1

I HC QUC GIA H NI
TRNG I HC KHOA HC T NHIN
---------------------



Trn Thy Hng





PHN LP, NGHIN CU C IM SINH HC CA MT
S CHNG VI SINH VT C KH NNG TO MNG SINH
VT (BIOFILM) VIT NAM




LUN VN THC S KHOA HC






H Ni 2011


2
I HC QUC GIA H NI
TRNG I HC KHOA HC T NHIN
---------------------



Trn Thy Hng



PHN LP, NGHIN CU C IM SINH HC CA MT
S CHNG VI SINH VT C KH NNG TO MNG SINH
VT (BIOFILM) PHN LP VIT NAM


Chuyn ngnh: Sinh hc thc nghim
M s: 60 42 30

LUN VN THC S KHOA HC


NGI HNG DN KHOA HC:
TS. NGUYN QUANG HUY


H Ni - 2011



3
Phn lp, nghin cu c im sinh hc ca mt s chng vi sinh vt
c kh nng to mng sinh vt (biofilm) phn lp Vit Nam

1. t vn
Mng sinh vt l tp hp cc qun x vi sinh vt bm dnh v pht trin trn b mt
cc mi trng khc nhau thng qua mng li cht ngoi bo do chnh chng to ra v l
mt hin tng ph bin trong t nhin. Cc vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt ng
vai tr quan trng trong cc chu trnh dinh dng cng nh trong x l nhim mi trng.
Thm vo , s to thnh mng sinh vt ca cc chng vi sinh vt cn gp phn kim sot s
xm nhim ca cc tc nhn gy hi cy trng, lm gim s n mn kim loi v s ph hy
nhng hp kim khc.
2. Nguyn liu v phng php
Cc vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt c phn lp t mu nc thi cc khu
vc lng ngh H Ni v Hng Yn theo phng php nui cy lm giu. Cc chng vi sinh
vt phn lp c th nghim hot tnh to thnh mng sinh vt nh phng php nhum tm
kt tinh. Cc chng c kh nng to mng sinh vt c nui cy trong mi trng khong ti
thiu c b sung ngun cacbon, nit khc nhau v nui cy trong mi trng LB lng cc
iu kin nhit , pH khc nhau kho st nh hng ca cc yu t mi trng ln s to
thnh mng sinh vt ca cc chng phn lp.
Cc chng phn lp c th nghim kh nng to cht hot ng b mt thng qua
ch s nh tng ha E24. Cc chng c kh nng to mng c nghin cu kh nng khng
khun theo phng php ca De Angelis v cng s. ng thi cc chng ny c nui cy
trn cc b mt vt liu mi trng khc nhau quan st cc dng mng. Cui cng, chng
ti tin hnh phn tch c im hnh thi v phn loi cc chng c hot tnh biofilm mnh
nht bng phng php nhum Gram v phn tch gen 16S rDNA.
3. Kt qu v tho lun
3.1 Phn lp, tuyn chn cc chng vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt
3.1.1 Phn lp vi sinh vt
T mu nc thi cc khu vc nhim lng ngh H Ni v Hng Yn, chng ti
phn lp c 75 chng vi sinh vt, trong 23 chng vi sinh vt thu c t mu nc
thi khu vc lng ngh min Li Trch; 25 chng vi sinh vt thu c t mu nc thi nh
my sn xut bia v 27 chng vi sinh vt phn lp c t mu nc thi lng bn Ph .
Trong , cc chng vi sinh vt phn lp c ch yu t khu vc nc thi tng
gia v tng y. iu ny ph hp vi gii thch v kh nng bm dnh ca cc chng vi sinh
vt cc phn nc ny. y l khu vc t c s bin ng v xo trn v dng chy; ng
thi cng l ni tp trung nhiu ngun dinh dng thun li cho s tng trng v pht trin
ca vi sinh vt.

4

Hnh 1. Khun lc mt s chng vi sinh vt phn lp trn mi trng thch
3.1.2 Kh nng pht trin v to mng sinh vt ca cc chng phn lp
nh gi s pht trin v to mng sinh vt ca cc chng vi sinh vt phn lp t
ngun nc thi lng ngh min Li Trch, chng ti nhn thy: Trong mi trng nui cy
iu kin tnh, kh nng hp th nh sng bc sng 620 nm (OD
620
) c trng cho mt
t bo sng tri ni gim thp, trong khi kh nng hp th nh sng bc sng 570 nm
(OD
570
) c trng cho mt t bo trong cu trc mng sinh vt tng ln ng k. Trong s
, c 2 chng vi sinh vt to mng tt nht m chng ti la chn thc hin cc th
nghim tip theo l M1.10 v U1.3.
Kt qu nh gi tng t c chng ti thc hin vi cc chng vi sinh vt phn lp
t ngun nc thi nh my sn xut bia - Vin Cng nghip Thc phm v lng ngh bn
Ph .
i vi mu nc thi nh my sn xut bia, chng ti thu c kh nhiu chng vi
sinh vt c kh nng to mng sinh vt tt; trong 3 chng c hot tnh to mng tt nht
c chng ti la chn s dng trong cc th nghim tip theo l A3.3, M3.8 v U3.7.
Kt qu th nghim cho thy trong 3 khu vc ly mu th mu nc thi t lng ngh
bn Ph chng ti phn lp c nhiu chng vi sinh vt c kh nng to mng sinh vt
nht v cc chng ny cng c hot tnh to mng cao nht. Trong s , chng ti la chn
c 3 chng c kh nng to mng sinh vt tt nht s dng trong cc nghin cu tip
theo l M4.3, M4.9 v M4.10.
3.2 Cc yu t nh hng n s to mng sinh vt ca cc chng phn lp
3.2.1 nh hng ca nhit
Kt qu kho st nh hng ca nhit n s to thnh mng sinh vt cho thy: Cc
chng vi sinh vt c nghin cu hu ht biu hin hot tnh to mng sinh vt mnh nht
nhit 37
o
C. Tuy nhin, 50
o
C mt s chng nh M1.10, U1.3, M3.8, M4.9 vn c hot
tnh to mng sinh vt tng i tt.


5
Cc kt qu thu c ny cng kh ph hp vi cc kt qu t nghin cu ca Nguyn
Quang Huy v cng s. iu ny cho thy rng nhit 37
o
C thch hp cho nhiu chng vi
khun phn lp trong mi trng nhim Vit Nam pht trin v to mng sinh vt.
3.2.2 nh hng ca pH mi trng
Kt qu nghin cu cho thy gi tr pH ph hp nht cho s tng trng v to mng
sinh vt ca cc chng phn lp l pH7 - pH7,5.
Cc kt qu thu c ca chng ti cng ph hp vi cc kt qu ca mt s tc gi
trn th gii. Kt qu nghin cu ca Oliveira v cng s cho thy chng vi khun
Pseudomonas fluorescens to mng sinh vt ti u mi trng nui cy pH7 [64] cn chng
Stenotrophomonas maltophilia to mng sinh vt ti u mi trng pH7,3.
Kt qu nghin cu cn cho thy chng M4.9, M4.3 vn to mng sinh vt tt nht
tng ng trong mi trng pH8, pH8,5 c chng ti nhn nh l chng vi khun a kim.
3.2.3 nh hng ca ngun cacbon
Kt qu thu c bng 2 chng ti nhn nh chng M1.10 thch hp vi vic s
dng ngun cacbon l ng galactose, chng M4.10 s dng tt nht ngun cacbon l ng
glucose v chng M4.3 s dng ng mannose ti u nht. Cc kt qu ny ph hp vi
nh gi ca cc tc gi trong nc nh Nguyn Quang Huy v cng s hay tc gi nc
ngoi nh Haggag. Tuy nhin kh nng to mng sinh vt ca cc chng ny trong kt qu
nghin cu l khng cao i vi tng loi ng ring bit.
Trong s 8 chng vi sinh vt c la chn nghin cu, chng ti nhn thy 4 chng
c hot tnh to mng sinh vt cao nht l M3.8, M4.9, U1.3, U3.7; v c 4 chng ny u c
kh nng s dng tt c cc loi ng cho s to thnh mng sinh vt vi cc mc khc
nhau.
3.2.4 nh hng ca ngun nit
Kt qu nghin cu cho thy mt s chng nh U1.3, M3.8, M4.9, M4.10 to mng
sinh vt tng i tt vi ngun nit t mui (NH
4
)
2
SO
4
. Kt qu ny tng i ph hp vi
nghin cu ca Lee v cng s cho thy chng Aureobasidium pullulans to mng sinh vt tt
vi ngun nit t mui (NH
4
)
2
SO
4
. Bn cnh , kt qu nghin cu cng cho thy cao nm
men l ngun dinh dng thch hp cho s to thnh mng sinh vt ca nhiu chng phn lp.
T kt qu ny chng ti la chn c 4 chng vi sinh vt ln lt k hiu l U1.3,
U3.7, M3.8, M4.9 to thnh mng sinh vt tt nht vi nhiu ngun nit khc nhau c b
sung vo mi trng nui cy.
3.2.5 nh hng ca gi th
3.2.5.1 Kh nng to mng sinh vt trn b mt cc gi th khc nhau

6
Kt qu nghin cu cho thy c 4 chng U1.3, U3.7, M3.8, M4.9 u c kh nng to
cc dng mng sinh vt trn b mt cc gi th khc nhau nh: Dng mng ni (floating
biofilm) c to thnh trn b mt dch mi trng, phn tip xc vi khng kh to thnh
mt lp vng ni, mu trng (hnh 2). Hay dng mng bm dnh trn b mt rn m c th
y l trn ng eppendorf nha to thnh mt lp mng mu tm bao xung quanh thnh ng
(hnh 3).


Hnh 2. Mng ni ca 4 chng vi sinh vt sau 5 ngy nui cy

M3.8 M4.9 U1.3 U3.7 C
Hnh 3. Mng sinh vt trn b mt nha
3.2.5.2 Cu trc mng sinh vt quan st bng knh hin vi in t qut
Quan st cu trc khng gian ba chiu ca mng sinh vt di knh hin vi in t
qut (hnh 4) chng ti nhn thy mng sinh vt ca c 4 chng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 u
c to thnh bi cc vi khun lc, bao quanh l mng li cht ngoi bo.

7


M3.8 M4.9

U1.3 U3.7
Hnh 4. Cu trc mng sinh vt ca cc chng phn lp ( 1000)
3.3 Mt s c tnh sinh hc v phn loi cc chng vi sinh vt phn lp
3.3.1 Kh nng to cht hot ng b mt
Nhm mc ch nh gi kh nng to cht hot ng b mt ca cc chng vi sinh
vt phn lp, chng ti tin hnh nghin cu kh nng nh tng ha du n ca chng v thu
c kt qu nh hnh 5.

Hnh 5. Kh nng nh tng ha du n ca cc chng vi sinh vt

8
Kt qu thu c: 4 chng c kh nng nh tng ha du mnh nht l:
K hiu chng U1.3 A3.3 M3.8 U3.7
Ch s nh ha
(%)
74,19 80,58 80,77 67,33

Kt qu nh tng ha du n cho thy mt s chng vi sinh vt c hot tnh hnh
thnh mng sinh vt mnh ng thi cng c kh nng to thnh cht hot ng b mt. Cht
hot ng b mt sinh hc do vi sinh vt to ra l cht c thnh phn cu trc a dng vi b
mt rt hot ng. Bi vy, c mt mi lin h gia s hnh thnh mng sinh vt v kh nng
to cht hot ng b mt. Nhiu nghin cu ch ra rng cc phn t cht hot ng b mt
c th to iu kin thun li cho s gn kt v pht trin ca cc vi sinh vt trn mt b mt.
Bi chng lm gim sc cng b mt v nh tng cng kh nng lan rng v bm dnh
ca vi sinh vt, hnh thnh dng mng ni hay dng mng bm dnh vi b mt rn.
3.3.2 Kh nng khng khun
Bng 1: Hot tnh khng khun ca cc chng vi khun nghin cu
K hiu
chng
Hot tnh khng khun
(ng knh vng khng khun: mm)
E. coli
Vibrio
parahaemolyticus
Samonella
typhi
Ralstonia
solanacaerum
Staphylococcus
aureus
M3.8 7 9 2 3 2
M4.9 8 10 2 2 2
U1.3 7 9 2 3 3
U3.7 3 2 7 7 8

Kt qu bng 1 cho thy cc chng M3.8, M4.9, U1.3 c hot tnh khng mnh i
vi E. coli v Vibrio parahaemolyticus cn U3.7 c hot tnh mnh i vi 3 chng
Samonella typhi, Ralstonia solanacaerum v Staphylococcus aureus.
3.3.3 c im hnh thi
phn loi cc chng phn lp c kh nng to thnh mng sinh vt mnh M3.8,
M4.9, U1.3, U3.7, chng ti tin hnh quan st hnh dng khun lc v nhum Gram cc
chng, kt qu bc u cho thy cc t bo vi khun c dng hnh que ngn, nm ring r
nhau, khng xp thnh chui v u thuc nhm vi khun Gram dng (hnh 6).



9
K hiu Hnh thi khun lc Kt qu nhum Gram
M3.8


M4.9

U1.3

U3.7


Hnh 6. Hnh thi t bo cc chng vi khun trong mng sinh vt
3.3.4 Phn loi cc chng vi sinh vt phn lp da trn gen 16S rDNA
xc nh phn loi chnh xc ca cc chng vi khun phn lp M3.8, M4.9,
U1.3 v U3.7, chng ti tin hnh gii trnh t gen 16S rDNA ca chng.
Kt qu hnh 7 cho thy trnh t gen 16S rDNA ca chng M3.8 tng ng
99,9% vi on 16S ca chng Bacillus licheniformis_X68416; tng ng 99,5% vi

10
on 16S ca chng Bacillus aerius_AJ831843. Trnh t gen 16S rDNA ca chng
M4.9 tng ng 100% vi on 16S ca chng Bacillus licheniformis_X68416;
tng ng 99,6% vi on trnh t 16S ca chng Bacillus aerius_AJ831843.

Hnh 7. V tr phn loi ca cc chng M3.8, M4.9 vi cc loi c quan h h hng da vo
trnh t gen 16S rDNA
Kt qu hnh 8 cho thy trnh t gen 16S rDNA ca chng U1.3 tng ng
99,9% vi on 16S ca chng vi khun Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970
v tng ng 99,8% vi chng Bacillus subtilis_AB042061. Trnh t gen 16S rDNA
ca chng U3.7 tng ng 99,8% vi on trnh t 16S ca vi khun Bacillus
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus cibi_AY550276
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus idriensis_AY904033
100
Bacillus isabeliae_AM503357
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus altitudinis_AJ831842
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
100
99
100
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
M3.8
100
M4.9
80
77
Bacillus sonorensis_AF302118
72
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus velezensis_AY603658
Bacillus nematotocita_AY820954
Bacillus amyloliquefaciens_X60605
59
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus subtilis subsp subtilis _AB042061
Bacillus subtilis_subsp_spizizenii_ AF074970
Bacillus axarquiensis_AY603657
Bacillus malacitensis_AY603656
Bacillus mojavensis_AB021191 26
61
59
79
23
69
100
98
100
100
85
100
54
0.01

11
velezensis_AY603658 v tng ng 99,5% vi chng Bacillus
nematotocita_AY820954.

Hnh 8. V tr phn loi ca chng U1.3 v U3.7 vi cc loi c quan h h hng da vo trnh t gen
16S rDNA
Chi Bacillus c nh gi a phn gm cc chng vi khun khng gy bnh, c kh
nng to mng sinh vt cao v ng dng trong nhiu lnh vc. S to thnh mng sinh vt
chng Bacillus subtilis ng vai tr quan trng ng dng trong nhiu lnh vc: cng nghip,
nng nghip, thc phm, ha m phm. Bng cch to ra hp cht surfactin trong qu trnh
to mng sinh vt, B. subtilis gip cc cy trng c kh nng khng li mt s vi khun gy
bnh nh Erwina, Pseudomonas, Xanthomonas. Kh nng to gramicidin ca chng Bacillus
brevis 18-3 c tc dng lm gim ng k tc n mn kim loi bng cch c ch c hai
chng vi khun D. orientis v L. discophora SP-6. Mt khc, kh nng to cht hot ng b
mt ca cc chng vi sinh vt trong qu trnh to mng cng lm tng mc nh tng ha
v to bt trong ch bin thc phm v to nh ha cho cc sn phm m phm. ng thi,
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus cibi_AY550276
Bacillus indicus_AJ583158
Bacillus idriensis_AY904033
100
Bacillus isabeliae_AM503357
Bacillus safensis_AF234854
Bacillus pumilus_AY876289
Bacillus altitudinis_AJ831842
Bacillus aerophilus_AJ831844
Bacillus stratosphericus_AJ831841
99
100
99
Bacillus aerius_AJ831843
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus sonorensis_AF302118
100
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus velezensis_AY603658
U3.7
Bacillus nematotocita_AY820954
82
Bacillus amyloliquefaciens_X60605
79
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus axarquiensis_AY603657
Bacillus malacitensis_AY603656
Bacillus mojavensis_AB021191
78
Bacillus subtilis subsp spizizenii_ AF074970
59
U1.3
Bacillus subtilis_AB042061
67
54
79
70
72
100
99
100
98
77
100
66
0.01

12
c tnh ny cng m ra trin vng mi trong vic ch to cht hot ng b mt sinh hc
hot tnh cao t ngun vi sinh vt ng dng cho cng nghip du kh x l cc s c trn
du.
4. Kt lun v kin ngh
Kt lun
1. T mu 75 chng vi sinh vt phn lp c t nc thi cc lng ngh Vit Nam,
chng ti la chn c 8 chng M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9 v M4.10
c hot tnh to mng sinh vt cao hn cc chng cn li.
2. Tm chng vi khun phn lp c kh nng sinh trng v to mng sinh vt tt nht
37
o
C v pH t 7 - 7,5. Trong s cc chng ny, bn chng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 c kh
nng sinh trng v to mng sinh vt tt nht trong mi trng khong c bn c b sung
cc ngun cacbon (fructose, rhamnose, glucosamine) v trong mi trng khong c s c b
sung cc ngun nit ((NH
4
)
2
SO
4
, cao nm men) khc nhau.
3. Cc chng M3.8, M4.9 v U1.3 c hot tnh khng mnh i vi E. coli v Vibrio
parahaemolyticus, vi ng knh vng khng khun ln lt l 7 mm v 9 mm; 8 mm v 10
mm; 7 mm v 9 mm; trong khi chng U3.7 c hot tnh khng mnh i vi 3 chng
Staphylococcus aureus, Samonella typhi v Ralstonia solanacaerum vi ng knh vng
khng khun ln lt l 7 mm, 7 mm v 8 mm.
4. Nhng phn tch v c im hnh thi v phn tch gen 16S rDNA ca 4 chng cho
php chng ti nhn nh 4 chng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 l vi khun Gram dng thuc chi
Bacillus. Trong , chng M3.8, M4.9 gn vi loi Bacillus licheniformis; chng U1.3 gn
vi loi Bacillus subtilis cn chng U3.7 gn vi loi Bacillus velezensis.
Kin ngh
Tip tc nghin cu su hn v kh nng to thnh cht hot ng b mt v c tnh
khng khun ca bn chng vi khun phn lp M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 ng dng trong
cng ngh x l nc thi v trong phng chng dch hi gy bnh trn cy trng.
Tm hiu thnh phn protein v vai tr ca s iu ha biu hin gen trong qu trnh
to thnh mng sinh vt ca bn chng vi khun phn lp.