ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΜΟΝΤΕΛΑ ΓΙΑ ΒΑΣΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ

ΕΡΕΥΝΑ

Escherichia coli, Bacillus subtilis

Saccharomyces cerevisiae, Shizosaccharomyces pombe
Neurospora crassa, Aspergillus nidulans, Ustilago maydis
Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans,
Zebra fish, mouse, rat….άλλα?

ΠΡΟΤΥΠΑ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ

ΓΕΝΕΤΙΚΗ & ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΜΥΚΗΤΩΝ

?
 Υπάρχει τέλειο μοντέλο?

Πως διαλέγεις ένα

μοντέλο?

Χρειαζόμαστε και νέα

μοντέλα?
 Τα αναμφισβήτητα πλεονεκτήματα στους μύκητες-μοντέλα…
     Ταχεία αύξηση με μορφή αποικιών (2-3h χρόνος διπλασιασμού)
Μαζική παραγωγή. Απλά θρεπτικά Οικονομικά συστήματα

Moνοκύτταροι οργανισμοί (ζύμες)-μονοπυρηνικά σπόρια (νηματοειδείς)

Εξαιρετική κλασσική γενετική ανάλυση καθώς είναι απλοειδείς οργανισμοί

αλλά μπορούν να υπάρξουν και σε διπλοειδή κατάσταση – Γενετικοί χάρτες
              
Μικρό γονιδίωμα (1/100-1/200 ανθρώπινου)
S. cerevisiae 1.4 x 107 bp
A.nidulans 2.7 x 107 bp

    Ικανότητα μετασχηματισμού – «αντιστροφή» γενετική

Ποικιλία εξωγονιδιωματικών φορέων, συστημάτων στοχευμένης
ενσωμάτωσης – αντικατάστασης γονιδίων, knock-outs, κλπ.

Ήδη διαθέσιμες συλλογές όλως των Knock-outs,και χάρτες γενετικών αλληλεπιδράσεων

Κυτταρικοί ή μοριακοί μηχανισμοί όμοιοι με αυτούς των αντίστοιχων

ανώτερων ευκαρυωτικών (>30% γονιδίων ομόλογα με ανθρώπινα γονίδια)

   Συστήματα έκφρασης γονιδίων από ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς

 ΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ…..

Ζύμες
Saccharomyces cerevisiae
Schizosacharomyces pombe

Νηματοειδείς μύκητες

Aspergillus nidulans

Neurospora crassa
 
ΛΙΓΑ ΙΣΤΟΡΙΚΑ….. Μερικά από τα καλύτερα στιγμιότυπα

Πρώτο μισό του αιώνα, S. cerevisiae, A. nidulans & N. crassa, θεμελιώνονται ως

εξαιρετικά συστήματα γενετικής ανάλυσης – Φυλετικός κύκλος, διασταυρώσεις,
ανάλυση ασκών, γενετικοί χάρτες, κλπ

1941, Beadle & Tatum, μεταλλαγές αυξοτροφίας στη N. crassa, θεμελίωση του
δόγματος ένα γονίδιο-ένα ένζυμο (πρωτεΐνη). Η αρχή της σύγκλισης γενετικής-
βιοχημείας.

1949, Lindegren, Συζευκτικοί τύποι στο S. cerevisiae

1952, Ανακάλυψη του παραφυλετικού κύκλου στον A. nidulans από Pontecorvo &
Roper

1960-1970’s εδραίωση του γενετικού κώδικα και αναλόγων ρυθμιστικών

κυκλωμάτων (Scazzocchio, Arst, Hershkowitz, Guarente) αλλά και της έλλειψης
οπερονίων στα ευκαρυωτικά
1970-1980’s, Επίτευξη γενετικού μετασχηματισμού στη ζύμη (1978) και σε νηματοειδείς
(1984), Απαρχή της Μοριακής Γενετικής σε ευκαρυωτικά. Μεταλλαγές ρύθμισης του
κυτταρικού κύκλου cdc σε S. cerevisiae & S. pombe (Nurse, Nasmyth , Hartwell)

Μεταλλαγές ελαττωματικής έκκρισης sec (Sheckman), Μεταλλαγές μεταφραστικής &

μεταγραφικής ρύθμισης (Hinnebush, Struhl, Fink, Cooper) στον S. cerevisiae .

Μεταλλαγές κιρκαδικής ρύθμισης και επιγενετικών φαινομένων RIP, MIP, quelling,

(Selker, Faugeron, Rosignol), μεταλλαγές ρύθμισης κυτταροσκελετού (Morris, Osmani)
σε Neurospora, Aspergillus, Podospora, Ascobolus

1990’s Γονιδίωμα Saccharomyces cerevisiae (Goffeau, 1996). Two-hybrid system (Fields

& Song 1990). Μεταλλαγές ρύθμισης της μεταγραφής μέσω τροποποίησης της
χρωματίνης στον S. cerevisiae

2000’s Πρώτη πλήρης συλλογή απενεργοποιημένων γονιδίων (knock-outs) στον S.

cerevisiae. Γονιδιώματα Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora
crassa. Γονιδιώματα συγγενών παθογόνων μυκήτων.
ΤΟ ΠΡΩΤΟ ΜΕΓΑΛΟ ΒΗΜΑ ΣΤΗΝ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΤΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ– Η
ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ S. cerevisiae
Chromosomes
Per haploid
~ 6000 γονίδια Organism cell
(~2κβ Μ.Ο.)
120 rRNAs Zea mays 10
40 sRNA (corn)
274 tRNA
51 ρετρομεταθετά H. sapiens
(human) 23
στοιχεία Τy
8
Ιντρόνια μόνο σε rRNA C. elegans 1.05 x 10
14000 γονίδια
1 cM~ 3kb
D. melanogaster
28% γνωστές λειτουργίες (fruit fly) 4
26% ορφανά γονίδια
σε Β.Δ. 2.7x 107 bp
11% μόνο στον Saccharomyces A. nidulans 14000 γονίδια 8
15% ομόλογα με γνωστές
πρωτεΐνες S. cerevisiae 16
14% ομόλογα μοτίβα 1.4 x 10 7 bp
(yeast)
6% Α.Π.Μ. ??

>30% γονίδια ομόλογα E. coli 4 x 10 6 bp 1

ανθρώπινων γονιδίων
περιλαμβανομένων και
γονιδίων «ασθενειών» 106 107 108 109 1010
DNA content per cell (bp)
 Οικογένειες πρωτεϊνών

Signal transduction
Organelle biogenesis Cell rescue
Nuclear structure Not clear-cut
Amino acids
Cytoplasmic structure Nitrogen/Sulfur
Nucleotides
Cell envelope
Phosphate

Carbohydrates
Intracellular trafficking
Lipids
Transport facilitators Cofactors

Protein shaping Energy metabolism

Translation Cell growth, cell division,

DNA synthesis
Transcription, transcription
control

14 Κατηγορίες Πρωτεϊνών του Σακχαρομύκητα

1/3 ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΓΙΑ ΕΠΙΒΙΩΣΗ

Η εποχή των genomics, -omics & Systems Biology…
2014
The revolution of the sequencing and bionalysis methods…
Proteins
In NCBI available genomes are: 38,633,935
Microbial: > 8000 Transcripts
Protozoa: >30 7,051,549
Invertebrates: >34 Organisms
36,335
Vertebrates :> 35 ftp://ftp.ncbi.nlm.ni
Plants: >130 h.gov/refseq/release
/
In JGI (http://genome.jgi.doe.gov/)
The 1000 Fungal Genome Project..91 species of Aspergilli, 35 of Penicillium

Annotations: improve day by day…but lots of errors too! Why?

https://www.yeastgenome.org/

http://fungidb.org/fungidb/
 The human genome
Only 90% of the human genome has been sequenced and
the remaining 10% falls into 357 gaps scattered throughout the genome.

Τhe largest gaps cover highly repetitive parts of the genome—mostly around the
centromeres and other heterochromatic regions. There were also gaps at the locations
of several gene clusters (e.g. ribosomal RNA genes) where it's impossible to
determine the exact number of copies. In the case of ribosomal RNA gene clusters,
these gaps have now been closed.
Biologists propose to sequence the DNA of all life on Earth….
Feb. 24, 2017
Create reference genomes, Next sequence a species from each of the 150,000 to
200,000 genera, and finally get rough genomes of the 1.5 million remaining known
eukaryotic species.

Iceland’s effort to study the

genomes of its entire human
population…

Sequencing 100000 DNA codes

of patients, leading to better,
earlier diagnosis and
personalised care, for cancer,
rare diseases…
 Η ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ
…..ΚΑΙ ΤΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ

•Knock-outs/downs γονιδίων (πλήρης συλλογή μόνο στον S. cerevisiae)

(σε μύκητες εύκολο λογω συστήματος στοχευμένου ομόλογου ανασυνδυασμού.
Εναλλακτικοί τρόποι: μετάθετα στοιχεία (Arabidopsis, Drosophila) & SiRNA (C.
elegans, ζωικά κυτταρα) και φυσικά CRISP/Cas9 (Targeted Genome Editing: A
New Era in Molecular Biology)
•Υπερέκφραση ή ελεγχόμενη γονιδίων
•Πρωτεινικές αλληλεπιδράσεις
γενετικές (συνθετικοί φαινότυποι), βιοχημικές (συν-ανοσοκατακριμνηση),
κυτταρικές-μοριακές (two-hybrid system, GFP/RFP co-localization, splitYFP)

Transcriptomics
Proteomics
Metabolomics
Pharmacogenomics
 Η δεκαετία των 60ς - Ένα flash back πριν τα –omics

Jacques Monod, Francois Jacob, Francis Crick, André Lwoff,

Sydney Brenner, Seymur Benzer…
Max Delbrück, Salvador Luria, Barabra McLintock
η χρυσή εποχή του Pasteur και η γέννηση της μοριακής
βιολογίας…
 ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΤΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ
ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ
 
1.     Μεταγραφική ρύθμιση
Ι – ‘Έλεγχος δράσης του υποκινητή – ταχύτητα παραγωγής mRNA
ΙΙ - Μηχανισμός «εξασθένησης» παραγωγής mRNA
ΙΙΙ - Εναλλακτικοί παράγοντες σ – έλεγχος δράσης της πολυμεράσης
IV - Μεταγραφική ρύθμιση ΙV - Μεταγραφική ρύθμιση μέσω μεταθετών στοιχείων

2. Μετα-μεταγραφική ρύθμιση
Έλεγχος σταθερότητας mRNA – Αποικοδόμηση mRNA-Δευτεροταγείς δομές mRNA

3.Μεταφραστική ρύθμιση
tRNA, frameshifting, εξασθένηση

4.     Μετα-μεταφραστική ρύθμιση

Φωσφορυλίωση, Πρωτεόλυση, Ουβικουΐτιλίωσης κτλ

5. Επιγενετικά φαινόμενα
Μεθυλίωση, Ακετυλίωση DNA-ιστονών, prions

6. Τοπολογική ρύθμιση
Μεμβρανική – υποκυτταρική διακίνηση μεταγραφικών παραγόντων, mRNA, ένζυμων,
Ολιγομερισμός, κτλ
 Η ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ
 
 
H ΕΚΦΡΑΣΗ ΔΕΝ ΕΙΝΑΙ ΣΥΝΕΧΗΣ («ΣΥΣΤΑΤΙΚΗ»)
 
Τα γονίδια «ανάβουν» και «σβήνουν» σε απόκριση σε φυσιολογικά και αναπτυξιακά
σήματα. Οι μηχανισμοί ρύθμισης ενσωματώνονται σε αλληλοεξαρτώμενα «κυκλώματα»
τα οποία εξασφαλίζουν ότι ομάδες γονιδίων θα τεθούν σε λειτουργία ή σε αδράνεια με
την σειρά που πρέπει. Η σημασία του χρόνου στην γονιδιακή έκφραση της ανάπτυξης.

ΟΠΕΡΟΝΙΑ
 
Τα βακτηριακά γονίδια κοινών μεταβολικών οδών συχνά σχηματίζουν οπερόνια
(συνεργιώματα) που εμπεριέχουν όλα τα γονίδια που κωδικεύουν μεταφορείς και ένζυμα
για τον καταβολισμό ή αναβολισμό μιας ουσίας. Αποτέλεσμα της έκφρασης ενός
οπερονίου είναι ένα «πολυσιστρονικό» mRNA που «ωριμάζει» σε αυτόνομα RNA για
κάθε γονιδιακό προϊόν. Η οπερονική οργάνωση εξυπηρετεί την συνδυασμένη ρύθμιση
γονιδίων που εμπλέκονται σε μια κυτταρική λειτουργία.
ΚΥΡΙΟΙ ΠΡΩΤΑΓΩΝΙΣΤΕΣ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΡΥΘΜΙΣΗΣ
 
Νέες έννοιες- Ρυθμιστικές πρωτεΐνες-Υποκινητές

•Η μεταγραφή ρυθμίζεται από την αλληλεπίδραση «ρυθμιστικών πρωτεϊνών»

(trans- παράγοντες) και «χειριστών» (operators) η «υποκινητών» (promoters)
(θέσεις cis).
•Μια ρυθμιστική πρωτεΐνη μπορεί να ρυθμίζει πλειοτροπικά πολλά γονίδια

•Οι χειριστές-υποκινητές επηρεάζουν μόνο τα γονίδια που βρίσκονται δομικά

συνδεδεμένα με αυτούς
 
Διάκριση δομικών (S) και ρυθμιστικών (R) γονιδίων

R O S

(-/+) Τέσσερα βασικά συστήματα

ρύθμισης
Επαγωγή - PCI, NCI, PCR, NCR
αναστολή
ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ - ΒΑΣΙΚΟΙ ΑΜΕΣΟΙ ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ

Οι ρυθμιστικές ανασταλτικές πρωτεΐνες

(repressors or repressor proteins)

παρεμποδίζουν την RNA πολυμεράση είτε

στην δέσμευση στον υποκινητή είτε στην
έναρξη της μεταγραφής είτε στις επαφές της
με τους επαγωγείς

 Οι ρυθμιστικές επαγωγικές

πρωτεΐνες
(inducers or inducer proteins)
είτε ενεργοποιούν την RNA
πολυμεράση, είτε την βοηθούν να
δεσμευθεί σε μη-ιδανικούς
στόχους DNA στον υποκινητή
είτε παρεμποδίζουν τις επαφές
της με τους αναστολείς
ΡΥΘΜΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ - ΒΑΣΙΚΟΙ ΕΜΜΕΣΟΙ ΡΥΘΜΙΣΤΕΣ
Μεταβολίτες ως
Συν-επαγωγεις, συν-αναστολεις, επαγωγεις η αναστολεις….

Μικρά οργανικά μόρια (μεταβολίτες), που συνήθως είναι ουσίες σχετικές με το μεταβολικό
μονοπάτι το οποίο κωδικεύει ένα συγκεκριμένο οπερόνιο, ρυθμίζουν θετικά ή αρνητικά τις
ρυθμιστικές πρωτεΐνες μέσω αλλοστερικών αντιδράσεων που προκαλούν στις ρυθμιστικές
πρωτεΐνες όταν αυτές είναι «ελεύθερες» ή ήδη δεσμευμένες στους υποκινητές. Ονομάζονται
συνεπαγωγείς, συναναστολείς αλλά και επαγωγείς ή αναστολείς

Ο όρος gratuitous inducer

Η ικανότητα ενός μορίου να λειτουργεί ως συνεπαγωγέας/συναναστολέας των ρυθμιστικών
πρωτεϊνών δεν συνεπάγεται ότι το μόριο αυτό μπορεί πάντα να καταβολιστεί από τα ένζυμα
που κωδικεύονται από το οπερόνιο που ενεργοποιείται

(J. Monod)
 Αρνητική ρύθμιση Θετική ρύθμιση

R o S NCI PCI

(-) R o S

ΕΠΑΓΩΓΗ
(+)
π.χ. lac operon π.χ. καταβολισμός
Επαγωγέας
Συν-Επαγωγέας N, C

R o S NCR PCR

(-)
ΑΝΑΣΤΟΛΗ

R o S
(+)
Συν-αναστολέας

Αναστολέας

π.χ. try operons π.χ. γενικός έλεγχος

γεν-καταβολισμός C καταβολισμού Ν
 ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
 
 
1.     Δέσμευση στον χειριστή-υποκινητή - αναγνώριση στόχου στο DNA

2.     Δέσμευση – αλληλεπίδραση με το περιβάλλον, δηλαδή με

επαγωγέα, αναστολέα, συν-επαγωγέα ή συν-αναστολέα

3.     Ενεργοποίηση του βασικού μεταγραφικού μηχανισμού – RNA

πολυμεράση

4.     Αλληλεπιδράσεις με άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες

(συνεργατικά ή ανταγωνιστικά)  
 ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ

Μεταλλαγές στην ρυθμιστική πρωτεΐνη ή στον υποκινητή -χειριστή.

Στον υποκινητή οι μεταλλαγές

επηρεάζουν τα γονίδια - πρωτεΐνες
του γονιδίου/οπερονίου που
βρίσκονται σε θέση –cis
(cis-dominant, trans-recessive)

Στα δομικά γονίδια οι μεταλλαγές

επηρεάζουν μόνο την πρωτεΐνη που
κωδικεύεται.
ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΑ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ

Σε ρυθμιστικά γονίδια οι μεταλλαγές

επηρεάζουν όλα τα γονίδια/οπερόνια
(-cis και –trans)
που βρίσκονται υπό τον έλεγχο της
αντίστοιχης ρυθμιστικής πρωτεΐνης.
Πλειοτροπικές μεταλλαγές. Γιατί?
 ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ

1. Στο μοτίβο-περιοχή αναγκαίο για την δέσμευση στο DNA

2. Στο μοτίβο που αναγνωρίζει το μικρό μόριο επαγωγής ή αναστολής
3. Στο μοτίβο που χρειάζεται για την ενεργοποίηση της RNA πολυμεράσης
4. Σε περιοχές που αλληλεπιδρούν (συνεργατικά ή ανταγωνιστικά) με άλλες
ρυθμιστικές πρωτεΐνες
5. Σε άλλες περιοχές που έμμεσα επηρεάζουν τα παραπάνω μοτίβα, συνήθως
μέσω του αποτελέσματος που έχουν στην γενική δομή του μορίου.
 ΕΙΔΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ
ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΟΠΕΡΟΝΙΟΥ

    Μερική απώλεια λειτουργικότητας (partial loss of function)

Μεταλλαγές που είτε μειώνουν την απόδοση της πρωτεΐνης, είτε επηρεάζουν ένα από
τα μοτίβα λειτουργίας της (δέσμευση στο DNA, δέσμευση ρυθμιστικού μορίου, κλπ)
 
Αλλαγή της λειτουργίας (gain-of-function)
Απόκτηση νέας λειτουργίας. π.χ. δέσμευση σε νέους στόχους αναγνώριση άλλων
μορίων

Ολική απώλεια λειτουργικότητας (loss-of-function)

Σημειακές, εξαλείψεις, παρεμβολές, κλπ. Σ’ ένα αρνητικό κύκλωμα τέτοιες
μεταλλαγές στο R γονίδιο οδηγούν σε συνεχή («συστατική») έκφραση του
οπερονίου, ενώ σ’ ένα θετικό κύκλωμα οδηγούν στην μη-έκφραση του οπερονίου
(«μη-επαγωγή»)
 ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ

Μεταλλαγή PCI PCR NCI NCR

ΜΗ – ΜΟΝΙΜΗ ΣΥΝΕΧΗΣ ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ
Απώλειας ΕΠΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΕΚΦΡΑΣΗ (ΣΥΝΕΧΗΣ
ΕΚΦΡΑΣΗ)
λειτουργίας
- - + +
Απώλεια ΜΗ – ΜΟΝΙΜΗ ΣΥΝΕΧΗΣ ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ
ικανότητας ΕΠΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΕΚΦΡΑΣΗ (ΣΥΝΕΧΗΣ
δέσμευσης στο ΕΚΦΡΑΣΗ)
DNA
- - + +
Απώλεια ΜΗ – ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ ΜΟΝΙΜΗ ΑΠΑΝΑΣΤΟΛΗ
ικανότητας ΕΠΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ
δέσμευσης με
συνεπαγωγέα
- - + - +
συναναστολέα
Μόνιμη ΣΥΝΕΧΗΣ ΣΥΝΕΧΗΣ ΜΟΝΙΜΗ ΜΟΝΙΜΗ
δέσμευση στο ΕΚΦΡΑΣΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ
DNA
+ + - -
  ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

1) Ο φαινότυπος που προκαλεί μια μεταλλαγή είναι αποκαλυπτικός όσον

αφορά: (i) στο είδος του γονιδίου (ρυθμιστικό, δομικό, χειριστής)
(ii) στο είδος του κυκλώματος

2) Η συχνότητα του φαινοτύπου αυτού είναι επίσης ενδεικτική του

είδους του μεταλλαγμένου γονιδίου

Άλλα κριτήρια που μας αποκαλύπτουν το είδος του κυκλώματος είναι:

3) Γενετική «κυριαρχία» (dominance) των μεταλλαγών

Πρόβλημα όταν η «κυριαρχία» είναι ποσοτικά εξαρτώμενη

4) Φαινότυποι μεταλλαγών «αναστροφής» (reversion)

 ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΓΕΣ
Ένα μοναδικό εργαλείο για την in vivo μελέτη ενδογονιδιακών ή διαγονιδιακών
αλληλεπιδράσεων

 Κατασταλτικές μεταλλαγές είναι οι μεταλλαγές που τροποποιούν ή καταστέλλουν το

αποτέλεσμα (φαινότυπο) που προκαλεί μια αρχική μεταλλαγή
Μια κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να είναι: 
1.Ενδογονιδιακή
2.Διαγονιδιακή
 
• Οι Ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι: 
1.Ανaστροφή της αρχικής μεταλλαγής
2.Μεταλλαγή «Δεύτερης θέσης»

Οι μεταλλαγές δεύτερης θέσης μπορεί να είναι:  

1. Εξειδικευμένες ως προς την αρχική
μεταλλαγή (allele-specific)-
Υποδηλώνουν «επαφές».
2. Μη-εξειδικευμένες ως προς την αρχική
μεταλλαγή (allele non-specific)
Υποδηλώνουν εναλλακτικούς
μηχανισμούς (by-pass)
 Οι Διαγονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:
1. Σε γονίδιο παρόμοιας-εναλλακτικής λειτουργίας (by-pass)
2. Σε γονίδιο που κωδικεύει πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά με την
αρχικά μεταλλαγμένη πρωτεΐνη

Μεταφραστική καταστολή
 ΕΠΙΛΟΓΗ ΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ  

•Η γενετική απομόνωση in vivo κατασταλτικών μεταλλαγών αποτελεί ισχυρή μεθοδολογία καθορισμού

περιοχών, ή συγκεκριμένων αμινοξέων, που αλληλεπιδρούν εντός της ίδιας πρωτεΐνης (ενδογονιδιακά) ή
μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών (διαγονιδιακά).

•Mία ενδογονιδιακή κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να διαχωριστεί σε μεταλλαγή πρώτης θέσης (first-site
suppressor mutation) ή σε μεταλλαγή δεύτερης θέσης (second-site suppressor mutation).

•Οι ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές πρώτης θέσης είναι αυτές που «διορθώνουν» μία αρχική
μεταλλαγή που προϋπάρχει στην πρωτεΐνη (αναστροφή), και επομένως προσδίδουν συνήθως φαινότυπο
φυσικού τύπου.

•Οι ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές δεύτερης θέσης αφορούν σε ένα άλλο αμινοξύ της ίδιας
πρωτεΐνης. Η δεύτερη κατασταλτική μεταλλαγή μπορεί να τροποποιεί τη δομή ή τη λειτουργία της πρωτεΐνης
είτε αλληλεπιδρώντας άμεσα με το αρχικά μεταλλαγμένο αμινοξύ, είτε παρακάμπτοντας το πρόβλημα που είχε
δημιουργήσει η αρχική μεταλλαγή.

•Μέσω των κατασταλτικών μεταλλαγών αποκαλύπτονται αμινοξέα που αλληλεπιδρούν ή βρίσκονται «κοντά»
στο ενεργό κέντρο ή σε άλλες λειτουργικές περιοχές της πρωτεΐνης. Συχνά, οι κατασταλτικές μεταλλαγές
δεύτερης θέσης προσδίδουν νέες ιδιότητες στην πρωτεΐνη.

•Οι διαγονιδιακές μεταλλαγές, είναι κατασταλτικές μεταλλαγές οι οποίες χαρτογραφούνται σε ένα γονίδιο
διαφορετικό από αυτό που φέρει την αρχική μεταλλαγή. Μπορεί απλά να επαναφέρουν το φυσικό τύπο, αλλά
επίσης συχνά οδηγούν σε πλειοτροπικές αλλαγές στο κύτταρο. Μπορεί να αφορούν στην ενεργοποίηση ή την
τροποποίηση ενός εναλλακτικού ενζύμου, ή μια μεταλλαγή που «διορθώνει» την αλληλεπίδραση της αρχικά
μεταλλαγμένης πρωτεΐνης με κάποιο παράγοντα.
• 
 
 Περιληπτικά, κατασταλτικές μεταλλαγές είναι οι μεταλλαγές που τροποποιούν ή καταστέλλουν το
αποτέλεσμα (φαινότυπο) που προκαλεί μια αρχική μεταλλαγή.

      Οι ενδογονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:

1. Αναστροφή της αρχικής μεταλλαγής.
2. Μεταλλαγή δεύτερης θέσης.
 
      Οι μεταλλαγές δεύτερης θέσης μπορεί να είναι:
1. Εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele-specific)-Υποδηλώνουν
«επαφές».
2. Μη-εξειδικευμένες ως προς την αρχική μεταλλαγή (allele non-specific) Υποδηλώνουν
μηχανισμούς παράκαμψης (by-pass).
 
      Οι διαγονιδιακές κατασταλτικές μεταλλαγές μπορεί να είναι:
1. Σε γονίδιο παρόμοιας-εναλλακτικής λειτουργίας.
2. Σε γονίδιο του οποίου η μεταλλαγμένη λειτουργία έχει επιγενετικό αποτέλεσμα στην
αρχική μεταλλαγή. Πολλαπλοί μηχανισμοί by-pass.

Μεταφραστική καταστολή?
 ΠΡΟΤΥΠΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ
S. cerevisiae (yeast) versus A. nidulans (filamentous)
 ΠΡΟΤΥΠΟΙ ΜΥΚΗΤΕΣ
S. cerevisiae (yeast) versus A. nidulans (filamentous)
ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΣΕ ΠΡΟΤΥΠΟΥΣ ΜΥΚΗΤΕΣ-ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ
 ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ S. cerevisiae

Μεθοδολογία όμοια του χημικού μετασχηματισμού βακτηρίων

Μεθοδολογία επιλογής μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση

μεταλλαγής

Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ - (προτιμότερα με

Μεταλλαγή ολικής έλλειψης) και πλασμίδιο με φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ +

Κύτταρα στη λογαριθμική φάση αύξησης (OD=0.5)

Επώαση σε οξικό Li (ανάλογο του Ca++, Rb++ στα βακτήρια)-ρευστοποίηση μεμβράνης
Πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG)+DΝΑ (πλασμίδιο)
Θερμικό σοκ 42 ο C
Eπώαση σε επιλεκτικό θρεπτικό (συνήθως θρεπτικό χωρίς

Απόδοση: διαφέρει ανάλογα το πλασμίδιο (αυτόνομο ή ενσωμάτωσης),

μέγιστη 105-6 τ/μg
ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae

Πλασμίδια που αντιγράφονται σε

βακτήρια (Ε.coli) και στον S. cerevisiae

        Περιέχουν γονίδια επιλογής σε E. coli

(συνήθως Αr) και σε S. cerevisiae (LEU2,
TRD1, HIS3, URA3, κλπ).
       Πλασμίδια ενσωμάτωσης στο
γονιδίωμα     

Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής που

περιέχουν αλληλουχίες αυτόνομης
αντιγραφής ARS από το γονιδίωμα του S.
CEN cerevisiae ή το φυσικό πλασμίδιο 2μ

      Τα πλασμίδια 2μ υπάρχουν >12

ARS αντίγραφα/κύτταρο και είναι σταθερά.
Τα πλασμίδια ARS υπάρχουν επίσης σε
πολλαπλά αντίγραφα αλλά
είναι ασταθή εκτός εάν περιέχουν και
αλληλουχίες CEN από το κεντρομερές του
S. cerevisiae. Τα πλασμίδια ARS-CEN: 1-2
2μ αντίγραφα/κύτταρα.
 ΓΟΝΙΔΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΣΤΟΝ S. cerevisiae
-  

Απαραίτητοι για την αναγνώριση των γενετικά τροποποιημένων

κυττάρων – κλώνων.
Κυρίως γονίδια ενζύμων του μεταβολισμού αμινοξέων και
βάσεων που αρχικά κλωνοποιήθηκαν σε βακτήρια.

Leu2 +
Ανάλογο σύστημα με αυτό των
βακτηρίων όπου κυρίως
χρησιμοποιούνται γονίδια
Mετασχηματισμός ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά.
στελέχους
Leu2-

Leu2+
 Κυριότερα Γονίδια Επιλογής στον S. cerevisiae
γονίδια βιοσύνθεσης αμινοξέων-πυριμιδινών

YEAST SELECTABLE ΜARKERS

G ENE E NZYME S ELECTION

HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydratase histidine

LEU2 β-Isopropylmalare dehydrogenase leucine

LYS2 a -Α minoadipate reductase lysine

TRP1 N-(5 ΄-phosphoribosyl) -anthranilate isomerase tryptophan

URA 3 Orotidine -5 ΄-phosphate decarboxylase uracil

 Ο ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΝΗΜΑΤΟΕΙΔΩΝ (Α. nidulans)

Μεθοδολογία όμοια αλλά και με σημαντικές διαφορές του μετασχηματισμού ζυμών

Επιλογή μετασχηματισμένων: γενετική (λειτουργική) συμπλήρωση μεταλλαγής.

Βασική προϋπόθεση: Στέλεχος μεταλλαγμένο στο γονίδιο επιλογής Χ- και πλασμίδιο με

φυσιολογικό γονίδιο επιλογής Χ+ . Σπανιότερα χρησιμοποιούνται και γονίδια
ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά όπως η ολιγομυκίνη, φλυομυκίνη, υγρομυκίνη. Διάκριση
υπολειπόμενων και κυρίαρχων γενετικών στοιχείων επιλογής μετασχηματισμένων
στελεχών

Μετασχηματισμός πρωτoπλαστ σε ισοοσμωτικό περιβάλλον. Το κυτταρικό τοίχωμα

καταστρέφεται με ενζυμική πέψη (μέσω λυτικών ενζύμων).

Οι πρωτόπλαστες, που μπορεί να προέρχονται από μυκήλιο (πολυπύρηνοι) ή

κονιδιοσπόρια (1-2 πυρήνες), απομονώνονται από το μείγμα, προστίθεται DNA
(πλασμίδιο) και PEG. Η σύντηξη πρωτόπλαστων οδηγεί σε «είσοδο» του DNA.
Αναγέννηση πρωτόπλαστων – μετασχηματισμένων πυρήνων
Χαμηλής – Μέσης απόδοσης : 10-104 t/μg DNA. Εξαρτημένη από το
πλασμίδιο. Πλασμίδια ενσωμάτωσης: 10-1000 τ/μg
Πλασμίδια αυτόνομης αντιγραφής: 100.000 τ/μg

Άλλες μέθοδοι: Ηλεκτροδιάτριση, Βιολιστικός βομβαρδισμός. Οχι ιδιαίτερα

αποδοτικότεροι των κλασσικών μεθόδων.
 ΠΛΑΣΜΙΔΙΑΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ ΣΤΟΝ A. nidulans

    Πλασμίδια που περιέχουν αλληλουχίες

αντιγραφής (OriC) και επιλογής (Αr) σε E.
coli και γονίδιο επιλογής στον A. nidulans
(ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ή
συμπλήρωση μεταβολικής ανεπαρκείς π.χ.
argB, amdS, pyrG)

      Τα πλασμίδια αυτά ενσωματώνονται στο

γονιδίωμα σε ομόλογες ή μη ομόλογες
περιοχές. Η ενσωμάτωση τους μπορεί να
οδηγήσει σε απλή ή πολλαπλή ενσωμάτωση
του πλασμιδίου ή αντικατάσταση ολοκλήρου
ή μέρους του γονιδίου από το γονιδίωμα

Πλασμίδια τύπου ARS χρησιμοποιούνται αλλά είναι ιδιαίτερα ασταθή και δεν
χρησιμοποιούνται ευρέως
 Η ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΣΤΟΥΝ A. nidulans

  Στον S. cerevisiae, πλασμίδια που δεν φέρουν αλληλουχίες 2μ ή ARS ενσωματώνονται

κυρίως με ομόλογο ανασυνδυασμό. Ο ετερόλογος (τυχαίος;) ανασυνδυασμός είναι πολύ
σπάνιος

Στον A. nidulans, τα πλασμίδια ενσωματώνονται με

ομόλογο και/ή ετερόλογο ανασυνδυασμό
Η ενσωμάτωση μπορεί να είναι απλή ή πολλαπλή

Μ τ1 τ2 τ3
Απλή ετερόλογη
γονιδιωματικό
ενσωμάτωση
αντίγραφο argB
(μάρτυρας)

Απλή ομόλογη ενσωμάτωση Τριπλή ομόλογη ενσωμάτωση

 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΣΩΜΑΤΩΣΗΣ ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ
ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ ΜΥΚΗΤΩΝ

Ομόλογος Ανασυνδυασμός Ετερόλογος Ανασυνδυασμός

Α
Χ
απλό
Χ απλό
cross - over
cross - over
Α΄

Εάν η θέση ενσωμάτωσης

Διπλασιασμός γονιδίου Α
αντιστοιχεί σε γονίδιο =
απενεργοποίηση

Σε όλους τους μύκητες, γραμμικό πλασμιδιακό DNA ενσωματώνεται με διπλό ομόλογο

ανασυνδυασμό. Αυτό αποτελέι τη βάση της γονιδιακής αντικατάστασης η τη δημιουργία
knock-outs στο γονιδίωμα.
Στοχευμένη απενεργοποίηση γονιδίου (Knock-out)
Γραμμική DNA κασέτα που φέρει γονίδιο Α+
επιλογής το οποίο «διακόπτει» το orf. του
γονιδίου που θα αντικατασταθεί και ταυτόσημες Χ Β+ Χ

αλληλουχίες στα 5’ & 3’ άκρα του γονίδιου που

θα αντικατασταθεί. Σε περίπτωση θνησιγόνων
απενεργοποιήσεων ο μετασχηματισμός γίνεται
σε διπλοειδή κύτταρα ή μέσω ελεγχόμενου
υποκινητή Α-, Β+
( knock-down).

Γονιδιακή αντικατάσταση Α
Γραμμική κασέτα που εμπεριέχει το τροποποιημένο
γονίδιο (ελεγχόμενος υποκινητής, gfp tag, μεταλλαγμένη
μορφή, κλπ), γονίδιο επιλογής (γκρι μπάρα) και ταυτόσημες Α-gfp
αλληλουχίες στα 5’ & 3’ άκρα του γονιδίου που θα
αντικατασταθεί
...Η δημιουργία γραμμικών κασετών γίνεται μέσω
πολλαπλής ένωσης προϊόντων PCR και δεν
απαιτεί κλωνοποιήσεις (multiple Joint PCR). Στον
Aspergillus η χρήση στελεχών nkuAΔ εγγυάται Α-gfp
ομόλογο ανασυνδυασμό της κασέτας.
 KNOCK-OUT KAI ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΑΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ
ΘΝΗΣΙΓΟΝΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ/ΜΕΤΑΛΛΑΓΩΝ

1. Κnock-down : Αντικατάσταση γονίδιου υπό ελεγχόμενο υποκινητή

2. Knock –out σε διπλοειδή/ετεροκάρυα και απλοειδισμός

3. Αντικατάσταση σε δύο βήματα

 «ΔΙΑΣΩΣΗ» ΠΛΑΣΜΙΔΙΩΝ ΑΠΟ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ
A. nidulans ή S. cerevisiae

r
A Προϋπόθεση της μελέτης γονιδίων που
μετασχηματίζουν στελέχη μυκήτων και τους
προσδίδουν ενδιαφέροντες φαινοτύπους είναι η
απομόνωση των πλασμιδίων που εμπεριέχουν τα
γονίδια αυτά. Η «διάσωσή» τους γίνεται σε βακτήρια
x E. coli.
r
A
Στον S. cerevisiae όπου χρησιμοποιούνται κυρίως
αυτόνομα αντιγραφικά πλασμίδια αυτό είναι απλό.
απομόνωσηDNA μετασχ. Τα κύτταρα λύονται και μετασχηματίζουμε βακτήρια
βακτηρίων επιλέγοντας Αr καθώς όλα τα πλασμίδια του S.
cerevisiae φέρουν το γονίδιο Αr.
EcoRI
Στον A. nidulans όπου τα πλασμίδια ενσωματώνονται
EcoRI Ar
EcoRI στο γονιδίωμα, η «διάσωσή» τους είναι δυσκολότερη
Ar
αλλά εφικτή λόγου μιτωτικής ή μειωτικής
«εξωσωμάτωσης» (excision) των πλασμιδίων –
κυρίως όταν αυτά δημιουργούν διπλασιασμούς
+ T4 λιγάση γονιδίων. Εναλλακτικά μπορούμε να «αποκόψουμε»
την περιοχή ενσωμάτωσης και να την απομονώσουμε
 ΑΠΟ ΤΗ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ ΣΤΟ ΓΟΝΔΙΟ-
ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ή ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΉ ΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗ

Πλεονεκτήματα
• Ύπαρξη εκατοντάδων
μεταλλαγμένων στελεχών στους
μύκητες...
•Η ευκολία απομόνωσης νέων
μεταλλαγμένων στελεχών.
•Η ευκολία παραγωγής πλήρων
γενωμικών βιβλιοθηκών λόγω
του μικρού γονιδιώματος και της
απουσίας ιντρονίων (ή
παρουσίας μικρών ιντρονίων).
•Η δυνατότητα κλωνοποίησης
γονιδίων μικρής ομοιότητας ή
μη-ομολόγων γονιδίωναπό
άλλους οργανισμούς
Σημασία της ταξινόμηση μεταλλαγών σε επικρατούσες-υπολειπόμενες,
(θετικές-αρνητικές) πριν σχεδιάσουμε τη στρατηγική κλωνοποίησης

Η «φύση» μιας μεταλλαγής

μπορεί να μελετηθεί με 4 γενετικά Τεστ

•Γενετικού Διαχωρισμού. Ένα γονίδιο;

Διασταύρωση με φυσιολογικό τύπο (wt) &
αναζήτηση του 1:1

•Επικράτειας. Φαινότυπος σε διπλοειδή

•Γενετικής Συμπλήρωσης. Τεστ

λειτουργίας σε διπλοειδή. Είναι δυο
μεταλλαγές λειτουργικά συμπληρωματικές

•Γενετικής Σύνδεσης. Τεστ τοπολογίας.

Είναι δυο μεταλλαγές γενετικά συνδεδεμένες
(στο ίδιο γονίδιο), Ανάλυση απογόνων
Υπάρχουν εξαιρέσεις όπου τα
τεστ δίνουν «περίεργα»
αποτελέσματα;

•Ενδογονιδιακή
συμπληρωματικότητα

•Μη-συνδεδεμένη μη-
συμπληρωματικότητα
ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ή ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΉ ΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗ
…αν η μεταλλαγή είναι υπολειπόμενη (Loss-of-function)

uv

X+
X-

X+

+
X+

X- X-
ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ή ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΉ ΣΥΜΠΛΗΡΩΣΗ
….αν η μεταλλαγή είναι επικρατής (gain-of-function)

uv

Xm

Xm

+
Xm

X+ X+
ΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΝΤΑΣ ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΠΟΥ ΣΥΜΠΛΗΡΩΝΕΙ ΜΙΑ ΜΕΤΑΛΛΑΓΗ
 ΙΔΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ

Κλωνοποίηση – αναγνώριση γονιδίων μέσω υπερέκφρασης

(καταστολή μέσω πολλών αντίγραφων)

Μπορούμε να υπερεκφράσουμε γονίδια στον S. cerevisiae χρησιμοποιώντας

φορείς 2μ ή ARS ή χρησιμοποιώντας «δυνατούς υποκινητές». Στον A. nidulans αυτό
μπορεί να γίνει με πολλαπλή ενσωμάτωση εν σειρά πλασμιδίου ή με ισχυρούς υποκινητές
όπως ο alcA (αφυδρογονάση αλκοόλης)]. Η υπερέκφραση ενός γονιδίου οδηγεί σε
«εμφανείς» φαινοτύπους – συχνά μπορεί να «παρακάμψει» την ανάγκη άλλων γονιδίων ή
να καταστείλει μεταλλαγές π.χ. (i) Α (ενεργοποίηση) Β  Γ.
Σ’  ένα στέλεχος Α-, η υπερέκφραση του Β καταστέλλει την έλλειψη του Α. (

Υπερέκφραση μπορεί να οδηγήσει και σ’ αρνητικούς φαινοτύπους όταν

το προϊόν που υπερεκφράζεται συμμετέχει σε περισσότερο από ένα μονοπάτι

Β ΒΑ

Α
Γ ΓΑ

Εάν υπερεκφραστεί ο Β όλο το Α θα υπάρχει δεσμευμένο με το Β

In vivo Κυτταρικη Βιολογια

σε προτυπους μυκητες
 Η επανασταση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (gfp)
Η νέα in vivo κυτταρική βιολογία

ArtA ArtA
GFP ή GFP

GFP

PM ER

C C

P
M P
M V
V
Απεικόνιση πραγματικού χρόνου
κινήσεων πρωτεϊνών (video)

Ταυτόχρονη χρήση χρωστικών για

οργανίδια-ταυτοποιηση
Πυρήνα, χυμοτοπίου, ενδοσωμάτων,
μιτοχονδρίων, κτλ
Απεικόνιση πραγματικού χρόνου
κινήσεων πρωτεϊνών (movies)
Ταυτόχρονη χρήση χρωστικών για οργανίδια-ταυτοποίηση
ER, cis & trans-Golgi, διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. κτλ
Συνεντοπισμός με GFP/RFP
Cis-Golgi/ER
Νέα μικροσκόπια-νεες τεχνολογίες
Super resolution microscopy

 Co-localization/Z-stacks/deconvolution
FRET
FRAP
TIRF
PALM
2 Photon
STED
SplitYFP/BiFC
MΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ
ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ
ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΩΝ
 Το σύστημα διπλού υβριδίου στον S. cerevisiae
(yeast two-hybrid system 1989, Fields & Song)

Βασίζεται στο ότι δομικά & λειτουργικά διακριτές περιοχές (domains) μιας πρωτεΐνης μπορούν
να «συναρμολογηθούν» λειτουργικά ακόμη και αν εκφράζονται από διαφορετικους φορείς

ΥΒΡΙΔΙΟ 1:
Πρωτεΐνη Χ – GAL4 μοτίβο
δέσμευσης DNA

ΥΒΡΙΔΙΟ 2:
Πρωτεΐνη Υ-GAL4 μοτίβο
ενεργοποίησης μεταγραφής.

Εάν Χ-Υ σχηματίσουν σύμπλοκο, τα

δύο μοτίβα του GAL4 έρχονται σε
επαφή-συναρμολογούνται και
ενεργοποιούν το γονίδιο

Τα Χ & Υ μπορεί να είναι γνωστά ή

άγνωστα…

Ζύμη:>1000γονίδια, >4500 αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών

Εντοπισμός πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με το σύστημα
διαμελισμένης ουβικουιτίνης ( split-ubiquitin system)

Fusions of ubiquitin and a target protein are recognized

and cleaved by ubiquitin-specific proteases (UBPs).
UBPs do not recognize a specific sequence of a
polypeptide chain but instead recognize the folded
ubiquitin.

Ubiquitin can be expressed in yeast as an N-terminal half

(Nub) as well as a C-terminal half (Cub). The two halves
retain their affinity for each other and spontaneously
reassemble to form the so-called split-ubiquitin.

A point mutation in the N-terminal half of ubiquitin

(NubG) completely abolishes the affinity of the two
halves for each other. As the separate NubG and Cub
parts are not recognized by ubiquitin-specific proteases
(UBPs), no cleavage of the reporter protein takes place.

The bait protein is fused to the Cub domain followed by a

reporter protein, and a prey protein is fused to a mutated
NubG domain. If bait and prey interact, their interaction
brings the NubG and Cub domains close enough together
to reconstitute split-ubiquitin, resulting in the release of
the reporter protein (red) by the action of the UBPs.
Εντοπισμός πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με το σύστημα
split-YFP ή bi-fluorescence (BiF)

UapA-driven reconstitution of split-YFP

 Εντοπισμός πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με FRET
(Fluorescence resonance energy transfer)

FRET between cyan fluorescent protein (CFP) as a donor fused to protein A and yellow
fluorescent protein (YFP) fused as an acceptor to protein B. Under favorable spatial and
angular conditions, interaction between A and B causes a decrease in the intensity of
donor (CFP) fluorescence concomitant with an increase in acceptor (YFP) fluorescence.
CFP and YFP are depicted as cyan and yellow ribbon models fused to putative
interacting proteins A and B, respectively.
Εντοπισμός-Απομόνωση- Καθαρισμός πρωτεϊνών
Μεσω προσθήκης πολυπεπτιδικών επιτόπων (tags)