10.10.2013.

POPRAVAK DNA

Oteenja DNA

spontana oteenja
deaminacija adenina, gvanina i citozina
spontani gubitak amino-grupe
posljedica: supstitucija baza (dolazi do mutacija) ili zastoj
sinteze

oteenja DNA mogu biti

spontana
inducirana (kemijskim i fizikim faktorima)

posljedica
H se spaja s C

tranzicija AT-GC

ne spaja se

zastoj sinteze

tranzicija CG-AT

U se spaja s A

depurinacija i depirimidinizacija
spontani gubitak baze
nastaje tzv. AP (apurinsko/apirimidinsko) mjesto
posljedica: zaustavljanje replikacije ili jednolanani lom u DNA

inducirana oteenja
UV svjetlo
UV zraenje
pogrena veza

uzrokuje nastajanje pirimidinskih dimera

~ povezuju se susjedne pirimidinske baze
ciklobutanskim prstenom
naruava se struktura DNA

depirimidinizacija = gubitak adenina ili gvanina

prije

poslije

gubitak baze

depurinacija = gubitak citozina ili timina

UV foton

10.10.2013.

Popravak oteene DNA

inducirana oteenja
alkiliranje
adicija metilne ili etilne skupine uslijed djelovanja alkilirajuih
agensa

izravni popravak
enzimska fotoreaktivacija
uklanjanje alkil-grupe iz alkilirane baze
popravak izrezivanjem (ekscizijom)

adicija velikih kemijskih grupa na DNA

uslijed djelovanja citotoksinih, mutagenih ili kancerogenih
agensa

izrezivanje baza
izrezivanje nukleotida
popravak povezan s transkripcijom
popravak pogreno sparenih baza
translezijska sinteza DNA
rekombinacijski popravak

? enzimska fotoreaktivacija

? uklanjanje alkil grupe s alkilirane baze

enzim fotoliaza nakon apsorpcije vidljive svjetlosti cijepa pirimidinski

dimer

npr. popravak O6 - metilgvanina

UV

nastajanje dimera

DNA-fotoliaza

vezanje enzima

vidljiva svjetlost

popravljena DNA

~ enzim O6 -metiltransferaza prenosi metilnu grupu s O6 -metilgvanina

na cistein koji se nalazi na njegovom aktivnom mjestu

izravni popravak
enzimska fotoreaktivacija
uklanjanje alkil-grupe iz alkilirane baze
popravak izrezivanjem (ekscizijom)
izrezivanje baza
izrezivanje nukleotida
popravak povezan s transkripcijom
popravak pogreno sparenih baza
translezijska sinteza DNA
rekombinacijski popravak

10.10.2013.

? popravak izrezivanjem nukleotida - prokarioti

? popravak izrezivanjem baza

oteena baza

oteenu ili pogrenu bazu prepoznaje

DNA-glikozilaza

DNA glikozilaza

kida vezu izmeu baze i deoksiriboze

nastaje AP mjesto
~

AP mjesto

oteeni nukleotid

nema baze, ostaje samo eer

Uvr ABC kompleks

AP mjesto prepoznaje AP endonukleaza

AP endonukleaza
deoksiribozafosfodiesteraza

izrezuje oligonukleotid od 12-13 baza

kida lanac DNA hidrolizom fosfodiesterske

veze
helikaza

deoksiriboza-fosfodiesteraza uklanja
deoskiribozu

DNA polimeraza I
DNA ligaza

oteenu DNA prepoznaje UvrABC

kompleks

DNA polimeraza I popunjava pukotinu

DNA ligaza lijepi lanac DNA

? popravak izrezivanjem nukleotida - sisavci

DNA polimeraza I
DNA ligaza

helikaza uklanja nukleotid s oteenim

bazama
DNA polimeraza I popunjava pukotinu
DNA ligaza lijepi lanac DNA

? popravak izrezivanjem nukleotida sisavci

prepoznavanje mjesta oteenja (XPC protein)

vezanje proteina koji stabiliziraju jednolananu
DNA
XPA i RPA (replikacijski protein A)

izrezivanje nukleotida ~30pb oko mjesta

oteenja

vezanje helikaza i odmotavanje ~25pb oko mjesta

oteenja

TFIIH protein
~ ima helikazne podjedinice XPB i XPD

popunjavanje nastale pukotine

DNA-polimeraza d
ligaza

vezanje endonukleaza koje cijepaju DNA

na 3 i 5 kraju mjesta oteenja
proteini XPG i XPF/ERCC

? popravak povezan s transkripcijom - prokarioti

specifian je za popravak oteenja unutar gena koji se prepisuju
RNA polimeraza se zaustavlja na
mjestu oteenja

zaustavljenu RNA polimerazu

prepoznaje specifian protein
faktor povezan s tranksripcijom
(Mfd) i uklanja ju

vezanje UvrABC kompleksa i

izrezivanje oteenja

? popravak povezan s transkripcijom - sisavci

specifian je za popravak oteenja unutar gena koji se prepisuju
RNA polimeraza se zaustavlja na
mjestu oteenja

vezanje proteina koji prepoznaju

zaustavljenu RNA polimerazu
CSA i CSB
vezanje proteina koji stabiliziraju
jednolananu DNA
XPA i RPA
vezanje helikaza
TFIIH (XPB i XPD)

10.10.2013.

vezanje endonukleaza i cijepanje

oteene DNA
XPG i heterodimer XPF/ERCC1
global genome nucleotide
excision repair (GG-NER)

popunjavanje pukotine
DNA polimeraza d

transcriptional coupled nucleotide

excision repair (TC-NER)

XPC uvijek dolazi u

kompleksu sa hHR23B

lijepljenje lanca DNA

DNA ligaza

izravni popravak
enzimska fotoreaktivacija
uklanjanje alkil-grupe iz alkilirane baze

? popravak pogreno sparenih baza - prokarioti

krivo sparenu bazu prepoznaje i na nju se

vee protein MutS

popravak izrezivanjem (ekscizijom)

izrezivanje baza
izrezivanje nukleotida
popravak povezan s transkripcijom
popravak pogreno sparenih baza

na MutS se vee protein MutL

translezijska sinteza DNA

rekombinacijski popravak

kod prokariota roditeljski i novosintetizirani lanac se razlikuju, jer

je DNA modificirana metilacijom adenina
na protein MutL se vee protein MutH,
koji prepoznaje nemodificirani roditeljski
lanac i kida ga

do metilacije dolazi nakon replikacije, pa novosintetizirani

lanci nisu metilirani

MutH se zatim otputa, a MutS i MutL,

zajedno s helikazom i egzonukleazom
izrezuju dio lanca koji sadri pogreno
sparenu bazu

DNA polimeraza popunjava pukotinu

ligaza zatvara pukotinu

kod eukariota prepoznavanje se temelji na tome to lanac kalup

nema nikakav prekid
~
~

u vodeem lancu prekid je na rastuem 3 kraju

u zaostajuem lancu prekid je na 3 i 5 kraju Okazakijevih
fragmenata

10.10.2013.

? popravak pogreno sparenih baza sisavci

krivo sparenu bazu prepoznaje i na nju se

vee protein MSH
~ dimer je MSH2+MSH6

na kompleks DNA-MSH vee se protein

MLH
~ dolazi kao heterodimer

vezanje egzonukleaze
izrezivaje dijela lanca s oteenjem
DNA polimeraza popunjava pukotinu
ligaza zatvara pukotinu

? translezijska sinteza DNA

izravni popravak
enzimska fotoreaktivacija
uklanjanje alkil-grupe iz alkilirane baze
popravak izrezivanjem (ekscizijom)
izrezivanje baza
izrezivanje nukleotida
popravak povezan s transkripcijom
popravak pogreno sparenih baza
translezijska sinteza DNA
rekombinacijski popravak

? translezijska sinteza DNA

regularna DNA polimeraza se zaustavlja

na mjestu oteenja

specijalizirana DNA polimeraza

prepoznaje mjesto oteenja i vee se
na njega, a regularna DNA polimeraza
disocira

nakon sinteze DNA preko mjesta

oteenja, otputa se specijalizirana i
sintezu nastavlja regularna DNA
polimeraza

oteenje se uklanja izrezivanjem nakon

zavrene replikacije
specijalizirana DNA polimeraza nastavlja
sintezu preko mjesta oteenja

izravni popravak
enzimska fotoreaktivacija
uklanjanje alkil-grupe iz alkilirane baze

? rekombinacijski popravak

popravak izrezivanjem (ekscizijom)

izrezivanje baza
izrezivanje nukleotida
popravak povezan s transkripcijom
popravak pogreno sparenih baza
translezijska sinteza DNA
rekombinacijski popravak

10.10.2013.

mehanizam nehomolognog spajanja krajeva

mehanizam homologne rekombinacije

~ praznina u novosintetiziranom lancu koja se nalazi nasuprot dimeru u
roditeljskom lancu, popunjava se homolognim segmentom sestrinskog lanca

~ mutagen je, jer se uklanja nekoliko pb oko mjesta loma

DNA s oteenjem

oteeni roditeljski lanac

novosintetizirani lanac s prazninom
normalni heliks DNA

oteeni roditeljski lanac

popravljeni novosintetizirani lanac
normalni novosintetizirani lanac
roditeljski lanac s prazninom

DNA s oteenjem
normalni heliks DNA

Hollidayev model homologne ili ope rekombinacije

rekombinacija je cijepanje i ponovno spajanje dvije DNA
molekule, pri emu dolazi do izmjene njihovih genetikih
informacija
homologna rekombinacija je rekombinacija izmeu dvije
homologne molekula DNA

REKOMBINACIJA

Hollidayev model
roditeljske molekule DNA

istovremeni urezi u obje roditeljske

molekule

djelomino razmotavanje lanaca i sparivanje

komplementarnih baza izmeu zarezanih
roditeljskih lanaca
nastaje struktura na kojoj se vidi prekrienje
(Hollidayeva veza)
~ prolazi niz rotacijskih izmjena

10.10.2013.

novi model s objanjenjem inicijacije rekombinacije

proteini ukljueni u izmjenu lanaca

" prokarioti protein RecA

dvolanani lom DNA

a) vezanje RecA proteina na jednolananu DNA

b) vezanje RecA proteina na drugu, dvolananu DNA

razgradnja nukleazom u 5-3

smjeru u oba lanca

c) sparivanje baza jednog lanaca dvolanane DNA s

jednolananom DNA

jednolanani krajevi zalaze u drugu

roditeljsku molekulu i spajaju se
komplementarne baze
d) disociranje drugog lanca dvolanane DNA

pukotine se popunjavaju
sintezom i zatvaraju ligacijom

" eukarioti proteini Rad51 i Dmc1

proteini ukljueni u razrjeenje Hollidayeve veze

" prokarioti proteini RuvA, B i C

RuvA prepoznaje
Hollidayevu vezu

RuvB potie migraciju

prekrienja

O
okomiti rez

vodoravni rez

proteini ukljueni u razrjeenje Hollidayeve veze

" prokarioti proteini RuvA, B i C

rotacijske izmjene

RuvC cijepa
Hollidayevu vezu

" eukarioti endonukleazni kompleks Mus81-Eme1

10.10.2013.

PRESLAGIVANJE DNA

crossing-over tokom mejoze

mjesno-specifina rekombinacija

odvija se izmeu specifinih kratkih homolognih sljedova

u podrujima DNA koja nisu potpuno homologna
kod kraljenjaka ima vanu ulogu u stvaranju
imunoglobulinskih gena i gena receptora T-stanica tokom
razvoja imunolokog sustava
za imunoodgovor su vani:
B-limfociti izluuju protutijela (imunoglobulini)
T-limfociti izluuju proteine stanine povrine (receptori Tstanica)

mjesno-specifina rekombinacija

imunoglobulini i receptori T-stanica

vrlo raznoliki
kodirani limfocitnim genima
nastaju tokom razvoja imunolokog sustava uslijed mjesnospecifine rekombinacije izmeu razliitih segmenata
imunoglobulina i gena za receptore T-stanica

transpozicija posredovana DNA intermedijarima

transpozicija = premjetanje sljedova unutar genoma

nema homologije izmeu sljedova

transpozoni
pokretni genetiki elementi koji se mogu ubaciti ili izdvojiti iz
molekule DNA neovisno o sustavu rekombinacije stanice
mogu se premjetati putem DNA ili RNA intermedijara

insercijski sljedovi
najjednostavniji transpozoni koji se premjetaju putem DNA
intermedijara
sadre samo gen za enzim transpozazu
na krajevima imaju ponavljajue sljedove
baze na jednom kraju sekvence ponavljaju se u obrnutom
redoslijedu obzirom na baze na drugom kraju

imunoglobulini su graeni od lakih i tekih lanaca

~lanci imaju varijabilna i konstantna podruja
~varijabilna podruja su odgovorna za vezanje antigena

premjetaju se unutar genoma, ali se pri tome ne repliciraju

transpozicija posredovana RNA intermedijarima

retrotranspozoni
premjetaju se preko RNA-intermedijara
transpozon se prvo prepisuje u RNA, a zatim se
reverznom transkripcijom RNA prepisuje u DNA
mehanizam je slian premjetanju retrovirusa

10.10.2013.

retrovirusi

retrovirusu slini elementi

njihov genom ini jednolanana RNA

kada retrovirus inficira stanicu, RNA ulazi u stanicu i u njoj se
stvara dvolanana DNA kopija molekule DNA djelovanjem
enzima reverzne transkriptaze
na krajevima tako nastale DNA nalaze se ponavljajui sljedovi
LTR (duga terminalna ponavljanja)

imaju LTR sljedove

kodiraju reverznu transkriptazu i integrazu
premjetaju se poput retrovirusa

LINE-elementi (visokoponavljajui dugi raspreni elementi)

~ nemaju LTR sljedove
~ kodiraju reverznu transkriptazu i integrazu
~ na 3 kraju imaju sljedove bogate adeninom

SINE-elementi

(visokoponavljajui kratki raspreni elementi)

~ nastaju reverznom transkripcijom malih molekula RNA

~ ne kodiraju funkcionalne produkte
~ predstavljaju pseudogene

doraeni pseudogeni

amplifikacija gena

uzastopne replikacije odreenog kromosomskog podruja

posljedica: povean broj kopija gena unutar stanice
inaktivna kopija gena
nastaju reverznom
transkripcijom mRNA
na krajevima imaju
sekvence bogate adeninom
nemaju introne
nemaju promotore