YILDIZ TEKNK NVERSTES BYOMHENDSLK BLM BYO3031 BYOMHENDSLK LABORATUVARI I

N RAPOR 20092010 GZ

MAKROMOLEKLLERN KROMATOGRAFK TNTEMLE ANALZ

DENEY SORUMLUSU retim yesi: DENEY SORUMLUSU Aratrma Grevlisi:
RAPOR TESLM TARH: 01.11.2010

Yrd.Do.Dr. Sevil DNER Kadriye ATICI KIZILBEY

DENEY GRUBU: 4
rencinin Ad - Soyad Rdvan YILDIRIM Gke KASACI Cansu KELTEN Tufan SALAN Ezgi BAKIRCI rencinin Numaras 07056018 07056027 08056002 08056034 08056037 rencinin mzas

1.Deneyin Amac Kromatografik yntemle, kimyasal ve fiziksel zellikleri birbirine ok yakn bileenlerden oluan maddeleri veya karmlar tmyle, kolayca ya da ksa srede ayrarak analiz etmektir. 2.Teorik Bilgi 2.1. Kromatografi Kramatografi, bir karmn bileenlerini, bunlara seimsel ilgi gsteren iki ya da daha ok evreden sistemler arasnda farkl glerine bakarak tanmak, gerektiinde niceliklerini belirlemek amacyla yaplan ve ayrma ilemine dayanan analitik yntemdir. Kromatografi terimi balangta, rnein bitkisel pigmentlerde olduu gibi cisimleri renklerine gre ayrma olumu ileminden kaynakland, ama zamanla uygulama alan olduka geniledi.Kromatografi gnmzde son derece duyarl ve etkin bir ayrma yntemi olarak kabul edilmektedir. Duruma gre iki temel mekanizma uygulanr;

Bileikler ya iki sv evre arasnda paylalr bu durumda dalm ya da paylam kromatografisinden sz edilir. Hareket halindeki bileikler duraan kat bir evre yzeyine balanr (balar yzeysel ve fiziksel bir nitelik tadnda yzde tutma kromatografisinden [tersinir ba, bileiin btnlnn korunmas], buna karlk hareketli ve yzde tutulan bileikler arasnda gerek kimyasal balar olutuunda iyon deiimi kromatografisinden sz edilir).

Kimyasal ve fiziksel zellikleri birbirine ok yakn olan bileiklerden oluan karmlar damtma ve ayrmsal kristallendirme ile birbirinden ayrmak zor olabilir. Bu tr maddeler iin eitli kromatografi yntemleri kullanlarak baarl ayrmlar yaplabilir. Kromatografi, bir karmn gzenekli bir ortamda, hareketli bir zc etkisiyle, karm bileenlerinin farkl harkeketleri sonucu birbirinden ayrlmas olgusuna dayanr. Hareket eden faza hareketli faz, bahsedilen gzenekli ortama ise adsorban veya sabit faz denir. Kromatografi olaynda adsorpsiyon, dalma ve deitirme kuvvetleri rol oynar. Bu kuvvetlere gre de farkl kromatografik yntemler farkl gruplarda toplanrlar [1]. 2.2. Kromatografi Trleri 2.2.1.Adsorpsiyon Kromatografisi(Molekllerin kat bir yzeye yapmas, tek molekl tabakasndan oluan bir yzey tabakasnn olumas) Sv - Kat : Kolon ve nce Tabaka Kromatografisi Gaz - Kat : Gaz Kromatografisi

2.2.2.Dalma Kromatografisi Sv - Sv : Kolon ve Kat Kromatografisi Gaz - Sv : Kolon ve Gaz Kromatografisi 2

2.2.3.yon Deitirme Kromatografisi 2.3. Kromatografik Yntemlerin Snflandrlmas Kromatografik yntemler kullanlan mobil fazn sv veya gaz olmasna gre; Sv Kromatografisi ve Gaz Kromatografisi olmak zere balca 2 ana grupta snflandrlabilir. Bunun haricinde kromatografik yntemler, alkonulma mekanizmas ve alma metoduna gre de 2 ekilde snflandrlabilir. 2.3.1.Alkonma Mekanizma Gre Adsorpsiyon Kromatografisi: Analizlenecek madde hem mobil faz hem de sabit faz oluturan molekllerle etkileim ierisindedir. Polar maddeler polar, apolar maddeler ise apolar sabit faz tarafndan daha fazla tutulurlar Partisyon (Dalm) Kromatografisi: Adsorpsiyon kromatografisinden farkl olarak bu yntemde sabit fazda svdr. Sv sabit fazn getirdii zorluklar uygulama alann kstlamaktadr. Size Exclusion Kromatografisi: Analizlenecek maddelere ait molekller boyutlarna gre ayrlmaktadr. Bu ilem iin ok deiik por aplar ieren dolgu maddesiyle doldurulmu kolonlar kullanlmaktadr. Bylece deiik aplardaki porlar birer elek gibi davranarak maddeleri boyut-aplarna gre alkoymaktadr. Afinite Kromatografisi: Alkonma mekanizmas maddeye zgn olmakta ve anahtar-kilit modeline uygun biyolojik materyaller dolgu malzemesi olarak kullanlmaktadr. Maliyetinin ok yksek olmas uygulama alann kstlamaktadr. yon Deiim Kromatografisi: Ykl bir maddenin ters ykle yklenmi kat bir sabit fazla tutulmas prensibine dayanr [2]. 2.3.2.alma Metoduna Gre Daha az kullanlan, rnein kolondan uzaklatrlma mekanizmasna gre yaplm bir snflandrmadr. - Elsyon Olutumu Kromatografisi (Elution development chromatography) -Yerdeitirme Oluumu Kromatografisi (Displacement Development Chromatography) - Frontal Analiz Kromatografisi (Frontal Analysis Chromatography). 2.4. HPLC ve Donanm Sv kromatografi bir ayrma tekniidir. Bir svda znm ayrlacak bileenler, bir kolon ierisinde bulunan genellikle kat bir destek zerindeki sabit faz ile farkl etkilemelere girerek, kolon iinde deiik hzlarda ilerler. Kolonu deiik zamanlarda terkederler ve bylece birbirlerinden ayrlrlar. Burada tayc faz olan sv, pompalarla kolona basldndan yksek ak hzndadr. Bu nedenle ayrma daha ksa srede ve tam olarak gereklemektedir. Ayrlan bileik, kolon kna balanan uygun bir dedektrle tesbit edilip miktaryla orantl olarak kaydedilir. Yksek hzda gerekletirilen ayrmalarn yapld sv kromatografi sistemlerine, Yksek Basn Sv Kromatografi (HPSC) denir. Gaz ve sv kromatografinin uygulama alanlar farkldr; ancak birok bileen her iki kromatografiyle de ayrlabilir. Amaca uygun seim yaplr: Kromatografiyle ayrlan maddelerle daha baka ilemler yaplacaksa bunlarn toplanmas istenir. Toplama ileminde, Gaz kromatografisinde tayc faz gaz olduundan ortamdan hemen uzaklar ve saf madde 3

uygun bir soutma sistemiyle kolayca sv veya kat halde elde edilebilir. Sv kromatografi sinde, tayc faz sv olduundan, saf madde ile birlikte gelen tayc svnn uzaklatrlmas iin ek ilemler yaplmaldr. Bu koulda gaz kromatografisi tercih edilir. Sv kromatografi (SK), ayrlacak bileik sya kar duyarlysa veya byk molekllyse kullanlr [3]. Yksek Performansl Sv Kromatografisi(HPLC) Sv kromatografisi ynteminin zel bir uygulamas olan yksek performansl sv kromatografisi (HPLC) ynteminde, sabit faz olarak kullanlan parack boyutlarnn nemli lde kltlmesi sonucu hareketli faz ile etkileen sabit faz yzey alan byr ve bylece kolonun etkinlii arttrlm olur. ok sk olarak doldurulmu kolondan hareketli f azn belirli bir hzla geebilmesi iin bir basn uygulanmas gerekir. Bu yksek verimdeki kolonlarn ve olduka yksek basnlarn kullanld HPLC, element trlendirilmesinde en yaygn biimde uygulanan kromatografi trdr. HPLC gnmzde kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, tp kimyas, bitki kimyas, tarm ve kimya mhendisliini ieren alanlarda ayrma ve analiz iin vazgeilmez bir ara olarak kabul edilmektedir. Bilhassa dier kromatografik tekniklere uygun olmayan bileiklerin ayrlmas ve analizi iin uygundur. evre scaklnda termal olarak kararsz bileikleri ve yksek polarlktaki bileikleri herhangi bir trevlendirme olmakszn ayrabilir ve analiz edebilir [4]. Standart HPLC donanm temel olarak 4 bileenden olumaktadr. Bu bileenler srasyla pompa, enjektr, kolon (sabit faz) ve dedektrdr. 2.4.1.Pompa HPLC donanmnda yer alan pompalama sistemleri, ak hzna gre, pompann yapmnda kullanlan malzemeye gre ve pompann mobil faz iletme mekanizmasna gre olmak zere 3 farkl ekilde kategorize edilebilmektedir. 2.4.1.1.Ak Hzna Gre Microbore Pompa Sistemleri: ap 2 mmye kadar olan kolonlar iin kullanlr ve 1-250 L/dak aralnda ak hz salarlar. Standart Bore Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarnda en sk kullanlan pompa sistemi olup 100 L 10 mL/dak aralnda ak hz salarlar. Yar preperatif HPLC uygulamalarnda i ap 12 mmye kadar olan kolonlar iin tercih edilirler. Preperatif Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarnn dndakir alma alanlarnda kullanlr ve 10 mL/dakdan byk ak hz salarlar [2]. 2.4.1.2.Pompann Yapld Malzemeye Gre Metalik: En ok tercih edilen metalik malzeme, mekanik dayankll, anma direnci ve iyi termal stabilitesi nedeniyle 316 paslanmaz eliktir. Mobil fazn bileenlerinden ok az (rn. Hidroklorik asit) 316 paslanmaz elie zarar verebilir. Bir dier metalik malzeme alternatifi ise titanyumdur. Mekanik dayankllk zellikleri 316 paslanmaz elie benzemekle birlikte, anma direnci ve kimyasallara kar inertlii daha fazladr. Titanyum ve elik materyaller 6000 psi basnca kadar dayankldrlar. Metalik materyallerin sakncalar olarak ise yksek maliyetleri, kuvetli asidik ortamlara dayankszlk, biyolojik rneklerle geimsizlik saylabilir.

Ametalik : Metalik pompalarn bahsedilen sakncalar sebebiyle ametalik materyaller de pompa imalinde kullanlmaktadr. Bu amala en ok polietiletilketon (PEEK), politetrafloroetilen (TEFLON) ve seramik mateyaller tercih edilmektedir. TEFLON biyolojik rnekler ve asidik ortamlarla geimli olmakla birlikte 2000 psi basncn zerisi iin dayankl deildir. PEEK ise 5000 psi basnca kadar dayankl olup 316 paslanmaz elie zarar veren asidik zeltilere dayankldr. Ancak HPLC uygulamalarnda kullanlan bir ok organik zclere dayankszdr. Seramik yap materyali olarak safir 20 yl akn sredir pompalarda zellikle piston paralarnn imalatnda kullanlmaktadr. Bu tr malzemeler iyi kimyasal stabiliteye sahip olmakla beraber ok yksek maliyetleri uygulamalarnda kstlamalar getirmektedir [2]. 2.4.1.3.Mobil Faz letme Mekanizmasna Gre rnga Tip Pompalar: ok kullanlmamakla birlikte ak hznn 100L/dakdan daha az olduu uygulamalarda (rn. Kapiller sv kromatografisi uygulamalar) tercih edilmektedirler. 10-50 mL hacminde bir rngaya pistonun elektrik motoruyla ittirilmesiyle ak salanmaktadr. Salanabilecek mobil faz ak sresi rngann hacmi ile snrl olup, yeniden dolum srasnda ak kesilmek zorundadr. Piston Pompalar: Modern HPLC donanmnn standart parasdr. Yaps 2 ksm hareketli paradan oluur. Bunlar, check valveler ve pistondur. 2.4.2.Enjektr HPLC donanmn oluturan enjektr rnein sabit faz (kolon) ncesinde mobil faza enjekte edilmesi iin kullanlr. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandal oto-enjektrler olmak zere 2 eidi bulunmaktadr. Manuel Enjektrler(Manuel Injector): rnein enjekte edilebilmesi iin enjektr nce doldurma pozisyonuna (load position) getirilerek rnek, istee gre seilebilen sabit hacimli, loop ierisine doldurulur. Loopa doldurulan rnek hacmi loop sabit hacmini geerse, fazla olan ksm darya otomatik olarak atlr. Daha sonra enjektrn kolu enjeksiyon pozisyonuna (inject position) getirilerek rnek mobil faz ierisine enjekte edilmi olur. Kullanlan loop hacimleri ok deiken olup genellikle 5 L 5 mL aralnda deiir. Loop hacmi kldke tekrarlanabilirlik adna yaplan hata oran da bymektedir. Oto-enjektrler(Autosampler): 2 tip oto-enjektr mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel tipidir. XY tipinde enjektr hareketli olup belirtilen koordinatlara giderek rnei iesinden ekmekte ve loop vastasyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun iin seilen rneklere ait bilgilerin, gerekli yazlm kullanlarak, nceden bilgi ilemciye girilmesi gerekmektedir. Carousel tipinde ise rnekler dnen, dairesel ekilli bir tayc vastasyla sabit bir enjektrn altna tanmaktadr [2]. 2.4.3.Kolon Modern HPLC donanmnn 4 temel yap tandan birisi olan kolon, karmak rneklerde bileenlerin birbirinden iyi znrlkle ayrmndan sorumlu sabit fazdr. Kolon imalatnda yap materyali olarak 316 paslanmaz elik, TEFLON, cam veya PEEK en sk tercih edilenlerdir. Kolonun ayrm gc ve performans yapld materyalden ok, i yzeyine yaplan kaplamada kullanlan malzemenin kimyasal ve fiziksel zelliklerinden etkilenmektedir. Kullanlan bu tr kaplama malzemeleri ok eitli olup, kullanlacak mobil fazn ve uygulanacak HPLC metodunun zelliklerine ve analizi yaplacak rnein bilinen 5

kimyasal ve fiziksel zelliklerine gre seilmelidir. Seilecek kolonun HPLC uygulamasnda kullanlacak ak hz ve dolaysyla oluacak basnca dayankl olmasna dikkat edilmelidir. Birok analitik kolonun i ap 2-5 mm aralnda deimektedir. Kolon i ap arttka ak hz ve i doldurma hacmi artmakta ama oluacak piklerin znrl dolaysyla duyarllk azalmaktadr. Kolonlarn boylar (uzunluu) ok eitli olup genellikle 30 -300 mm aralnda deimektedir. Kolon uzunluu arttka rnek bileenlerinin ayrm daha iyi olmakta fakat analiz sresi uzad iin daha fazla mobil faz harcanmaktadr. Kolon boyutlarnn tanmlanmasna uluslararas standartlar getirilmitir. Buna gre nce mm cinsinden uzunluk ve ap yazlmakta, bunu firma ad, sabit faz tr, AO trnden poroz yzey ap ve m cinsinden partikl bykl izlemektedir. rnein, 250/4,6 Nucleosil C18 100 5 yazldnda, kolonun 250 mm uzunluk ve 4,6 mm i apa sahip olduu anlalmaktadr. Kolonun firmas (markas) Nuclesoil olup, sabit faz tr normal fazda kullanlan bir tr olan C18 dir. Poroz yzey ap 100 AO olup, dolgu materyaline ait partikl bykl 5 mdur [2]. 2.4.4.Dedektr [2] HPLC donanmnda 4 temel bileenden birisi olan dedektrler, rnek bileenlerini tayin ederken ltkleri fiziksel zelliklere gre, 8 eittir: 2.4.4.1.UV / Grnr Blge Dedektr (Ultraviolet / Visible dedector - UV/VIS): Absorbans llr. Lambert-Beer yasas geerlidir. Spektrum taramas yapmak, farkl dalga boyunda almak veya dalga boyunu zamana kar programlamak mmkndr. 2.4.4.2. Fotodiyot Array Dedektr (Photodiode array dedector-DAD): UV/VIS dedektrden fark, 512 elementden oluan bir yzeyde, her elementin ayr bir dalga buyundaki absorbans e zamanl olarak lebilmesidir. Bu sayede 3 boyutlu kromatogramlar almak ve istenilen her pikin ok hzl spektrum taramasn grebilmek olasdr. Ayrca istenilen dalga boyu aralnda allabilmesi bu dedektrn salad bir dier nemli avantajdr. Kullanlan k kayna dteryum veya tungsten lambadr. 2.4.4.3.Floresans Dedektr (Fluorescence dedector-FLD): Organik maddelerin yaklak %15I fluoresans oluturma yeteneine sahiptir. Oluan fluoresans llmektedir. Kullanlan k kayna ksenon lamba olup, duyarll UV/VIS dedektre gre yaklak 103 kat fazladr. 2.4.4.4.letkenlik Dedektr (Conductivity dedector-CDD): letkenlik llr. Daha ok anyon ve katyon analizlerinde kullanlr. Scaklk kontrol ok nemlidir bu sebeple kolon frn ierisinde allmaldr. Kullanlan mobil fazn iletkenlii ne denli dk olursa oluan grlt de o denli dk olur. 2.4.4.5. Refraktif ndeks Dedektr (Refreactive index dedector-RID): Krlma indisi llr. Scaklktan etkilenir. rnek bileenlerinin bulunduu ortamda younluk artacandan gelen k krlarak hcreyi terkeder. In llen krlma oranndan (krlma indisi) kantitatif tayin yaplr. 2.4.4.6. Elektrokimyasal Dedektr (Electrochemical dedector-ECD): Elektroaktif maddeler analizlenebilir. Yani bileenler , belirli potansiyel deerlerinde ykseltgenebilir veya indirgenebilir olmaldr. llen fiziksel zellik tayin srasnda oluan elektrik akmdr.

2.4.4.7. Ktle Dedektr (Mass dedector-MS): rnek bileenlerine ait ok zgn kromatogramlar elde edilir, dolaysyla zellikle kalitatif tayinlerde tehis amal kullanmlarda ok nemli bir dedektrdr [2] . 2.4.5. rnek Hazrlanmas Kat rnekler: Bir rnei HPLC sistemine vermek iin, bu rnein, hareketli faz olarak kullanlan zcde znmesi gerekir. rnein, metanol/su karm bir hareketli fazla ile analiz yaplacaksa, rnek metanolde, suda veya metanol/su karmnda zlmelidir. Eer rnek byle bir zcde znmyorsa, dier bir zcde znmeli, fakat bu durumda kullanlan zc kesinlikle hareketli fazla karabilir olmaldr. rnek bileenlerinin, mobil faz zcsnde kmemesine de dikkat edilmelidir. Sv rnekler: Sv rneklerde zc, sistem ile uyumluysa, dorudan enjekte edilebilir. Eer rnekler istenen zcde deillerse veya enjekte edilecek kadar deriik deillerse, kurutulmaldr veya deritirilmelidir. Daha sonra hareketli fazda tekrar znmelidir. rneklerin szlmesi: Hareketli faz aknda azalmaya, geri basncnda artmaya, kolon veriminde azalmaya ve istenmeyen piklere neden olabilecek znmeyen maddelerin kolona girmesini nlemek iin, rnein enjeksiyondan nce szlmesi tavsiye edilir [5]. 2.4.6.HPLC Uygulamalar HPLC sistemi ile hangi analiz yaplacak ise ncelikle o analiz icin gerekli artlar salanr. Analiz yaplacak numuneden, analiz yaplacak bileenin saf olarak ayrtrlabilmesi iin uygun ekstraksiyon yntemi bulunur. Daha sonra o analiz icin uygun kolon, haraketli faz ve ak hznn eilmelidir. Btn bu artlar yerine getirildikten sonra analiz edilecek maddenin bilinen bir deriimdeki standart sisteme enjeksiyon edilir. Standart ok saf olduu iin deney sonucunda sadece tek pik gzlenmelidir. Standartn kolondan k sresi (alkonma sresi) tespit edilir. Analiz edilecek zelti sisteme enjekte edildii zaman elde edilen kromatogramda deiik zamanlarda gelen birden fazla pik olmas muhtemeldir. Bu nedenle de standartn alkonma sresine denk gelen pik o kromatogramda bizim aradmz pik olacaktr. Daha sonra deriimi bilinen standartn verdii pikin altnda kalan alan veya pik ykseklii ( h) hesaplanr. rnek kromotogramndaki yeri tespit edilen bilinmeyen bileenin pikinin altnda kalan alan veya ykseklik hesaplanr. Sonuta orant hesaplamas ile analiz edilen bileenin deriimi hesaplanr [5].

3.Deneysel Yntem 3.1.Deney Dzeneinin ematik Gsterimi ve Tantm

ekil 1: HPLC sisteminin basit ematik gsterimi [6] 3.2.Deney Koullar Sv kromatografisinde ayrmaya etki eden deikenlerden en nemlisi hareketli fazdr. yi bir hareketli faz; sabit fazn zelliklerini deitirmemeli, rnekteki bileenlerin hepsini zmeli, dk viskozitede olmal, (gerektiinde) ayrlan bileenlerden kolayca ayrlabilmeli (kolayca buharlaabilmeli), kullanlan dedektre uygun olmal, ekonomik ve istenen saflkta kolayca bulunabilir olmaldr. Yksek basnta yaplan kromatografide, sisteme verilmeden nce, hareketli fazn ierisindeki znm gazlar uzaklatrlmaldr; aksi halde sistemin dk basnl ksm olan dedektrde, znm gazlar (zellikle hava) kabarck olut urur. Bu durum, dedektrden ok hatal deerler alnmasna neden olur. Hareketli fazdan gaz uzaklatrma ilemi stma veya vakum uygulayarak olur. Sistemde ak hzn elde etmek iin hareketli faza basn uygulanr. Pompalanan hareketli fazn basncna dikkat edilmelidir. nk kullanlan kolonlarn dayanabildikleri maksimum basn deerleri bulunmaktadr. Karm bileenlerinin uygun ekilde ayrlmalarna olanak salamak iin ak hz iyi ayarlanmaldr. Eer ak hz dk olursa karm kromatografi sisteminde daha uzun sre tutulacak ve daha iyi bir ayrma salanacaktr. Ama bu durumda da alma sresi uzayacaktr. Bu sebeple optimum ak hz salanmaldr. Karm zmekte kullanlan zc hareketli faz ile uyumlu olmaldr. Polarlklar yakn olmal, kme, bulanma olmamaldr. Dedeksiyon hcresinde gaz kabarcklar oluursa, tayinde problemler ortaya kar. Gaz kabarcnn oluumunu nlemek iin u nlemler alnmaldr: 8

Sistemde sznt olmamaldr. Solvent HPLC sisteminde kullanlmadan nce degaze edilmelidir. Eter, pentan gibi uucu solventler sistemde buharlaacandan, bunlar kullanmaktan kanlmaldr [7].

3.3.Gvenlik Kaygs Cihazda elektrik kaa olmamasna dikkat edilmeli. Deneyler srasnda elden bulaabilecek kontaminasyonu nlemek iin eldiven kullanlmaldr. UV dedektr alr durumdayken cihazdan szabilecek nlardan korunulmald. Gzle temas geici krle yol aabilir. ncelenen rnek ve hazrlanan zeltilerin deriyle temas engellenmelidir. Pompalanan hareketli fazn basncna dikkat edilmelidir. nk kullanlan kolonlarn dayanabildikleri maksimum basn deerleri bulunmaktadr [8].

4.Sorular 4.1.Deney ncesi Aratrlmas Gereken Sorular 4.1.1. Kromatografi trleri nelerdir? Kromatografi, farkl fazlardaki denge esasna dayanarak, bir hareketli faz ile bir sabit faz yardmyla bir karmn bileenlerine ayrlmas ilemidir. Kromatografi iin hareketli faz, sabit faz ve bileenlerine ayrlacak karm ile kimyasal tepkimeye girmeyen uygun bir zelti olabilir; sabit faz olarak da genellikle farkl aplarda tanecik byklkleri olan kristal veya amorf yapdaki maddeler kullanlr. lem srasnda, bileenlerine ayrlacak konsantre haldeki karm, sabit fazn balang blgesine konur; sonra sabit fazn balang blgesinden ileriye doru hareketli faz ilerletilir. Hareketli faz, ilerleyii srasnda zd karmdaki maddeleri de sabit faz zerinde deiik hzlarda ilerletir; bileenler, sabit fazn farkl blgelerinde tutulurlar ve bylece birbirlerinden ayrlrlar. Ayrma mekanizmalarna gre ve ayrc materyale gre eitli kromatografi teknikleri vardr [9]. Ayrma mekanizmalarna gre kromatografi eitleri unlardr: a) yon deitirme kromatografisi b) Jel filtrasyon kromatografisi c) Adsorpsiyon kromatografisi d) Partisyon kromatografisi e) Affinite kromatografisi Ayrc materyale gre kromatografi eitleri unlardr: a) Dzeysel kromatografi: + nce tabaka kromatografisi + Kat kromatografisi 9

b) Kolon kromatografisi: + Gaz kromatografisi (GC) + Likit kromatografisi (LC) + Yksek performans likit kromatografisi (HPLC) 4.1.2. Gaz ve sv kromatografiyi hangi durumlarda uygulayabilirim? Sv kromatografisi dzlemsel yzeylere ve kolonlara uygulanabilir. Yani sv sv karm olan karmlar ayrmada kullanlr. Gaz kromatografisi ise gaz halinde bulunan veya kolayca buharlastirilabilen bilesenlerin birbirinden ayrilmasi amaciyla kullanilir. Bu yntemde ayrilma, bilesenlerin farkli kati yzeylerdeki farkli adsorpsiyon ilgilerine gre gereklesir [4]. 4.1.3. Kromatografik ayrma hangi parametrelerden etkilenebilir? Bir kantitatif analiz teknii olan kromatografide ayrmay etkileyen parametreler [9]: Kolon ile ilgili olanlar; Kolonun tr Kolonun boyutlar Hareketli faz ile ilgili olanlar; Hareketli fazn tr Hareketli fazn bileimi Hareketli fazn ak hz lm ile ilgili olanlar; Detektr tr Dalga boyu vb rnek ile ilgili olanlar rnein deriimi rnein hacmi

4.1.4. Deney yaparken hangi verileri kaydetmem gerekiyor? Alkonma zaman denen tR deerleri kaydedilmelidir. Bu deer her bir maddenin alkonma zamann gstererek maddenin enjeksiyondan kolona geene kadar olan sresini tespit etmemizi salar. 4.1.5. Deneyde elde edeceim verileri maddelerin molekl arlklar ile nasl ilikilendirebilirim? Polimerlerin fiziksel zellikleri molekl arl ile ilikilidir. Bu nedenle polimerlerden beklenen fiziksel zellikleri gsterebilmeleri iin belirli bir molekl arlna sahip olmalar gerekir. Genellikle molekl arlnn artmas ile yapda molekller aras ekim artmakda ve buda polimerin mekanik ve s zelliklerini etkilemektedir. Polimerlerin molekl arlklar, jel geirgenlik kromatografisi, viskozimetrik lm, ozmotik ve basn k salmas gibi yntemlerle belirlenebilir.

10

4.1.6. HPLC sistemini kullanrken nelere dikkat etmeliyim? Pompalanan hareketli fazn basncna dikkat edilmelidir. nk kullanlan kolonlarn dayanabildikleri maksimum basn deerleri bulunmaktadr. Karm bileenlerinin uygun ekilde ayrlmalarna olanak salamak iin ak hz iyi ayarlanmaldr. Eer ak hz dk olursa karm kromatografi sisteminde daha uzun sre tutulacak ve daha iyi bir ayrma salanacaktr. Ama bu durumda da alma sresi uzayacaktr. Bu sebeple optimum ak hz salanmaldr. Karm zmekte kullanlan zc hareketli faz ile uyumlu olmaldr. Polarlklar yakn olmal, kme, bulanma olmamaldr [10].

4.2.dev Sorusu Preparatif HPLC ile Analitik HPLC' yi tanmlayarak aralarndaki farklar aklaynz? Preperatif genel olarak, maddeleri ayrm yaparak saflatrma tekniidir. Preperatif tanm genel olarak HPLC teknii iin kullanlr, Prep HPLC nin Analitik HPLC den temel fark(baka farkllklar da var) ak hznn, kolonun ve enjeksiyon yaplan madde miktarnn yksek olmasdr. Burdan yola karak prep kolonlar da daha geni ve daha fazla dolgu maddesi ieren kolonlardr tek bir enjeksiyonda daha fazla madde ayrm salamak iin, baka sebepler de var. Preperatif dedektr ise genelde analitik dedektrn ak hcresini(flow cell) prep ak hcresi ile deitirerek oluturulan dedektr sistemidir. Prep sistemler yksek miktardaki kimyasal maddelerin genelde yksek deerdeki saflatrlmas ileminde kullanlr. Analitik hplc ile preparatif hplc arasndaki tek fark rnein dedektrden sonra izledii yoldur. Analitik HPLCde rnekler atk kabna atlrken preparatif HPLCde fraksiyon toplaycya gnderilir.

5.Kaynaklar [1] http://tr.wikipedia.org/wiki/Kromatografi [2] http://sci.ege.edu.tr/~eubio/yaz_okulu/hplc.htm [3] Instrmental Analiz, Prof.Dr. Turgut GNDZ, Gazi Kitapevi, 5. Bask, 1999 [4]http://www.forumfood.net/yuksek-performans-sivi-kromatografisi-hplc-t9907.html?t=9907 [5] http://www.muhendislikokulu.com/forum/forum_posts.asp?TID=61 [6] www.lcresources.com/resources/getstart/generic%20HPLC.gif [7] http://www.bilimfaresi.com/forum/viewthread.php?thread_id=60 [8] http://2kilobyte.org/biyom/kromatografik-yontemlerle-makromolekullerin-analizi/172 [9] www.analitik.hacettepe.edu.tr/Demolar/kromatografi.pdf [10] http://www.scribd.com/doc/2665797/HPLC-sistemleri [11] http://www.kimyaturk.net/index.php?topic=17025.0

11