İLAÇ ANALİZ TEKNİKLERİ

GAZ KROMATOGRAFİSİ
 Gaz Kromatografisi
Gaz kromatografisi tekniği ilk defa olarak James ve Martin
tarafından 1952 yılında uçucu yağ asitleri karışımlarının
analizlerinde ve ayrılmasında kullanılmıştır.
Hemen hemen tüm kimya, biyokimya , biyoloji ve
mühendislik alanlarında uygulamaları günümüzde
görülmektedir.
Bir değerlendirmeye göre (istatiksel bir araştırmada) gaz
kromatografisi sistemi dünyada 200.000’den fazla yerde
kullanılmaktadır.
Son yıllarda kromatografi, yaygın bir şekilde analitik bir metot
olarak kabul edilmiştir.
2
 Gaz Kromatografisi
Gaz kromatografisi, fiziksel ve kimyasal özelliklerindeki farklardan
yararlanarak, bir karışımı oluşturan bileşiklerin birbirinden
ayrılmasıdır.

Gaz kromatografisi, analitik kimya alanında gazların ve uçucu

maddelerin analizleri ve ayrılmasında uygun bir metot olarak yaygın
bir şekilde kabul edilmiştir.

Ölçmenin kısa sürede ve çok duyarlı şekilde başarılması da metodun

üstünlüğünü ortaya koymaktadır.

3
 Avantajı

Gaz kromatografisi yöntemi, çok etkili bir ayırma

olanağı sağlaması, ayrılan bileşenlerin tanımında
duyarlılık sağlaması, ayrılmanın hızlı oluşu, aynı
zamanda hemen hemen her grup ilaç maddesine
uygulanabilmesi bakımından da üstün bir farmasötik
ilaç analiz yöntemidir.
4
Gaz kromatografisinde iki faz mevcuttur;

1) Yarıçapı küçük, çok uzun bir boru içine yerleştirilmiş geniş

yüzeyli (gözenekli) bir maddeden meydana getirilen sabit faz
(kolon).

2) Bu sabit faz içindeki geniş yüzeyli (gözenekli) madde

arasından kolaylıkla geçebilen hareketli faz (bu faz inert, saf
ve uçucu bir gazdır ve genellikle azot ya da helyumdur).

5
 Gaz Kromatografisinin Türleri

Sabit fazın yapısına göre gaz kromatografisi ikiye ayrılır,

1) Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi

2) Sabit fazı sıvı olan gaz-sıvı kromatografisi (en çok

kullanılan gaz kromatografisi türüdür.)

6
Gaz-katı kromatografisi; adsorpsiyon olayına dayandığından elde edilen
pikler kuyruklu olduğu için ayrılmaları güçleştirirler. Bu nedenle gaz-katı
kromatografisi az kullanılır. Sadece H2, O2, N2, NO, CH4, C2H4, C3H6 ve
C3H8 vb. gazların analizlerinde kullanılmaktadır.
Gaz-sıvı kromatografisi; yüzeyi geniş gözenekli katı maddeye (sabit faza)
özel bir sıvı emdirilir. Bu sıvı, katı maddenin gözenekleri dahil bütün
yüzeyine dağılır ve sabit bir faz gibi davranır. Hareketli olan gaz fazı, bu
fazın içinden kolayca geçer. Analizi yapılacak numune içindeki maddeler
bu iki faz arasında özelliklerine göre dağılırlar. Ayırmanın yapıldığı
sıcaklıkta, ölçülebilen bir buhar basıncına sahip olan hemen hemen tüm
7
organik yapıların ayrılmasında kullanılabilir.
 Gaz Kromatografi Cihazı
Kromatografik sistem şematik olarak şekilde görülmektedir:         

8
Gaz Kromatografisi Cihazının Ana Kısımları

 Sürükleyici gaz, basınç ve akışı ayarlayan kısım,

 Numune enjekte etme kısmı,
 Kolon kısmı,
 Isıtma kısmı,
 Dedektör kısmı,
 Kaydetme kısmı.

9
Shimadzu marka bir GC cihazının genel görünümü.
10
 Taşıyıcı Gaz
Görevi; buharlaşmış maddeleri kolona taşımaktır. Gaz, içinde basınçlı
taşıyıcı gaz bulunan silindirden regülatör yardımı ile basıncı düşürülerek,
sabit akış hızında kolon sistemine gönderilir. Öteki kromatografi dallarında
olanın aksine, GC kromatografisinde ayrılmaları istenen maddelerle
hareketli faz arasında hiçbir etkileşme olmaz. Hareketli fazın görevi sadece
maddeleri taşımaktır.
Uygun bir taşıyıcı gaz;
a) Ayrılacak bileşik ve sabit fazla reaksiyona girmemeli,
b) Gaz difüzyonunu en düşük düzeyde tutabilmeli,
c) Saf, kolay bulunabilir ve ucuz olmalı,
d) Kullanılan dedektörlere uygun olmalıdır. 11
 Gaz Kromatografisi Kolonları

 Sistemin en önemli kısmıdır.

 Ayırma işlemi burada gerçekleşir.
 Ayırma işleminin başarılı olması, büyük ölçüde uygun kolon
seçimine bağlıdır.
 Kolonlar, bakırdan, alüminyumdan, paslanmaz çelikten, camdan
veya teflondan olabilir.
 Cam kolon, en çok tercih edilen kolondur ama kullanımı zordur.
 En çok kullanılan paslanmaz çelikten olan kolonlardır.
 Kolonların şekli, u-şeklinde veya spiral şeklinde olabilir.
12
 Kolon Tipleri
Dolgulu Kapiler

Dolgulu Kapiler

Uzunluk (metre) 0.5-10 5-100

İç Çap (mm) 2-4 0.1-0.25

13
Dolgulu Kolonlar; daha büyük miktarlardaki ayrımları
gerçekleştirebilirler. Daha çok preparatif çalışmalarda
kullanılırlar.
Kapiler Kolonlar; genellikle silika ve türevlerinden
yapılırlar. İç çapları 0,25-0,53 mm , ortalama uzunlukları
15-60 metredir. Kaplama film kalınlıkları ise 1 mikrondur.
Etkinlikleri (plato sayıları) dolgulu kolonlara göre daha
fazladır.

14
 Örneğin Kolona Verilmesi
Ayrılacak bileşikler, kolon girişine bir seferde verilir. Gazlar, gaz kaçırmayan
şırınga veya özel gaz muslukları kullanılarak, sıvılar şırınga kullanılarak,
katılar ise önce inert ve uçucu bir çözücüde çözülüp sonra şırınga kullanılarak
sisteme verilir. Madde, enjekte edildiği yerde, enjektör ısıtıcısının verdiği ısı
ile hemen buhar haline geçer ve taşıyıcı gaz ile sürüklenir.
Bir karışım içindeki maddeler, kolonun verimlilik derecesine bağlı olarak
kolonu farklı zamanlarda terk ederler. Maddeler kolonda iken, kolonun fırın
sıcaklığı, bu maddelerin buhar halinde bulunabileceği bir derecede sabit
tutulur. Kolondan farklı zamanlarda çıkan buhar halindeki maddeler, taşıyıcı
gaz ile dedektöre taşınır. Dedektör taşıyıcı gaz içindeki maddeyi alır ve bunu
bir sinyale çevirir. Sinyal maddenin konsantrasyonu ile orantılıdır. Bu
sinyaller sıra ile bir kaydediciye gönderilir. Yazıcıda her maddenin enjekte
edildiği andan kolonu terk ettiği ana kadar geçen zaman süreci içindeki
konsantrasyonu saptamaya yarayan piklerden ibaret bir grafik verir. Bu
grafiğe diferansiyel gaz kromatogramı denir.
15
Gaz Kromatogramı

16
17
18
Genel olarak, kullanılan kolonun çapına göre verilebilecek sıvı
miktarları aşağıdaki gibidir.

Kolon Hacmi Sıvı Miktarı

(inch) (ml)

1 0.02-2

1/4 0.2-20

1/8 0.04-4

1/16 (kapiler kolon) 0.004-0.5

19
 Sabit Faz
Uygun fazı seçmek için kullanılan kesin bir yöntem yoktur, ancak
uygun bir sabit faz sıvısı aşağıdaki özellikleri taşımalıdır:
a)Ayrılacak bileşikler için iyi bir çözücü olmalıdır.
b)Kimyaca inert olmalıdır.
c)Ayrılacak bileşiklerin hepsini çözmüyorsa, bir kısmını iyi
çözmelidir ki çözünmeyenler önce, çözünenler sonra kolonu terk
ederek ayrılma gerçekleşsin.
d)Uçucu olmalıdır (kaynama noktası yüksek olmalı).
e)Termal kararlılığı olmalı, sıcaklığa dayanıklı olmalı, kolon
sıcaklığında parçalanmamalıdır.
f)Ayrılacak bileşenlerle reaksiyona girmemelidir. 20
 Dedektörler

Bir GC dedektör, kolondan gelen taşıyıcı gaz içinde

bulunan binde kısım oranındaki yabancı bir gazı tespit
edebilen bir araçtır.

Bir gazın pikinin dedektörden geçme zamanı, en fazla bir

saniye kadardır.

21
Bir dedektörde aranan başlıca özellikler şunlardır :

a) Duyarlılığı yüksek olmalıdır.

b) Duyarlılığı geniş bir konsantrasyon aralığında olmalıdır.
c) Her çeşit bileşiğe duyarlı olmalıdır.
d) Gaz akış hızı ve sıcaklık değişimlerinden
etkilenmemelidir.
e) Sağlam olmalıdır.
22
Bütün bu koşulları sağlayan ideal bir dedektör yoktur,
ancak verileri bu şartlara yaklaşanlar vardır. Bunlar:

1) Isı İletken Dedektörler (TCD)

2) Alev İyonlaştırma Dedektörleri (FID)
3) Elektron Yakalama Dedektörleri (Çok az miktarda dedekte
edilebilir.)

23
 Isı İletken Dedektörler (TCD)
 En çok kullanılan dedektörlerdendir.
 Çeşitli gazların ısıyı değişik oranlarda iletmesi esasına dayanır.
 Konsantrasyon değişimine duyarlıdır.
 Böyle bir dedektörde, sabit bir akımla ısıtılmış volfram bir
telden yararlanılır.
 Taşıyıcı ve dedektör gazları aynı olmalıdır.
 Genellikle Helyum kullanılmakla birlikte, Hidrojen, Argon, Azot
ve Metan gibi gazlar da kullanılır.
24
 Alev İyonlaştırma Dedektörü (FID)
 Yüksek hassasiyeti ve kararlılığından dolayı en çok
kullanılan dedektördür.
 Kütle akış hızına duyarlıdır.
 Kolondan çıkan organik maddeler, hidrojen alevinde
yakılarak iyonlaştırılır ve meydana gelen pozitif iyonlar
dedektörde akım değişimine neden olur.
 Oluşan akım, birim zamanda alevden geçen karbon miktarı
ile doğru orantılıdır.
 C-H bağı içeren tüm bileşiklere duyarlı iken, sadece kükürt
bileşikleri, su, amonyak ve azot oksitlerine karşı duyarsızdır.
25
FID dedektör

26
 Elektron Yakalama Dedektörü (ECD)

 Sinyal artışı yerine sinyal kaybını ölçer.

 Taşıyıcı gaz (genellikle azot) radyoaktif bir ortamdan
geçerken iyonize olur.
 Hassasiyeti halojenli bileşikler ve azotlu bileşiklere karşı
yüksek, alkollere ve hidrokarbonlara karşı düşüktür.
 Dezavantajları; linearitenin dar olması, kullanım için izin
gerekli olması ve taşıyıcı gazın ultra saf olması
gerekliliğidir.
27
 Kaydetme (Recorder/ Integrator)
Detektörde algılanan akımın elektriksel sinyale çevrildikten
sonra, hesaplamaların rahatlıkla yapılabilmesi için bir
ölçekli şeritli kağıda kaydedildiği cihazlardır.
Pik çıkışları kaydediciden (recorder) alınır ve alan boyları
bulunduktan sonra faktörle çarpılarak hesaplama yapılır.
İntegratör ise hem kaydedici, hem de alan ve boylar ile
faktörlere göre hesabı kendi yapan daha komplike bir
kaydedicidir.
28
 Sıcaklık Kontrolü
Ayrılmanın kesin olarak aynı şekilde tekrarlanabilmesi
için üç kısmın sıcaklığının ayrı ayrı kontrol edilmesi
gereklidir. Bunlar;

1) Enjeksiyon kısmının sıcaklığı,

2) Kolon sıcaklığı,

3) Dedektör sıcaklığı.

29
Gaz Kromatografisinden Elde Edilen Yararlar
1) Verilen bir numune içindeki uçucu maddelerin sayısının
tayininde; verilen numuneden elde edilen her pik ayrı bir
maddeyi gösterir. Bu kromatografinin en önemli yönlerinden
birisidir.
2) Bir maddenin saf olup olmadığının araştırılmasında; saflığı
kontrol edilen madde birden fazla pik vermişse, safsızlık var
demektir. Piklerin altında kalan alanların birbirilerine oranı,
madde ve yabancı maddenin karışıma oranı kadardır.
3) Yeni geliştirilen bir metodun ne derecede duyarlı
olduğunun araştırılmasında kullanılır.
30
 GC’nin Kullanım Alanları:
Günümüzde;
 Biyokimya, biyoteknoloji, petrokimya, farmakoloji (eczacılık-ilaç
analizleri) alanlarında,
 Bitkisel yağlardan sterollerin ayrılmasında,
 Genetik, gıda sektörlerinde,
 Adli tıp toksikoloji laboratuarlarında,
 Amino asitlerin kalitatif ve kantitatif tayinlerinde,
 Temiz su, Atık su, Katı Atık ve Atık yağ numunelerinde bulunan
düşük miktarlardaki mineral yağ ve hidrokarbonların belirlenmesi
amacıyla ayırma ve analiz için kullanılmaktadır.
31
 GC’nin Endüstride Çok Kullanılmasının
Nedenleri:
a) İzomerler dahil çok karmaşık örneklerin bileşenlerine
ayrılabilmesi,
b) Hızlı bir şekilde sonuç alınabilmesi,
c) Çok az düzeyde (mikrolitre) örnek gerektirmesi,
d) Sistemin çok düşük buhar basıncı gösteren (kaynama noktası)
örneklerde bile kullanılabilmesi,
e) Diğer aletli analiz yöntemlerine oranla daha güvenilir ve basit
aletlerle analizlerin yapılabilmesi,
f) Nitel ve nicel olarak daha duyarlı sonuçların elde edilmesi ve
genellikle bu sonuçların yorumlarının kullanılması,
g) Sanayi için anında analiz yapılabilecek Gaz Kromatografisi
cihazlarının geliştirilmiş olmasıdır.
32
 Gaz Kromatografisi ile Kalitatif ve Kantitatif
İlaç Analizleri:
Kalitatif analizde en çok kullanılan yöntem, bilinmeyen madde ile
standardının aynı kolondan, aynı koşullar altında alınmış alıkonma
zamanlarını karşılaştırmaktır. Analiz örneği ile standardın ayrı ayrı
kromatogramlarının alınmasının yerine, her ikisinin karışımının
kromatogramı alınır. Eğer bilinmeyen madde standartla aynı ise bir
tane pik elde edilecek, aksi halde iki ayrı pik elde edilecektir.
Kantitatif analizde, pik alanı ile dedektörden geçen madde miktarı
arasındaki ilişki, pik alanlarından yararlanılarak miktar tayini yapma
olanağını sağlar. Bu amaçla bir seri standart çözelti hazırlanır ve bu
standart çözeltilerin konsantrasyonuna karşı, pik alanlarının değeri
kullanılarak bir grafik çizilir. Bu grafikten, miktarı tayin edilecek
maddenin kromatogramdaki pik alanı değerine karşı gelen madde
miktarı bulunur. 33