IMUNOFENOTIPIZACIJSKA DETERMINACIJA

SPECIFIČNIH KLINIČKIH SLE I RA FENOTIPOVA

PROTOČNA CITOMETRIJA
 Imunofenotipizacija
• Imunofenotipizacija je zasnovana na
multiparametijskoj-protočnoj citometriji koja
omogućuje karakterizaciju stanica na osnovu
antigena koji se nalazi na stanici ili u jedru.
Protočna citometrija otvara mogućnost
mjerenja svojstava velikog broja molekularnih
parametara u heterogenim staničnim
populacijama.
Protočni citometar-BD FACS CANTO II
Princip protočne citometrije
FSC detektor
Side Scatter, Right Angle Scatter), nastalo raspršno svijetlo koje je
približno pod pravim kutom u odnosu na lasersku zraku ovisi o
veličini i granulaciji stanica.
 Shematski i realni prikaz Dot-Plot analiza

Zelena nakupina stanica odgovara Ovako izgleda Dot-Plot na protočnom

Limfocitima (mali, malo granula),
plava skupina su monociti (veliki,
malo granula) i roza skupina su ne-
utrofilni granulociti (veliki sa mnogo
granula).
citometru. Svaka točka odgovara jednoj
stanici. Boje se pri analizi dodijeljuju pojedi-
načnim stanicama.
 Obilježavanje T i B limfocita.

Mjerenje T i B limfocita. Zeleno svijetlucava stanica je CD3-FITC obilježeni

T-limfocit, (žuto)crvena svijetlucava stanica je CD19-PE B-limfocit.
 RA
Parametar Rezultat FC pretrage Referentne
vrijednosti (%)

CD3(T Ly) 85,2 59-85

CD4(Th) 39,8 30-59

CD8(CTL) 33,5 11-38

CD4(Th):
CD8(CTL)
CD19(B Ly) 6,8 6,4-23

CD16+56 ( NK) 6,8 5,6-31

 RA
Parametar Rezultat FC pretrage Referentne
vrijednosti ( % )

CD3(T Ly) 90,9 59-85

CD4(Th) 53,6 30-59
CD8(CTL) 36,8 11-38
CD19(B Ly) 3,9 6,4-23
CD16+56 5,7 5,6-31
( NK)
 RA
Parametar Rezultat FC pretrage Referentne
vrijednosti ( % )

CD3(T Ly) 90,9 59-85

CD4(Th) 53,6 30-59

CD8(CTL) 36,8 11-38

CD19(B Ly) 3,9 6,4-23

CD16+56 ( NK) 5,7 5,6-31

 SLE
Parametar Rezultat FC pretrage Referentne
vrijednosti ( % )

CD3(T Ly) 65,3 59-85

CD4(Th) 30,8 30-59

CD8(CTL) 30,5 11-38

CD19(B Ly) 45,4 6,4-23

CD16+56 ( NK) 6,8 5,6-31

 SLE
Parametar Rezultat FC pretrage Referentne
vrijednosti ( % )

CD3(T Ly) 65,3 59-85

CD4(Th) 30,8 30-59
CD8(CTL) 30,5 11-38
CD19(B Ly) 45,4 6,4-23
CD16+56 ( NK) 6,8 5,6-31
 Ostali parametri koji su uzeti u obzir prilikom selekcije
pacijenata za imunofenitipizacijske analize
Uzorak Anti-ds- ACA-G ACA-M Beta-2-G Beta-2-M Sm/RNPs
DNA
1(SLE) + 26,50 (P) 3,59 3,65 5,52 73,87 (P)
2 + 5,43 3,35 2,45 1,37 141,8(P)
3(RA) + 49,14(P) 17,45(P) 3,18 5,18 5,47
4(RA) + 13,33(P) 11,12(P) 1,98 1,74 3,11
5 + 12,42(P) 3,27 3,47 1,36 2,31
6 + 2,48 1,54 1,78 1,74 3,49
7(SLE+RA) + 7,41 29,15(P) 4,51 1,82 47,03(P)
8 + 8,83 27,61 4,73 1,64 119,2(P)
9(SLE) + 28,60(P) 11,25(P) 2,77 2,48 151,9(P)
10 + 3,83 1,89 2,77 1,84 9,52
11 + 6,08 3,43 1,80 2,70 5,43
12 + 7,06 6,71 1,78 1,63 62,21
13(RA) + 11,35(P) 17,65(P) 7,74 8,19 2,22
14(SLE) + 13,33(P) 21,73(P) 3,86 1,41 119,3(P)
15 + 8,04 6,55 4,39 1,64 1,32
16(OS) + 32,97(P) 29,86(P) >100(P) 29,49(P) 1,19
17 + 1,54 11,74(P) 2,29 1,58 1,08
18(SLE) + >100(P) >60(P) 1,77 1,82 1,08
19(RA) + 16,12(P) 16,20(P) 2,40 3,70 2,40
 Abnormalne vrijednosti biomarkera
karakterišu određeni SLE ili RA fenotip

SLE fenotipovi RA fenotipovi

ACA-G;Sm/RNPs;CD19(BLy) Beta-2G;CD3(TLy); CD4(Th): CD8(CTL) ratio

 Biomarkeri aktivnosti bolesti
• Kada se radi o pacijentima sa autoimunim poremećajima
kao što su SLE i RA, imunofenotipizacija se uvjek koristi u
kombinaciji sa ostalim značajnim biomarkerima
aktivnosti bolesti. Određuju se preciznim kvantitativnim
mjerenjima kritični i klinički značajni nivoi pojedinih
parametara za svaki klinički fenotip posebno, jer se radi
o takvim oboljenjima koja su, na molekularnom nivou,
inducirana abnormalnom ekspresijom preko hiljadu
gena. Zbog toga su svi dobijeni rezultati originalni, jer su
specifični za određeni klinički SLE ili RA fenotip.
 Protočna citometrija
• Protočni citometar se sastoji od 3 međusobno povezana sustava:
protočnog, optičkog i elektronskog. Protočni sustav čine pokretačka
tekućina, koja je nosač stanične suspenzije, stanična suspenzija i
zračni potisak. Protočni sustav omogućuje da stanice iz stanične
suspenzije pojedinačno laminarnom protokom kroz sustav uske
kapilare dolaze do snopa laserskog svjetla koje s lećama, filtrima i
osjetnicima čine optički sustav. Stanice se obasjavaju laserskim
svjetlom, a stupanj raspršenja svjetlosti iste valne duljine pokazatelj
je fizičkih osobina stanica - veličine (svjetlost koja se raspršila pod
malim kutom od 0,5-10°, FSC - prema engl. Forward Light Scatter ili
Low Angel Scatter-) i zrnatosti (svjetlost raspršena pod pravim kutom
- SSC, prema engl. Side Scatter, Orthogonal Scatter ili Right Angle
Scatter).
 Protočna citometrija
• U slučajevima autoimunih poremećaja kao što
su sistemski eritemski lupus (SLE) i
reumatoidni artritis (RA) u cilju provjere
efikasnosti terapije i praćenja aktivnosti
bolesti, redovno se vrše imunofenotipizacijske
analize protočnom citometrijom.
 Protočna citometrija
• Na taj način prati se nivo receptorskih molekula
karakterističnih za B limfocite (CD19), NK ćelija
(CD16+65+) i makrofaga. Moderni protočni citometri
kakav je BD FACS-CANTO-II, koji je korišten u ovim
istraživanjima, sposobni su da analiziraju nekoliko
hiljada partikula ili ćelija u sekundi, i to u realnom
vremenu, te separiraju partikule određenih
svojstava. Protočni citometar je sličan mikroskopu s
tim što on, umjesto slike ćelija, nudi automatsku
kvantifikaciju seta parametara.
 Protočna citometrija
• Selekciju pacijenata oboljelih od RA i SLE vršili su
kliničari reumatolozi po čijim su preporukama
uzimani uzorci seruma za analizu. RA pacijenti-
fenotipovi (visoke vrijednosti dijagnostičkih
parametara Beta-2G; CD3-T-Ly; CD4-Th:CD8-CTL-
ratio) bili su tretirani sa Metotreksatom, a SLE
pacijenti-fenotipovi (abnormalno visoke vrijednosti
dijagnostičkih parametara ACA-G; Sm/RNPs; CD19-
B-Ly) su bili pod tretmanom sa Ciklofosfoamidom
(CF).
 Protočna citometrija
• Cilj ove terapije je redukcija broja CD19+ B limfocita
i NK ćelija (CD16+) čime se želi postići smanjeni
nivo njihove patološke hiperaktivnosti i spriječiti
dalja progresija bolesti. Međutim, u nekim
slučajevima pacijenti obolijevaju od leukemija ili
limfoma, a primarno su bili pacijenti sa autoimunim
poremećajima. Zbog toga je određeni broj
pacijenata sa hematološke klinike, obrađivan sa dva
aspekta, odnosno aspekta autoimunosti i
hematološkog poremećaja.
 Protočna citometrija- imunofenotipizacijski
parametri
• Imunofenotipizacijske analize protočnom
citometrijom imale su za cilj određivanje broja
CD16+CD56+(NK) i CD19+(B lym) čime se brzo i
tačno može odrediti efikasnost terapije
Methotrexate-om i CF-om. Osim ovih parametara
rade se rutinski i ostali imunofenotipizacijski
biomarkeri aktivnosti bolesti i efikasnosti terapije.
To su: CD3, CD4 , CD8, CD4:CD8 ratio, CD3+/HLA
DR, ukupni HLA-DR, CD4+CD25+ i CD4+CD25-.
Rezultati imunofenotipizacijskih analiza
• Kod SLE pacijenata utvrđena je pozitivna
korelacija uvećanog nivoa CD4+ i CD8+ T
limfocita sa sedimentacijom eritrocita, nivoom
anti-ds-DNA i IgG, dok je negativna korelacija
bila sa nivoom komplement komponenti. Kod RA
pacijenata redukcija analiziranih parametara bila
je praćena sa povećanjem CD3(T-ly).

•
Rezultati imunofenotipizacijskih analiza

• Utvrđena je orelacija između ovih parametara i

nivoa CD4 T limfocita, pa se još jednom
pokazala veza aktivnosti B-limfocita, produkcije
autoantitjela i nivoa CD4 limfocita kod aktivnih
faza bolesti kod sistemskog eritemskog lupusa.
Svi navedeni parametri bili su u korelaciji sa
biohemijskim parametrima, a naročito sa
nivoom haptoglobina, hemoglobina, te nivoom
leukocita, monocita i retikulocita.
Rezultati imunofenotipizacijskih analiza

• Inače, umanjene vrijednosti CD16+ kretale su

se u rasponu od 5,5-6,8 kod RA pacijenata
odnosno 5,7-8,6 kod SLE pacijenata (referalne
vrijednosti: 5,6-31). Što se tiče SLE pacijenata
terapija sa CS reducirala je broj CD19+ B
limfocita. Dobijene vrijednosti bile su u
rasponu od 2,9-3,9 u odnosu na referalne
vrijednosti (6,4-23), što je znatno ispod donje
granice.
Rezultati imunofenotipizacijskih analiza

• Ovim se potvrđuje efikasnost terapije

Metotreksatom i Ciklofosfoamidom, odnosno
tačnost i efikasnost imunofenotipizacije kao
metoda za brzu i pravovremenu analizu
efikasnosti terapije i aktivnosti bolesti kod RA i
SLE pacijenata.
 Klinički menadžment HIV pozitivnih
pacijenata
• Real-time RT PCR – praćenje broja HIV-RNA
kopija
• Protočna citometrija- Praćenje broja CD4+T
limfocita
BIO RAD REAL TIME PCR APARAT
Bio-rad real time pcr aparat
 CD4+ T cell count (cells per µL) –blue
HIV RNA copies per mL of plasma-red
HIV infection activity