HPLC

Yksek Performansl Sv Kromatografisi

HPLC Nedir?
HPLCnin Ksmlar:
Hareketli Faz Rezervuar
Pompa Sistemi
Numune enjeksiyon Sistemi
Kolon
Dedektr
HPLC eitleri
HPLC Uygulamalar
 HPLC

Yksek performans sv kromotografisi

(High Performance Liquid Chromatography : HPLC) ;
en yaygn olarak kullanlan analitik tekniklerden bir
tanesidir.

Kromatografik prosesler, durgun ve hareketli fazlar

arasnda ktle transferini kapsayan ayrma teknikleri
olarak tanmlanrlar.

HPLC; bir karmdaki bileenlerin ayrlmasnda sv

hareketli faz kullanr. Bu bileenler ilk olarak zgende
znrletirilirler ve daha sonra yksek basn altnda
kromatografi kolonundan gemeye zorlanrlar.
 Balangta basn; modern sv kromatografisinin temel kriteri
olarak dnlmekteydi ve bu nedenle Yksek Basn Sv
Kromatografisi olarak adlandrlmaktayd.

Ancak bu gnmzde geersiz kabul edilmektedir. nk yksek

performans yalnz basncn deil bir ok faktrn birlemesiyle ortaya
kmaktadr.

Bu faktrler ;
-Dar bir dalm aralnda ok kk partikllerin kullanlmas,
- Uniform gzenek boyutu ve dalm,
- Yksek basnta kolon paketleme,
- Doru, dk hacimli rnek enjektrleri,
- Duyarl dedktrler,
- yi pompalama sistemi kullanm,

olarak snflandrlr. Bu nedenlerden dolay Yksek Performans Sv

Kromatografisi terimi kullanlmaktadr.
 HPLCnn dier klasik tekniklerle kyaslandnda;

Kk boyutlu paslanmaz elik kolonlarn kullanlmas,

Partikl boyutlar ok kk (3,5-10 m) matrikslerin kullanlmas,
Yksek i basn ve kontroll ak hz salanabilmesi,
rnek gereksinimlerinin az olmas,
Srekli ak dedektrleri ile kk miktarlarn tayinine olanak
salamas,
Otomasyona msait olmas,
Hzl analiz imkan ve yksek ayrma gcne sahip olmas

nedeniyle ok ynl uygulamalara daha ak olduu

grlmektedir.

Bu gelimelerin; adsorbsiyon, dalm, iyon deiim, molekler

elek ve affinite kromatografi tekniklerine de yansmasyla hzl ve
daha iyi ayrm gc salanmtr.
 HPLCnn KISIMLARI

HPLC aletleri genelde;

hareketli faz rezervuar,

pompa,
enjektr,
kolon,
dedektr ve kaydedici (veya veri sistemi) ierirler.

Ayrma kolonda gerekleir.Durgun faz m boyutlu

porz partikllerden oluur, bu nedenle hareketli
fazn kolondan geii iin yksek basn pompalarna
ihtiya vardr.
 Kromatografik proses kolona rnein
enjeksiyonu ile balar.
Bileenlerin ayrlmas analit ve hareketli fazn
kolona pompalanmas ile devam eder.
Ayrlarak elue olan her bir kompenentin
pikleri kaydedilir.
Her bir komponent iin alnan dedektr cevab
bir kaydedici veya bilgisayar ekrannda
kromotogram olarak grntlenir.
 1- Hareketli Faz Kaplar ve zc
Muamele Sistemleri

Modern bir HPLC cihaznda bir veya daha ok

cam veya paslanmaz elik kaplar bulunur. Bunlarn
her biri 500 mLden daha fazla zc alacak
kapasiteye sahiptir.

Sistemde kullanlan hareketli fazn seimi

uygulanan ayrma tipine baldr. Bu nedenle sulu
tamponlardan hidrokarbonlara kadar farkl polaritede
zcler kullanlr. HPLC sistemlerinde kullanlacak
tm zgenler ok saf olmaldr. z miktardaki
safszlklar kolonu etkileyerek dedeksiyon sisteminde
giriime neden olabilirler.
 Tm solventlerin gaznn alnmas (degassing)
zorunludur, aksi taktirde zgende hava
kabarcklarnn bulunmas pompa ve kolonda
problemlere neden olmaktadr. (rnein; kolonda
kabarck oluturarak pik genilemesine yol aar.)

Gazn alnmas farkl ekillerde gerekletirilebilir;

solventlerin stlmas, kartrarak vakuma maruz
brakma, ultra sonifikasyon veya zgen rezervuarna
helyum gaz verilmesi.
 Sonu olarak hareketli fazda bulunmas
gereken zellikler; saflk, dedektre
uyumluluk, rnein znrl, dk
viskozite, kimyasal inertlik ve uygun fiyat
olarak sralayabiliriz.
 Hareketli faz , rnek ve sabit faz arasndaki
etkileimlerin ayarlanabilmesi iin deitirilmektedir.
Hareketli faz tipleri; izokratik, gradiyent ve
politipik olmak zere formda uygulanabilir.

zokratik elsyonda bileenler sabit bileimli tek bir

zc ile ele edilirler. Tm bileenler kolonda ayn
anda, farkl hzlarda g ederler.

Gradiyenet elsyon; polarlklar birbirinden farkl iki

(veya bazen daha fazla) zc sistemlerinin
kullanld tekniktir. zc bileimi srekli veya
basamakl olarak deitirilir.

Politipik hareketli faz, kark tip kromatografilerde

tercih edilebilir. Ayn kolonu kullanarak birok
kromatografik teknik iin uygulanabilir.
 Pompa sistemleri

HPLC pompas, sv kromatografi sisteminin en

nemli ksmlarndan bir tanesidir. Sistemde;
elentin; enjektr, kolon ve dedektr boyunca srekli
sabit akn salayan ksmdr.

HPLC analizlerinde kullanlan bir ok tip pompa

mevcuttur. Bunlar; Emme Basma Piston Pompalar,
rnga Tipi Pompalar ve Sabit Basn Pompalardr.
Sv kromatografide kullanlan pompalarn u zellikleri
bulunmaldr:

- 5000 psi (1b/in2) ye kadar basnlar oluturabilmeli,

- Pulssuz sv k bulunmal
- Ak hz 0,1den 10mL/dakikaya kadar
ayarlanabilmeli,
- Sv ak hzlarnn tekrarlanabilirlii %0,5 veya daha
iyi olmal,
- ok sayda zcnn korozyon etkisine kar
dayankl olmaldr.
 Numune Enjeksiyon Sistemi

rnekler; HPLCye enjeksiyon nitesinden

enjekte edilir. Enjeksiyon nitesi basit olarak
bir enjeksiyon valfi ve rnek haznesinden
oluur.

rnek Enjeksiyon ncesi hareketli fazda

zlerek bir rnga ile valften enjekte edilir.
 Kolon

HPLCde kullanlan ayrma kolonlar genellikle

paslanmaz elik olup yksek basnlara dayankldr.
Sklkla kullanlan kolonlar 4.5-5.0 mm i apl ve 10-
30 cm uzunluundaki kolonlardr. Ancak aratrmann
ihtiyacna gre ok farkl boyutlarda kolonlar ticari
firmalardan temin etmek mmkndr.
 Durgun Faz;
Kolon Dolgu Materyali:
HPLC durgun faz kolon iindeki kat destek
maddesidir. rnek solsyonunun, kolona enjeksiyonu
ile non-kovalent etkileim olmakszn durgun fazda
bileenlerin g sz konusudur.
Durgun faz ve rnein hareketli faz ile kimyasal
etkileimleri, g derecesi ve rnek bileenlerin
ayrlmasn belirler.
Uygulanacak kromatografi trnn prensibine
gre kolon dolgu maddeleri farkldr. (Kromatografi
tipleri; sv-kat adsorpsiyon, normal faz, zt- faz, iyon
deiimi vb.)
 Kolon dolgu materyalleri genellikle silika ve
almina esasldr; gzenekli (porz), kresel
spherical), dzensiz (irregular), pellikler (pellicular)
ve mikro tiplerinde olmaktadr.

Dolgu maddesinin seiminde tanecik biimi,

bykl, tanecik byklnn dalm, gzenek
hacmi ve yzey alan gibi zellikler rol oynar.
Yaplacak almann cinsine gre seim yaplmaldr.
 Kolonlarn doldurulmas

HPLC kolonlar; deiik dolgu materyali

yaplarnda ve boyutlarda ticari firmalardan temin
edilebilirler. Ancak birok aratrc ucuz olmas
nedeniyle kendi kolonlarn doldurmay tercih eder.
Kolon doldurulmasnda kullanlacak metot, dolgu
materyalinin tabiatna ve partikl byklne
baldr.
 Dedektr

Dedektrler, kolondan ele olan rnek

bileeninden alnan cevap dorultusunda sinyallerin
kromatogram zerinde pik olarak ifade edilmesini
salayan alettir. Dedektrler kolon sonrasna monte
edilir.
 HPLC iin ideal bir dedektr; geni konsantrasyon
aralnda; yksek duyarlla, dk grlt
seviyesine, bilinen seicilie sahip olmal ve
kromatografik rezolsyona kt etki yapmakszn
kolon akntsndaki bileiklere duyarl olmaldr. Byle
bir dedektr scaklk ve basntaki deimelere de
duyarsz olmaldr.

Kullanlacak dedektr sistemi, analizi yaplacak

numunenin cinsine uygun olmaldr.
Sv kromatografisinde en ok kullanlan
dedektrler, ultraviyole veya grnr n
absorpsiyonuna dayanrlar.
 HPLC ETLER

Sv kolon kromatografisinin snflandrlmas durgun faz

ve ayrma prosesinin tabiat zerine yaplyorsa bu durumda
drt snftan bahsedilebilir.

1) yon deiim kromatografisi

2) Molekler elek kromatografisi (Jel Filtrasyon)
3) Affinite kromatografisi
4) Adsorbsiyon kromatografisi

Normal Faz Kromatografisi Ters Faz Kromatografisi

 RP-HPLC (Ters Faz Kromatografisi) :

ok sayda organik bileii ayrabilme

yeteneinden dolay tercihen sklkla kullanlan HPLC
trdr. Durgun faz apolardr, hareketli faz ise polar
bir svdr. Apolar materyallerin kolonda tutulmas sz
konusudur.
 HPLC UYGULAMALARI

Preparatif HPLC, bileiklerin izolasyonu ve

saflatrlmas iin kullanlr.

Kimyasal ayrmalar, bir kolon ve hareketli fazda

bileiklerin farkl g hzlarna gre ayrlmas temeline
dayanr.

Saflatrma; hedef bileiin dier bileikler veya

kontaminantlardan ayrlmas ve ekstraksiyonudur. Her
bir bileik belirli kromatografik koullar altnda
karakteristik bir pike sahiptir. Ayrlmas istenen
bileenin ihtiyalarna gre aratrcnn koullar
optimize etmesi gerekmektedir.
 HPLC ile bileiklerin identifikasyonu yaplr.

Miktar tayini; konsantrasyonu bilinmeyen bir

rnein solsyonda tayin edilmesi; genelde rnein
standart zeltisinin bilinen farkl miktarlarnn kolona
verilmesi ve elde edilen deerlerin korelasyonunun
yaplmas ile mmkn olabilmektedir. Genelde
korelasyon pik alanlar veya pik yksekliklerinin
kullanlmas ile yaplr.
 Yksek Performansl Dalm Kromatografisinin
Tipik Uygulamalar

Uygulama Alan Karmlar

lalar Antibiyotikler, sedafitler, steroitler, analjezikler

Biyokimyasallar Amino asitler, proteinler, k.hidratlar, lipitler

Gda maddeleri Suni tatlandrclar, antioksidanlar,alfatoksinler

Endstriyel kimyasallar ok halkal aromatikler, boyalar, yzey aktif

mad.

Kirleticiler Pestisitler, herbisitler, fenoller, PCBler

Uyuturucular Uyuturucu ilalar, zehirler, narkotikler

Klinik Tp Safra asitleri, ila metabolitleri, re ekstraklar