Структура и функции на

нуклеинови киселини

М. Драгнева
Медицинска биохимия
Определение, видове и биологична роля
Нуклеиновите киселини са:
• Едни от трите основни типа макромолекули, изграждащи живата материя,заедно с
белтъци и въглехидрати.
• Биват рибонуклеинови (РНК) и дезоксирибонуклеинови киселини (ДНК).
• Хетеробиополимери с изключителна биологична роля - съхраняват и предават наследствената
информация от едно поколение на друго.

ДНК репликация
транскрипция

РНК
ЯДРО

транслация ЦИТОПЛАЗМА

БЕЛТЪК
Централна догма в биологията
 От какво са изградени нуклеиновите киселини?

Те са дълги полимери, изградени от повтарящи се нуклеотиди, които са производни органични структури.

Нуклеотидът е изграден от:

азотна база

пентоза

β-D рибоза β-D дезоксирибоза

(в РНК) (в ДНК)

фосфорна киселина
Главни азотни бази в нуклеиновите киселини

пурин аденин (А) гуанин (G)

пиримидин цитозин (C) урацил (U) тимин (T)

 Структура на нуклеозидите

Азотна база
N-гликозидна връзка

рибоза

цитидин уридин аденозин гуанозин

 Нуклеотиди - номенклатура, заряд, спектри

дАМФ (дезоксиаденозин монофосфат)

естерна
връзка

При физиологично pH
нуклеотидите са заредени азотна
отрицателно база
(аденин)
фосфатен
остатък
пентоза (дезоксирибоза)

нуклеозид (аденозин)

нуклеотид (аденозин монофосфат)

 Нуклеотиди - номенклатура, заряд, спектри
Спектрите на пуриновите и пиримидинови бази и на техните производни имат максимум на поглъщане
при 260 nm в ултравиолетовата област.

γ β α

~ ~

Структура на аденозинмонофосфат (АМФ),

Структура на цикличен 3',5'-АМФ (цАМФ)
аденозиндифосфат (АДФ) и аденозинтрифосфат (АТФ)
 Свободни нуклеотиди с важно биологично значениие

Нуклеозид-дифосфатите и -трифосфатите са с висок потенциал на групов пренос (съдържат киселинно-

анхидридни фосфатни връзки, които са макроергични). Доставят енергия за ендергонични процеси.

Участие в метаболизма, например:

  - уридиловите нуклеотиди са необходими за обмяна на въглехидрати;
  - цитидиловите нуклеотиди са необходими за обмяна на фосфолипиди;
  - гуаниловите са необходими за белтъчна биосинтеза и глюконеогенеза.

Участват в състава на по-сложни коензими - никотинамидаденин динуклеотид (НАД окислен и редуциран),

никотинамидаденин динуклеотидфосфат (НАДФ окислен и редуциран), флавинадениндинуклеотид
(ФАД окислен и редуциран) и коензим А (КоА).

Имат регулаторен ефект, напр. съотношението АДФ/АТФ регулира скоростта на окисление в

митохондрийната дихателна верига.

Действат като алостерични ефектори (инхибитори или активатори) върху различни ензимни активности.

Цикличните нуклеотиди цАМФ и цГМФ участват в преноса на хормонални сигнали, а също и като
ктиватори на транскрипцията на някои гени.
Нещо любопитно
• Аденозинът е инхибиторен невротрансмитер,
с роля в процеса на заспиване и подтискане на възбудата.
Концентрацията му се повишава с увеличаване на периода
на бодърстване.
Как работи кофеина?

• Аденозинът подготвя тялото ни за сън.

• Рецепторите по повърхостта на нервните клетки не правят разлика между
аденозин и кофеин.
• Когато приемаме кофеин, той блокира ефекта на аденозина и се повишава
работоспособността на мозъка, чувстваме се бодри. Има вазоконстрикторен
ефект – изчезва главоболието.
Различия между ДНК и РНК

1) Молекулна маса
5’-край 5’-край
2) Пентоза
рибоза в РНК
дезоксирибоза в ДНК

3) Пиримидинови бази
урацил (U) само в РНК
тимин (T) само в ДНК

4) Конформация

5) Локализация в клетката

6) Функции
3’-край 3’-край

дAGCT (ДНК) AGCT (РНК)

Защо ДНК съдържа тимидин вместо урацил?
• Цитозинът се превръща в урацил спонтанно чрез хидролитно дезаминиране:

цитозин урацил

• Тимидинът (метил-урацил) е начин клетката да разпознава „истинските“

урацилови бази от мутантните.
• Урацил – ДНК – гликозилаза отстранява урациловите бази от ДНК.
РНК може лесно да се хидролизира в базични условия
.. ..
.. ..
O O
..
.. O P O-CH2 N O P O-CH2 N
O O
O O O

O P O-CH2 N
O
O O O H2O O OH
P
O O O P OH
OH
O OH O

O P O CH2 N N
O
HOCH2 Смес от 2’- и 3’-
H+ O
O монофосфатни
производни
РНК O OH O OH
... ...
O P O O P O Скъсена РНК
O O

Реакцията на хидролиза на РНК води до образуване на 2’,3’- циклични

монофосфатни междинни продукти. Ензимната хидролиза на РНК от РНази
протича по подобен механизъм. Тъй като ДНК няма 2’-OH група, тя е стабилна
в базични условия.
Фосфатните групи в
състава на ДНК и РНК 5’
HO-CH2 N
са отрицателно заредени O

M+ O P O CH2 N
O
O

pKa на фосфатната група е около

O
1, поради което е винаги N
O P O CH2
йонизирана и отрицателно O
M+ O
заредена при физиологични
условия (pH ~7). O

Молекулите на нуклеиновите O P O CH2

O
N
M+
киселини се нуждаят от O

положително заредени йони, 3’

O-PO32
полиамини, хистони, с които да M+
балансират заряда си.
 NH2 NH2
Азотните бази могат да се N
C
C
N N
C
C
N
завъртат около HC C
CH HC
C CH
рибозата/дезоксирибозата N N N N
HOCH2 HOCH2
O O

OH OH OH OH

syn-аденозин anti-аденозин
Базите съществуват
както като syn-, така NH2 NH2
и като anti- N
C
CH HC
C
N
конформери, но anti - C CH HC C
конформацията е O N N O

предпочитана. HOCH2
O
HOCH2
O

OH OH OH OH

syn-цитозин anti-цитозин
 Първична структура на нуклеиновите киселини

5’-край Представлява последователността на нуклеотидите в

полинуклеотидната верига.

Първичната структура определя биологичните свойства

на нуклеиновите киселини.
3’
5’ 5’ В полинуклеотидните вериги нуклеотидите са свързани
чрез ковалентни 3', 5'-фосфодиестерни връзки

Полинуклеотидните вериги в еукариоти са отворени,

с два различни края, линейни, неразклонени.

Разнообразието в различните вериги се дължи на

различното редуване на базите.

3’ Скелетът на всяка полинуклеотидна верига е еднакъв

поради монотонно редуване на фосфатни и пентозни
3’-край остатъци, свързани чрез 3'-,5'-фосфодиестерни връзки.
 Размери и локализация на ДНК в клетката

Единствената хромозома на E.coli е една двойно-верижна кръгова молекула на ДНК, съдържаща 4 х 10 6

двойки бази.

Във висшите организми ДНК от различни тъкани на един и същи индивид е една и съща.

Хаплоидният геном на всяка човешка клетка съдържа 3 х 109 двойки бази и е разделен в 23 хромозоми.

Дължината на ДНК от 46-те хромозоми на соматична клетка от човек в опънато състояние би била около 2 м.

Около 99 % от ДНК в еукариоти се намира в ядрата на клетките. Ядрената ДНК в еукариоти е свързана с
белтъци, образуващи комплекс, наречен хроматин, който се наблюдава през интерфазата или хромозоми
по време на митозата.

ДНК (около 1 % ) има и в митохондриите. Човешките митохондрии съдържат 2 до 10 копия от

нискомолекулна двойно-верижна циклична ДНК.
 Първична структура на ДНК - Вторична структура на ДНК -
последователност на нуклеотидите двойна спирала
2 nm
Четем:
5’CATT…AGT3’

Прокариоти –
3х106 bp.
Еукариоти – 1,7 nm
3х109 bp.

Възможни комбинации
– 4n (n – брой
нуклеотиди;
Ако n=10 000 1,1 nm
съществуват
410 000 възможни
комбинации
Watson и Crick, 1953
“We have discovered the secret of life!”
Конформация на ДНК. Модел на Watson и Crick – предпоставки за появата му

1) Експеримент на Avery–MacLeod–McCarty – в 1944 доказват, че именно ДНК, а не друг компонент е

носител на наследствената информация.

2) Erwin Chargaff установява, че в състава на ДНК количеството молове аденин е равно на това на тимин, а
количеството молове гуанин е равно на това на цитозин. Напр. за човешката ДНК A=30.9% и T=29.4%;
G=19.9% и C=19.8%.
Тези данни силно подсказват сдвояването на базите А-Т и G-C в молекулата на ДНК, въпреки че самият
Chargaff не изказва това заключение.

3) Рентгено-структурни изследвания на М. Wilkins и R. Franklin върху структурата на ДНК.

Photo 51, showing x-ray diffraction pattern of DNA

 1962: Нобелова награда по Физиология и Медицина
Watson, J.D. and F.H. Crick, “Molecular Structure of
Nucleic Acids: A Structure for Deoxynucleic Acids”.
Nature 171 (1953), p. 738.

James D. Francis H.
Maurice H. F.
Watson Crick Wilkins

Rosalind Franklin?
 Модел на Watson и Crick за двойноспиралната структура на ДНК
Дезоксирибозо-фосфатните скелети на двете вериги са
от външната страна на спиралата, а базите от двете
вериги са насочени едни срещу други във вътрешността
на спиралата.

Оформят се две различни бразди (вдлъбнатини) - малка

малка
и голяма, в които специфични белтъци взаимодействат с бразда
ДНК. 3.4 nm
(10.5 нд)
Две от киселинните групи на всеки фосфатен остатък са
ангажирани в 3',5'-фосфодиестерните връзки, а третата голяма
киселинна група е свободна и дисоциира протон при бразда
физиологично рН. Затова всяка ДНК спирала има
отрицателни заряди по повърхността.

Във всяка от веригите базите, разположени в плоскости една

над друга, взаимодействат помежду си и чрез хидрофобни 2.0 nm
взаимодействия
Модел на Watson и Crick за двойноспиралната структура на ДНК
Двойната спирала на ДНК има диаметър около 20 Å

~20 Å
Азотните бази заемат центъра на спиралата. Фосфатните остаъци са
разположени на повърхността.
B-формата на ДНК е дясновъртяща двойна спирала от две
антипаралелни вериги
5’ 3’
3.4 Å на
базова
двойка

малка
Голяма бразда

34 Å (10 bp)
на завивка

голяма
Малка бразда бразда

3’ 5’
Двете ДНК вериги са комплементарни и антипаралелни

T Ц

A Г
Двойната спирала е резултат от два типа взаимодействия между базите

Хидрофобни връзки
Водородни връзки
“stacking interaction”

Minor
groove

Major
groove
 Денатурация и ренатурация на ДНК
В отсъствие на фосфодиестерази, фосфодиестерните връзки в ДНК са стабилни и изолирана ДНК може
да се съхранява дълго време.

Денатурацията на ДНК е процес, при който се

разкъсват водородните връзки между базите и
двете вериги се разделят.

Денатурацията може да се проследи по увеличеното

поглъщане на УВ светлина при 260 nm
(хиперхромен ефект).

Ренатурация, или обратното свързване на

комплементарни, разделени при денатурация вериги,
може да се извърши, ако температурата се понижи
бавно.

Крива за денатурация на ДНК в зависимост от температурата. Хибридизация се нарича специфичната реасоциация

 Тm - температура на прехода. на комплементарни вериги от различен произход
(напр. от различни ДНК-молекули или от ДНК и от РНК,
или от различни РНК-молекули).
 Структурата на двойната спирала се
разрушава с повишаване на температурата

100
Температурата на
денатурация или „стапяне“
на ДНК зависи от pH и 80
солевата концентрация и се

% Denatured
повишава с повишаване на
GC съдържанието. 60

40
40 50 60 70% GC
20

0
70 80 90 100 110
o
Temperature / C
 Двойноверижната ДНК се различава по
абсорционния си спектър от едноверижната

dA nucleotide
dG ssDNA
dU dsDNA
dC

Пуриновите и пиримидинови бази Абсорбцията на едноверижната ДНК, както и

абсорбират UV светлина (това на свободните нуклеотиди е по-висока от тази
обяснява мутагенния ефект на на двойноверижната ДНК. Това явление е
тази светлина). известно като хиперхромен ефект.
Основни структурни характеристики на В-ДНК

•Двойна спирала с десен ход

•Две антипаралелни вериги, свързани с водородни
връзки
•Един оборот на спиралата = 34 Å (3.4 nm)
•Диаметър на спиралата 20 Å (2.0 nm)
•Широка голяма бразда, тясна малка бразда
•Правило на Chargaff: A = T; G = C
•Заредени фосфатни остатъци
•Азотни бази в anti - конформация
•Молекулата денатурира при висока температура
•Структурата на ДНК е динамична в развор
A B Z

11 базови
двойки, 10,5 базови 13 базови
двойки двойки, с десен ход,
при дехидратация и
рядко срещана
РНК/ДНК хибриди най-често срещана
 Пакетиране на ДНК
ДНК в човешки клетки е свързана с белтъци от
три групи:  хистонови белтъци, нехистонови
хромозомни белтъци и ензимни белтъци,
участващи в репликацията и транскрипцията.

Хистоните са консервативни белтъци. Има пет вида

хистони: Н1, Н2А, H2B, Н3 и Н4. Те улесняват
пакетирането на ДНК в по-малък обем, като се
свързват с ДНК и изграждат по-компактни структури,
наречени нуклеозоми.

В нуклеозомата октамер от хистони, съдържащ по

два от хистоните Н2А, H2B, Н3 и Н4, формира
белтъчна сърцевина, около която е навита ДНК
(1.75. оборота от ДНК-спиралата).

В нуклеозомата 146 двойки бази от ДНК са защитени

от нуклеази и са недостъпни за транскрипция.
Нуклеозомите са разделени една от друга с къси
участъци свързваща ДНК. Присъединяването на
хистон Н1 към нуклеозомата води до получаване на
т.н. хроматозома
Хромозоми и интерфазен хроматин
 Хромозоми и интерфазен хроматин

хетерохроматин ядърце По време на интерфазата, когато ДНК трябва да е

достъпна за ензимите на репликацията и транскрипцията,
тя е пакетирана по-слабо в структура, наречена хроматин.
Цялата ДНК не е пакетирана в еднаква степен.

1)Хетерохроматин - най-плътно пакетираната ДНК,

така както е в митотичната хромозомна форма. Тук спадат
около 90 % от ДНК, която е транскрипционно неактивна,
свързана в нуклеозоми и нечувствителна към действието
на нуклеази.

2) Еухроматин - степента на пакетиране е много по-слабо

изразена. Тук спадат останалите 10 % от ДНК, която
съдържа около 100 000 гена. Информацията на тези гени
може да се презаписва, т.е се използва за биосинтеза на
белтъци и РНК.

еухроматин ядрена мембрана

 28
Функция на ДНК – носител на генетичната информация

Генетичен код

- Триплет
42=16; 43=64

- Изроден

- Специфичен

- Универсален
 29
Рибонуклеинова киселина (РНК)
Съдържа рибонуклеотиди

Рибоза в ДНК Дезоксирибоза

в ДНК

Урацил Тимин
в РНК в ДНК
Първична структура на РНК – последователност, комплементарна на
някаква секвенция от ДНК
РНК е едноверижна молекула
Вторична структура – къси двойноверижни участъци
Видове РНК

1. Информационна (иРНК) – кодира белтъци

2. Рибозомна РНК (рРНК) – изгражда рибозомите и участва в

белтъчната биосинтеза

3. Транспортна РНК (тРНК) – транспортира аминокиселини и

участва в белтъчната биосинтеза

Функционират в цитоплазмата

4. Малки ядрени РНК (snRNA) – участват в

постранскрипционните модификации на мРНК

5. Малки ядърцеви РНК (snoРНК) – участват в модификациите

на рРНК, тРНК, мяРНК.
Функционират в ядрото
 34
1) Информационна иРНК – 2% от цялата
РНК
5'-cap 5'-UTR start Coding sequence stop 3'-UTR
Роля и конформация на иРНК

Информационните РНК (иРНК) пренасят информацията за синтеза на белтъци от ДНК в ядрото към
специални органели в цитоплазмата, наречени рибозоми, където се извършва белтъчната биосинтеза.

Тя е комплементарна на матричната верига на ДНК и идентична с първичната структура на кодиращата

верига в ДНК с тази разлика, че вместо Т, съдържа У и има различни нива на структуриране от ДНК.
При свързването на няколко рибозоми с иРНК се получават полизоми.

В 5'-края на иРНК има шапка, необходима, за да бъде разпозната иРНК от апарата за белтъчна синтеза.
иРНК започва с иницииращия кодон АУГ и завършва с терминиращ кодон (УАГ или УАА или УГА).
След терминиращия кодон е разположена т.н. поли-А-опашка в 3'-края на иРНК, която представлява
полимер от аденилатни остатъци (20-250 на брой).
"Шапката" и "опашката" защитават иРНК от действието на специфични екзонуклеази.

Информационните рибонуклеинови киселини се синтезират в ядрото във вид на прекурсорни молекули,

които са много хетерогенни по размер. Те са с по-високи молекулни маси от тези на зрелите иРНК.
Съдържат екзони (кодиращи последователности) и интрони (некодиращи последователности).
„Шапка“
 Конформация на рРНК. Рибозоми

Рибозомните РНК (рРНК) са важни за белтъчната биосинтеза, защото заедно с белтъци изграждат рибозомите.
Свързвайки иРНК и тРНК към рибозомите, те правят възможна транслацията на наследствената информация.

Рибозомните РНК са в преобладаващо количество в клетката в сравнение с останалите РНК. Те са метаболитно стабилни
поради свързване с рибозомните белтъци и действат в продължение на много транслационни цикли.

В пространствената им структура се редуват двойноспирални и едноверижни участъци. В двойноспиралните участъци,

наречени фуркетни форми, взаимодействията между базите от различни участъци на веригата са комплементарни и
антипаралелни.

Голямата субединица на рибозоми (60S) от бозайници се изгражда от 5S РНК, 28S РНК и 5.8S РНК и приблизително равно
количество белтъци.

В малката субединица на рибозоми (40S) от бозайници се съдържа 18S рРНК и белтъци.

Конформация на рРНК. Рибозоми
 Рибозоми

Прокариоти Еукариоти
 Структура на тРНК

Във всяка тРНК има четири важни участъци:

1) акцепторен участък (тройка нуклеотиди ЦЦА в 3'-края),

където се свързва определена аминокиселина;

2) псевдоуридилова бримка (Т- y-Ц) - за свързване с 5.8S

рРНК от рибозомите.

3) антикодонна бримка, съдържаща специфичен триплет

от нуклеотиди, наречен антикодон, тъй като е
комплементарен и антипаралелен на определен кодон
в иРНК;

4) дихидроуридилова бримка (D). Тя се свързва с 28S рРНК

от 60S рибозомната субединица.

Mодел за вторична структура на тРНК, наречен "детелинов лист"

Interfering RNAs
Micro (miRNAs) and small interfering(siRNAs)
 Interfering RNAs
translational repressors, post translational regulators
 Пуринови и пиримидинови аналози като антиракови и антивирусни агенти

Голям брой синтетични аналози на естествените бази, нуклеозиди и нуклеотиди потискат злокачествен
растеж и инфекции като или инхибират ензими, които са важни за синтезата на нуклеиновите киселини,
или изместват естествените нуклеотиди в нуклеиновите киселини и с това значимо променят
взаимодействията между базите.

6-Меркаптопурин 5-флуорурацил

6-Меркаптопурин (6-МП) е полезен антитуморен F-дУМФ е мощен и специфичен инхибитор на

агент при хора. В туморните клетки той се превръща ензима, който синтезира тимин, тъй като се
в 6-меркаптопурин рибонуклеотид, който се свързва необратимо към него. Това води до
натрупва в клетките и инхибира синтезата на пурини. необразуване на ТМФ и смърт на клетката
поради липса на тимин.
Методи за анализ на нуклеинови киселини

• Гел електрофореза
• Оцветяване с етидиев
бромид
• UV визуализация
PCR -1985 – K. Mullis
DNA sequences can be determined when we use the DNA polymerase and
dideoxynucleotides
Sanger sequencing, 1977
Synthesis of DNA with the help of enzyme in the presence of small quantities of
dideoxynucleotides (for example, ddTTP) and high quantities of regular
deoxynuclotides ATP, GTP, CTP and TTP, using a primer and single stranded DNA
which will serve as the template. DNA polymerase synthesise the new strand in the
direction 5’  3’. Dideoxynucleotides when incorporated will stop the synthesis of
DNA. This will happen at random places where the corresponding complementary
base is met. In such a case every newly synthesised fragment will finish with ddT,
which is marked in red.

O O O

O P O P O P O-CH2 T
O
O O O
5’ primer 3’ synthesis ddTTP
G C C G C A T G T C G T A A C T T
C G G C G T A C A G C A T T G A A
3’ template 5’ (continues…)
 Sanger DNA sequencing can be automated
GC C G C A T G T C GT A A C TT

The same procedure is

repeated with ddC, ddA and
ddG, as different fluorescent
dyes are used to mark the
different dideoxynucleotides.
All DNA fragments are mixed
and separated according to
their size in electrophoresis.

5’ primer 3’ synthesis
GC C G C A T GT C GT A A C T T
CGG C GT A C A G C A T T GA A
3’ template 5’
Sanger sequencing of DNA
DNA double helix model - interactive sculpture
Berkeley, California
Лекции по биохимия – учебника на проф. Косекова без формули и фигури
http://mu-sofia.bg/book/export/html/133

E_mail на доц. Драгнева

praskova@gmail.com