MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA

GENETIČKIH POREMEĆAJA

Adriana Bobinec, mag.biol.mol.; Ana-Maria Ivankov, mag.biol.mol.

Klinika za dječje bolesti Zagreb

Referentni centar Ministarstva zdravstva RH za praćenje kongenitalnih

anomalija
 Metode genetičkog testiranja
• Molekularne metode:
• Sekvenciranje (po Sangeru, NGS)
• DNA hibridizacija (MLPA)
• Digestija restrikcijskim enzimima (RFLP)

• Standardne i molekularne citogenetičke metode:

• Klasična kariotipizacija
• FISH (Fluorescence In-Situ Hybridization)
• Molekularna kariotipizacija: kromosomski microarray (CMA) ili
array Comparative Genomic Hybridization (aCGH)
 Genetički poremećaji

• Monogenski
• Mutacije
• Autosomne i X-vezane
• Dominantne i recesivne
• Kromosomski
• Brojčani (aneuploidije i poliploidije)
• Strukturni
• Multifaktorijalni
 Strukturne kromosomske promjene
• Uzrok: kromosomski lomovi
• Tijekom umnožavanja DNA:
• Delecije

• Duplikacije

• Tijekom crossingover-a u mitozi/mejozi:

• Inverzije

• Translokacije
 Strukturne kromosomske promjene
• Balansirane promjene: inverzije i balansirane translokacije
• Nebalansirane promjene (višak/manjak genetičkog materijala):
delecije, duplikacije i nebalansirane translokacije
 Metode analize strukturnih
kromosomskih promjena
• Kvalitativne i kvantitativne citogenetičke i molekularne metode:
• Kariotipizacija i FISH
• Detektiraju: promjene broja kromosoma, balansirane i
nebalansirane promjene

• Kvantitativne molekularne citogenetičke metode:

• MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
• Kromosomski microarray (CMA)
• Otkrivaju višak ili manjak genetičkog materijala (nebalansirane
promjene)
• Ne otkrivaju prirodu poremećaja i balansirane promjene
 Kariotipizacija
• Analiza obojenih kromosoma pomoću svjetlosnog mikroskopa u
metafazi/prometafazi
• Postupak: kultivacija staničnih kultura, zaustavljanje diobe u
metafazi/prometafazi, fiksacija i bojanje Giemsa bojom (G-pruganje), analiza
svjetlosnim mikroskopom i izrada kariotipa
• Bojanjem do izražaja dolaze svjetlije i tamnije pruge osobite za svaki kromosom

46,XX 46,XY
 Kariotipizacija
• Prednosti:
• Strukturna i numerička analiza svih kromosoma
• Detekcija balansiranih i nebalansiranih promjena te mozaika

• Nedostaci:
• Zastarjela tehnika – subjektivna
• Potrebne kulture stanica – dugotrajno, mogućnost kontaminacije...
• Detekcija promjena ≥ 5 Mb
• Nije moguće vidjeti submikroskopske promjene

• Kariotipizaciju polako zamjenjuju kvantitativne molekularne citogenetičke

tehnike: MLPA i kromosomski microarray.
• No nije u potpunosti zamjenjiva – „Zlatni standard” citogenetike
 MEĐUNARODNI SUSTAV NAZIVLJA U HUMANOJ
CITOGENETICI

ISCN – an International System for Human Cytogenomic Nomenclature

• Sustav označavanja u citogenetici za prikazivanje i opisivanje kariotipa čovjeka
upotrebom znakova i kratica
• Zasniva se na dogovoru postignutom na više međunarodnih konferencija

• Kromosomi su podijeljeni na regije i podregije (svijetle i tamne pruge) koje

se označavaju brojevima od centromere prema telomerama
• Autosomni kromosomi se označavaju brojem: 1-22
• Spolni kromosomi se označavaju sa X i Y
• Krakovi kromosoma se označavaju slovima p ("p" za „petit” ili kratki krak) i
q ("q" za „queue” ili dugi krak) počevši od centromere
 MEĐUNARODNI SUSTAV NAZIVLJA U HUMANOJ
CITOGENETICI

Opisivanje pojedine kromosomske regije:

1) Broj kromosoma Telomera

2) Simbol za krak
3) Broj regije (broj podregije)
Centromera

21q22.2 – regija 22.2 na dugom

kraku kromosoma 21

Telomera
IDIOGRAM
-grafički prikaz opruganih kromosoma
Simboli za opisivanje kariotipa
 MEĐUNARODNI SUSTAV NAZIVLJA U HUMANOJ
CITOGENETICI

• ISCN 1978 → ISCN 1981 → ISCN 1985 → ISCN 1991 → ISCN 1995 →
ISCN 2005 → ISCN 2009 → ISCN 2013 → ISCN 2016
 ISCN 2016
• Kariotip:
• 46,XX – uredan ženski
• 46,XY – uredan muški
• 46,XX,t(5;6)(q34;q23)mat
• Oznake za različite tehnike:
• FISH – ish del(22)(q13.3)(ARSA-)
• CGH – cgh
• Sekvenciranje - seq
• Kvantifikacijske tehnike za specifične regije (MLPA)
– rsa 22q11.2(P245)x1

• Kromosomalni microarray – arr

• arr [GRCh37] 22q11.21(18661724-21505417)x1
↙ ↘
referentna genska karta koordinate
čovjeka na kojoj se temelji nalaz promjene
Ukoliko se radi više tehnika analize, pri pisanju nalaza, one se
međusobno odvajaju točkom:

46,XX.arr[GRCh37] 8p23.1(8,479,797-11,897,580)x1.rsa 8p23.1(GATA4)x1

- nalaz kariotipa : normalan ženski kariotip

- CMA nalaz (UCSC 2009, GRCh37 -genska karta): delecija na

kratkom kraku kromosoma 8 u kromosomskom području 8p23.1

- potvrđeno MLPA analizom GATA4 lokusa.

 MLPA

Metoda višestrukog umnažanja vezanih sondi

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
Prvi put opisana: Schouten JP et al. (2002)
Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-
dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. Jun 15;30(12):e57.

Metoda omogućava otkrivanje promjenjenog broja kopija i do

50 DNA slijedova u genomu u jednoj višestrukoj reakciji PCR.
 MLPA

1. Denaturacija

2. Hibridizacija

3. Ligacija

4. Amplifikacija

5. Elektroforetsko razdvajanje
umnoženih probi

6. Analiza rezultata
- dobiveni PCR produkti razdvajaju se kapilarnom elektroforezom
- svaki vršak predstavlja jednu specifičnu umnoženu probu
- vrškovi se vizualno uspoređuju s kontrolnim uzorcima
- razlike u visini/površini pikova upućuju na promjenu u broju kopija ciljane
sekvence probe
- statistička analiza podataka
 Detekcija poznatih mutacija s MLPA

Pogrešno sparivanje Savršeno sparivanje

Mismatch na mjestu ligacije sonde  nema Ligacija dviju oligonukleotidnih dijelova

ligacije, niti produkta umnožavanja sonde  produkt umnožavanja
Mogućnosti primjene MLPA tehnike u dijagnostici genetičkih
poremećaja

Numeričke kromosomske aberacije; kromosomi 13, 18, 21, X, Y

Subtelomerni poremećaji

Mikrodelecijski sindromi

Monogenske bolesti

Točkaste mutacije

Poremećaj metilacije MS-MLPA

Dijagnostika tumora

Genska ekspresija (mRNA) RT-MLPA

 SALSA MLPA P036 SALSA MLPA P070

• SALSA MLPA kitovi P036 i P070 dizajnirani su za

detekciju deleciju/duplikaciju subtelomernih regija svih
kromosoma.
• G pruganjem telomerni krajevi kromosoma su svijetlo
obojeni pa su promjene teško prepoznatljive
konvencionalnom citogenetikom.
Idiogram
 SALSA KOMPLETI ZA POJEDINE
SUBTELOMERE
Subtelomerno područje SALSA MLPA komplet

1p P147 -1p36

4p, 5p, 13q-cen, 14q-cen P358

2p, 3p, 6p, 8p P208 telo-6

9p, 10p, 11p,12p P230 telo-7

17p, 18p, 19p, 20p P249 telo-8

1q,2q, 3q,4q P264 telo-9

5q, 6q, 7q,8q P277 telo-10

9q, 10q, 11q, 12q P286 telo-11

13q, 14q, 15q,16q P291 telo-12

17q,18q,19,20q P320 telo-13

7p, 15q-cen, 16p, 21q-cen, 21q P365 telo-14

22q-cen P356 22q

22q P188 22q

 0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6

0
1
1p TNFRSF4
2p ACP1
3p CHL1
4p FLJ20265
5p PDCD6
6p IRF4
7p CENTA1
8p FBXO25

1,37
9p DMRT1
10p KIAA0934
11p RIC -8
12p SLC6A12
13p PSPC1
14p HEI10
15p MKRN3
16p POLR3K
17p RPH3AL
18p USP14
19p CDC34
20p SOX12
21p RBM11
22p BID
X/Yp SHOX
1q KIAA1720
2q CAPN10
MD9/P036-E1

3q BDH
4q TRIML2
5q GNB2L1
6q PSMB1
7q VIPR2
8q KIAA0150
NALAZ MLPA ANALIZE

9q EHMT1
10q PAO
11q KIAA0056
12q ZNF10
Nalaz (ISCN 2013): rsa 8psubtel(P036)x3,rsa18qsubtel(P036)x1
13q F7
14q MTA1
15q ALDH1A3
Nalaz (ISCN 2009): mlpa 8psubtel(P036)x3,mlpa18qsubtel(P036)x1

16q GAS11
17q TBCD
18q FLJ21172
0,50

19q BC -2
20q OPRL1
21q HMT1
22q RABL2B
X/Yq SYBL1
 1

0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8

0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
CSMD1sonda 8p23.3
TXNL4A sonda 18q23

FLJ20913sonda 8p23.3

TSHZ1 sonda 18q22

CSMD1sonda 8p23.3

ZNF236 sonda 18q23

ANGPT2sonda 8p23.3

ZNF516 sonda 18q23

CSMD1sonda 8p23.3

NFATC1 sonda 18q23

DLGAP2sonda 8p23.3
P208-B1

P320-A1

MBP sonda 18q23

CSMD1sonda 8p23.3
GALR1 sonda 18q23

ARHGEF10sonda 8p23.3
SALL3 sonda 18q23

ANGPT2sonda 8p23.3

rsa 8p23.1(P208)x3,18q23q22.3(P320)x1
MD9

MD9

DLGAP2sonda 8p23.3
CTDP1 sonda 18q23
MAJKA

ZNF407 sonda 18q22.3

CSMD1sonda 8p23.2
MAJKA
OTAC

OTAC

CSMD1sonda 8p23.2
Kariotip bolesnika MD-9 s deriviranim kromosomom18.
Kariotip oca bolesnika MD-9 s balansiranom translokacijom t(8;18)
(p23.1;q22.1).
 SALSA MLPA 245-B1
• SALSA MLPA P245-B1 komplet sadrži sonde za 23 mikrodelecijska sindroma.

Sindrom delecije 1p36 22q13 / Phelan-McDermid Sindrom Prader Willi/Angelman

Mikrodelecija 2p16 Sindrom Cri du Chat MECP2 / Xq28 duplikacija

Mikrodelecija 2q23 Sindrom DiGeorge; 22q11 Sindrom Rubinstein-Taybi

Mikrodelecija 2q33 Mikrodelecija distalne regije 22q11 Sindrom Smith-Magenis

Mikrodelecija 3q29 DiGeorge područje 2, 10p15 Sindrom Sotos

Mikrodelecija 9q22.3 Sindrom Langer-Giedion, 8q Sindrom WAGR

Sindrom delecije 15q24 Sindrom Miller-Dieker, 17p Sindrom Williams

Mikrodelecija 17q21 NF1 mikrodelecijski sindrom Sindrom Wolf-Hirschhorn

 Mikrodelecijski sindromi

SALSA komplet Mikrodelecijski sindrom

P371 15q24 deletion syndrome, 17q21 microdeletion

2p16 microdeletion , Langer-Giedion syndrome, WAGR
syndrome
P372 DiGeorge syndrome, DiGeorge region 2, 10p15
NF1 microdeletion syndrome
Rubinstein-Taybi syndrome
P373 1p36 region, 3q29 region
Cri du Chat syndrome, Phelan-McDermid,
Wolf-Hirschhorn region
P374 Miller-Dieker region, Prader-Willi / Angelman region,
MECP2 / Xq28 duplication
Smith-Magenis region,
Williams syndrome region
 MLPA 22q11.2(P245)x1

MLPA kit P245

1.6

1.4

1.2

0.8
0.01
0.6 0.01 0.01

0.4

0.2

0
 Sindrom fragilnog X
- rijedak genetički poremećaj koji uzrokuje umjerene do teške intelektualne poteškoće, a neke
osobe pokazuju i poremećaje ponašanja
- X vezano dominantno nasljeđivanje sa smanjenom penetrantnošću kod žena
- uzrokovan mutacijom u genima na kromosomu X koji imaju važnu ulogu u razvoju i funkciji
živčanih stanica:

1.) FMR1 (engl. fragile X mental retardation 1) (FMRP, FRAXA) - Xq27.3

2.) AFF2 (FMR2, FRAXE) - Xq28

Područje dugog niza ponavljanja CGG-trinukleotida (tripleta) u promotoru gena FMR1/AFF2

- prema broju CGG ponavljanja, razlikuju se 4 vrste alela: normalni (6-50), intermedijarni (51-58),
premutacijski (59-200) i s punom mutacijom (>200 ponavljanja).

Puna mutacija sprječava prepisivanje FMR1 gena zbog hipermetilacije što kod osoba s ovom
promjenom uzrokuje klasični oblik FXS.
 Methylation specific MLPA
MS MLPA - metoda za otkrivanje mutacija u FMR1 i AFF2 genima na kromosomu X
koja detektira:

1. promjene u broju kopija (dup/del) u genima FMR1 i AFF2

2. metilacijski status promotora ovih gena pomoću metilacijsko specifičnih probi

Određivanje metilacijskog statusa promotora FMR1/AFF2 omogućuje jasno razlikovanje alela

bez mutacije/s premutacijom i onih s punom mutacijom u muških ispitanika, što je čini
pogodnom za metodu probira.
 MS-MLPA

1. Denaturacija

2. Hibridizacija

3. Ligacija i cijepanje RE Hha1

4. Amplifikacija

5. Elektroforetsko razdvajanje
umnoženih probi
 20
40
60
80
100
120

0
20
40
60
80
100
120
AR exon 1
MTM1 exon 3
FMR1 exon 1
AFF2 exon 1
AFF2 exon 1
FMR1 exon 1
FMR1 Intr.1
CDKL5 exon 13
FMR1 exon 1
METILACIJSKI

FANCB exon 1
KONTROLA BEZ PUNE

FMR1 exon 1
FMR1 exon 1
AFF2 Intr.1
PUNA MUTACIJA FMR1
F9 exon 6

AFF2 METILACIJSKA SONDA

FMR1 METILACIJSKA SONDA
FMR1 exon 1

METILACIJSKA SONDA FANCB

AFF2 exon 21
STATUS

FMR1 exon 3
DMD exon 48
AFF2 exon 6

SONDE ZA KONTROLU CIJEPANJA S Hha1

AFF2 exon 1
AFF2 exon 1
COL4A5 exon 23
MS-MLPA ME029-B2 FMR1/AFF2

STS exon 3
AFF2 exon 3
FMR1 exon 17
AFF2 exon 5
MUTACIJEPROMOTORA

IDS exon 5
FMR1exon 5
GPR143 exon 4
AFF2 exon 8
MITF exon 11
AFF2 exon 9
FMR1 exon 7
OPHN1 exon 1
FMR1 exon 15
HDHD1 exon 3
FMR1 exon 9
AFF2 exon 11
FMR1 exon 14
IL1RAPL1 exon 6
AFF2 exon 15
FLNA exon 29
RARB exon 1
EME1 exon 1
OPHN1 exon 21
 MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA RETTOVOG
SINDROMA

• Prevalencija klasičnog RTT kod ženske djece do 15 god.

 1:8.500, X dominantno nasljeđivanje
• Mutacije u genu methyl-CpG-binding protien 2 (MECP2) (Xq28)
najčešći su uzrok RTT
• Gen MECP2 sadrži 4 eksona, kodiraju 3 domene:
Metil CpG-vezujuća domena (MBD)
Transkripcijsko represorska domena (TRD)
C-terminalna domena
 Patološke varijante gena MECP2

• identificirano više od 390 patogenih mutacija - missense,

nonsense, frameshift, splicing mutacije, velike delecije i
rearanžmani
• 50-70% MECP2 mutacija otpada na mutacije u CpG hot-spot
regiji MBD i TRD domene.
• C-terminalna domena je sklona malim delecijama (20-100 pb)
koje leže u hotspot regijama, čine oko 10% svih mutacija
(RettBASE; mecp2.chw.edu.au)
Patološke varijante gena MECP2

• Nedavno su pronađene velike delecije:

- kilobazne veličine, brišu cijele egzone
- u dijelu bolesnika za koje se prije smatralo da
nemaju mutacije u genu MECP2
- češće su kod klasičnog (8% slučajeva) nego
atipičnog (3% slučajeva) RTT.
MOLEKULARNO GENETSKO TESTIRANJE RTT

• Dvosmjerno sekvenciranje cijele kodirajuće regije gena MECP2

otkriva mutacije koje uzrokuju bolest u 70-90% bolesnika s
klasičnim RTT.
• Southernovim otiskom, a u novije vrijeme MLPA tehnikom
detektiraju se velike preraspodjele i delecije gena (kb veličine)
koji se prethodno navedenim metodama probira (post PCR
analiza) ne mogu otkriti.
 0
1

0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
130 Ref 8q24 1,02
136 G DI1 Xq28 1,01
143 CDKL5 ekson 10 1,00
149 NTNG 1 1p13 ekson 1 1,08
154 ARX ekson 2 0,95

1021_1037del17
160 Ref 10q26 0,99
166 SLC6A8 Xq28 0,97
171 IRAK1 Xq28 1,08
178 MECP2 ekson 1 1,14
185 CDKL5 ekson 3 1,01
191 MECP2 ekson 3 1,18
196 Ref 10q21 1,12
202 MECP2 ekson 1 1,05
208 MECP2 ekson 4 1,06
214 MECP2 ekson 1 1,01
221 FVIII Xq28 0,94
231 ARX ekson 5 0,98
238 L1CAM Xq28 0,99
247 MECP2 ekson 2 0,96
256 MECP2 ekson 4 0,90
265 Ref 5q35 0,91
1057_1089del33

274 MECP2 ekson 4 1,10

283 CDKL5 ekson 6 1,00
293 MECP2 ekson 1 0,95
302 NTNG 1 1p13 ekson 5 0,95
310 Ref 13q14 1,08
319 DKC1 Xq28 1,11
326 CDKL5 ekson 15 0,97
337 MECP2 ekson 4 0,52
MECP2. Označene su tri uzastopne male delecije.

346 MECP2 ekson 4 1,16

355 MECP2 ekson 3 0,96
364 Ref 9q34 0,94
373 MECP2 ekson 2 0,87
382 IDH3G Xq28 0,96
400 CDKL5 ekson 9 0,89
409 Ref 13q14 0,89
418 IRAK1 Xq28 0,92
427 NTNG 1 ekson 6 0,90
436 NTNG 1 1p13 ekson 3 0,86
1162_1179del18

445 FLNA Xq28 0,91

453 VAMP7 Xq28-PAR 0,91
463 Ref 11q23 0,90
Rezultat analize djelomičnog slijeda nukleotida eksona 4 gena
 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
130 Ref 8q24 0.01
136 GDI1 Xq28 0.01
143 CDKL5 exon 10 0.01
149 NTNG1 1p13 exon 1 0.01
154 ARX exon 2 0.01
160 Ref 10q26 0.01
166 SLC6A8 Xq28 0.01
171 IRAK1 Xq28 0.01
178 MECP2 exon 1 0.01
185 CDKL5 exon 3 0.01
191 MECP2 exon 3 0.01
196 Ref 10q21 0.01
202 MECP2 exon 1 0.01
208 MECP2 exon 4 0.00
214 MECP2 exon 1 0.01
221 FVIII Xq28 0.01
231 ARX exon 5 0.01
238 L1CAM Xq28 0.01
247 MECP2 exon 2 0.01
256 MECP2 exon 4 0.01
265 Ref 5q35 0.01
274 MECP2 exon 4 0.01
283 CDKL5 exon 6 0.01
293 MECP2 exon 1 0.01
302 NTNG1 1p13 exon 5 0.01
310 Ref 13q14 0.01
del ex 3 – 4.3

319 DKC1 Xq28 0.01

326 CDKL5 exon 15 0.01
337 MECP2 exon 4 0.01
346 MECP2 exon 4 0.01
MLPA P015-E1 MECP2

355 MECP2 exon 3 0.01

364 Ref 9q34 0.01
373 MECP2 exon 2 0.01
382 IDH3G Xq28 0.01
400 CDKL5 exon 9 0.01
409 Ref 13q14 0.01
418 IRAK1 Xq28 0.01
427 NTNG1 exon 6 0.01
436 NTNG1 1p13 exon 3 0.01
445 FLNA Xq28 0.01
453 VAMP7 Xq28-PAR 0.01
463 Ref 11q23 0.01
 MOLEKULARNA ANALIZA GENA GJB2 I GJB6 U OSOBA S
NESINDROMSKIM ZAMJEDBENIM OŠTEĆENJEM SLUHA

• Oštećenje sluha je najčešći nasljedni senzorni poremećaj- 1 na

1000 godišnje rođene djece.
• Poremećaj istog naziva kao i pripadni lokus - DFNB1 (Nonsyndromic hearing
loss and deafness), čini oko 50% urođene, autosomno recesivne NSG u
razvijenim zemljama.
• Na lokusu DFNB1 (13q11-12) smješteni su geni zjapnih veza- GJB2
(od engl. gap junction beta-2) i GJB6 (od engl. gap junction beta-
6) koji kodiraju koneksin 26 odnosno 30. Dio su sustava zjapnih
veza epitelnih stanica i fibrocita u stanicama pužnice
• Dijagnoza DFNB1 potvrđuje se ako se u tim genima otkriju
patogene mutacije
 GEN GJB2

• Sastavljen od dva eksona- cijela kodirajuća regija

smještena u eksonu 2 dužine 681 pb.

• Recesivna mutacija 35delG najučestalija je u većini bijele

populacije Europe i američkih bijelaca

• splice-site mutacija IVS1+1G>A u eksonu 1, jedna je od 10

najčešćih u zemljama Europe. Naročito je učestala u
heterozigotnih osoba za mutacije gena GJB2 u Češkoj,
Turskoj i Mađarskoj
 ANALIZA TOČKASTIH (MALIH) MUTACIJA
METODOM MLPA

MLPA kompletima probi moguće je otkriti:

1.) delecije/duplikacije jednog ili više eksona gena:

GJB2, GJB3, GJB6, WFS1 i POU3F4

2.) točkaste mutacije u genu GJB2

(35delG, 313del14, 235delC, M34T, 167delT i IVS1+1G>A)
 Kapilarna elektroforeza na uzorcima s mutacijama 35delG, 313del14,
IVS1+1G>A, analiziranih SALSA MLPA kompletom P163 GJB C1
zdrava ženska
kontrola
313del14
35delG/
35delG/
35delG
Usporedba MLPA s ostalim tehnikama

1 pb – 10 Mpb
 Prednosti MLPA

Detekcija broja kopija do 50 genomskih DNA sekvenci.

Zahtjeva samo 20 ng humane DNA.

Moguća analiza sekvenci koje se razlikuju u samo jednom nukleotidu.

Identični protokol za puno različitih aplikacija.

Svi reagensi su se pokazali vrlo stabilnima.

Brza tehnička obrada uzoraka omogućava ispitivanje velikog broja bolesnika.

MLPA metodom se može detektirati široki raspon genomskih promjena, od

točkastih mutacija do velikih aberacija (10Mb).
 CMA
(chromosomal microarray)

• Comparative Genomic Hybridization -

Komparativna genomska hibridizacija na
microarray-u
• Služi za detekciju promjena broja kopija u
čitavom genomu (del/dupl, aneuploidije)
• Primjena :
• Analiza submikroskopskih
promjena
• Analiza genomskih abnormalnosti
karcinoma
• Prenatalna dijagnostika
1. DNA izolacija i 2. Hibridizacija 3. Skeniranje 4. Analiza rezultata
obilježavanje obilježene DNA
uzorka i kontrole
 CMA
Prednosti
• Jednostavno uzorkovanje, mala
količina DNA (0.2-0.5 µg)
• Brza i robustna metoda
• Visoka specifičnost i osjetljivost
- 5 Kb - CGH array
- 5 Mb - klasična citogenetika
• Analiza varijacija u broju kopija
DNA na razini cijelog genoma
Ograničenja
Neće detektirati:
• Balansirane kromosomske
rearanžmane (balansirane
translokacije, inverzije),
triploidije, mozaicizme, točkaste
mutacije
• Regije genoma koje nisu
pokrivene probama
GENETSKO TESTIRANJE KOD BOLESNIKA S ID/DD-om, ASD-om ili MCA
Intellectual Delay/Developmental Delay, Autism Spectrum Disorder, Multiple Congenital Anomalies
Intelektualno zaostajanje/razvojno zaostajanje, autistični spektar poremećaja, višestruke kongenitalne anomalije

• kromosomske aberacije su najčešči uzrok ovih poremećaja (5-30%)

• klasična citogenetika:
- prva korištena metoda
- u 15% slučajeva otkriva etiologiju poremećaja
- ispitivanje na razini čitavog genoma, ne otkriva submikroskopske promjene (< 5 Mb)

• MLPA - omogućuje ispitivanje genoma na submikroskopskoj razini, ali samo ciljanih regija
- postupno zamjenjuje klasičnu citogenetiku kao prvi dijagnostički test

• CMA - omogućuje analizu čitavog genoma na submikroskopskoj razini

Pokazalo se da su najčešći uzročnici težih oblika RZ-a, ASD-a i višestrukih kongenitalnih anomalija
autosomno dominantne mikro-duplikacije/delecije nastale de novo.
Blaži oblici ovih poremećaja su najvjerojatnije uzrokovani kompleksnijim oblicima nasljeđivanja –
recesivno nasljeđivanje (genetička pozadina nije dovoljno istražena).
 POSTUPNIK OBRADE BOLESNIKA S ID/DD-om, ASD-om ili MCA

FMR1/AFF2,
Uredan drugi geni,
NGS
Vjerojatno
De novo
patološki
Nositelj, Obiteljska
CMA VOUS
Analiza
roditelja
zdrav varijanta
Nasljeđeno
Nositelj,
Patološki
bolestan

Analiza Nasljeđeno
Potvrdna
Patološki
analiza roditelja
De novo
 Mutacije unutar distrofinskog gena

Veliki gen, 2.5 Mb na Xp21.1, ima 79 eksona

Mutacije dijelimo na:
a) Velike preraspodjele (obuhvaćaju jedan ili više
egzona/introna)
- delecije ~ 65% DMD, do 85% (BMD)
- duplikacije 5 – 10%
b) Točkaste mutacije i male del/dup
- 25 - 30% DMD
- 5 -10% BMD
S KOJOM ANALIZOM ZAPOČETI
DIJAGNOSTIKU?
 0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
1.6
1.8

0
1
2

0
1

0.2
0.4
0.6
0.8
1.2
11 0.01
1 12 0.01
0.01
2 0.01 13 0.01
3 0.01 14 0.01
4 0.01 15 0.01
5 0.01 16 0.01
6 0.01 17 0.01
7 0.01 18 0.01
8 0.01 19 0.01
9 0.01 20 0.01
10 0.01 31 0.01
19

21 0.01 32 0.01
22 0.01 33 0.01
23 0.01 34 0.01
P035-A2 DMD

24 0.01 35 0.01
25 0.01 36 0.01
26 37 0.01
27 38 0.01
28 39 0.01
29 40
1
0.01
30 51 0.01
41 52 0.01
EGZONI

42 53

EGZONI
43
0.01
P034-A2 DMD

54 0.01
44 0.01 55
45 0.02
0.01 56 0.02
46 0.01 57 0.02
47 0.01 58 0.0
48 0.01 59 0.02
49 0.01 60 0.02
50 0.01
61 71 0.01
0.01 72
62 0.01 0.01
63 73 0.01
0.01 74
64 0.01 0.01
65 75 0.01
0.01
66 76 0.01
0.01
67 77 0.01
0.01
68 0.01 78 0.01
Dup E55 – E63

Del E26 – E43

69 0.01 79 0.01
70 0.01 DP427C 0.01
Korisne mrežne stranice:

• NCBI
• GeneReviews – Molecular Genetics
• PubMed
• OMIM
• Genetics Home Reference
• OrphaNet – baza rijetkih bolesti
• DECIPHER
• UCSC
• DGV – baza benignih varijanti broja kopija u populaciji
• MRC-Holland
• MLPA kompleti probi