CAÙC PHÖÔNG PHAÙP

PHAÂN TÍCH VI SINH

VAÄT
1. Phöông phaùp nuoâi caáy
2. Phöông phaùp treân cô sôû kyõ thuaät
sinh hoïc phaân töû
3. Phöông phaùp treân cô sôû mieãn dòch
hoïc
 PHAÂN TÍCH VSV BAÈNG
PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁY
• Phöông phaùp ñoå ñóa (pour plate)
• Phöông phaùp caáy beà maët (spread)
• Phöông phaùp MPN (most probable number)
• Phöông phaùp nuoâi caáy kî khí
 PHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓA
• Muïc ñích söû duïng trong ñònh löôïng VSV
• Kyõ thuaät
– Moâi tröôøng agar ñöôïc ñun chaûy vaø laøm nguoäi ñeán
45±1oC
– Caáy tối ña 1ml dòch maãu hay dòch pha loaõng vaøo ñóa
petri troáng voâ truøng (Þ 9 – 10cm)
– Ñoå 10-15ml moâi tröôøng vaøo ñóa
– Laéc ngöôïc vaø xuoâi chieàu kim ñoàng hoà
– Ñaët ñóa leân maët phaúng ngang cho moâi tröôøng ñoâng
ñaëc
– UÛõ ngöôïc ñóa, trong ñieàu kieän vaø thôøi gian xaùc ñònh
 PHÖÔNG PHAÙP ÑOÅ ÑÓA
• Öu ñieåm
– Caáy ñöôïc theå tích maãu lôùn (1ml)
– Xaùc ñònh ñöôïc caùc VSV caàn dinh döôõng tieáp xaùc töø
nhieàu phía
– Cho pheùp ñeám ñöôïc maät ñoä VSV cao, khoaûng 150 - 300
khuaån laïc
Nhöôïc ñieåm
- Khoâng ñònh löôïng ñöôïc nhöõng VSV quaù nhaïy nhieät
- Khoâng xaùc ñònh ñöôïc hình daïng khuaån laïc nhaát ñònh
- Khoù laøm thuaàn moät doøng VSV
 PHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ
MAËT
• Moâi tröôøng phaûi ñöôïc chuaån bò treân
ñóa tröôùc 1-2 ngaøy ñeå khoâ maët
• Phöông phaùp
– Caáy 0,1 – 0,3ml vaøo ñóa moâi tröôøng (ñóa Þ 90mm)
Caáy toái ña 1ml vaøo ñóa moâi tröôøng (ñóa Þ
140mm)
– Traûi ñeàu maãu leân beà maët moâi tröôøng baèng que
trang tam giaùc
– Ñeå ôû nhieät ñoä phoøng 15-20 phuùt cho khoâ maët
– Laät ngöôïc ñóa ñeå uû
 PHÖÔNG PHAÙP CAÁY BEÀ
MAËT
• Öu ñieåm
– Ñònh löôïng ñöôïc caùc VSV nhaïy nhieät
– Coù theå nhaän daïng ñöïôc daïng khuaån laïc ñaëc
tröng
– Deã daøng laøm thuaàn chuûng VSV muïc tieâu
Nhöôïc ñieåm
- Chæ caáy ñöïôc theå tích maãu nhoû (neáu duøng
ñóa thoâng thöôøng Þ90-100mm)
- Chæ cho pheùp ñeám ñöôïc soá löôïng khuaån laïc
 PHÖÔNG PHAÙP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER)
• Khaùi nieäm
– Coøn goïi laø phöông phaùp pha loaõng tôùi haïn
– Giaù trò keát quaû nhaän ñöôïc laø soá löôïng VSV muïc
tieâu coù xaùc suaát cao nhaát theo nguyeân taéc thoáng keâ
– Giaù trò MPN laø giaù trò coù xaùc xuaát cao nhaát
• Heä thoáng MPN
– Goàm 3 hoaëc 5 laàn laëp laïi ôû moãi noàng ñoä
– Laëp laïi ôû 3 noàng ñoä pha loaõng lieân tieáp
– Choïn caùc ñoä pha loaõng sao cho trong heä thoáng coù
caû oáng döông tính vaø oáng aâm tính
– Keát quaû MPN coù ñoä chính xaùc cao nhaát khi soá oáng
döông tính vaø aâm tính trong heä thoáng töông ñöông nhau
 PHÖÔNG PHAÙP MPN
Chia theo soá löôïng oáng trong heä thoáng
- Heä thoáng 9 oáng: moãi ñoä pha loaõng laëp laïi 3 laàn
- Heä thoáng 15 oáng: moãi ñoä pha loaõng laëp laïi 5 laàn
Nguyeân taéc
- Döïa treân keát quaû ñònh tính VSV muïc tieâu ôû caùc laàn laëp
laïi treân cuøng moät ñoä pha loaõng vaø ôû caùc ñoä pha loaõng
khaùc nhau
- Vi sinh vaät muïc tieâu phaûi coù nhöõng bieåu hieän ñaëc tröng
treân moâi tröôøng nuoâi caáy loûng nhö
Söï taïo hôi: Coliforms, E. coli …
Söï ñoåi maøu: S. aureus
Ñaëc ñieåm
Cho pheùp ñònh löôïng ñöôïc maät ñoä VSV thaáp trong theå tích maãu lôùn
 HEÄ THOÁNG MPN
• Heä thoáng 9 oáng Heä thoáng 15 oáng

10ml moâi
tröôøng noàng
ñoä thöôøng
(ñôn)
HEÄ THOÁNG MPN

10ml moâi
tröôøng noàng
ñoä ñoâi

10ml moâi tröôøng

noàng ñoä ñôn
(thöôøng)
 ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORMS BAÈNG PP
MPN
1ml

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

10-1
1ml

2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

10-2 10ml LSB (Lauryl
sulphate broth)
1ml
(chuông Durham)
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
10-3
ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP MPN(tt)

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5

1.1 1.2 1.5

2.2 2.3 Endo/EMB

10ml EC 2.2

3.3
1.1 1.2
Indol 2,0,0 4,5
MPN/g
Keát quaû 2,0,0  = 4,5
 Coâng thöùc tính chæ soá MPN
MPN / g 
g j

t j mj   (t j  g j ) mj

• Trong ñoù:
– ∑ gj : soá löôïng oáng döông tính trong daõy daõ
choïn
– ∑ tjmj :Khoái löôïng maãu trong daõy ñaõ choïn
– ∑ (tj-gj)mj Khoái löôïng maãu trong taát caû caùc
maãu aâm tính.
 GIỚI HẠN TIN CẬY

Trong ñoù:
∑ gj : soá löôïng oáng döông tính trong daõy daõ choïn
∑ tjmj :Khoái löôïng maãu trong daõy ñaõ choïn
∑ (tj-gj)mj Khoái löôïng maãu trong taát caû caùc maãu
aâm tính.
t: Số ống trong hệ thống
 CHÆ SOÁ MPN CÔ BAÛN
• Laø chæ soá tra ñöôïc töø baûng keát quaû MPN
coù soá löôïng maãu trong từng daõy laëp laïi nhö
sau:
• - Daõy 1: 1g hoaëc 1ml maãu
• - Daõy 2: 0,1g hoaëc 0,1ml
• - Daõy 3 0,01g hoaëc 0,01ml
 COÂNG THÖÙC CHUYEÅN
ÑOÅI KEÁT QUAÛ MPN
• Cs = M x F/V0 x Vs
Cs: là khả năng lớn nhất của vi sinh vật có trong thể tích Vs
M : chỉ số MPN tra từ bảng đối với độ pha loãng cơ bản V0
F : nghịch đảo hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thấp nhất
của dãy
Vs: Thể tích chuẩn được chọn để biểu thị mật độ vi sinh vật
• Nếu tính kết quả là MPN/g thì Vs = 1
• Nếu tính kết quả là MPN/100g thì Vs = 100
V0: Thể tích mật độ pha loãng cơ bản ( V0 = 10)
•
 Các bảng MPN và công thức
• https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/la
boratorymethods/ucm109656.htm
PHÖÔNG PHAÙP MAØNG LOÏC
• Kích thöôùc loå loïc 0,47µm hay 0,22µm
• Ñöôøng kính vaø hình daïng maøng loïc phuï
thöïc vaøo ñöôøng kính pheåu loïc
• Ñöôøng kính maøng thöôøng laø 45mm
THIEÁT BÒ LOÏC NHIEÀU PHEÅU
(MULTIFOLDER)
CAÙC BOÄ PHAÄN CUÛA THIEÁT BÒ LOÏC VSV
 PHÖÔNG PHAÙP LOÏC VSV
• Pheåu loïc, giaù ñôû maøng loïc phaûi ñöôïc
voâ truøng sau moãi laàn loïc
• Maät ñoä VSV trong dòch loïc thích hôïp:
<150 khuaån laïc/maøng
• Theå tích dòch loïc trong 1 laàn: 50 -100ml
• Neáu theå tích dòch loïc nhoû hôn thì phaûi
pha loaõng baèng dd pha loaõng hay nöôùc
caát voâ truøng
PHÖÔNG PHAÙP MAØNG LOÏC
• Öu ñieåm
– Xaùc ñònh ñöôïc maät ñoä VSV cuï theå trong
moät theå tích maãu lôùn: 10ml, 100ml …
Nhöôïc ñieåm
- Khoâng thích hôïp cho vieäc phaân tích caùc
maãu thöïc phaåm raén
 KHUAÅN LAÏC VSV TREÂN
MAØNG LOÏC

1A 1B 2A 2B

1C 1D 2C 2C
E. coli treân moâi tröôøng ID Coli agar .
Coliforms treân moâi tröôøng ID Coli agar
 PHÖÔNG PHAÙP MAØNG
PETRI-FILM
• Caûi bieân töø phöông phaùp ñeám khuaån
laïc treân ñóa
• Thích hôïp cho vieäc phaân tích maãu taïi
hieän tröôøng
• Khoâng phaûi baûo quaûn hay vaän
chuyeån maãu
Nhöôïc ñieåm
- Chæ aùp duïng haïn cheá ôû moät
soá chæ tieâu deå nuoâi caáy
- Chæ caáy ñöôïc theå tích maãu nhoû
PHÖÔNG PHAÙP ÑÓA PETRI FILM

Ñaët maãu leân maøng Petrifilm

Daøn ñeàu maãu treân maøng

UÛ Petrifilm, ñeám tröïc tieáp hoaëc phaân laäp

Xanh: E. coli
Ñoû: Coliforms
 Chromogenic Substrates
Different colors with indolyl substrates

Ma S
g e a lm o
n ta n ( 6
(5 -Ch
-B lor o
ro -3 i n
mo do l
-6 y l)
-ch

5-
Io
lo r
BC

do
o-
In d

3-

-3
I (5
Gree

i nd

-in
o ly

-B oly

do
l)
ro4
l

ly l
n
(N-Me

-c h
lor
o-3
thy l-3

-i n
do
-ind o

ly l
)
ly
PHẢN ỨNG ENZYME TẠO MÀU
ß-D-Galactosidase
–95 % of Coliforms
ß-D-Glucuronidase
–94-97 % of E.coli
Tryptophanase
–99 % E.coli có phản ứng
Indole dương tính
 CƠ CHẾ TẠO MÀU

CARBO INDOLYL
HYDRATE
Không màu
ENZYME

+
02

Có màu
PHẢN ỨNG CHUNG CỦA CƠ CHẤT TẠO MÀU

O - CARBOHYDRATE
X

Y
Z
N
H
ENZYME

X OH

Y
Z + CARBOHYDRATE
N
H

OXY HÓA
X O H
N
Y Z
Z Y
N
H O X
HIỆN MÀU
 COLIFORMS
6-CHLORO-3-INDOLYL-ß-D-GALACTOPYRANOSIDE

(SALMON-GAL)
GALACTOSIDASE
= ENZYME GALACTOSIDE
=CARBOHYDRATE COLORLESS
INDOLE

COLORLESS

+
O 2
CHLOROINDIGO
 E.coli
5-Bromo-4-CHLORO-3-INDOXYL-ß-D-GLUCURONIDE
(X-GLUC)
GLUCURONIDASE
= ENZYME GLUCURONIDE
=CARBOHYDRATE COLORLESS
INDOLE

COLORLESS

+
O 2
BROMOCHLOROINDIGO
 E. coli VÀ Coliforms
X-GLUC và Salmon-GAL
Glucuronidase
và Galactosidase Glucuronide
và Không màu
= Enzyme Galactoside
=Carbohydrate Indolyl

Không màu

+
O22
Chloroindigo Bromochloroindigo

Coliforms E.coli
and E.coli E.coli
 PHẢN ỨNG TẠO KẾT TỦA,
PHÁT HUỲNH QUANG
 Phosphatidylinositol phosphalipase
– Listeria monocytogenes
Lecithinase
– Bacillus cereus
 Acid phosphatase phân cắt
MUP (4-
methylumbelliferylphosphate)
tạo 4-methylumbellferone
phát huỳnh quang dưới tia UV
–Clostridium perfringens
Biểu hiện của L. monocytogenes trên môi trường ALOA và
Eggyolk
Hoạt tính enzym
phosphatidylinositol
phosphalipase ở
L. monocytogenes

ALOA

EGGYOLK

36
Clostridium perfringens phát
huỳnh quang trong môi
trường TSC agar có bổ sung
MUP
Pseudomonas phát huỳnh
quang trong môi trường
Pseudomonas agar có
Hecxadecyltrimethyl
ammonium bromide(cetrimide)
 PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG
ATP
• Nguyeân taéc
Mg2+
E + LH2 + ATP E – LH2 AMP + PPi (1)
E – LH2 AMP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (2)

Phaûn öùng treân coù theå vieát laïi nhö sau:

E + LH2 + ATP +O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv +PPi

E : luciferase
LH2 :luciferin
Aùnh saùng phaùt ra coù böôùc soùng 562nm, coù maøu
vaøng.
 PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG
ATP
• ATP chuû yeáu hieän dieän ôû teá baøo VSV
soáng
• Ñònh löôïng VSV thoâng qua soá löôïng ATP
cuûa VSV trong maãu
• Soá löôïng ATP phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän
dinh döôõng, traïng thaùi teá baøo
• Khoâng phaân bieät ñöôïc caùc doøng, loaøi
hay nhoùm VSV khaùc nhau
 PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP

• Öu ñieåm
– Cho pheùp ñònh löôïng ñöôïc toång soá vsv trong
maãu
– Cho keát quaû ñònh löôïng nhanh
– Thích hôïp cho vieäc giaùm saùt veä sinh treân
daây chuyeàn saûn xuaát
PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG
ATP
• Nhöôïc ñieåm
– Khoâng phaân bieät ñöôïc ATP cuûa VSV vaø cuûa
maãu
– Khoâng phaân bieät ñöôïc caùc doøng, loaøi hay
nhoùm VSV khaùc nhau
– Caàn thieát bò tinh vi, coù ñoä nhaïy vaø ñoä chính
xaùc cao
– Caùc hoaù chaát khoù baûo quaûn, nhaïy caûm vôùi
aùnh saùng
PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT QUANG ATP

Đơn vị đo: RLU - CFU

 PHÖÔNG PHAÙP ELISA (Enzym Linked
Immunosorbent Assay
• Thieát laäp treân nguyeân taéc cuûa phaûn öùng khaùng
nguyeân – khaùng theå
• Khaùng nguyeân: ñoái töôïng caàn phaân tích trong maãu
• Khaùng theå: coá ñònh trong gieáng (well) vaø trong trong kít
• Coù hai loaïi phöông phaùt ELISA
– ELISA thöôøng (thuaän)
– ELISA caïnh tranh
 PHÖÔNG PHAÙP ELISA
(enzym linked immunosorbent assay)
• Boä kít cuûa phaûn öùng ELISA thuaän
+ Coù 2 khaùng theå trong moät phaûn öùng
- Khaùng theå sô caáp: coá ñònh trong gieáng
- Khaùng theå thöù caáp töï do coù gaén enzym
taïo maøu
+ Cô chaát taïo maøu vôùi enzym
+ Chaát röûa
+ Chaát döøng phaûn öùng enzym
 NGUYEÂN TAÉC PHAÛN ÖÙNG
ELISA THUAÄN

Khaùng theå thu Cô chaát

khaùng nguyeân

Khaùng Khaùng theå mang Phaùt

nguyeân enzyme ñaùnh “Sandwich” quang
daáu
ÑAËC ÑIEÅM
 PHÖÔNG PHAÙP ELISA (Enzym Linked
Immunosorbent Assay)
• Boä kít cuûa phaûn öùng ELISA caïnh
tranh
+ Coù 2 khaùng theå
- Khaùng theå sô caáp: coá ñònh trong gieáng laø
khaùng nguyeân cuûa khaùng theå sô caáp
- Khaùng theå thöù caáp töï do: coù khaû naêng lieân
keát mieãn dòch vôùi khaùng theå sô caáp vaø chaát caàn
phaùt hieän, khoâng mang enzym
+ Chaát caïnh tranh coù mang enzym
+ Cô chaát taïo maøu vôùi enzym
+ Chaát röûa
 SÔ ÑOÀ PHAÛN ÖÙNG ELISA CAÏNH TRANH
4
1
Gieáng coù Söï taïo
khaùng theå sandwich
sô caáp xaõy ra

2 7
Maãu vaø 5
chaát caïnh Röûa
tranh

3 Döøng
6 phaûn
Khaùng theå öùng, so
thöù caáo Hieän maøu
ñöôïc cho maøu
vaøo
 ÖU, NHÖÔÏC ÑIEÅM CUÛA ELISA
• Öu ñieåm
– Nhanh, nhaïy
– Deã daøng töï ñoäng hoaù
– Coù theå thöïc hieän moät luùc nhieàu maãu
Nhöôïc ñieåm
– Tæ leä keát quaû döông tính giaû cao, caàn phaûi khaúng
ñònh laïi khi kết quả ELISA dương tính
– Moãi ñoái töôïng phaân tích phaûi coù moät boä kít
rieâng
– Hoaù chaát deã hoûng, thôøi gian baûo quaûn ngaén
 Phương pháp Lateral Flow
Test (LFT)

antibody

bacterium
gold particle

membrane
Phương pháp Lateral Flow Test
(LFT)

-Antigen -Antigen
51
 PHÖÔNG PHAÙP SÖÛ DUÏNG MAÃU DOØ

• Nguyeân taéc
– Treân cô sôû phöông phaùp lai phaân töû
– Coù theå phaùt hieän ñoái töôïng baèng DNA hay RNA
– Möùc ñoä chuyeân bieät cuûa phöông phaùp
phuïthuoäc vaøo söï chuyeân bieät cuûa maãu doø
(probes)
– Maãu doø coù theå laø maïch RNA hay DNA
Nguyên tắc phát hiện VSV
bằng mẫu dò
Dịch tăng sinh

Dịch chiết DNA vi khuẩn

Mẫu dò phát hiện

Phát hiện
 Đặt mẫu Cố định mẫu

Tế bào vi khuẩn

Chuyển lên màng

Lai với mẫu dò

Rửa màng Phát hiện với

Kính hiển vi
huỳnh quang
Phương pháp GenTrap
Maãu doø
RNA muïc tieâu Maãu doø
phaùt hieän
thu giöõ

Que thöû

Cô chaát phaùt
quang