ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ

Εθνικόν και Καποδισφιακόν

Πανεπιστήμιον Αθηνών
------- ΙΔΡΥΘΕΝ ΤΟ 1837 ------
ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ & ΒΙΟΤΕΧΝΟΛ ΟΓΙΑΣ

ΜΑΘΗΜΑ: ΓΕΝΕΤΙΚΗ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ

Α.Μ. ΠΑΠΠΑ, Μ. ΊΎΠΑΣ, Κ. ΛΑΜΝΗΣΟΥ, Μ. ΣΑΡΙΚΑ, Β. ΚΟΥΒΕΛΗΣ, Π. ΚΟΛΛΙΑ

ΑΘΗΝΑ 2021
 ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ

Οι εργαστηριακές ασκήσεις του μαθήματος της Γενετικής (μάθημα Γ' εξαμήνου) αρχίζουν 1 εβδομάδα
μετά την έναρξη των μαθημάτων και διαρκούν 10 εβδομάδες πειραματικής εργασίας.

Βασικοί Κανόνες

Οι φοιτητές εργάζονται ανά δύο και οι θέσεις που διατηρούν στο εργαστήριο είναι μόνιμες.

Δεν επιτρέπεται απουσία από εργαστηριακή άσκηση, παρά μόνο μία αιτιολογημένη. Επειδή σχεδόν
όλες οι ασκήσεις γίνονται σε περισσότερες της μιας εβδομάδες, σε περίπτωση απουσίας είναι καλό η
αναπλήρωση να γίνεται την ίδια εβδομάδα σε άλλο τμήμα με την ίδια άσκηση, για να μην υπάρχουν
διδακτικά κενά στο φοιτητή. Η αναπλήρωση γίνεται μετά από συνεννόηση με τον διδάσκοντα. Σε
περίπτωση περισσοτέρων της μιας απουσιών ο φοιτητής θα πρέπει να επαναλάβει όλη την σειρά των
ασκήσεων σε επόμενο ακαδημαϊκό έτος.

Οι φοιτητές θα πρέπει να είναι ενημερωμένοι για το περιεχόμενο της εργαστηριακής άσκησης και να
μελετούν την αντίστοιχη ύλη που έχει διδαχθεί στο μάθημα.

Σε ειδικές περιπτώσεις όπου χρειάζεται να γίνει αναβολή άσκησης λόγω αργιών θα ενημερώνεστε για
τη νέα ημερομηνία η οποία θα είναι (συνήθως) μέσα στην ίδια εβδομάδα λόγω της φύσης των
ασκήσεων.

Βαθμολογία

Ο βαθμός του εργαστηρίου αποτελεί το 30% του τελικού βαθμού του μαθήματος και συνυπολογίζεται
από το βαθμό του διαγωνίσματος που θα γίνει μετά την ολοκλήρωση των ασκήσεων στο εργαστήριο και
ενός προφορικού βαθμού που διαμορφώνεται από την εικόνα των γραπτών κειμένων - απαντήσεων που
παραδίδει ο κάθε φοιτητής (ή ομάδα δύο ατόμων) στο τέλος κάθε άσκησης και από την προσωπική
γνώμη του κάθε διδάσκοντα για την παρουσία του φοιτητή στο εργαστήριο.
Ο βαθμός εργαστηρίου που εξασφαλίζει κάθε φοιτητής τον χρόνο που θα ασκηθεί παραμένει και
συνυπολογίζεται στο βαθμό του μαθήματος όποτε και αν ο φοιτητής εξεταστεί στο μάθημα. Διόρθωση
βαθμού γίνεται μόνο εάν ο φοιτητής ασκηθεί εκ νέου σε επόμενο ακαδημαϊκό έτος (εάν αυτό είναι
εφικτό).

Διδάσκοντες εργαστηρίου
Αικ. Παππά, Αν. Καθηγήτρια
Β. Κουβέλης, Επ. Καθηγητής
Μ. Σαρίκα, ΕΔΙΠ
Π. Κόλλια, Καθηγήτρια
Α. Αγαθαγγελίδης, Επ. Καθηγητής

2
 Περιεχόμενο των εργαστηριακών ασκήσεων

Α/Α Άσκηση Περιεχόμενο

1
Μεντελική Κληρονομικότητα Ι Α) Παρατήρηση μεταλλαγμένων στελεχών Drosophila
melanogaster.
Β) Πατρικές διασταυρώσεις μεταξύ διαφορετικών στελεχών
(Ρ).
2
Ανάλυση αποτελεσμάτων Α) Απομάκρυνση γονέων από τις διασταυρώσεις (Ρ).
διασταυρώσεων σε ρόκες
Β) Επεξεργασία αποτελεσμάτων διασταυρώσεων που
καλαμποκιού
αφορούν επτά ζεύγη γονιδίων σε ρόκες καλαμποκιού, με
απλές αναλογίες μονουβριδισμού, διυβριδισμού και
αναλογίες αλληλεπιδράσεων γονιδίων.
3
Μεντελική Κληρονομικότητα II Α) Αποτελέσματα F1 γενιάς - Συμπεράσματα.
Β) Διασταυρώσεις FI X F1.
Απομάκρυνση γονέων από τις διασταυρώσεις FI X F1.
4
Μεντελική Κληρονομικότητα Καταγραφή αποτελεσμάτων F2 γενιάς.
III
Επεξεργασία – Συζήτηση.
Ανάλυση X2 - Εύρεση απόστασης γονιδίων (αν είναι
συνδεδεμένα).
5
Εισαγωγή στη γενετική Μεταλλαξογένεση σε βακτήρια και μύκητες με επίδραση
μικροοργανισμών υπεριώδους ακτινοβολίας.
6
Καταγραφή και ανάλυση των Θνησιμότητα - μεταλλαξιμότητα - επιδιόρθωση. Έλεγχος
αποτελεσμάτων της άσκησης 6 μορφολογικών μεταλλαγών και μεταλλαγών αυξοτροφίας
[η άσκηση αυτή γίνεται σε δύο μυκήτων.
εβδομάδες]
7
Κυτταρογενετική
8&9
Η βακτηριακή ανθεκτικότητα σε Μοριακοί στόχοι των αντιβιοτικών και γενετική βάση της
αντιβιοτικά ως γενετικό μοντέλο ανθεκτικότητας, έλεγχος ανάπτυξης και μελέτη ζωνών
καταστολής, χρωμοσωμική και εξωχρωμοσωμική
κληρονομικότητα γονιδίων ανθεκτικότητας, οριζόντια
μεταφορά γονιδίων, επίδειξη φαινομένων γονιδιακής
επαγωγής. Καταγραφή αποτελεσμάτων αυξοτροφικών
μεταλλαγών μυκήτων της άσκησης 6.

10
Πληθυσμιακή Γενετική Ισορροπία κατά Hardy-Weinberg, επιπτώσεις στον πληθυσμό
λόγω επίδρασης της φυσικής επιλογής.

3
 ΜΕΝΤΕΛΙΚΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ (Ι, ΙΙ, ΙΙΙ)

ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟ ΕΝΤΟΜΟ Drosophila melanogaster

Κ. Λάμνησου, Μ. Σαρίκα

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ
Εισαγωγή

Μια σειρά εργαστηριακών ασκήσεων στο πλαίσιο του μαθήματος της Γενετικής πραγματοποιείται με το
έντομο Drosophila melanogaster μια μικροσκοπική, κοινή μύγα που στη φύση απαντάται κοντά σε
ώριμα φρούτα (μύγα των φρούτων). Δεδομένου ότι το είδος αυτό χρησιμοποιείται πάνω από έναν αιώνα
για πειράματα σχετιζόμενα με διάφορες βιολογικές διεργασίες, υπάρχουν διαθέσιμα στην αγορά πολλά
διαφορετικά μεταλλαγμένα στελέχη του. Επιπλέον αυθόρμητες μεταλλαγές προκύπτουν αρκετά συχνά
σε άγριους πληθυσμούς του, οι οποίοι εύκολα μπορεί να απομονωθούν από την φύση. Οι μεταλλάξεις
σε αυτούς τους πληθυσμούς είναι σχετικά συχνές σε σύγκριση με άλλα είδη, λόγω μικρού χρόνου
γενιάς.
Η Drosophila melanogaster έχει μελετηθεί εντατικά περισσότερο από 100 χρόνια, και εκτιμάται ότι
παγκοσμίως πάνω από 10.000 επιστήμονες έχουν πάρει μέρος σε έρευνες στις οποίες η Drosophila
melanogaster αποτελεί τον οργανισμό αναφοράς. Τα αποτελέσματα αυτών των ερευνών είχαν και έχουν
σπουδαίο αντίκτυπο στην εξέλιξη πολλών κλάδων της βιολογίας : εννέα τουλάχιστον ερευνητές έχουν
λάβει βραβείο Νόμπελ για τη δουλειά τους στη Δροσόφιλα - το τελευταίο μόλις το 2017 (Εικ. 1). Οι
βιοϊατρικές επιστήμες θα ήταν πολύ πίσω από την τρέχουσα κατάστασή τους χωρίς τις έρευνες στις
μύγες Drosophila ή άλλους απλούς οργανισμούς, όπως ο νηματοειδής Caenorhabditis elegans ή η ζύμη
Saccharomyces cerevisiae.

Εικόνα 1. Ερευνητές στους οποίους απονεμήθηκε βραβείο Nόμπελ για την επιστημονική τους εργασία στην
Drosophila (https://poppi62.wordpress.com/tag/drosophila/).

Στα μέσα του 20ου αιώνα έρευνες επί της Drosophila βοήθησαν να αποκτηθεί γνώση που έδωσε
αλματώδη ώθηση στην εξέλιξη δύο μεγάλων επιστημονικών κλάδων, της γενετικής και της
εμβρυολογίας. Οι έρευνες αυτές μαζί με την έλευση της μοριακής βιολογίας και τις εξελίξεις στη
βιοχημεία οδήγησαν από κοινού στην ανακάλυψη και μελέτη γονιδίων που εμπλέκονται στην εμβρυϊκή
ανάπτυξη και στη λειτουργία του νευρικού συστήματος (Mohr, 2018). Αργότερα αποδείχθηκε πως
γονίδια θηλαστικών είναι πολύ παρόμοια στη δομή και τη λειτουργία με ισοδύναμα τους στη
Drosophila ενώ έχει διαπιστωθεί πως περίπου το 75% γνωστών γονιδίων ανθρώπινης νόσου έχουν μια
αναγνωρίσιμη αντιστοιχία στο γονιδίωμα των «μύγας των φρούτων». Γίνεται επομένως αντιληπτό πως
το έντομο αυτό αποτέλεσε κορυφαίο πειραματικό μοντέλο για την κατανόηση αρχαίων θεμελιωδών

4
βιολογικών και γονιδιακών λειτουργιών που φαίνεται να έχουν βαθειά ομολογία σε οργανισμούς που
μοιράστηκαν τον τελευταίο κοινό πρόγονό τους πριν από πολλά εκατομμύρια χρόνια. Πολλοί ερευνητές
προτείνουν πως είναι ο ιδανικότερος οργανισμός για τη μελέτη των κληρονομικών ασθενειών και την
αναζήτηση συναφών θεραπειών. Το 1910, μελέτες του Thomas Hunt Morgan (αμερικανός βιολόγος,
βραβείο Νόμπελ Φυσιολογίας και Ιατρικής 1933) σχετικά με την εξέλιξη οδήγησαν στο σχεδόν τυχαίο
εύρημα ότι τα γονίδια βρίσκονται στα χρωμοσώματα. Η ανακάλυψη αυτή σηματοδότησε την έναρξη
της εποχής της Γενετικής - με τις έρευνες επί της Drosophila να οδηγούν σε συμπεράσματα που
ερμηνεύουν το πως τα γονίδια οργανώνονται, μεταλλάσσονται ή αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Οι
έρευνες αυτές καθιέρωσαν στο εξής τη χρήση του εντόμου στη διεξαγωγή πειραμάτων που
αποσκοπούσαν στη διαλεύκανση του τρόπου μεταβίβασης των κληρονομικών παραγόντων από τους
γονείς στους απογόνους. Μέχρι τότε η Βιολογία βασιζόταν κυρίως στην παρατήρηση και την
ταξινόμηση. Ο Morgan όμως θεώρησε πως τα πειραματικά αποτελέσματα υπερτερούν της παρατήρησης
και πως μόνο αυτά μπορούν να δώσουν αξιόπιστες και τεκμηριωμένες απαντήσεις σε ερωτήματα όπως
ποιοί είναι οι κληρονομικοί παράγοντες, που βρίσκονται και πως περνούν από τη μια γενιά στην άλλη.
Μελετώντας τη Drosophila ο Morgan και οι συνάδελφοί του επιβεβαίωσαν την χρωμοσωμική θεωρία
της κληρονομικότητας: ότι τα γονίδια φέρονται πάνω στα χρωμοσώματα και ότι ορισμένα από αυτά
συνδέονται (που σημαίνει ότι βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα και κληρονομούνται πάντα μαζί).
Ανακάλυψαν επίσης τη φυλοσύνδετη κληρονομικότητα και τον γενετικό ανασυνδυασμό, θέτοντας τις
βάσεις της σύγχρονης γενετικής και τη μικρή μύγα στην πρώτη γραμμή της γενετικής έρευνας.
Μολονότι δεν ήταν οι πρώτοι που χρησιμοποίησαν αυτόν τον οργανισμό, τα πειράματά τους απλά στον
σχεδιασμό και εύχρηστα έχουν καθιερωθεί και θεωρούνται κλασικά. Ακόμη και σήμερα, καμία
προπτυχιακή εκπαίδευση στη γενετική δεν θεωρείται πλήρης χωρίς να αφιερωθεί κάποιος χρόνος σε
πειράματα με Drosophila. Η D. melanogaster από τότε μέχρι και σήμερα αποτελεί ιδανικό οργανισμό
για γενετικές μελέτες διότι συγκεντρώνει σημαντικά πλεονεκτήματα (έναντι άλλων οργανισμών) όπως:
1. Καλλιεργείται εύκολα στο εργαστήριο. Η συντήρηση των αποθεμάτων έχει χαμηλό κόστος,
απαιτεί απλό εξοπλισμό και λίγο διαθέσιμο χώρο.
2. Έχει μικρό κύκλο αναπαραγωγής και δίνει μεγάλο αριθμό απογόνων με μικρό μέγεθος που
επιτρέπει τον εύκολο χειρισμό.
3. Έχει καλά γνωστό, μικρό σε μέγεθος γονιδίωμα που για πολλά χρόνια χρησιμοποιείται ως γενετικό
μοντέλο, εύκολο στο χειρισμό με πολλά ορθόλογα γονίδια (orthologous genes or orthologs) που
σχετίζονται με ανθρώπινες νόσους.
4. Διαθέτει σεξουαλικό διμορφισμό: τα αρσενικά άτομα διαφέρουν από τα θηλυκά, γεγονός που
διευκολύνει τη διάκριση των φύλων.
5. Τα παρθένα (σεξουαλικώς ανώριμα) άτομα διαφέρουν αρκετά από τα ώριμα ενήλικα, καθιστώντας
εύκολο τον διαχωρισμό παρθένων θηλυκών και αρσενικών ατόμων για την διεξαγωγή επιλεγμένων
διασταυρώσεων.
6. Αναισθητοποιείται εύκολα
7. Υπάρχει διαθέσιμος ένας μεγάλος αριθμός μεταλλαγών που προκαλούν μορφολογική, κυρίως
ποικιλότητα
8. Έχει μικρό αριθμό χρωμοσωμάτων.

Είναι φανερό ότι για να μελετηθεί ο τρόπος μεταβίβασης των κληρονομήσιμων χαρακτηριστικών από
τους γονείς στους απογόνους είναι χρήσιμο να διαδέχονται η μια γενιά την άλλη σε σχετικά σύντομο
χρονικό διάστημα, να υπάρχει μεγάλος αριθμός απογόνων ώστε να μπορεί να οδηγηθεί κάποιος σε

5
στατιστικά αποτελέσματα και να υπάρχει προφανώς ποικιλομορφία σε κληρονομούμενα
χαρακτηριστικά. Επίσης, ο μικρός αριθμός χρωμοσωμάτων διευκολύνει σημαντικά στη χαρτογράφηση
των γονιδίων.
Τι αποκομίζουν οι φοιτητές από τα πειράματα με D. Melanogaster:
1. Κατανοούν τον κύκλο ζωής ενός εντόμου που εμφανίζει πλήρη μεταμόρφωση.
2. Αποκτούν γνώσεις για τον τρόπο καλλιέργειας και διατήρησης των πειραματικών στελεχών.
3. Μαθαίνουν τεχνικές χειρισμού των εντόμων (αναισθητοποίηση, μεταφορά σε φιαλίδια
καλλιέργειας, παρατήρηση στο στερεοσκόπιο)
4. Παρατηρούν και μαθαίνουν να αναγνωρίζουν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά του άγριου
(φυσικού) τύπου και άλλων στελεχών που φέρουν μεταλλαγές ως προς ένα ή περισσότερα
χαρακτηριστικά.
5. Κάνουν διασταυρώσεις μεταξύ διαφορετικών στελεχών (άγριου τύπου και μεταλλαγμένων)
διεξάγοντας οι ίδιοι ένα επιστημονικό πείραμα.
6. Ανακαλύπτουν προβληματισμούς και έννοιες που καθοδηγούν τις επιστημονικές έρευνες.
7. Καταλήγουν σε συμπεράσματα για τα πρότυπα κληρονομικότητας από τα αποτελέσματα που
λαμβάνουν.
8. Αντιλαμβάνονται ότι οι κληρονομικές πληροφορίες εδράζονται στα γονίδια.
9. Ερμηνεύουν και διατυπώνουν τα αποτελέσματά τους χρησιμοποιώντας τη λογική και τα
αποδεικτικά στοιχεία που διαθέτουν.
10. Συνειδητοποιούν ότι πολλά επιστημονικά πειράματα δεν μπορούν να διεξαχθούν και να
ολοκληρωθούν σε μία ή δύο εργαστηριακές συνεδρίες.

Συστηματική κατάταξη

Η Drosophila melanogaster, από πλευράς Συστηματικής, ανήκει στα Δίπτερα στην Οικογένεια
Drosophilidae, στο Γένος Drosophila
Classification
Domain: Eukarya
Kingdom: Animalia
Phylum: Arthropoda
Class: Insecta
Order: Diptera
Family: Drosophilidae
Genus: Drosophila
Species: melanogaster

Τα πιο πολλά είδη που ανήκουν στο Γένος Drosophila έχουν 6 ζευγάρια χρωμοσωμάτων, ενώ μερικά
έχουν μικρότερο αριθμό όπως π.χ. το είδος D. melanogaster που έχει 4 ζευγάρια χρωμοσωμάτων (τρία
επιμήκη και ένα σφαιρικό) που αριθμούνται από ένα Ι για τα φυλετικά μέχρι IV για τα αυτοσώματα.

Κύκλος ζωής

Σε άριστες συνθήκες τα αυγά αποτίθενται στην τροφή (θρεπτικό υπόστρωμα) αμέσως μετά τη
γονιμοποίηση. Αν για κάποια αιτία, όπως χαμηλή θερμοκρασία ή έλλειψη κατάλληλης θέσης για την

6
απόθεση των αυγών, το θηλυκό δεν γεννήσει το γονιμοποιημένο ωάριο (η γονιμοποίηση του ωαρίου
γίνεται στην πορεία του όταν αυτό εγκαταλείπει την ωοθήκη και κατευθύνεται προς τον ωοθέτη), τα
πρώτα στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης η οποία αρχίζει αμέσως μετά τη γονιμοποίηση, γίνονται στο
εσωτερικό του ατόμου.

Εικόνα 2. Το φιαλίδιο που απεικονίζεται δείχνει τα στάδια του κύκλου ζωής (έμβρυο - τέλειο έντομο), ο
οποίος ολοκληρώνεται σε 9–10 ημέρες όταν οι μύγες διατηρούνται στους 25 ο C. Τα έμβρυα εκκολάπτονται
από το ωάριο μετά από 1 ημέρα (22 - 24 ώρες) και περνούν 4 ημέρες ως προνύμφες μέσα στην τροφή.
Περίπου την 5η ημέρα, οι προνύμφες τρίτου σταδίου εξέρχονται για να επικαθίσουν στα τοιχώματα του
φιαλιδίου. Κατά τη διάρκεια των ημερών 5-9, λαμβάνει χώρα η μεταμόρφωση και η ωρίμανση των τέλειων
εντόμων τα οποία εξέρχονται από το βομβύκιο την 9 η ή 10η ημέρα (Hales et al. 2015).

Η ανάπτυξη του ατόμου από το πρώτο εμβρυικό στάδιο μέχρι το τέλειο έντομο διαρκεί, στους 25 ο C, 9-
10 ημέρες. Όταν συμπληρωθεί η ανάπτυξη του εμβρύου (απαιτείται διάστημα 22 ωρών περίπου), από
το αυγό εκκολάπτεται η προνύμφη (larva) η οποία (μοιάζει με σκουλήκι) σκάβει στοές μέσα στην

7
τροφή. Κατά τη διάρκεια του σταδίου αυτού που διαρκεί 4 ημέρες γίνονται δύο εκδύσεις της προνύμφης
που χωρίζουν το προνυμφικό στάδιο σε τρία επί μέρος στάδια (first, second and third instar larva).
Περίπου την 5η ημέρα οι προνύμφες τρίτου σταδίου εξέρχονται από το θρεπτικό μέσο και κάθονται στα
τοιχώματα των φιαλιδίων όπου ακινητοποιούνται, μικραίνουν σε μέγεθος και μεταμορφώνονται σε
νύμφες (pupa). Αυτό είναι ένα μεταβατικό στάδιο που διαρκεί περίπου μισή ημέρα. Το στάδιο της
νύμφης διαρκεί 4 ημέρες κατά τη διάρκεια των οποίων λαμβάνει χώρα η μεταμόρφωση και η ωρίμανση
του τέλειου ατόμου. Την 9η ή 10η ημέρα το τέλειο έντομο εκκολάπτεται από το βομβύκιο ανοίγοντας
οπή στο πρόσθιο τμήμα του. Στην αρχή, έχει σώμα επίμηκες με χρώμα ανοικτότερο του κανονικού και
αναδιπλωμένα φτερά (Εικ. 4), γρήγορα όμως παίρνει την κανονική του μορφή (Εικ. 3). Η εκδίπλωση
των φτερών γίνεται μια ώρα περίπου μετά την εκκόλαψη ενώ η απόκτηση του κανονικού χρώματος
μερικές ώρες αργότερα.

Εικόνα 3. Τέλεια έντομα (αριστερά αρσενικό, δεξιά θηλυκό)

Εικόνα 4. Νέο-εκολαφθέν θηλυκό άτομο

Η διάρκεια ζωής της D. melanogaster ποικίλει ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Σε ιδανικές
συνθήκες καλλιέργειας φτάνει μέχρι της 50 ημέρες ενώ σε δυσμενείς συνθήκες περιορίζεται σημαντικά.

8
Σύζευξη

Από τη στιγμή που θα εκκολαφθούν τα τέλεια έντομα απαιτούνται μερικές ώρες ώσπου να γίνουν
ώριμα σεξουαλικά. Ένα ώριμο αρσενικό μπορεί να γονιμοποιήσει μέχρι 10 παρθένα θηλυκά σε μια
μέρα. Το θηλυκό αποθηκεύει το σπέρμα που παίρνει από τη σύζευξη σε ειδικό όργανο που έχει, τη
σπερματοθήκη, μέσα στην οποία παραμένει βιώσιμο για πολλές ημέρες. Μια μόνο σύζευξη προμηθεύει
το θηλυκό με αρκετό σπέρμα ώστε να γεννά γονιμοποιημένα αυγά για 6-8 ημέρες. Τα θηλυκά δεν είναι
συνήθως δεκτικά στα αρσενικά μετά τη σύζευξη, όμως αν συζευχθούν και πάλι η τελευταία ομάδα
σπερματοζωαρίων που παίρνουν εκτοπίζει εκείνα που ήδη υπήρχαν αποθηκευμένα. Έτσι αν ένα θηλυκό
συζευχθεί με δύο διαφορετικά αρσενικά οι απόγονοι που θα δώσει θα είναι κυρίως, αλλά όχι
αποκλειστικά, από το δεύτερο πατέρα.
Από τα παραπάνω είναι φανερό ότι σε περιπτώσεις προγραμματισμένων διασταυρώσεων είναι
απαραίτητη η χρησιμοποίηση παρθένων θηλυκών ατόμων.

Αναγνώριση φύλου

Η αναγνώριση του φύλου είναι πολύ σημαντική για την επιτυχή εκτέλεση επιλεγμένων πειραματικών
διασταυρώσεων. Τα δύο φύλα αναγνωρίζονται εύκολα από εξωτερικά χαρακτηριστικά στο στάδιο του
τέλειου εντόμου. Τα σημαντικότερα είναι τα εξής:
1. Η μορφολογία του τελικού τμήματος της κοιλιάς. Στα αρσενικά το τμήμα αυτό είναι στρογγυλό ενώ
στα θηλυκά οξύληκτο, λόγω του ωοθέτη (Εικ. 3, 5 & 6).
2. Το χρώμα του τελικού τμήματος της κοιλιάς. Στα άτομα φυσικού (άγριου) τύπου (και σε πολλές
μεταλλαγές) το τελικό τμήμα της κοιλιάς των αρσενικών είναι σκουρότερο των θηλυκών (Εικ. 3, 5
& 6), στοιχείο που διευκολύνει την αναγνώριση του φύλου μακροσκοπικά.

Εικόνα 5. Αριστερά: , δεξιά Εικόνα 6. Αριστερά: , δεξιά

3. Το φυλετικό χτένι. Τα αρσενικά άτομα φέρουν στο πρώτο ζευγάρι των ποδιών τους ένα σύνολο
σμηρίγγων, που σχηματίζουν το φυλετικό χτένι (Εικ. 3). Τέτοιος σχηματισμός δεν υπάρχει στα
θηλυκά.

9
4. Αριθμός τμημάτων κοιλιακής χώρας. Τα αρσενικά έχουν στη κοιλιακή τους χώρα πέντε τμήματα
ενώ τα θηλυκά επτά (Εικ. 5 & 6).

Επίσης είναι δυνατή η αναγνώριση του φύλου στο στάδιο της προνύμφης και της νύμφης. Χρειάζεται
όμως πιο προσεκτική παρατήρηση στα στάδια αυτά. Στη νύμφη, κριτήριο είναι πάλι το φυλετικό χτένι
το οποίο μπορούμε να δούμε στα αρσενικά άτομα μέσα από το λεπτό διαφανές βομβύκιο που
περιβάλλει το άτομο στο στάδιο αυτό. Η παρατήρηση για αναγνώριση του φύλου πρέπει να γίνεται όταν
η νύμφη είναι ώριμη, δηλαδή λίγο πριν εκκολαφθεί το έντομο οπότε έχει σχηματιστεί το φυλετικό χτένι
στα αρσενικά άτομα. Στο στάδιο της προνύμφης η αναγνώριση γίνεται ακόμα πιο δύσκολα και
στηρίζεται στο μέγεθος των γονάδων. Στα αρσενικά άτομα οι γονάδες (προγονικές μορφές των όρχεων)
είναι μεγαλύτερες από τις γονάδες των θηλυκών (προγονικές μορφές των ωοθηκών).

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Καλλιέργεια D. melanogaster

Τα έντομα εκτρέφονται συνήθως μέσα σε πλαστικά φιαλίδια που περιέχουν κατάλληλο θρεπτικό μέσο
(τροφή) και διατηρούνται κλειστά με πώμα από βαμβάκι ή πορώδες υλικό (Εικ. 7). Μικρά πλαστικά
φιαλίδια θεωρούνται ως τα καταλληλότερα τόσο για τη διατήρηση μικρών πληθυσμών όσο και για την
άσκηση των φοιτητών καθώς αν οι εργαστηριακές διασταυρώσεις γίνουν σε γυάλινα δοχεία υπάρχει
ενδεχόμενο θραύσης από την οποία ο φοιτητής θα έχανε δεδομένα 2 εβδομάδων με μία μόνο διαρροή.
Οι βέλτιστες συνθήκες διατήρησης των καλλιεργειών της D. melanogaster στο εργαστήριο
διασφαλίζονται όταν η υγρασία παραμένει σταθερά στο 60% και η θερμοκρασία κυμαίνεται από 23ο
έως 25ο C. Σε αυτές τις συνθήκες ο χρόνος γενιάς (παραγωγής) είναι 9 - 10 ημέρες από το έμβρυο έως
τα ενήλικο άτομο.

Εικόνα 7. Α: Φιαλίδιο καλλιέργειας, Β: Θάλαμος σταθερής θερμοκρασίας, C & D: Χειρισμός εντόμων με τη

βοήθεια στερεοσκοπίου, E: Drosophila melanogaster (https://poppi62.wordpress.com/tag/drosophila/)

Σε μικρότερες θερμοκρασίες παρατηρείται επιβράδυνση της ανάπτυξης ενώ σε θερμοκρασία

μεγαλύτερη των 30ο C επέρχεται η στείρωση ή και ο θάνατος των εντόμων. Για την εκτροφή της D.
melanogaster υπάρχουν διάφορα είδη τροφής. Στο εργαστήριο μας χρησιμοποιούμε τροφή με την

10
ακόλουθη σύσταση: 450ml νερό, 4gr agar-agar, 13gr μαγιά, 32gr ριζάλευρο, 16gr ζάχαρη, 25gr
τοματοπολτό, 2 ml αιθανόλη, 2ml προπιονικό οξύ.

Επέκταση καλλιεργειών

Κάθε 10-15 ημέρες παρασκευάζεται τροφή και μοιράζεται σε πλαστικά φιαλίδια. Αφού κρυώσει
προσθέτουμε λίγες σταγόνες μαγιάς και μεταφέρουμε τα έντομα από τα ήδη υπάρχοντα αποθέματα των
παλαιότερων καλλιεργειών στα φιαλίδια με την φρέσκια τροφή. Με τον τρόπο αυτό οι καλλιέργειες
όλων των στελεχών διατηρούνται για πολλές δεκαετίες. Η μεταφορά των εντόμων γίνεται χωρίς
νάρκωση με μία τεχνική που απαιτεί γρήγορες και συγχρονισμένες κινήσεις χεριών, με την οποία οι
φοιτητές εξοικειώνονται κατά την διάρκεια των εργαστηριακών ασκήσεων. Στο εργαστήριο μας εκτός
από την D. melanogaster φυσικού τύπου διατηρείται ικανοποιητικός αριθμός στελεχών που φέρουν μία
ή δύο μεταλλαγές.

Παράσιτα καλλιεργειών

Οι καλλιέργειες της D. melanogaster προσβάλλονται κυρίως από μύκητες και ακάρεα. Οι μύκητες
αναπτύσσονται στην τροφή με γρήγορο ρυθμό και καταπνίγουν τα νεαρά στάδια του ατόμου
(γονιμοποιημένα αυγά, προνύμφες). Για την αποφυγή επιμολύνσεων γίνεται αποστείρωση των
φιαλιδίων εκτροφής και των πωμάτων και προσθήκη στην τροφή ειδικού μυκοστατικού, κυρίως
προπιονικού οξέος.
Τα ακάρεα παρασιτούν κυρίως στα τέλεια έντομα. Διακρίνονται από το σφαιρικό σχήμα και το
υπόλευκο χρώμα τους. Η καταπολέμηση τους γίνεται με συνεχείς επεκτάσεις των καλλιεργειών και με
ψεκασμούς διαφόρων χημικών ουσιών, όπως διαλύματος βενζοϊκού βενζυλεστέρα.

Συλλογή παρθένων θηλυκών ατόμων

Επειδή όπως προαναφέρθηκε απαιτούνται μερικές ώρες μετά την εκκόλαψη για να ωριμάσουν τα άτομα
σεξουαλικά, τα θηλυκά που μόλις έχουν εκκολαφθεί και δεν έχουν ακόμη αποκτήσει το κανονικό τους
χρώμα είναι σίγουρα παρθένα (Εικ. 8).

11
Εικόνα 8. Επάνω: ώριμα θηλυκά άτομα. Κάτω: παρθένα θηλυκά άτομα αρκετά μεγαλύτερα σε μέγεθος και
πιο ανοιχτόχρωμα από τα ώριμα. Στα τελευταία λίγες ώρες μετά την εκκόλαψη παραμένει ορατή μια
πρασινωπή κηλίδα στην κάτω πλευρά της κοιλιάς (file:///G:/Drosophila/An introduction to fruit flies).

Τέτοια άτομα μπορεί να επιλεγούν από μια καλλιέργεια που δίνει συνεχώς απογόνους. Αν π.χ.
απομακρύνουμε όλα τα τέλεια έντομα από μια τέτοια καλλιέργεια και μετά από τρείς ώρες μαζέψουμε
τα άτομα που στο μεταξύ έχουν εκκολαφθεί, τα άτομα αυτά θηλυκά και αρσενικά θα είναι παρθένα.

Νάρκωση των ατόμων

Για τον χειρισμό των εντόμων η νάρκωση είναι απαραίτητη και γίνεται με αιθέρα πάντα σε άδειο
φιαλίδιο (ποτέ σε φιαλίδιο που περιέχει τροφή). Τοποθετούμε στο πώμα μερικές σταγόνες αιθέρα και
κλείνουμε μέχρι να ακινητοποιηθεί και το τελευταίο άτομο. Στη συνέχεια το πώμα απομακρύνεται και
το φιαλίδιο αφήνεται ανοικτό. Αν το πώμα ξεχαστεί, η παρατεταμένη νάρκωση οδηγεί στο θάνατο των
ατόμων, γι’ αυτό χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή. Αν τα άτομα πεθάνουν από την νάρκωση τότε
σηκώνουν τα φτερά τους κάθετα προς το σώμα τους. Είναι αυτονόητο ότι αυτά τα άτομα δεν
χρησιμοποιούνται για τις διασταυρώσεις. Αναισθητοποίηση μπορεί επίσης να επιτευχθεί με παροχή
διοξειδίου του άνθρακα ή ισχυρή ψύξη διάρκειας 8-12’.

Πειραματικές διασταυρώσεις

Από τα βασικά χαρακτηριστικά ενός οργανισμού που αποτελεί πειραματικό μοντέλο γενετικής είναι η
ικανότητα δημιουργίας στελεχών που φέρουν σταθερές μεταλλαγές και στη συνέχεια η ικανότητα
διασταύρωσης αυτών των στελεχών με άλλα στελέχη για τη δημιουργία επιθυμητών γονότυπων και
φαινοτύπων. Οι διασταυρώσεις στελεχών που φέρουν ορατές μεταλλαγές (μεταλλαγές δείκτες)
επιτρέπουν τη δημιουργία απογόνων που κληρονομούν είτε το ένα ή το άλλο αλληλόμορφο των υπό
μελέτη γονιδίων σε ομόζυγη ή ετερόζυγη κατάσταση. Κλασικά παραδείγματα τέτοιων μεταλλαγών είναι
το κίτρινο χρώμα σώματος (y), το λευκό χρώμα ματιών (w), οι κοντές-στριφτές σμήριγγες (f) στο Χ
χρωμόσωμα και τα ατροφικά φτερά (vg) στο δεύτερο χρωμόσωμα (Hales et al. 2015). Στη D.
melanogaster, προγραμματισμένες διασταυρώσεις μπορούν εύκολα να σχεδιαστούν και να

12
πραγματοποιηθούν με την απομόνωση μη ζευγαρωμένων (παρθένων) θηλυκών, ηλικίας λίγων ωρών (>
4h, δεδομένου ότι μετά το πέρας αυτών των ωρών τα θηλυκά μπορεί να ζευγαρώσουν με αρσενικά
άτομα της ίδιας γενιάς και να αποθηκεύσουν σπέρμα για μελλοντική χρήση) τα οποία στη συνέχεια
αναμιγνύονται με αρσενικά καθορισμένων γονότυπων. Μια τυπική ημέρα ενός ερευνητή της
Drosophila αρχίζει με τη συλλογή παρθένων θηλυκών νωρίς το πρωί, εργασία που συχνά
ολοκληρώνεται αργά το απόγευμα.
Στις διασταυρώσεις που γίνονται στο πλαίσιο των εργαστηριακών ασκήσεων τοποθετούμε συνήθως 3-4
παρθένα θηλυκά άτομα και περίπου 5 αρσενικά σε κάθε φιαλίδιο καλλιέργειας που περιέχει φρέσκια
τροφή. Η παρουσία περισσότερων του ενός ατόμων από κάθε φύλο απαιτείται για να αποφευχθεί η
περίπτωση αποτυχίας της διασταύρωσης λόγω τυχαίας στειρότητας του ενός ατόμου ή ανικανότητας
σύζευξης. Η πορεία της άσκησης για κάθε ομάδα εργασίας έχει ως εξής:

1η εβδομάδα
1. Παρατήρηση φαινοτύπου του άγριου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών με τα οποία θα
διεξαχθούν οι διασταυρώσεις
2. Εκτέλεση των διασταυρώσεων της πατρικής γενιάς (P1)
Α) ♀ Α x Β ♂
Β) ♀ Β x Α ♂
Θηλυκά παρθένα άτομα στελέχους Α διασταυρώνονται με αρσενικά άτομα στελέχους Β και το
αντίστροφο, δηλ. θηλυκά παρθένα άτομα του στελέχους Β διασταυρώνονται με αρσενικά άτομα του
στελέχους Α. Κάθε ομάδα γνωρίζει πόσες και ποιές μεταλλαγές φέρει το ένα ή και τα δύο στελέχη με
τα οποία διεξάγει το πείραμά της και κρατά σημειώσεις σχετικά με αυτές.

2η εβδομάδα
Οι γονείς απομακρύνονται μετά από μια εβδομάδα από τα φιαλίδια καλλιέργειας. Το διάστημα αυτό
είναι αρκετό για να γεννήσουν μεγάλο αριθμό γονιμοποιημένων αυγών τα οποία θα αναπτυχθούν σε
απογόνους σε περίπου 9-10 ημέρες.

3η εβδομάδα
1. Παρατήρηση των απογόνων της πρώτης θυγατρικής γενιάς (F1), όσον αφορά τον φαινότυπο τους
(χωριστά θηλυκά από αρσενικά) και για τους δύο τύπους διασταυρώσεων της πατρικής γενιάς
2. Διασταυρώσεις F1 X F1 (για δημιουργία F2 γενιάς) και για τους δύο αρχικούς τύπους των
διασταυρώσεων.

4η εβδομάδα
Απομάκρυνση γονέων από τα φιαλίδια των διασταυρώσεων F1 X F1.

5η εβδομάδα
1. Παρατήρηση των φαινοτύπων των απογόνων της δεύτερης θυγατρικής γενιάς (F2).
2. Καταγραφή των αποτελεσμάτων χωριστά για θηλυκά και αρσενικά για τουλάχιστον 100 άτομα από
κάθε αρχική διασταύρωση.
3. Αξιολόγηση του πειράματος. Πρέπει να απαντηθούν οι ακόλουθες ερωτήσεις: α) Πόσα γονίδια
διαχωρίζονται και ποιά η συμπεριφορά τους έναντι των γονιδίων φυσικού τύπου β) Αν είναι
αυτοσωμικά ή φυλοσύνδετα γ) Αν είναι ανεξάρτητα ή συνδεδεμένα.

13
Πρωτόκολλο εργασίας
Στο πρωτόκολλο εργασίας πρέπει να αναφέρονται:
• Η ημερομηνία διασταυρώσεων της πρώτης πατρικής διασταύρωσης (P1), ο αριθμός διασταυρώσεων
και ο αριθμός των ατόμων (P1) σε κάθε φιαλίδιο.
• Η ημερομηνία εκκολάψεως των πρώτων απογόνων της πρώτης διασταύρωσης (F1 γενιά).
• Τα αποτελέσματα της πρώτης θυγατρικής γενιάς (F1) χωριστά για τα δύο φύλα και για την κάθε
διασταύρωση.
• Η ημερομηνία διασταυρώσεων F1 x F1 και ο αριθμός διασταυρώσεων.
• Τα αποτελέσματα της F2 (δεύτερης θυγατρικής γενιάς). Φαινότυποι και αναλογίες των απογόνων
χωριστά για τα δύο φύλα.
• Λύση της άσκησης με τη βοήθεια των πειραματικών δεδομένων σύμφωνα με τον τρόπο που
συζητήθηκε στην τάξη.
• Ανάλυση των αποτελεσμάτων με τη μέθοδο x2 ή αν υπάρχει σύνδεση να υπολογισθεί η απόσταση
μεταξύ των γονιδίων

Βιβλιογραφία
Allchin, D. (1997). Thomas Hunt Morgan & the white-eyed mutant. In: Hagen, J. B., Allchin, D. &
Singer, F. (Eds.), “Doing Biology. Pp 48-59. Benjamin Cummings.
Ashburner, M. & Thompson, J.N. (1980). The laboratory culture of Drosophila. In The Genetics and
Biology of Drosophila Vol 2a edidet by M. Ashburner and T. R. F. Wright. Academic Press. London,
New York.
Brookes, M. (2002). Fly: The Unsung Hero of 20th-Century Science. Ecco/Phoenix.
Dobzhasky, Th. & Paulousky, O. (1967). Repeated mating and sperm mixing in Drosophila
pseeudoobscura. Amer. Nat. 101: 527-533.
Fisher, R. A.; De Beer, G. R. (1947). «Thomas Hunt Morgan. 1866-1945». Obituary Notices of Fellows
of the Royal Society 5 (15): 451–466.
Hales, G.K., Korey, C.A., Larracuente, A.M. & Roberts, D.M. 2015. Genetics on the Fly: A Primer on
the Drosophila Model System. Genetics 201 (3): 815-842.
Hildreth, P.E. & Lucchese, J.C. (1963). Fertilization in Drosophila. Evidence for the regular occurrence
of monospermy. Dev. Biol. 6: 263-278.
King, R.C. (1970). Ovarian Development in Drosophila melanogaster. Academic Press, New York.
Krelland, I. (1962). Sexual activity of Drosophila melanogaster males. Heretidy 48: 442-476.
Levitan, D. (2015). Paul Knocks flies and NIH funding. Blog post in “FactCheck.org”
www.factchck.org/2015/02/paul-knocks-flies-and-nih-funding
Lindsley, D.L. and Grell, E.H. (1968). Genetic variations of D. melanogaster. Carnegie Inst. Wash.
Publ. No: 627.
Mohr, S. E. (2018). First in fly. Drosophila research and biological discovery. Harvard Univ. Press,
Cambridge, London.
Prokop, A. (2016). Fruit flies in biological research. Biological Sciences Review 28, 10-14
Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. (2001). A systematic analysis of human
disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res 11, 1114-25.

14
 2η ΆΣΚΗΣΗ ΜΕ ΤΟ ΦΥΤΟ Zea mays (αραβόσιτος)
ΜΕΝΤΕΛΙΚΗ ΚΛΗΡΟΝΟΜΙΚΟΤΗΤΑ - ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ
Κ. Λάμνησου

Zea mays:
Το φυτό Zea mays (αραβόσιτος) είναι ετήσιο, ψηλό φυτό με χοντρό και συμπαγή βλαστό. Είναι μόνοικο
φυτό και έχει στην κορυφή του την αρσενική ταξιανθία και πλευρικά στο βλαστό τη θηλυκή ταξιανθία.
Οι δύο τύποι γαμετοφύτων αντιπροσωπεύονται από μικρά μικροσπόρια για τα αρσενικά και μεγάλα
μεγασπόρια για τα θηλυκά. Η θηλυκή ταξιανθία αποτελείται από ένα πλατύ στάχυ με παχύ άξονα, πάνω
στον οποίο βρίσκονται τα άνθη σε σειρές. Στη συνέχεια, μετά τη γονιμοποίηση, τη θέση των ανθέων
παίρνουν οι σπόροι που καλύπτονται από φύλλα.
Το φυτό Zea mays είναι διπλοειδικός οργανισμός και έχει 20 χρωμοσώματα (n = 10). Χρησιμοποιείται
για γενετικές μελέτες καθώς παρουσιάζει ποικιλομορφία σε μορφολογικά χαρακτηριστικά των σπόρων
που ελέγχονται γενετικά (με ένα ή περισσότερα γονίδια).

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Θα μελετηθούν γενετικοί χαρακτήρες του φυτού που αφορούν τα πιο κάτω χαρακτηριστικά των
σπόρων:
• Το χρώμα του εξωτερικού περιβλήματος
• Το χρώμα ενδοσπερμίου
• Το σχήμα ενδοσπερμίου

Όλες οι ρόκες καλαμποκιού που θα μελετηθούν είναι F2 γενιά και προέρχονται από διασταυρώσεις
μεταξύ καθαρόαιμών ατόμων (P1) και στη συνέχεια διασταυρώσεις F1 X F1 ή διασταυρώσεις ελέγχου.
Στην άσκηση αυτή θα μελετηθούν γονίδια που αφορούν χαρακτηριστικά του εξωτερικού περιβλήματος
του σπόρου ή του εσωτερικού ενδοσπερμίου.

Γονίδια περιβλήματος
R: χρώμα r: όχι χρώμα
Pr: βυσσινί χρώμα pr: κόκκινο
I: όχι χρώμα i: χρώμα
C: χρώμα c: όχι χρώμα

Γονίδια ενδοσπερμίου
Y: κίτρινο χρώμα y: λευκό χρώμα
Su: λείο su: ρυτιδωμένο
Sh: λείο sh: αφυδατωμένο

15
Προϋπόθεση να δούμε το χρώμα του ενδοσπερμίου είναι το εξωτερικό περίβλημα το σπόρου να είναι
άχρωμο. Όταν αυτό είναι χρωματισμένο (βυσσινί ή κόκκινο) είναι αδύνατον να φανεί το χρώμα του
ενδοσπερμίου (κίτρινο ή λευκό).

Πορεία εργασίας
Σε κάθε ομάδα φοιτητών θα δοθούν πέντε ρόκες καλαμποκιού.
Μετρήστε τουλάχιστον 200 συνεχόμενους σπόρους και καταγράψτε τους φαινοτύπους τους.
Βρείτε την πιθανή αναλογία.
Βρείτε ποια γονίδια διαχωρίζονται.
Γράψτε τους γονότυπους της P1, F1, F2 (για κάθε ρόκα).

Παράδειγμα 1
Σε μια ρόκα F2 γενιάς μετρήθηκαν οι παρακάτω σπόροι:
153 [βυσσινί, λείοι σπόροι]
49 [λευκοί, λείοι σπόροι]
Ποιοι είναι οι γονότυποι P1, F1, F2;

Απάντηση:
Συνολικά οι σπόροι (απόγονοι διασταύρωσης) που μετρήθηκαν είναι: 202 και η πιθανή αναλογία είναι
3:1. Διαιρούμε 202:4 = 50,5, για να βρούμε την τιμή της μονάδας και στη συνέχεια πολλαπλασιάζουμε
3 Χ 50,5 = 151,5
1 Χ 50,5 = 50,5
Αυτές είναι οι αναμενόμενες τιμές για αναλογία 3:1. Με στατιστική επεξεργασία (έλεγχος Χ 2) μπορεί οι
τιμές που παρατηρήθηκαν να δειχθεί εάν εμπίπτουν στη συγκεκριμένη αναλογία ή όχι.
Θεωρούμε ότι εμπίπτουν και προσπαθούμε να λύσουμε την άσκηση.
Αφού εξετάζουμε επτά ζευγάρια γονιδίων γράφουμε για κάθε φαινότυπο σπόρων 14 παύλες. Επειδή
στην F2 γενιά έχουμε αναλογία 3:1, συμπεραίνουμε ότι έχουμε μονοϋβριδισμό. Επομένως, ένα από τα 7
ζευγάρια γονιδίων που μελετάμε διαχωρίζεται στη διασταύρωση αυτή.
Ποιο θα μπορούσε να είναι αυτό; Σίγουρα κάποιο που σχετίζεται με την παρουσία χρώματος στο
εξωτερικό περίβλημα και το οποίο στην υπολειπόμενη μορφή του δεν επιτρέπει νε εκφραστεί το χρώμα.
Αυτό θα μπορούσε να είναι είτε το R είτε το C (όμοια συμπεριφορά).
Έστω ότι διαχωρίζεται το R (R,r)
Επομένως η P διασταύρωση ήταν:
P1: RR X rr
F1: Rr
F1 X F1: Rr X Rr
F2: R- PrPriiCCyySuSuShSh [βυσσινί, λείοι σπόροι]
rr PrPriiCCyySuSuShSh [λευκοί, λείοι σπόροι]

Παράδειγμα 2
Σε μια ρόκα καλαμποκιού F2 γενιάς μετρήθηκαν οι παρακάτω σπόροι:
103 [κόκκινοι, ρυτιδωμένοι σπόροι]
99 [κίτρινοι, ρυτιδωμένοι σπόροι]
Ποιοι είναι οι γονότυποι P1, F1, F2;

16
Απάντηση:
Η αναλογία είναι 1:1. Επομένως έχουμε διασταύρωση ελέγχου. Εδώ θα μπορούσε να διαχωρίζεται
οποιοδήποτε από τα τρία γονίδια που σχετίζονται με την παρουσία χρώματος ή μη στο εξωτερικό
περίβλημα του σπόρου, δηλαδή R ή C ή I.
Έστω ότι διαχωρίζεται το I (I,i)
Επομένως η P διασταύρωση ήταν:
P1: II X ii
F1: Ii
F1 X P: Ii X ii
F2: RRIiCCprprYYsusuShSh [κίτρινοι, ρυτιδωμένοι σπόροι]
RRiiCCprprYYsusuShSh [κόκκινοι, ρυτιδωμένοι σπόροι]

17
 5η & 6η ΑΣΚΗΣΗ ΜΕ ΜΥΚΗΤΕΣ
ΜΕΤΑΛΛΑΞΟΓΕΝΕΣΗ – ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ

Ο σύντομος κύκλος ζωής των μυκήτων καθώς και το γεγονός ότι μεγαλώνουν, αναπτύσσονται και
αναπαράγονται με μεγάλη ευκολία τους κάνει ιδανικούς για γενετικές μελέτες. Με παλιές και νέες
έρευνες που έχουν γίνει με μύκητες, έχει δειχτεί ότι προσφέρουν στους γενετιστές πρωτότυπα γενετικά
συστήματα καθώς και την ευκαιρία να μελετήσουν εντελώς εξειδικευμένα προβλήματα με τέτοια
ευκολία και σαφήνεια που κανείς άλλος οργανισμός δεν τους προσφέρει. Έτσι, αποτελούν το πιο
κατάλληλο υλικό για να μελετηθούν η απλή Μεντελική κληρονομικότητα, οι επιχιασμοί, ανάλυση
τετράδων, σύνδεση γονιδίων και μελέτη της λεπτής τους δομής, βιοσυνθετικά συστήματα και
λειτουργία γονιδίων, διαφοροποίηση, παραφυλετικότητα, βιομετρική και γενετική πληθυσμών, κ.α.
Για την καλύτερη κατανόηση των γενετικών πειραμάτων που θα γίνουν κατά τη διάρκεια των
ασκήσεων είναι απαραίτητη μια αναφορά στα κύρια δομικά και βιολογικά χαρακτηριστικά των
μυκήτων (για λεπτομέρειες βλ. Γεν. Μικροβιολογία).

Διατροφή

Όλοι οι μύκητες έχουν μια βασική κοινή ιδιότητα, είναι ανίκανη να χρησιμοποιήσουν το CO2 σαν πηγή
άνθρακα και επομένως είναι ετεροτροφικοί (σαπροφυτικοί ή παρασιτικοί) για τις ενώσεις του άνθρακα.
Για λόγους ευκολίας στα διάφορα πειράματα γενετικής χρησιμοποιούνται μύκητες που μπορούν να
περάσουν όλο τον κύκλο της ζωής τους σαπροφυτικά, δηλαδή πάνω σε ζωντανά υλικά. Για τους
περισσότερους μύκητες, οι διαιτητικέ τους απαιτήσεις μπορούν να ικανοποιηθούν με παροχή απλών
σακχάρων όπως η γλυκόζη ή σακχαρόζη, μεταλλικών ιόντων (κυρίως Fe3+, Ca2+, K+, Na+) κάποιας
πηγής αζώτου (κατά κύριο λόγω νιτρικά ανόργανα άλατα, αμμωνία και νιτρώδη άλατα), κάποιας πηγής
θείου (κυρίως θειικά άλατα) και νερού. Απ’ αυτές τις ουσίες, μύκητες όπως αυτοί που χρησιμοποιούνται
στα Εργαστήρια μπορούν να παίρνουν τα απαιτούμενα θρεπτικά συστατικά για την επιβίωση και την
ολοκλήρωση του κύκλου ζωής τους. Το πιο απλό χημικά καθορισμένο θρεπτικό υλικό, πάνω στο οποίο
μπορεί να μεγαλώνει ο φυσικός τύπος κάποιου είδους μύκητα λέγεται ελάχιστο θρεπτικό υλικό
(Minimal Medium) και συμβολίζεται MM. Είναι ευνόητο ότι το ΜΜ μπορεί να διαφέρει από μύκητα σε
μύκητα. Για παράδειγμα, μερικοί μύκητες που χρησιμοποιούνται σε μεγάλη έκταση για γενετικά
πειράματα, π.χ. Neurospora crasa, Coprinus lagopus είναι επιπλέον ετεροτροφικοί για βιταμίνες όπως η
θειαμίνη, βιοτίνη ή πυριδοξίνη. Σε ελάχιστες περιπτώσεις μερικοί μύκητες έχουν απαίτηση κάποιου
συγκεκριμένου αμινοξέος για να μπορέσουν να ολοκληρώσουν όλα τα στάδια της ζωής τους. Οι
θερμοκρασίες που χρησιμοποιούνται εργαστηριακά είναι μεταξύ 20 – 37ο C. Για κάθε είδους μύκητα
και ανάλογα με το στάδιο του κύκλου ζωής του που θέλουμε να ευνοήσουμε υπάρχει και μια άριστη
θερμοκρασία.

Δομή

Η βασική δομική μονάδα οργάνωσης όλων των μυκήτων είναι η υφή. Τα τοιχώματα των υφών
μεγαλώνουν κατά μήκος μόνο στο ακραίο τμήμα της υφής (hyphal tip). Οι μύκητες είναι κοινοκυτικοί
οργανισμοί και οι υφές είναι γεμάτες με κυτταρόπλασμα που περιέχει πυρήνες, μιτοχόνδρια, σταγόνες
λιπιδίων και κρυσταλλικά εγκλείσματα. Για τους περισσότερους μύκητες το κυτταρόπλασμα των υφών
είναι χωρισμένο σε διαστήματα από κάθετες προς τα τοιχώματα μεμβράνες, τα septae. Τα septae φέρουν

18
περίπου στο μέσο τους πόρους μέσα από τους οποίους το κυτταρόπλασμα μετακινείται ελεύθερα και οι
πυρήνες μπορούν να μεταναστεύουν. Οι πυρήνες είναι μικροσκοπικοί και παρουσιάζουν πολλά
προβλήματα σε ότι αφορά τις τεχνικές χρώσης και επεξεργασίας των χρωμοσωμάτων τους. Είναι κατ’
εξοχή απλοειδικοί και μόνο σε σπάνιες περιπτώσεις είναι διπλοειδικοί για μια μεγάλη φάση του κύκλου
ζωής τους. Παρόλες τις επί μέρους διαφορές που παρουσιάζουν, τόσο η μίτωση όσο και η μείωση
(τουλάχιστον στις βασικές γραμμές) των μυκήτων ακολουθούν τα γνωστά πλαίσια. Ανάλογα με τον
αριθμό των πυρήνων που περιέχουν στα κύτταρα των υφών οι μύκητες χαρακτηρίζονται σαν
μονοκαρυωτικοί, δικαρυωτικοί κ.λ.π. Οι υφές είναι δυνατό να διακλαδίζονται αμέσως πίσω από την
κορυφή τους και σε κανονικά διαστήματα που είναι χαρακτηριστικά για το κάθε είδος μύκητα.
Δευτερογενείς και τριτογενείς διακλαδώσεις συμβαίνουν τακτικά και σύντομα δημιουργείται ένα
πλέγμα από υφές. Όταν ένας μύκητας μεγαλώνει σε ένα επίπεδο (π.χ. ανάμεσα σε φύλλα σελοφάνης
πάνω σε άγαρ), ένα μικρό κομμάτι υφής μπορεί σύντομα να διακλαδιστεί συμμετρικά και να φτιάξει ένα
μυκήλιο.

Κύκλοι ζωής

Στη διάρκεια των ασκήσεων στο εργαστήριο θα χρησιμοποιηθούν οι μύκητες Aspergillus nidulans,
Sordaria brevicolis, Neurospora crassa και Saccharomyces cerevisiae. Απ' αυτούς, μόνον o A. Nidulans
παρουσιάζει τόσο φυλετικό (sexual) όσο και παραφυλετικό (parasexual) κύκλο. Τα αφυλετικά σπόρια
αυτού του είδους, τα κονίδια, είναι μονοπυρηνικά απλοειδικά, ο δε πυρήνας του σπορίου είναι το
προϊόν μόνο μιτωτικών διαιρέσεων. Επομένως κάθε σπόριο έχει γονότυπο πανομοιότυπο με εκείνον του
πατρικού. Σε σπάνιες περιπτώσεις δημιουργούνται και διαφορετικές μορφές είτε από μεταλλαγές (τόσο
χρωμοσωμικές όσο και εξωχρωμικές) ή από αλλαγές πλοϊδισμού ( δηλ. του αριθμού πλήρους σειράς
χρωμοσωμάτων του οργανισμού).
Το μυκήλιο δεν έχει χρώμα και αποτελείται από πολυπυρηνικά κύτταρα που σε διάφορα σημεία
διαφοροποιούνται και δίνουν γένεση στους κονιδιοφορείς. Ο κάθε κονιδιοφορέας ξεκινάει από ένα
μυκηλιακό κύτταρο που βρίσκεται στη βάση του και καταλήγει σε μια πολυπυρηνική διόγκωση (σχήμα
2). Από την επιφάνεια αυτής της διόγκωσης βγαίνουν τα πρωτογενή μομοπυρηνικά στηρίγματα που το
καθένα τους δίνει γένεση σε δύο ή περισσότερα δευτερογενή στηρίγματα. Κάθε δευτερογενές στήριγμα
παραμένει μονοπυρηνικό αλλά βλασταίνει συνέχεια για να δημιουργείται μια αλυσίδα από κονίδια
ύστερα από επανειλημμένες διαιρέσεις του πυρήνα του. Τα νεώτερα κονίδια βρίσκονται πάντα στη
βάση της αλυσίδας και στο φυσικό τύπο έχουν όλα σκούρο πράσινο χρώμα.
Σύντηξη μεταξύ υφών του ίδιου ή διαφορετικού μυκηλίου είναι ένα φαινόμενο που συμβαίνει συχνά και
έχει σαν αποτέλεσμα την ανάμειξη κυτταροπλάσματος ανάμεσα στα κύτταρα που έγινε η σύντηξη και
συνήθως τη μετανάστευση πυρήνων από το ένα κύτταρο στο άλλο. Οι κυτταροπλασματικές γέφυρες
που δημιουργούνται στα σημεία σύντηξης, άλλοτε αποκόπτονται αμέσως μετά την ανταλλαγή
κυτταροπλάσματος και πυρήνων και άλλοτε παραμένουν για μεγάλα χρονικά διαστήματα.
Σχήμα 2 .

19
'Οταν η σύντηξη γίνει ανάμεσα σε υφές με γενετικά ίδιους πυρήνες, τα κύτταρα που προκύπτουν
λέγονται ομοκάρυα. Αντίθετα, όταν οι πυρήνες είναι γενετικά διαφορετικοί, τότε τα κύτταρα λέγονται
ετεροκύτταρα. Το ετεροκαρυωτικό στάδιο είναι πολύ ασταθές και μεταβατικό για τον A. nidulans, σε
αντίθεση με τους βασιοδιομύκητες που εμφανίζουν πολύ σταθερές μορφές ετεροκαρύων που περιέχουν
δύο διαφορετικούς πυρήνες (τα δικάρυα). Πολλές φορές το σχηματισμό ετεροκαρύων ακολουθεί η
σύντηξη των δύο διαφορετικών γενετικά πυρήνων, που έχει σαν αποτέλεσμα τη δημιουργία ετερόζυγου
διπλοειδικού πυρήνα. Ο πυρήνας αυτός είναι ασταθής και διασπάται σε 2n+1 και 2n -1 πυρήνες (όπου n
ο αριθμός χρωμοσωμάτων του μύκητα) δίνοντας γένεση σε ανευπλοειδικά σπόρια. Η μορφολογία των
αποικιών που προκύπτουν από τέτοια σπόρια αλλάζει συνέχεια μέχρις ότου σταθεροποιηθεί κάπου.
Στην πορεία των διαδοχικών μορφολογικών αλλαγών δημιουργούνται περιοχές σχήματος V (sectors) με
διαφορετικά μορφολογία και γενετική σύσταση. Οι αλλαγές αυτές οφείλονται στο ότι οι 2n+1 πυρήνες
χάνουν το επί πλέον χρωμόσωμα και ξαναγίνονται ετερόζυγοι διπλοειδικοί, ενώ οι 2n-1 χάνουν μια
σειρά από χρωμοσώματα μέχρι να φτάσουν τον απλοειδικό αριθμό χρωμοσωμάτων n. Ο μηχανισμός
της λαθεμένης διαίρεσης του ετερόζυγου διπλοειδικού λέγεται μη-σποσχισμός (non-disjunction) και η
διαδικασία της διαδοχικής απώλειας χρωμοσωμάτων μέχρι της δημιουργίας απλοειδικών απογόνων
λέγεται απλοϊδισμός. Τις περισσότερες φορές, τα απλοειδικά σπόρια που προκύπτουν έχουν και
ταχύτερη ανάπτυξη από τα ετερόζυγα διπλοειδικά, με αποτέλεσμα να υπερκαλύπτουν σε ανάπτυξη
κάποια αποικία που έχει μίγμα διαφόρων σπορίων. Η όλη διεργασία, από το σχηματισμό ετεροκαρύων,
τη σύντηξη γενετικά διαφορετικών πυρήνων μέχρι το μη αποσχισμό και τον απλοειδισμό (εδώ δίνεται η
δυνατότητα δημιουργίας ανασυνδυασμένων τύπων από μιτωτικό ανασυνδυασμό), λέγεται
παραφυλετικός κύκλος (για καλύτερη κατανόηση βλ. κεφ. 11 του βιβλίου).
Τόσο τα σπόρια που προκύπτουν από τον παραφυλετικό όσο και από τον φυλετικό κύκλο είναι
απλοειδικά και μονοπύρηνα. Παρόλο που ο A. nidulans είναι ομοθαλλικός μύκητας, εύκολα μπορούν να

20
γίνουν διασταυρώσεις ανάμεσα σε στελέχη που έχουν διαφορετικούς γενετικούς χαρακτήρες.
Εργαστηριακά οι διασταυρώσεις αυτές γίνονται με δύο τρόπους:
α) σχηματισμός ετεροκαρύων ανάμεσα σε δύο αυξότροφα στελέχη με συμπληρωματικές απαιτήσεις
όπου ο πυρήνας του ενός δίνει τη λειτουργία που λείπει στο άλλο και αντίστροφα,
β) ανάμειξη ίσων ποσοτήτων κονιδίων, τουλάχιστον 5X106/ml, για κάθε στέλεχος και ανάλυση των
πλεγμάτων μυκηλίων που δημιουργούνται.
Το κανονικό μυκήλιο είναι απλοειδικό και πολυπυρηνικό. Ύστερα από σύντηξη δύο πυρήνων - αν είναι
γενετικά όμοιοι δημιουργούν αυτοκλειστοθήκια - σχηματίζεται το κλειστοθήκιο (ή περιθήκιο) που μέσα
του περιέχει πολλούς ασκούς. Κάθε ασκός περιέχει 8 ασκοσπόρια που είναι αποτέλεσμα δύο μειωτικών
και μίας μιτωτικής διαίρεσης του αρχικού απλοειδικού πυρήνα. Τα ασκοσπόρια, απλοειδικά και
μονοπύρηνα, δεν βρίσκονται σε γραμμική διάταξη μέσα στους ασκούς όπως συμβαίνει με τα
ασκοσπόρια του Neurospora ή Sordaria. Τα ώριμα κλειστοθήκια μπορεί να περιέχουν μέχρι 100.000
ασκούς το καθένα τους. Είναι ευνόητο ότι τη γενετική ανάλυση των πατρικών γενετικών χαρακτήρων
την ευνοούν οι σχηματισμοί υβριδιακών ασκών και όχι ασκών που περιέχουν μόνο τον ένα ή τον άλλο
γονικό τύπο. Έτσι στο εργαστήριο γίνεται πάντοτε προσπάθεια να υπάρχουν οι κατάλληλες συνθήκες
που ευνοούν το σχηματισμό υβριδιακών ασκών και στις αναλύσεις παραβλέπονται τα
αυτοκλειστοθήκια (βλ. άσκηση ανάλυσης τετράδων στη Sordaria). Τα χρωμοσώματα του A. nidulans
είναι πολύ μικρά και δεν αποτελούν εύκολο υλικό για μελέτη. Παρόλα αυτά έχει βρεθεί ότι ο
απλοειδικός αριμός των χρωμοσωμάτων είναι 8.
Στα ετεροθαλλικά είδη, όπως η Neurospora και η Sordaria, η ύπαρξη δύο διαφορετικού φυλετικού
τύπου μυκηλίων είναι απαραίτητο στοιχείο για την ολοκλήρωση του φυλετικού κύκλου και δεν υπάρχει
πρόβλημα αναγνώρισης μεταξύ των αυτογονιμοποιημένων οργάνων και των υβριδίων όπως στον
Aspergillus. Τα μυκήλια της Neurospora είναι πολυπυρηνικά, αλλά απλοειδικά, και δίνουν γένεση σε
απλοειδικά σπόρια που χωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος και τον αριθμό πυρήνων που περιέχουν σε
μικροκονίδια όσο και τα μακροκονίδια μπορούν να επιτελούν τις ίδιες λειτουργίες στη Neurospora. Σε
ορισμένα όμως άλλα είδη ασκομυκήτων π.χ. Podospora anserina, τα μακροκονίδια δρουν αποκλειστικά
σαν "αρσενικά" στοιχεία στη σύντηξη τους με το τριχογύνειο και τη γονιμοποίηση. Όπως φαίνεται και
στο διάγραμμα του κύκλου ζωής της Neurospora (σχήμα 3), τα μικροκονίδια συνήθως δρουν σαν
γαμέτες που συντήκονται με τη λεπτή υφή του τριχογύνειου που αναπτύσσεται από το πρωτοπεριθήκιο.
Το μικροκονίδιο και το τριχογύνειο πρέπει να είναι αντιθέτων συζευκτικών τύπων, Α και α, για να γίνει
η γονιμοποίηση. Η σύντηξη υφών με αναστόμωση είναι και σ’αυτό το μύκητα πολύ συνηθισμένη και
αποτελεί έναν ακόμη τρόπο "γονιμοποίησης". Η ασκογόνος υφή, ύστερα από μια σύντηξη δύο γενετικά
διαφορετικών πυρήνων, δίνει γένεση στον ασκό που αναπτύσσεται μέσα στο περιθήκιο και περιέχει 8
απλοειδικά διπυρπνικά ασκοσπόρια. Τα ασκοσπόρια της Neurospora όπως και του Aspergillus
σχηματίζονται ύστερα από δύο διαδοχικές μειώσεις που ακολουθούνται από μια τελική μίτωση. Έχουν
χρώμα ροζ και σ’ αυτά οφείλεται η ροζ εμφάνισης των αποικιών.
Τα μυκήλια της Neurospora που έχουν διαφορετικούς συζευκτικούς τύπους δεν εμφανίζουν καμιά
εμφανή φυλετική διαφορά μεταξύ τους. Είναι συνεπώς πανομοιότυπα μορφολογικά, με μόνη διαφορά
την ικανότητά τους να ζευγαρώνουν συμβατά (compatible matings, ταιριαστά) με μυκήλια άλλων
στελεχών. Πολλές φορές τόσο στον Aspergillus και Neurospora όσο και στους άλλους μύκητες
εμφανίζεται το φαινόμενο της συζευκτικής ασυμβατότητας (incompatibility), ιδιαίτερα στο σχηματισμό
ετεροκαρύων, με αποτέλεσμα η διασταύρωση μεταξύ στελεχών του ίδιου είδους αλλά διαφορετικών
γονοτύπων να είναι προβληματική ή ακόμα και αδύνατη. Στη Neurospora, η συζευκτική ασυμβατότητα
ελέγχεται τουλάχιστον από δύο ζευγάρια αλληλομόρφων γονιδίων (που έχουν και κυτταροπλασματικό

21
τύπο κληρονομικότητας), ενώ σε άλλους μύκητες από πολλά ζευγάρια αλληλομόρφων, π.χ.
Schizophyllum commune.
H Sordaria brevicolis είναι κι αυτή ασκομύκητας με κύκλο ζωής παρόμοιο με της Neurospora. Από
πειραματικής πλευράς είναι πιο εύχρηστη γιατί τα ασκοσπόρια της είναι αρκετά μεγάλα ώστε να
γίνονται εύκολα οι γενετικές παρατηρήσεις. Παρουσιάζει επίσης μεγάλο ενδιαφέρον ερευνητικά γιατί
υπάρχουν μια σειρά από μεταλλαγές που αφορούν τα στάδια της φυλετικής αναπαραγωγής και η
γενετική ανάλυση των μεταλλαγών αυτών βοηθάει στην κατανόηση των γενετικών μηχανισμών που
ελέγχουν τη φυλετική αναπαραγωγή.
Ο Saccharomyces cerevisiae (κοινώς μαγιά) είναι μονοκυτταρικός μύκητας που δεν εμφανίζει κανονικό
μυκήλιο. Επειδή τα απλοειδικά κύτταρα συνυπάρχουν με τα διπλοειδικά, καθαρές απλοειδικές αποικίες
μπορούν να δημιουργηθούν μόνο ύστερα από απομόνωση ανεξαρτήτων ασκοσπορίων που
αποκόπτονται από ώριμους ασκούς με τη βοήθεια μικροχειριστών. Τόσο τα απλοειδικά όσο και τα
διπλοειδικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται με εκβλάστηση.

Σχήμα 3.

Κάθε διαιρούμενο κύτταρο παρουσιάζει μια βλαστητική προεκβολή που αυξάνει σε μέγεθος μέχρις
ότου φτάσει το μισό του μεγέθους του πατρικού κυττάρου (ή ακόμα και τα 4/5), οπότε και αποκόπτεται
και δημιουργεί ένα θυγατρικό κύτταρο.
Στο Saccharomyces η σύζευξη γίνεται με ζευγάρωμα απλών κυττάρων που έχουν διαφορετικούς τύπους
ή με απομόνωση πρωτοτρόφων διπλοειδικών κυττάρων που έχουν προκόψει από ανάμιξη (και στη
συνέχεια άπλωμα πάνω σε ΜΜ) κυττάρων με διαφορετικούς τύπους και αυξοτροφικές απαιτήσεις

22
συμπληρωματικές μεταξύ τους. Συνήθως από τη σύντηξη δύο απλοειδικών κυττάρων εκβλαστάνουν
διπλοειδικά. Μερικές φορές πάντως, εκβλαστάνουν και απλοειδικά κύτταρα που δεν έχουν προκύψει
από ανασυνδυασμό των πατρικών τύπων. Φαίνεται δηλαδή πώς η σύντηξη απλοειδικών κυττάρων
συμβάλλει στη δημιουργία ενός μεταβατικού ετεροκαρύου (σχ. 4). Τα διπλοειδικά κύτταρα είναι
μεγαλύτερα από τα απλοειδικά, αλλά κατά τα άλλα μορφολογικά χαρακτηριστικά είναι πανομοιότυπα.
Τόσο η μείωση όσο και ο σχηματισμός ασκών γίνεται όταν τα διπλοειδικά κύτταρα τοποθετηθούν κάτω
από συνθήκες ασιτίας (π.χ. ένα θρεπτικό υλικό που περιέχει μόνο νερό, άγαρ και οξικό νάτριο).

Σχήμα 4.

Γενετικοί δείκτες (genetic markers)

Οι μεταλλαγές που δημιουργούν στελέχη με νέες ιδιότητες, όταν συγκρίνονται με το φυσικό τύπο, είναι
και οι γενετικοί δείκτες που χρησιμοποιούνται σε κάθε οργανισμό για τη μελέτη της γενετικής του και
τη χαρτογράφηση. Επομένως είναι απαραίτητο να υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός από τέτοιες
μεταλλαγές που μπορούν εύκολα να αναγνωριστούν ώστε να γίνεται ευκολότερη η μελέτη των
διαφόρων γενετικών προβλημάτων.
Οι μεταλλαγές μπορούν να διακριθούν σε γονιδιακές (δηλαδή σε μια περιοχή του χρωμοσώματος) και
χρωμοσωμικές, (ολόκληρο το χρωμόσωμα). Οι χρωμοσωμικές συνήθως έχουν θανατηφόρα
αποτελέσματα στους μικροοργανισμούς ενώ οι γονιδιακές, που έχουν και τη μεγαλύτερη σπουδαιότητα
χωρίζονται στις μορφολογικές, στις μεταλλαγές χρώματος, τις βιοχημικές, τις φυσιολογικές και τις
θνησιγόνες (βλ. αντίστοιχο κεφάλαιο βιβλίου).

23
α) Μορφολογικές μεταλλαγές: Σχετίζονται κατά κύριο λόγο είτε με τα βλαστητικά είτε με τα
αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των μυκήτων. Βέβαια, όλες αυτές oι μεταλλαγές έχουν και κάποια
βιοχημική βάση, η οποία όμως είναι πολύ σπάνια κατανοητή. Τις περισσότερες φορές αλλοιώνεται η
μορφολογία ολόκληρης της αποικίας και πολύ συχνά οι υφές δείχνουν ότι η ανά μονάδα μήκους
ανάπτυξη έχει υποστεί σημαντική επιβράδυνση. Πολλές φορές δημιουργείται πρόβλημα με την
ονοματολογία των μεταλλαγών αυτής της κατηγορίας επειδή οι διαφορές τους από το φυσικό τύπο είναι
τόσο λεπτομερειακές που είναι αδύνατο να γίνουν κατανοητές από την ονομασία τους με μια λέξη.
Επειδή τις περισσότερες φορές τα μυκήλια του φυσικού τύπου μεγαλώνουν γρηγορότερα από τους
μεταλλαγμένους δημιουργείται μια δυσκολία στην απομόνωση και χαρακτηρισμό των μεταλλαγών γιατί
υπερκαλύπτονται από το φυσικό τύπο. Ο πιο απλός και συνηθισμένος τρόπος για ν' αποφεύγεται αυτή η
απώλεια μεταλλαγμένων τύπων είναι η προσθήκη κάποιου καταστολέα της ανάπτυξης.(π.χ. sodium
deoxycholate) που δίνει τη δυνατότητα στο σχηματισμό ευδιάκριτων αποικιών, που είναι χωρισμένες η
μία από την άλλη. Οι μεταλλαγές που επιδρούν επάνω στα φυλετικά διαφοροποιημένα οργανίδια έχουν
το μειονέκτημα ότι διατηρούνται δύσκολα. Ο κύριος λόγος που χρησιμοποιούνται τέτοιες μεταλλαγές
είναι η γενετική ανάλυση της μορφογένεσης των μυκήτων με πιο αντιπροσωπευτικό παράδειγμα τις
μεταλλαγές της Sordaria macrospora.

β) Μεταλλαγές χρώματος: Κατά κύριο λόγο αφορούν το χρώμα των κονιδίων και σπανιότερα το
χρώμα των υφών ή διαφοροποιημένων δομών. Στους μύκητες με έντονη χρωστική π.χ. A. niger, οι
μεταλλαγές με διαφορετικό χρώμα σπορίων είναι επιστατικές. Η αξία των μεταλλαγών στο χρώμα
σπορίων εξαρτάται επίσης από το αν η έκφραση του χρώματος στα μονοπυρηνικά κονίδια είναι
αυτόνομη, δηλαδή όταν το χρώμα εξαρτάται από τον πυρήνα και μόνο, ή μη-αυτόνομη, δηλαδή όταν
εξαρτάται από το γονότυπο του μυκηλίου στο σύνολό του. Ιδιαίτερη γενετική σημασία έχουν οι
μεταλλαγές ασκοσπορίων με ασκούς όπου τα σπόρια έχουν γραμμική διάταξη (κυρίως Sordaria και
Neurospora) γιατί με την ανάλυσή τους μπορούν να βρεθούν οι επιχιασμοί και το στάδιο που
συμβαίνουν.

γ) Βιοχημικές μεταλλαγές: Μεταλλαγές που προκαλούν το σταμάτημα παραγωγής κάποιου

συστατικού στο κύτταρο με αποτέλεσμα την ανικανότητα του οργανισμού να φτιάξει αντίστοιχα τελικό
προϊόν στα μονοπάτια του μεταβολισμού. Οι πιο απλές μορφές βιοχημικών μεταλλανών είναι οι
αυξοτροφικές. Οι μύκητες που μπορούν να ζήσουν, να αναπτυχθούν και να αναπαραχθούν πάνω στο
ελάχιστο θρεπτικό υλικό ΜΜ, λέγονται πρωτοτροφικοί σε αντιπαράθεση με τους αυξοτροφικούς, που
είναι μεταλλαγμένες μορφές του φυσικού τύπου με απαίτηση για προσθήκη κάποιου επί πλέον
θρεπτικού υλικού ώστε να δείξουν κανονική ανάπτυξη. Η αυξοτροφία μπορεί να εκδηλωθεί για ένα ή
περισσότερα από τα 20 αμινοξέα, τις 5 νουκλεϊκές βάσεις και τις βιταμίνες. Παράλληλα όμως με τις
αυξοτροφικές μεταλλαγές έχουν βρεθεί και πολλές άλλες βιοχημικές μεταλλαγές, με πιο σημαντικές τις
μεταλλαγές ενζυματικής δράσης και μεταλλαγές στην ανθεκτικότητα. Υπάρχει και μία άλλη κατηγορία
βιοχημικών μεταλλαγών που έχουν μεγάλη οικονομική σπουδαιότητα επειδή παράγουν αυξημένες
ποσότητες κάποιου μεταβολίτου (π.χ. πενικιλλίνης, κιτρικού οξέος κ.λ.π.) αλλά δεν έχουν μελετηθεί
πολύ γενετικά. Τέλος, σαν μια εντελώς εξειδικευμένη κατηγορία βιοχημικών μεταλλαγών μπορεί να
θεωρηθεί η κατηγορία των μεταλλαγών καταστολής (suppressor mutants). Αναγνωρίζονται κυρίως σαν
μεταλλαγές επιστροφής μιας μεταλλαγής στο φαινότυπο φυσικού τύπου, ο ορισμός τους όμως
αναφέρεται κυρίως στα γονίδια που φανερώνουν την έκφραση κάποιου άλλου γονιδίου.

24
δ) Φυσιολογικές μεταλλαγές: Η διαφορά τους από τις βιοχημικές μεταλλαγές είναι ότι εδώ
προκαλείται κάποια αλλοίωση στις αντιδράσεις τους σε κάποια φυσιολογική κατάσταση χωρίς μια
ταυτόχρονη μορφολογική ή βιοχημική αλλαγή (που να είναι γνωστή). Σ’αυτή την κατηγορία ανήκουν
όλες οι μεταλλαγές που εμφανίζουν αλλαγές στις αντιδράσεις τους σε φυσιολογικούς παράγοντες όπως
το φως, η θερμοκρασία, η βαρύτητα, το pH κ.λ.π. Επίσης, υπάρχει και μία ομάδα μεταλλαγών που είναι
πολύ σπουδαίες από αγρονομική πλευρά, οι μεταλλαγές που αφορούν στην παθογενετικότητα και
μολυσματικότητα των μυκήτων στους οργανισμούς που παρασιτούν. Τέλος, εδώ ανήκουν και οι
μεταλλαγές που αλλάζουν το φυλετικό - τύπο (mating type).

ε) Θνησιγόνες μεταλλαγές: Αυτή η κατηγορία μεταλλαγών είναι η λιγότερο μελετημένη και ελάχιστα
γνωστή από γενετικής πλευράς. Ο κύριος λόγος είναι ότι οι θνησιγόνες μεταλλαγές χάνονται στους
απλοειδικούς οργανισμούς αμέσως μόλις εμφανιστούν. Επειδή είναι υπολειπόμενες, υπάρχει
δυνατότητα να διατηρούνται σε ετεροκάρυα με το φυσικό τύπο. Τα τελευταία χρόνια έχει γίνει μελέτη
σ’ ένα κατά συνθήκη θνησιγόνο γονίδιο στη μαγιά, που δημιουργεί αποικίες με κανονικό φαινότυπο
στους 23°C, αλλά που πεθαίνουν στους 36°C. Έχει αποδειχθεί ότι αυτού του είδους τα γονίδια έχουν
εμπόδια (block) σε σημαντικές διεργασίες όπως η σύνθεση DNA, RNA και κυτταρικών τοιχωμάτων.
Στις θνησιγόνες μεταλλαγές ανήκουν επίσης και οι μεταλλαγές που προέρχονται από χρωμοσωμικές
ελλείψεις και άλλες χρωμοσωμικές ανωμαλίες.

Οι μεταλλαξογόνοι παράγοντες που μπορούν να δημιουργήσουν όλους τους τύπους των παραπάνω
μεταλλαγών περιγράφονται στο αντίστοιχο κεφάλαιο του βιβλίου.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

1. Απαραίτητες προφυλάξεις για καλλιέργηση μυκήτων που έχουν ξερά σπόρια

Τα σπόρια των μυκήτων είναι συνήθως ξερά και μπορούν να διασκορπιστούν στην ατμόσφαιρα πολύ
εύκολα (αυτό είναι άλλωστε και ο κανονικός τρόπος διασποράς των σπορίων στους περισσότερους
μύκητες). Επομένως, είναι απαραίτητο ο καθένας να πάρει όλα τα μέτρα προφύλαξης για να ελαττωθεί
η μόλυνση από σπόρια στο εργαστήριο, αφού αυτή μπορεί να προκαλέσει αλλεργίες, μολύνσεις πέρα
από το ότι θα καταστρέψει τα πειράματα.

Τα παρακάτω μέτρα είναι εντελώς απαραίτητα για ασφαλή προφύλαξη:

1) Μην ανοίγετε τα τρυβλία χωρίς να υπάρχει λόγος.
2) Αν είναι απαραίτητο να ανοίξετε τα τρυβλία αυτό πρέπει να γίνεται αργά και χωρίς έντονες κινήσεις.
3) Όταν παίρνετε σπόρια με τη βελόνα - λούπα φροντίστε η βελόνα να είναι υγρή από πριν (δηλ.
θερμάνετε καλά τη βελόνα στη φλόγα του λύχνου για να αποστειρωθεί και μετά κρυώστε την είτε μέσα
στο τρυβλίο με το καθαρό θρεπτικό υλικό, είτε σε δοκιμαστικό σωλήνα με απεσταγμένο-
αποστειρωμένο νερό).
4) Αποφεύγετε να ανοίγετε τα τρυβλία ή να ρίχνετε κονιδιακό εναιώρημα στο θρεπτικό υλικό όταν
γίνονται ρεύματα αέρα. Το ρεύμα αέρα θα σκορπίσει τα σπόρια παντού και θα καταστρέψει τα
πειράματά σας και των συναδέλφων σας.
5) Όταν μπορείτε, εμβολιάστε τα τρυβλία με την ανοικτή επιφάνεια του θρεπτικού υλικού προς τα κάτω
για να αποφύγετε μολύνσεις από σπόρια που πέφτουν πάνω στην επιφάνεια (διάγραμμα).

25
6) Ένα απλό άγγιγμα της βελόνας - λούπας στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού είναι αρκετό για τον
εμβολιασμό. Αποφεύγετε τις «ζικ-ζακ» κινήσεις κατά μήκος του τρυβλίου.

7) Πριν αρχίσετε οποιοδήποτε πείραμα να είστε σίγουροι ότι δεν έχετε κανένα ερωτηματικό πάνω στις
μεθόδους. Αν υπάρχει αμφιβολία συμβουλευτείτε τους υπεύθυνους επόπτες για τις ασκήσεις. Ποτέ μην
αρχίσετε ένα πείραμα αν δεν είναι κάποιος υπεύθυνος επόπτης κοντά σας.

2. Μεταλλαγές από υπεριώδη ακτινοβολία στον Ασπέργιλλο

Φυσικές μεταλλαγές συμβαίνουν σ' όλους τους οργανισμούς αλλά είναι τεχνικά δύσκολο ν’
απομονωθούν στις περισσότερες περιπτώσεις. Υπάρχουν διάφοροι τρόποι που αυξάνουν αυτό το
φυσικό ποσοστό των μεταλλαγών. Ένας απ’αυτούς είναι η χρήση υπεριωδών ακτινοβολιών (Ultra-violet
irradiation) που απορροφούνται έντονα από το DNA. Τα θανατηφόρα αποτελέσματα της υπεριώδους
ακτινοβολίας φαίνεται ότι κατά ένα μέρος, οφείλονται στη δημιουργία διμερών της θυμίνης μέσα στο
DNA. Οι μεταλλαγές πιστεύεται ότι οφείλονται στην εκτομή (excision) και επισκευή (repair) των
διμερών όταν λανθασμένες βάσεις αποκαταστούνται (βλ. αντίστοιχο κεφάλαιο βιβλίου).
Αυτό το πείραμα, έχει σχεδιαστεί για να δείχνει την παραγωγή μεταλλαγμένων αποικιών του
Ασπέργιλλου, που οφείλονται σε υπεριώδη ακτινοβόληση των μονοπυρηνικών του σπορίων (ή κονίδια).
Θα είναι δυνατή η ανακάλυψη και η απομόνωση μεταλλαγών πάνω στο χρώμα των σπορίων καθώς και
μορφολογικών μεταλλαγών. Ακόμα σε μικρότερο ποσοστό θα είναι πιθανή η ανακάλυψη βιοχημικών
μεταλλαγών (biochemical mutations), δηλαδή μεταλλαγών που απαιτούν κάτι περισσότερο (αμινοξύ,
βιταμίνη ή πουρίνες-πυριμιδίνες) σε θρεπτικό υλικό από τον άγριο ή φυσικό τύπο (wild-type). Στη
μέθοδο χρησιμοποιείται πλήρες θρεπτικό υλικό (complete medium), που περιέχει 0,1 % SDC (sodium
deoxycholate), που μειώνει την ακτινωτή ανάπτυξη των αποικιών. Αυτό επιτρέπει την καταμέτρηση
περισσότερων αποικιών στο κάθε τρυβλίο.

Απαιτούμενα υλικά

Σαν CM χρησιμοποιείται το MM (Czapek-Dox Agar) + 2% από τα Yeast extract, Hydrolysed casein,

Prune extract, Malt extract. To MM περιέχει: NaNO3 2.0 g, KH2PO4 1.0 g, MgSO4 * 7 H2O 0 0.5 g, KC1
0.5 g, FeSO4 0.01 g, σουκρόζη 15.0 g, άγαρ 15.0 g, απεσταγμένο νερό 1,0 lt. Όλα τα τρυβλία περιέχουν
CM + 0.1% SDC. Μία λάμπα Hanovia U.V., που εκπέμπει 80% από την υπεριώδη ακτινοβολία σε
μήκος 2537 Å.
Κωνικές φιάλες, των 50 - 100 ml απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό + 0.2% γλυκόζη (για να μη
δημιουργείται υπέρτονο ή υπότονο περιβάλλον).

26
Δοκιμαστικοί σωλήνες απεσταγμένοι και αποστειρωμένοι.
Πιπέττες των 100 ml και του 1 ml απεσταγμένες και αποστειρωμένες.
Γυάλινοι ράβδοι σε σχήμα (spreaders).
Δοκιμαστικοί σωλήνες που θα περιέχουν τουλάχιστον 10 ml εναιώρημα κονιδίων Ασπέργιλλου σε
απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό + 0.2% γλυκόζης (περίπου 106 κονίδια / ml).

Μέθοδος

1. Τοποθετείστε τη λάμπα στο ύψος των 20 cm. Η λάμπα μένει αναμμένη για 30 λεπτά πριν από το
πείραμα. Μη κοιτάζετε κατευθείαν την UV λάμπα γιατί μπορεί να καταστρέψει τα μάτια σας.

2. Το εναιώρημα κονιδίων θέλει ζωηρή ανακίνηση πριν τη χρήση γιατί τα κονίδια έχουν την τάση να
καθιζάνουν. Χρησιμοποιείστε τον αναδευτήρα για 10-15 δευτερόλεπτα.

3. Ετοιμάστε εναιωρήματα 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 από το αρχικό εναιώρημα κονιδίων στους
παραπάνω 5 δοκιμαστικούς σωλήνες και εξαπλώστε 0.1 ml με τη γυάλινη ράβδο πάνω σε 4 τρυβλία
CM+SDC για κάθε συγκέντρωση από τα 10-3, 10-4, 10-5. Όσοι θα κάνουν τον έλεγχο σε χρόνο
ακτινοβόλησης 0 min, θα δώσουν τις απαραίτητες μετρήσεις για να βρεθούν πόσα κονίδια από τα
αναμενόμενα να βλαστήσουν καταφέρνουν και επιζούν.

4. Τοποθετείστε το υπόλοιπο από το αρχικό κονιδιακό εναιώρημα σε ένα αποστειρωμένο πλαστικό

τρυβλίο. Απομακρύνετε το καπάκι και τοποθετήστε το ανοικτό τρυβλίο κάτω από τη UV λάμπα και
πάνω στο αλουμινόχαρτο που υπάρχει.

5. Ακτινοβολείστε αυτό το διάλυμα για 1, 2, 4, 7, 10 και 16 λεπτά. Ανακατεύετε το εναιώρημα του

τρυβλίου κάθε μισό λεπτό με ζωηρή ανακίνηση του αλουμινόχαρτου.

6. Ανάλογα με την ομάδα που ανήκετε, αραιώστε το ακτινοβολημένο εναιώρημα όπως παρακάτω: Για 1
και 2 λεπτά ακτινοβόληση, 10-3, 10-4, 10-5. Για 4 και 7 λεπτά 10-2, 10-3, 10-4 και για 10 και 16 λεπτά 10-1,
10-2, 10-3. Εξαπλώστε 0,1 ml από τα αντίστοιχα διαλύματα, με τη γυάλινη ράβδο, πάνω σε 4 τρυβλία
CM+SDC για κάθε συγκέντρωση.

7. Τοποθετείστε τα τρυβλία στους 37° για 2-3 μέρες.

8. Αναλύσατε τα αποτελέσματά σας, σαν ομάδα, και στο σύνολο της τάξης.

Υπολογείστε:
(α) Το ποσοστό των βιώσιμων κονιδίων πριν την ακτινοβόληση.
(β) % επιζώντα κονίδια μετά την ακτινοβόληση.
(γ) % μεταλλάξεις (μορφολογικές) σχετικά με το ποσοστό των επιζώντων κονιδίων που έδωσαν
αποικίες μετά την ακτινοβόληση.
(δ) Περιγράφτε με συντομία (όχι περισσότερο από σελίδα) τους πιθανούς γενετικούς μηχανισμούς που
προκάλεσαν τη μεταλλαγή.

27
Υποσημείωση: Η άσκηση θα γίνει από ομάδες. Η κάθε ομάδα έχει από 14 άτομα χωρισμένα σε
ζευγάρια, δηλαδή 2 άτομα για τα μη ακτινοβολημένα, 2 για την ακτινοβόληση 1 λεπτού, 2 για 2 λεπτά,
κ.ο.κ. Τα αποτελέσματα θα είναι συνολικά της ομάδας και θα συγκριθούν στατιστικά με τα
αποτελέσματα της τάξης.

ΓΙΑ ΤΙΣ ΟΜΑΔΕΣ ΠΟΥ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΟΥΝ ΒΑΚΤΗΡΙΑ

Θα σας δοθούν 4 διαφορετικά στελέχη βακτηρίων τα RR1, ED 8767, RC 5064 και X . ΙΙροκειμένου να
μελετηθεί ο τρόπος λειτουργίας των συστημάτων επιδιόρθωσης στα παραπάνω βακτήρια θα
σχηματιστούν τέσσερις ομάδες φοιτητών που θα κάνουν την ακτινοβόληση και τις επιστρώσεις των
βακτηριακών εναιωρημάτων στα τρυβλία με φως, και αντίστοιχα άλλες τέσσερις ομάδες που θα
εργαστούν στο σκοτάδι.
Στις διαδικασίες προβλέπεται και η επώαση ακτινοβολημένων βακτηρίων παρουσία ή απουσία
καφεΐνης για να μελετηθεί η επίδραση της ουσίας αυτής στην επιδιόρθωση/μεταλλαξογένεση.
Συγκεκριμένα θα σας δοθούν 11 τρυβλία με την ένδειξη ΝΒ (nutrient broth) τα οποία θα εμβολιαστούν
με 0.1 ml, ανά ένα, για τις αραιώσεις που αναφέρονται στον κάθε χρόνο ακτινοβόλησης, σύμφωνα με
τον παρακάτω πίνακα:

RR1 ED 8767 RC 6054 X Αραιώσεις

0 0 0 0 -6 -8
10 2 2 15 -4 -6
20 5 5 30 -2 -4
30 10 10 50 -2 -4
40 15 15 60 -2
50 20 20 90 -2
60 30 30 120 -2

Στους χρόνους που υπογραμμίζονται στον πίνακα (για το κάθε στέλεχος ξεχωριστά) θα γίνει επίστρωση
και σε τρυβλία ΝΒ τα οποία περιέχουν αντιβιοτικά (και πάλι με 0.1 ml, αλλά από την -2 αραίωση για τις
δύο πρώτες περιπτώσεις και από τη μηδενική για τον τελικό χρόνο ακτινοβόλησης). Τα τρυβλία αυτά θα
έχουν τις ενδείξεις NBR (ριφαμπικίνη), ΝΒΑρ (αμπικιλλίνη) και NBTc (τετρακυκλίνη).

Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δοθεί στις περιπτώσεις σημειώνονται με κύκλους. Στις περιπτώσεις
αυτές (ισχύει για όλες τις ομάδες φοιτητών, είτε ακτινοβολούν στο σκοτάδι είτε στο φως), αμέσως μετά
την ακτινοβόληση για το συγκεκριμένο χρόνο θα πάρουν από 0.5 ml και θα εμβολιάσουν δοκ. σωλήνες
οι οποίοι περιέχουν 4.5ml υγρού ΝΒ ή NB+caf υλικού. Στη συνέχεια οι δοκ. σωλήνες αυτοί επωάζονται
αντίστοιχα σε φως ή σκοτάδι για 1h 30 min. Μετά το τέλος της επώασης, εμβολιάζουν από αυτά μια
σειρά τρυβλίων: Δυο ΝΒ (αραιώσεις 0 και -2 αντίστοιχα) και από ένα NBR, ΝΒΑρ, NBTc (απευθείας
από το ΝΒ) με 0.1 ml από το δοκ. σωλήνα ΝΒ, καθώς και άλλη μια πανομοιότυπη σειρά τρυβλίων με
0.1ml από το υλικό του δοκ. σωλήνα NB+caf.

28
Στόχος της άσκησης αυτής είναι, να μελετηθούν οι καμπύλες βιοσιμότητας των βακτηριακών στελεχών,
μετά από ακτινοβόληση με υπεριώδη ακτινοβολία και να γίνουν οι συγκρίσεις μεταξύ τους. Το στέλεχος
RR1 της E. coli έχει συμπεριφορά φυσικού τύπου ως προς την ανθεκτικότητά του σε UV ακτινοβολία,
το δε X είναι ένα άλλο βακτηριακό είδος το οποίο σας παρέχεται για σύγκριση. Ταυτόχρονα γίνεται μια
προσπάθεια να υπολογιστεί η συχνότητα αυτόματης και προκαλούμενης μεταλλαξογένεσης, όπως και
να δειχθεί η επίδραση του φωτός ή του σκοταδιού στις διαδικασίες επιδιόρθωσης των μεταλλαγών. Το
τελευταίο θέμα εξετάζεται επίσης και με την παρουσία ή απουσία της καφεΐνης, ώστε να διαπιστωθεί το
εάν η ουσία αυτή έχει την παραμικρή επίδραση στα συστήματα επιδιόρθωσης ή όχι.

Ενδεικτικά αποτελέσματα

Εκτελώντας τα παραπάνω πειράματα στα Εργαστήρια, φοιτητές της προηγούμενης χρονιάς πήραν τα
παρακάτω αποτελέσματα: (θα χρησιμοποιηθούν παράλληλα με αυτά που θα πάρουν από τα· δικά τους
πειράματα, ώστε να γίνονται σωστότερα οι συγκρίσεις)

Σκοτάδι
Χρόνος Αραιώσεις RR1 ED8767 RC 5064 X
0 -7, -8 xxx, 500 xxx, 450 xxx, 600 xxx, 500
10 -5, -6 2300, 250 47, 4 58, 6 xxx, 150
20 -3, -4 1200, 115 42, 5 54, 5 xxx, 1200
30 -3, -4 400, 46 4, 0 5, 0 xxx, 310
40 -2 41 1 0 390
50 -2 4 0 0 40
60 -2 2 0 0 37

Στα τρυβλία με αντιβιοτικά πήραμε αντίστοιχα:

0 NBR 50 44 10 6
ΝΒΑρ 76 80 77 14
NBTc 2 1 5 2
30 NBR 0 0 0 0
ΝΒΑρ 2 1 1 1
NBTc 1 0 0 0
60 NBR 2 1 1 1
ΝΒΑρ 5 2 2 3
NBTc 2 0 0 0

Στον τελευταίο χρόνο έγινε επίστρωση των τρυβλίων με τη μηδενική αραίωση. Τα xxx σημαίνουν
αμέτρητα.

Ύστερα από επίδραση καφεΐνης και επώαση για 1,5 ώρα τα αποτελέσματα ήταν τα ίδια με αυτά χωρίς
καφεΐνη, δηλ. :

29
 NBR 0 0 0 0
ΝΒΑρ 2 1 1 1
NBTc 1 0 0 0

Φως
Χρόνος Αραιώσεις RR1 ED8767 RC 5064 X
0 -7, -8 xxx, 500 xxx, 450 xxx, 600 xxx, 500
10 -5, -6 2100, 230 45, 4 52, 5 xxx, 170
20 -3, -4 1000, 99 39, 4 50, 5 xxx, 1600
30 -3, -4 300, 36 3, 0 4, 0 xxx, 620
40 -2 29 0 0 505
50 -2 2 0 0 120
60 -2 0 0 0 95

Στα τρυβλία με αντιβιοτικά πήραμε αντίστοιχα:

0 NBR 52 46 11 6
ΝΒΑρ 76 80 77 14
NBTc 2 1 5 2
30 NBR 3 2 1 0
ΝΒΑρ 11 2 2 1
NBTc 2 0 0 0
60 NBR 4 1 1 0
ΝΒΑρ 8 4 3 2
NBTc 3 0 0 0

Στον τελευταίο χρόνο έγινε επίστρωση των τρυβλίων με τη μηδενική αραίωση. Τα xxx σημαίνουν
αμέτρητα.

Μετά από επίδραση καφεΐνης και επώαση για 1,5 ώρα οι αποικίες που πήραμε στα τρυβλία με τα
αντιβιοτικά ήταν αντίστοιχα

Caf. + NBR 7 2 1 4
ΝΒΑρ 22 1 4 10
NBTc 7 0 4 2

Από τα αποτελέσματα αυτά, καθώς και από τα συνολικά του Τμήματος στο οποίο θα ασκηθείτε, θα
πρέπει να παραδώσετε τις παρακάτω καμπύλες : (α) καμπύλες βιοσιμότητας σε συνάρτηση με το χρόνο
ακτινοβόλησης για το καθένα στέλεχος ξεχωριστά, (β) καμπύλες μεταλλαξογένεσης για τα ίδια στελέχη,
(γ) τα συμπεράσματά σας ως προς τα επιδιορθωτικά συστήματα και ποιο είναι ανθεκτικότερο από τα
άλλα.

30
 ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΗΣΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ

Εισαγωγή

Είναι γνωστό ότι πρωταρχικό ρόλο στην επιβίωση ενός οργανισμού παίζει η ακριβής αντιγραφή του
γενετικού του υλικού. Γι’αυτό σε όλους τους οργανισμούς υπάρχουν μηχανισμοί που τη διασφαλίζουν
κάτω από ομαλές και μη συνθήκες.
To SOS σύστημα αποτελείται από περισσότερα από 20 ασύνδετα γονίδια. Ο κύριος ρόλος τους είναι η
επιδιόρθωση βλαβών του DNA. Ελέγχεται δε κυρίως από τα γονιδιακά προϊόντα των recA, lexA
γονιδίων.
Η LexA πρωτεΐνη προσδένεται στην περιοχή έναρξης της μεταγραφής όλων των SOS γονιδίων (SOS
box) και την παρεμποδίζει .Όταν το σύστημα επαχθεί, η RecA κόβει πρωτεολυτικά την LexA. Όταν
κοπεί η LexA απενεργοποιείται, και έτσι αποκαταστέλλεται η μεταγραφή των SOS γονιδίων σταδιακά.
Όταν το σήμα επαγωγής πάψει, η RecA χάνει την πρωτεολυτική της ενεργότητα και η LexA
συσσωρεύεται και καταστέλλει και πάλι τη μεταγραφή των SOS γονιδίων.
Η recA πρωτεΐνη εκτός από το να ανενεργοποιεί την lexA καταστολέα, συμμετέχει και με άλλους
τρόπους στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA. Συμμετέχει σε όλα τα μονοπάτια επιδιόρθωσης που
περιλαμβάνουν ομόλογο ανασυνδιασμό, ενεργοποιεί την umuD πρωτεΐνη και την οδηγεί στις περιοχές
της βλάβης. Η λειτουργία της recA πρωτεΐνης είναι βασικής σημασίας για το κύτταρο σε κανονικές
συνθήκες αλλά γίνεται απαραίτητη όταν δρουν παράγοντες που προκαλούν βλάβες στο DNA. Στελέχη
που δεν έχουν μια λειτουργική recA πρωτεΐνη είναι υπερευαίσθητα σε τέτοιους παράγοντες.
Για την μεταλλαξογένεση ενός οργανισμού είναι απαραίτητη η λειτουργία τουλάχιστον τριών γονιδίων,
των recA και umuDC. Τα umuDC γονίδια βρίσκονται σε ένα συνεργίωμα, αποτελούν μέρος του SOS
συστήματος και η μεταγραφή τους ελέγχεται από τις πρωτεΐνες lexA και recA. Όταν επαχθεί η
μεταγραφή τους, οι umuDC πρωτεΐνες, μαζί με την recA, βοηθούν στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA
εισάγοντας όμως και μεταλλαγές αναγνωστικού πλαισίου.
Ένα στέλεχος που φέρει μεταλλαγή στα umuDC γονίδια, έχει την ιδιότητα να παραμένει αμετάλλακτο
σε μια σειρά, μεταλλαξογόνα όπως η υπεριώδη ακτινοβολία, το EMS, MMS, 4NQO, mitomycin C κ.α.
και επίσης έχει μικρότερη ανθεκτικότητα σε όλους αυτούς τους παράγοντες.
Η DNA πολυμεράση I συμμετέχει σε όλα σχεδόν τα επιδιορθωτικά συστήματα. Έχει ενεργότητα 5΄- 3'
και 3΄- 5' εξινουκλεάσης. Ο ρόλος της είναι να κλείνει τα κενά που δημιουργούνται κατά την ανταλλαγή
των αλυσίδων του DNA. Μεταλλαγμένα στελέχη είναι βιώσιμα αλλά ευαίσθητα στην υπεριώδη
ακτινοβολία.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Θα χρησιμοποιηθούν τα στελέχη RR1, DH5a (recA-), CR101 (ροΙΑ-) και RW96 (recA-, umuDC-) τα
οποία θα παρασχεθούν από τους υπεύθυνους της άσκησης. Προκειμένου να μελετηθεί ο τρόπος
λειτουργίας των συστημάτων επιδιόρθωσης στα παραπάνω βακτήρια θα σχηματιστούν τέσσερεις
ομάδες φοιτητών που θα κάνουν την ακτινοβόληση και τις επιστρώσεις των βακτηριακών
εναιωρημάτων.
Θα σας δοθούν 11 τρυβλία με την ένδειξη ΝΒ ( nutrient broth ) τα οποία θα εμβολιαστούν με 0,1 ml,
ανά ένα για τις αραιώσεις που αναφέρονται στον κάθε χρόνο ακτινοβόλησης, σύμφωνα με τον
παρακάτω πίνακα:

31
 RR1 DH5a RW96 CR110
0 0 0 0 -4 -6
10 2 3 5 -4 -6
20 4 6 10 -2 -4
30 6 9 20 -2 -4
40 8 12 30 -2
50 10 15 40 -0
60 12 18 50 -0

Στους χρόνους που υπογραμμίζονται στον πίνακα (για το κάθε στέλεχος ξεχωριστά) θα γίνει επίστρωση
και σε τρυβλία ΝΒ τα οποία έχουν αντιβιοτικά ( και πάλι με 0,1 ml, αλλά από τη μηδενική αραίωση).
Τα τρυβλία θα έχουν τις ενδείξεις NBR (ριφαμπικίνη), ΝΒΑρ (αμπικιλλίνη) και NBTc (τετρακυκλίνη).
Στόχος της άσκησης είναι να μελετηθούν οι καμπύλες βιωσιμότητας των βακτηριακών στελεχών, μετά
από ακτινοβόληση με υπεριώδη ακτινοβολία και να γίνουν οι συγκρίσεις μεταξύ τους. Το στέλεχος της
RR1 E.coli έχει συμπεριφορά φυσικού τύπου ως προς την ανθεκτικότητά του στην υπεριώδη
ακτινοβολία.
Ταυτόχρονα γίνεται μια προσπάθεια να υπολογιστεί η συχνότητα αυτόματης και προκαλούμενης
μεταλλαξογένεσης.

Ενδεικτικά αποτελέσματα

Εκτελώντας τα παραπάνω πειράματα στα Εργαστήρια, φοιτητές της προηγούμενης χρονιάς πήραν τα
παρακάτω αποτελέσματα: (Θα χρησιμοποιηθούν παράλληλα με αυτά που θα πάρουν από τα δικά τους
πειράματα, ώστε να γίνονται σωστότερα οι συγκρίσεις).

Χρόνος Αραιώσεις RR1 DH5a RW96 CR110

0 -5, -6 42, 5 30, 2 30, 4 35, 4
10 -3, -4 xxx, 330 6, 0 7, 0 xxx, 300
20 -3, -4 400, 70 5, 0 4, 0 300, 42
30 -2, -4 49, 6 4, 0 2, 0 10, 2
40 -2 22 0 1 1
50 0 500 0 0 0
60 0 35 0 0 0

Στα τρυβλία με αντιβιοτικά πήραμε αντίστοιχα:

RR1 DH5a RW96 CR110

0 NBR 5 0 0 2
ΝΒΑρ 8 1 0 3
NBTc 2 0 0 0
10 NBR 10 0 0 5

32
 ΝΒΑρ 13 0 0 7
NBTc 5 0 0 2
20 NBR 20 0 0 10
ΝΒΑρ 30 0 0 18
NBTc 5 0 0 3

στον τελευταίο χρόνο έγινε επίστρωση των τρυβλίων με τη μηδενική αραίωση. Τα xxx σημαίνει
αμέτρητες αποικίες.

Από τα αποτελέσματα αυτά, καθώς και από τα συνολικά του Τμήματος στο οποίο θα ασκηθείτε, θα
πρέπει να παραδώσετε τις παρακάτω καμπύλες:

(α) καμπύλες βιωσιμότητας σε συνάρτηση με καμπύλες μεταλλαξογένεσης για το καθένα στέλεχος

ξεχωριστά, (β) καμπύλες μεταλλαξογένεσης για τα ίδια στελέχη, (γ) τα συμπεράσματα ως προς τα
επιδιορθωτικά συστήματα και ποιο είναι ανθεκτικότερο από τα άλλα.

33
 7η ΆΣΚΗΣΗ: ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΩΝ - ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ
ΑΝΑΛΥΣΗ
Π. Κόλλια

Στα ευκαρυωτικά κύτταρα το γενετικό υλικό εντοπίζεται στον πυρήνα όπου σχηματίζει ειδικές δομές
που ονομάζονται χρωμοσώματα. Ο όρος χρωμόσωμα προέρχεται από τις ελληνικές λέξεις «χρώμα» και
«σώμα» και χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1888 από τον Waldeyer, όταν μετά την εφαρμογή
συγκεκριμένης τεχνικής χρώσης οι δομές αυτές παρουσίασαν έντονο χρωματισμό. Κάθε χρωμόσωμα
αποτελείται από DNA και ειδικές πρωτεΐνες που βοηθούν στο σχηματισμό ειδικών
δομών/διαμορφώσεων που οδηγούν στη συσπείρωσή του (Εικόνα 1).

Εικόνα 1: Δομή των χρωμοσωμάτων

Κάθε οργανισμός διαθέτει ένα χαρακτηριστικό αριθμό χρωμοσωμάτων. Συγκεκριμένα ο άνθρωπος έχει
46 χρωμοσώματα, δεδομένο που καθορίστηκε το 1956 από τους Tjio and Levan. Η συγκεκριμένη
ανακάλυψη οδήγησε στην ανάπτυξη ενός νέου πεδίου της Γενετικής, την Κυτταρογενετική. Ο όρος
Κυτταρογενετική αναφέρεται στον κλάδο της Βιολογίας που αφορά στη μελέτη του αριθμού και της
δομής των χρωμοσωμάτων.

Ιστορική αναδρομή

Στη συνέχεια αναφέρονται κάποιες ημερομηνίες ορόσημα που αφορούν στην εξέλιξη του κλάδου της
Κυτταρογενετικής:
• 1956: Προσδιορισμός του αριθμού των χρωμοσωμάτων του ανθρώπου (Tjio and Levan)

34
 • 1959: Χαρακτηρισμός του συνδρόμου Down-τρισωμία χρωμοσώματος 21 (Lejeune)
• 1960: Παρασκευή καρυοτύπου από καλλιέργειες λεμφοκυττάρων (Moorehead)
• 1960-1963: Ταυτοποίηση πολλών χρωμοσωμικών συνδρόμων
• 1963: Ανακάλυψη τεχνικών ζωνοποίησης

Χρωμοσώματα

Τα χρωμοσώματα, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, είναι δομές που εντοπίζονται στον πυρήνα του
κυττάρου. Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης τα χρωμοσώματα λαμβάνουν πυκνή διαμόρφωση
που τα καθιστά ορατά στο οπτικό μικροσκόπιο με συνέπεια να είναι δυνατές η παρατήρηση και η
μελέτη τους. Ο μέγιστος βαθμός συσπείρωσης των χρωμοσωμάτων παρατηρείται κατά στο στάδιο της
μετάφασης. Κάθε χρωμόσωμα αποτελείται από δύο αδελφές χρωματίδες, οι οποίες ενώνονται στην
περιοχή του κεντρομεριδίου. Λόγω αυτού, προκύπτουν δύο βραχίονες (σκέλη), το βραχύ σκέλος (p) και
το μακρύ σκέλος (q). Ανάλογα με τη θέση του κεντρομεριδίου, τα χρωμοσώματα διακρίνονται σε:

μετακεντρικά, όταν το κεντρομερίδιο βρίσκεται στο μέσο περίπου του χρωμοσώματος και το
μήκος των βραχέων και μακρών σκελών είναι ίδιο
υπομετακεντρικά, όταν το κεντρομερίδιο βρίσκεται μεταξύ του μέσου και του άκρου του
χρωμοσώματος με αποτέλεσμα τα μακρά και βραχέα σκέλη να έχουν διαφορετικό μήκος
ακροκεντρικά, όταν το κεντρομερίδιο βρίσκεται στην άκρη του χρωμοσώματος.

Στην Εικόνα 2 απεικονίζονται οι κατηγορίες των χρωμοσωμάτων ανάλογα με τη θέση του

κεντρομεριδίου (μετακεντρικό, υπομετακεντρικο, ακροκεντρικό).

Εικόνα 2: Κατηγορίες χρωμοσωμάτων

Σε κάθε κύτταρο του ανθρώπου εντοπίζονται 23 ζεύγη ομόλογων χρωμοσωμάτων (46 συνολικά). Τα
ομόλογα χρωμοσώματα έχουν το ίδιο σχήμα και μέγεθος και περιέχουν τις ίδιες γενετικές πληροφορίες
στις αντίστοιχες γενετικές θέσεις. Σε κάθε ζεύγος ομόλογων χρωμοσωμάτων το ένα είναι μητρικής και
το άλλο πατρικής προέλευσης. Από τα 23 ζεύγη, τα 22 ονομάζονται αυτοσωμικά και είναι κοινά και στα
δύο φύλα, ενώ το τελευταίο ζεύγος αποτελείται από τα φυλετικά χρωμοσώματα (γονότυπος ΧΧ στις
γυναίκες και ΧΥ στους άνδρες).
Μετά από ομοιόμορφη χρώση με τη χρωστική Giemsa τα χρωμοσώματα κατατάσσονται σε επτά
κατηγορίες (A-G) ανάλογα με το μέγεθός τους και τη θέση του κεντρομεριδίου, οι οποίες
περιγράφονται αναλυτικά στον παρακάτω πίνακα.

35
Ομάδες Χρωμοσωμάτων
Χρωμοσώματα
Ομάδα
περιλαμβάνονται
A 1, 2, 3
B 4, 5
C 6 έως 12, Χ
D 13, 14, 15
E 16, 17, 18
F 19, 20
G 21, 22
που
Χαρακτηριστικά χρωμοσωμάτων της ομάδας
Μεγάλα, μετακεντρικά (1,3)
Υπομετακεντρικά (2)
Μεσαία, υπομετακεντρικά
Μεσαία, υπομετακεντρικά
Μεσαία, ακροκεντρικά
Μικρά, Μετακεντρικό (16), Υπομετακεντρικά (17,18)
Πολύ μικρά, μετακεντρικά
Πολύ μικρά, ακροκεντρικά

Η ταξινόμηση των χρωμοσωμάτων σε ζεύγη (ομόλογα χρωμοσώματα) κατά σειρά μεγέθους και η
περιγραφή της χρωμοσωμικής σύστασης ενός κυττάρου ονομάζεται καρυότυπος (Εικόνα 3).

Εικόνα 3: Καρυότυπος φυσιολογικού άρρενος ατόμου

Χρωμοσωμικές ανωμαλίες

Με τον όρο χρωμοσωμικές ανωμαλίες περιγράφονται τα φαινόμενα που συμβαίνουν στα χρωμοσώματα
και προκαλούν αλλαγές σε σχέση με το φυσιολογικό. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες διακρίνονται σε 2
κύριες κατηγορίες: αριθμητικές και δομικές. Στις αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες ο αριθμός των

36
χρωμοσωμάτων αποκλίνει από το φυσιολογικό (π.χ. έλλειψη ή προσθήκη ενός χρωμοσώματος), ενώ οι
δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες χαρακτηρίζονται από αλλαγές στη δομή ενός ή περισσοτέρων
χρωμοσωμάτων. Πιο συγκεκριμένα, οι δομικές ανωμαλίες διακρίνονται σε ισοζυγισμένες (π.χ.
μεταθέσεις), όπου το (ποσοτικό) ισοζύγιο του γενετικού υλικού δεν επηρεάζεται και σε μη
ισοζυγισμένες, όταν το ισοζύγιο του γενετικού υλικού διαταράσσεται (π.χ. απαλοιφές, ενθέσεις). Οι
χρωμοσωμικές ανωμαλίες που μπορεί να αναγνωριστούν μέσω κλασικής Κυτταρογενετικής ανάλυσης
είναι μεγέθους 5-10Mb.

Εφαρμογές της Κυτταρογενετικής

Μερικές από τις πιο σημαντικές εφαρμογές της Κυτταρογενετικής είναι οι παρακάτω:
Προγεννητικός Έλεγχος: Έλεγχος του εμβρύου για την ανίχνευση κοινών χρωμοσωμικών
ανωμαλιών. Ως αρχικό υλικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί είτε δείγμα αμνιακού υγρού (το υγρό που
πληρεί τον αμνιακό σάκο και εκεί αναπτύσσεται το έμβρυο) είτε δείγμα χοριακών λαχνών (μέρος
του αναπτυσσόμενου πλακούντα).
Ανάλυση καρυοτύπου από περιφερικό αίμα για την ταυτοποίηση χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε
πλήθος κλινικών και ερευνητικών περιπτώσεων.
Ανάλυση καρυοτύπου από μυελό των οστών σε αιματολογικές κακοήθειες και βιοψίες συμπαγών
όγκων για την ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών, με σημαντική διαγνωστική και προγνωστική
σημασία.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Παρατήρηση μεταφασικών χρωμοσωμάτων στο μικροσκόπιο

Θα σας δοθούν αντικειμενοφόρες πλάκες με μεταφασικά χρωμοσώματα.

Βρείτε τις μεταφάσεις στο μικροσκόπιο πρώτα με τον 10x φακό και μετά με το φακό 40x.
Μετρείστε τον αριθμό των χρωμοσωμάτων και βρείτε το φύλο. Γράψτε τον καρυότυπο.
Στην παρακάτω εικόνα απεικονίζεται ο καρυότυπος φυσιολογικού αρσενικού ατόμου: 46, ΧΥ.

37
ΕΡΓΑΣΙΑ

Στις παρακάτω εικόνες μεταφάσεων (Α, Β, Γ), θα πρέπει να μετρήσετε τον αριθμό των χρωμοσωμάτων
και στη συνέχεια να κατατάξετε τα χρωμοσώματα σε κατηγορίες (A-G) με βάση το μέγεθός τους και τη
θέση του κεντρομεριδίου.

38
Α.

39
 Β.

Γ.

40
 8η ΑΣΚΗΣΗ
Γενετική Μικροοργανισμών ΙΙΙ

Η γενετική βάση της ανθεκτικότητας σε αντιμικροβιακούς παράγοντες:

μοριακοί στόχοι των αντιβιοτικών, μηχανισμοί ανθεκτικότητας, χρωμοσωμική και εξωχρωμοσωμική
κληρονομικότητα γονιδίων ανθεκτικότητας, οριζόντια μεταφορά γονιδίων, γονιδιακή επαγωγή

Οι αντιμικροβιακοί παράγοντες ή αντιμικροβιακοί παρεμποδιστές (antimicrobial agents ή inhibitors)

είναι χημικές ουσίες που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών ή/και οδηγούν στον θάνατό
τους. Ανάλογα με τους οργανισμούς-στόχους, οι αντιμικροβιακοί παράγοντες διακρίνονται σε
αντιβακτηριακούς, αντιμυκητιακούς, αντιιικούς και αντιπαρασιτικούς. Ανάλογα με τον τρόπο εφαρμογής
τους, σε in vivo χορηγούμενους, όπως είναι τα αντισηπτικά και τα αντιβιοτικά, και σε χρησιμοποιούμενους σε
αβιοτικά υλικά και επιφάνειες, όπως είναι τα απολυμαντικά.
Τα αντιβιοτικά είναι αντιμικροβιακοί παράγοντες κατ’ εξοχήν αντιβακτηριακοί, που σύμφωνα με τον
κλασικό ορισμό "παράγονται από μικροοργανισμούς και σε αραιά διαλύματα παρεμποδίζουν ή καταστέλλουν
την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών". Ο ορισμός αυτός περιγράφει πλήρως περιπτώσεις αντιβιοτικών όπως
η κοινώς ονομαζόμενη πενικιλλίνη, φυσική ένωση παραγόμενη από τον μύκητα Penicillium chrysogenum. Η
πενικιλλίνη ανακαλύφθηκε τυχαία το 1928 από τον Alexander Fleming, όταν ο τελευταίος παρατήρησε ότι η
ανάπτυξη Penicillium σε τρυβλία εμβολιασμένα με σταφυλοκόκκους κατέστειλε την αύξησή τους πέριξ του
μύκητα και οδήγησε σε λύση τους. Ευθύς αμέσως έγιναν οι πρώτες κλινικές μελέτες χορήγησης της
πενικιλλίνης σε ασθενείς που έπασχαν από μικροβιακές λοιμώξεις, καθώς και αναπτύχθηκαν πρωτόκολλα
βιομηχανικής παραγωγής της. Πλήθος άλλων φυσικών ενώσεων ανακαλύφθηκαν σταδιακά και
χρησιμοποιούνται σήμερα ως φάρμακα ειδικά για την αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία ή ως αντιμικροβιακοί
παρεμποδιστές στην εργαστηριακή έρευνα. Ωστόσο, ο κλασικός ορισμός του αντιβιοτικού έχει διευρυνθεί έτσι
ώστε να περιλαμβάνει και συνθετικές ενώσεις, η συντριπτική πλειοψηφία των οποίων παράγεται με
υποκαταστάσεις χημικών ομάδων των αρχικών φυσικών ενώσεων. Η προσπάθεια δημιουργίας νέων
δραστικών ενώσεων αποσκοπεί στο να ενισχυθεί το οπλοστάσιο των φαρμακευτικών ουσιών έναντι των
μικροβιακών παθογόνων, κι εδώ δεν πρέπει να εξαιρεθεί ότι συγκεκριμένες συνθετικές ενώσεις – σύμπλοκα
αρσενικού και αργότερα οι σουλφοναμίδες – είχαν με επιτυχία εφαρμοστεί θεραπευτικά ήδη από τις αρχές
προς μέσα του 20ου αιώνα. Η έννοια του ‘αραιού διαλύματος’ στον ορισμό παραπέμπει στην ειδικότητα της
δράσης των αντιβιοτικών και τον αποκλεισμό αλκοολούχων ή άλλων αντισηπτικών σκευασμάτων, που είναι
δραστικά σε υψηλές συγκεντρώσεις. Τα αντιβιοτικά, τέλος, ανάλογα με τον τρόπο δράσης τους, διακρίνονται
σε βακτηριοστατικά ή βακτηριοκτόνα, ενώ ανάλογα με το πλήθος των διαφορετικών βακτηρίων που
καταπολεμούν – θετικών ή/και αρνητικών κατά Gram, υποχρεωτικά παρασιτικών, μυκοβακτηρίων, κ.ά. – σε
ευρέος ή στενού φάσματος.
Οι στόχοι των αντιβιοτικών στο κύτταρο είναι πολλοί και διαφορετικοί (βλ. και Πίνακα Ι). Για
παράδειγμα, η οικογένεια των ουσιών που κοινώς ονομάζονται ‘πενικιλλίνη’, με πρότυπη ένωση την
πενικιλλίνη G ή βενζυλοπενικιλλίνη (Εικ. 1α), φέρουν στη δομή τους τον λεγόμενο β-λακταμικό δακτύλιο και
παρεμποδίζουν τη δημιουργία διασυνδέσεων ανάμεσα στις πεπτιδικές αλυσίδες της πεπτιδογλυκάνης του
κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων, καθώς προσδένονται στα ενεργά κέντρα των ενζύμων που επιτελούν
αυτές τις διαπεπτιδιώσεις (DD διαπεπτιδάσες ή PBPs – penicillin-binding proteins). H ελλιπής διασύνδεση
των πεπτιδικών αλυσίδων του τοιχώματος εξασθενίζει το τελευταίο και οδηγεί σε οσμωτική λύση των
κυττάρων. Οι ενώσεις που φέρουν β-λακταμικό δακτύλιο, οι λεγόμενες β-λακτάμες – φυσικές ή ημισυνθετικές

41
– αποτελούν τη μεγαλύτερη κατηγορία των ευρέος φάσματος χρησιμοποιούμενων αντιβιοτικών (άνω του
54%). Άλλο ευρύτατα γνωστό αντιβιοτικό είναι η στρεπτομυκίνη (Εικ.1β), που ανήκει στην οικογένεια των
αμινογλυκοσιδών και λειτουργεί ως παρεμποδιστής της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η στρεπτομυκίνη παράγεται από
το βακτήριο Streptomyces griseus και ανακαλύφθηκε το 1943 ως το πρώτο αντιβιοτικό αυτής της κατηγορίας
δράσης. Η στρεπτομυκίνη προσδένεται στο 16S rRNA της 30S ριβοσωμικής υπομονάδας και παρεμποδίζει
την πρόσδεση του φορμυλομεθειονυλο-tRNA, δηλαδή την έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης, καθώς και την εν
γένει συγκρότηση του συμπλέγματος ριβοσώματος-mRNA. Τα παραπάνω οδηγούν σε παρακώλυση της
σύνθεσης των πρωτεϊνών, αλλά και σε λάθη αποκωδικοποίησης ή πλαισιοτροποποιητικές μεταλλαγές κατά τη
σύνθεση, που επιφέρουν τον θάνατο των κυττάρων.

Εικόνα 1. (α) Άνω: γενική δομή

πενικιλλινών (όπου R: πλευρική αλυσίδα).
Αναδεικνύεται με κύκλο ο τετραμελής
λακταμικός δακτύλιος. Κάτω: η δομή της
βενζυλοπενικιλλίνης. (β) Δομή της
στρεπτομυκίνης, μιας τυπικής
αμινογλυκοσίδης.

Είναι προφανές ότι η κυτταρική ανθεκτικότητα σε έναν παρεμποδιστή μπορεί να προκύψει με πολλούς
και διαφορετικούς τρόπους. Μπορεί, για παράδειγμα, να μεταλλαχθεί το μόριο-στόχος έτσι ώστε να πάψει να
αλληλεπιδρά με τον παρεμποδιστή. Αυτή είναι η κλασικότερη περίπτωση της ανθεκτικότητας στη
στρεπτομυκίνη, που έγκειται σε μεταλλαγή του ίδιου του 16S rRNA ή του γονιδίου της ριβοσωμικής
πρωτεΐνης S12 (μεταλλαγή rpsL). Εναλλακτικά, μπορεί να υπάρξει απενεργοποίηση του παρεμποδιστή μέσω
αποικοδόμησης ή χημικής τροποποίησης αυτού. Τυπικό παράδειγμα απενεργοποίησης μέσω αποικοδόμησης
είναι αυτό της υδρόλυσης του λακταμικού δακτυλίου των β-λακταμών από εξειδικευμένα ένζυμα, τις β-
λακταμάσες, τα γονίδια των οποίων είτε υπάρχουν ενδογενώς σε βακτηριακά στελέχη, είτε εισέρχονται μέσω
οριζόντιας μεταφοράς, καθιστώντας τα στελέχη ανθεκτικά. Παράδειγμα απενεργοποίησης μέσω τροποποίησης
των αρχικών μορίων συναντάται κατά την αδρανοποίηση των αμινογλυκοσιδών, που γίνεται μέσω ενζυμικών
δράσεων ακετυλίωσης, νουκλεοτιδυλίωσης και φωσφορυλίωσης των αρχικών μορίων. Τέτοιες λειτουργίες,
εάν δεν υπάρχουν ενδογενώς, αποκτώνται επίσης μέσω οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων.
Από τα παραπάνω, γίνεται φανερό ότι η μελέτη των στόχων και των τρόπων δράσης των
αντιβιοτικών, καθώς και των μηχανισμών ανθεκτικότητας σε αυτά, έχει συνεισφέρει τα μέγιστα στην
ανάπτυξη ουσιών για τη θεραπευτική καταπολέμηση των μικροβιακών λοιμώξεων, αλλά όχι μόνο. Στις
βιολογικές επιστήμες εν γένει, η φύση των αντιβιοτικών ως μοριακών παρεμποδιστών έχει βοηθήσει στη
διαλεύκανση πλήθους ζητημάτων βασικής έρευνας που αφορούν σε γενετικούς, βιοχημικούς ή κυτταρικούς
μηχανισμούς, καθώς και στην εξακρίβωση βιομοριακών δομών, μέσω της μελέτης συμπλόκων των
αντιβιοτικών με τα μόρια-στόχους. Στη δε κατεύθυνση της γενετικής των μικροοργανισμών, οι μεταλλαγές
ευαισθησίας ή ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά αποτελούν πολύτιμα εργαλεία γενετικής ανάλυσης, καθώς
σηματοδοτούν το γενετικό υλικό και τις μετακινήσεις του – αποτελούν δηλαδή πρόσφορους γονοτυπικούς
δείκτες.

42
 Στην παρούσα σύνοψη δεν θα έπρεπε να εξαιρεθεί ο σύγχρονος προβληματισμός που διέπει την
αλόγιστη χρήση των αντιβιοτικών στα πλαίσια (α) της αντιμικροβιακής χημειοθεραπείας ανθρώπου και ζώων,
και (β) εξαιρετικά βλαβερών κτηνοτροφικών πρακτικών, που έγκεινται στην αθρόα προσθήκη αντιβιοτικών
στις ζωοτροφές, με σκοπό τη διατήρηση της καλής υγείας των ζώων και την αύξηση του βάρους τους. Είναι
πλήρως αποδεκτό ότι η χρήση των αντιβιοτικών στον χώρο της υγείας άλλαξε δια παντός την αντιμετώπιση
των μικροβιακών λοιμώξεων και συνέβαλε στη μείωση της θνησιμότητας εξαιτίας των μικροβιακών
παθογόνων και την εκτόξευση του προσδόκιμου ζωής σε παγκόσμιο επίπεδο. Ωστόσο, η υπερβολική ή λάθος
χρήση τους αποτελεί θέμα παγκόσμιου συναγερμού, κυρίως εφόσον η θεραπευτική εφαρμογή έκαστης νέας
ένωσης συνοδεύτηκε απαρέγκλιτα από την εμφάνιση μικροοργανισμών ανθεκτικών σ’ αυτήν σε σύντομο
χρονικό διάστημα. Η αύξηση της συχνότητας εμφάνισης υπερανθεκτικών παθογόνων μάλιστα (δηλ.,
ανθεκτικών σε μεγάλο εύρος διαφορετικών ουσιών), από τη δεκαετία του ’50 ως τις μέρες μας, αποτελεί πλέον
δημόσιο κίνδυνο χωρίς σύνορα και έχει οδηγήσει στην εφαρμογή αυστηρότατων κανόνων χρήσης των
αντιβιοτικών σε όλα τα προηγμένα κράτη. Η χορήγηση στον άνθρωπο, για παράδειγμα, πρέπει απαραιτήτως
να μην γίνεται αυθαίρετα αλλά να συνταγογραφείται (με ρητή οδηγία ως προς τον τύπο του χορηγούμενου
αντιβιοτικού, τη δοσολογία και τη διάρκεια της αγωγής), στα κλινικά περιβάλλοντα η εφαρμογή τελευταίας
γενιάς φαρμάκων πρέπει να γίνεται με φειδώ και αφού προηγουμένως θα έχει αποδειχθεί η ακαταλληλότητα
φαρμάκων παλαιότερης γενιάς, ενώ, τέλος, στην κτηνοτροφία επιβάλλεται να χρησιμοποιούνται ουσίες
διαφορετικές από αυτές που χορηγούνται κλινικά σε ασθενείς.

Πίνακας Ι: Τρόπος δράσης τυπικών αντιβιοτικών και εξειδικευμένοι στόχοι

Αντιβιοτικά Στόχοι και τρόποι παρεμπόδισης

Παρεμποδιστές νουκλεϊκών οξέων
L-αζασερίνη# Ανάλογο γλουταμίνης, παρεμποδιστής μεταβολισμού γλουταμίνης και
ανταγωνιστής πουρινών
Ναλιδιξικό οξύ Παρεμποδιστές βιοσύνθεσης DNA: παρεμποδιστές γυράσης και
τοποϊσομεράσης ΙV (οικογένεια κινολονών)
Νοβοβιοκίνη
Μιτομυκίνη C# Δημιουργία διασυνδέσεων στο DNA (cross-links) κυρίως σε περιοχές
υποκινητών
Ριφαμπικίνη Παρεμποδιστής βιοσύνθεσης RNA: RNA πολυμεράσης

Μιθραμυκίνη# Παρεμποδιστές μεταγραφής

Ντακτινομυκίνη# Η ακτινομυκίνη προσδένεται στο DNA και παρεμποδίζει τη μεταγραφική
(Ακτινομυκίνη D) έναρξη και επιμήκυνση

Παρεμποδιστές πρωτεϊνοσύνθεσης
Αμικασίνη Παρεμποδιστές 30S ριβοσωμικής υπομονάδας
Γενταμυκίνη
Τετρακυκλίνες Η αμικασίνη λειτουργεί περίπου όπως η στρεπτομυκίνη (παρεμπόδιση 16S

43
 rRNA και πρωτεΐνης S12), η τετρακυκλίνη παρεμποδίζει την πρόσδεση
Στρεπτομυκίνη
των aa-tRNAs στην θέση Α του ριβοσώματος
Νεομυκίνη
Νετιλμυκίνη
Καναμυκίνη
Ερυθρομυκίνη Παρεμποδιστές 50S ριβοσωμικής υπομονάδας
Κλινταμυκίνη
Σπιραμυκίνη Tα περισσότερα δρουν στην παρακώλυση της μεταφοράς ριβοσώματος/
tRNAs από την Α στην Ρ θέση, η χλωραμφαινικόλη προσδένεται στο 23S
Καρμπομυκίνη
rRNA και παρακωλύει την πεπτιδυλοτρανσφεράση (επιμήκυνση)
Ολεαντομυκίνη
Λινκομυκίνη
Χλωραμφαινικόλη
Πουρομυκίνη Παρεμποδιστές ρόλων των tRNAs
Μουπυροκίνη
H πουρομυκίνη είναι aa-tRNA ανάλογο, προκαλεί πρόωρο τερματισμό,
και η μουπυροκίνη, παρεμποδιστής της Ile-tRNA συνθετάσης
Παρεμποδιστές σύνθεσης κυτταρικών τοιχωμάτων
D-κυκλοσερίνη Ανάλογο D-αλανίνης, παρεμποδίζει τη ρακεμάση της αλανίνης και την D-
Ala–D-Ala λιγάση (παρακωλύει τη διαπεπτιδίωση του τοιχώματος)
Βασιτρακίνη Παρεμποδίζει την αποφωσφορυλίωση και ανακύκλωση του C55-
ισοπρενυλο-πυροφωσφορικού (πυροφωσφορικής βακτοπρενόλης), που
εξάγει μονάδες NAM, NAG για τη σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης
Βανκομυκίνη Προσδένεται σε διασυνδεδεμένα κατάλοιπα D-Ala–D-Ala των Gram+ και
παρακωλύει την περαιτέρω διαπεπτιδίωση των πεπτιδογλυκανικών
αλυσίδων
Πενικιλλίνες βλ. κείμενο για β-λακτάμες
Κεφαλοσπορίνες
Καρβαπενέμες
Παρεμποδιστές ακεραιότητας κυτταρικής μεμβράνης
Πολυμυξίνες Ανοίγουν οπές στη μεμβράνη
Γκραμισιδίνες Οι πολυμυξίνες προσδένονται στον λιποπολυσακχαρίτη (LPS) της
εξωτερικής μεμβράνης και αποδιοργανώνουν και τις δύο μεμβράνες των
Gram- (κολιστίνη: πολυμυξίνη Ε)
Αμφοτερισίνη Β Δημιουργούν σύμπλοκα με την εργοστερόλη (μεμβρανικό στεροειδές) των
μυκήτων
Νυστατίνη

44
 Παρεμποδιστές ενδιάμεσου μεταβολισμού
Σουλφανιλαμίδη Παρεμποδιστές σύνθεσης του τετραϋδροφυλλικού οξέως (ενεργοποιημένο
φυλλικό) από το παρααμινοβενζοϊκό οξύ (ΡΑΒΑ): παρεμποδιστής της
(και σουλφοναμίδες)
διυδροπτεροϊκής συνθετάσης η σουλφανιλαμίδη και της διυδροφυλλικής
Τριμεθοπρίμη
αναγωγάσης η τριμεθοπρίμη
Με έντονη γραμματοσειρά σημειώνονται αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται στην άσκηση
#
: αντικαρκινικές ενώσεις

Στην προηγούμενη άσκηση καταγράφηκαν από τους φοιτητές οι συχνότητες εμφάνισης

ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά στρεπτομυκίνη, ριφαμπικίνη ή/και τετρακυκλίνη στο εντερικό βακτήριο
Escherichia coli, ως αποτέλεσμα αυτόματης ή επαγόμενης μεταλλαξογένεσης. Στην παρούσα άσκηση θα
δοθούν στελέχη E. coli και θα χαρακτηριστεί με απλές δοκιμασίες – streaks και αντιβιόγραμμα – ο γονότυπός
τους ως προς την ανθεκτικότητα ή ευαισθησία σε διαφορετικά αντιβιοτικά, θα εξετασθεί πού εδράζονται τα
γονίδια ανθεκτικότητας, αν μπορούν να μεταφερθούν μέσω κυτταρικών επαφών (εν προκειμένω, μέσω
συζευκτικών επαφών) και εάν υπάρχει περίπτωση η έκφραση τέτοιου τύπου γονιδίων να επάγεται.

Υποσημείωση: Τα στελέχη E. coli που δίνονται δεν είναι παθογόνα αλλά σε κάθε περίπτωση θα
πρέπει να ακολουθηθούν κατά γράμμα οι οδηγίες των υπευθύνων των ασκήσεων όσον αφορά στη χρήση των
καλλιεργειών και τη διαδικασία των πειραμάτων.

Διαδικασία άσκησης

Α) Θα σας δοθούν ανά ζευγάρι 2 τρυβλία με πλήρες θρεπτικό υλικό ΝΑ (Νutrient Agar), στα οποία
θα επιστρώσετε με αποστειρωμένη κεκαμένη ράβδο, προσεκτικά και σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου, 0.1
ml κορεσμένης βακτηριακής καλλιέργειας στελέχους E. coli, που θα βρείτε σε κωνική φυάλη στον πάγκο σας
(δίνονται διαφορετικά στελέχη ανά πάγκο). Το δείγμα για την επίστρωση θα το λάβετε με αποστειρωμένη
πιπέττα των 1 ή 2 ml. Μετά την επίστρωση, θα τοποθετηθούν στα τρυβλία με λαβίδα ή με διανομέα, δισκία
εμποτισμένα με αντιβιοτικά. Έκαστο δισκίο αναγράφει κωδικοποιημένο το αντιβιοτικό με το οποίο είναι
εμποτισμένο και την ποσότητά του σε μg (π.χ. RD/30: ριφαμπικίνη 30 μg). Στην επόμενη άσκηση θα
παρατηρήσετε εάν υπάρχουν ζώνες καταστολής της βακτηριακής αύξησης (inhibition zones) πέριξ του
δισκίου, ποια είναι η εικόνα τους και πιο το μέγεθός τους, και θα αναγράψετε τον γονότυπο του στελέχους που
σας δόθηκε βάσει αυτών (βλ. Άσκηση 8).
Τα βακτηριακά στελέχη που θα χρησιμοποιηθούν θα είναι το E. coli DH5α και παράγωγα αυτού με
επιπρόσθετο γενετικό υλικό. (ΣΗΜ: Καταγράψτε τα στελέχη που χρησιμοποιείτε)
Ενδεικτικά αντιβιοτικά που θα χρησιμοποιηθούν: Ναλιδιξικό οξύ (ΝΑ), Αμικασίνη (ΑΚ), μεθικιλλίνη
(ΜΕΤ), θειική κολιστίνη (CT), νοβοβιοκίνη (NV), τετρακυκλίνη (ΤΕ), καρβενικιλλίνη (CAR), ερυθρομυκίνη
(E), ριφαμικίνη (RD), καναμυκίνη (K), τριμεθοπρίμη (W), κλινταμυκίνη (DA).

Β) Θα σας δοθούν ανά ζευγάρι 5 τρυβλία με διαβαθμίσεις συγκέντρωσης αντιβιοτικών. Οι

διαβαθμίσεις επιτυγχάνονται κατά την προπαρασκευή των τρυβλίων: σε κατάσταση κλίσης του τρυβλίου

45
επιστρώνεται θρεπτικό υλικό άνευ αντιβιοτικού (ΝΑ), αφήνεται να στερεοποιηθεί, οριζοντιώνεται το τρυβλίο
και κατόπιν επιστρώνεται θρεπτικό υλικό με αντιβιοτικό (ΝΑ+ αντ. – Εικ. 2).

Εικόνα 2. Τρόπος προπαρασκευής τρυβλίων με διαβαθμίσεις συγκέντρωσης αντιβιοτικών (ενδεικτικά

αναφέρονται η στρεπτομυκίνη και η πενικιλλίνη).

Στα τρυβλία αυτά και κατά τη φορά της διαβάθμισης θα κάνετε εμβολιασμούς βακτηριακής
καλλιέργειας με χρήση αποστειρωμένου κρίκου (loop) και σε συρόμενη γραμμή (streak), κατά προτίμηση
κυματιστή. Καλό θα είναι να κάνετε 3 διαφορετικές γραμμές, με φορά που να εναλλάσσεται (: το πυκνό
εμβόλιο να τοποθετείται στη μία ή την άλλη πλευρά του τρυβλίου για να ελεγχθούν φαινόμενα δόσης του
εμβολίου συναρτήσει συγκέντρωσης – Εικ. 3).

Εικόνα 3. Γραμμικοί εμβολιασμοί βακτηριακών καλλιεργειών (streaks) σε

τρυβλία με διαβαθμίσεις συγκέντρωσης αντιβιοτικού. Τα βέλη συμβολίζουν
την αλλαγή κατεύθυνσης των streaks. Με τη γραμμή αριστερά συμβολίζεται
το όριο του μετώπου του δεύτερου επιστρωμένου υλικού (ΝΑ+αντ., βλ.
κείμενο). Κάτω καταδεικνύεται η κλίση συγκέντρωσης του αντιβιοτικού.

Οι καλλιέργειες που θα χρησιμοποιηθούν στο μέρος αυτό θα είναι ίδιες με του μέρους (Α) ανά πάγκο.
Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται στα τρυβλία είναι: αμπικιλλίνη 50 μg/ml, στρεπτομυκίνη 50
μg/ml, τετρακυκλίνη 25 μg/ml, καναμυκίνη 50 μg/ml και χλωραμφαινικόλη 30 μg/ml (οι συγκεντρώσεις
αναφέρονται στο προπαρασκευασμένο θρεπτικό υλικό).
Στην επόμενη άσκηση θα παρατηρηθεί το αποτέλεσμα όλου του τμήματος, θα καταγραφούν οι
γονότυποι των στελεχών και θα αντιπαραβληθούν με αυτούς που προκύπτουν από το μέρος (Α).

Γ) Θα δοθεί σε κάθε ζευγάρι τρυβλίο με πλήρες θρεπτικό υλικό LBA (Luria-Bertani Agar) και δύο
αντιβιοτικά, στο οποίο θα πραγματοποιήσετε διασταύρωση δύο διαφορετικών βακτηριακών στελεχών από
αυτά της σημερινής άσκησης. Έκαστο στέλεχος θα είναι ανθεκτικό σε ένα από τα χρησιμοποιούμενα
αντιβιοτικά και ευαίσθητο στο άλλο, ενώ μόνο τα προϊόντα της διασταύρωσης θα είναι ανθεκτικά και στα δύο
αντιβιοτικά. Οι διασταυρώσεις μέσω κυτταρικών επαφών στα βακτήρια ονομάζονται συζεύξεις (conjugations),
και οι ‘γονείς’, δότης (donor) και δέκτης (recipient) γενετικού υλικού. Το κύτταρο - δέκτης αποκτά μέσω της
σύζευξης γενετικό υλικό από το κύτταρο - δότη και ονομάζεται κατά τη γενετική ορολογία ‘μετασυζευγμένο’
(transconjugant) (: παρατηρείστε σ’ αυτήν τη διαδικασία τη διαφορά από τις φυλετικές διασταυρώσεις των

46
ανώτερων ευκαρυωτικών, π.χ.). Kατά συνέπεια, το πείραμα είναι σχεδιασμένο έτσι ώστε μόνο τα
μετασυζευγμένα κύτταρα, που έχουν προσλάβει γονίδιο ανθεκτικότητας μέσω της διασταύρωσης, να μπορούν
να αναπτυχθούν στο τρυβλίο και όχι οι γονείς. Για να επιβεβαιωθεί η επιτυχία του πειράματος, στο τρυβλίο,
εκτός της διασταύρωσης, θα γίνει και έλεγχος έκαστου γονεϊκού στελέχους ξεχωριστά (αρνητικοί μάρτυρες
πειράματος). Τα εμβόλια των μαρτύρων και της διασταύρωσης θα γίνουν με μικρές ευθείες γραμμές (streaks
των ~2 cm), παρμένες από έκαστη γονεϊκή καλλιέργεια με αποστειρωμένο κρίκο, όπως δείχνει η Εικόνα 4.

Εικόνα 4. Πειραματική διάταξη συζευκτικής διασταύρωσης

ανάμεσα σε βακτηριακά στελέχη (στο κέντρο του τρυβλίου)
και έλεγχος έκαστου γονεϊκού στελέχους εκατέρωθεν, ως
μάρτυρα του πειράματος σύζευξης.

Στην επόμενη άσκηση θα παρατηρηθεί και καταγραφεί το αποτέλεσμα όλου του τμήματος και θα
αποφανθείτε ποιο ή ποια από τα στελέχη που σας δόθηκαν είναι συζευκτικό/ά, ποιο ή ποια δεν είναι, πού
εντοπίζεται η συζευκτική ιδιότητα και η πλήρης εικόνα του πειράματος.

Δ) Θα πραγματοποιηθεί ή συζητηθεί εικονοποιημένο πείραμα που καταδεικνύει τις αλληλεπιδράσεις

μεταξύ διαφορετικών βακτηριακών στελεχών με αντιμικροβιακές – ανταγωνιστικές ιδιότητες.

Στα πειράματα της Άσκησης 8 θα ακολουθήσετε ρουτίνα μικροβιολογικής εργασίας σε ασηπτικές

συνθήκες: εργασία κοντά σε αναμμένο λύχνο, τρυβλία που εμβολιάζονται με καπάκια μισάνοιχτα, αποφυγή
ρευμάτων αέρα κατά τους εμβολιασμούς, αποφυγή μόλυνσης των κωνικών ή των δοκιμαστικών σωλήνων που
φέρουν καλλιέργειες (προσοχή στους χειρισμούς των πωμάτων), καυτηριασμός των μέσων των εμβολιασμών
(ράβδων, κρίκων και πιπεττών), σύμφωνα με τις οδηγίες των υπευθύνων.

47
 9η ΑΣΚΗΣΗ
Γενετική Μικροοργανισμών ΙV

Η γενετική βάση της ανθεκτικότητας σε αντιμικροβιακούς παράγοντες:

μοριακοί στόχοι των αντιβιοτικών, μηχανισμοί ανθεκτικότητας, χρωμοσωμική και εξωχρωμοσωμική
κληρονομικότητα γονιδίων ανθεκτικότητας, οριζόντια μεταφορά γονιδίων, γονιδιακή επαγωγή

(1) Καταγράφετε και αξιολογείτε τα αποτελέσματα του μέρους (Β) της Άσκησης 8 ως τμήμα.

Αποφαίνεστε για τους γονότυπους των στελεχών που σας δόθηκαν με χαρακτηρισμούς + ή r (resistant), - ή s
(sensitive), π.χ. AprSmrKms… κ.ο.κ.
Τυπική εικόνα ανθεκτικότητας ή ευαισθησίας σε αντιβιοτικά στις συγκεκριμένες δοκιμασίες με
διαβαθμισμένα τρυβλία (ευαίσθητο στέλεχος, κάτω αριστερά):

(2) Καταγράφετε τις ζώνες καταστολής του μέρους (Α) της Άσκησης 7 ως τμήμα: μέγεθος διαμέτρου σε mm
(χρειάζεται χάρακας!) και εικόνα ζώνης: διαυγής (έστω τύπου Α), ανύπαρκτη (έστω τύπου Δ), με μεταλλαγές
ή όχι εσωτερικά της ζώνης (λίγες ή πολλές – έστω τύπου Β (< 3-4) ή Γ (>4)). Παρατηρείτε άλλες τυχόν
ιδιαιτερότητες. Ελέγχετε την εικόνα στα κοινά αντιβιοτικά (Α) και (Β) μέρους Άσκησης 7. Συζήτηση.

Τυπική εικόνα ζωνών καταστολής, διαυγών ή με μεταλλαγές (στα δισκία CAR και RD δεξιά):

48
(3) Καταγράφετε ως τμήμα το συζευκτικό αποτέλεσμα (μέρος (Γ) Άσκησης 7) και αποφαίνεστε περί των
ιδιοτήτων των διαφόρων στελεχών που σας δόθηκαν.
Παράδειγμα εμφάνισης μετασυζευγμένων στην εικόνα αριστερά στο
σημείο της διασταύρωσης. Εδώ φαίνεται τάπητας βακτηριακής
ανάπτυξης, αλλά μπορεί η ανάπτυξη στο σημείο αυτό να έχει
οποιοδήποτε σχήμα ή να παρατηρήσετε διακριτές αποικίες.

(4) Καταγράφετε και συζητείτε το μέρος (Δ) της Άσκησης 8

(5) Παραδίδετε έκθεση των αποτελεσμάτων της ομάδας σας (ζεύγους φοιτητών) ή και των συνολικών του
τμήματος όπου χρειάζεται, με κριτικό σχολιασμό.
Με το τέλος των Ασκήσεων 8 και 9 καλείστε να έχετε εξοικειωθεί με τα θέματα της αντιμικροβιακής
δραστηριότητας των μικροοργανισμών, των τρόπων δράσης των αντιβιοτικών και των μηχανισμών
ανθεκτικότητας των κυττάρων, καθώς και ποσοτικών, πληθυσμιακών και περιβαλλοντικών στοιχείων που
παίζουν ρόλο στην έκφραση ευαισθησίας ή ανθεκτικότητας. Επίσης, με έννοιες όπως η οριζόντια μεταφορά
γονιδίων, η φύση των βακτηριακών γονιδιωμάτων και οι διαφοροποιήσεις στη γονιδιακή έκφραση κατόπιν
ερεθισμάτων.
Αναπ. Καθ. Αικ. Μ. Παππά

49
 10η ΆΣΚΗΣΗ: ΤΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΣΤΟΝ ΠΛΗΘΥΣΜΟ
Β. Κουβέλης

Στα προηγούμενα εργαστηριακά μαθήματα όταν μιλούσαμε για διασταυρώσεις αναφερόμασταν πάντα
σε συγκεκριμένες πειραματικές διασταυρώσεις. Στη φύση όμως οι διασταυρώσεις γίνονται τυχαία μέσα
στον πληθυσμό και τα γονίδια είναι σταθερά στις διαδοχικές γενιές εκτός εάν συμβούν μεταλλάξεις,
μετανάστευση ή επίδραση της φυσικής επιλογής. Εκείνοι που αλλάζουν από γενιά σε γενιά είναι οι
γονότυποι των ατόμων, οι οποίοι διαφοροποιούνται από γενιά σε γενιά.
Η Γενετική Πληθυσμών είναι ο κλάδος της Γενετικής που μελετά τις συχνότητες των γονιδίων και
γονοτύπων σ’ έναν πληθυσμό σε σχέση με τους παράγοντες που τις επηρεάζουν.
Στην άσκηση αυτή θα σας δοθούν οι βασικές αρχές της Γενετικής Πληθυσμών και θα μελετηθεί
υποθετικό παράδειγμα της επίδρασης της Φυσικής επιλογής σε ένα γονίδιο του Πληθυσμού.

Έστω ότι έχουμε ένα διπλοειδικό οργανισμό και μια γενετική θέση με τα δύο αλληλόμορφα γονίδια Α,
α. Η συχνότητα του αλληλομόρφου Α στον πληθυσμό συμβολίζεται με ρ και η συχνότητα του
αλληλομόρφου α συμβολίζεται με q.
Επειδή αναφερόμαστε σε ένα γονίδιο ισχύει:
p+q=1

Αν αναπτύξουμε το διώνυμο στο τετράγωνο έχουμε:

(p + q)2 = p2 + 2pq + q2 = 1

Όπου: p2 = P, αντιπροσωπεύει τη συχνότητα των ζυγωτών ΑΑ

2pq = Η, αντιπροσωπεύει τη συχνότητα των ζυγωτών Αα
q2 = Q, αντιπροσωπεύει τη συχνότητα των ζυγωτών αα.

Οι συχνότητες των γονιδίων Α και α στον πληθυσμό μπορούν να υπολογιστούν από τις σχέσεις:

𝛢𝛼+2 (𝛢𝛢) 𝛢𝛼+2 (𝛼𝛼)

Α = 2 (𝛢𝛢+𝛢𝛼+𝛼𝛼) α = 2 (𝛢𝛢+𝛢𝛼+𝛼𝛼)

όπου ΑΑ, Αα, αα: αριθμός ατόμων στον πληθυσμό.

Μέρος Α

Κάθε ζευγάρι της τάξης έχει συνολικά 100 χάντρες που αντιπροσωπεύουν ένα αλληλόμορφο κάποιου
γονιδίου, έστω Α (Α, α), σ’ έναν πληθυσμό. Οι 60 από αυτές είναι άσπρες και θεωρούμε ότι είναι το
επικρατές γονίδιο Α και οι 40 είναι κόκκινες και αντιπροσωπεύουν το υπολειπόμενο αλληλόμορφο α.
Επομένως οι συχνότητες των δύο αλληλομόρφων Α και α διαφέρουν και είναι:

Α = p = 0.6 και α = q = 0,4

50
Οι 100 χάντρες βρίσκονται σε ένα ποτήρι. Σκεπάζοντας το και παίρνοντας κάθε φορά τυχαία δύο από
αυτές να καταγράψετε το γονότυπο του ατόμου που σχηματίσθηκε. Π.χ. αν πάρουμε μια άσπρη και μια
κόκκινη χάντρα έχουμε γονότυπο Αα. Αν το επαναλάβουμε 100 φορές έχουμε συνολικά 100
γονότυπους από τυχαίους συνδυασμούς των δύο αλληλομόρφων που αντιπροσωπεύουν 100 απογόνους.
Από τα αποτελέσματα που θα πάρει το κάθε ζευγάρι θα πρέπει να υπολογίσετε τις συχνότητες
γονοτύπων και γονιδίων μέσα στον πληθυσμό.

𝜎𝜐𝜈𝜊𝜆𝜄𝜅𝜊ί 𝛢𝛢 𝜎𝜐𝜈𝛿𝜐𝛼𝜎𝜇𝜊ί
Συχνότητα ΑΑ = 𝜎𝜐𝜈𝜊𝜆𝜄𝜅𝜊ί 𝜎𝜐𝜈𝛿𝜐𝛼𝜎𝜇𝜊ί 𝛢𝛢+𝛢𝛼+𝛼𝛼

𝜎𝜐𝜈𝜊𝜆𝜄𝜅𝜊ί 𝛢𝛼 𝜎𝜐𝜈𝛿𝜐𝛼𝜎𝜇𝜊ί
Συχνότητα Αα = 𝜎𝜐𝜈𝜊𝜆𝜄𝜅𝜊ί 𝜎𝜐𝜈𝛿𝜐𝛼𝜎𝜇𝜊ί 𝛢𝛢+𝛢𝛼+𝛼𝛼

𝜎𝜐𝜈𝜊𝜆𝜄𝜅𝜊ί 𝛼𝛼 𝜎𝜐𝜈𝛿𝜐𝛼𝜎𝜇𝜊ί
Συχνότητα αα = 𝜎𝜐𝜈𝜊𝜆𝜄𝜅𝜊ί 𝜎𝜐𝜈𝛿𝜐𝛼𝜎𝜇𝜊ί 𝛢𝛢+𝛢𝛼+𝛼𝛼

𝛢𝛼+2 (𝛢𝛢)
Συχνότητα Α = 2 (𝛢𝛢+𝛢𝛼+𝛼𝛼)

𝛢𝛼+2 (𝛼𝛼)
Συχνότητα α = 2 (𝛢𝛢+𝛢𝛼+𝛼𝛼)

Οι θεωρητικά αναμενόμενες συχνότητες των γονοτύπων ΑΑ, Αα και αα μπορούν να υπολογιστούν από
την εξίσωση p2 + 2pq + q2 = 1 όπου p = 0.6 και q = 0,4.

Σημειώστε τα αποτελέσματα σας στον πίνακα της τελευταίας σελίδας.

Συγκρίνετε τις θεωρητικά αναμενόμενες τιμές με αυτές που έχετε υπολογίσει πειραματικά.
Επαναλάβατε όπως στο πρώτο μέρος αφού αποσύρετε ένα αριθμό από τις κόκκινες χάντρες που θα σας
αναφερθεί στην τάξη.
Απαντήστε στις ερωτήσεις της τελευταίας σελίδας.

Μέρος Β

Το φαινυλο-θειοκαρβαμίδιο (PTC) είναι μια ουσία που έχει την ιδιότητα να είναι πικρή στη γεύση για
την πλειοψηφία των ανθρώπων.
Όμως υπάρχουν άτομα που για την ουσία αυτή δεν έχουν γεύση. Η ικανότητα γεύσης ελέγχεται
γενετικά από ένα γονίδιο T, t. Άτομα με γονότυπο TT ή Tt έχουν γεύση για το PTC ενώ άτομα με
γονότυπο tt δεν έχουν γεύση.
Η γεύση του PTC για την πλειοψηφία των ανθρώπων είναι πικρή αλλά υπάρχουν και άτομα που έχουν
ξινή, γλυκιά ή αλμυρή. Επίσης η ικανότητα γεύσης εξαρτάται από τη συγκέντρωση του PTC η οποία
ποικίλει στους διάφορους πληθυσμούς. Έτσι λοιπόν μπορούμε να πούμε ότι το γονίδιο το υπεύθυνο για
την ικανότητα γεύσης στο PTC παρουσιάζει διαφορετική εκφραστικότητα.

51
Εκτός από το PTC υπάρχουν και άλλες χημικές ουσίες όπως το θειοκαρβαμίδιο, η θειουρία που
προκαλεί εμετική γεύση και το βενζοϊκό νάτριο που προκαλεί πικρή, ξινή, γλυκιά ή αλμυρή γεύση.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Θα δοθούν στον καθένα από εσάς 10 δοκιμαστικοί σωλήνες με διαλύματα PTC αυξανόμενης
συγκέντρωσης (αριθμημένοι 1-10). Με τη βοήθεια πιπέτας Pasteur, ξεκινώντας από την αραιότερη
συγκέντρωση (δοκιμαστικός σωλήνας Νο 1), θα δοκιμάσετε τα διαλύματα μέχρι να νιώσετε την πικρή
γεύση (ή όποια άλλη γεύση – αναφέρετε τυχόν διαφορετική γεύση). Σημειώνετε σε ποια συγκέντρωση
αρχίζει η αίσθηση της γεύσης. Στη συνέχεια θα συγκεντρωθούν τα αποτελέσματα της τάξης και με βάση
αυτά να υπολογίσετε τη συχνότητα των γονιδίων και γονοτύπων για τον πληθυσμό της τάξης (ερώτηση
5 στην παρακάτω σελίδα).

52
 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ – ΑΣΚΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ

Τμήμα: Ομάδα:

Ονοματεπώνυμα: Α. Μ.

Αποτελέσματα ομάδας:

Γενιά Αρ. Γονοτύπων Συχνότητες γονοτύπων Συχνότητες γονιδίων

ΑΑ Αα αα P H Q p q
1.
2.
3.

Αποτελέσματα Τμήματος:

Γενιά Αρ. Γονοτύπων Συχνότητες γονοτύπων Συχνότητες γονιδίων

ΑΑ Αα αα P H Q p q
1.
2.
3.

Ερωτήσεις
Μέρος Α

1. Ποιές είναι οι συχνότητες των φαινότυπων [Α], [α], για κάθε γενιά (αποτελέσματα τμήματος).
2. Συγκρίνετε τις παρατηρηθείσες συχνότητες γονιδίων με τις θεωρητικά αναμενόμενες (για την
πρώτη μέτρηση).
3. Τι παρατηρείτε στις συχνότητες των γονιδίων Α και α με την επίδραση της φυσικής επιλογής.
4. Το γονίδιο α θα εξαφανιστεί αν η φυσική επιλογή συνεχίσει να δρα εναντίον του. Αιτιολογείστε
την απάντηση σας.
Μέρος Β
5. Με ποια συχνότητα εμφανίζεται ο φαινότυπος [ t ].

53