 10.
gouvernement de l'empire; et sur le refus de ce
prince, il se fait prier par son fils, par le sénat et Incert. Pan.
par le peuple, d'accepter de nouveau le titre Maxim. et
d'Auguste. Const. c. 10.

Maximin ne prit point de part à ces premières

agitations. Tranquille en Orient, et livré à ses xxvi. Maximin
plaisirs, il goûtait un repos dont il ne laissait pas ne prend point
jouir les chrétiens. Étant à Césarée de Palestine le de part à ces
mouvements.
20 novembre, jour de sa naissance, qu'il célébrait
avec grand appareil, après les divertissements
ordinaires, il voulut embellir la fête par un Eus. de Mart.
spectacle dont les païens étaient toujours fort Palæst. c. 6.
avides. Le chrétien Agapius était depuis deux ans
condamné aux bêtes. La compassion du magistrat, ou l'espérance
de vaincre sa fermeté, avait fait différer son supplice. Maximin le fait
traîner sur l'arène avec un esclave qu'on disait avoir assassiné son
maître. Le César fait grace au meurtrier, et tout l'amphithéâtre
retentit d'acclamations sur la clémence du prince. Ayant fait ensuite
amener le chrétien devant lui, il lui promet la vie et la liberté, s'il
renonce à sa religion. Mais celui-ci protestant à haute voix qu'il est
prêt à tout souffrir avec joie pour une si belle cause, court lui-même
au-devant d'une ourse qu'on avait lâchée sur lui, et s'abandonne à la
férocité de cet animal, qui le déchire. On le reporte à demi mort dans
la prison, et le lendemain comme il respirait encore, on le jette dans
la mer avec de grosses pierres attachées à ses pieds. Tels étaient
les amusements de Maximin.
Constantin signalait les commencements de son
empire par des actions plus dignes d'un souverain. xxvii.
Quoiqu'il fût encore dans les ténèbres du Occupations de
paganisme, il ne se contenta pas, comme son Constantin.
père, de laisser aux chrétiens, par une permission
tacite, le libre exercice de leur religion, il l'autorisa Lact., de mort.
par un édit. Comme il avait souvent dans la pers. c. 24.
bouche cette belle maxime: que c'est la fortune qui
fait les empereurs, mais que c'est aux empereurs à Lamprid. in
justifier le choix de la fortune, il s'occupait du soin Helag. c. 34.
de rendre ses sujets heureux. Il s'appliqua d'abord
à régler l'intérieur de ses états, et songea ensuite à en assurer les
frontières.
Après avoir visité les provinces de son obéissance,
en rétablissant partout le bon ordre, il marcha xxviii. Sa
contre les Francs. Ces peuples, les plus belliqueux victoire sur les
des barbares, profitant de l'absence de Constance Francs.
pour violer les traités de paix, avaient passé le
Rhin et faisaient de grands ravages. Constantin les vainquit, fit
prisonniers deux de leurs rois, Ascaric et Régaïse;
et pour punir ces princes de leur perfidie, il les fit Eus. vit. Const.
dévorer par les bêtes dans l'amphithéâtre: action l. 1, c. 25.
barbare qui déshonorait sa victoire, et à laquelle la
postérité doit d'autant plus d'horreur, que la basse Eumen. Paneg.
flatterie des orateurs du temps s'est efforcée d'en c. 10 et 11.
faire plus d'éloge.
Ayant forcé les Francs à repasser le fleuve, il le Nazar. Pan. c.
passa lui-même sans être attendu, fondit sur leur 16 et 17.
pays[6], et les surprit avant qu'ils eussent eu le
temps de se sauver, comme c'était leur coutume, Incert. Pan. c. 4
dans leurs bois et leurs marais. On en massacra, et 23.
on en prit un nombre prodigieux. Tous les
troupeaux furent égorgés ou enlevés; tous les
xxix. Il acheva
villages brûlés. Les prisonniers qui avaient l'âge de de les dompter.
puberté, trop suspects pour être enrôlés dans les
troupes, trop féroces pour souffrir l'esclavage,
furent tous livrés aux bêtes à Trèves, dans les jeux Eumen. Pan. c.
qui furent célébrés après la victoire. Le courage de 12 et 13.
ces braves gens effraya leurs vainqueurs, qui
s'amusaient de leur supplice: on les vit courir au- Vorburg, Hist.
devant de la mort, et conserver encore un air Rom. Germ., l.
intrépide entre les dents et sous les ongles des 2, p. 112.
bêtes farouches, qui les déchiraient sans leur
arracher un soupir. Quoi qu'on puisse dire pour Incert. Pan. c.
excuser Constantin, il faut avouer qu'on retrouve 23 et 24.
dans son caractère des traits de cette férocité
commune aux princes de son siècle, et qui s'échappa encore en
plusieurs rencontres, lors même que le christianisme eut adouci ses
mœurs.
[6] Constantin ravagea le pays des Bructères, tribu de la nation des Francs.—S.-
M.
Pour ôter aux barbares l'envie de passer le Rhin,
et pour se procurer à lui-même une libre entrée sur xxx. Il met à
leurs terres, il entretint, le long du fleuve, les forts couvert les
déja bâtis et garnis de troupes, et sur le fleuve
même une flotte bien armée. Il commença à terres de la
Cologne un pont de pierre qui ne fut achevé qu'au Gaule.
bout de dix ans, et qui, selon quelques-uns,
subsista jusqu'en 955. On dit aussi que ce fut pour Eumenius, Pan.
défendre ce pont qu'il bâtit ou répara le château de c. 13.
Duitz vis-à-vis de Cologne[7]. Ces grands ouvrages
achevèrent d'intimider les Francs; ils demandèrent Vorb. Hist. Rom.
la paix, et donnèrent pour ôtages les plus nobles Germ. t. 2, p.
de leur nation. Le vainqueur, pour couronner ces 170.
glorieux succès, institua les jeux franciques, qui
continuèrent long-temps de se célébrer tous les Till., art. 10.
ans depuis le 14 de juillet jusqu'au 20.
[7] C'est une conjecture de Bucher (Hist. Belg., l. 8, c. 2, § 5). Les anciens ne
disent rien de pareil.—S.-M.
Tout était en mouvement en Italie. Sévère, parti de
Milan au milieu de l'hiver de l'an 307, marcha vers An 307.
Rome avec une grande armée, composée de
Romains et de soldats Maures, qui tous avaient xxxi. Sévère
servi sous Maximien, et lui étaient encore trahi.
affectionnés. Ces troupes, accoutumées aux
délices de Rome, avaient plus d'envie de vivre
Incert. Pan. c. 3.
dans cette ville que de la ruiner. Maxence ayant
d'abord gagné Anullinus, préfet du prétoire, n'eut
pas de peine à les corrompre. Dès qu'elles furent à Lact., de mort.
la vue de Rome, elles quittèrent leur empereur et pers. c. 26.
se donnèrent à son ennemi. Sévère abandonné
prend la fuite, et rencontrant Maximien à la tête Anony. Vales.
d'un corps qu'il venait de rassembler, il se sauve à
Ravenne, où il se renferme avec le petit nombre
de ceux qui lui étaient demeurés fidèles. Cette ville Zos. l. 2, c. 10.
était forte, peuplée, et assez bien pourvue de
vivres pour donner à Galérius le temps de venir au Vict. epit. p.
secours. Mais Sévère manquait de la principale 221.
ressource: il n'avait ni bon sens, ni courage.
Maximien pressé par la crainte qu'il avait de Eutrop. l. 10.
Galérius, prodiguait les promesses et les serments
pour engager Sévère à se rendre: celui-ci plus pressé encore par sa
propre timidité, et menacé d'une nouvelle désertion, ne songeait qu'à
sauver sa vie; il consentit à tout, se remit entre les mains de son
ennemi, et rendit la pourpre à celui qui la lui avait donnée deux ans
auparavant.
Réduit à la condition privée, il revenait à Rome, où
Maximien lui avait juré qu'il serait traité avec xxxii. Sa mort.
honneur. Mais Maxence, pour dégager son père
de sa parole, fit dresser à Sévère une embuscade Anony. Vales.
sur le chemin. Il le prit, l'amena à Rome comme un
captif, et l'envoya à trente milles sur la voie
Appienne, dans un lieu nommé les Trois- Zos. l. 2, c. 10.
Hôtelleries (Tres tabernæ), où ce prince infortuné,
ayant été retenu prisonnier pendant quelques [Victor, epit. p.
jours, fut forcé de se faire ouvrir les veines. On 221].
porta son corps dans le tombeau de Gallien, à huit
ou neuf milles de Rome. Il laissa un fils nommé Sévérianus qui ne
fut héritier que de ses malheurs.
Maximien s'attendait bien que Galérius ne tarderait
pas de venir en Italie pour venger la mort de xxxiii. Mariage
Sévère. Il craignait même que cet ennemi violent de Constantin.
et irrité n'amenât avec lui Maximin; et quelles
forces pourraient résister aux armées réunies de Lact., de mort.
ces deux princes? Il songea donc de son côté à se pers. c. 27.
procurer une alliance capable de le soutenir au
milieu d'une si violente tempête. Il met Rome en
Du Cange, in
état de défense, et court en Gaule pour s'attacher numm. Byz. p.
Constantin en lui faisant épouser sa fille Flavia- 45.
Maximiana-Fausta, qu'il avait eue d'Eutropia, et
qui, du côté de sa mère, était sœur cadette de
Theodora, belle-mère de Constantin. Elle était née Till. art. 11.
et avait été élevée à Rome. Son père l'avait
destinée au fils de Constance dès l'enfance de l'un Incert. Paneg.,
et de l'autre: on voyait dans son palais d'Aquilée Max. et Cons. c.
un tableau, où la jeune princesse présentait à 6.
Constantin un casque d'or. Le mariage de
Minervina rompit ce projet: mais sa mort arrivée
avant celle de Constance donna lieu de le Baluzius, in
reprendre, et il semble que ce prince avait consenti Lact., c. 27.
à cette alliance. L'état où se trouvait alors
Maximien la fit promptement conclure: le mariage fut fait à Trèves, le
31 mars. Nous avons encore un panégyrique qui fut alors prononcé
en présence des deux princes[8]. Pour la dot de sa fille, Maximien
donna à son gendre le titre d'Auguste, sans s'embarrasser de
l'approbation de Galérius.
[8] Cet ouvrage, dont on ignore l'auteur, se retrouve dans le Recueil des anciens
panégyristes (Panegyrici veteres).—S.-M.
Ce prince était bien éloigné de l'accorder. Plein de
courroux et ne respirant que vengeance, il était xxxiv. Galérius
déja entré en Italie avec une armée plus forte que vient assiéger
celle de Sévère, et ne menaçait de rien moins que Rome.
d'égorger le sénat, d'exterminer le peuple, et de
ruiner la ville. Il n'avait jamais vu Rome, et n'en Incert. Pan. c. 3.
connaissait ni la grandeur ni la force: il la trouva
hors d'insulte: l'attaque et la circonvallation lui
Lact., de mort.
paraissant également impraticables, il fut contraint pers. c. 27.
d'avoir recours aux voies de négociation. Il alla
camper à Terni en Ombrie, d'où il députa à
Maxence deux de ses principaux officiers, Licinius Anony. Vales.
et Probus, pour lui proposer de mettre bas les
armes, et de s'en rapporter à la bienveillance d'un beau-père, prêt à
lui accorder tout ce qu'il ne prétendrait pas emporter par violence.
Maxence n'avait garde de donner dans ce piége. Il
attaqua Galérius avec les mêmes armes qui lui xxxv. Il est
avaient si bien réussi contre Sévère; et profita de contraint de se
ces entrevues pour lui débaucher par argent une retirer.
grande partie de ses troupes, déja mécontentes
d'être employées contre Rome, et par un beau-père contre son
gendre. Des corps entiers quittèrent Galérius et s'allèrent jeter dans
Rome. Cet exemple ébranlait déja le reste de l'armée, et Galérius
était à la veille d'éprouver le même sort que celui qu'il venait venger,
lorsque ce prince superbe, humilié par la nécessité, se prosternant
aux pieds des soldats et les suppliant avec larmes de ne pas le livrer
à son ennemi, vint à bout, à force de prières et de promesses, d'en
retenir une partie. Il décampa aussitôt et s'enfuit en diligence.
Il ne fallait qu'un chef avec une poignée de bonnes
troupes, pour l'accabler dans cette fuite précipitée. xxxvi. Il ruine
Il le sentit; et pour ôter à l'ennemi le moyen de le tout sur son
poursuivre, et payer en même temps ses soldats passage.
de leur fidélité, il leur ordonna de ruiner toutes les
campagnes et de détruire toutes les subsistances. Jamais il ne fut
mieux obéi. La plus belle contrée de l'Italie éprouva tous les excès
de l'avarice, de la licence et de la rage la plus effrénée. Ce fut au
travers de ces horribles ravages que l'empereur, ou plutôt le fléau de
l'empire, regagna la Pannonie; et la malheureuse Italie eut lieu de se
ressouvenir alors que Galérius, recevant deux ans auparavant le
titre d'empereur, s'était déclaré l'ennemi du nom romain, et qu'il avait
projeté de changer la dénomination de l'empire, en l'appelant
l'empire des Daces, parce que presque tous ceux qui gouvernaient
alors tiraient, comme lui, leur origine de ces barbares.
Maximien était encore en Gaule. Indigné contre
son fils, dont la lâcheté avait laissé échapper xxxvii.
Galérius, il résolut de lui ôter la puissance Maximien
souveraine. Il sollicita son gendre de poursuivre revient à Rome
d'où il est
Galérius, et de se joindre à lui pour dépouiller
chassé.
Maxence. Constantin s'y trouvait assez disposé,
mais il ne put se résoudre à quitter la Gaule, où sa
présence était nécessaire pour contenir les Lact. de mort.
barbares. Rien n'est plus équivoque que la pers. c. 28.
conduite de Maximien. Cependant, quand on suit
avec attention toutes ses démarches, il paraît qu'il Incert. Paneg. c.
n'avait rien d'arrêté que le désir de se rendre le 3.
maître. Sans affection comme sans scrupule,
également ennemi de son fils et de son gendre, il
Zos. l. 2, c. 10.
cherchait à les détruire l'un par l'autre, pour les
faire périr tous deux. Il retourne à Rome: le dépit
d'y voir Maxence plus honoré et plus obéi, et de Eutrop. l. 10.
n'être lui-même regardé que comme la créature de
son fils, joignit à son ambition une amère jalousie.
Il pratiqua sous main les soldats de Sévère, qui Zonar., l. 12, t. i,
avaient été les siens: avant même que d'en être p. 644.
bien assuré, il assemble le peuple et les gens de
guerre, monte avec Maxence sur le tribunal; et après avoir gémi sur
les maux de l'état, tout-à-coup il se tourne d'un air menaçant vers
son fils, l'accuse d'être la cause de ces malheurs, et, comme
emporté par sa véhémence, il lui arrache le manteau de pourpre.
Maxence effrayé se jette entre les bras des soldats qui, touchés de
ses larmes et plus encore de ses promesses, accablent Maximien
d'injures et de menaces. En vain celui-ci veut leur persuader que
cette violence de sa part n'est qu'une feinte, pour éprouver leur zèle
à l'égard de son fils; il est obligé de sortir de Rome.
Galérius avait donné le consulat de cette année à
Sévère et à Maximin: le premier n'avait pas été xxxviii.
reconnu dans les états de Maxence, qui avait Maxence lui ôte
nommé son père consul pour la neuvième fois: et le consulat.
Maximien, en donnant à Constantin la qualité
d'Auguste, l'avait fait consul avec lui, sans Buch. de cycl.
s'embarrasser du titre de Maximin. Maxence ayant p. 238.
chassé son père, lui abrogea le consulat, sans lui
substituer personne. Il cessa même alors de Till. note 15 sur
reconnaître Constantin pour consul, et fit dater les Constantin.
actes par les consulats de l'année précédente en
ces termes: Après le sixième consulat; c'était celui
de Constance Chlore et de Galérius, qui tous deux Idat. chron.
avaient été consuls pour la sixième fois en 306.
Maximien se retira en Gaule, soit pour armer
Constantin contre Maxence, soit pour le perdre lui- xxxix. Maximien
même. N'ayant pu réussir dans l'un ni dans l'autre va trouver
projet, il se hasarda d'aller trouver Galérius, Constantin et
ensuite
l'ennemi mortel de son fils, sous prétexte de se
Galérius.
réconcilier avec lui, et de prendre de concert les
moyens de rétablir les affaires de l'empire: mais en
effet pour chercher l'occasion de lui ôter la vie, et Lact., de mort.
pers. c. 29.
de régner en sa place, croyant ne pouvoir trouver du repos que sur
le trône.
Galérius était à Carnunte en Pannonie. Désespéré
du peu de succès qu'il avait eu contre Maxence, et xl. Portrait de
craignant d'être attaqué à son tour, il songea à se Licinius.
donner un appui dans Licinius, en le mettant à la
place de Sévère. C'était un Dace, d'une famille Lact., de mort.
aussi obscure que celle de Galérius; il se vantait pers. c. 29.
pourtant de descendre de l'empereur Philippe. On
ne sait pas précisément son âge, mais il était plus
Zos. l. 2, c. 11.
âgé que Galérius, et c'était une des raisons qui
avaient empêché celui-ci de le créer César, selon
la coutume, avant que de l'élever à la dignité Eutrop. l. 10.
d'Auguste. Ils avaient formé ensemble une liaison
intime, dès le temps qu'ils servaient dans les Aurel. Vict. de
armées. Licinius s'était ensuite attaché à la fortune Cæs., p. 174 et
de son ami, et avait beaucoup contribué, par sa 176.
valeur, à la célèbre victoire remportée sur [le roi de
Perse] Narsès. Il avait la réputation d'un grand
Vict. epit. p. 221
homme de guerre, et il se piqua toujours d'une et 222.
sévère exactitude dans la discipline. Ses vices,
plus grands que ses vertus, n'avaient rien de rebutant pour un
homme tel que Galérius: il était dur, colère, cruel, dissolu, d'une
avarice sordide, ignorant, ennemi des lettres, des lois et de la
morale; il appelait les lettres le poison de l'état; il détestait la science
du barreau, et il prit plaisir, étant empereur, à persécuter les
philosophes les plus renommés, et à leur faire souffrir, par haine et
par caprice, les supplices réservés aux esclaves. Il y eut pourtant
deux sortes de personnes qu'il sut traiter avec assez d'équité: il se
montra favorable aux laboureurs et aux gens de la campagne; et
retint dans une étroite contrainte les eunuques et les officiers du
palais, qu'il aimait à comparer à ces insectes qui rongent sans cesse
les choses auxquelles ils s'attachent.
Pour rendre l'élection de Licinius plus éclatante,
Galérius invita Dioclétien à s'y trouver. Le vieillard xli. Dioclétien
y consentit: il partit de sa paisible retraite de refuse l'empire.
Salone, et reparut à la cour avec une douce
majesté, qui attirait les regards sans les éblouir, et Vict. epit. p.
les respects sans mélange de crainte. Maximien, 221.
toujours agité du désir de régner, comme d'une
fièvre ardente, voulut encore exciter en secret son ancien collègue,
devenu philosophe, à reprendre la pourpre et à rendre le calme à
l'empire, qui, dans les mains de tant de jeunes souverains, n'était
que le jouet de leurs passions. Ce fut alors que Dioclétien lui fit cette
belle réponse: Ah! si vous pouviez voir à Salone ces fruits et ces
légumes que je cultive de mes propres mains, jamais vous ne me
parleriez de l'empire! Quelques auteurs ont dit que Galérius se
joignit à Maximien pour faire à Dioclétien cette proposition: si le fait
est vrai, ce ne pouvait être qu'une feinte et un pur compliment de la
part de ce prince, qui n'était pas d'humeur à reculer d'un degré; mais
l'ambition de Maximien nous répond ici de sa sincérité.
Ce fut donc en présence et du consentement des
deux anciens empereurs, que Galérius honora xlii. Licinius
Licinius du titre d'Auguste, le 11 novembre 307, lui Auguste.
donnant, à ce qu'on croit, pour département la
Pannonie et la Rhétie, en attendant qu'il pût lui Chron. Alex. vel
donner, comme il espérait le faire bientôt, toute la Paschal, p. 278.
dépouille de Maxence. Licinius prit les noms de C.
Flavius Valerius Licinianus Licinius: il y joignit le
Noris, de num.
surnom de Jovius, que Galérius avait emprunté de Licinii.
Dioclétien.
Constantin, qui n'avait pas été consulté, garda sur Till. n. 19 sur
cette élection un profond silence. Maxence, de son Constantin.
côté, créa César son fils M. Aurélius Romulus.
Mais le dépit de Maximin ne tarda pas à éclater.
Pour faire sa cour à Galérius, et pour gagner dans [Eckhel, doct.
num. vet. t. viii,
son esprit l'avantage sur Licinius, qui commençait p. 61-68.]
à lui donner de la jalousie, il avait redoublé de
fureur et de cruauté contre les chrétiens. Mennas,
préfet d'Égypte, était chrétien: Maximin, l'ayant xliii. Maximin
appris, envoie Hermogènes pour prendre sa place continue à
persécuter les
et pour le punir. Le nouveau préfet exécute ses chrétiens.
ordres, et fait cruellement tourmenter son
prédécesseur; mais ébranlé d'abord par sa Baronius, ann.
constance, éclairé ensuite par plusieurs miracles 307.
dont il est témoin, il se convertit et embrasse le
christianisme. Maximin outré de colère vient à Alexandrie: il leur fait
à tous deux trancher la tête; et pour tremper lui-même ses mains
dans le sang des martyrs, il tue d'un coup d'épée Eugraphus,
domestique de Mennas, et qui osait devant l'empereur professer la
religion proscrite. Mon dessein n'est pas de mettre sous les yeux de
mes lecteurs tous les triomphes des martyrs: ce détail appartient à
l'histoire de l'Église, dont ils furent l'honneur et la défense. Je me
propose seulement de rendre compte des principaux faits de ce
genre, auxquels les empereurs ont eu part immédiatement et par
eux-mêmes.
Les édits de Maximin remplissaient tout l'Orient de
gibets, de feux et de carnage. Les gouverneurs xliv. Punition
s'empressaient à l'envi à servir l'inhumanité du d'Urbanus et de
prince. Urbanus, préfet de la Palestine, se signalait Firmilianus.
entre les autres, et la ville de Césarée était teinte
de sang. Aussi possédait-il toute la faveur du Eus. Hist. Mart.
tyran: sa complaisance barbare couvrait tous ses Pal. c. 7. et 11.
autres crimes, dont il espérait acheter l'impunité
aux dépens des chrétiens. Mais le Dieu qu'il attaquait dans ses
serviteurs, ouvrit les yeux du prince sur les rapines et les injustices
du préfet. Urbanus fut convaincu devant Maximin, qui devint pour lui
à son tour un juge inexorable, et qui, l'ayant condamné à la mort,
vengea, sans le vouloir, les martyrs sur celui qui avait prononcé tant
de condamnations injustes. Firmilianus, qui succéda à Urbanus,
ayant été comme lui le fidèle ministre des ordres sanguinaires du
tyran, fut comme lui la victime de la vengeance divine, et eut
quelques années après la tête tranchée.
Quoique les rigueurs que Maximin exerçait contre
les chrétiens ne coûtassent rien à sa cruauté, An 308.
cependant plus il s'était étudié à se conformer aux
volontés de Galérius, plus il se sentit piqué de la xlv. Maximin
préférence que ce prince donnait à Licinius. Après prend le titre
s'être regardé comme tenant la seconde place d'Auguste.
dans l'empire, il ne voulait pas reculer à la
troisième. Il en fit des plaintes mêlées de Lact., de mort.
menaces. Pour l'adoucir, Galérius lui envoie pers. c. 20.
plusieurs fois des députés; il lui rappelle ses
bienfaits passés; il le prie même d'entrer dans ses
vues, et de déférer aux cheveux blancs de Eus. Hist. eccl.
l. 8, c. 14.
Licinius. Maximin, que ces ménagements
rendaient plus fier et plus hardi, proteste qu'étant
depuis trois ans revêtu de la pourpre des Césars, il Numism.
ne consentira jamais à laisser à un autre le rang Mezzab. et
qui lui est dû à lui-même. Galérius, qui se croyait Banduri.
en droit d'en exiger une soumission entière, lui
reproche en vain son ingratitude: il lui fallut céder à Toinard et
l'opiniâtreté de son neveu. D'abord pour essayer Cuper. in Lact.
de le satisfaire il abolit le nom de César; il déclare
que lui-même et Licinius seront appelés Augustes, [Eckhel, doct.
et que Maximin et Constantin auront le titre non num. vet. t. viii,
plus de Césars, mais de fils des Augustes. Il paraît p. 71-95].
par les médailles de ces deux princes, qu'ils
adoptèrent d'abord cette nouvelle dénomination. Mais Maximin ne la
garda pas long-temps; il se fit proclamer Auguste par son armée, et
manda ensuite à son oncle la prétendue violence que ses soldats lui
avaient faite. Galérius, forcé avec chagrin d'y consentir, abandonna
le plan qu'il avait formé, et ordonna que les quatre princes seraient
tous reconnus pour Augustes. Galérius tenait sans contredit le
premier rang; l'ordre des trois autres était contesté: Licinius était le
second selon Galérius, qui ne donnait que le dernier rang à
Constantin; mais Maximin se nommait lui-même avant Licinius; et
selon toute apparence, Constantin dans ses états était nommé avant
les deux autres. D'un autre côté, Maxence ne reconnaissait d'abord
que lui seul pour Auguste; il voulut bien ensuite faire part de ce titre
à Maximin. Mais enfin toutes ces disputes de prééminence se
terminèrent par la mort funeste de chacun de ces princes, qui
cédèrent l'un après l'autre au bonheur et au mérite de Constantin.
Maximien, empereur honoraire, puisqu'il n'avait ni sujets, ni
fonctions, que celles que lui imposait son humeur turbulente, avait
été compté pour rien dans ces nouvelles
dispositions. Il était dès lors brouillé avec Galérius: xlvi. Maximien
il paraît qu'au commencement de cette année ils consul.
avaient vécu en bonne intelligence, puisqu'on voit
dans les fastes le dixième consulat de Maximien, Till. note 21 sur
joint au septième de Galérius. Maxence, qui ne Constantin.
reconnaissait ni l'un ni l'autre, après avoir passé
près de quatre mois sans nommer de consuls, se nomma lui-même
le 20 avril avec son fils Romulus, et se continua avec lui l'année
suivante.
Comme il se voyait tranquille en Italie, il envoya
ses images en Afrique pour s'y faire reconnaître. Il xlvii. Alexandre
s'attribuait cette province: c'était une partie de la est nommé
dépouille de Sévère. Les troupes de Carthage, empereur à
regardant Maxence comme un usurpateur, Carthage.
refusèrent de lui obéir; et craignant que le tyran ne
vînt les y contraindre à main armée, elles prirent le Zos. l. 2, c. 12.
long du rivage la route d'Alexandrie, pour se retirer
dans les états de Maximin. Mais ayant rencontré Aurel. Vict., de
en chemin des troupes supérieures, elles se Cæs., p. 174 et
jetèrent dans des vaisseaux et retournèrent à 175.
Carthage. Maxence, irrité de cette résistance,
résolut d'abord de passer en Afrique, et d'aller en
personne punir les chefs de ces rebelles; mais il Vict. 221.
epit. p.
fut retenu à Rome par les aruspices, qui
l'assurèrent que les entrailles des victimes ne lui promettaient rien
de favorable. Une autre raison plus solide, c'est qu'il craignait
l'opposition du vicaire d'Afrique, nommé Alexandre, qui avait un
grand crédit dans le pays. Il voulut donc s'assurer de sa fidélité, et lui
demanda son fils pour ôtage: c'était un jeune homme fort beau; et le
père, informé des infâmes débauches de Maxence, refusa de le
hasarder entre ses mains. Bientôt des assassins, envoyés pour tuer
Alexandre, ayant été découverts, les soldats plus indignés encore
proclamèrent Alexandre empereur. Il était Phrygien selon les uns,
Pannonien selon les autres; peut-être était-il né dans une de ces
provinces, et originaire de l'autre: tous conviennent qu'il était fils d'un
paysan; ce qui ne le rendait pas moins digne de l'empire que