ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ

Εργασία χειμερινού εξαμήνου 9ου 2022-2023

«ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΤΩΝ

ΦΥΤΩΝ»
Βασιλική Κάβουρα
Μαριλένα Κοντζεντάκη
Άγγελος Ζορμπάς
Ανδρέας Αθανασόπουλος
Γεώργιος Βέρδος

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από κηλίδες φύλλων ή καρπών ελιάς

• Ασηπτικός τεμαχισμός δειγμάτων φύλλων

• Καθαρισμός δειγμάτων φύλλων με νερό

βρύσης

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από κηλίδες φύλλων ή καρπών

• Απολύμανση δειγμάτων φύλλων με

αιθυλική αλκοόλη

• Τοποθέτηση δειγμάτων φύλλων σε θρεπτικό

υπόστρωμα PDA

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από κηλίδες φύλλων ή καρπών

• Επώαση 25 ⁰C / 1 εβδομάδα

• Μικροβιολογικό παρασκεύασμα

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από κηλίδες φύλλων ή καρπών

• Φυτοπαθογόνος μύκητας : Γλοιοσπόριο (Colletotrichum sp.) ακέρβουλα και σπόρια

https://journals.plos.org/plosone/article/figures?id=10.1371/journal.pone.0233916

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από κηλίδες φύλλων ή καρπών

Παρατηρήσεις

 Επιμολύνσεις τρυβλίων

 Η απομόνωση του μύκητα θα

έπρεπε να γίνει κάτω από
ασηπτικές συνθήκες σε θάλαμο
νηματικής ροής

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από κηλίδες φύλλων ή καρπών

Παρατηρήσεις

 Επιλογή κατάλληλων θρεπτικών υποστρωμάτων, π.χ εκλεκτικών (Dichloran Rose

Bengal Chloramphenicocol Agar)

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 2
Απομόνωση βακτηρίων από φύλλα ή εξογκώματα κλαδίσκων ελιάς

• Ασηπτικός τεμαχισμός δειγμάτων

• Καθαρισμός δειγμάτων φύλλων με νερό

βρύσης

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5
Μοριακή ταυτοποίηση γλοιοσπόριου ελίας

Ανανέωση και καλλιέργεια

Απομόνωση μύκητα σε
μύκητα σε Malt Extract Broth
Nutrient Broth + 25 %
στους 22 ºC για 7 ημέρες υπό
γλυκερόλη στους -80 ºC
συνθήκες σκότους

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5
Μοριακή ταυτοποίηση γλοιοσπόριου ελίας

Συλλογή μυκηλίου και κρυολυοφιλίωση

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5
Μοριακή ταυτοποίηση γλοιοσπόριου ελίας
Εξαγωγή DNA
• 0.1 g μυκηλίου, 700 μL Lets-buffer, 5 min ανάδευση
• 700 μL φαινόλης χλωροφορμίου και παραμονή για 5 min
• Φυγοκέντριση (13000 rpm/4 ºC/10 min
• Παραλαβή υποκείμενου, προσθήκη φαινόλης χλωροφορμίου και φυγοκέντριση
• Παραλαβή υπερκειμένου, προσθήκη αιθανόλης 95 %, φυγοκέντριση
• Απομάκρυνση υπερκειμένου, προσθήκη 500 μL αιθανόλης 70 % και
φυγοκέντριση (13000rpm/ 4 ºC/2 min)
• Στέγνωμα σωλήνων φυγοκοκέντρισης και προσθήκη 40 μL Tris-buffer (pH=8) +
2 μL RNAase (παραμονή σε υδατολουτρο 50 ºC/15 min

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5
Μοριακή ταυτοποίηση γλοιοσπόριου ελίας

Μέτρηση συγκέντρωσης DNA σε NanoDrop στα 260 nm

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5
Μοριακή ταυτοποίηση γλοιοσπόριου ελίας

Ενίσχυση δειγμάτων DNA σε θερμοκυκλοποιητή

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5
Μοριακή ταυτοποίηση γλοιοσπόριου ελίας

Ηλεκτροφόρηση δειγμάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης και απεικόνιση σε UV

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 5
Μοριακή ταυτοποίηση γλοιοσπόριου ελίας

Παρατηρήσεις

 Χρησιμοποίηση της περιοχής ITS4 με χρήση εκκινητών Calnt2

 Η καλύτερη επιλογή μοριακών τεχνικών είναι η Αλληλούχιση Νέας Γενιάς (NGS)

λόγω της ικανότητας του συγκεκριμένου πρωτοκόλλου να στοχεύει σε πολλαπλούς
γονιδιακούς τόπους και να ενισχύει το γενετικό υλικό όλων των μυκήτων που
υπάρχουν σε ένα φυτικό υλικό

 Η χρήση μοριακών τεχνικών είναι ένα συμπληρωματικό εργαλείο το οποίο βοηθά

στην επιβεβαίωση της μακροσκοπικής και μικροσκοπικής διάγνωσης ασθενειών των
φυτών με σκοπό την καλύτερη και στοχευμένη αντιμετώπιση του προβλήματος
ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από αγγεία φύλλου

• Ασηπτικός τεμαχισμός δειγμάτων βλαστού

• Απολύμανση δειγμάτων βλαστού με

διάλυμα χλωρίνης 10 %

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από αγγεία φύλλου

• Τοποθέτηση δειγμάτων φύλλων σε θρεπτικό

υπόστρωμα PDA

• Επώαση 25 ⁰C / 1 εβδομάδα

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ 1
Απομόνωση μυκήτων από αγγεία φύλλου

• Μικροβιολογικό παρασκεύασμα

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ
 ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ

Εργασία χειμερινού εξαμήνου 9ου 2022-2023

«ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΩΝ ΤΩΝ

ΦΥΤΩΝ»
Βασιλική Κάβουρα
Μαριλένα Κοντζεντάκη
Άγγελος Ζορμπάς
Ανδρέας Αθανασόπουλος
Γεώργιος Βέρδος

ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΦΥΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ