YKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFS

(HGH PERFORMANCE LQUD CHROMATOGRAPHY)

Hazrlayan
Sevda DARCAN
1

Gda Mh.

 HPLC Nedir?
HPLCnin Ksmlar:

Hareketli Faz Rezervuar

Pompa Sistemi
Numune enjeksiyon Sistemi
Kolon
Dedektr
HPLC eitleri
HPLC Uygulamalar

Yksek Performans Sv Kromatografisi

En yaygn olarak kullanlan analitik tekniklerden bir
tanesidir. Kromatograk prosesler, sabit ve hareketli fazlar
arasnda ktle transferini kapsayan ayrma teknikleri olarak
tanmlanrlar. HPLC; bir karmdaki bileenlerin ayrlmasnda
sv hareketli faz kullanr. Bu bileenler ilk olarak zcde
znrletirilirler ve daha sonra yksek basn altnda
kromatogra kolonundan gemeye zorlanrlar.
Balangta basn; modern sv kromatograsinin temel
kriteri olarak dnlmekteydi ve bu nedenle Yksek Basn
Sv Kromatograsi olarak adlandrlmaktayd. Ancak bu
gnmzde geersiz kabul edilmektedir. nk yksek
performans yalnz basncn deil birok faktrn birlemesiyle
ortaya kmaktadr.
5

Bu faktrler;

Dar bir dalm aralnda ok kk partikllerin kullanlmas,

Uniform gzenek boyutu ve dalm,
Yksek basnta kolon paketleme,
Doru, dk hacimli rnek enjektrleri,
Duyarl detektrler,
yi pompalama sistemi kullanm,
olarak snandrlr.

Bu nedenlerden dolay "Yksek Performans Sv Kromatograsi "terimi

kullanlmaktadr. HPLCnn dier klasik tekniklerle kyaslandnda;

Kk boyutlu paslanmaz elik kolonlarn kullanlmas,

Partikl boyutlar ok kk (3,5-10 m) matrikslerin kullanlmas,
Yksek i basn ve kontroll ak hz salanabilmesi,
rnek gereksinimlerinin az olmas,
Srekli ak dedektrleri ile kk miktarlarn tayinine olanak salamas,
Otomasyona msait olmas,
Hzl analiz imkan ve yksek ayrma gcne sahip olmas
nedeniyle ok ynl uygulamalara daha ak olduu grlmektedir.

Bu gelimelerin; adsorbsiyon, dalm, iyon deiim, molekler

elek(jel filtrasyon) ve afnite kromatogra tekniklerine de
yansmasyla hzl ve daha iyi ayrm gc salanmtr.
HPLC, bir karm iinde bulunan kimyasal bir maddenin
miktar tayininde kullanlr. rnein incelenebilmesi iin, su veya
alkol gibi bir svda znm olmas gerekir. HPLCnin temel
alma prensibine gre, detektr zc ve zelti arasndaki
karakteristik deiiklikleri ler. Bu deiiklikler monitrde
grntlenir.
Ayrma kolonda gerekleir. Durgun faz m boyutlu porz
partikllerden oluur, bu nedenle hareketli fazn kolondan geii iin
yksek basn pompalarna ihtiya vardr.

Kromatograk proses kolona rnein enjeksiyonu ile balar.

Bileenlerin ayrlmas analit ve hareketli fazn kolona pompalanmas
ile devam eder. Ayrlarak elue olan her bir kompenentin pikleri
kaydedilir. Her bir komponent iin alnan dedektr cevab bir
kaydedici veya bilgisayar ekrannda kromotogram olarak
grntlenir.

ekil 1 HPLC ( Kaynak: waters.com)

10

HPLCnn KISIMLARI

HPLC aletleri genelde;

Hareketli Faz Rezervuar
Pompa Sistemi
Numune enjeksiyon Sistemi
Kolon
Dedektr ve kaydedici (veya veri sistemi) ierir.

11


1- Hareketli Faz Kaplar ve zc Muamele Sistemleri
Modern bir HPLC cihaznda bir veya daha ok cam veya
paslanmaz elik kaplar bulunur. Bunlarn her biri 500 mLden
daha fazla zc alacak kapasiteye sahiptir. Sistemde kullanlan
hareketli fazn seimi uygulanan ayrma tipine baldr. Bu
nedenle sulu tamponlardan hidrokarbonlara kadar farkl
polaritede zcler kullanlr. HPLC sistemlerinde kullanlacak
tm zcler ok saf olmaldr. z miktardaki safszlklar kolonu
etkileyerek dedeksiyon sisteminde giriime neden olabilirler.
Tm solventlerin gaznn alnmas (degassing) zorunludur, aksi
taktirde zcde hava kabarcklarnn bulunmas pompa ve
kolonda problemlere neden olmaktadr. (rnein; kolonda
kabarck oluturarak pik genilemesine yol aar.) Gazn alnmas
farkl ekillerde gerekletirilebilir; solventlerin stlmas,
kartrarak vakuma maruz brakma, ultrasonikasyon veya
zc rezervuarna helyum gaz verilmesi.

12

Sonu olarak hareketli fazda bulunmas gereken zellikler;

sak, dedektre uyumluluk, rnein znrl, dk viskozite,
kimyasal inertlik ve uygun yat olarak sralayabiliriz. Hareketli faz ,
rnek ve sabit faz arasndaki etkileimlerin ayarlanabilmesi iin
deitirilmektedir. Hareketli faz tipleri; izokratik, gradiyent ve
politipik olmak zere formda uygulanabilir. zokratik elsyonda
bileenler sabit bileimli tek bir zc ile ele edilirler. Tm
bileenler kolonda ayn anda, farkl hzlarda g ederler. Gradiyenet
elsyon; polarlklar birbirinden farkl iki (veya bazen daha fazla)
zc sistemlerinin kullanld tekniktir. zc bileimi srekli
veya basamakl olarak deitirilir. Politipik hareketli faz, kark tip
kromatogralerde tercih edilebilir. Ayn kolonu kullanarak birok
kromatograk teknik iin uygulanabilir.
13

2.zc Datma Sistemi (Pompa Sistemi)

ekil 2 Mikro HPLC Pompas

14


HPLC cihaz, dier sv kromatografisi cihazlarndan,
daha nce de belirtildii gibi, kolon giri ve k arasnda
oluturulmas gereken yksek basn nedeni ile farkllk
gsterir. Bu basn fark, kolon giriine bir pompa yoluyla
uygulanan basn ile salanr. zc pompalama sistemi
belki de HPLC sisteminin en nemli ksmdr.
Pompann performans, analitik sonulardaki
tekrarlanabilirlii, nicel deeri, gzlenebilme snr vb.
deerleri byk lde etkiler.
Ticari olarak mevcut pompalama sistemleri;

Dorudan gaz basn pompalar

Pnmatik hzlandrc pompalar
Pistonlu pompalar
rnga tipi pompalar

15

Dorudan gaz basn pompalarnda, yksek basnta sv aknn

salanmasyla olur. Genellikle azot veya helyum gaznn kullanlr. Gaz
basnc, hareketli fazn yzeyine dorudan veya bir diyafram yoluyla
uygulanr. Bu sistem snrl bir hacime sahiptir, bu yzden durdurularak
tekrar zc ile doldurulmaldr. Avantaj, ucuz ve tek hareketli faz
kullanldnda gvenilir olmasdr.

Pnmatik (haval) pompalar, gaz basncyla alr. Gaz basnc kk

alanl bir pistonu iten byk alanl bir pistona etki eder. Gaz basnc
bylece pistonlarn yzey alanlar orannda kuvvetlenir. Sabit basntaki
sv sisteme datlr. Svnn pompay terketme hz, zcnn
vizikositesine, pompa kndaki akn direncine ve kolon dolgu
maddesiyle olan etkisine baldr.

rnga tipinde pompalarda, elektriksel olarak hareket eden kurun

vida, verilen zc hacmini yeterli basnta tutan bir pistonu hareket
ettirir. Bu pompalarn balca avantaj, yksek basnta (7500 psia
kadar) serbest pulslu ak salama yetenekleridir ve ak hz, allan
basntan bamszdr.

16

Sv kromatograde kullanlan pompalarda bulunmas gereken

zellikler:

5000 psi (1b/in2) ye kadar basnlar oluturabilmeli,

Pulssuz sv k bulunmal
Ak hz 0,1den 10mL/dakikaya kadar ayarlanabilmeli,
Sv ak hzlarnn tekrarlanabilirlii %0,5 veya daha iyi
olmal,
ok sayda zcnn korozyon etkisine kar dayankl
olmaldr.

17

zcler, ayrma kolonuna girmeden nce kartrlrlar. Bu

sistem gerekli ayrmay salamakta kullanlan iki hareketli faz
iin, iki yksek basn pompasna sahiptir. Bu amala
kullanlacak iki hareketli fazn tamamen karabilir olmas
gerekir. Pompalar yoluyla zcler, ya difzyon ya da mekanik
olarak alan kk hacimdeki kartrma odalarnda
kartrlrlar.
3. Numune Enjeksiyon Sistemi
rnekler HPLCye enjeksiyon nitesinden enjekte edilir.
Enjeksiyon nitesi basit olarak bir enjeksiyon val ve rnek
haznesinden oluur. rnek Enjeksiyon ncesi hareketli fazda

biralma
rnga
ile valften
enjekte
edilir.
ekil 3zlerek
Bir oto rnekleyicinin
ekli. Viallerden(
1) numunelerin
ine (2) ve rnga(7)
yardm ile ekilme aamasnda, Vana(4) n
durumu ve kolona iletim aamasnda yine vana(4) n durumunu dier HPLC elemanlar ile balant ekilleriyle birlikte gsterilmitir. (Kaynak:
www.sielc.com)

18

19

4.Kolon
HPLCde kullanlan ayrma kolonlar genellikle paslanmaz elik olup
yksek basnlara dayankldr. Sklkla kullanlan kolonlar 4.5-5.0 mm i
apl ve 10-30 cm uzunluundaki kolonlardr. Dzgn bir i apa
sahiptirler ve ticari olarak deiik byklklerde mevcutturlar. Bir
kromatografik sistemin performans, kolonda gerekletirilen ayrma ile
yani, kolon dolgu maddesinin seilmesi ve kullanlmasyla tayin edilir.
yi bir kolon dolgu maddesi:

Kararl olmaldr.
Hem hareketli faz zclerine hem de rnek zeltilere kar inert

olmaldr.
Geni yzey alanna sahip olmaldr.
Yksek basn ve yksek ak hzlarndan etkilenmemelidir.

20

Kolon verimi:

kolon dolgu maddesi,

ortalama parack ap,
kolonu doldurmak iin kullanlan teknikler,
kolonun i ap,
kolonun i yzeyinin geometrisi

gibi faktrlere baldr.

Paslanmaz elik kolonlarn, malzeme zellikleri asndan en
uygun kolonlar olduu ortaya kmtr. Analitik uygulamalarda,
2.1 mm, 3.2 mm ve 4.5 mm i apa sahip kolonlar 10-30 cm
arasndaki uzunluklarda kullanlrlar.
21

Kolon Dolgu Materyali:

HPLC durgun faz kolon iindeki kat destek maddesidir. rnek
solsyonunun, kolona enjeksiyonu ile non-kovalent etkileim
olmakszn durgun fazda bileenlerin g sz konusudur. Durgun
faz ve rnein hareketli faz ile kimyasal etkileimleri, g derecesi
ve rnek bileenlerin ayrlmasn belirler.
Uygulanacak kromatogra trnn prensibine gre kolon dolgu
maddeleri farkldr. (Kromatogra tipleri; sv-kat adsorpsiyon,
normal faz, zt- faz, iyon deiimi vb.) Kolon dolgu materyalleri
genellikle silika ve almina esasldr; gzenekli (porz), kresel
spherical), dzensiz (irregular), pellikler (pellicular) ve mikro
tiplerinde olmaktadr. Dolgu maddesinin seiminde tanecik biimi,
bykl, tanecik byklnn dalm, gzenek hacmi ve
yzey alan gibi zellikler rol oynar. Yaplacak almann cinsine
gre seim yaplmaldr.

22

Kolonlarn doldurulmas :
HPLC kolonlar; deiik dolgu materyali yaplarnda ve
boyutlarda ticari rmalardan temin edilebilirler. Ancak birok
aratrc ucuz olmas nedeniyle kendi kolonlarn doldurmay tercih
eder. Kolon doldurulmasnda kullanlacak metot, dolgu materyalinin
tabiatna ve partikl byklne baldr.

23

ekil 4 HPLC Kolon

24

5.Dedektrler
HPLC iin ideal dedektr; geni bir konsantrasyon aralnda yksek
duyarlla, dk grlt seviyesine, belirli seicilie sahip olmaldr.

Dedektr tipleri:
Maddenin baz tabii zelliklerinin tanlanmasna ynelik madde-zel
dedektrler (Absorbans, flouresans, elektrokimyasal, iletkenlik
dedektrleri)
Kolonda ayrlan maddelerin varln, mobil fazn ktle zelliine
dntren, ktle zellikli dedektrler (Reaktif indeks dedektr)
Maddenin tanmlanmasndan nce evaporasyonla mobil fazn
uzaklatrld desolvasyon dedektrleri (hareket eden tel dedektr,
modifiye FID dedektr, ktle dedektr)
Kimyasal reaksiyon ieren trevlendirme dedektr

25

Enjeksiyon sistemi-kolon ve kolon-dedektr arasndaki balant

borularnn uzunluunun mmkn olduu kadar kk olmas
istenmektedir. Bu rnek seyrelmesini engelleyen, 0.025-0.05 cm i
apa sahip (elik ve teflon) balant borularnn kullanlmasyla
gereklemektedir.
HPLC almalarnda sabit faz olarak genellikle silikajel
kullanlr. Ierdii gruplar nedeniyle zayf asidik zellik gsteren
silikajel, bazik zellik gsteren bileikleri bazlk kuvvetlerine gre
tutar (kuvvetli bazlar silikajel kolonlarda zayf bazlara oranla daha
kuvvetli tutulur). Silikajel dorudan dolgu maddesi olarak
kullanld gibi bir kat yzeyine film halinde de
kaplanabilmektedir.

26

Elemental trlendirme amac ile kullanlan dolgu maddesi ise

genellikle anyon ya da katyonlar tutan iyon deitirici
reinelerdir. Bu reinelerin kullanlmas durumunda rnekte
iyon halinde bulunan trlerin birbirinden ayrlmas
salanabilir. Kullanlan iyon deitirici reineler dorudan
kolona doldurulabilen kat reineler olabilecei gibi, bir kat
yzeyine kaplanm sv reineler de olabilir. Iyonlarn bu
reinelerle olan etkileimi iyonlarn yk ve bykl, pH,
iyon iddeti, kullanlan reinenin gzeneklilii, zc cinsi,
zc deriimi ve scaklk ile deimektedir.
Birka bileenden oluan bir karmdaki her bileen, farkl bir
net yke sahiptir ve bu yzden kolondan ayrlmas iin farkl
bir iyonik kuvvet gerekmektedir. yonik kuvvet tamponun ya
da tampona eklenen tuzun artan deriimiyle artabilir. Bu
rnein kolonda alkonma sresini azaltabilir ve bileikler
farkl tuz deriimlerinde kolondan ayrlr.

27

Dedektrler, kolondan ele olan rnek bileeninden alnan cevap

dorultusunda sinyallerin kromatogram zerinde pik olarak ifade
edilmesini salayan alettir. Dedektrler kolon sonrasna monte edilir.
HPLC iin ideal bir dedektr; geni konsantrasyon aralnda; yksek
duyarlla, dk grlt seviyesine, bilinen seicilie sahip olmal ve
kromatograk rezolsyona kt etki yapmakszn kolon akntsndaki
bileiklere duyarl olmaldr. Byle bir dedektr scaklk ve basntaki
deimelere de duyarsz olmaldr. Kullanlacak dedektr sistemi, analizi
yaplacak numunenin cinsine uygun olmaldr. Sv kromatograsinde en
ok kullanlan dedektrler, ultraviyole veya grnr n
absorpsiyonuna dayanrlar.

28

HPLC UYGULAMALARI

Preparatif HPLC, bileiklerin izolasyonu ve saatrlmas iin

kullanlr.
Kimyasal ayrmalar, bir kolon ve hareketli fazda bileiklerin
farkl g hzlarna gre ayrlmas temeline dayanr.
Saatrma; hedef bileiin dier bileikler veya
kontaminantlardan ayrlmas ve ekstraksiyonudur. Her bir bileik
belirli kromatograk koullar altnda karakteristik bir pike
sahiptir. Ayrlmas istenen bileenin ihtiyalarna gre
aratrcnn koullar optimize etmesi gerekmektedir.
HPLC ile bileiklerin identikasyonu yaplr.
Miktar tayini; konsantrasyonu bilinmeyen bir rnein
solsyonda tayin edilmesi; genelde rnein standart zeltisinin
bilinen farkl miktarlarnn kolona verilmesi ve elde edilen
deerlerin korelasyonunun yaplmas ile mmkn
olabilmektedir. Genelde korelasyon pik alanlar veya pik
yksekliklerinin kullanlmas ile yaplr.

29

Yksek Performansl Sv Kromatograsinin Tipik Uygulama Alan

Uygulama Alan

Karmlar

lalar

Biyokimyasallar

Gda maddeleri

Endstriyel kimyasallar

Kirleticiler

Pestisitler, herbisitler, fenoller, PCBler

Uyuturucular

Uyuturucu ilalar, zehirler, narkotikler

Klinik Tp

Antibiyotikler,sedafitler,steroitler,
analjezikler
Amino asitler, proteinler, k.hidratlar, lipitler
Suni tatlandrclar, antioksidanlar,
alfatoksinler
ok halkal aromatikler, boyalar, yzey aktif
mad.

Safra asitleri, ila metabolitleri, re

ekstraklar

30

TEEKKRLER

TEEKKRLER
31