Pichanee Chaweekulrat MD.

Thalassemia and abnormal Hb

ความผิดปกติของ Hb แบ่งออกเป็ น 2 ลักษณะ คือ

1. ความผิดปกติเชงิ ปริมาณ ทำให ้มีการผลิต globin chain ชนิดใด

ชนิดหนึง่ (หรือมากกว่าหนึง่ ชนิด) ลดลง เรียกว่า thalassemia

สร ้าง α-globin ลดลง เรียกว่า α-thalassemia

สร ้าง β-globin ลดลง เรียกว่า β-thalassemia
 Thalassemia and abnormal Hb
ความผิดปกติของ Hb แบ่งออกเป็ น 2 ลักษณะ คือ

2. ความผิดปกติเชงิ คุณภาพ ทำให ้มี abnormal Hb ทีพ

่ บบ่อยและ
สำคัญในประเทศไทย คือ Hb E

• เกิดจาก missense mutation

ของ β-globin gene

• เกิด Hb E ทีไ่ ม่เสถียร และมี

การสร ้าง β-globin ลดลง
 Thalassemia and abnormal Hb
• มีอาการแสดงทีห ่ ลากหลาย ตัง้ แต่ไม่มอ ี าการ, ภาวะซดี เล็กน ้อย,
ภาวะซดี รุนแรง ร่วมกับตัวเหลือง ตับม ้ามโต หรือ เสยี ชวี ต
ิ

Hydrops fetalis
 Thalassemia screening test

• เพือ
่ คัดแยกผู ้ทีเ่ ป็ นพาหะออกจากคนปกติ

วิธท
ี น
ี่ ย ้ จจุบน
ิ มใชในปั ั มี 3 วิธ ี ดังนี้

1. การตรวจค่าดัชนีเม็ดเลือดแดง

2. DCIP precipitation test

3. One tube osmotic fragility test (OF Test)

การตรวจค ัดกรองในปัจจุบ ันจะใช ้ 2 วิธรี ว่ มก ันคือ MCV

หรือ OF Test ร่วมก ับ DCIP
 Thalassemia screening test
1. การตรวจค่าด ัชนีเม็ดเลือด
แดง
• ทีส
่ ำคัญคือ MCV (mean corpuscular volume) ซงึ่ บอกขนาดของเซลล์เม็ด
เลือดแดง

• ผู ้ป่ วยและสว่ นใหญ่ของผู ้ทีเ่ ป็ นพาหะธาลัสซเี มีย จะมีคา่ MCV น ้อยกว่า 80

fL (normal 80-100 fL)

• ภาวะโลหิตจางอืน ่ ๆ ทีท ่ ภาวะขาดธาตุ

่ ำให ้เม็ดเลือดแดงมีขนาดเล็กลง เชน
เหล็ก จะทำให ้มีคา่ MCV ต่ำได ้เชน ่ เดียวกัน
• ค่า MCV ห ้อง lab พยาธิวท ิ ยาคลินค ิ จะวิเคราะห์ให ้
 Lab ทีต ้ งทำว ันนี้
่ อ

Thalassemia screening test

1.subject 1 คน/โต๊ะ

2.unknown 2 หลอด/ห ้อง (unknown 1, unknown 2)

 Lab ทีต ้ งทำว ันนี้
่ อ
Thalassemia screening test

1.DCIP precipitation test

2.One tube osmotic fragility test (OF Test)

 Blood sample preparation
Subject 1 คน/โต๊ะ

1.เจาะเลือดจากปลายนิว้ โดยใช ้ lancing device ใสใ่ น capillary tube

อุปกรณ์ทใี่ ช ้
- lancing device และ lancet
-Capillary tube (hematocrit tube)
lancet 2 หลอด
-Eppendorf tube
-ถุงมือ
-สำลีแห ้ง
-70% alcohol
lancing device -ทีท
่ งิ้ ขยะ
 Blood sample preparation
วิธก
ี ารประกอบ lancing device และ lancet

1 2
ปรับความลึก (ระดับ 3-4) ใส่ lancet เข ้าทีป
่ ลายของ lancing device

3 4
ดึง lever ขึน
้ ถอดปลอก lancet ออก

5
จรดทีป
่ ลายนิว้ แล ้วเจาะเลือดโดยกดปุ่ ม push
 Blood sample preparation
Subject 1 คน/โต๊ะ

1.เจาะเลือดจากปลายนิว้ โดยใช ้ lancing device ใสใ่ น capillary tube

- ใชส้ ำลีชบ ุ แอลกอฮอล์เชด ็ บริเวณปลายนิว้

ทีจ
่ ะทำการเจาะเลือด รอจนแห ้ง
- ใช ้ lancing device เจาะเลือดจากนิว้ กลาง
หรือนิว้ นางห่างจากปลายเล็บประมาณ 4-5 มม.
แล ้วเชด ็ เลือดหยดแรกออกด ้วยสำลีแห ้ง
- ค่อยๆบีบไล่เลือดไปทีบ ่ ริเวณปลายนิว้ ให ้เข ้า
ไปใน capillary tube ให ้ได ้ 2 หลอด
(ปริมาณ~ 3/4 ของหลอด)
- ใชส้ ำลีกดห ้ามเลือดบริเวณปลายนิว้ ประมาณ
5 นาที
 Blood sample preparation

่ งในหลอดบรรจุสารตัวอย่าง (eppendorf tube)

2. นำเลือดใสล
Blood sample preparation
 Thalassemia screening test
1. DCIP precipitation test

• ใชทดสอบ
้ Hb ผิดปกติชนิดต่างๆ
• โครงสร ้างของ Hb E ไม่แข็งแรง
• Hb E ทำปฏิกริ ย ิ าก ับ DCIP reagent ได้งา่ ยและเร็วกว่า Hb
ชนิดอืน่ ถูกออกซไิ ดซไ์ ด ้เป็ นโกลบินสายเดีย ่ วทีม
่ ห
ี มู่ sulfhydryl
(-SH) เกิดเป็ นตะกอน
• ให ้ผลบวกกับ test นี้ 100%
• Hb H(4), Hb Bart’s(4) อาจทำให ้ขุน ่ เล็กน ้อยได ้
 Thalassemia screening test
1. DCIP precipitation test : Kit reagent ทีใ่ ช ้

KKU-DCIP-Clear Reagent Kit - KKU-DCIP reagent 2 ml

- Clearing solution
 Thalassemia screening test
1. DCIP precipitation test : วิธท
ี ท
ี่ ดสอบ

1. ใช ้ automatic pipette ดูดเลือด 20 μl ใสใ่ น KKU-DCIP reagent 2 ml

2. ผสมโดยพลิกกลับไปมา 2-3 รอบให ้เข ้ากัน

3. แชใ่ น water bath ที่ 37°C นาน 15 นาที

4. เติม clearing solution 20 μl แล ้วทิง้ ไว ้ 3 นาที จึงอ่านผล

 Thalassemia screening test
2. DCIP precipitation test : การอ่านผล

ผลบวก สารละลาย
ขุน
่
ผลลบ สารละลาย
ใส
 Thalassemia screening test
2. One tube osmotic fragility test (OF Test)
• วัดปริมาณการแตกของเม็ดเลือดแดงใน hypotonic saline solution (0.36%
NaCl)
• การแตกของเม็ดเลือดแดง(Osmotic fragility) ขึน้ อยูก
่ บ
ั
อัตราสว่ นของพืน
้ ทีผ
่ น ังเซลล์ตอ
่ ปริมาตรเซลล์
หรือ surface-to-volume ratio
• เม็ดเลือดแดงปกติ จะแตกหมด แต่เม็ดเลือดแดงของผูป ้ ่ วย หรือผูท
้ เี่ ป็น
พาหะ จะแตกไม่หมด

• ไม่สามารถแยกธาลัสซเี มียออกจากภาวะโลหิตจางจากการธาตุเหล็กได ้
 Thalassemia screening test
2. One tube osmotic fragility test (OF Test) : ผลการทดสอบ

Positive

• ผู ้ป่ วยโรค thalassemia และ homozygous Hb E ให ้ผลบวก 100%

• β-thalassemia trait ให ้ผลบวก 90%
• α-thalassemia 1 trait ให ้ผลบวก 93%
• พบในภาวะอืน ี างเชน
่ ทีเ่ ม็ดเลือดแดงมีการติดสจ ่ เดียวกับโรคธาลัสซเี มีย
เชน ่ ภาวะซด ี จากการขาดธาตุเหล็ก

False Positive
• มีผลบวกลวงกับคนปกติ 5%
 Thalassemia screening test
2. One tube osmotic fragility test (OF Test) : วิธท
ี ดสอบ

1. ใช ้ automatic pipette ดูดเลือด 20 μl ใสใ่ น KKU-OF reagent 2 ml

2. ผสมโดยพลิกกลับไปมา 2-3 รอบให ้เข ้ากัน

3. ตัง้ ทิง้ ไว ้ทีอ

่ ณ
ุ หภูมห
ิ ้อง 30 นาที แล ้วอ่านผล
 Thalassemia screening test
2. One tube osmotic fragility test (OF Test) : การอ่านผล

ผลบวก ่ สว่ นใหญ่ของเม็ดเลือดแดงผูป

สารละลายขุน ้ ่ วยแตก
ไม่หมด
ผลลบ ี ดง เม็ดเลือดแดงคนปกติแตกหมด
สารละลายใสสแ
 Confirmatory test

1. Hemoglobin typing
2. Iron studies : serum ferritin, serum iron, total
iron binding capacity (TIBC)
Thalassemia screening test

• บันทึกผลการทดลองของ subject
และ unknown ลงในคูม ่ อ
ื ปฏิบต
ั ิ
การของตนเอง
• ดูคา่ ดัชมีเม็ดเลือดแดงของ
unknown จากอาจารย์ประจำห ้อง
แล ้วแปรผล
• กรอกข ้อมูลลงในตารางบันทึกผล
การทดลองประจำห ้อง
(ตามความสมัครใจ)
 Timeline

• 8.00 – 8.40 น. Talk lab และทำ lab

• 8.40 – 8.50 น. แบบฝึ กหัด
(ให้ นกั เรี ยนแบ่งกลุม่ ละ 2 โต๊ ะ+แจกใบงานชุดที่ 1)
• 8.50 – 9.15 น. ให้ นกั ศึกษาในแต่ละห้ องปฏิบตั ิการนำแบบฝึ กหัดมา
อภิปรายร่วมกัน
• 9.15 – 12.00 น. KSA blood protein and hemoglobin