IZVJEŠĆE O PREGLEDU CORMAN-DROSTENA

REVIDIRAN OD MEĐUNARODNOG KONZORCIJA ZNANSTVENIKA U ŽIVOTNIM ZNANOSTIMA (ICSLS)

Izvještaj o pregledu Corman-Drosten i sur. Eurosurveillance 2020

27. studenog 2020

Ovo opsežno izvješće o pregledu službeno je dostavljeno uredništvu Eurosurveillance-a 27. studenoga
2020. putem njihovog portala za podnošenje, priloženo uz ovo izvješće o pregledu je pismo
zahtjeva za povlačenje koje su potpisali svi glavni i koautori. Prvo i prezime navedena su prvi i drugi
glavni autori. Sva imena između njih su koautori.

Vanjski stručni pregled RTPCR testa za otkrivanje SARS-CoV-2 otkriva 10 glavnih znanstvenih nedostataka
na molekularnoj i metodološkoj razini: posljedice za lažno pozitivne rezultate.

Pieter Borger (1) , Bobby Rajesh Malhotra (2) , Michael Yeadon (3) , Clare Craig (4) , Kevin McKernan (5) , Klaus
Steger (6) , Paul McSheehy (7) , Lidiya Angelova (8) , Fabio Franchi (9) , Thomas Binder (10) , Henrik Ullrich (11) ,
Makoto Ohashi (12) , Stefano Scoglio (13) , Marjolein Doesburg-van Kleffens (14) , Dorothea Gilbert (15) , Rainer
Klement (16) , Ruth Schruefer (17) , Berber W. Pieksma (18), Jan Bonte (19) , Bruno H. Dalle Carbonare (20) , Kevin
P. Corbett (21) , Ulrike Kämmerer (22)

SAŽETAK

U publikaciji pod naslovom „Otkrivanje novog koronavirusa 2019 (2019-nCoV) RT-PCR-om u stvarnom
vremenu“ (Eurosurveillance 25 (8) 2020) autori predstavljaju dijagnostički tijek rada i RT-qPCR protokol za
otkrivanje i dijagnostiku 2019-nCoV (danas poznat kao SARS-CoV-2), za koji tvrde da je potvrđen, kao i
robusna dijagnostička metodologija za upotrebu u laboratorijima javnog zdravstva. 

U svjetlu svih posljedica koje je upravo ova publikacija imala za društva širom svijeta, skupina neovisnih
istraživača izvršila je detaljni pregled spomenute publikacije u kojem su 1) sve komponente predstavljenog
testa bile unakrsno provjerene, 2) Preporuke protokola RT-qPCR ocijenjene su dobrom laboratorijskom
praksom i 3) ispitivani su parametri u odnosu na relevantnu znanstvenu literaturu koja pokriva to područje. 

Objavljeni protokol RT-qPCR za otkrivanje i dijagnostiku 2019-nCoV i rukopis trpe zbog brojnih tehničkih i
znanstvenih pogrešaka, uključujući nedovoljnu izvedbu temeljnih premaza, problematičan i nedovoljan
protokol RT-qPCR i odsutnost točne provjere valjanosti testa. Ni predstavljeni test ni sam rukopis ne
ispunjavaju uvjete za prihvatljivu znanstvenu publikaciju. Nadalje, ozbiljni sukobi interesa autora se ne
spominju. Konačno, vrlo kratki vremenski okvir između predaje i prihvaćanja publikacije (24 sata) znači da
ovdje nije proveden sustavni postupak stručne provjere ili je problematične loše kvalitete. Pružamo
uvjerljive dokaze o nekoliko znanstvenih nedostataka, pogrešaka i mana.

S obzirom na ovdje predstavljene znanstvene i metodološke nedostatke, uvjereni smo da uredništvo

Eurosurveillancea nema drugog izbora nego povući publikaciju.

IZVJEŠĆE O PREGLEDU KONCISA

Ovaj će rad pokazati brojne ozbiljne nedostatke u radu Corman-Drosten, čiji je značaj doveo do svjetske
pogrešne dijagnoze infekcija pripisanih SARS-CoV-2 i povezanih s bolešću COVID-19. Suočeni smo sa strogim
blokadama koje su uništile živote i sredstva za život mnogih ljudi, ograničenim pristupom obrazovanju, a
ova nametnuta ograničenja od strane vlada širom svijeta izravni su napad na osnovna prava ljudi i njihove
osobne slobode, što rezultira kolateralnom štetom za cijela gospodarstva na globalne razmjere.
Deset je fatalnih problema s Corman-Drostenovim papirom koje ćemo u slijedećim odjeljcima detaljnije
izložiti i objasniti.

Prvo i glavno pitanje je da se roman Coronavirus SARS-CoV-2 (u publikaciji nazvanoj 2019-nCoV i u veljači
2020. pod nazivom SARS-CoV-2 od strane međunarodnog konzorcija stručnjaka za viruse) temelji na silico
(teorijskim) sekvencama , isporučen iz laboratorija u Kini [1], jer u to vrijeme autorima nije bio dostupan niti
kontrolni materijal zarazne („žive“) ili inaktivirane SARS-CoV-2 niti izolirana genomska RNA virusa. Do danas
autorstvo nije provelo valjanost na temelju izoliranih virusa SARS-CoV-2 ili njihove RNA pune duljine. Prema
Cormanu i suradnicima:

"Cilj nam je bio razviti i primijeniti robusnu dijagnostičku metodologiju za uporabu u laboratorijima
javnog zdravstva bez raspoloživog virusnog materijala."  [1]

Ovdje bi se trebalo usredotočiti na dva navedena cilja: a) razvoj i b) postavljanje dijagnostičkog testa za
uporabu u laboratorijima javnog zdravstva . Ti se ciljevi ne mogu postići bez raspolaganja stvarnim virusnim
materijalom (npr. Za utvrđivanje zaraznog virusnog opterećenja). U svakom slučaju, samo protokol s
maksimalnom točnošću može biti obvezni i primarni cilj u bilo kojem scenariju-ishodu ove
veličine. Određivanje kritičnog virusnog opterećenja obavezna je informacija, a Christian Drosten je u
grupnoj odgovornosti da izvede ove pokuse i pruži ključne podatke.

Ipak, ovi in silico sljedovi korišteni su za razvoj metodologije RT-PCR testa za identificiranje gore
spomenutog virusa. Ovaj se model temeljio na pretpostavci da je novi virus vrlo sličan SARS-CoV iz 2003.
godine jer su oba beta-koronavirusi.

Stoga je PCR test dizajniran koristeći genomsku sekvencu SARS-CoV kao kontrolni materijal za Sarbeco
komponentu; to znamo iz naše osobne komunikacije putem e-pošte s [2] jednim od koautora Corman-
Drostenovog rada. Ova metoda za modeliranje SARS-CoV-2 opisana je u Corman-Drostenovom radu na
sljedeći način:

„  Uspostavljanje i potvrđivanje dijagnostičkog tijeka rada za  probir  2019-nCoV  i specifične potvrde,
osmišljene u nedostatku dostupnih izolata virusa ili izvornih uzoraka pacijenta.  Dizajn i validacija
omogućeni su uskom genetskom povezanošću s SARS-CoV iz 2003. godine, a potpomognuti uporabom
tehnologije sintetičke nukleinske kiseline. "

Reverzna lančana reakcija transkripcije-polimeraze (RT-PCR) važna je biomolekularna tehnologija za brzo

otkrivanje rijetkih fragmenata RNA koji su poznati unaprijed. U prvom koraku molekule RNA prisutne u
uzorku se obrnuto transkribiraju dajući cDNA. Zatim se cDNA pojačava u lančanoj reakciji polimeraze
pomoću određenog para početnika i termostabilnog enzima DNA polimeraze. Tehnologija je vrlo osjetljiva i
njezina granica otkrivanja teoretski je 1 molekula cDNA. Na specifičnost PCR-a jako utječu biomolekularne
pogreške u dizajnu.

Što je važno kod dizajniranja RT-PCR testa i kvantitativnog RT-qPCR testa opisanog u publikaciji Corman-
Drosten?

1. Prajmeri i sonde:

a) koncentracija početnica i sondi mora biti optimalnog raspona

(100-200 nM)
b) mora biti specifična za ciljni gen koji želite pojačati
c) mora imati optimalan postotak sadržaja GC u odnosu na ukupne dušične baze ( najmanje 40%,
maksimalno 60%)
d) za dijagnostiku virusa najmanje 3 para početnika moraju otkriti 3 virusna gena (po mogućnosti što je
moguće dalje u virusnom genomu)
2. Temperatura na kojoj se odvijaju sve reakcije:

a) temperatura taljenja DNA (> 92 °)

b) temperatura pojačanja DNA (specifična za TaqPol)
c) Tm; temperatura žarenja (temperatura na kojoj početni premazi i sonde dosežu ciljno vezanje /
odvajanje, ne prelazeći 2 ̊C po paru početnih slojeva). Tm uvelike ovisi o sadržaju GC u početnim premazima

3. Broj ciklusa pojačanja (manji od 35; po mogućnosti 25-30 ciklusa);

U slučaju otkrivanja virusa,> 35 ciklusa otkriva samo signale koji nisu u korelaciji s infektivnim virusom kako
je određeno izolacijom u kulturi stanica [pregledano u 2]; ako se PCR testira kao pozitivan kada se koristi
prag od 35 ciklusa ili veći (kao što je slučaj u većini laboratorija u Europi i SAD-u), vjerojatnost da je
navedena osoba stvarno zaražena manja je od 3%, vjerojatnost da navedeni rezultat je lažno pozitivan je
97% [pregledano u 3]

4. Molekularno biološke validacije; pojačani PCR proizvodi moraju se potvrditi ili stavljanjem proizvoda u
gel s DNA ravnalom, ili izravnim sekvenciranjem DNA

5. Treba navesti pozitivne i negativne kontrole kako bi se potvrdilo / opovrglo otkrivanje specifičnog
virusa

6. Trebao bi biti dostupan standardni operativni postupak (SOP)

SOP nedvosmisleno navodi gore navedene parametre, tako da svi laboratoriji mogu postaviti točno iste
uvjete ispitivanja. Validacija univerzalnog SOP-a je ključna jer omogućuje usporedbu podataka unutar i
između zemalja.

MALE ZABRINUTOSTI S CORMAN-DROSTEN PAPIROM

1. U tablici 1 Corman-Drostenovog rada navedene su različite kratice - navedeno je "nM", a "nm" nije. Što
se tiče ispravne nomenklature, nm znači "nanometar", stoga bi nm ovdje trebao čitati nM.

2. Opći je konsenzus pisati genetske sekvence uvijek u smjeru 5'-3 ', uključujući i obrnute
početnice. Izuzetno je neobično poravnati s obrnutim komplementarnim pisanjem sekvence premaza, kao
što su to učinili autori na slici 2 Corman-Drostenovog rada. Ovdje je, uz to, baza kolebanja označena kao "y"
bez opisa osnova za koje Y stoji.

3. Dvije zavaravajuće zamke u Corman-Drostenovom radu su da njihova tablica 1 ne uključuje Tm-

vrijednosti (vrijednosti temperature žarenja), niti GC-vrijednosti (broj G i C u sekvencama kao% -vrijednost
ukupne baze).

VEĆE ZABRINUTOSTI S CORMAN-DROSTEN PAPIROM

A) POZADINA

Autori uvode u pozadinu svog znanstvenog rada kao: „Stalno izbijanje nedavno pojavljenog novog
koronavirusa (2019-nCoV) predstavlja izazov za laboratorije javnog zdravstva jer izolati virusa nisu dostupni
dok je sve više dokaza da je izbijanje šire u početku se mislilo, a međunarodno širenje putem putnika već se
događa ”.

Prema BBC News [4] i Google Statistics [5] u svijetu je zabilježeno 6 smrtnih slučajeva 21. siječnja 2020. - na
dan predaje rukopisa. Zašto su autori pretpostavili izazov za laboratorije javnog zdravstva, dok u to vrijeme
nije bilo značajnih dokaza koji bi ukazivali na to da je izbijanje bilo šire nego što se u početku mislilo?

Kao cilj autori su izjavili da će razviti i primijeniti robusnu dijagnostičku metodologiju za uporabu u
laboratorijima javnog zdravstva bez raspoloživog virusnog materijala. Nadalje, oni priznaju da "ova studija
pokazuje ogroman kapacitet odgovora postignut koordinacijom akademskih i javnih laboratorija u
nacionalnim i europskim istraživačkim mrežama."

B) METODE I REZULTATI

1. Dizajn temeljnog premaza i sonde

1a) Pogrešne koncentracije primera

Pouzdani i točni PCR-test protokoli obično se izrađuju koristeći između 100 nM i 200 nM po temeljnom
premazu [7]. U Corman-Drostenovom radu uočavamo neobično visoke i različite koncentracije primera za
nekoliko primera (tablica 1). Za parove temeljnih slojeva RdRp_SARSr-F i RdRp_SARSr-R opisani su 600 nM,
odnosno 800 nM. Slično tome, za set temeljnih premaza N_Sarbeco_F i N_Sarbeco_R savjetuju 600 nM,
odnosno 800 nM [1].

Trebalo bi biti jasno da su ove koncentracije previsoke da bi bile optimalne za specifična pojačanja ciljnih
gena. Ne postoji određeni razlog za upotrebu ovih izuzetno visokih koncentracija početnih slojeva u ovom
protokolu. Umjesto toga, ove koncentracije dovode do povećanog nespecifičnog vezanja i pojačavanja
PCR proizvoda.

Tablica1: Primeri i sonde (adaptirano iz papira Corman-Drosten; istaknute su pogrešne koncentracije

temeljnih premaza)

1b) Nespecificirani ("klimavi") redoslijed podloga i sondi

Da bi se dobili ponovljivi i usporedivi rezultati, bitno je jasno definirati parove temeljnih premaza. U
Corman-Drostenovom radu primijetili smo šest neodređenih položaja označenih slovima R, W, M i S (tablica
2). Slovo W znači da na ovom položaju može biti A ili T; R znači da može biti ili G ili A; M označava da položaj
može biti A ili C; slovo S označava da na ovom položaju može biti G ili C

Ovaj veliki broj inačica ne samo da je neobičan, već je i vrlo zbunjujući za laboratorije. Ovih šest
neodređenih položaja lako bi moglo rezultirati dizajnom nekoliko različitih alternativnih sekvenci temeljnih
premaza koji se ne odnose na SARS-CoV-2 (2 različita početnika RdRp_SARSr_F + 8 različitih sondi
RdRp_SARS_P1 + 4 različita RdRp_SARSr_R).Varijacije dizajna neizbježno će dovesti do rezultata koji nisu
povezani ni s SARS CoV-2. Stoga zbunjujući nespecifični opis u radu Corman-Drosten nije prikladan kao
standardni operativni protokol. Ovi neodređeni položaji trebali su biti dizajnirani nedvosmisleno.

Te klimave sekvence već su stvorile izvor zabrinutosti na terenu i rezultirale su Pismom uredniku čiji su
autori Pillonel i sur. [8] u vezi s očitim pogreškama u opisanim sekvencama. Te su pogreške same po sebi
razumljive u Corman et al. dodatak također.

Tablica 2: Primeri i sonde (adaptirano iz Corman-Drosten papira; istaknuti su nespecificirani („klimavi“)

nukleotidi u početnicima)

SZO-protokol (slika 1.), koji izravno proizlazi iz Corman-Drostenovog rada, zaključuje da se moraju potvrditi
prisutnost SARS-CoV-2, dva kontrolna gena (E-i RdRp-geni) u testu. Treba imati na umu da RdPd-gen ima
jedan nesigurni položaj ("klimav") u prednjem početnom sloju (R = G / A), dva nesigurna položaja u
obrnutom početnom sloju (R = G / A; S = G / C) i ima tri neizvjesna položaja u RdRp-sondi (W = A / T; R = G /
A; M = A / C). Dakle, za RdPd-gen mogu se sintetizirati dvije različite početne početnice, četiri različite
reverzne početnice i osam različitih sondi. Zajedno postoje 64 moguće kombinacije temeljnih premaza i
sondi!

Corman-Drosten-ov članak nadalje identificira treći gen koji, prema protokolu WHO-a, nije dalje validiran i
smatran je nepotrebnim:

"Treba napomenuti da je i test gena N dobro izveden, ali nije podvrgnut intenzivnoj daljnjoj provjeri jer je
bio nešto manje osjetljiv."

To je bio nesretan propust jer bi bilo najbolje koristiti sva tri genska PCR-a kao potvrdni test, a to bi
rezultiralo gotovo dovoljnim protokolom dijagnostičkog alata za otkrivanje RNA virusa. Tri koraka
potvrdnog ispitivanja barem bi umanjila pogreške i nesigurnosti u svakom koraku u pogledu "klimavih"
točaka. (Bez obzira na to, protokol i dalje ne bi ispunio nijednu "dobru laboratorijsku praksu", uzimajući u
obzir sve ostale pogreške u dizajnu).

Takvo kakvo je, nažalost, test N gena nije predložen u preporuci SZO (slika 1.) kao obvezni i ključni treći
potvrdni korak, niti je u Corman-Drostenovom radu naglašen kao važno neobavezno osiguranje "za rutinski
tijek rada" (Tablica 2).
Slijedom toga, u gotovo svim ispitnim postupcima širom svijeta, umjesto sva tri korištena su samo 2
podudarna primera. Ovaj nadzor čini čitav testni protokol beskorisnim u pogledu pružanja točnih
rezultata ispitivanja od stvarnog značaja u trajnoj pandemiji.

Slika 1: Potvrdni test N-gena niti je naglašen kao nužni treći korak u službenoj preporuci SZO Drosten-
Corman u nastavku [8], niti je potreban kao presudan korak za veću točnost ispitivanja u publikaciji
Eurosurveillance.

1c) Pogrešan sadržaj GC (raspravlja se u 2c, zajedno s temperaturom žarenja (Tm))

1d) Otkrivanje virusnih gena

RT-PCR se ne preporučuje za primarnu dijagnostiku infekcije. Zbog toga RT-PCR test koji se koristi u kliničkoj
rutini za otkrivanje COVID-19 nije indiciran za dijagnozu COVID-19 na regulatornoj osnovi.

„Kliničari moraju prepoznati povećanu točnost i brzinu molekularnih dijagnostičkih tehnika za dijagnozu
infekcija, ali i razumjeti njihova ograničenja.  Laboratorijske rezultate uvijek treba tumačiti u kontekstu
kliničke prezentacije pacijenta, a za pouzdane rezultate ispitivanja potrebni su odgovarajuće mjesto,
kvaliteta i vrijeme uzimanja uzoraka. "  [9]

Međutim, može se koristiti za liječnikovu diferencijalnu dijagnozu kada mora razlikovati različite infekcije
pluća (gripa, Covid-19 i SARS imaju vrlo slične simptome). Za potvrdnu dijagnozu određenog virusa moraju
se primijeniti najmanje 3 specifična para početnika kako bi se otkrila 3 gena specifična za virus. Poželjno je
da se ti ciljni geni nalaze na najvećoj mogućoj udaljenosti u virusnom genomu (uključujući suprotne
krajeve).

Iako Corman-Drostenov rad opisuje 3 početnice, ti početnici pokrivaju samo otprilike polovicu genoma
virusa. To je još jedan faktor koji smanjuje specifičnost za otkrivanje netaknute RNK virusa COVID-19 i
povećava citat lažno pozitivnih rezultata ispitivanja.

Stoga, čak i ako u uzorku dobijemo tri pozitivna signala (tj. Tri para početnika daju 3 različita produkta
pojačanja), to ne dokazuje prisutnost virusa. Bolji dizajn primera imao bi završne primere na oba kraja
virusnog genoma. To je zato što bi bio pokriven cijeli virusni genom i tri pozitivna signala mogu bolje
razlikovati između cjelovitog (a time i potencijalno zaraznog) virusa i fragmentiranih virusnih genoma
(bez zarazne snage).Kako bi se zaključilo bilo što značajno o zaraznosti virusa, gen Orf1, koji kodira
esencijalni replikazni enzim virusa SARS-CoV, trebao je biti uključen kao meta (slika 2). Položaj ciljeva u regiji
virusnog genoma koja je najteže i varijabilno transkribirana još je jedna slabost protokola.

Kim i sur. pokazuju vrlo varijabilnu 3 'ekspresiju subgenomske RNA u Sars-CoV-2 [23]. Te se RNA aktivno
prate kao potpisi za asimptomatske i neinfektivne bolesnike [10]. Vrlo je upitno pregledati populaciju
asimptomatskih ljudi s qPCR početnicima koji imaju 6 parova baza primer-dimer na 3 osnovna kraja primera
(slika 3).
Očito SZO preporučuje ove primere. Isprobali smo sve derivate kolebanja iz Corman-Drosten papira
pomoću Thermofisherovog mrežnog alata za temeljne dimere [11]. RdRp premaz za naprijed ima 6bp
3prime homologije sa Sarbeco E Reverse. Pri visokim koncentracijama primera to je dovoljno za stvaranje
netočnosti.

Napomena: Postoji savršeno podudaranje jednog od N početnika s kliničkim patogenom (Pantoea), koji se
nalazi u imunološki ugroženih pacijenata. Obrnuti temeljni premaz pogađa i Panteju, ali ne u istoj regiji
(slika 3).

To su ozbiljne greške u dizajnu, jer test ne može razlikovati cijeli virus i fragmente virusa. Test se ne može
koristiti kao dijagnostika za SARS-viruse.

Slika 2: Relativni položaji ciljeva amplikona na koronavirusu SARS-a i novom genomu koronavirusa iz
2019. ORF: otvoreni okvir za čitanje; RdRp: RNA-ovisna RNA polimeraza. Brojevi ispod amplikona položaji
su genoma prema SARS-CoV, NC_004718 [1];

Slika 3: Test s Thermofischerovim web alatom za dimere temeljnih premaza otkriva da RdRp premazni
premaz ima 6bp 3` primarnu homologiju sa Sarbeco E Reverse (lijevi okvir). Drugi test otkriva da postoji
savršeno podudaranje jednog od N-početnika s kliničkim patogenom (Pantoea) koji se nalazi u
imunološki ugroženih pacijenata (desni okvir).
2. Reakcijske temperature

2a) temperatura topljenja DNA (> 92 °).

Adekvatno obrađeno u Corman-Drostenovom radu.

2b) temperatura pojačavanja DNA.

Adekvatno obrađeno u Corman-Drostenovom radu.

2c) Pogrešni GC-sadržaji i Tm

Temperatura žarenja određuje na kojoj temperaturi se temeljni premaz veže / odvoji od ciljane
sekvence. Za učinkovito i specifično pojačavanje, sadržaj GC u početnim količinama trebao bi zadovoljavati
najmanje 40% i maksimalno 60% pojačanja. Kao što je naznačeno u tablici 3, tri početna sloja opisana u
Corman-Drostenovom radu nisu unutar normalnog raspona za sadržaj GC. Dva temeljna premaza
(RdRp_SARSr_F i RdRp_SARSr_R) imaju neobične i vrlo niske GC-vrijednosti od 28% -31% za sve moguće
varijante oslonaca kolebanja, dok primer E_Sarbeco_F ima GC-vrijednost od 34,6% (tablica 3. i druga
ploča tablice 3) .

Treba napomenuti da sadržaj GC u velikoj mjeri određuje vezanje za svoj specifični cilj zbog svoje tri
vodikove veze u osnovnom uparivanju. Dakle, što je niži sadržaj GC u početnom sloju, to je manja njegova
sposobnost vezanja na njegov specifični ciljni slijed gena (tj. Gen koji treba detektirati). To znači da bi se
ciljni slijed mogao prepoznati, moramo odabrati temperaturu koja je što bliža stvarnoj temperaturi žarenja
(vrijednost najbolje prakse) da se temeljni premaz ne bi odvojio ponovno, istovremeno istodobno odabirući
ciljni slijed.

Ako je vrijednost Tm vrlo niska, kao što je uočeno za sve klimave varijante RdRp reverznih početnica,
početnice se mogu nespecifično vezati za nekoliko ciljeva, smanjujući specifičnost i povećavajući
potencijalne lažno pozitivne rezultate.

Temperatura žarenja (Tm) presudan je čimbenik za određivanje specifičnosti / točnosti postupka qPCR i
presudna za ocjenu točnosti qPCR protokola. Preporuka najbolje prakse: Oba početna sloja (naprijed i
natrag) trebala bi imati gotovo sličnu vrijednost, po mogućnosti identičnu vrijednost.
Upotrijebili smo besplatno dostupni softver za oblikovanje temeljnih premaza Primer-BLAST [12, 25] za
procjenu vrijednosti najbolje prakse za sve temeljne premaze korištene u Corman-Drostenovom radu
(Tablica 3). Pokušali smo pronaći vrijednost Tm od 60 ° C, dok smo na sličan način tražili najvišu moguću GC
% -vrijednost za sve početne slojeve. Smatrala se prihvatljivom maksimalna Tm razlika od 2 ° C u parovima
primera. Testirajući parove primera navedene u Corman-Drostenovom radu, primijetili smo razliku od 10 ° C
s obzirom na temperaturu žarenja Tm za par primera1 (RdRp_SARSr_F i RdRp_SARSr_R). To je vrlo ozbiljna
pogreška i čini protokol beskorisnim kao specifičan dijagnostički alat.

Dodatna ispitivanja pokazala su da je samo par početnica dizajniran za pojačavanje N-gena (N_Sarbeco_F i
N_Sarbeco_R) postigao odgovarajući standard za rad u dijagnostičkom testu, jer ima dovoljan sadržaj GC i
Tm razliku između početnica (N_Sarbeco_F i N_Sarbeco_R ) je 1,85 ° C (ispod presudne maksimalne razlike
od 2 ° C). Važno je da je ovo gen koji nije ispitan u uzorcima virusa (tablica 2) niti je naglašen kao potvrdni
test. Uz vrlo varijabilne temperature taljenja i izrođene sekvence u ovim početnim premazima, postoji još
jedan faktor koji utječe na specifičnost postupka: dNTP (0,4 uM) su 2x veći od preporučenih za visoko
specifično pojačanje. U reakciju se dodaje i dodatni magnezijev sulfat. Ovaj postupak u kombinaciji s niskom
temperaturom žarenja može stvoriti nespecifična pojačanja. Kada je potreban dodatni magnezij za qPCR,
specifičnost testa treba dodatno ispitati.

Ovdje opisane pogreške u dizajnu toliko su ozbiljne da je malo vjerojatno da će doći do specifičnog
pojačanja genetskog materijala SARS-CoV-2 koristeći protokol Corman-Drosten-ovog rada.

Tablica 3: GC-sadržaj primera i sondi (prilagođeno Corman-Drosten-ovom papiru; istaknute su aberacije

optimiziranih GC-sadržaja. Druga ploča prikazuje tablicu popisa svih najboljih primjera dobre prakse
Primer-BLAST za sve primere i sonde korištene rad Corman-Drosten prof. dr. Ulrike Kämmerer i njezin tim
3. Broj ciklusa pojačanja

Treba napomenuti da se u Corman-Drostenovom radu nigdje ne spominje da je test pozitivan ili negativan,
ili zapravo ono što definira pozitivan ili negativan rezultat. Ove vrste viroloških dijagnostičkih testova
moraju se temeljiti na SOP-u, uključujući potvrđeni i fiksni broj PCR ciklusa (vrijednost Ct), nakon čega se
uzorak smatra pozitivnim ili negativnim. Maksimalno razumno pouzdana vrijednost Ct je 30 ciklusa. Iznad Ct
od 35 ciklusa, mora se očekivati brzo povećanje broja lažno pozitivnih rezultata.

Podaci PCR-a koji su ocijenjeni kao pozitivni nakon vrijednosti Ct od 35 ciklusa potpuno su nepouzdani.

Pozivajući se na Jaafara i sur. 2020. [3]: „Kod Ct = 35, vrijednosti koju smo koristili za izvještavanje o
pozitivnom rezultatu za PCR, <3% kultura je pozitivno.“ Drugim riječima, nije bilo uspješne izolacije virusa
SARS-CoV-2 pri tim visokim vrijednostima Ct.

Nadalje, znanstvene studije pokazuju da se otkrivaju samo neinfektivni (mrtvi) virusi s vrijednostima Ct
od 35 [22].

Između 30 i 35 postoji siva zona, gdje se pozitivan test ne može sa sigurnošću utvrditi. Ovo područje treba
isključiti. Naravno, moglo bi se izvesti 45 PCR ciklusa, kao što je preporučeno u Corman-Drosten WHO-
protokolu (slika 4), ali tada također morate definirati razumnu vrijednost Ct (koja ne bi trebala prelaziti
30). Ali analitički rezultat s vrijednošću Ct od 45 znanstveno je i dijagnostički apsolutno besmislen (razumna
vrijednost Ct ne bi trebala prelaziti 30). Sve to treba priopćiti vrlo jasno. Značajna je pogreška što Corman-
Drostenov papir ne spominje maksimalnu vrijednost Ct pri kojoj se uzorak može nedvosmisleno smatrati
pozitivnim ili negativnim rezultatom testa. Ovo važno ograničenje praga ciklusa također nije određeno ni u
jednom daljnjem podnesku do danas.

Slika 4: Preporuka za RT-PCR komplet u službenom Corman-Drosten WHO protokolu [8]. Pronaći će se

samo vrijednost "Cycler" (ciklusi) bez odgovarajućih i znanstveno opravdanih Ct (granična
vrijednost). Ova ili bilo koja druga ciklus-vrijednost nigdje se ne može naći u stvarnom Corman-
Drostenovom radu.

4. Biomolekularne validacije

Da bi se utvrdilo jesu li amplificirani proizvodi zaista geni SARS-CoV-2, bitna je biomolekularna validacija
amplificiranih PCR proizvoda. Za dijagnostički test ovo je validiranje apsolutno neophodno.

Validacija PCR proizvoda trebala bi se provesti pokretanjem PCR proizvoda u 1% agaroza-EtBr gelu zajedno s
indikatorom veličine (DNA ravnalo ili DNA ljestvica) kako bi se mogla procijeniti veličina proizvoda. Veličina
mora odgovarati izračunatoj veličini proizvoda pojačanja. Ali još je bolje slijediti proizvod pojačanja. Potonje
će dati 100% sigurnost u identitet proizvoda pojačanja. Bez molekularne validacije ne može se biti siguran u
identitet amplificiranih PCR proizvoda. Uzimajući u obzir ranije opisane ozbiljne greške u dizajnu, pojačani
PCR proizvodi mogu biti bilo što.

Također se u radu Corman-Drosten ne spominje slučaj malih fragmenata qPCR (oko 100 bp): to može biti
1,5% agarozni gel ili čak akrilamidni gel.

Činjenica da ti PCR proizvodi nisu validirani na molekularnoj razini još je jedna upečatljiva pogreška
protokola, što čini bilo koji test temeljen na njemu beskorisnim kao specifični dijagnostički alat za
identifikaciju virusa SARS-CoV-2.

5. Pozitivne i negativne kontrole za potvrdu / opovrgavanje specifičnog otkrivanja virusa.

Nepotvrđena pretpostavka opisana u radu Corman-Drosten je da je SARS-CoV-2 jedini virus iz skupine beta-
koronavirusa nalik SARS-u koji trenutno uzrokuje infekcije kod ljudi. Sljedovi na kojima se temelji njihova
PCR metoda nalaze se u siliko sekvencama, koje je isporučio laboratorij u Kini [23], jer u vrijeme razvoja PCR
testa nije bilo kontrolnog materijala zaraznog („živog“) ili inaktiviranog SARS-CoV- 2 je bio dostupan
autorima. Stoga je PCR test dizajniran koristeći slijed poznatog SARS-CoV kao kontrolni materijal za
komponentu Sarbeco (dr. Meijer, koautor Corman-Drosten-ovog papira u razmjeni e-pošte s dr. Peterom
Borgerom) [2].

Pretpostavlja se da su sve osobe koje su pozitivne na RT-PCR testu, kako je opisano u radu Corman-Drosten,
pozitivne na infekcije SARS-CoV-2. U njihovoj pretpostavci postoje tri ozbiljne nedostatke. Prvo, pozitivan
test za molekule RNA opisan u Corman-Drostenovom radu ne može se izjednačiti s "infekcijom
virusom". Pozitivan RT-PCR test samo ukazuje na prisutnost virusnih molekula RNA. Kao što je prikazano u
točki 1d (gore), Corman-Drostenov test nije dizajniran za otkrivanje virusa pune dužine, već samo njegov
fragment. Već smo zaključili da ovo klasificira test kao neprikladan kao dijagnostički test
za infekcije virusom SARS.

Drugo, što je od najveće važnosti, funkcionalnost objavljenog RT-PCR testa nije dokazana upotrebom
pozitivne kontrole (izolirana SARS-CoV-2 RNA) koja je važan znanstveni zlatni standard.

Treće, Corman-Drostenov članak navodi:

„Kako bismo pokazali da testovi mogu otkriti druge viruse povezane s SARS-om šišmiša, koristili smo test
gena E za testiranje šest uzoraka fecesa izvedenih iz šišmiša dostupnih od Drexlera i sur.  […] Und Muth i
sur.  […].  Ovi uzorci pozitivni na virus potječu od europskih šišmiša rinolofida.  Otkrivanje ovih
filogenetskih odstupanja unutar klade CoV povezanih s SARS-om sugerira da će vjerojatno biti otkriveni
svi azijski virusi.  To bi, teoretski, osiguralo široku osjetljivost čak i u slučaju višestrukog neovisnog
stjecanja različitih virusa iz rezervoara za životinje. "

Ova izjava pokazuje da gen E korišten u RT-PCR testu, kako je opisano u radu Corman-Drosten, nije
specifičan za SARS-CoV-2.

Primeri gena E također otkrivaju širok spektar drugih SARS virusa.

Genom koronavirusa najveći je od svih RNK virusa koji zaraze ljude i svi imaju vrlo sličnu molekularnu
strukturu. Ipak, SARS-CoV1 i SARS-CoV-2 imaju dva visoko specifična genetska otiska prsta, što ih izdvaja od
ostalih koronavirusa. Prvo, jedinstveni slijed otiska prsta (KTFPPTEPKKDKKKK) prisutan je u N-proteinima
SARS-CoV i SARS-CoV-2 [13,14,15]. Drugo, i SARS-CoV1 i SARS-CoV2 ne sadrže HE protein, dok svi ostali
koronavirusi posjeduju taj gen [13, 14].Dakle, da bi se specifično detektirao PCR proizvod SARS-CoV1 i
SARS-CoV-2, gornja regija u genu N trebala je biti izabrana kao cilj pojačanja. Pouzdan dijagnostički test
trebao bi se usredotočiti na ovu specifičnu regiju u genu N kao potvrdni test. PCR za ovaj gen N nije dalje
validiran niti je preporučen kao testni gen u radu Drosten-Corman, jer "nije bio tako osjetljiv" s
originalnom sondom SARS-CoV [1].

Nadalje, odsutnost HE gena i u SARS-CoV1 i u SARS-CoV-2 čini ovaj gen idealnom negativnom kontrolom za
isključivanje ostalih koronavirusa. Corman-Drostenov papir ne sadrži ovu negativnu kontrolu, niti sadrži bilo
koju drugu negativnu kontrolu.PCR test u Corman-Drostenovom radu stoga ne sadrži niti jedinstvenu
pozitivnu kontrolu niti negativnu kontrolu kako bi se isključila prisutnost drugih koronavirusa. Ovo je još
jedan od glavnih nedostataka u dizajnu koji test klasificira kao neprikladan za dijagnozu.

6. Standardni operativni postupak (SOP) nije dostupan

Trebao bi biti dostupan standardni operativni postupak (SOP) koji nedvosmisleno navodi gore navedene
parametre, tako da svi laboratoriji mogu postaviti identične iste ispitne uvjete. Validan univerzalni SOP je
presudan, jer olakšava usporedbu podataka unutar i između zemalja. Vrlo je važno nedvosmisleno odrediti
sve parametre temeljnog premaza. Primjećujemo da to nije učinjeno.Nadalje, vrijednost Ct koja označava
kada uzorak treba smatrati pozitivnim ili negativnim nije navedena. Također nije navedeno kada se uzorak
smatra zaraženim virusima SARS-CoV. Kao što je gore prikazano, test ne može razlikovati virus i njegove
fragmente, pa je vrijednost Ct koja ukazuje na pozitivnost presudno važna. Ova vrijednost Ct trebala je biti
navedena u Standardnom operativnom postupku (SOP) i stavljena na mrežu tako da svi laboratoriji koji
provode ovo ispitivanje imaju potpuno iste granične uvjete. Ukazuje na manjkavu znanost da takav SOP ne
postoji. Laboratoriji su stoga slobodni provoditi ispitivanje onako kako smatraju prikladnim, što rezultira
ogromnom količinom varijacija. Laboratorijama diljem Europe ostaje mnoštvo pitanja; koje primere
naručiti? koje nukleotide ispuniti na nedefiniranim mjestima? koju vrijednost Tm odabrati? Koliko PCR
ciklusa izvesti? Pri kojoj je vrijednosti Ct uzorak pozitivan? A kada je negativan? A koliko gena
testirati? Trebaju li se testirati svi geni ili samo gen E i RpRd kako je prikazano u tablici 2 Corman-
Drostenovog rada? Treba li testirati i gen N? A koja je njihova negativna kontrola? Koja je njihova pozitivna
kontrola?

Kako je opisano, protokol je nažalost vrlo nejasan i pogrešan u svom dizajnu da se može ići u desecima
različitih pravaca. Čini se da ne postoji nikakva standardizacija niti SOP, pa nije jasno kako se ovaj test
može primijeniti.

7. Posljedice pogrešaka opisanih pod 1-5: lažno pozitivni rezultati.

RT-PCR test opisan u Corman-Drostenovom radu sadrži toliko grešaka u molekularno-biološkom dizajnu
(vidi 1-5) da nije moguće dobiti jednoznačne rezultate. Neizbježno je da će ovaj test generirati strašan broj
takozvanih "lažnih pozitivnih rezultata". Definicija lažno pozitivnih rezultata negativan je uzorak koji u
početku ocjenjuje pozitivno, ali koji je negativan nakon ponovnog testiranja istim testom. Lažno pozitivni su
pogrešno pozitivni rezultati testa, tj. Negativni uzorci koji su pozitivni. I to je doista ono što se nalazi u
Corman-Drostenovom radu. Na stranici 6 rukopisnog PDF-a autori pokazuju da se ovim testom čak i pod
dobro kontroliranim laboratorijskim uvjetima stvara značajan postotak lažno pozitivnih rezultata:

„U četiri pojedinačne testne reakcije uočena je slaba početna reaktivnost, no one su bile negativne nakon
ponovnog testiranja istim testom.  Ti signali nisu povezani s bilo kojim određenim virusom, a za svaki
virus s kojim se dogodila početna pozitivna reaktivnost, postojali su i drugi uzorci koji su sadržavali isti
virus u višoj koncentraciji, ali nisu imali pozitivan test.  S obzirom na rezultate gore opisane opsežne
tehničke kvalifikacije, zaključeno je da ova početna reaktivnost nije posljedica kemijske nestabilnosti PCR
sondi u stvarnom vremenu i najvjerojatnije rješavanja problema uzrokovanih brzim uvođenjem novih
dijagnostičkih testova i kontrola tijekom ove evaluacije studija."  [1]

Prva rečenica ovog izvatka jasan je dokaz da PCR test opisan u Corman-Drostenovom radu generira lažne
pozitivne rezultate. Čak i pod dobro kontroliranim uvjetima najsuvremenijeg Charité-laboratorija, 4 od 310
primarnih testova lažno su pozitivni po definiciji. Četiri negativna uzorka u početku su bila pozitivna, a zatim
su bila negativna nakon ponovnog testiranja. Ovo je klasični primjer lažno pozitivnog. U ovom slučaju autori
ih ne identificiraju kao lažno pozitivne, što je intelektualno nepošteno.

Sljedeće zapaženo zapažanje u gornjem odlomku je da autori objašnjavaju lažne pozitivne učinke kao
„probleme rješavanja uzrokovane brzim uvođenjem novih dijagnostičkih testova“. Zamislite laboratorije koji
moraju uvesti test bez svih potrebnih podataka koji su obično opisani u SOP-u.

8. Corman-Drosten-ov članak nije recenziran

Prije formalne objave u znanstvenom časopisu, znanstveni i medicinski članci tradicionalno se ovjeravaju
"recenzijom". U ovom procesu urednici časopisa uzimaju savjete različitih stručnjaka („sudaca“) koji su
procijenili rad i mogu identificirati slabosti u njegovim pretpostavkama, metodama i zaključcima. Časopis
obično objavljuje članak tek nakon što se urednici uvjere da su autori odgovorili na zabrinutost sudaca i da
predstavljeni podaci podržavaju zaključke izvučene u radu. " Ovaj je postupak dobro opisan i za
Eurosurveillance [16].

Corman-Drosten-ov dokument predan je Eurosurveillanceu 21. siječnja 2020. i prihvaćen za objavljivanje

22. siječnja 2020. 23. siječnja 2020. rad je bio na mreži. 13. siječnja 2020. verzija 1-0 protokola objavljena je
na službenoj web stranici SZO [17], ažurirana 17. siječnja 2020. kao verzija 2-1 [18], čak i prije nego što je
Corman-Drosten objavljen 23. siječnja u Euronadzor.

Uobičajeno je da je recenzija dugotrajan postupak jer najmanje dva stručnjaka s tog područja moraju kritički
pročitati i komentirati prijavljeni rad. Prema našem mišljenju, ovaj rad nije recenziran. Dvadeset i četiri sata
jednostavno nisu dovoljna za temeljitu recenziju. Naš zaključak potkrepljuje činjenica da smo pronašli
ogroman broj vrlo ozbiljnih nedostataka u dizajnu, što PCR test čini potpuno neprikladnim kao dijagnostički
alat za identifikaciju virusa SARS-CoV-2. Bilo koji molekularni biolog upoznat s dizajnom RT-PCR lako bi
uočio ozbiljne pogreške prisutne u Corman-Drostenovom radu prije stvarnog postupka pregleda. Zatražili
smo od Eurosurveillancea 26. listopada 2020. da nam pošalje kopiju izvještaja o stručnoj provjeri. Do danas
nismo primili ovo izvješće, a u pismu od 18. studenog 2020. ECDC kao domaćin Eurosurveillance-a odbio je
pružiti pristup bez navođenja značajnih znanstvenih razloga za svoju odluku. Suprotno tome, pišu da bi
„otkrivanje potkopalo svrhu znanstvenih istraživanja“. [24].

9. Autori kao urednici

Konačna točka je jedna od glavnih briga. Ispostavilo se da su dva autora Corman-Drostenovog rada,

Christian Drosten i Chantal Reusken, također članovi uredništva ovog časopisa [19]. Stoga postoji ozbiljan
sukob interesa koji pojačava sumnju da rad nije recenziran. Čini se da je brzo objavljivanje bilo moguće
samo zato što su autori također bili dio uredništva Eurosurveillancea. Ova je praksa kategorizirana kao
ugrožavanje znanstvenog integriteta.

SAŽETAK KATALOG POGREŠKA NAĐENIH U PAPIRU

Corman-Drostenov papir sadrži sljedeće specifične pogreške:

1. Ne postoji određeni razlog za upotrebu ovih izuzetno visokih koncentracija početnih slojeva u ovom
protokolu. Opisane koncentracije dovode do povećanog nespecifičnog vezanja i pojačavanja PCR proizvoda,
čineći test neprikladnim kao specifični dijagnostički alat za identifikaciju virusa SARS-CoV-2.

2. Šest nespecificiranih klimavih položaja uvest će ogromnu varijabilnost u stvarne laboratorijske provedbe
ovog testa; zbunjujući nespecifični opis u radu Corman-Drosten nije prikladan kao Standardni operativni
protokol što test čini neprikladnim kao poseban dijagnostički alat za identifikaciju virusa SARS-CoV-2.

3. Test ne može razlikovati cijeli virus i fragmente virusa. Stoga se test ne može koristiti kao dijagnostika za
netaknute (zarazne) viruse, što čini test neprikladnim kao poseban dijagnostički alat za prepoznavanje
virusa SARS-CoV-2 i zaključivanje o prisutnosti infekcije.

4. Razlika od 10 ° C u odnosu na temperaturu žarenja Tm za par primera1 (RdRp_SARSr_F i RdRp_SARSr_R)

također čini test neprikladnim kao poseban dijagnostički alat za identifikaciju virusa SARS-CoV-2.

5. Teška pogreška je izostavljanje vrijednosti Ct pri kojoj se uzorak smatra pozitivnim i negativnim. Ova
vrijednost Ct također se ne može naći u naknadnim prijavama što test čini neprikladnim kao specifični
dijagnostički alat za identifikaciju virusa SARS-CoV-2.

6. PCR proizvodi nisu validirani na molekularnoj razini. Ova činjenica čini protokol beskorisnim kao poseban
dijagnostički alat za identificiranje virusa SARS-CoV-2.
7. PCR test ne sadrži jedinstvenu pozitivnu kontrolu za procjenu njegove specifičnosti za SARS-CoV-2 niti
negativnu kontrolu koja isključuje prisutnost drugih koronavirusa, čineći test neprikladnim kao specifični
dijagnostički alat za identifikaciju SARS-CoV-2 virus.

8. Dizajn testa u Corman-Drostenovom papiru toliko je nejasan i manjkav da se može ići u desecima
različitih pravaca; ništa nije standardizirano i ne postoji SOP. To visoko dovodi u pitanje znanstvenu
valjanost testa i čini ga neprikladnim kao poseban dijagnostički alat za identificiranje virusa SARS-CoV-2.

9. Najvjerojatnije Corman-Drostenov papir nije recenziran što je test učinio neprikladnim kao specifični
dijagnostički alat za identifikaciju virusa SARS-CoV-2.

10. Otkrivamo ozbiljne sukobe interesa za najmanje četiri autora, uz činjenicu da su dvojica autora Corman-
Drostenovog rada (Christian Drosten i Chantal Reusken) članovi uredništva Eurosurveillancea. Sukob
interesa dodan je 29. srpnja 2020. (Olfert Landt je izvršni direktor TIB-Molbiola; Marco Kaiser je viši
istraživač u GenExpressu i služi kao znanstveni savjetnik za TIB-Molbiol), koji nije objavljen u izvornoj verziji
(i još uvijek jest nedostaje u verziji PubMed); TIB-Molbiol je tvrtka koja je "prva" proizvela PCR setove (Light
Mix) na temelju protokola objavljenog u rukopisu Corman-Drosten, a prema njihovim vlastitim riječima, ti
su kompleti za PCR test prije distribucije objavljeni čak i podnesen [20]; dalje, Victor Corman & Christian
Drosten nije spomenuo njihovu drugu pripadnost: komercijalni ispitni laboratorij "Labor Berlin". Oboje su
tamo odgovorni za dijagnostiku virusa [21], a tvrtka djeluje na području PCR testiranja u stvarnom vremenu.

U svjetlu našeg ponovnog ispitivanja protokola ispitivanja radi identificiranja SARS-CoV-2, opisanog u
radu Corman-Drosten, identificirali smo pogreške i svojstvene zablude zbog kojih PCR test SARS-CoV-2
postaje beskoristan.

ZAKLJUČAK

Odluka o tome koji će se protokoli ispitivanja objaviti i učiniti široko dostupnima leži u rukama
Eurosurveillance-a. Odluka da se prepoznaju pogreške očite u Corman-Drostenovom radu ima veliku korist
u velikoj mjeri smanjiti ljudske troškove i patnju u budućnosti.

Nije li u najboljem interesu Eurosurveillance-a da povuče ovaj rad? Naš je zaključak jasan. Suočeni sa svim
ovdje opisanim ogromnim nedostacima i pogreškama u dizajnu PCR-protokola, zaključujemo: U okviru
znanstvenog integriteta i odgovornosti nije preostalo puno izbora.

REFERENCE

[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW,
Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans
Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis
Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten
Christian. Otkrivanje novog koronavirusa 2019 (2019-nCoV) RT-PCR-om u stvarnom vremenu. Euro
nadzor. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] Komunikacija e-poštom između dr. Petera Borgera i dr. Adama Meijera: Dopunski materijal

[3] Jafaar i sur., Korelacija između 3790 kvantitativnih uzoraka lančane reakcije polimeraze - pozitivni uzorci
i pozitivne stanične kulture, uključujući izolate koronavirusa 2 s teškim akutnim respiratornim sindromom
1941. godine. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, 21. siječnja 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836 ;

Arhiva: https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics - COVID19 smrtnih slučajeva širom svijeta: https://bit.ly/3fndemJ

Arhiva: https://archive.is/PpqEE
[6] Laboratorijska ispitivanja za COVID-19 Tehnički centar za hitne slučajeve, NIVD pod
Kinom CDC 15. ožujka 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Priručnik za PCR u stvarnom vremenu Životne

tehnologije: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf

Nolan T, Huggett J, Sanchez E.Dobar praktični vodič za primjenu kvantitativne PCR (qPCR) Prvo izdanje 2013.

[8] Trestan Pillonel i suradnici, Pismo uredniku: Otkrivanje SARS-CoV-2 RT-PCR-om u stvarnom
vremenu: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Kurkela, Satu i David WG Brown. "Molekularno-dijagnostičke tehnike." Medicina 38.10

(2009): 535-540.

[10] Wolfel i sur., Virološka procjena hospitaliziranih bolesnika s COVID-2019

https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[11] Web alat Thermofischer Primer Dimer: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-

sciaching/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library
/thermo-sciaching-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

Dopunski materijal

[12] Primer-BLAST, NCBI - Nacionalni centar za informacije o

biotehnologiji: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW i sur. (2003) Znanost.
Genom SARS-povezanih korona. Science 300 (5624): 1399-1404.

[14] Izolat teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 Wuhan-Hu-1, kompletni

genom: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Borger P. Očekivao se koronavirus sličan SARS-u, ali ništa nije učinjeno kako bi se pripremilo. Am J
Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared ;
Arhiva: https://archive.is/i76Hu

[16] Proces evaluacije / recenzije Eurosurveillance

dokumenta: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Službena preporuka Corman-Drosten protokola i rukopisa WHO-a, objavljena 13. siječnja 2020. kao
verzija 1.0 dokumenta:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus -test-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf ; arhiva: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Službena preporuka SZO za protokol Corman / Drosten RT-qPCR, koji

izravno proizlazi iz publikacije Eurosurveillance, dokument-verzija 2-1, objavljene
17. siječnja 2020: https://www.who.int/ docs / default-source / coronaviruse / protocol-v2- 1.pdf
? sfvrsn = a9ef618c_2

[19] Uredništvo Eurosurveillance-a, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-

assets / imgs / 2020-09-Editorial% 20Board% 20PDF.pdf ;
Arhiva: https://bit.ly/2TqXBjX
[20] Upute za uporabu LightMix SarbecoV E-gen plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, 11. siječnja 2020 .: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gen_V200204_09164154001 (1 ) .pdf
Arhiva, vremenska oznaka - 11. siječnja 2020: https://archive.is/Vulo5 ;
Arhiva: https://bit.ly/3fm9bXH

[21] Christian Drosten i Victor Corman, odgovorni za virusnu dijagnostiku na Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Arhiva: https://archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Virusne kulture za procjenu
zaraznosti COVID- 19. Sistemski pregled. Sustavni pregled doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932  https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.201
67932v4

[23] Kim i sur., Arhitektura SARS-CoV-2 Transcriptome:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] ECDC-ov odgovor dr. Peteru Borgeru, 18. studenoga 2020 .:

Dopunski materijal

[25] Prof. dr. Ulrike Kämmerer i tim, anketa i tablica Primer-BLAST:

Dopunski materijal

Dodatna literatura:

Opis RT-PCR RKI Njemačka, na stranici 10 ovog linka:

https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE
? DownloadsJ / JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf __ blob = p
ublicationFile

Pripadnosti autora :

1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), molekularna genetika, W + W istraživački suradnik, Lörrach, Njemačka 

2) Rajesh Kumar Malhotra (Alias umjetnika: Bobby Rajesh Malhotra ), bivši 3D umjetnik / znanstvene

vizualizacije na CeMM - Centar za molekularnu medicinu Austrijske akademije znanosti (2019. - 2020.),
Sveučilište za primijenjenu umjetnost - Odjel za digitalnu umjetnost Beč, Austrija

3) dr. Michael Yeadon , dipl. Ing. (S priznanjem) Biochem Tox U Surrey, doktor farmakologije U
Surrey. Generalni direktor, Yeadon Consulting Ltd, bivši glavni znanstvenik Pfizera, Ujedinjeno Kraljevstvo 

4) dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, Ujedinjeno Kraljevstvo

5) Kevin McKernan , sveučilište BS Emory, glavni znanstveni direktor, osnivač Medical Genomics,
projektirao je cjevovod za sekvenciranje na WIBR / MIT za projekt ljudskog genoma, izumio i razvio SOLiD
sekvencer, dodijelio patente koji se odnose na PCR, izolaciju i sekvenciranje DNA, SAD

6) prof. Dr. Klaus Steger , Odjel za urologiju, dječju urologiju i andrologiju, Molekularna andrologija,
Biomedicinski istraživački centar Sveučilišta Justus Liebig, Giessen, Njemačka

7) dr. Paul McSheehy (dipl.ing.), Biokemičar i industrijski farmakolog, Loerrach, Njemačka

8) dr. Lidiya Angelova , mag. Biologije, doktorat mikrobiologije, bivša istraživačica na Nacionalnom institutu
za alergije i zarazne bolesti (NIAID), Maryland, SAD
9) dr. Fabio Franchi , bivši medicinski direktor (MD) na odjelu za infektivne bolesti, specijalizirao se za
"Infektivne bolesti" i "Higijena i preventivna medicina", Znanstveno društvo za načelo predostrožnosti
(SSPP), Italija

10) dr. Med. Thomas Binder, internist i kardiolog (FMH), Švicarska

11) prof. Dr. Med. Henrik Ullrich, specijalist dijagnostičke radiologije, glavni liječnik u Centru za radiologiju
bolnice Collm Oschatz, Njemačka

12) Prof. dr. Makoto Ohashi , emeritus profesor, doktor mikrobiologije i imunologije, Sveučilište
Tokushima, Japan

13) dr. Stefano Scoglio, dipl. Dr. Mikrobiolog, nutricionist, Italija

14) Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), specijalistica za laboratorijsku medicinu (klinička
kemija), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Nizozemska

15) dr. Dorothea Gilbert (dr. Sc.), Dr. Kemija okoliša i toksikologija. DGI Consulting Services, Oslo, Norveška

16) dr. Rainer J. Klement, dr. Sc. Odjel za radijacijsku onkologiju, bolnica Leopoldina Schweinfurt, Njemačka

17) dr. Ruth Schruefer, dr. Sc., Ljudska genetika / imunologija, München, Njemačka, 

18) Dra. Berber W. Pieksma, liječnik opće prakse, Nizozemska

19) dr. Med. Jan Bonte (GJ), savjetnik neurolog, Nizozemska

20) dr. Bruno H. Dalle Carbonare (molekularni biolog), specijalist za intelektualnu svojinu, BDC Basel,
Švicarska

21) dr. Kevin P. Corbett , mag. Sestrinstva (Kings College London), dr. Sc. (London South Bank) Društvene
znanosti (znanosti i tehnologije) London, Engleska, Ujedinjeno Kraljevstvo

22) prof. Dr. Ulrike Kämmerer, specijalistica za virusologiju / imunologiju / humanu biologiju / staničnu
biologiju, Sveučilišna bolnica Würzburg, Njemačka

Prilozi autora:

PB: Planirao i proveo analize i istraživanja, konceptualizirajući rukopis.

BRM: Planirao i proveo istraživanje, konceptualizirajući slike i rukopis.

MOJA: Lektura analiza i istraživanja.

KMcK: Provodio je analize i istraživanja, konceptualizirao rukopis.

KS: Proveo analize i istraživanja.

PMcS: Lektura analiza i istraživanja.

LA: Lektura analiza i istraživanja.

FF: Lektura analiza i istraživanja.

TB: Lektura analiza i istraživanja.

HU: Lektura analiza i istraživanja.

MO: Lektura analiza i istraživanja.

SS: Lektura analiza i istraživanja.

MDvK: Lektura analiza i istraživanja.

DG: Lektoriranje analiza i istraživanja.

RJK: Lektura analiza i istraživanja.

RS: Lektura analiza i istraživanja te rukopis.

BWK: Lektoriranje analiza i istraživanja.

RvV: Lektura analiza i istraživanja.

JB: Lektura analiza i istraživanja.

KC: Lektura analiza i istraživanja.

UK: Planirao i proveo analize i istraživanja, konceptualizirajući rukopis.

Dodatni lektori:

Saji N Hameed, Informatika o okolišu, Sveučilište Aizu, Tsuruga, Ikki-machi, Aizuwakamatsu-shi, Fukushima,
Japan

Howard R. Steen, MA Chem. Inž. Cantab, bivši voditelj istraživanja, Njemačka

Dodatak

Ažuriranje 2.12.2020: 

Autor Doprinos dr. Michael Yeadon promijenjen je u:

Lektura analiza i istraživanja.

Pripadnost autora Kevin Mckernan promijenio je u:

Medicinal Genomics.