Μελέτη της ποικιλότητας στελεχών E.

coli
από νερό κολυμβητικών δεξαμενών.

Παπατζιτζέ Ο.2, Παππά Ο.1,Καραγκούνη

A.Δ.3, Λυμπεροπούλου Δ.Σ.3, Καλκάνη Ε.1,
Σαγκανα Δ.Ε.2, Παπαναστασίου Α.2 και
Μαυρίδου Α. 1
1
Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, Τεχνολογικό
Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Αθηνών 2 Γενικό Νοσοκομείο
Δυτικής Αττικής 3 Εργαστήριο Μικροβιολογίας, Τομέας
Βιολογίας, Τμήμα Βοτανικής, Πανεπιστήμιο Αθηνών
 Εισαγωγή
 E. coli
 Οικογένεια Εντεροβακτηριακών
 Gram αρνητικό (-) βακτήριο
 Τα περισσότερα στελέχη E. coli είναι μη παθογόνα
 Υπάρχουν και παθογόνα στελέχη (ETEC, EPEC, EIEC, EHEC, EAggEC)
 Χρησιμοποιείται ως δείκτης κοπρανώδους μόλυνσης
 Περιβάλλοντα E. coli
 Φυσιολογική χλωρίδα στο έντερο του ανθρώπου και των ζώων
 Υδατικά Περιβάλλοντα (Κολυμβητικές Δεξαμενές, Λίμνες, Δίκτυα
Ύδρευσης,Θαλάσσιο νερό)
 Εμφιαλωμένο νερό
 Απόβλητα
 Έδαφος
 Ποικιλότητα
Η μκροβιακή ποικιλότητα καθορίζεται από τα γενετικά χαρακτηριστικά των
μικροοργανισμών, από τα περιβάλλοντά τους και τον οικολογικό ή
λειτουργικό ρόλο τους στο οικοσύστημα.
Turner, 1999

Υπάρχει συσχέτιση ανάμεσα :

Στον βαθμό της κοπρανώδους μόλυνσης και της μόλυνσης από τους
κολυμβητές και
Του κινδύνου για ασθένεια από κολυμβητικές δραστηριότητες

Μικροβιολογική ποιότητα Κολυμβητικών δεξαμενών

Μέθοδοι απόλύμανσης και αντιμικροβιακοί παράγοντες
Χλώριο
Όζον
Yπεριώδης ακτινοβολία
ιόντα και μέταλλα Grabow, 1991
99
 Σκοπός
 Η εκτίμηση της επίδρασης της χλωρίωσης του νερού στην
ποικιλότητα της E.coli

 Ο προσδιορισμός της γενετικής ποικιλότητας και οι πιθανές

ομοιότητες μεταξύ διαφορετικών κλώνων στελεχών E.coli.
Απομόνωση : από χλωριωμένα και μη-χλωριωμένα νερά
κολυμβητικών δεξαμενών.

 Η εργασία αυτή περιέχει προκαταρκτικά αποτελέσματα και

συμπεράσματα, διότι η μελέτη βρίκεται σε εξέλιξη.
 Υλικά και Μέθοδοι
1. Δειγματοληψία
100 δείγματα νερού

47
Απο κολυμβητικές 26
27
δεξαμενές Από λίμνες
Από πόσιμο νερό
 Υλικά και Μέθοδοι
2. Απομόνωση και ταυτοποίηση βακτηρίων
(ISO 19458, 2006, ISO 9308-1 2000, APHA 2005)

100 δείγματα νερού

Διήθηση 100ml
Επώαση του φίλτρου σε MLSA
για 36±2 και 44± 0.5 oC και 21±3h

Τυπικές αποικίες

Ινδόλη και Οξειδάση tests

5 Στελέχη αναφοράς (NCTC 9001) χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο των

επιβεβαιωτικών διαδικασιών και την επαναληψιμότητα της μεθόδου.
Παρτίδες: 113-040420, 113-030407
 Υλικά και Μέθοδοι
3. Μοριακή Τυποποιήση
 Το ολικό γενωμικό DNA απομονώθηκε από τα βακτηριακά κύτταρα
της χρησιμοποιώντας το QIAampDNA stool Mini Kit της Qiagen

 Τα κύτταρα τυποποιήθηκαν χρησιμοποιώντας

Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequence
polymerase chain reaction (ERIC-PCR)

 Eric εκκινητές
ERIC 1: 5΄ -ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC - 3΄ and
ERIC 2: 5΄ -AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’
Rademaker και de Bruijn, 1997

 Τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 1%

 Υλικά και Μέθοδοι
3. Μοριακή Τυποποιήση

Οπτική Παρατήρηση
 Στατιστική ανάλυση

PHYLIP 3.6.1
Πρόγραμμα ανάλυσης
 Materials and Methods
Επιλογή ERIC-PCR
Υψηλή ικανότητα να διαχωρίζει διαφορετικά αλλά στενά σχετιζόμενα
στελέχη χρησιμοποιώντας οποιονδήποτε συνδιασμό εκκινητών,
σχεδιασμένοι για την συντηρημένη ERIC περιοχή
Meacham και συνεργάτες, 2003 and Casarez και συνεργάτες, 2007

Γρήγορη, απλή και χαμηλού κόστους τεχνική (Matsumoto et al, 2001)

Τυχαίοι εκκινητές (Olive and Bean,1999)
Η μέθοδος μπορεί να αυτοματοποιηθεί (Sazakli, 2005)

Χαμηλή επαναληψιμότητα (Meacham,2003)

Η μέθοδος είναι ευαίσθητη στις αλλαγές των συνθηκών της PCR
(Sazakli, 2005)
 Αποτελέσματα
Ταυτοποιήση Βακτηρίων

100 δείγματα νερού

163 απομονώσεις

134 στελέχη E. coli 29 εντεροβακτηριακά

 Αποτελέσματα
! Ανάμεσα στις 134 απομονώσεις επιβεβαιωμένες σαν E. coli, 37
απομονώσεις επιλέχθηκαν τυχαία για μοριακή τυποποίηση με την
ERIC-PCR
37 E. coli

25 12 από
απο χλωριωμένα μη χλωριωμένα
δείγματα νερού δείγματα νερού

Η μελέτη αυτών των στελεχών χρησιμοποιήθηκε σαν πιλοτική μέθοδος

για την συνολική εργασία και τα αποτελέσματα αυτά είναι προκαταρκτικά
 Results
ERIC-PCR
! Τα 37 στελέχη E. coli που απομονώθηκαν από κολυμβητικές
δεξαμενές τυποποιήθηκαν με την ERIC-PCR

37 E. coli

28 9
Τυποποιήσιμα Ατυποποίητα

17 από 11 από μη- 8 από 1 από μη-

χλωριωμένα χλωριωμένα χλωριωμένα χλωριωμένα
νερά νερά νερά νερά
 28 τυποποιήσημα στελέχη E. coli

1500 bp

500x2 bp

Στενά σχετιζόμενα
στελέχη Στενά σετιζόμενα
Πιθανόν ίδιος τύπος στελέχη
Πιθανόν ίδιος τύπος
Tenover et al,1995

Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%

 Αποτελέσματα: τυποποίηση
ERIC-TYΠOI ΣΤΕΛΕΧΗ

1. Οπτική παρατήρηση E1 34, 36, 37, 38, 39, 41 , 45

Στελέχη που διαφέρουν E2 R1, 5β
≥1 ζώνες θεωρούνται E3 35, 42
διαφορετικός τύπος E4 43, 5ε
E5 32, 33
Matsumoto et al, 2001,
E6 R4, 9β, 28
Van Belkum et al, 2007
Ε7 4α, 4β, 5α
Ε8 R2, R3, 5γ
Ε9 1
Ε10 2
Χλωριωμένα στελέχη Ε11 40
Μη-χλωριωμένα στελέχη Ε12 6
Στελέχη αναφοράς :
Ε13 7
R1,R2,R3,R4
Ε14 30
Ε15 Μβ, Μγ
Συν. Στελέχη 28 + 4 R.M
 Αποτελέσματα :τυποποίηση
2. Phylip 3.6.1 προγραμμα ανάλυσης
ERIC-TYPOI ΣΤΕΛΕΧΗ
Distance-based analysis was undertaken
using the neighbour-joining algorithm E1 28, 34, 36, 37, 38, 39, 41
Nikam,
Nikam, 2004 E2 30, 33, 4a, Mβ
E3 1, 5ε, 4β, 5α
E4 2
E5 R2, R3,R4,5γ
E6 6,7
Ε7 43
Ε8 9β, 32, 35, 40, 45,
Συν. στελέχη 25 + R.M

Χλωριωμένα στελέχη
Μη-χλωριωμένα στελέχη
Στελέχη αναφοράς :R2,R3,R4
 Αποτελέσματα:τυποποίηση
3. Ο συνδιασμός της οπτικής παρατήρησης και του
δενδρογράμματος από το στατιστικό πρόγραμμα Phylip έδωσε 8
ERIC -τύπους

Ε1 34,36,37,38,39,41,28
Ε2 30,33,4a,Μβ,32
Ε3 Results:Clustering
Results:5a, 4β, 5e, 1
Ε4 2
Ε5 R2,R3,R4,5γ
Ε6 6,7
Ε7 43
Ε8 40,35,45,9β
Συν. στελέχη 25 + R.M

Χλωριωμένα στελέχη
Μη-χλωριωμένα στελέχη
Στελέχη αναφοράς :R2,R3,R4
 Αποτελέσματα:τυποποίηση

8 ERIC - τύποι

 4 ERIC-τύποι (Ε2, E3, E4, E6) αποτελούνται αποκλειστικά από

στελέχη που έχουν απομονωθεί από χλωριωμένα δείγματα.

 Ένας ERIC- τύπος (E7) αποτελείται από ένα στέλεχος που έχει
απομονωθεί από μη-χλωριωμένο νερό.

 3 ERIC-τύποι (E1, E5, E8) αποτελούνται κυρίως από στελέχη

απομονωθέντα από μη-χλωριωμένα δείγματα με μόνο ένα
στέλεχος στον κάθε τύπο που έχει απομονωθεί από χλωρωμένα
δείγματα.
 Συζήτηση-Συμπεράσματα
Διαφορές
Οπτική παρατήρηση Phylip πρόγραμμα ανάλυσης
 8 ERIC-τύποι
 15 ERIC-τύποι
 25 τυποποιήσιμα
 28 τυποποιήσιμα
 12 ατυποποίητα
 9 ατυποποίητα

Επιδημιολογικά δεδομένα (π. χ. Κοινή πηγή προέλευσης, ημερομηνία

δειγματοληψίας, τύπος δείγματος του νερού κ.λ.π.) πρέπει πάντα να
λαμβάνονται υπ’οψιν κατά την τυποποίηση των στελεχών.

Συνδιασμός οπτικής παρατήρησης και

λογισμικού προγράμματος Phylip
8 ERIC τύποι
 Συζήτηση-Συμπεράσματα
Προοπτικές εργασίας
 Υπάρχει ένδειξη δημιουργίας καινούριων E. coli τύπων ανθεκτικών
στο χλώριο

 Κάθώς η εργασία είναι σε εξέλιξη, θα μελετήσουμε και άλλες

παραμέτρους όπως την προέλευση των στελεχών (γεωγραφικές,
τύπος δείγματος νερού) και της συγκέντρωσης του χλωρίου

Η μελέτη περισσότερων στελεχών θα φωτίσει

κάποια αμφισβητήσιμα αποτελέσματα
Σας ευχαριστώ