AGRONOMSKI FAKULETE

SVUILITA U ZAGREBU

Tea Odak, dipl. ing.

MOLEKULARNO-BIOLOKA OBILJEJA ENDEMSKE

MEKOUSNE PASTRVE (SALMOTHYMUS
OBTUSIROSTIRS SALONITANA)

Magistarski rad

Zagreb, 2004.

1. UVOD
Hrvatska je u svjetskim ihtiolokim krugovima poznata po postojanju
brojnih endemskih vrsta i podvrsta riba (Economidis i Banarescu, 1991).
Razlog izuzetne specijacije slatkovodne ihtiofaune je postojanje dva velika
rijena sliva, dunavskog i jadranskog na relativno malom podruju, koji su u
Sloveniji meusobno odijeljeni Alpama, a u Hrvatskoj Dinaridima. Jadranski
sliv, sa pripadajuom povrinom od 23800 km2 ubraja se meu najmanja
ihtiofaunska podruja ovog dijela Europe. Rijeke toga sliva znatno se
meusobno razlikuju po duini toka i mjestu poniranja, (jezero, more ili krake
rupe), a ako ih usporedimo s rijekama Dunavskoga sliva, uoavamo da su
izrazito kratke i izolirane (Mrakovi i sur., 1995). Procesom specijacije u
njima su se razvile endemske riblje vrste i podvrste (ponajprije iz porodice
pastrva, Salmonidae te aranki, Cyprinidae, ali i druge). Gotovo svaka rijeka
tog podruja ima bar jednu endemsku vrstu. Iako su posljednjih godina vrena
su brojna istraivanja ihtiofaune (Popovi, 1985; Bianco i Kneevi, 1987;
Mrakovi i Mieti, 1989), postoji ipak odreeni broj nedovoljno opisanih
vrsta, pa premda se brojni istraivai slau da se radi o vrlo interesantnom
podruju (Lelek, 1989), mali se broj istraivaa bavio ekologijom, biologijom,
taksonomijom i meuvrsnim odnosima riba. Za razliku od tropskog pojasa,
danas je rijetkost u Europi nai neku nepoznatu vrstu kraljenjaka. Pa ipak je
u Hrvatskoj jo prije nekoliko godina otkrivena nova vrsta glavoa
Knipowitichia mrakovcici (Mrakovi i Kreovec, 1997).

Po nekim teorijama, baziranim na fosilnim i paleogeografskim

istraivanjima (Bianco,

1990;

Snoj,

2001),

endemi

jadranskog

sliva

predstavljaju ostatke populacija, izvedenih iz primarnih paratetskih riba, koje

su prodrijele u Jadransko podruje prije pet milijuna godina, kada je cijelo
Sredozemno more bilo djelomino punjeno sa slatkom vodom iz Paratetisa.
Nakon invazije slane vode kroz Gibraltarski kanal, ribe u Jadranskom moru su
nestale, a preivjele su samo one koje su ivjele u peri-Jadranskim prastarim
rijekama. Te ribe su kasnije bivale ugroene sa nekoliko ledenih doba. Upravo

njihova dugotrajana izoliranost uzrokovala je formiranje nekoliko razliitih

homogenih populacija.
Mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostris salonitana) je endemska
pastrva sa izvornim stanitem u rijeci Jadro, pokraj Splita. Naknadno je dio
populacije prebaen i u rijeku rnovnicu, te danas ona i tamo obitava. Spada
u porodicu Salmonidae. Kao i ostale podvrste roda Salmothymus (S. o.
oxyrhynchus, S. o. krkensis i S. o. zetensis), ograniena je na usko podruje
rasprostranjenja, te i najmanji utjecaji na njeno stanite imaju znatno
djelovanje na malu populaciju. U rijekama gdje uz mekousnu pastrvu ivi i
potona pastrva javlja se problem mogueg krianja izmeu dviju vrsta i
nastanak hibrida.
Prepoznati hibride izmeu potone i mekousne pastrve vrlo je teko,
stoga su uz morfoloke koritene i molekularne metode razlikovanja
populacija.
Kod endemske mekousne pastrve solinke (Salmothymus obtusirostris
salonitana) evolucijska povijest, klasifikacija i filogenetsko mjesto u skupini
salmonida nisu jo odreeni. Takoer jo nije jasno utvreno da li se solinka
kria sa potonom pastrvom (Salmo trutta), te ako da, da li to ugroava
njezino postojanje. Stoga je osnovni cilj ovoga rada bio odrediti molekularno
genetsku strukturu solinke te na taj nain odgovoriti na gore navedena pitanja.
Pri tome emo uz klasine morfoloke metode koristiti dva tipa molekularnih
metoda analizu mitohondrijske i nuklearne DNA (mikrosateliti i gen za laktat
dehidrogenazu). Mitohondrijska DNA, koja je radi strukturalne jednostavnosti
genoma, hipervarijabilnih regija, homozigotnosti i drugih svojstava jedan od
najprimjenjenijih alata za molekularno genetske i populacijske studije, te
mikrosatelitska DNA, koja radi svoje lokusne specifine hipervarijabilnosti
predstavlja odlian molekularni alat, s kojim je mogue utvrditi razlike na nivou
roda, ali i niih taksonomskih jedinca da bismo to potpunije ispitali
podudaranje evolucijske dinamike mitohondrijske i nuklearne DNA.

1.1. PREGLED LITERATURE

1.1.1. Openito o Salmonidima
Porodica Salmonidae pripada u red Salmoniformes, koji spada u grupu
primitivnih Euteleostei. Red Salmoniformes sastoji se od dva podreda:
Osmeroidei i Salmonoidei.
Vrste

podreda

Osmeroidi

razvrstane

su

est

porodica,

rasprostranjene su u sjevernim dijelovima Atlantskog i Tihog oceana. ive u

priobalnim zonama, odakle za vrijeme mrijesta ulaze u rijeke. U nekim
dijelovima areala dostiu veliku brojnost, pa ine ekonomski vane ribe.
Salmonidi su karakteristini za sjevernu Zemljinu hemisferu. Nalazimo
ih u morima i rijekama Europe, sjeverne i zapadne Azije, sjeverne Amerike i
Afrike. Radi njihove ekonomske i portske vrijednosti introducirane su i u vode
june Amerike, Novog Zelanda i Australije (Wheeler, 1992).

Sistematika Salmonidae prema Stearley i Smith (1993).

Red: Salmoniformes
Podred: Salmonoidei
Porodica: Salmonidae Regan, 1914
Podporodica: Coregoninae (ozimice)
Podporodica: Thymallinae (lipljani)
Podporodica: Salmoninae
Rod: Brachymystax
Rod: Platisalmo
Rod: Salmothymus
Vrsta: Salmothymus obtusirostris (mekousne pastrve)
Rod: Acantholingua
Rod: Hucho (mladice)
Rod: Salvelinus (zlatovice)
Rod: Oncorhynchus (pacifiki lososi i pacifike pastrve)
Rod: Salmo
Vrsta: Salmo salar (atlantski losos)
Vrsta: Salmo trutta (pastrva)

Slika 1: Shematski odnos izmeu rodova Salmonidae (Glubokovsky, 1995)

Podred Salmonoidei ukljuuje anadromne grupe, koje vei dio ivotnog

ciklusa provode u morima, sa spektakularnim migracijama u slatke vode za
vrijeme mrijesta. Zaviajno ponaanje je jako izraeno. Kod anadromnih
slatkovodnih riba primarna se metamorfoza dogaa za vrijeme nizvodnih
migracija, a sekundarna tijekom uzvodnih migracija pred period mrijesta. Kod
pripadnika roda Salmo dolazi do regresivne metamorfoze, odnosno do
gubljenja morfolokih karakteristika nastalih sekundarnom metamorfozom
tijekom njihovih nizvodnih migracija nakon reprodukcije. Ciklus morfolokih
promjena dogaa se svaki put u vrijeme mrijesta (Saunders i Schom, 1985).

Prema

postojeoj

klasifikaciji,

podporodica

Salmoninae,

uz

podporodice ozimica (Coregoninae) i lipljena (Thymallinae) sainjava

porodicu Salmonidae. Prema njihovoj morfologiji Coregoninae i Thymallinae
su evolucijski jako stare, dok su Salmoninae napredniji i noviji oblici.
Paleontoloki dokazi ukazuju na pojavljivanje salmonidnih vrsta u periodu
kasnog tercijara, u epohi pliocena, dok su u pleistocenu ve iroko
rasprostranjene. Njihovi su preci pripadali redu sleovki (Clupeiformes),
(Smith i sur., 1982). Mnogi se znanstvenici slau da Salmonidae potjeu iz
slatkih voda (Neave, 1958; Vladykov, 1963), iako postoje i oni koji vjeruju u
njihovo prvotno morsko stanite (Schmidt, 1947). Brojne studije o porijeklu
Salmonidae bave se filogenetskim odnosima izmeu rodova, oslanjajui se

pritom na morfoloke (Jankovi, 1961; Delling i sur., 2000), karioloke

(Svrdson, 1945; Simon, 1963) i genetske (Giuffra i sur., 1996; Bernatchez,
2001) podatke, pri emu su sastavljena razliita filogenetska stabla. Meutim,
gotovo svi se slau da su rodovi Salmo i Oncorhynchus evolucijski
najnapredniji i najbolje proueni (Domanico i sur, 1997), dok je mjesto ostalih
rodova

jo

pod

znakom

pitanja

(npr.

Platysalmo,

Acantholingua,

Salmothymus), (Osinov, 1999).

Sloena sistematika porodice Samonidae pripisuje se njihovoj izuzetnoj
sposobnosti adaptacije koja je proizala nakon tetraploidnog dogaaja, koji se
zbio kod njihova pretka prije 50 do 100 miliuna godina (Allendorf i Thorgaard,
1984). Tezu da Salmonidae imaju poliploidno porijeklo, prvi je propagirao
Svardson 1945. godine. On je promatrao kromosomski broj salmonidnih vrsta
i utvrdio njegovo opadanje u umnoku sa 10. Tek kasnije, 1970. godine Ohno
predlae konkretne dokaze tezi da Salmonidae imaju tetraploidno porijeklo, a
to su:
- Koliina DNA u stanici Salmonidae je 80% vea od koliine DNA koju
nalazimo u sisavaca, a to je gotovo dvostruko vie od DNA u
stanicama drugih srodnih riba.
- Salmonidae imaju obino oko 100 kromosoma to je gotovo dvaput
vie od drugih srodnih riba.
- Multivalentnost je esto naena u mejotikim preparatima od nekoliko
salmonidnih vrsta.
- Salmonidae nose velik broj dupliciranih enzimskih lokusa.

Slika 2: Podruje rasprostranjenosti porodice Salmondiae (Maitland, 1995)

Osnovna obiljeja koja su zajednika za vrste ove porodice su:

sitna masna peraja na leima, iza lene peraje

kratka lena peraja

itavo tijelo, izuzev glave, pokriveno sitnim ljuskama

dodatna kost na gornjo-vilinoj kosti

velika usta

iljasti zubi, osim na eljustima, koji su proireni i na jezik

izraena bona linija

velik broj pilorikih nastavaka (izmeu 17 i 210)

veliki riblji mjehur

ribolovno su interesantne

mrijeste se u slatkoj vodi (Vukovi i Ivanovi, 1971)

Sve salmonidne vrste riba obitavaju iskljuivo u hladnim, bistrim i

nezagaenim potocima, rjeicama ili rijekama brzog toka, koje su bogate
otopljenim kisikom, ili u planinskim jezerima gdje se temperatura vode kree
oko 10oC i koja, ni u najtoplije doba godine ne prelaze 18oC ili 20oC. To su
sve reofilne vrste riba, vretenastog oblika tijela, prilagoenog ivotu u brzim
rijenim tokovima.
Salmonidae su izraziti predatori, jedu ivu hranu, stoga im je eludac
prilagoen probavi hrane animalnog porijekla, irok je i miiav.
Sazrijevanje gonada riba iz ove porodice nastupa u kasnim jesenskim
danima, od studenog do prosinca. Izuzetak su mladica (Hucho hucho) i
mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostis) koje se mrijeste u proljee
(oujak travanj). Relativna plodnost kod salmondinih vrsta riba je poprilino
mala, kod potone pastrve se kree oko 1500 jaja, a kod mladice oko 12 000
jaja na 1 kg tjelesne teine (Aganovi, 1979).
Salmonidae su slatkovodne ribe, no mnoge od njih imaju hranidbene
migracije u more, a u slatke vode se vraaju kada su zrele za mrijest. Nagon
odlaska u more nakon izvaljivanja vie je izraen na sjeveru. Stoga svi
salmonidi arktikih rijeka migriraju u more, dok se oni sa junih predjela
ogranieni na slatke vode. Mnoge od tih junih populacija je ograniavaju su
na jezera i rijeke, koje su kolonizirale tijekom perioda irenja polarnog leda, a
9

u kojima su ostale zarobljene podizanjem temperature mora. ivei u tim

stanitima tisuama godina znatno su promijenile svoj izgled i ponaanje.
Razlike u njihovim stanitima uvjetovale su veliku fenotipsku razliitost i
genetsku izolaciju odvojenih populacija. Stoga je sistematika porodice
Salmonidae izuzetno sloena. Vie od pedeset razliitih vrsta opisano je kroz
prola dva stoljea, u kojima danas prepoznajemo samo jednu, Salmo trutta
(Behnke, 1986). Utvrivanje tonog filogenetskog odnosa unutar porodice
Salmonidae je vrlo vano pri njihovoj zatiti, budui da se mnoge vrste unutar
ove porodice smatraju ugroenima (Crivelli, 1996). Kod prijanjih klasifikacija,
koje su se bazirale uglavnom na morfolokim i ekolokim karakteristikama,
uoene su brojne nepravilnosti. Kod nekih rodova (Oncorhynchus, Salmo,
Salvelinus, Brachymystax i Hucho) klasifikacija je obnovljena zahvaljujui
molekularnim metodama (Phillips i Oakley, 1997).

POTONA PASTRVA Salmo trutta, Linnaeus 1758

Potonu pastrvu kao autohtonu vrstu nalazimo na irokom podruju od

Europe i Azije do Sjeverne Amerike. Rasprostranjena je od sjevera Norveke
do sjeverno-istonog dijela Rusije te juno do Atlas gorja u sjevernoj Africi.
Sastoji se od brojnih, udaljenih geografskih oblika, velike fenotipske
razliitosti. Osnovna karakteristika pastrve je vretenasto, izdueno tijelo.
Odlian je i brz pliva. Na trupu ispod i iznad bone linije nalaze se
mnogobrojne crne toke. Na glavi su izraena velika usta u kojima su zubi
rasporeeni u dva reda koje zadrava tijekom cijelog ivota. Gornja vilica
dosee do zadnjeg oboda oka. Na prvom krnom luku ima od 18 do 24
branhiospina, a broj pilorikih nastavaka varira od 40 do 100. Diploidni broj
kromosoma iznosi 84, uz znatno variranje u intraspecijskim formama.
Za vrijeme mrijesta izraen je spolni dimorfizam. enke imaju zaobljen
trbuh i crveno nabubren spolni otvor. Mrijesti se krajem jeseni i poetkom
zime od studenog do sijenja. Ikru odlae na kamenitom dnu sa brzim tokom
vode. Dijametar jaja je veliki i iznosi od 4,5 do 5 mm. Inkubacijski period je
ovisan o temperaturi vode, od 60 do 90 dana. Liinke izvaljene u sijenju ili
veljai imaju veliku umanjanu vreicu, koja im omoguuje ishranu, ali im
10

istovremeno oteava kretanje. Aktivan ivot liinki zapoinje troenjem

umanjane vreice na 1/3 njene veliine. Poetkom jeseni, kad mla
dosegnu duinu od oko 10 cm, seli se nizvodno u mirnije vode u potrazi za
hranom. Spolna zrelost nastupa sa 2 do 3 godine starosti. U prvoj godini
pastrva naraste od 10 do 14 cm. Tada nosi tzv. mladenako ruho, obiljeeno
sa desetak crnih vertikalnih mrlja na bokovima tijela. Daljnjim rastom ova
obiljeja se gube.
Pastrva se hrani razliitim organizmima: ribama, liinkama vodenih
insekata, ikrom dugih riba, kukcima koji lete nad vodom i padaju na njenu
povrinu, raiima i drugim beskraljenjacima.
Pastrva naseljava hladne vode u gornjim tokovima rijeka umjereno
kontinentalne klime, iako je nalazimo i u ravniarskim rijekama borealne zone,
i jezerima sa istom, hladnom vodom sjeverne hemisfere. Izuzetno je
prilagodljiva na razliite uvjete stanita, a prilagodljivost se odraava i u
razliitim morfolokim oblicima, (Wheeler, 1992). Postoje tri razliita ekoloka
oblika pastrva:

Potoni oblik Salmo trutta m. fario

Jezerski oblik Salmo trutta m. lacustris
Morski oblik Salmo trutta m. trutta

Potona i jezerska pastrva stalno ive u slatkoj vodi. Jezerska pastrva

radi boljih uvjeta stanita dosta je krupnija od potone. Lako se razlikuje od
nje i po tome to joj je tijelo prekriveno nepravilnim crnim tokama dok crvenih
toaka obino nema, a ako one i postoje imaju oblik slova x. Jezerske
pastrve, u jesen, za vrijeme mrijesta, odlaze iz jezera u rijeke, da bi se kasnije
ponovno vratile u jezera. Morski oblici pastrva vale se u slatkim vodama, no
odmah po izvaljenju migriraju u mora, gdje ive do spolne zrelosti, kada
odlaze na mrijest u rijeke ili jezera (Treer i sur., 1995).
Vanjski izgled tih triju tipova ponajprije ovisi o okoliu, u kojem riba ivi,
jer ako bi mla potone pastrve stavili u jezero, ona bi pridobila vanjski izgled
jezerskog tipa pastrve i obrnuto. Bernatchez i suradnici (1992) su promatrali
mtDNA sekvence triju razliitih ekolokih oblika i nisu uoili signifikantne

11

razlike. Stoga su zakljuili da se izvor razliitih ekolokih oblika ne temelji na

njihovom zajednikom pretku, ve na zajednikom okoliu.

Slika 3: Potona pastrva iz rijeke Krke (foto Odak)

Genetskim analizama pastrva iz razliitih dijelova Europe, uoeno je,

da pastrve odreenog geografskog podruja imaju zajednike osobine i na
genetskom nivou, (Bernatchez, 2001). Na taj nain uoeno je pet razliitih
grupa pastrva vezanih za odreena geografska podruja, odnosno za
osnovne rijene slivove u Europi. Izdvojeno je pet samostalnih jedinica,
filogenetskih grupa, odnosno geografskih linija:
-

atlantska linija

dunavska ili crnomorska linija

sredozemna linija

jadranska linija

marmoratus linija
Bernatchez i suradnici (1992) pokuavajui utvrditi sloene filogenetske

odnose meu udaljenim populacijama slue se teorijom molekularnog sata,

gdje razlika u sekvencama od 2% oznaava period od milijun godina (Brown i
sur., 1979).
Prije priblino 10 milijuna godina, iz zajednikog pretka dolo je do
nastanka dviju vrsta: lososa (Salmo salar) i pastrve (Salmo trutta).
Razdvajanje pastrva prema filogenetskim linijama od zajednikog pretka zbilo
se prije 2,5 milijuna godina. Prvo se, prije 2,5 milijuna godina, iz jedinstvene
vrste pastrva odcijepila atlantska linija, a kasnije, kroz oko milijun godina (ve

12

u ledenom dobu) formirale su se jo dvije nove grupe: dunavska i jadranskomediteranska. Kasnije, radi burnih geomorfolokih zbivanja u ledenom dobu,
nastale su jo tri linije: mediteranska, jadranska i linija marmoratus. Predvia
se, da je stanita jadranskog sliva prvo naselila jadranska linija potone
pastrve, a kasnije se na tom podruju pojavila i glavatica, odnosno linija
marmoratus. U vrijeme hladnijih intervala ledenog doba, radi nastanka velikih
koliina leda, nivo mora spustio se ak za vie od 150 metara. Posljedica
snienja nivoa mora bilo je i povezivanje rijeka, koje su se ranije izlijevale
direktno u more. Upravo je to omoguilo ribama, da nesmetano migriraju iz
jedne rijeke u drugu (Bianco, 1990; Bernatchez, 2001).
Svaka linija ima neka zajednika morfoloka obiljeja. Za atlantsku
liniju karakteristina je crna pigmentacija, koja znatno prevladava nad
crvenom, i nalazi se preteno na prsnom dijelu (Giuffra i sur., 1996).
Dunavska linija ima jednoliko zastupljene crne i crvene toke, koje su
jednakomjerno rasporeene po cijelom tijelu. Karakteristine osobine
vanjskog izgleda jadransko-mediteranske linije su etiri ira tamna pojasa u
obliku obrua oko tijela. Jedan se pojas nalazi na glavi, dva na trupu i jedan
na repu. Kod nekih primjeraka pojasi su jae izraeni, a kod nekih slabije. Za
jadransko-mediteransku liniju pastrva karakteristina je jo i sitna, crno crvena pigmentacija. Linija marmoratus odnosi se na glavaticu, koja naseljava
isto podruje kao i linija jadranskih pastrva.

MEKOUSNA PASTRVA (Salmothymus obtusirostris Heckel, 1851.)

Mekousna pastrva je zasigurno jedna od najintrigantnijih vrsta, ija je

klasifikacija pobuivala pozornost znanstvenika od pionirskih studija do
dananjih dana. Uvrtavamo je u rod Salmothymus, u koji spada samo jedna
vrsta monofiletski rod. Mekousna pastrva ima etiri podvrste koje su
endemine za srednji i juni jadranski sliv. Karakterizira je neobina slinost
sa oboje, lipljenom i pastrvom. Osim morfoloke slinosti sa lipljenom,
naroito u podruju trupa, sa njim dijeli i neka druga obiljeja; zauzimaju ista
stanita, imaju sline hranidbene navike, obje vrste ive u jatima i mrijeste se
u proljee. Meutim, lipljen nikada nije bio autohton na podrujima gdje
13

nalazimo mekousnu pastrvu, ve je tamo naknadno unesen. Njihova izrazita

slinost moe se objasniti u slinosti stanita koje su naselili u prolosti i njima
se prilagodili (Snoj i sur. 2002b). Radi specifinog izgleda mekousnu pastrvu
nazivaju reliktom ostatkom davne zemljine prolosti, posjeduje vei broj
"primitivnih" obiljeja pleistomorfi (kratke eljusti, mala usta, kratki zubi i
spada u obligatorne slatkovodne ribe).

Izdvojene su etiri podvrste mekousne pastrve:

Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus Steindachner, 1882.

Salmothymus obtusirostris salonitana Karaman, 1926.
Salmothymus obtusirostris krkensis Karaman, 1926.
Salmothymus obtusirostris zetensis Karaman, 1932.

Slika 4: Podruje rasprostranjenja etiri podvrste mekousne pastrve (Snoj,

2003)

14

Zajednike karakteristike podvrsta mekousne pastrve su:

-

malene ljuske

zlatni sjaj tijela

mala usta sa mesnatim usnama

kratke eljusti

sitni zubi

eludac sa velikim brojem pilorikih nastavaka (48 91)

guste tamne toke iza krga sve do lene peraje

rijetko rasporeene crvene toke koje dopiru do kraja tijela

peraje nisu pigmentirane, izuzev lene peraje

proljetni mrijest

Salmothymus obtusirostris salonitana Karaman, 1926.

Podvrsta mekousne pastrve solinka (S. o. salonitana) naseljava

kratke krake rijeke Jadro i rnovnicu, koje se ulijevaju u more u blizini grada
Splita. Ukupna duljina Jadra je 4,5 km. Iako se vodom iz rijeke Jadro
opskrbljuje grad Split i njegova okolica, podruje sliva te rijeke izuzetno je
podlono oneienju. rnovnica je kratka, kraka rijeka, duine toka od
svega 5,3 km (tambuk-Giljanovic, 2002). Prije izgradnje brane kod
Pranevia rijeka rnovnica nije imala je stalan tok. Za vrijeme ljetnih mjeseci
rijeka je presuivala, pa stoga ihtiofaune u njoj nije bilo. Kad je prije 25
godina, brana izgraena, rijeka je dobila stalan tok. Tada su prof. Paur sa
Agronomskog fakulteta i gosp. Ritterman, vlasnik oblinjeg ribogojilita,
prenijeli dio populacije mekousne pastrve iz rijeke Jadro u rijeku rnovnicu.
Danas je rnovnica postala pogodna i za druge vrste riba, pa uz mekousnu
pastrvu nalazimo kalifornijsku pastrvu i jegulje. Treer i suradnici (2003a;
2003b) prouavali su rast i kondiciju mekousne pastrve u rijekama rnovnici i
Jadru. Zakljuili su da ona ima dobar rast u oba stanita, no bolji rast ipak
pokazuje u rijeci rnovnici. Naglaavaju da se translokacija u novo stanite u
ovom sluaju pokazala kao dobar postupak za zatitu ove ugroene vrste.
15

Djelomino slabiji rast u rijeci Jadro objanjavaju time to je Jadro znatno vie
pod utjecajem ovjeka, od vodnih regulacija do izuzetne naseljenosti uz rijeku.
Osim toga u rijeci Jadro postoji mnogo vea vrsna kompeticija.

Mekousnu pastrvu karakterizira zaobljena njuka, usta su joj mala i

mesnata, a gornjoviline kosti su i kratke i iroke. Kao i druge podvrste, ima
velik broj pilorikih nastavaka, do 81. Lea su sivkasto-uta bez toaka, crne
toke se nalaze samo na prednjem dijelu tijela, a crvene se pruaju po
itavom tijelu. Peraje su bez toki, a dok jedino na lenoj nalazimo. Broj bica
u perajama je D IV 11, a IV 9, V II 8, P I 12, C 19. ivi u mirnim tokovima
rijeka. Hrani se gamarusima, malim puevima i insektima (Vukovi i Ivanovi,
1971). Mrijesti se u oujku. Na osnovu podataka o kondiciji dobivenih pri kraju
perioda mrijesta, Treer i sur. (2003a) su zakljuili da je poetak mrijesta
mekousne pastrve u rnovnici u treoj, a puni mrijest u etvrtoj godini ivota.

Slika 5: Mekousna pastrva solinka (S. o. salonitana) iz rijeke Jadro (foto

Odak)

16

Salmothymus obtusirostris krkensis Karaman, 1926.

Mekousna pastrva, zlousta endem je rijeke Krke. Krka spada meu

najljepe rijeke u Hrvatskoj, nacionalnim parkom proglaen je 1985. godine.
Izvire podno slapa Kria, pokraj grada Knina. Do spajanja s morem duga je
72 km. Kvaliteta vode varira od prve pa sve od etvrte kategorije koju
nalazimo u podruju grada Knina.
Mekousna pastva u rijeci Krki odlikuje se jakom, tupom i kratkom
njukom na kojoj su smjetena mala usta. Gornja vilica joj je kraa i ira nego
donja, pa ne dosee ni do sredine oka. Tijelo joj je srebrnaste boje, posuto sa
crvenim i crnim tokama. Crne toke su sitnije od crvenih koje su rasute po
itavom tijelu. Za vrijeme mrijesta u proljee, toke su prisutne i na lenoj
peraji, dok su ostale peraje bez pjega. Zlousta ivi u otvorenom dijelu rijeke i
nikada se na skriva pod kamenjem. Kao i ostale mekousne pastrve mrijesti se
u proljee, na krupnijem pijesku. Hrani se preteno kukcima s povrine vode
(Vukovi i Ivanovi, 1971).

Slika 6: Mekousna pastrva zlousta (S. o. krkensis), (foto Schffman)

17

Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus Steindachner, 1882

Neretvansku pastrvu danas nalazimo u rijeci Neretvi i njenim pritocima

Buni, Rami, Rakitnici. Nekada je u rijeci Buni mekousna pastrva sainjavala
99% svih salmonida (Taler, 1952), no danas je ovdje, vrlo ugroena kao i u
ostalim stanitima. U Hrvatskoj je nalazimo u maloj rjeici Vrljici pokraj
Imotskog, iji je izvorini dio 1971. godine proglaen ihtiolokim rezervatom.
Mekousnu pastrvu lako prepoznajemo po karakteristinom obliku glave
i ispupenim lubanjskim kostima oko oiju. Njuka joj je izduena, a usta
mala, mesnata i mekana, sa zubima koji su poprilino pokriveni odebljalom
koom. Gornjovilina kost dopire do polovine oka. Boja tijela je maslinasta, po
bokovima se preklapaju crne i naranaste toke. Crvene toke su vrlo rijetke
(Vukovi i Ivanovi, 1971).
Neretvanska mekousna pastrva ivi u otvorenim tokovima rijeka, ee
se zadrava na mirnim, dubljim mjestima, a rjee u brzacima i bukovima.
Mrijesti se u travnju i svibnju. Mujaci postaju spolno zreli u etvrtoj odnosno
petoj godini, a enke neto kasnije (od pete do sedme godine). Tada enke
kopaju gnijezda na dubini od 34 cm do 1,4 m, a mujaci ih uvaju. Optimalna
temperatura vode za mrijest je od 9,3 do 10,10C. Kosori i suradnici (1969) su
ispitivali mogunost umjetne hibridizacije ove vrste, pri tome naglaavaju
optimalnu temperaturu (100C) za umjetni mrijest, pri kojoj je postotak
oploene ikre najvei.
Usporedbom mekousne pastrve iz Bune sa mekousnim pastrvama
dalmatinskih voda, uoene su mnoga zajednika obiljeja, ali i znatan broj
razlika u morfolokim obiljejima, to ukazuje na njihovo zajedniko srodstvo,
ali i na posljedice prostorne i ekoloke izolacije.

Slika 7: Neretvanska mekousna pastrva (S. o. oxyrhynchus), (foto Pleko)

18

Salmothymus obtusirostris zetensis Karaman, 1932.

Mekousna pastrva je najugroenija riblja vrsta u Crnoj Gori, naseljava

usko podruje od svega 50 km duine donjeg toka rijeke Zete, kao i njen
zapadni pritok, rijeku Morau (Mari, 1995).

Rod Salmothymus je monofiletski rod s vrstom mekousnom pastrvom

koja je prema stanitu podijeljena u etiri podvrste. Brojni autori su imali
razliita miljenja o odnosima te etiri podvrste.
Mekousna pastrva prvi put je opisana u rijekama Jadru i Vrljici (Heckel,
1851), kao Salar obtusirostris. Steindachner (1882) opisuje mekousnu pastrvu
u rijeci Neretvi, koju radi slinosti s lipljenom, uvrtava u rod Thymallus, kao
Thymallus microlepis. Kasnije uvia da se tu radi o rodu Salmo, te mekousna
pastrva iz Neretve dobiva novo ime Trutta obtusirostirs oxyrhnchus po
karakteristinoj iljatoj njuci. Steindachner takoer ukazuje na njezinu
slinost s vrstom Coregonus oxyrhynchus.
Berg

(1908)

prvi

ujedinjuje

mekousne

pastve

jedan

rod

Salmothymus. U rod Salmothymus uvrtena je i endemska pastrva iz

Ohridskog jezera u Makedoniji, belvica Acantholingua (Salmo) ohridana.
Steindachner (1892) je prvi opisao belvicu.
Prouavajui morfoloka i ekoloka obiljeja mekousne pastrve iz
Bune, Jankovi (1961) ih je usporedila endemskim pastrvama Ohridskog
jezera, letnicom (Salmo letnica Karaman, 1924) i belvicom (Acantholingua
(Salmo) ohridanus Steindacher, 1892). Ona pretpostavlja da su vrste iz
Ohridskog jezera nekada bile u bliskom srodstvu sa vrstama iz dalmatinskih
voda. Meutim, nakon duge odvojenosti, te su vrste dobile posebne
morfoloke i ekoloke odlike po kojima se danas jasno razlikuju. Stearley i
Smith (1993) na osnovu osteolokih mjerenja tvrde da su S. obtusirostris i A.
ohridanus pripadnici istog roda Salmothymus, pa u taj rod smjetaju i vrste
Salmo ishchan i Salmo carpio. Hadie (1961) smatra da prema morfolokim
karakteristikama belvica ipak spada u rod Acantholingua. Meutim, nakon
molekularnih analiza (Oakley i Phillips, 1999) za belvicu je utvreno da
pripada rodu Salmo. To su potvrdili i Snoj i sur. (2002b), usporeujui
19

sekvence kontrolne regije i citokroma b sa mtDNA i dijela LDH C*1 gena sa

nuklearne DNA molekule.
Usporeujui morfoloka obiljeja mekousne pastrve iz Jadra s onima
iz Bune Heckel i Kner (1857) su uoili znaajne razlike u duini njuke i
slinosti u duini gornje vilice (dopire do polovine oka). Broj bica u svim
perajama je jednak, meutim zapazili su vei broj ljuski u bonoj liniji kod
mekousne pastrve iz rijeke Bune. Morfoloke karakteristike i ponaanje
mekousne pastrve iz Jadra, Krke i Neretve opisao je Karaman (1927). Behnke
(1968) smatra da se Karamanovo poimanje vrste kosi s modernim
taksonomskim pogledima, te da je potrebno napraviti reviziju njegova rada.
Karaman je prvi opisao mekousnu pastrvu u rijeci Zeti koju je nazvao
Trutta obtusirostris, smatrajui da se radi o formi mekousne pastrve koja
obitava u Ohridskom jezeru u Makedoniji Salmo letnica Kraman, 1924. Svoju
tvrdnju Karaman je objasnio time to je Skradarsko jezero, kojemu je rijeka
Zeta pritok, povezano rijekom Bojanom s donjim dijelom rijeke Drima koji je
pritok Ohridskog jezera. Hadie je 1962. godine na osnovu slinih
karakteristika sa rodovima Salmothymus i Acantholingua zakljuio da se radi
o novoj vrsti koju je nazvao Salmo zetensis. Karaman (1966) smatra da
mekousna pastrva u rijeci Zeti predstavlja prijelazni oblik izmeu var.
obtusirostris i var. ohridanus, ali naglaava da treba nastaviti ispitivanja kako
bi se meu njima utvrdile razlike i slinosti. Danas mekousna pastrva (S. o.
zetensis) obitava samo u donjem dijelu rijeke Zete i njenom zapadnom
pritoku, rijeci Morai. Radi zagaenja i izlovljavanja spada u jednu od
najugroenijh slatkovodnih riba u Crnoj Gori (Mari, 1995).
Stefanovi (1948) se bavi usporedbom mekousne pastrve s azijskim
rodom salmonida Brachymystax, na iju je slinost ukazivao i Berg (1923).
Mekousna pastrva iz rijeke Bune i azijska vrsta Brachymystax lenok Pallas
imaju priblino jednak broj bica u perajama. Meutim, mekousna pastrva ima
manji broj ljuski u bonoj liniji i te neto iru granicu variranja broja
branhiospina u prvom krnom luku. Povezuje ih broj slijepih crijeva (oko
100), duina gornjoviline kosti, koja dopire do polovine oka, te jednako
razdoblje mrijesta - proljee. Stoga, iznosi pretpostavku o eventualnoj
srodnosti mekousnih pastrva s azijskim salmonidima roda Brachymystax.

20

Dorofeyeva (1989) iznosi filogenetsku hipotezu da rod Salmothymus

nije u vezi sa rodom Brachymystax i ponovo naglaava njegovo mjesto u
skupini Salmo.
Specifian izgled mekousne pastrve i njena ekoloka svojstva iznio je
Taler u nizu lanaka (1951, 1952, 1953, 1954). Sistematskim poloajem
endemske mekousne pastrve bavio se Stankovi (1960). Kosori i suradnici
(1969) su ispitivali mogunost umjetnog mrijesta mekousne pastrve iz rijeke
Neretve (subsp. oxyrhinchus). Utvrdili su da je optimalna temperatura za
mrijest 100C jer je pri toj temperaturi postotak oploene ikre najvii.
Prema pregledu prolih istraivanja na rodu Salmothymus oito je da
su se morfoloke karakteristike kao kriterij za klasifikaciju pokazale
nedovoljnima i nepouzdanima. Stoga je bilo neophodno preispitati filogenetski
odnos i sa gledita molekularne genetike.

Klasifikacija porodice Salmonidae i intergenerini odnosi unutar nje,

odreeni su uglavnom na osnovu morfolokih istraivanja (Stearley i Smith,
1993), no takve analize, iako brojne, u suprotnosti su sa genetikim
analizama (Phillips i Oakley, 1997). Brojni autori predlau razliite odnose
unutar Salmonidae. Na osnovu osteolokih obiljeja (Shaposhinikova, 1975),
porodica

Salmonidae

podijeljena

je

tri

podporodice:

Salmoninae,

Coregoninae i Thymallinae. U prvoj porodici nalazi se 6, u drugoj 3, a u treoj

1 rod. Istraivano je 6 rodova: Salvelinus, Hucho, Brachymystax podporodice
Salmoninae i Stenodus, Prosopium i Coregonus podporodice Coregoninae.
Osteoloka istraivanja omoguila su da se ustanove njihova taksonomska
obiljeja i da se odredi taksonomski poloaj u porodici.
Analize na biokemijskom nivou podporodice Salmoninae vrili su
Osinov i Lebedev (2000) na 31 37 genskih lokusa kod 21 vrste iz 7 razliitih
rodova. Utvreno je monofiletsko porijeklo (Oncorhynchus + Parasalmo) i
(Hucho + Brachymystax). U filogenetskom stablu najproblematiniji je bio rod
Parahucho. Tona i ope prihvaena klasifikacija porodice Salmonidae samo
je djelomino zavrena i to uglavnom kod dobro prouenih rodova (npr.
Oncorhynchus,

Salmo,

Salvelinus

Hucho)

zahvaljujui

ponajprije

molekularnim analizama (Phillips i Oakley, 1997), dok su brojne vrste sa

stanitima u Aziji i Balkanskom poluotoku (npr. Brachymystax, Acantholingua,
21

Salmothymus) vrlo slabo prouene, a njihovo sistematsko mjesto je i dalje

upitno (Osinov, 1999).

Slika 8: etiri osnovne hipoteze za odnose izmeu rodova Brachymystax,

Hucho i Salvelinus: (A) Norden (1961), (B) Kendall i Behnke (1984), (C)
Dorofeyeva (1989) i (D) Stearley i Smith (1993)

Openito je prihvaeno da je rod Oncorhynchus najudaljeniji u porodici

Salmoninae, a prate ga rodovi Salmo i Salvelinus. Norden (1961) smatra da je
svaki rod monofiletski, i da se grana zasebno od debla (Slika 8, A). Kendall i
Behnke (1984) smatraju da su sva tri "problematina" roda (Brachymystax,
Hucho i Salvelinus) potekla iz jedne monofiletske grupe (Slika 8, B).
Dorofeyeva (1989) na osnovu osteolokih analiza smatra da su rodovi
Brachymystax, Hucho i Salvelinus potekli s jedne, a rod Salvelinus sa druge
monofiletske strane (Slika 8, C). Stearley i Smith (1993) odvajaju rodove
Brachymystax, Hucho i Salvelinus u dvije zasebne monofiletske grane, pa u
jednu spadaju rodovi Hucho i Salvelinus, a u drugu rod Brachymystax (Slika
8, D).
Tek nakon ulaska molekularne tehnologije u podruje istraivanja
sistematike Salmonidae, dobiven je toan i ope prihvaen poloaj spornih
rodova.

22

Sekvencioniranjem hormona rasta (GH2C) Oakley i Phillips (1999)

dokazali su da je rod Braxhymystax napredni predstavnik roda Hucho, te
odbacili hipotezu o Braxhymystaxu kao rodu arhainih salmonida.

Slika 9: Brachymystax lenok (foto Schffman)

Slika 10: Acantholingua ohridana

(http://www.ittiofauna.org/webmuseum/acantholingua_ohridana/index.htm)

Predmet istraivanja Phillipsa i sur. (2000) je sistematsko mjesto roda

Acantholingua.

Sekvencioniranjem

hormona

rasta

(GH2C),

te

dijela

ribosomske DNA (ITSI) i citokroma b na mitohondrijalnoj DNA ustanovili su da

je rod Acantholingua filogenetski vrlo blizu rodu Salmo.
Snoj i sur. (2002b) prouavali su mtDNA (kontrolnu regiju i citokrom b
gen) i nuklearnu DNA (dio laktat dehidrogenaze C1 gena). Na osnovu
sekvencioniranja navedenih dijelova izvedeno je filogenetsko stablo (Slika
11).

23

Slika 11: Sistematika porodice Salmondiae, s posebnim osvrtom na odnose

izmeu

rodova

Salmothymus,

Acantholingua

Salmo,

na

osnovu

sekvencioniranja kontrolne regije mtDNA i citokroma b, iz nuklearne DNA

(Snoj i sur, 2002)

Kako su se rodovi Salmothymus, Acantholingua i Salmo pokazali jako

bliski,

smjeteni

su

zasebnu

skupinu,

poput

rodova

Salvelinus,

Oncorhynchus i ostalih. Upravo taj podatak ukazuje na nepravilnosti prijanjih

klasifikacija. Blizak odnos izmeu rodova Salmo i Salmothymus potvren je i
analizom LDH gena, koji je utvren samo kod predstavnika rodova
Salmothymus, Acantholingua i Salmo, to ga ini vanim filogenetskim
markerom.
U narednim istraivanjima filogenetskih odnosa analizirani su LDH i
ITS1 gen (Snoj, 2003), kako bi se odredio toan poloaj roda Salmothymus u
Salmo skupini.

24

Salvelinus fontinalis
Oncorhynchus mykiss
Salmo salar
SaSalmo
lmothyobtusirostris
mus obtusirostris
100

100

Acantholingua ohridana
100

Da
At

94

Ma

Salmo trutta/ marmoratus

complex

81

0.01

Ad

Slika 12: Sistematika porodice Salmoniae na osnovu sekvencioniranja

kontrolne regije mtDNA, citokorma b, LDH-C1* i ITS1 gena nuklearne DNA
(Snoj, 2003).

Unutar roda Salmo prisutna su tri ogranka; S. salar, S. trutta kompleks

sa S. marmoratus i trei A. ohridana i S. obutusirostris, koji predstavlja
evolucijski prijelaz izmeu Atlantskog lososa i potone pastrve.
Na osnovu sekvencioniranja kontrolne regije mitohondrijalne DNA
(Snoj i sur., 2002b; Snoj, 2003) utvrena je bliska veza podvrste
Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus i rodova Salmo i Acantholingua (Slika
12). Filogenetsko drvo proizalo iz analize mtDNA i nuklearne DNA ukazuje
da su podvrste Salmothymus obtusirostris oxyrhynchus i Acantholingua
sestrinske vrste, znatno blie sa S. trutta, nego sa S. salar. Stoga, rodovi
Salmothymus i Acantholingua, smatra autor, predstavljaju posebni ogranak
koji se filogenetski nalazi izmeu S. salar i S. trutta. Ovo otkrie pobija
dananju klasifikaciju roda Salmothymus kao zasebnog roda, i namee
njegovu reklasifikaciju na razinu vrste unutar roda Salmo.

25

1.1.2. Metode razlikovanja ribljih populacija

Ribe su najbrojnija grupa kraljenjaka sa 24 600 razliitih vrsta (Nelson,
1994). Da bi opisali i sistematski odredili razliite vrste, sistematiari su razvili
razliite metode.

1.1.2.1. Morfoloke metode razlikovanja ribljih populacija

Danas postoje brojne metode kojima je mogue odrediti genetsku

strukturu neke populacije. Najstarije, a ipak jo uvijek najvie koritene
metode, su klasine morfoloke metode, morfometrijske i meristike metode.
Razlozi njihove iroke koritenosti su jednostavnost i pristupanost, a takoer
i

ekonomski

znaaj.

Morfometrija

je

podruje

istraivanja

gdje

se

kvantitativnim analizama opisuje oblik i veliina neke morfoloke jedinke ili

karakteristike (Oxnard, 1978). Morfometrijskim metodama utvruju se
dimenzije pojedinih dijelova tijela, kao i odnosi meu njima. Pri tome je, radi
pouzdanosti usporedbi, potrebno voditi rauna o starosti i spolu usporeivanih
riba. Ovakva klasina metoda odnosa pojedinih tjelesnih duina pokazala se
posebno prikladnom za utvrivanje ekolokih utjecaja na morfologiju riba
(Treer i sur., 1995; 2000). Za prikazivanje morfolokih razlika izmeu genetski
bliskih populacija ili taksona riba, bolje rezultate daje metoda vezane mree
(truss metwork), kojom se mjere elementi oblika, bazirani na linearnim
mjerenjima izmeu homolognih kljunih anatomskih toaka (Delling i sur.
2000). Uz duine na tijelu riba, morfometrijskim osobinama pripadaju i one
unutar tijela, kao to su npr. duina probavila, duina branhiospina, promjer
ikre i dr. Vanjski utjecaji mogu bitno djelovati na morfometrijske osobine, jer
su njihovi heritabiliteti (h2) u pravilu vrlo niski (Tave, 1993). Morfoloka
istraivanja, kako ona to se bave vanjskom morfologijom, a tako i ona
osteoloka, esto su izvor podataka za analizu filogenetskih odnosa pojedinih
vrsta riba (Shaposhnikova, 1975). Zadatak takovih istraivanja je da se utvrdi
stanje odreenih karakteristika i njihova uestalost u istraivanim vrstama.
Time je omogueno utvrivanje statusa nekih karakteristika u filogenetskom

26

smislu, odnosno da li su one odavno prisutne u populaciji (pleizmorfne) ili su

izvedene (apomorfne), (Hening, 1966).
Za razliku od morfometrijskih osobina, meristike osobine imaju znatno
vei stupanj nasljeivanja, a time i veu pouzdanost u razlikovanju ribljih
populacija. To su parametri koji se na tijelu riba mogu izbrojiti, kao npr. broj
bica u perajama, broj ljuski u bonoj pruzi, iznad i ispod nje, broj kraljeaka i
dr. U genetskim istraivanjima posebno znaajan u razlikovanju ribljih
populacija pokazao se broj branhiospina (Alegria Hernandez, 1985).

1.1.2.2. Genetike metode razlikovanja ribljih populacija

Funkcijska jedinica DNA molekule to se pri reprodukciji prenosi sa

roditelja na potomstvo zove se gen. Geni zajedno s faktorima okoline uvjetuju
razliita tjelesna obiljeja i ponaanja. Razliiti oblici pojedinog gena su
alelomorfni geni ili aleli (Stryer, 1995). Sloenim uklapanjima molekule DNA i
proteina nastaju kromosomi. Svaki organizam ima karakteristian set
kromosoma koji se zove kariotip. Diploidni organizmi posjeduju dvije kopije
jednog kromosoma, pri emu je jedan naslijeen od majke, a drugi od oca. Na
kromosomu se nalazi veliki broj gena. Lokus oznaava poloaj gena na
kromosomu. Tako na svakom lokusu diploidni organizmi imaju dva alela,
jedan je na majinskom, a drugi na oinskom kromosomu. Homozigoti su oni
organizmi koji imaju jednake alele na lokusima, odnosno jednak slijed
nukleotida na oba alela. Kod heterozigota to nije sluaj (Lewin, 2000).
Molekularni marker je sekvenca na DNA molekuli ili proteinu koja se
moe lako detektirati i ije je nasljeivanje mogue izuavati. Varijabilnost ili
polimorfizam ini molekularni marker korisnim u genetskom razlikovanju
populacija (Ford-Lloyd, 1996).
Molekularna sistematika bavi se razvojem makromolekula i na toj
osnovi rekonstruira povijest gena i organizma, a ire gledano, objanjava
genetsku razliitost (Moritz i Hillis, 1996).
Molekulu DNA nalazimo u jezgri i u mitohondrijima. Kod riba, veliina
nuklearnog genoma kree se od 0,3 do 4 bilijuna parova baza (Ohno, 1974),

27

a mitohondrijalnog genoma od 14 000 do 20 000 parova baza (Park i Morgan,

1994).
Polimorfizam na DNA razini nastaje kao rezultat tokastih mutacija i
pogreki prilikom replikacije. Istraivanje tih varijacija postalo je mogue
zahvaljujui razvoju tehnika DNA analize, ponajprije otkriem restrikcijskih
enzima, koji reu molekulu DNA na fragmente, te razvojem lanane reakcije
polimeraze (PCR), koja omoguuje amplifikaciju fragmenta DNA od
minimalnog uzorka.
Metodoloka podruja molekularne genetike, koja se esto u
istraivanjima koriste su: aloenzimi, mitohondrijska DNA i ponavljajue
sekvence DNA molekule, mikrosateliti.

1.1.2.2.1. Aloenzimi

Sedamdesetih godina u molekularnoj populacijskoj genetici riba glavni

alat bili su enzimi. Razlikovanje alelnih varijanti proteina (aloenzima) pomou
elektroforeze pokazalo se vrlo uspjeno pri istraivanju genetske razliitosti.
Aloenzimi kao genetski markeri su vrlo uvjerljivi i relativno se lako koriste,
meutim, potrebno je spomenuti i njihove mane pri koritenju kod nekih ribljih
vrsta. Ponajprije se pojavio problem kada se utvrdilo da je njihova varijabilnost
kod nekih vrsta znatno niska. Osim toga, esto se nalaze na vrlo malom
kodirajuem dijelu genoma i teko ih je detektirati elektroforezom. Za
istraivanje tom metodom potreban je vei uzorak tkiva, koji ako se due uva
dolazi do njegove degradacije (Carvalho i Hauser, 1994). U ranijim studijama
enzimski lokusi su prvo koriteni kao biokemijski markeri ribogojilinih linija,
radi otkrivanja i popravljanja rijetkih alela (Utter i Seeb, 1990), tek kasnije i
kao dijagnostika za razlikovanje domaih od divljih populacija. Osim toga,
enzimski polimorfizam je bio efikasno koriten kao genetski marker pri
odreivanju strukture populacija razliitih ribljih vrsta. Meutim, javila se
potreba za vie polimorfnim markerima pri detektiranju inbridinga u
populacijama, u studijama uspjeha krianja divljih populacija.

28

1.1.2.2.2. Mitohondrijska DNA

Mitohondrijska DNA molekula ima jednostavnu strukturu i organizaciju,

zatvorenog je i krunog oblika. Vrlo je znaajan dio genoma i nalazimo je u
svakoj stanici sa 0.0006% ili 1% ukupne mase stanine DNA (Cables, 2001).
Duga je od 14 do 20 kbp, a sadri 37 gena, dva ribosomska DNA (rDNA)
gena, 22 transverzna RNA (tRNA) gena i 13 gena to kodiraju proteine
ukljuene u transport elektrona ili ATP sintezu. Na mtDNA se nalaze dijelovi
za kodiranje nasljednih proteina: citokroma b, tri podjedinice citokrom
oksidaze, tri podjedinice ATP sintetaze i sedam podjedinica NADH
dehidrogenaze. Takoer sadri i kontrolnu regiju (engl. D-loop region), duine
oko 1000 bp sa sekvencama koje djeluju u zaetku replikacije i transkripcije
(Harrison, 1989). Dok su geni za rRNA molekule izuzetno konzervativni,
podruje kontrolne regije esto je podlono promjenama (Shedlock i sur.,
1992). Odreeni segmenti kontrolne regije imaju razliit stupanj varijabilnosti.
Najbolje je sauvan njen centralni dio, koji je posebno bogat citozinskim i
gvaninskim bazama, duine 270 bp (Shedlock i sur., 1992). Velika
varijabilnost kontrolne regije objanjava se time to jedan od dva lanca
zavojnice biva premjeten sintezom novog lanca tijekom replikacije. Kontrolna
regija je kod riba dosta duga i esto sadri tandemski ponavljajue sekvence.
Mitohondrijska DNA (mtDNA) je izuzetno vrijedan genetski marker u
populacijskoj i evolucijskoj biologiji. Razlog tome je, to je relativno lako
izolirati iste homologne sekvence, budui da je prisutna sa velikim brojem
kopija - do 1000 po stanici. Jednostavna organizacija, materinsko
nasljeivanje i odsutnost rekombinacija uz visoki stupanj mutacija, ine
mtDNA idealnim markerom za istraivanje strukture populacija (Zhang i
Hewitt, 1996). Pri promatranju strukture neke populacije, mtDNA je vrlo
korisna, bilo da se radi o razlikama izmeu razliitih vrsta (interspecifina
divergenca) ili unutar pojedine vrste (intraspecifina divergenca). MtDNA kao
molekularnim markerom mogue je razluiti strukturu populacije i pratiti
intraspecifine varijacije pojedinih, geografski odvojenih populacija (Snoj,
1997).
Radi materinskog nasljeivanja mtDNA replicira se zasebno od
nuklearne DNA, pri emu samo dio populacije prenosi mtDNA na potomstvo.
29

Mitohondrijalni geni predstavljaju neprekinutu liniju genetske informacije

unatrag do prve enke ili populacije enki (Cables, 2001). Zbog haploidnosti
mitohondrijalnog genoma, efektivna veliina populacije za mtDNA je samo
jedna etvrtina nuklerane DNA (Nei i Tajima, 1981). Pri tome ne dolazi do
rekombinacija, kao to je sluaj sa nuklearnom DNA, ve se mtDNA prenosi
nepromijenjena na potomstvo. Magoulas i Zouros (1993) navode da
materinsko

nasljeivanje

mtDNA

nije

iskljuivo,

tako

sluajevima

heteroplazmije udaljenih mitohondrijskih linija to nije sluaj. Postotak zamjene

nukleotida u mt DNA je 5 do 10 puta vei nego u nuklearnoj DNA, izmjerena
je vrijednost od 5,7 x 10-8 supstitucija za pojedinano nukleotidno mjesto za
godinu dana (Brown i sur. 1982). Pretpostavljajui konstantnim stupanj
promjene mtDNA sekvence uz procjenu postojee razliitosti, mogue je
izraunati vrijeme kada su dvije vrste dijelile istog enskog pretka. Stupanj u
kojem mtDNA akumulira mutacije je 2 4% u milijun godina (Lewin, 2000).
Signifikantne razlike mtDNA u razliitim geografskim podrujima i materinsko
(klonalno) nasljeivanje ine mtDNA efikasnim genetskim markerom za
prouavanje evolucije, ukljuujui migracije, introdukcije i uska grla
populacija. Ti markeri uz razlikovanje populacija i identificiranje podrijetla riba,
omoguuju ispitivanje efikasnosti uvoenja pojedinih linija u akvakulturu, a
vrlo su efikasni za kontrolu djelovanja unesenih linija na domae autohtone
vrste (Li i sur., 1993). Usporedbom mtDNA sa sekvencama koje se prenose
sa oba spola (autosomalni geni) i onima to ih prenose samo mujaci,
mogue je uoiti znatne razlike u strukturi populacije izmeu mujaka i enki,
te ukazati na razlike u njihovoj ekologiji i ponaanju (Harrison, 1996).
Mnoge studije u odreivanju stupnja razliitosti izmeu i unutar
populacija

koriste

se

tehnikom

rezanja

mtDNA

restrikcijskim

endonukleazama (engl. restriction fragment length polymorphism RFLP), pri

emu se molekula razree specifinim restrikcijskim enzimima, a potom se
produkti odvajaju po veliini koristei gel elektroforezu. Restrikcijska mjesta se
mapiraju, osnosno biljei se njihova prisutnost ili odsutnost. Koritenje ove
tehnike nije toliko preporuljivo pri odreivanju razlika izmeu vrsta i viih
taksonomskih jedinica (Dowling i sur., 1990).
Mitohondrijska DNA regija je dobro prouena kod razliitih ribljih vrsta.
Poznavanje i koritenje univerzalnih zaetnih nukleotida (engl. primer) za
30

amplifikaciju sekvenci lananom reakcijom polimeraze, uinilo ju je vrlo

prihvatljivim alatom u molekularnoj genetici kod riba. Podruja gdje su
smjeteni geni za kodiranje proteina i podruje kontrolne regije, pokazala su
se posebno korisnima pri analizi odnosa nedavno odvojenih populacija.
Meutim, ta podruja radi pojave viestrukih supstitucija nisu dovoljna pri
analizi viih taksonomskih jedinica, pa se pri takvim istraivanjima koriste
konzervativnija podruja poput 12S i 16S ribosomskih RNA gena (Stepien i
Kocher, 1997).
Evolucija mtDNA sekvence je dobro prouena kod riba. Zamjena baza
se dogaa dosta esto, no struktura mtDNA i poredak gena je jako
konzervativan. Budui da se mtDNA prenosi kao jedan gen, treba biti oprezan
pri donoenju zakljuaka o itavoj populaciji, jer se evolucija pojedinog gena
moe razlikovati od evolucijskog prosjeka itavog genoma.
Citokrom b je vjerojatno najbolje prouen gen u mtDNA kod riba. On
ima ulogu u kodiranju proteina vanih u procesu disanja kod staninog
metabolizma. Citokrom b se vrlo esto koristi kod istraivanja strukture i
porijekla ribljih populacija. Tako ga Basely i Bernatchez (2001) koriste uz
mikrosatelite kod jezerske ozimice (Coregonus clupeaformis), a Sunik i sur.
(2001) prouavaju genetske strukture razliitih populacija lipljena (Thymallus
thymallus).

31

1.1.2.2.3. Ponavljajua DNA

Ponavljajuu DNA molekulu nalazimo u dva oblika; kao rasprenu i kao

tandemski ponavljajuu. Rasprenu ponavljajuu DNA molekulu dijelimo s
obzirom na broj ponavljanja na: duge rasute elemente (LINE) koji su dui od
1000 baza i kratke rasute elemente (SINEs), koji su krai od 500 baza. Ako je
prisutno mnogo kopija, oko 1000 jedne ponavljajue jedinice, tada govorimo o
satelitima. Pri manjem broju ponavljanja koristimo termine minisateliti i
mikrosateliti. Minisateliti nisu posebno prihvaeni u ribarstvu, pa je veina
istraivanja koncentrirana na drugu klasu ponavljajue DNA, mikrosatelite.

1.1.2.2.3.1. Mikrosateliti

Mikrosateliti su otkriveni u eukariotskim stanicama prije vie od

petnaest godina, no njihovo postojanje u poetku nije pobuivalo vei interes
znanstvenika (Jarne i Lagoda, 1996). Tada su nazvani beznaajna DNA
(engl. junk DNA), iako je vrlo brzo otkrivena njihova vrijednost kao genetskih
markera. Termin mikrosateliti odnosi se na najmanje ponavljajue jedinice.
Sastoje se od jednostavnih ponavljajuih sljedova nukleotida, veliine od 2 do
6 parova baza, npr. (TG)n ili (AAT)n i rijetko sadre vie od 70 ponavljajuih
jedinica. Brojni su u eukariotskim genomima, no nalaze se i u prokariota, ali
sa manjom uestalou. Nalaze se po cijelom genomu, u kodirajuim i u
nekodirajuim regijama. Manji broj ih se nalazi na podruju centromernih i
telomernih regija (Tautz, 1993). Ipak, izgleda da svaki gen ima jedan
mikrosatelit.

Mikrosateliti su prisutni u genomu svih do sada prouenih organizama.

Genom riba je vrlo bogat tim sekvencama, pa u genomu potone pastrve
nalazimo od oko 33 000 do 109 000 mikrosatelita (Estoup i sur. 1993). Vrlo su
pogodni za istraivanja, jer se uspjeno mogu izolirati iz razliitih materijala.

32

Najee se izoliraju iz krvi i tkiva riba, ali ih je mogue izolirati i iz dlake, sline
ili izmeta (Constable i sur., 1995). Takoer se uspjeno izoliraju iz suhih ljuski
(Miller i Kapuscinski 1996), i iz otolita (Hutchinson i sur. 1999), te iz vrlo malih
koliina biolokog materijala, kao to je arheoloki materijal, koji moe
sadravati gotovo razgraenu DNA (Bruford i sur., 1998). Mogunost izolacije
mikrosatelita iz vrlo malih dijelova biolokog materijala uinio ih je korisnima
pri istraivanju rijetkih i ugroenih vrsta (Queller i sur., 1993).

Zbog ponavljajuih sljedova nukleotida koje sadre, mikrosateliti su

izuzetno podloni pogrekama prilikom replikacije DNA. Taj se proces naziva
pogreno sparivanje iskliznutog lanca (engl. slipped - stand misparing) ili
klizanje (engl. slippage), a dovodi do skraenja ili produljenja DNA molekule
prilikom replikacije (Schltterer i Pemberton, 1994). Najea mutacija kod
mikrosatelita je promjena od jedne ponavljajue jedinice. Takav tip mutacija
omoguuje da lokusi evoluiraju procesom tzv. stepenaste mutacije (engl.
Stepwise Mutation Model SMM). Stupanjski mutacijski model moe se
pojaviti u dva podoblika: jednostupanjski (engl. single-step mutation model) i
dvofazni mutacijski model (engl. two-phase mutational model), (Dirienzo i sur.,
1994). U prvom se modelu pretpostavlja da mutacijske promjene dovode do
poveanja ili smanjenja u broju jedne ponavljajue jedinice, dok drugi model
ukljuuje

jednostupanjski

mutacijski

model,

ali

doputa

mutacije

ponavljajuih jedinica. Slatkin (1995) objanjava da je mutacija kod tih lokusa

proces s memorijom (tzv. konvergentna priroda memorije), odnosno, da se u
procesu mutacije novi mutant nadovezuje na prethodni alel, pa u tom sluaju
razlika u duini izmeu alela sadri informaciju koja ima filogenetiku
vrijednost. Razlika u duini izmeu dva alela daje informaciju o vremenu koje
je prolo od kada su ta dva alela dijelila jedan zajedniki, ancestralni alel.

33

Slika 13: Stvaranje polimorfizma DNA sekvence pogrenim sparivanjem baza,

ispadom dijela sekvence
a) Ispad unatrag uzrokuje inserciju
b) Ispad naprijed uzrokuje deleciju (Strachan i Read, 1996)

34

Brzina mutacije mikrosatelita je izuzetno velika. Spontana mutacija za

mikrosatelitske lokuse je 10-2 do 10-4 po generaciji, to je znatno vie od
promjena na enzimima od 10-6 po generaciji (Nei, 1987). To dovodi do
promjene u broju ponavljajuih nukleotida, odnosno do produenja ili
skraenja lanca DNA tijekom replikacije. Mutacije su prisutne i kod
deseterostrukog ponavljanja dinukeotidne sekvence. Stupanj polimorfizma je
razmjeran broju ponavljanja osnovnog motiva. Mutacijski stupanj kod
dinukleotidnih ponavljanja je za 1,5 do 2 puta vei od mutacijskog stupanja
tetranukleotidnih ponavljanja, dok je stupanj mutacije kod tronukleotidnih
ponavljanja, izmeu ova dva (Chakraborty i sur., 1997).

Mikrosatelite dijelimo u tri skupine:

-

potpuni mikrosateliti (CACACACACACACACACACA)

sastavljeni mikrosateliti (CACACACACAGAGAGAGAGA)

prekinuti mikrosateliti (CACATTCACACATTCATTCA)

Sastavljeni i prekinuti mikrosateliti pokazuju manji stupanj polimorfizma od

potpunih mikrosatelita (Jarne i Lagoda. 1996).

Visoki stupanj polimorfnosti, kodominantnost (heterozigoti se razlikuju

od homozigota) te jednostavan Mendeljevski nain nasljeivanja, ini
mikrosatelite vrlo popularnim molekularnim markerima (Page i Holmes, 1998).
Zahvaljujui njihovom visokom stupnju polimorfizma, ti markeri su se pokazali
korisnima u istraivanju vrsta s malim enzimskim varijacijama kao to je npr.
atlantski losos (Salmo salar), (Gavin i sur. 1996) i jezerska zlatovica
(Salvelinus alpinus), (Brunner i sur. 1998).
Mikrosateliti su vrlo korisni pri istraivanjima genetske varijacije u
populacijskoj genetici, jer se lako otkivaju pomou PCR tehnike i jer se razlika
u alelima od samo 1 bp moe uoiti na visoko rezolucijskim gelovima (Hansen
i sur., 2001). Lananu reakciju polimeraze je mogue dobro optimizirati pa je
mogue u jednom procesu amplificirati vie razliitih lokusa. Mikrosateliti se
esto koriste pri odreivanju roditeljstva, srodnosti i identifikaciji jedinki
(Queller i sur., 1993). Radi velikog polimorfizma mnogi mikrosateliti
omoguuju uspjenu identifikaciju jedinki i odnosa unutar porodica. To
ukljuuje veliki broj mikrosatelita (engl. DNA fingerprinting), koji predstavljaju
35

razliite genotipove. Ti markeri omoguuju istraivaima da identificiraju

srodstvo i vezu ne samo u prvoj, nego i u daljnjim generacijama, a to
omoguuje analizu reprodukcijskog uspjeha i fitness pojedine jedinke
(Crivelli i sur. 2000). Aliah i suradnici (2000) ih koriste pri istraivanju bliskih
linija, kod populacija koje su ugroene uskim grlom (engl. bottlenecks) kao
rezultatom krianja.
Ono to bitno pridonosi popularnosti mikrosatelita kao markera je da su
mikrosatelitski lokusi bliskih vrsta gotovo jednaki, pa je stoga mogue koristiti
iste zaetne nukleotide i procedure. Meutim, kod filogenetski udaljenih vrsta
ipak je potrebno ponovno izolirati nove lokuse, jer ne postoje univerzalni
zaetni nukleotidi (Schltterer i Tautz, 1992).
Duina alela mikrosatelitskog lokusa odreuje se umnaanjem
odreenog lokusa pomou lanane reakcije polimerazom (PCR). Meutim,
prije nego to se mikrosatelitski lokus umnoi potrebno je spoznati sljedove
baza koji se nalaze neposredno uz istraivani lokus, tada je mogue napraviti
zaetne nukleotide. Za neke ivotinje postoji vei broj mikrosatelita. Te
podatke je mogue pronai u literaturi ili u raunalnim bazama podataka
(EMBL ili GenBank). Ako za istraivanu vrstu na postoje ve otkriveni
mikrosateliti, tada pristupamo analizi izolacija mikrosatelitskih lokusa i njihovih
postranih sljedova (Schltterer, 1998).
Jedan od problema koji se javlja pri interpretaciji rezultata nakon
elektroforeze je pojava niza odjeljaka (engl. stutter bands), a ne samo jednog
ili dva (ovisno da li se radi o homozigotu ili heterozigotu). Taj problem je
naroito izraen kod dinukleotidnih ponavljanja nukleotida. Obino je odjeljak
najveeg intenziteta onaj oekivani, no razlike u intenzitetu nisu dovoljne da bi
se sa sigurnou moglo zakljuiti koji je odjeljak ishodini alel. Nastanak
dodatnih odjeljaka rezultat je klizanja DNA (engl. slippage) za vrijeme PCR
umnaanja in vitro (Schltterer, 1998).

36

1.1.3. Ouvanje genetske razliitosti ribljih populacija

Genetska varijabilnost je osnova bioloke evolucije svega ivoga, pri
emu je posebno vana genetska varijabilnost unutar vrste, jer je nuna za
uspjeno prilagoavanje promjenama okolia i za preivljavanje vrste. S
gubitkom genetske razliitosti dolaze posljedice razliitog stupnja, pri emu je
najtraginija ona to dovodi do izumiranja vrste. Bioloka razliitost je u prirodi
hijerarhino organizirana. Svaki ekosustav se sastoji od velikog broja jedinki
koje su razliitim filogenetskim vezama povezane unutar i meu vrsta. Osim
toga, i svaka evolucijska linija ima svoj vrsni diverzitet. esto je potrebno
poznavati izvor i nain bioloke raznolikosti za uspjeno ouvanje neke vrste
(Vida, 1994, Sunik, 2001).
Evolucijski signifikantne jedinke (engl. ESU; Evolutionary Signifacant
Units) su populacija ili skupina populacija koje su reproduktivno izolirane od
drugih populacija iste vrste i predstavljaju vaan element u genetskoj
raznolikosti vrste (Waples, 1991). Najprimjerenije za ouvanje bile bi one
vrste koje su autohtone u nekom geografskom podruju i genetski su to vie
udaljene od srodnih vrsta (Maitland, 1995).
Na Konferenciji o biolokoj raznolikosti (Rio de Janeiro, 1992)
zakljueno je da su genetski razliite populacije primarne jedinice za
ouvanje, bez obzira na njihov taksonomski status. Stoga se uspjeno
ouvanje temelji na genetskim razlikama meu jedinicama, bez obzira da li se
radi o vrsti, podvrsti ili o lokalnoj populaciji (Moritz, 1994).
Hibridizacija je meusobno krianje individua iz genetiki dalekih
populacija (Rhymer i Simberloff, 1993). Hibridne zone su obino uski prostori
gdje se susreu i mrijeste genetiki razliite populacije. Za visok postotak
hibridizacije izmeu bliskih ribljih vrsta zasluno je nekoliko faktora:

gubitak ili smanjenje prirodnih stanita neke vrste

poveanje stanita od strane neke vrste

akvakultura

introdukcija

vanjska oplodnja
37

slab mehanizam izolacije

nejednaka prisutnost obaju roditelja

kompeticija za mali mrjestilini prostor (Campton, 1987).

Hibridizacija je esta pojava u riba. Uoeno je da se hibridizacija u riba

pojavljuje mnogo ee nego u ostalih skupina kraljenjaka, a razlog tome
pripisuje se vrlo estoj vanjskoj oplodnji. U ribljim populacijama uoeno je
krianje unutar rodova (Avise i Saunders, 1984), kao i izmeu razliitih rodova
(Verspoor, 1988). Formiranje hibridnih populacija izmeu prirodnih i unesenih
vrsta je vrlo esta pojava meu salmonidima u SAD (Allendorf i Leary, 1988),
kao i u Europi (Jordan i Verspoor, 1993). Vrste koje se u velikom postotku
sastoje od hibrida karakterizira velik broj srodnih oblika sa slinom ekologijom
i stanitima.
Hibridizacija moe biti prirodna ili uvjetovana ljudskim faktorom
antropogena hibridizacija. esto je vrlo teko utvrditi na koji nain je do
hibridizacija dolo u nekoj populaciji. Allendorf i suradnici (2001) mogunost
nastanka hibridizacije razvrstavaju u est tipova, od kojih se prva tri tipa
odnose na prirodnu hibridizaciju, a ostala tri na antropogenu hibridizaciju:

1. Prirodni tip hibrida Hibrid koji je nastao krianjem u davnoj prolosti,

a danas je ugroena vrsta kojoj je potrebna zatita. Hibridizacija
izmeu ribljih vrsta esto je vezana uz prirodne promjene i geoloke
dogaaje. Ledeno doba pleistocena jako je doprinjelo promjeni stanita
brojnih ribljih vrsta i utjecalo na karakteristike i stupanj povezanosti
vodenih podruja (Bernachez i Wilson, 1998). Riblje populacije ranije
izolirane ledom, mijeale su se pratei povlaenje leda, to je uvelike
omoguilo hibridizaciju.
2. Prirodna introgresija Dvije vrste ive na istom podruju, razlikuju se
fenotipski i ekoloki, no njihova genetska udaljenost je mnogo blia,
nego to je za oekivati za promatranu vrstu. Stoga dolazi do
povremene hibridizacije izmeu tih dviju vrsta. Populacija nastala
nakon ovakve hibridizacije sadri i alele od druge vrste, no daljnja

38

hibridizacija ne smanjuje frekvenciju tih alela. Takva introgresija je dio

evolucijskog procesa.
3. Prirodne hibridne zone iroka podruja na kojima zajedno ive dvije
populacije, populacija hibrida i populacija njihovih davnih roditelja.
Prirodna selekcija uz stanine razlike dovela je do odranja roditeljskih
i hibridnih populacija. Openito, veliina i stabilnost hibridne zone ovisi
o stupnju protoka gena, razliitostima izmeu roditelja i hibrida u
genotipskom fitnessu, veliini razliitosti genskih frekvencija izmeu
roditeljskih

populacija,

stupnju

populacijske

strukture

stupnju

hibridizaciju

izmeu

promijene okolia.
4. Hibridizacija

bez

introgresije

Obuhvaa

autohtone i alohtone vrste, no uz slabo preivljavanje hibrida prve

generacije. Osnovni problem u ovom sluaju je gubitak reprodukcijskog
materijala.
5. Uvelike prisutna introgresija Hibridizacija sa introgresijom je uvelike
prisutna tamo gdje se na istom podruju nalaze dvije vrste koje se
uspjeno razmnoavaju. esto se u udaljenim i nepristupanim
predjelima mogu nai iste populacije takovih vrsta, pa se u smislu
zatite i obnavljanja upravo na njih treba koncentrirati.
6. Potpuna hibridizacija populacije Prirodna populacija je jako mala,
ako uope i postoji. Kad je hibridizacija jednom zapoela, teko ju je
zaustaviti, naroito kada su hibridi fertilni a razmnoavaju se i
meusobno i sa roditeljima. Nakon nekoliko generacija takvog procesa
dolazi do stvaranja populacije koja se sastoji samo od jedinki hibridnog
porijekla. Tada je potrebno je zatiti hibride jer je to jedina mogua
opcija ako elimo izbjei potpuni gubitak vrste.

Problem hibridizacije dugo je bio podcijenjen i slabo prepoznat, pa se

nije na vrijeme sprijeilo unoenje novih vrsta u stanita i izmjena prirodnih
stanita, za to se ustanovilo da uvelike doprinosi ovoj pojavi (Allendorf i sur.,
2001). Vanost ljudskog faktora u hibridizaciji i gubitku ribljeg biodiverziteta
danas je jako poznat. Ljudske aktivnosti koje su dovele do promjena u
prirodnom stanitu nekih vrsta, to je posljedino dovelo do hibridizacije su:
izgradnja brana i kanala, smanjenje vodenog stupca radi koritenja vode za
39

navodnjavanje poljoprivrednih povrina, zagaenje, uklanjanje submerzne

vegetacije. ovjek je svojim aktivnostima, prenoenjem jedne vrste u prirodno
stanite druge, doprinjeo da se ranije izolirane vrste susretnu i razmnoavaju,
uz to je i smanjenje mrjestilinog prostora doprinjelo je pojavi hibridizacije.
Meutim, neki hibridi su namjerno stvoreni sa ciljem da se povea
produktivnost akvakulturnih linija ili mogunost ulova pri udiarenju (Pipas i
Bulow, 1998; Dowling i Secor, 1997).

Carvalho (1993) uvia da izolacija pojedinih ribljih populacija radi

nemogunosti migracija izmeu rijenih sustava, esto dovodi do vee
genetske raznolikosti i do prilagoenosti tih populacija za odreeno stanite.
Do promjene genetskog sastava populacija dolazi unoenjem genetski
neprimjerenih linija u rijene sustave, kao i njihovim krianjem sa pripadnicima
autohtonih populacija. Unoenje razliitih ribljih vrsta u otvorene vode
uglavnom ima za cilj poveanje veliine populacija radi sportskog ribolova.
Mnogo godina se prakticirao unos riba u nova im stanita bez ikakvih
razmiljanja o buduim posljedicama smanjenja bioloke raznolikosti.
Unoenjem novih vrsta ili populacija, kod izdvojenih populacija dolazi do
izmjene gena koji su nastali tijekom evolucije kroz milijun godina. Nastavak
takovog procesa vodi ka nenadomjestivom gubitku genetskog identiteta
pojedinih populacija i prema umjetnoj tvorbi jedne "mijeane" vrste bez
meupopulacijskih razlika (Avise, 1994). Posljedice toga su gubitak lokalne
genetske populacijske strukture i specifinih genotipskih kombinacija sa
potencijalnom adaptivnom vrijednou (Hansen i Loeschcke, 1994). Jedno od
moguih rjeenja za popravak stanja u tim vodama je unoenje autohtonih
jedinki, prethodno umjetno izmrijetenih sa ciljem da se povea broj
autohtonih jedinki. Uz to potrebno je sprijeiti unos tuih gena. Meutim
javljaju se i negativne posljedice pomonog unoenja, npr. razmnoavanje u
srodstvu sa ime se smanjuje ukupna genetska raznolikost (Berrebi i sur.,
1999).
Osnovna pravila u vezi ouvanja vrsta i populacija slatkovodnih riba, pri
emu je najvanije ouvanje prirodnih ekosistema i genetske strukture
populacija. postavili su Berrebi i sur. (1999). Genetska struktura populacija je
vana u poetku procesa zatite pa prvo odreujemo genetski identitet
40

populacije a na osnovi njega odreujemo prikladne jedinke za ouvanje. Pri

uzgoju riba s namjerom ouvanja odreenih populacija, potrebno je prije
unoenja uzgojenih jedinki prouiti njihove morfoloke, ekoloke i genetske
osobine.
Meffe (1986) je ujedinio itav proces koji dovodi do ugroenosti ribljih
populacija, te predlae neka pravila za upravljanje ugroenim populacijama.
Uzroci koji smanjuju genetsku raznolikost su: mala veliina populacije, efekt
uskog grla, sluajan tok alela, razmnoavanje u srodstvu, umjetna selekcija i
dugotrajno mijeanje sa ribogojilinim linijama. Sva ta djelovanja uzrokuju
poveanje homozigotnosti, gubitak polimorfizma i poveano izraavanje
recesivnih alela, to utjee na smanjenu sposobnost preivljavanja. S
genetskog stajalita, jedino pravilno upravljanje ribljim populacijama mora se
temeljiti na praenju genetske strukture prirodnih i uzgojenih populacija,
uporabi veeg broja roditeljskih jedinki pri uzgoju, selektivnom razmnoavanju
koje bi sprijeilo razmnoavanje u srodstvu, to kraem vremenu ivota
potomstva u zatoenitvu i odvojenom uzgoju razliitih genetskih linija ili
populacija. Nakon stavljanja uzgojenih jedinki u prirodnu sredinu, potrebno ih
je pratiti genetskim analizama i preko statistike ribolova. Osim identifikacija
populacije, potreban je opis cjelokupnog biolokog kompleksa, koji je nuan
za ouvanje ugroenih jedinki, jer mnoge rijetke i ugroene ivotinjske vrste
ive u manjim i izoliranim populacijama (Sunik, 2001).
Genetika zatite ivih organizama (engl. conservation genetics) bavi se
genetskim istraivanjima rijetkih ili ugroenih vrsta. Prouavajui imbenike
koji su utjecali na uestalost alela, pokuava se dokuiti evolucijski razvoj
populacije. Takva su saznanja vana za daljnja planiranja gospodarenja
odreenom vrstom u svrhu njenog ouvanja, odnosno ouvanja odgovarajue
genetske raznolikosti (Crivelli i sur., 2000). Genetika zatite ivih organizama
se

takoer

bavi

istraivanjima

bliskom

srodstvu,

uspjenou

razmnoavanja, te openito istraivanjima genetske raznolikosti (Beaumont i

Bruford, 1999).

Ouvanje prirodnog stanita i genetskog polimorfizma vrlo je vano za

preivljavanje mnogih ugroenih vrsta, kao i onih vrsta ije je prirodno stanite
drastino smanjeno. Stoga je, naroito za ugroene populacije potrebno
41

ouvati to vei stupanj heterozigotnosti u populaciji, jer je tada vei i postotak

preivljenja. Meutim vrlo esto je sluaj upravo suprotan, da ugroene
populacije imaju vrlo nizak stupanj heterozigotnosti, to je najee posljedica
efekta "uskog grla" (Carvalho, 1993).

Veliki problem hibridizacije u riba je to, to je potomstvo hibrida vrlo

esto fertilno pa se i dalje normalno razmnoava generacijama. Stoga je vrlo
vano uoiti i prepoznati hibrida, ali i vrlo sloeno. Do 1966. godine, u tu svrhu
su se koristile iskljuivo meristike i morfoloke metode. Detekcija hibrida
uporabom morfolokih metoda polazi od pretpostavke da e hibrid fenotipski
izgledati negdje izmeu obaju roditelja (Smith, 1992). Meutim, to esto i nije
sluaj, jer hibridi ponekad pokazuju i itav spektar roditeljskih fenotipova
(Campton, 1987), a ponekad uope i ne slie roditeljima. Morfoloke znaajke
ne omoguavaju otkrivanje da li hibrid pripada prvoj generaciji ili nekoj
daljnjoj.
Koritenje molekularnih markera uvelike olakava identifikaciju i opis
hibridnih populacija.

Koritenje molekularnih markera zapoelo je s

proteinskom elektroforezom (aloezimima) sredinom ezedestih godina, a

sredinom osamdesetih godina, u tu svrhu koristi se i mtDNA. Dananje
prednosti u molekularnoj tehnologiji, naroito nakon mogunosti amplifikacije
pomou lanane reakcije polimerazom, znatno je povealo broj lokusa koji se
koriste u hibridizaciji. Osim toga, molekularne tehnike su vrlo pogodne za
male ugroene populacije, jer za istraivanje nije potrebno rtvovati ribu
(Taberlet, 1999). Perez i sur. (1999) vrlo su uspjeno koristili restrikcijski
enzim SacI pri razlikovanju hibrida od istih roditeljskih linija pastrva i lososa.
No, unato velikoj popularnosti molekularnih metoda, morfoloke analize su i
dalje uobiajene, najee zajedno sa genetskim markerima (Pipas i Bulow,
1998).
Procjena podudarnosti izmeu razliitih genetskih markera koji se
koriste u filogeografskim istraivanjima, danas je postala vanim pitanjem
(Avise, 2000), pa se velik broj istraivanja bavi odnosima izmeu populacija.
Oni koriste nekoliko razliitih genetskih markera na razliitim regijama DNA
molekule (Lu i sur., 2001). Podudarnost razliitih molekularnih tehnika
omoguuje toan uvid u evolucijsku povijest vrste, ali je znaajno i njihovo
42

nepodudaranje, jer omoguuje bolje razumijevanje evolucijskog procesa i udio

selekcije i hibridizacije (Rieseberg, 1998).
Razpet i suradnici (2003) prouavali su hibride izmeu potone (Salmo
trutta) i mekousne (Salmo obtusirostis) pastrve u rijeci Neretvi. Izmeu te dvije
vrste u rijeci Neretvi postoje hibridi, a morfoloki se razlikuju od roditelja. Koje
lokalni stanovnici ih nazivaju "kosor". Pomou tehnika mikrosatelita i
sekvencioniranja II introna gena laktat dehidrogenaze i C introna gena
hormona rasta na mtDNA, razdvojili su grupe - potone pastrve, mekousne
pastrve, njihove hibride. Znatna varijabilnost hibrida navodila je na to da su
hibridi fertilni.

Nekoliko imbenika treba uzeti u obzir kada se promatra potencijal

hibridne populacije. Jedan od njih je broj preostalih istih populacija. to je
manji broj preostalih istih populacija, potrebna je vea zatita preostalih
hibridnih populacija.
Mogunost obnavljanja prvotne populacije bez hibrida najbolje je
mogue onda kad se populacija sastoji od roditelja i hibrida prve generacije.
Tada se uz koritenje veeg broja dijagnostikih lokusa, odvoje iste jedinke
od hibrida. Obnavljanje populacije mogue je uz umjetni mrijest.
Primjer negativnog utjecaja uneenih potonih pastrva, uzgojenih u
ribogojilitu, na prirodnu populaciju glavatice (Salmo trutta marmoratus,
Cuvier 1817) vidljiv je u rijeci Soi u Sloveniji (Snoj, 1997). Uzgojene pastrve
imale su vrlo slab "homing" efekt koji je uzrokovao genetski tok izmeu
reproduktivno izoliranim prirodnim populacijama glavatice i potone pastrve,
koje su zauzimale razliite dijelove rijenog sustava. Situacija je bila znatno
oteana injenicom da su krianci potone pastrve i glavatice bili plodni.
Kako bi se ouvala ista glavatica u Sloveniji je razraen plan za
njezinu zatitu (Pov i sur., 1996):

Gospodarenje glavaticom ukljuuje prekid naseljavanja potone

pastrve i poveanje izlova krianaca i potone pastrve iz rijeka
jadranskog sliva.

Zatita stanita glavatice, naroito vodotoka sa istom glavaticom.

43

Zatita glavatice, koja bi ukljuivala ouvanje biolokih i genetskih

obiljeja. Osnivanje rezervata sa glavaticom, koja bi se birala na prema
fenotipskim i prema raspoloivim genetskim markerima (Snoj i sur.,
1996; Snoj, 1997; Sunik i sur., 1997; Berrebi i sur., 2000). Sa
namjerom smanjenja negativnih posljedica unosa uzgojenih glavatica u
njihova prirodna stanita, pastrve se neko vrijeme dre u ribogojilitu,
gdje se pokuavaju imitirati uvjeti to sliniji njihovom prirodnom
stanitu. Potomci se prvo smjetaju u uzgojne potoke, pri emu se
svake godine dio matine populacije zamjenjuje sa dijelom potomaka iz
rezervata.

Posljednjih godina hibridizacija je naroito dobila na popularnosti kao

znaajna sila u evoluciji (Harrison, 1993), naime vrlo esto je mogue hibridnu
zonu promatrati kao jedan "prirodni laboratorij", gdje se mogu promatrati
djelovanja i interakcije evolucijskih sila (Barton i Hewitt, 1989). Hibridi imaju
sposobnost formiranja multi genetskog kompleksa koji u odreenim
okolnostima moe dovesti do hibridske specijacije. Ipak, mnogo ee
genetske promjene izmeu hibridnih vrsta nisu reciprone, ve direktne, gdje
se geni jedne vrste uklope u genom druge vrste, odnosno dolazi do
introgresivne hibridizacije (Mayr, 1963), pri emu vrlo esto hibridi pokazuju
manji fitness od roditelja.
Dugo se smatralo da populacije kod kojih je dolo do hibridizacije sa
genetski razliitim pripadnicima drugih populacija, ne bi trebale biti zatiene,
meutim danas postoje i suprotna miljenja. Avise (1994) smatra da se
hibridizacija kod veine organizama spontano dogaa u prirodi, a to bi znailo
da bi vrlo mali broj vrsta trebao biti uvrten u programe zatite. Stoga Hansen
i Loeschcke (1994) smatraju da se hibridne populacije ne bi trebale iskljuivati
iz programa zatite.

Uska distribucija endemskih slatkovodnih riba Mediterana ini ih vrlo

osjetljivim na promjene okolia. Osnovni razlog ugroenosti i nestanka
endemskih vrsta je unitavanje njihova prirodnoga stanita, a prate ga
organsko i industrijsko oneienje.

44

Za mekousnu pastrvu moemo rei da je jedna od najugroenijih

slatkovodnih riba. Podruje koje naseljava je poprilino usko, pa njegovo
zagaenje ima drastine posljedice za ovu vrstu. Naglaenom smanjenju
njene brojnosti doprinose i drugi imbenici:
1. Nekontrolirano unoenje alohtonih vrsta u njena prirodna stanita
(kalifornijska

pastrva),

kada

dolazi

do

direktne

kompeticije

hranidbenoj nii i do genetikog oneienja (mekousna pastrva se

uspjeno kria s potonom pastrvom na prostoru gdje dijele ista
stanita).
2. Izgradnja pregrada i retencija koje postepeno dovode do zagrijavanja
vode. Temperatura od 20oC je letalna za mekousnu pastrvu.
3. Prekomjerno oduzimanje vode dovodi do smanjenja protoka i brzine
vode, to posebno za ljetnih mjeseci uvjetuje zagrijavanje vode.
Smanjenje brzine vodenog toka ima za posljedicu manju koliinu
otopljenog kisika, na to je mekousna pastrva naroito osjetljiva.
Smanjen

protok

dovodi

do

nestanka

brzica

slapova

gdje

jednogodinje jedinke nalaze zaklon.

4. Organska i druga oneienja su posredno i neposredno uzrok
smanjenja populacije. Razgradnjom organske tvari dolazi do poveane
potronje kisika, a mekousna pastrva se pokazala vrlo osjetljivom na
smanjenje koliine kisika u vodi (Bonacci i sur., 1998).
5. Ribolov, naroito prelov, uzrokuje smanjenje prirodnih populacija, a s
time i inerpopulacijski i intrapopulacijski polimorfizm.

Mogunost ouvanja ove vrste bila bi ponajprije prestanak unosa

alohtonih kompeticijskih ribljih vrsta, njena potpuna zatita u smislu izlova,
nemijenjanje i neunitavanje njenih stanita, te uzgoj nasadnog materijala u
ribogojilitima, ije bi se potomstvo unosilo u prirodna stanita mekousne
pastrve. Ponovno obnavljanje unitenih i promijenjenih stanita vrlo je sloeno
i zahtijeva velika sredstva.
Zatita i obnavljanje promijenjenih i unitenih stanita vrlo je vana za
dugorono ouvanje ugroenih vrsta. Pri tome bi prednost trebale imati one
vode kod kojih utjecaj ovjeka nije prevelik i u kojima jo obitava vrsta ili
populacija koju elimo zatiti. Potreban je potpuni nadzor takovih voda, a sve
45

aktivnosti koje bi negativno djelovale na ugroenu populaciju, treba svesti na

minimum (Sunik, 2001).

Filogeografija je znanost koja se bavi geografskim distribucijama

evolucijskih linija i geografskim procesima koji su utjecali na te distribucije sa
osvrtom na razliitost izmeu i unutar srodnih vrsta. Filogeografske studije su
uvelike doprinijele razumijevanju evolucijskog procesa u riba (Avise, 2000) i
pomou njih je poboljan opis geografskih distribucija, filogenetskih odnosa i
genetskih udaljenosti izmeu evolucijskih linija (Berningham i Moritz, 1998).
Kod filogeografskih istraivanja kao marker najvie je koritena
varijabilnost mtDNA. Razlog tome je njezina brza evolucija i materinsko
prenoenje bez intermolekularne rekombinacije (Avise, 2000). Meutim, zbog
toga to mitohondrijalni genom predstavlja samo mali fragment od ukupnog
povijesnog dogaaja, studije u kojima je koritena samo mtDNA esto su bile
upitne i podvrgavane kritikama (Palumbi i Baker, 1994). Razlog tome je to u
takvim studijama esto moe doi do pogrene interpretacije filogenetskih
veza, naroito u sluajevima kad je ukljuena i hibridizacija sa introgresijom
(Riesberg, 1998).

46

1.1.4. Osnovne postavke populacijske genetike

Znanost koja se bavi promjenama nasljednog materijala unutar
populacije, zove se populacijska genetika. Ona je usko vezna za genotipske
promjene, a zadatak joj je objasniti rasprostranjenost genetskih varijacija, te
objanjenje porijekla, tijeka i evolucijskog znaenja takvih varijacija (Li i
Grauer, 1991).
Kvantitativno odreivanje genetskih varijacija mogue je provesti
pomou frekvencije (uestalosti) alela (p).

p = (2 (AA) + (Aa)) / 2n

Frekvencija (p) bilo kojeg alela (A) jednaka je dvostrukom broju

homozigotnih genotipova tog alela (AA), budui da svaki homozigot nosi iste
dvije kopije alela, uveanom za broj heterozigotnih genotipova koji sadre
ovaj alel (Aa), podijeljen sa brojem uzoraka (n), (Nicholas, 1996).
Iz alela nastaju razliiti genotipovi, frekvencija genotipova predstavlja
njihovu uestalost. Mjera genetske varijabilnosti je udio heterozigota u nekoj
populaciji. Uestalost alela a oznaava se kao q, stoga je u populaciji sa dva
alela ukupna suma frekvencija jednaka p + q = 1, jer uestalost alela u
populaciji slijedi binomnu raspodjelu.
Osnovni teorem populacijske genetike je Hardy-Weinbergov zakon
ravnotee. Poetkom prologa stoljea (1908. godine), engleski matematiar
Godfrey Hardy i njemaki lijenik Wilhelm Weinberg, neovisno jedan o
drugome, objavili su teorijski ogled kojim se mogu predvidjeti uestalosti
genotipova na odreenom lokusu. Matematiki opisi nastali iz ovih postavki
poznati su pod nazivom Hardy-Weinbergov zakon ravnotee. Ovaj zakon
predstavlja uvjet pod kojim su uestalosti alela i genotipova u diploidnim
organizmima, iz generacije u generaciju, jednake produktu uestalosti
uoenih alela, a matematiki je izraavamo sljedeim odnosom:
pi2 AiAi + 2pipi Ai Aj
i

i<j

47

Da bi Hardy-Weinbergov zakon ravnotee bio valjan slijedei uvjeti

trebaju biti zadovoljeni: postojanje dovoljno velike populacije, nasumino
sparivanje unutar populacije, iskljuiti postojanje mutacije, selekcije i
migracije.
Najee koriteni test u populacijskoj genetici je 2 test (Hi kvadrat
test). Njega dobivamo iz podataka o uoenoj (obs) i oekivanoj (exp)
uestalosti genotipova.
2 = S (obs exp)2 / exp

Hardy-Weinbergov zakon testira se

testom, nakon odreivanja

udjela homozigota (Hom) i heterozigota (Het) prema formuli:

2 = (Homobs Homexp)2 / Homexp + (Hetobs Hetexp)2 / Hetexp

1.1.4.1. Promjene genetskog materijala

Uzrok genetikim varijacijama su mutacije. Mogunost nastavljanja

evolucije ovisna je o novonastalim mutacijama koje se uspiju odrati u
populaciji, odnosno o tome da svi potomci u narednim generacijama naslijede
mutirani gen. Bez porasta uestalosti, mutacija e imati mali znaaj za
evolucijsku povijest neke vrste. Da bi se poveala uestalost mutiranom alelu,
osim same mutacije, moraju se razmotriti i drugi mogui imbenici, kao to je
prirodna selekcija, genetiki "drift", rekombinacija i migracije.
Stabilnost i varijabilnost genetskog materijala tijekom reprodukcije
osiguravaju postojanost vrste, dugoronu prilagodljivost populacija i bioloku
evoluciju. Maksimalna genetika stabilnost prednost je u populacijama koje su
dobro prilagoene na uvijete okoline, no prilagodba na nove selektivne uvijete
zahtijeva odreeni stupanj genetike varijabilnosti u populaciji. Svaka
promjena redoslijeda nukleotida u DNA ili strukture ili broja kromosoma u
stanici naziva se mutacijom. Neke mutacija uzrokuju smrt stanice, dok se
druge ustaljuju i stabilno nasljeuju iz generacije u generaciju. Takve mutacije
48

mogu ili ostati prikrivene ili uzrokovati vidljive promjene fenotipa, odnosno
organizma. S obzirom na obujam genoma zahvaenog promjenom, mutacije
mogu biti genske, kromosomske i genomske.
Mutacije mogu uzrokovati razliite promijene:

supstitucije

zamjene

jednog

nukleotida

drugim.

Zamjene

nukelotida mogu se podijeliti na tranzicije i transverzije. Pod

tranzicijom

se

smatra

zamjena

pirimidinske

baze

drugom

pirimidinskom bazom ili jednog purina drugim purinom, dok se pod

transverzijom podrazumijeva zamjena pirimidinske baze purinskom
ili purinske pirimidinskom bazom;

delecije uklanjanje jednog ili vie nukleotida iz molekule DNA;

insercije - umetanje jednog ili vie nukleotida;

inverzije rotacija dvolananog dijela DNA, duljine dvaju ili vie

parova baza za 180o.

Prirodna selekcija je proces kod kojeg genetike varijacije stvaraju

razlike izmeu organizama u njihovoj sposobnosti preivljavanja i uspjenosti
reprodukcije. Genetiki drift (engl. random genetic drift) ima vanu ulogu u
evoluciji, no njegov je utjecaj znakovit tek na molekularnoj razini. Sluajni
genetiki dirft predstavlja kolebljivost u uestalosti alela (iz generacije u
generaciju) uzrokovanu sluajnim dogaajima poput sluajnog uzorkovanja
gameta. Stoga i kada bi sve jedinke u populaciji imale jednaku bioloku
sposobnost, mijenjanje uestalosti alela bi postojalo radi nasuminog
zdruivanja gameta. Genetska struktura populacije mijenja se dolaskom
novog gena u populaciju. Taj proces zove se "tok gena" (engl. gene flow) (Li i
Grauer, 1991).
Prisutnost vie alela na odreenom lokusu u populaciji gdje se svaki
alel pojavljuje sa "znatnom" frekvencijom, zove se genetiki polimorfizam.
"Znatna" je ona frekvencija koja je via od one stvorene tijekom mutacijskog
procesa. Premda u prirodi svi geni mutiraju veina tih mutacija, vrlo esto
nestane pa ih ne uspijemo registrirati. No, ako se promatra populacija u tono
odreenom trenutku, ne mogu se otkriti svi aleli ve samo oni koji se zadre u
populaciji kroz dulji period i prisutni su sa "znatnim" frekvencijama. Brojana

49

granica koja oznaava "znatnu" frekvenciju i kojom se dogovorno slue

genetiari, je 0,01. Ako se jedan alel javlja s uestalou veom ili jednakom
0,01 tada predstavlja polimorfizam - u suprotnom ga ne smatramo
polimorfizmom (Ford-Llyoyd, 1996).
Glavni mehanizam za stvaranje polimorfizama kod mikrosatelita je
pogreno sparivanje baza ispadom dijela sekvence. Ta se pojava dogaa
kada je normalno sparivanje baza dvaju komplementarnih lanaca DNA
ometeno razmicanjem ponavljajueg niza na oba lanca, to dovodi do
pogrenog nizanja ponavljajuih sekvenci. Ovaj se mehanizam naziva i
replikacijski ispad (engl. replication slippage) jer se zbiva tijekom replikacije
kada DNA postaje jednolanana, a svaki lanac slui kao kalup za
polimerizaciju novog komplementa.

50

2. MATERIJAL I METODE RADA

U istraivanje je ukljueno 79 primjeraka pastrva: 55 mekousnih i 24
potone pastrve iz 5 razliitih populacija (Tablica 1). Na tri uzorka mekousne
pastrve izvrena su morfometrijska mjerenja. Morfometrijska mjerenja
izvrena su samo na uzorcima koji su uginuli, dva uzorka su naena u donjem
toku rijeke, a jedan primjerak je uginuo prilikom uzorkovanja, budui da se
radi o osjetljivoj i ugroenoj vrsti.
Veina uzoraka prikupljena je iz rijeka na podruju Republike Hrvatske,
Jadra, rnovnice, Zrmanje i Krke, dok je samo 7 uzoraka mekousne pastrve
prikupljeno iz rijeke Neretve u Bosni i Hercegovini. U rijeci Jadro prikupili smo
19, u rijeci rnovnici 29 uzoraka mekousne pastrve. U rijeci Krki prikupljeno je
19 i u rijeci Zrmanji 5 uzoraka potone pastrve. Sve populacije imaju
karakteristian fenotip, te ih je lako meusobno razlikovati.
Uzorkovanje je izvreno u razdoblju izmeu 2001. i 2003. godine.
Ribe su hvatane u gornjim tokovima rijeka elektrinim agregatom
"Sever". Nakon uzimanja uzoraka za molekularnu analizu i mjerenja, putene
su natrag u vodu. Ribama smo odstranili dio podrepne peraje, oko 0,5 cm2, i
pohranili ih u 96% etanolu do daljnje analize.

51

Tablica 1: Pregled broja uzoraka s obzirom na vrstu, lokalitet i obavljene

analize; mtDNA/MS (analiza mitohondrijske i mikrosatelitske DNA), mtDNA
(analiza mitohondrijske DNA), MS (analiza mikrosatelitske DNA).

Vrsta

Lokalitet

Morfometrijska
mjerenja

mtDNA/MS

mtDNA

MS

Ukupno

Salmo trutta
Krka

13

19

13

45

Zrmanja

12

19

19

19

60

rnovnica

19

29

19

67

Neretva

21

63

76

63

Salmothymus
obtusirostris
Jadro

Ukupno

2. 1. MORFOMETRIJSKE ANALIZE
Prilikom istraivanja na rijeci Jadro, jedan primjerak mekousne pastrve je
uginuo, a dvije mekousne pastrve su naene uginule u donjim tokovima
rijeke. Na tim uzorcima obavljene su sljedee morfometrijske analize:

to

totalna duina tijela. Udaljenost izmeu vrha ustiju i linije koja

spaja krakove repne peraje.

a1

standardna duina tijela. Udaljenost izmeu vrha ustiju i toke

od koje poinju bice repne peraje.

duina do vilice. Udaljenost izmeu vrha ustiju i vrhova srednjih

bica repne peraje.

najvea visina tijela

najmanja visina tijela

antenalno rastojanje

52

antedorzalno rastojanje

anteventralno rastojanje

udaljenost izmeu prsnih i trbunih peraja

udaljenost izmeu trbune i podrepne peraje

duina prsne peraje

duina trbune peraje

duina osnove lene peraje

o1

visina prednjeg dijela lene peraje

o2

visina zadnjeg dijela lene peraje

duina osnove podrepne peraje

visina podrepne peraje

udaljenost izmeu podrepne i osnove repne peraje

udaljenost izmeu masne i osnove repne peraje

y1

duina repnog stabla

o0

duina gornjeg dijela repne peraje

o01

duina donjeg dijela repne peraje

a0

duina srednjih bica repne peraje

duina glave. Udaljenost izmeu vrha ustiju i prednje ivice oka.

ch2

visina glave u zatiljku

ch1

visina glave u onom dijelu

duina postokularnog dijela glave

uzduni dijametar oka

irina meuonog prostora

duina gornje vilice. Udaljenost izmeu vrha vilice i zadnje sdfas

adf a viline toke.

irina gornje vilice

duina donje vilice. Udaljenost izmeu vrha donje vilice i zadnje

faasf viline toke.

sp.br.

broj branhiospina na prvom krnom luku

1.1. broj ljuski u bonoj liniji

1.2. broj redova ljuski od bone linije do lene peraje

1.3. broj redova ljuski od bone linije do trbune peraje

53

broj bica u lenoj peraji

broj bica u trbunoj peraji

broj bica u prsnoj peraji

broj bica u podrepnoj peraji

Vert. S.

ukupan broj kraljeaka

Caud. V.

broj kaudalnih kraljeaka

App. pyl.

broj pilorikih nastavaka

Ukupan broj kraljeaka odreen je na osnovi rengen fotografije (Slika 14).

Slika 14: Rengen fotografija kostura mekousne pastrve iz rijeke Jadro

54

Statistika obrada morfometrijskih metoda

Za obraunavanje dobivenih morfometrijskih vrijednosti upotrebljena je

varijaciono-statistika metoda sa sljedeim elementima: srednja vrijednost i
standardna devijacija.
Da bi se usporedili s rezultatima od Jankovi (1961), Behnke (1968) i
Mari (2002), dobiveni podaci su stavljeni u odnos s duinom vilice i totalnom
duinom, a mjere na glavi s duinom glave.

2.2. PREGLED PROBAVILA

Kod tri primjerka mekousne pastrve iz rijeke Jadro, uz morfometrijske
metode, obavili smo i pregled probavila. Pregledom krugova prirataja (anula)
na ljuskama utvrdili smo starost primjeraka, koja je iznosila od 1 do 3 godine
(Treer i sur., 2003b).
Analiza ishrane izvrena je prema eluanom i crijevnom sadraju.
Sadraj probavila izdvojili smo u epruvetu s alkoholom i promatrali
stereomikroskopom.

55

2.3. MOLEKULARNO-GENETSKE ANALIZE

2.3.1. Izolacija DNA
DNA molekulu izolirali smo iz tkiva podrepne peraje na tri razliita
naina. Prvi korak u svim postupcima je bio, da smo od pohranjenog dijela
podrepne peraje odrezali manji dio tkiva i oprali ga od alkohola destiliranom
vodom.
Prvi postupak koji smo primjenjivali je tzv. brza izolacija DNA
(Bowling i sur., 2000). Radili smo je tako da smo uzorku dodali 50 l 0,2 M
NaOH, zagrijavali ga na 97C 15 minuta, a otopinu zatim smo neutralizirali
dodatkom 50 l 0,2 M NaCl uz snano mijeanje. Da bi stabilizirali DNA
molekulu, otopini smo dodali 50 l 1 M Tris-HCl pufera, pH 8,5.

Druga metoda izolacije koju smo koristili je metoda izolacije iz tkiva

pomou kitova za izolaciju Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega).
Izolaciju smo vrili prema uputama proizvoaa.

Trea metoda izolacije DNA molekule koju smo koristili, bila je prema
protokolu White i Densmore (1992). Mali dio tkiva stavili smo preko noi u 200
l Lysis pufera (1M Tris-HCl, 2M MgCl2, 1M KCl, pH 8,3) i 4 l Proteinaze K
na 370C. Nakon inkubacije dodali smo jednak volumen fenol/koloroforma u
digestoru, nakon ega je uzorak centrifugiran (14 500 x g/12 min). Gornju
frakciju, u kojoj se nalazi otopljena DNA, smo otpipetirali, pri emu smo pazili
da ne uzmemo dio bijelog taloga u kojem su se nalazili proteini. U
odpipetiranu frakciju dodali smo jednak volumen koloroforma i ponovili
postupak. Uslijedila je precipitacija sa 2,5 volumena 96% etanola ohlaenog
na -200C, te smo uzorke ostavili pola sata na -200C. Nakon precipitacije
uzorke smo centrifugirali (10 000 x g 10 min), odstranjen je etanol i
precipitacija ponovljena sa 500 l 70% etanola. Nakon centrifugiranja (10 000
x g 7 min) odstranili smo etanol, a sadraj posuili do voskaste konzistencije
(do ishlapljenja etanola). Posuenim uzorcima dodali smo 30 l Milli Q vode,
pri emu smo otopili DNA. Uzorke smo do analize pohranili na 40C.

56

2.3.2. Provjera uspjenosti izolacije DNA

Uspjenost izolacije DNA provjerili smo na 1% agaroznom gelu u 0,5 x
TBE puferskom sustavu. Na gel smo nanijeli 1,5 l otopljene DNA. Uzorke
smo vizualizirali pomou Macrouve UV transilluminatora.

Slika 15: Izolirana DNA iz uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro

2.3.3. Analiza mikrosatelitske DNA

2.3.3.1. Izbor mikrosatelita i zaetnih nukleotida

Za populacijsku studiju mekousne pastrve odabrali smo osam

mikrosatelita iz genetske knjinice salmonidnih vrsta BFRO 001 (Snoj i sur.,
1997; U90327), BFRO 002 (Susnik i sur., 1997; AF005074), Ssa 197 (OReilly
i sur., 1996; U43694), SsoSL438 (Slettan, 1995; Z49134), Strutta-24 i Strutta58 (Poteaux i sur., 1999; U60225 i U60223), Str591INRA (Presa i Guyomard,
1996; AB001064) i OmyFgt1TUF (Sakamoto i sur., 1994). Naknadno je
odabran i mikrosatelitski lokus naen u etvrtom intronu LDH-C1* gena
StMS-LDH4, to je lokus koji se pokazao specifinim za mekousnu pastrvu iz
rijeke Neretve. Zaetni nukleotidi koriteni za njegovu amplifikaciju su LDH1MSf (5-TCA TCA AAC ACT CCC CCA ACT GC-3) i LDH1R (McMeel i sur.,
2001).

57

Tablica 2: Pregled upotrebljenih mikrosatelitskih lokusa. Ime lokusa,

ponavljajua mu jedinica, broj alela, njihova duina i nukleotidni slijed
zaetnog nukleotida.

Ime lokusa

Ponavljajui

Broj

motiv

alela

Veliina
alela
(bp)

(TG)13(AG)4(TG)2(1)

BFRO 001

CATGTGCGAC-

Nukleotidni slijed zaetnog nukleotida

22

200-256

116-124

(TG)12

5 ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3
5 CTTACAGCCACCTTTATGCG 3
5 ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3

BFRO 002(2)

(TG)14

5GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3

Ssa 197(3)

(GTGA)+(GT)

18

107-177

Strutta 58(4)

GT

38

102-190

CT

22

146-198

GT

20

171-237

Str 591 INRA

(5)

Strutta 24(6)

5 GGGTTGAGTAGGGAGGCTTA 3
5 TGGCAGGGATTTGACATAAC 3
5 AACAATGACTTTCTCTGAC 3
5 AAGGACTTGAAGGACGAC 3
5 CTGGTGGCAGGATTTGA 3
5 CACTGTCTTTCGTTCTT 3
5 ATGTTTTTGACTGCACTATGTATT 3
5GGAGATAAGAGTCAACGAGGC 3

OmyFgt1TUF(7)

GT

27

187-263

SsoSL438(8)

GT

103-115

5'-AGATTTACCCAGCCAGGTAG-3'
5'-CATAGTCTGAACAGGGACAG-3'
5 GACAACACACAACCAAGGCAC 3
5 TTATGCTAGGTCTTTATGCATTGT 3

(1) Snoj i sur., 1997

(2) Sunik i sur., 1997
(3) OReilly i sur., 1996
(4) Poteaux, 1995
(5) Presa i Guyomard, 1996
(6) Poteaux i sur., 1999
(7) Sakamoto i sur., 1994
(8) Slettan, 1995

58

Fluorescentno

oznaene

zaetne

nukleotide

upotrijebili

smo

za

TM

310

odreivanje duine mikrosatelitskih lokusa na aparatu ABI PRISM

(Parkin Elmer). S razliitim bojama smo oznaili po jedan od para zaetnih

nukleotida. Istraivanje smo vrili u dvije skupine u prvoj je kao standard
koriten Rox, a zaetni nukleotidi su nosili sljedee boje: BFRO 001 Fam, Str
591 INRA i SsoSL438 Joe, a OmyFgt1TUF i Strutta 58 Tamru. U drugoj
skupini standard je bio Tamra, a zaetni nukleotidi su nosili sljedee boje: Str
24 i LDH Fam, Ssa 197 Tet, a BFRO 002 Hex.

2.3.3.2. Lanana reakcija polimerazom (PCR)

Lananom reakcijom polimeraze umnoili smo odsjeke na molekuli

DNA. Reakcija se odvijala u tri stupnja na razliitim temperaturama. U prvom
stupnju pri visokoj temperaturi dolo je do denaturacije dvolanane molekule
DNA.

Pri

sniavanju

temperature

zaetni

nukleotidi

su

prilegli

uz

komplementarna mjesta na molekuli, a uz prisustvo enzima polimeraze dolo

je do sinteze komplementarnog lanca DNA.
U lananoj reakciji polimeraze za svaki mikrosatelitski lokus pripremili
smo reakcijsku smjesu od 10 l, sljedeeg sastava:

50 ng genomske DNA
0,5 M svakog zaetnog nukleotida od para
0,2 mM dNTP-a (smjesa etiri nukleotida)
1,5 mM MgCl2
20 mM Tris-HCl
50 mM KCl
0,5 U/l Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)
Reakcija je provedena u termostatu PTC-100TM Programmable
Thermal Contoller (MJ Research, Inc.). Nakon 3 minute poetne denaturacije
pri 95C slijedilo je 30 ciklusa jednog od dvaju temperaturnih profila:

59

Za lokuse BFRO 001, Strutta 58, Str 591 INRA, SsoSL438,

OmyFgt1TUF, Strutta 58, Str 24, LDH i Ssa 197
denaturacija 940C, 30 sekunda
prilijeganje

520C, 15 sekunda

Za lokus BFRO 002:

denaturacija 940C, 45 sekunda
prilijeganje

600C, 25 sekunda

Sinteza DNA lanca dogaala se pri 720C, a reakciju smo zavrili

hlaenjem na 140C.

2.3.3.3. Elektroforeza na agaroznom gelu

Za odreivanje duine PCR produkata, te za njihovu naknadnu

izolaciju, koristili smo elektroforezu na agaroznom gelu. Koristili smo gelove
razliite veliine u razliitim elektroforetskim jedinicama (Biorad, LKBPharmacia). Duina fragmenata, dobivenih nakon PCR reakcije, odreena je
uz pomo DNA markera znanih veliina, od 100 do 10 000 bp (100 bp DNA
ladder i 1 kb DNA ladder, Gibco BRL). Kao pufer koriten je 0,5xTBE (50 mM
Tris, 50 mM borna kiselina, 1 mM EDTA, pH 8,2).
Agarozni gel napravili smo zagrijavanjem odreene koliine agaroze
(SeaKem LE, Biozym) u 0,5xTBE puferu. Koncentracija agaroznog gela
ovisila je o duini dobivenih fragmenata. Dui fragmenti se tee kreu kroz
agarozni gel, te su zahtijevali gelove nie koncentracije. Nakon to se smjesa
za gel ohladila na oko 500C dodali smo etidijev bromid u koncentraciji od 0,5
g/ml, te ga ulili u kalup za gel.
Da bismo pratili kretanje uzoraka u gelu, uzorcima smo prije nanoenja
u gel dodali pufer u odnosu 10:1. Pufer se sastojao od bromfenol modrila
(0,25%), ksilen cianola (0,25%) i 30% glicerola.

60

Elektroforeza se odvijala pri sobnoj temperaturi oko pola sata pri

poetnom naponu od 9 V/cm, koji smo kasnije pojaali na 12 V/cm.
Fragmente smo promatrali pod transiluminantnim svjetlom valne duine 302
nm.

Slika 16: Fragmenti mikrosatelita OmyFgt1TUF na 1,5% agaroznom gelu.

2.3.3.4. Analiza mikrosatelitskih lokusa na ABI PRISMTM 310

Mikrosatelitske lokuse analizirali smo na automatskom sekvenceru ABI

PRISMTM 310 (Perkin Elmer), koji omoguuje automatsko odreivanje
nukleotidnih jedinica kao i odreivanje duine i koliine fragmenata DNA
molekule.
Uzorke smo pripremili umnoavanjem na PCR-u, gdje smo po jedan
zaetni nukelotid od para oznaili sa fluorescentnom bojom (Fam, Hex,
Tamra, Joe ili Tet). Na jedan l PCR produkta dodali smo 12 l deioniziranog
formamida i 0,7 l standarde veliine, Tamra 350 ili Rox 350. Podizanjem
temperature na 950C dolo je do denaturacije, nakon ega smo uzorke
ohladili na ledu. Denaturirane uzorke smo stavili na ABI PRISMTM 310. Do
elektroforetskog razdvajanja fragmenata dolo je u 47 cm dugoj kapilari sa
gelom POP-4 (Performance Optimized Polymers). Razdvajanje fragmenata
teklo je po principu kapilarne elektroforeze. Laser u aparatu uzbudio je emisiju
fluorescentnih boja, a detektor ih je oitao. Dobiveni podaci su obraeni na
kompjutoru programom GeneScan 2.1.

61

2.3.3.5. Statistika analiza mikrosatelitskih podataka

Kompjutorski programi GENETIX (Belkhir i sur. 1998) i Fstat (Goudet,

1995) koriteni su pri statistikoj analizi mikosatelitskih podataka. Statistikim
metodama obraeni su odnosi izmeu jedinki, odnosi jedinki unutar populacija
i odnosi izmeu razliitih populacija.

Za ispitivanje odnosa izmeu pojedinih jedinki sluili smo se analizom

glavnih koordinata (engl. correspondence analyses). Jedinke smo prvo
svrstali s obzirom na prisutnost razliitih alela. S vrijednou 0
oznaena je ona jedinka koja nije imala promatrani alel; s vrijednou 1
ona jedinka koja je imala prisutan promatrani alel u heterozigotnom
obliku, dok je sa 2 oznaena ona jedinka kod koje je promatrani alel bio
prisutan u homozigotnom obliku. Daljnjim izraunavanjem veza izmeu
alela pomou analize glanih kooridanta dobili smo podatke u
viedimenzionalnoj strukturi.

Za prouavanje jedinki unutar populacije koristili smo dva parametra:

stupanj polimorfizma i ravnoteu genotipova unutar populacije.
Genetski polimorfizam kod svake populacije odredili smo s obzirom na
broj alela na lokusu, stvarnu i oekivanu heterozigotnost.

o stupanj polimorfizma unutar populacije

Izraunali

smo

frekvencije

alela

udio

heterozigotnosti.

Oekivanu heterozigotnost smo izraunali iz broja pojedinanih

alela u populaciji s obzirom na Hardy-Weinbergov zakon
ravnotee (Nei, 1972). Stvarnu heterozigotnost smo izraunali iz
stvarnog udjela heterozigota u populaciji.
o ravnotea unutar populacije
Pri ocjeni ravnotee unutar populacije sluili smo se Fstatistikom koja ocjenjuje odstupanje od Hardy-Weinbergovog
zakona ravnotee (Wright, 1951). Panmiksiju smo mjerili s

62

parametrom FIS (Weir i Cockerham, 1984). Negativna FIS

vrijednost

ukazuje

na

to

da

je

populaciji

stvarna

heterozigotnost manja od oekivane.

Odnosi izmeu populacija

Razlike izmeu populacija izraunali smo pomou parametra (Wei i
Coockerham, 1984). Parametar je ocjena za FST. Prilagoen malim i
nejednako velikim populacijama ili manjem broju populacija.

2.3.4. Analiza LDH gena

2.3.4.1. Sekvencioniranje LDH gena

Zaetni nukelotidi Ldhxon3F i Ldhxon4R (McMeel i sur., 2001) su

koriteni za amplifikaciju 440 bp dugog fragmenta gena laktat dehidrogenaze.
Gen laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* sastoji se od egzona 3, dugog 43 bp,
egzona 4, dugog 3,77 bp i introna 3, varijabilne duine.
Amplifikacija je provedena na termostatu PTC-100TM Programmable
Thermal Contoller (MJ Research, Inc.). Ukupan volumen reakcijske smjese od
20 l sadravao je:

100 ng genomske DNA

1 M svakog zaetnog nukleotida od para
0,2 mM dNTP-a (smjesa etiri nukleotida)
1,5 mM MgCl2
20 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 U/l Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)

63

Uzorci su amplificirani po sljedeem vremensko-temperaturnom okviru:

poetnu denaturaciju od 950C, koja je trajala 3 minute, slijedilo je 30 ciklusa
od denaturacije (940C, 30 sekunda), prilijeganja zaetnih nukleotida (620C, 30
sekunda) i produenja DNA lanca (720C, 1 minutu).
Amplificirani DNA fragmenti promatrani su na 1,5 % agaroznom gelu, iz
kojeg su izolirani sa QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN), prema uputama
proizvoaa.

Reakcije za sekvencioniranje su pripremljene sa BigDye Terminator

Ready Reaction Mix (PE Applied Biosystems), prema uputama proizvoaa.
Za sekvencioniranje gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* koriten je zaetni
nukleotid Ldhxon3R (McMeel i sur., 2001). Lanana reakcija polimeraze
provedena je na termostatu PTC-100TM Programmable Thermal Contoller (MJ
Research,

Inc.)

po

sljedeem

vremensko-temperaturnom

okviru:

30

ponavljajuih ciklusa sastojalo se od denaturacije na 960C koja je trajala 10

sekundi, prilijeganja zaetnih nukleotida na 500C od 5 sekunda i produavanje
lanca na 600C od 4 minute.

Nakon sekvencijske reakcije, neupotrebljene fluorescentno oznaene

dideoksinukleotide i zaetne nukleotide, odstranili smo precipitacijom s
natrijevim acetatom. Ukupnom volumenu sekvencijske reakcije dodali smo 2
l 3 M natrijevog acetata i 50 l 96 % etanola. Slijedila je inkubacija na ledu,
te centrifugiranje od 20.000 x g 25 minuta. Sediment koji je sadravao
percipitirane fragmente sekvencijske reakcije oprali smo u 70 % etanolu, te
zatim centrifugirali 5 minuta. Talog smo osuili u vakumskoj centrifugi, te smo
ga zatim razrijedili sa 12 l TRS (Template Suppression reagent, PE Applied
Biosystem). Uzorke smo denaturirali 2 minute na 950C i ohladili ih na ledu.
Uzorci su sekvencionirani na ABI Prism 310 automatskom sekvenceru. Za
analizu sekvencioniranja upotrebljen je programski paket DNA Sequencing
Analysis Software 3.0.

64

2.3.4.2. Analiza odsjeaka LDH, DNA molekule sa tehnikom RFLP

(Restriction Fragment Lenght Polymophism)

Sekvencioniranjem smo pronali dijagnostinu mutaciju na intronu 3

koja je specifina za mekousnu pastrvu, i koju je bilo mogue otkriti s
restrikcijskim enzimom Rsal. Sve uzorke testirali smo sa RFLP analizom i na
taj nain razlikovali uzorke koji su imali sekvencu znaajnu za mekousnu
pastrvu.
Na umnoenom dijelu nuklearne DNA, LDH dijelu, provjerili smo
polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaje restrikcijski enzim Rsa I.
Restrikcijska endonukleaza Rsa I cijepa produkte na prepoznatljivoj sekvenci
gt/ac.

Restrikcijska smjesa od 15 l sastojala se od:

300 ng PCR produkta

2 l 10 X restrikcijskog pufera
10 U restrikcijskog enzima

Reakcijske smjese stavili smo na inkubaciju od 2 sata pri 370C.

65

2.3.5. Analiza mitohondrijske DNA

2.3.5.1. Umnoavanje odsjeka mtDNA s lananom reakcijom polimeraze

(PCR)

Pomou lanane reakcije polimeraze (PCR-a) umnoili smo dio

mitohondrijalne DNA molekule duine 1200 bp, kontrolnu ili D-loop regiju i
podruje citokorma b.
Pri amplifikaciji kontrolne regije mtDNA koristili smo zaetne nukleotide:
28r

5-CACCTTAACTCCCAAAGCTAAG-3, (Snoj i sur., 2002a)

HN20

5-CCTGAAGTAGGAACCAGATG-3, (Bernachez i Danzmann,

1993)

Pri amplifikaciji citokroma b koristili smo zaetne nukleotide:

C-Glu 5-TGACTTGAAAAACCACCGTTGTTA-3, (Cronin i sur., 1993)
28r

5-CACCTTAACTCCCAAAGCTAAG-3, (Snoj i sur., 2002a)

Slika 17: Raspored gena i restrikcijskih mjesta na mitohondrijskoj DNA

molekuli, duine 166 666 bp, vrste Salmo salar (Hurst i sur., 1999).

66

Reakcijska smjesa od 20 l sadravala je :

100 ng genomske DNA
1 M svakog zaetnog nukleotida od para
0,2 mM dNTP-a (smjesa etiri nukleotida)
1,5 mM MgCl2
20 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 U/l Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer)
PCR reakcija je raena na MJ Research PTC-100 termostatu po
sljedeem vremensko-temperaturnom okviru: poetnoj 3 minutnoj denaturaciji
na 940C slijedilo je 30 ciklusa sastavljenih od: denaturacije od 45 sekundi na
940C, prilijeganja zaetnih nukleotida od 30 sekundi na 530C i produenja
lanca u vremenu od 1 minute na 720C.
Umnoeni dio DNA molekule promatrali smo na 1,5% agaroznom gelu.
Fragmente iz gela oistili smo koristei komplet QIAEX II Gel Extaction Kit
(QIAGEN), prema uputama proizvoaa.

2.3.5.2. Analiza odsjeaka mtDNA molekule sa tehnikom RFLP (Restriction

Fragment Lenght Polymophism)

Na umnoenom dijelu mtDNA, kontrolnoj regiji, provjerili smo

polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaju restrikcijski enzimi.
Upotrijebili smo restrikcijske enzime Alu I i Eco 130 I. Restrikcijska
endonukleaza Alu I cijepa produkte na prepoznatljivoj sekvenci ag/ct, a Eco
130 I na sekvenci c/cttgg. Restrikcijske smjese od 15 l sadravale su :
300 ng PCR produkta
2 l 10 X restrikcijskog pufera
10 U restrikcijskog enzima
Reakcijske smjese stavili smo na inkubaciju od 3 sata pri 370C.

67

2.3.5.3. Sekvencioniranje dijela gena za citokrom b i dijela kontrolne regije

mtDNA molekule

Sekvencioniranje je izvreno na dva odsjeka mtDNA, koja su

prethodno umnoena lananom reakcijom polimeraze: na 5- kraju gena za
citokrom b i na 5- kraju kontrolne regije.
Za sekvencioniranje smo upotrijebili komplet ABI PRISM dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystem).
Sekvencijska reakcija imala je volumen od 15 l, a sastav je imala prema
uputama proizvoaa. Sekvencijska reakcija izvedena je na termostatu
GeneAmp PCR 2400 (PE Applied Biosystem), a imala je 35 ciklusa sa
sljedeim vremensko-temperaturnim profilom: 30 sekundi na 950C, 15
sekundi na 500C i 4 minute na 600C. Nakon sekvencijske reakcije,
neupotrebljene

fluorescentno

oznaene

dideoksinukleotide

zaetne

nukleotide, odstranili smo precipitacijom s natrijevim acetatom. Za analizu

sekvencioniranja upotrebljen je programski paket DNA Sequencing Analysis
Software 3.0.

2.3.5.4. Analiza produkata sekvencioniranja

Populacijska analiza obavljena je na osnovi frekvencijskog rasporeda

haplotipova pomou kompjutorskih programa ClustalX (Thompson i sur.,
1994), Mega (Ver. 2.100), (Kumar i sur. 2001) i ARLEQUIN (Ver. 2.000),
(Schneider i sur., 2000).

68

3. REZULTATI
3.1. MORFOLOKA OBILJEJA MEKOUSNE PASTRVE (S. o.
salonitana)
Vrijednosti morfolokih osobina mekousne pastrve iz rijeke Jadro
prikazane su u tablici 3. Za obraunavanje dobivenih morfometrijskih
vrijednosti upotrebljena je varijaciono-statistika metoda sa sljedeim
elementima: srednja vrijednost i standardna devijacija. Morfoloka obiljeja
prikazali smo kao proporciju s duinom vilice i duinom glave (Jankovi,
1961).

Tablica

3.

Morfometrijska

meristika

obiljeja

mekousne

pastrve

(Salmothymus obtusirostis salonitana) iz rijeke Jadro.

Oznake
proporcija

xsd

obiljeja
a1/a

91,290,93

u/a

69,440,7

m/a

42,410,43

r/a

48,230,47

q/a

27,480,29

t/a

25,190,34

p/a

15,250,13

s/a

12,640,12

n/a

12,040,12

o1/a

14,950,13

o2/a

6,870,07

v/a

12,50,17

x/a

12,640,18

69

z/a

19,640,24

y/a

10,990,12

y1/a

32,980,37

H/a

22.580,33

/a

8,840,08

o0/a

16,760,16

o01/a

17,40,17

a0/a

8,240,09

b/a

21,530,19

f/a

11,260,1

c/a

4,260,01

h/a

8,70,08

i/a

7,140,06

k/a

10,990,06

g/a

6,230,01

ch2/a

19,940,16

ch1/a

12,360,11

/b

41,060,45

a0/b

38,930,46

f/b

52,340,54

c/b

14,980,09

h/b

17,020,43

i/b

33,190,31

k/b

33,930,33

g/b

26,80,06

ch2/b

78,720,11

ch1/b

57,440,59

sp. br.

23,660,57

ll

106,666,65

130

70

12,661,15

90

121

Vert. S.

570

Caud. V.

230

App. pyl.

707

Kod tri analizirana primjerka mekousne pastrve ustanovili smo da su

svi mujaci. Duina tijela analiziranih primjeraka kretala se od 9,9 do 30,6 cm,
a teina tijela od 4,4 do 290 g. Najvea varijabilnost bila je prisutna u broju
pilorikih nastavaka od 63 do 77.

U tablici 4 prikazane su morformetrijske osobina kod mekousne pastrve

solinke iz rijeke Jadro (S. o. salonitana) i mekousne pastrve iz rijeke Neretve
(S. o. oxyrhynchus). Vrijednosti su prikazane u postotcima u osnosu na
duinu glave te duinu tijela, gdje je promatrana duina vilice kako bi se
podatci usporedili sa onima od Jankovi (1961).

Tablica 4: Morfometijske osobine kod dviju podvrsta mekousne pastrve

S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus.

S. o. salonitana

S. o. oxyrhynchus

21-24%

18-24%

Duina gornje vilice u duini glave

8%

36-39%

Duina gornje vilice u duini tijela

5-11%

24-36%

irina gornje vilice u duini tijela

7-8%

2-4%

irina gornje vilice u duini glave

34-36%

11-20%

Duina donje vilice u duini tijela

7-11%

7-15%

Duina donje vilice u duini glave

36-45%

41-64%

Uzduni dijametar oka u duini tijela

4-8%

4-9%

Uzduni dijametar oka u duini glave

18-32%

21-46%

Duina glave u duini tijela

71

Postkaudalno rastojanje glave prema

duini tijela
Postkaudalno rastojanje glave prema
duini glave
Antedorzalno rastojanje glave prema
duini tijela
Osnova leene peraje prema duini tijela
Osnova podrepne peraje prema duini
tijela
Duina prsne peraje prema duini tijela
Duina trbune peraje prema duini tijela
Najvea visina tijela prema duini tijela
Najmanja visina tijela prema duini tijela
Broj bica u perajama
Broj ljuski u bonoj liniji
Broj branhiospina na prvom krnom
luku
Broj kraljeaka
Broj kaudalnih kraljeaka

11-12%

8-16%

50-52%

43-66%

40-42%

38-49%

11-12%

9-14%

5-14%

5-9%

15-17%

15-20%

13%

12-15%

21-23%

18-24%

9%

7-10%

D III-10 P I-12(14) V I-8

D IV-12(10) P I-12 V II-8

A II(I)-10(11)

A IV-9

101-104

102-123

23-24

16-31

57

53-70

22-23

21-34

U tablici 5 prikazane su morfometijske osobine mekousne pastrve iz rijeke

Jadro (S. o. salonitana), potone pastrve (Salmo trutta) (Mari, 2002) i
enemskog salmonida iz Turske Platysalmo platycephalus (Behnke, 1968).
Morfometijske osobine su promatrane kao proporcije sa duinom glave i sa
totalnom duinom tijela.

72

Tablica 5: Morfometijske osobine kod mekousne pastrve (S. o.

salonitana), potone pastrve (Salmo trutta) i Platysalmo platycephalus.

Udio

standardne

duine

prema duini tijela

Duina

gornje

vilice

totalnoj duini tijela

Duina gornje vilice prema
duini glave
Duina donje vilice prema
totalnoj duini
Najvea visina tijela

Platysalmo

S. o. salonitana

Salmo trutta

86,910,09

89,460,95

83,830,93

8,280,08

11,150,15

11,110,11

17,020,34

7,980,05

platycephalus

46,710,32

11,580,16

21,50,23

20,930,23

14,520,13

15,70,05

12,030,12

12,480,03

11,460,12

11,290,19

11,90,17

8,720,13

20,490,19

23,780,34

23,660,57

23,330,57

106,666,65

109,660,57

17,331,52

17,660,57

172,64

28,330,57

Broj kaudalnih kraljeaka

57

581

Broj pilorikih nastavaka

57

15,660,5

Duina prsne peraje prema

totalnoj duni tijela
Duina trbune peraje prema
totalnoj duni tijela
Duina lene peraje prema
totalnoj duni tijela
Duina

osnove

podrepne

peraje prema totalnoj duni

tijela
Duina glave prema totalnoj
duini tijela
Broj branhiospina na prvom
krnom luku
Broj ljuski u bonoj liniji
Broj redova ljuski od bone
linije do trbue peraje
Broj redova ljuski od bone
linije do lene peraje

73

3.2. ANALIZA PREHRANE MEKOUSNE PASTRVE (S. o.

salonitana)
Analizu prehrane izvrili smo na tri primjerka mekousne pastrve iz
rijeke Jadro od kojih su dva naena uginula u donjem toku rijeke, a jedan je
uginuo prilikom uzorkovanja. Vizualno smo utvrdili da se radi o praznom
probavilu kod sva tri primjerka, no unato tome, sadraj probavila je izdvojen
u epruvetu sa alkoholom, i promatran stereomikroskopom. Analizom
eluanog i crijevnog sadraja ustanovili smo da sva tri primjerka imaju
potpuno prazno probavilo.

74

3.3. ANALIZA MITOHONDRIJSKE DNA

3.3.1. Analiza kontrolne regije mtDNA s tehnikom RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymophism)

Stupanj polimorfizma priblino 1200 bp dugog dijela mitohondrijske

DNA koji obuhvaa kontrolnu regiju, prouili smo koritenjem tehnike RFLP.
Izabrane uzorke analizirali smo sa restrikcijskim enzimom Alu I koji je
omoguio nastajanje polimorfnih restrikcijskih fragmenata, te na taj nain
prvotno razlikovanje populacija mekousne i potone pastrve. Uzorkovanje
smo proveli na 7 uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Neretve, 7 uzoraka
mekousne pastrve iz rijeke Jadro, 6 uzoraka mekousne pastrve iz rijeke
rnovnice, 5 uzoraka potone pastrve iz rijeke Krke i 5 uzoraka potone
pastrve iz rijeke Zrmanje.
Restrikcijski enzim Alu I rezao je uzorke iz populacije mekousne
pastrve iz rijeke Neretve na tri mjesta, stvarajui pri tome etiri odsjeka duga
464, 252, 129 i 37 bp, dok je populacije potone pastrve iz rijeka Krke i
Zrmanje (Jadranska linija), te mekousne pastrve iz rijeka Jadro i rnovnice,
rezao na dva mjesta, stvarajui odsjeke duine 563, 464 i 37 bp (Slika 18).

Slika 18: Restrikcija kontrolne regije mtDNA sa restrikcijskim enzimom Alu I,

uzorak 1 - mekousna pastrva iz rijeke Jadro, 2 mekousna pastrva iz rijeke
rnovnice, 3 potona pastrva iz rijeke Krke, 4 potona pastrva iz rijeke
Zrmanje, 5 mekousna pastrva iz rijeke Neretve, 6 - 100 kb DNA ladder,
Gibco BRL.

75

3.3.2. Analiza sekvencioniranja mitohondrijalne DNA

3.3.2.1. Sekvencioniranje dijela kontrolne regije

Sekvencioniranje kontrolne regije smo napravili na 12 uzoraka

mekousne pastrve iz rijeke rnovnice (ZRN) i 3 iz Jadra (ZRN), na 1 uzorku
potone pastrve iz rijeke Krke (Krka) i na 2 uzorka potone pastrve iz rijeke
Zrmanje (ZRM1 i ZRM2AD4). Sekvencionirana kontrolna regija kod populacija
mekousne pastrve iz rijeka Jadra i rnovnice bila je jednaka. Na 540 bp
dugom odsjeku pronali smo 1 varijabilno mjesto na osnovu kojeg smo
populaciji mekousne pastrve iz rnovnice pripisali novi haplotip, koji smo
nazvali ZRN. Na osnovi polimorfnog mjesta u kontrolnoj regiji mtDNA pronali
smo novi restrikcijski enzim pomou kojeg moemo razlikovati populaciju
mekousne pastrve iz rnovnice i Jadra (S. o. salonitana) od ostalih populacija.
Analizirane uzorke usporedili smo s populacijama ije se sekvence
nalaze u Gen banci (Tablica 6). Kod potone pastrve iz rijeke Zrmanje uoili
smo ranije prikazan haplotip Ad4, kojega smo prikazali kao ZRM2AD4.
Na osnovu polimorfizma uoenog pri sekvencioniranju odredili smo
restrikcijski enzim Eco 130 I s kojim specifino odreujemo haplotip
mekousne pastrve "solinke". Uzorci mekousne pastrve iz rijeka Jadro i
rnovnice imali su jednak, novi haplotip. Uzorke smo izrezali s restrikcijskim
enzimom te smo jo jednom potvrdili njihovu razliitost od ostalih uzoraka.

Slika 19: Restrikcija kontrolne regije mtDNA restrikcijskim enzimom Eco 130 I.
Linije 1 su uzorci mekousne pastrve iz rijeke Jadro, linije 2 su uzorci
mekousne pastrve iz rijeke rnovnice, linije 3 su uzorci potone pastrve iz
rijeke Krke, linije 4 su uzorci potone pastrve iz rijeke Zrmanje, linije 5 su
uzorci mekousne pastrve iz rijeke Neretve i linije pod brojem 6 su fragmenti
DNA poznatih veliina (1 kb DNA ladder, Gibco BRL).

76

Tablica 6: Imena vrsta te pristupni brojevi u Gen banci za kontrolnu regiju

mtDNA i gen za citokrom b.

Vrsta/populacija

Kontrolna regija mtDNA

Gen za citokrom b

Broj u Gen banci

Acantholingua ohridana

AF488536

AAF25872

U12143

X76253

AF488535

AF488534

Dunavska (Da1)

AY260524S1

X7625

Dunavska (Da2)

AY185570

Dunavska (Dal1)

AY185569

Mediteranska (Me1)

AF2347

(Bell)
Salmo salar
Salmothymus
obtusirostris (soxy)
Salmo trutta

Mediteranska (Me2)

STMTCTB1
STU63890

Atlantska (At)

AF498757

X76254

Jadranska (Ad1)

AF498756

X76251

Jadranska (Ad3)

AY260518S1

STMTCYB4

Jadranska (Ad4)

AY260520

Salmo marmoratus (Ma) AF498755

X76251

77

Slika 20: Nukleotidna sekvenca 412 bp dugog segmenta kontrolne regije

mtDNA. Polimorfna mjesta su obojena crvenom bojom i oznaena brojem.
1
ZRMl
ZRM2AD4
Krka
RN
Soxy

TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC
TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC
TTTTTCAGCTATGTACAATAACAATTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC
TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC
TTTTTCAGCTATGTACAATAACAACTGTTGTACCTTGCTAACCCAATGTTATACTACATC
************************ ***********************************

ZRMl
ZRM2AD4
Krka
RN
Soxy

2
3
TATGTATAATATTACATACTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT
TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT
TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT
TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATAGCATG-TGAGTAGT
TATGTATAATATTACATATTATGTATTTACCCATATATATAATATGGCATG-TGAGTAGT
****************** ************************** **************

ZRMl
ZRM2AD4
Krka
RN
Soxy

4
ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA
ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA
ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA
ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACCCAA
ACATCATATGTATTATCAACATTAGTGAATTTAACCCCTCATACATCAGCACTAACTCAA
********************************************************.***

ZRMl
ZRM2AD4
Krka
RN
Soxy

GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT
GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT
GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT
GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT
GGTTTACATAAAGCAAAACACGTGATAATAACCAACTAAGTTGTCTTAACCCGATTAATT
************************************************************

ZRMl
ZRM2AD4
Krka
RN
Soxy

5
6 7 8
GTTATATCAATAAAACTCCACCCAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA
GTTATATCAATAAAACTCCACCCAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA
GTTATATCAATAAAACTCCACCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA
GTTATATCAATAAAACTCCATCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA
GTTATATCAATAAACCTCGAGCTAACACGGGCTCCGTCTTTACCCACCAACT-TTCAGCA
************** *** * * *************************************

ZRMl
ZRM2AD4
Krka
RN
Soxy

9
TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT
TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT
TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT
TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATATATCAGTAGGCATACTCTTATT
TCAGTCCTGCTTAATGTAGTAAGAACCGACCAACGATTTATCAGTAGGCATACTCTTATT
************************************* **********************

ZRMl
ZRM2AD4
Krka
RN
Soxy

10 11 12 13
GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG
GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG
GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG
GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTAGGTCGCATCTCGTGAACTATTCCTGG
GATGGTCAGGGACAGATATCGTATTA-GCTGCATCTAGTGAACTATTCCTGG
************************** * ****** ***************

78

Tablica 7: Polimorfna mjesta na 5' kraju kontrolne regije mtDNA, koja se odnose na
sekvencionirane uzorke. Brojevi oznaavaju mjesta u nukleotidnoj sekvenci koja se
odnose na Sliku 20, sa crvenom bojom su oznaene transverzije.
varijabilna mjesta

ZRM1

10

11

12

13

ZRM2AD4
Krka

T
T

ZRN

Soxy

T
C
G

Odnos izmeu tranzicija i transverzija u kontrolnoj regiji kod haplotipova

mekousne pastrve iz Jadra, potone pastrve iz Krke i Zrmanje je 4:2. Dok je taj
odnos kod mekousne pastrve iz Neretve 7:5. Srodni odnos izmeu pojedinih
haploptipova odreivali smo na osnovu usporedbi haplotipova prema Kimura
dvoparametarskog modela gdje je odnos tranzicija/transverzija jednak 2. Vrijednosti
udaljenosti haplotipova su se kretale od 1,6 do 2,5 (prosjeno 0,016 % 0,0083).
Vrijednosti udaljenosti haplotipova, te broj polimorfnih mjesta izmeu njih, prikazani
su u Tablici 8.
Tablica 8: Vrijednosti razlika izmeu haplotipova u postotcima, te broj polimorfnih
mjesta izmeu njih u kontrolnoj regiji mtDNA.
haplotip

Da1

Da1
Da2

0,2

Dall

0,2

Da2

Dall

soxy

Bell

At1

ZRM1

ZRM2AD4

Ad3

Ad1

Krka

Ma1

ZRN

Me1

S.salar

10

27

12

28

10

26

10

12

13

10

10

10

11

10

30

28

27

29

29

28

27

27

28

26

0,5

soxy

2,7

3,0

3,0

Bell

1,7

2,0

1,5

1,7

At1

1,2

1,5

1,5

1,7

1,5

ZRM1

1,7

2,0

2,0

2,5

1,7

1,7

ZRM2AD4

1,5

1,7

1,7

2,2

1,5

1,5

0,2

Ad3

1,5

1,7

1,7

2,2

1,5

1,5

0,7

0,5

Ad1

1,2

1,5

1,5

2,0

1,2

1,2

0,5

0,2

0,2

Krka

1,2

1,5

1,5

2,2

1,0

1,0

0,7

0,5

0,5

0,2

Ma1

1,2

1,5

1,5

2,0

1,2

1,2

0,7

0,5

0,5

0,2

0,5

ZRN

1,5

1,7

1,7

2,2

1,5

1,5

1,0

0,7

0,7

0,5

0,7

0,5

Me1

1,7

2,0

2,0

2,0

1,7

1,7

1,5

1,2

1,2

1,0

1,2

1,0

1,2

S. salar

6,7

7,0

6,4

7,2

6,4

7,0

7,2

7,0

7,0

6,7

6,7

6,4

6,4

30
7,5

79

Kod analiziranih uzoraka na 412 bp dugom odsjeku nali smo 33 polimorfna

mjesta, na osnovu kojih smo razluili razliite haplotipove. Uoen je nov
haplotip kod mekousne pastrve iz rijeke Jadro, s mutacijom na mjestu 17,
specifinoj za taj haplotip (Slika 21).

2
ATGTACAATA

3 4
5
ACAACTGTTG

6
7
TACCTTGCTA

8
ACCCAATGTT

ATACTACATC

60

9
10
TATGTATAAT ATTACATATT

ATGTATTTAC

CCATATATAT

11
AATATAGCAT

12
G-TGAGTAGT

120

13
ACATCATATG

TATTATCAAC

14 15 16
ATTAGTGAAT

TTAACCCCTC

ATACATCAGC

17
ACTAACCCAA

180

GGTTTACATA

18
AAGCAAAACA

CGTGATAATA

ACCAACTAAG

19
TTGTCTTAAC

20
CCGATTAATT

240

21
GTTATATCAA

22
23 24
TAAAACTCCA TCTAACACGG

GCTCCGTCTT

TACCCACCAA

25 26
CT-TTCAGCA

300

TTTTTCAGCT

27
28
TCAGTCCTGC TTAATGTAGT

AAGAACCGAC

29
CAACGATATA

30
TCAGTAGGCA

TACTCTTATT

360

GATGGTCAGG

31 32
33
GTATTAGGTC GCATCTCGTG

34
AACTATTCCT

GG

412

GACAGATATC

Slika 21: Nukleotidna sekvenca 412 bp dugog fragmenta kontrolne regije

mtDNA mekousne pastrve iz rijeke Jadro. Polimorfna mjesta su obojena
crvenom bojom i oznaena brojem. Novo polimorfno mjesto prema kojemu
opisujemo novi haplotip je podcrtan i oznaen zvjezdicom. Mjesto koje ree
restrikcijski enzim Eco 130I oznaeno je plavom bojom.

Srodne odnose izmeu haplotipova prikazali smo u obliku filogenetskih

stabala. Prvo drvo napravljeno je po metodi "Neighbour-Joining" (NJ). Metoda
izrade

filogenetskog

drva

"Neighbour-Joining"

(NJ)

temelji

se

na

udaljenostima (Slika 22). Ova metoda predstavlja pojednostavljenu metodu

"Minimum evolution". Filogenetska drva napravili smo i pomou metoda
"Minimum evolution" (ME) i s "Maximum parisimony" (MP), koja se temelji na
nukleotidnim mjestima. Meutim, dobivena filogenetska drva se nisu bitno
razlikovala.

80

ZRMl

70

ZRM2AD4

53

Ad3
49

Adl
39

Krka
Ma1

40

ZRN

20
16

Me1
Soxy

30

Atl

31

bell
Dall
84
77

Dal
Da2
S.salar

0.005

Slika 22: Srodni odnosi izmeu haplotipova ukljuenih u istraivanje prema

kontrolnoj regiji mtDNA, filogenetsko drvo je prikazano s "Neighbour-Joining"
(NJ) metodom (program MEGA). Brojevi uz grananja predstavljaju postotne
vrijednosti grananja od 10 000 ponavljanja.

Pri usporedbi odnosa tranzicija i transverzija mekousne pastrve iz Neretve

(Soxy) i ostalih, uoavamo nepravilnost tog odnosa. Uz nizak bootstrap od 31.
Kontrolna regija je informativna pri odnosima unutar vrsta i niih taksonomskih
jedinica (npr. unutar roda Salmo), no pri unoenju viih taksomonsih jednica
dolazi do nepravilnosti koje se uoavaju na filogenetskom stablu (poloaj
Soxy).

3.3.2.2. Sekvencioniranje dijela gena za citokrom b

Radi moguih povratnih mutacija u podruju kontrolne regije mtDNA

kod mekousne pastrve iz Neretve, odnose izmeu istraivanih haplotipova
istraili smo i na osnovu sekvencioniranja gena za citokrom b. Sekvencirali
smo i 276 bp dug segment gena za citokrom b kod jednog uzorka mekousne
pastrve iz rijeke Jadro (ZRN) i kod jednog uzorka mekousne pastrve iz rijeke
Neretve (soxy), te smo ih usporedili sa sekvencama iz genske banke (Tablica
6).

81

Slika 23: Nukleotidna sekvenca 276 bp dugog segmenta gena za citokrom b.

Polimorfna mjesta su obojena crvenom bojom i oznaena brojem.
Soxy
zrn
Ad1

1
2
3
CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTGTGTTTAGCCACCCAAATTCTTACCGGGCTCTTCCTAGC
CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTGTGTCTAGCCACCCAAATTCTTACCGGACTCTTCCTAGC
CTTTGGCTCACTCTTAGGCTTATGTCTAGCCACCCAAATTCTTACCGGACTCTTCCTAGC
********************* *** ********************** ***********

Soxy
zrn
Ad1

4
5
CATACACTACACCTCCGACATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTCTGCCACATTTGCCGAGA
CATACACTACACCTCCGATATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTTTGCCACATTTGCCGAGA
CATACACTACACCTCCGATATCTCAACAGCCTTTTCCTCTGTTTGCCACATTTGCCGAGA
****************** *********************** *****************

Soxy
zrn
Ad1

6
TGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT
CGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT
CGTTAGCTACGGCTGACTCATCCGAAACATTCACGCTAACGGAGCATCTTTCTTCTTTAT
***********************************************************

Soxy
zrn
Ad1

CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC
CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC
CTGTATTTATATACATATCGCCCGAGGACTCTACTATGGTTCCTACCTATATAAAGAAAC
************************************************************
7
8
CTGAAACATCGGAGTCGTACTACTACTTCTCACTAT
CTGAAATATCGGAGTCGTACTGCTACTTCTCACTAT
CTGAAATATCGGAGTCGTACTGCTACTTCTCACTAT
****** ************** **************

Soxy
zrn
Ad1

Tablica 9: Polimorfna mjesta na genu za citokrom b mtDNA. Brojevi

oznaavaju mjesta u nukleotidnoj sekvenci koja se odnose na Sliku 23.
varijabilna mjesta

Soxy

ZRN
Ad1

Odnos izmeu tranzicija i transverzija u sekvenci gena za citokrom b je

5:0 izmeu haplotipova mekousne pastrve iz Jadra, Neretve i potone pastrve
iz Krke i Zrmanje. Srodni odnos izmeu pojedinih haploptipova odreivali smo
na osnovi usporedbi haplotipova prema Kimura dvoparametarskog modela
gdje je odnos tranzicija/transverzija jednak 2. Vrijednosti udaljenosti
haplotipova su se kretale od 0,4 do 3,4 (prosjeno 0,018 % 0,0012).
Vrijednosti udaljenosti haplotipova, te broj polimorfnih mjesta izmeu njih,
prikazani su u tablici 10.

82

Tablica 10: Vrijednosti razlika izmeu haplotipova u postotcima, te broj

polimorfnih mjesta izmeu njih u genu za citokrom b mtDNA.

Soxy

Bel

Da1,

Da

ZRN

Me2

Me1

Ad34Ma

Ad1

At

Ssa

17

11

11

10

11

10

10

19

15

15

14

13

14

13

13

Da2
Soxy

Bel

0,7

Da1,Da2

3,4

4,1

Da

3,4

4,1

0,0

ZRN

2,6

3,4

0,7

0,7

Me2

3,0

3,7

1,1

1,1

0,4

Me1

3,4

4,1

1,5

1,5

0,7

0,4

Ad34Ma

3,0

3,7

1,1

1,1

0,4

0,7

1,1

Ad1

3,0

3,7

1,1

1,1

0,4

0,7

1,1

0,0

At

2,6

3,4

1,5

1,5

0,7

1,1

1,5

0,4

0,4

Ssa

6,5

7,3

6,1

6,1

5,7

5,3

5,7

5,3

5,3

12
4,9

Kod analiziranih uzoraka na 276 bp dugom odsjeku nali smo 23

polimorfna mjesta, na osnovu kojih smo razluili razliite haplotipove. Haplotip
mekousne pastrve iz rijeke rnovnice prikazali smo na Slici 24.

1
CTTTGGCTCA

2
CTCTTAGGCT

3
4
TGTGTCTAGC

5
CACCCAAATT

6
CTTACCGGAC

TCTTCCTAGC

60

7
8
9
CATACACTAC ACCTCCGATA

10
11
TCTCAACAGC CTTTTCCTCT

12
GTTTGCCACA

TTTGCCGAGA

120

13
14
15
CGTTAGCTAC GGCTGACTCA

16
TCCGAAACAT

TCACGCTAAC

GGAGCATCTT

TCTTCTTTAT

180

CTGTATTTAT

17
ATACATATCG

CCCGAGGACT

18 19
CTACTATGGT

20
TCCTACCTAT

ATAAAGAAAC

240

21
CTGAAATATC

22
GGAGTCGTAC

23
TGCTACTTCT

CACTAT

276

Slika 24: Nukleotidna sekvenca 276 bp dugog fragmenta gena za citokrom b

mekousne pastrve iz rijeke Jadro. Polimorfna mjesta su obojena crvenom
bojom i oznaena brojem.

83

89 Da1, Da2
41
48

Da
zrn
Me2

45

73

Me1

Ad34Ma

53

56 Ad1

At
Soxy
Bel

99

Ssa
0.005

Slika 25: Srodni odnosi izmeu haplotipova ukljuenih u istraivanje prema

genu za citokrom b, filogenetsko drvo je prikazano sa "Neighbour-Joining"
(NJ) metodom (program MEGA).

3.3.2.3. Zajednika analiza kontrolne regije mtDNA i gena za citokrom b

Sekvence kontrolne regije i gena za citokrom b mtDNA analizirali smo

zajedno. Nakon analize "Neighbour-Joining" (NJ) metodom dobili smo
filogenetsko drvo (program MEGA) (Slika 26).
ZRM1

68

ZRM2AD4

73

ad3
80

Ad1
44
59

Ma1
zRN

52

Me1
Da1

70
99

Da2

At1
Soxy
98

bel1
Salmo

0.005

Slika 26: Srodni odnosi izmeu haplotipova ukljuenih u istraivanje prema

kontrolnoj regiji mtDNA i genu za citokrom b. Filogenetsko drvo je prikazano
sa "Neighbour-Joining" (NJ) metodom (program MEGA).

84

Filogenetsko drvo dobiveno spajanjem sekvenci kontrolne regije i gena

za citokrom b prikazuje slian genetiki odnos s onim koji je dobiven prema
sekvenci kontrolne regije. Kod obje analize zasebno, pa tako i kod njihova
udruivanja, vidljivo je da potona pastrva iz Zrmanje (ZRM1 i ZRM2) ulazi s
ranije istraenim haplotipovima (Ad1 i Ad3) u jadransku liniju pastrva.
Mekousna pastrva iz rnovnice S. o. salonitana (ZRN) je znatno blia
potonoj, nego mekousnoj pastrvi iz rijeke Neretve (Soxy). Prema kontrolnoj
regiji mekousna pastrva iz rnovnice ini poseban ogranak izmeu potonih
pastrva, a prema citokormu b ona ulazi isti ogranak sa potonim pastrvama
dunavske linije (Da1, Da2, Da). Udruivanjem obaju istraivanih sekvenci
solinka (ZRN), zauzima poseban ogranak unutar filogenetskih linija potone
pastrve. Istom analizom mekousna pastrva iz Neretve ulazi u ogranak sa
belvicom Acantholingua ohridana (bel), dok je posve suprotan sluaj kada
njeno mjesto promatramo samo analizom kontrolne regije. Pri analizi
kontrolne regije u populaciji mekousne pastrve iz Neretve odnos izmeu
tranzicija i transverzija odstupao je od uobiajnih, zabiljeen je povean broj
transverzija, stoga analizu te regije na smatramo informativnom pri
istraivanjima izmeu rodova. Za odnose izmeu rodova informativniji prikaz
u filogenetskom stablu daje kombinacija sekvenci kontrolne regije i gena za
citokrom b.

85

3.4. ANALIZA MIKROSATELITSKE DNA

3.4.1. Odreivanje veliine mikrosatelita na ABI PRISMTM 310
Pomou automatskog sekvencera ABI PRISMTM 310 automatski smo
odredili veliinu alela mikrosatelitskih lokusa.

Slika 27: Alelni polimorfizam na lokusima BFRO 001, Str 591 INRA, Strutta 58
i OmyFgt1TUF.
Plavi vrhovi prikazuju alele karakteristine za lokus BFRO 001, zeleni vrhovi
prikazuju alele karakteristine za lokus Str 591 INRA, crni vrhovi prikazuju
alele karakteristine za lokuse Strutta58 i OmyFgt1TUF kod jedinki iz rijeke
Jadro (J15) i rijeke Krke (K8), dok crveni vrhovi prikazuju fragmente DNA
poznate veliine (Tamra 350, Perkin Elmer).

86

3.4.2. Statistika analiza mikrosatelitskih podataka

Kompjutorski program GENETIX (Belkhir i sur. 1998) koriten je pri
statistikoj analizi mikrosatelitskih podataka. Kompjutorski program Fstat
(Goudet, 1995) koriten je za izraunavanje faktora "bogatstva alela", (engl.
allelic richness).

U ovom istraivanju prouili smo 9 mikrosatelitskih lokusa. Alele koje

smo uoili kod prouavanih populacija naveli smo u prilogu 1. U istraivanim
populacijama na lokusu BFRO 001 ima 12 razliitih alela, na lokusu BFRO002
ima 8 razliitih alela, na lokusu Ssa197 ima 18 razliitih alela, na lokusu
Strutta58 ima 17 razliitih alela, na lokusu Str591INRA ima 8 razliitih alela,
na lokusu Strutta24 ima 15 razliitih alela, na lokusu OmyFgt1TUF ima 7
razliitih alela, na lokusu SsoSL438 ima 14 razliitih alela i na lokusu StMSLDH4 ima 7 razliitih alela.

Tablica 11: Proueni lokusi, aleli i njihova prisutnost kod prouavanih

populacija.

Jadro

rnovnica

Neretva

Krka

Zrmanja

mekousna

mekousna

mekousna

potona

potona

198

0,9211

1,00

202

0,0526

206

1,00

214

0,0263

0,0455

222

0,3182

226

0,3000

230

0,2000

238

0,0909

242

0,3636

0,3000

244

0,0455

246

0,1364

256

0,1000

258

0,1000

BFRO001

87

Broj alela

1,307

1,000

1,000

2,848

3,133

H exp.

0,1482

0,7355

0,7600

H n. b.

0,1522

0,7706

0,8444

H obs.

0,1579

0,8182

0,8000

Fis

-0,0429

-0,0381

-0,0488

-0,0155

-0,0627

116

1,0000

1,0000

125

0,0588

131

0,2143

133

0,2143

135

0,4286

137

0,1429

140

0,8824

1,0000

145

0,0588

Broj alela

1.449

1,000

2,776

1,000

1,000

H exp.

0,2145

0,7041

H n. b.

0,2210

0,7582

H obs.

0,1176

0,4286

Fis

0,43284

0,45950

0,48289

0,45223

0,44823

132

0,526

0,2917

136

0,0833

137

0,2000

141

0,3947

0,4211

145

0,5263

0,5789

0,0714

150

0,0417

154

0,3750

155

0,0714

0,0417

158

0,0417

159

0,0714

0,3000

163

0,3000

167

0,1000

171

0,0714

0,1000

175

0,2857

179

0,2857

Faktor
bogatstva alela

BFRO002

Faktor
bogatstva alela

Ssa197

88

183

0,1429

211

0,0833

215

0,0417

Broj alela

2.146

1,876

3,229

2,937

3,133

H exp.

0,5637

0,4875

0,7959

0,7535

0,7600

H n. b.

0,5789

0,5007

0,8571

0,7862

0,8444

H obs.

0,6316

0,5263

1,0000

0,9167

1,0000

Fis

-0,14494

-0,15451

-0,12098

-0,11774

-0,12084

102

0,0263

172

0,0714

176

0,6429

178

0,2143

180

0,0833

192

0,0263

196

0,0714

200

0,7500

202

0,8684

0,9474

206

0,0789

0,0526

0,0417

208

0,0417

212

0,1250

214

0,1667

0,2500

218

0,0417

220

0,0833

222

0,0417

224

0,3750

Broj alela

1.501

1,202

2,237

3,142

1,786

H exp.

0,2382

0,0997

0,5306

0,7951

0,3750

H n. b.

0,2447

0,1024

0,5714

0,8297

0,4286

H obs.

0,1579

0,1053

0,2857

0,5833

0,5000

Fis

0,26633

0,31957

0,23496

0,26648

0,32150

91

0,1667

93

0,7500

95

0,0833

Faktor
bogatstva alela

Strutta24

Faktor
bogatstva alela

Strutta58

89

104

0,1364

145

0,0455

146

0,0455

147

0,9474

1,0000

150

0,0455

151

0,0263

158

0,1364

165

0,0455

166

0,3636

168

0,0455

170

0,0909

175

0,0263

0,0455

181

0,5000

187

0,5000

Broj alela

10

1.211

1,000

1,909

3,232

2,000

H exp.

0,1011

0,4028

0,8099

0,5000

H n. b.

0,1038

0,4394

0,8485

0,6667

H obs.

0,1053

0,3333

0,9091

Fis

0,08186

0,07281

0,02647

0,29274

-0,01916

149

0,0556

0,0417

159

0,1429

0,6250

169

0,0278

171

0,7778

0,8889

0,7857

0,0833

173

0,1389

0,1111

0,0714

183

0,2083

189

1,0000

193

0,0417

Broj alela

1.788

1,390

1,791

2,268

1,000

H exp.

0,3719

0,1975

0,3571

0,5556

H n. b.

0,3825

0,2032

0,3846

0,5797

H obs.

0,4444

0,2222

0,4286

0,5833

Fis

-0,05069

-0,08543

-0,08434

-0,13402

-0,09579

Faktor
bogatstva alela

Str591INRA

Faktor
bogatstva alela

OmyFgt1TUF
204

90

206

1,0000

1,0000

1,0000

0,1250

218

226

0,2500

241

0,6000

245

0,4000

246

0,1250

Broj alela

1.000

1,000

1,000

2,590

1,924

H exp.

0,6563

0,4800

H n. b.

0,7000

0,5333

H obs.

0,2500

0,4000

Fis

0,51892

0,52009

0,50868

0,20863

0,64360

96

0,0455

98

0,0455

104

0,1818

0,1,0000

106

0,5000

109

0,0333

110

0,0909

111

0,0333

0,4000

0,0833

114

0,1364

115

0,1667

116

0,2500

117

0,0833

118

0,0833

120

0,3333

123

0,6667

0,3667

125

0,2667

0,2333

Broj alela

1.992

2,424

3,180

2,780

1,000

H exp.

0,4822

0,6511

0,7778

0,6860

H n. b.

0,4989

0,6736

0,8485

0,7186

H obs.

0,3333

0,6000

1,0000

0,9091

Fis

-0,08095

-0,02291

0,06761

0,12770

0,01749

1.992

2,424

3,180

2,780

1,000

Faktor
bogatstva alela

SsoSL438

Faktor
bogatstva alela

Faktor
bogatstva alela

StMSLDH4

91

237

0,9375

1,0000

0,5833

245

0,4167

247

0,1250

0,6000

253

0,5833

264

0,0417

265

0,2500

0,4000

276

0,0625

Broj alela

1.238

1,000

1,919

2,296

1,924

H exp.

0,1172

0,4861

0,5799

0,4800

H n. b.

0,1210

0,5303

0,6051

0,5333

H obs.

0,1250

0,5000

0,7500

0,8000

Fis

-0,25737

-0,22129

-0,29933

-0,20838

-0,15343

0,2486

0,1595

0,4505

0,6191

0,3728

0,2295

0,16454

0,4877

0,6487

0,4279

0,2303

0,1615

0,4418

0,6355

0,3889

0,10296

0,01846

0,10118

0,02296

0,15493

1,5

3,4

5,8

2,3

Faktor
bogatstva alela

Ukupna H
exp.
Ukupna H n.
b.
Ukupna H
obs.
Ukupna F is
Prosjean br.
alela po
populaciji

H exp. oekivana heterozigotnost

H n.b. oekivana heterozigotnost prilagoena za manje populacije
H obs. uoena heterozigonost
Udio prouavanih alela po populacijama prikazali smo i grafiki (Grafovi
1 do 9).
Na mikrosatelitskom lokusu BFRO001 ima 12 razliitih alela (Graf 1).
Alel 198 karakteristian je za populacije mekousne pastrve u Jadru i
rnovnici. Jedino kod uzorka J13 nalazi se alel 214 koji je znaajan za
potonu pastrvu u Krki, a kod uzoraka J15 i J17 nalazimo alel 202. Aleli 214,
222, 238, 242, 244 i 246 znaajni su za populaciju potone pastrve u Krki, a
aleli 226, 230 i 242 su znaajni za populaciju potone pastrve u Zrmanji. Alel
206 znaajan je za mekousnu pastrvu u Neretvi. Kod mekousne pastrve se ne
pojavljuju aleli dui od 212.

92

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona

25
8

24
6

24
2

23
0

22
2

21
2

Neretva mekousna

20
2

19
8

udio u populaciji

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

veliina alela

Graf 1: Alelni polimorfizam na lokusu BFRO001

Na lokus BFRO002 ima 8 razliitih alela (Graf 2), od kojih su

prevladavali aleli 116 i 142. Alel 140 znaajan je za populaciju mekousne
pastrve u rnovnici i Jadru, gdje se osim tog alela nalaze i aleli 125 (uzorci
J13 i J17) i 145. Za potone pastrve u Zrmanji i Krki znaajan je alel 116. Za

udio u populaciji

mekousnu pastrvu u Neretvi znaajni su aleli 131, 133, 135 i 137.

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona
Neretva mekousna

116

125

131

133

135

137

140

145

veliina alela

Graf 2: Alelni polimorfizam na lokusu BFRO002

93

Na lokusu Ssa197 ima 18 razliitih alela (Graf 3). Za populacije

mekousne pastrve u rijekama Jadru i rnovnici znaajni su aleli 141 i 145.
Kod uzoraka J15 i J17 u Jadru naili smo na alel 132, koji je znaajan za
potonu pastrvu u Krki. Za potonu pastrvu u rijeci Krki znaajni su jo aleli
137, 154, 159, 183, 211 i 215, a za potonu pastrvu u rijeci Zrmanji aleli 137,
159, 163, 167 i 171. Aleli 175 i 179 karakteristini su za mekousnu pastrvu u
rijeci Neretvi.

udio u populaciji

0,6
0,5
Jadro mekousna

0,4

rnovnica mekousna

0,3

Krka potona
Zrmanja potona

0,2

Neretva mekousna

0,1
215

183

175

167

159

156

154

145

137

132

0
veliina alela

Graf 3: Alelni polimorfizam na lokusu Ssa197

Na lokusu Strutta24 otkrili smo 15 razliitih alela (Graf 4). Alel 202
znaajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i rnovnici. Kod tri
uzorka u rijeci Jadro pojavili su se aleli 192 (J15) i 206 (J12, J15 i J17). Kod
populacije potone pastrve u rijeci Krki, lokus Strutta24 pokazao se vrlo
varijabilnim, s veim brojem razliitih alela (180, 206, 208, 212. 214, 218,
220), a s neto veim postotkom bio je prisutan alel 224). U populaciji potone
pastrve u Zrmanji, znaajni su aleli 200 i 214, dok su za mekousnu pastrvu u
Neretvi, karakteristini aleli 172, 178, 180 i 196.

94

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona

22
2

21
8

21
2

20
6

20
0

19
2

Neretva mekousna

17
8

17
2

udio u populaciji

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

veliina alela

Graf 4: Alelni polimorfizam na lokusu Strutta24

Na lokusu Strutta58 otkrili smo 17 razliitih alela (Graf 5). Alel 147
znaajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru i rnovnici. Aleli 151
(J15) i 175 (J17) su se pojavili u dva uzorka u rijeci Jadro. Kod populacije
potone pastrve u rijeci Krki lokus Strutta58 pokazao se vrlo varijabilnim, s
veim brojem razliitih alela: 104, 147, 158, 166, 168 i 170. U populaciji
potone pastrve u Zrmanji znaajni su aleli 181 i 187, dok su za mekousnu

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona

18
1

17
0

16
6

15
8

15
0

14
5

Neretva mekousna

95

91

udio u populaciji

pastrvu u Neretvi karakteristini aleli 91, 93 i 95.

veliina alela

Graf 5: Alelni polimorfizam na lokusu Strutta58

95

Na lokusu Str591INRA otkrili smo 8 razliitih alela (Graf 6). Alel 171
znaajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru, rnovnici te u Neretvi,
gdje se uz njega pojavljuju i aleli 190 i 173. Alel 149 se pojavio u dva uzorka
kod mekousne pastrve u rijeci Jadro (J13 i J15). Za potonu pastrvu u Krki

udio u populaciji

znaajni su aleli 149, 171, 183 i 193, a za potonu pastrvu u Zrmanji alel 189.
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona
Neretva mekousna

149

159

169

171

173

183

189

193

veliina alela

Graf 6: Alelni polimorfizam na lokusu Str591INRA

Na lokusu OmyFgt1TUF otkrili smo 7 razliitih alela (Graf 7). Alel 206
znaajan je za populacije mekousne pastrve u Jadru, rnovnici te u Neretvi.
Za potonu pastrvu u Krki znaajni su aleli 204, 218, 226 i 245, a za potonu
pastrvu u Zrmanji aleli 241 i 245. Kod mekousne pastrve se ne pojavljuju aleli
dui od 206.

96

udio u populaciji

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona
Neretva mekousna

204

206

218

226

241

245

246

veliina alela

Graf 7: Alelni polimorfizam na lokusu OmyFgt1TUF

Na lokusu SsoSL438 otkrili smo 14 razliitih alela (Graf 8). Kod

populacije mekousne pastrve u rijeci Jadro znaajni su aleli 123 i 125, a
pojavljuju se i aleli 109 (J13) i 111. Za populaciju mekousne pastrve u
rnovnici znaajni su aleli 123 i 125, a takoer se pojavljuje alel 111. Za
populaciju mekousne pastrve u Neretvi znaajni su aleli 116 i 120, a pojavljuju
se aleli 111 i 118. Za populaciju potone pastrve u rijeci Zrmanji znaajan je
alel 104, dok se takoer pojavljuje i alel 106. Aleli 96, 98, 104, 111 i 114 se

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona

12
5

12
0

11
7

11
5

11
1

10
9

Neretva mekousna

10
4

96

udio u populaciji

pojavljuju u populaciji potone pastrve u Krki, za nju je znaajan i alel 106.

veliina alela

Graf 8: Alelni polimorfizam na lokusu SsoSL438

97

Na lokusu StMSLDH4 otkrili smo 7 razliitih alela (Graf 9). Alel 237
znaajan je za populacije mekousne pastrve u rijekama Jadro, rnovnica i
Neretve, gdje je jo prisutan i alel 245. Za potonu pastrvu u rijeci Zrmanji
znaajni su aleli 247 i 265. Ti aleli su znaajni i za potonu pastrvu u rijeci Krki
gdje se uz njih, u veem postotku jo pojavljuje i alel 253. Alel 276 pojavljuje

udio u populaciji

se samo kod uzoraka J13 i J15 u populaciji mekousne pastrve u rijeci Jadro.

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

Jadro mekousna
rnovnica mekousna
Krka potona
Zrmanja potona
Neretva mekousna

237

245

247

253

264

265

276

veliina alela

Graf 9: Alelni polimorfizam na lokusu StMSLDH4

98

3.4.2.1. Varijabilnost mikrosatelitskih lokusa kod prouavanih populacija

Prosjean broj alela po lokusu kod pojedinih populacija kretao se od

1,55 kod populacije mekousne pastrve u rijeci rnovnici do 5,88 u populaciji
potone pastrve u rijeci Krki. U populaciji mekousne pastrve u rijeci rnovnici
nali smo najmanji broj alela. To objanjavamo s nainom nastanka te
populacije. Populacija mekousne pastrve u rijeci rnovnici nastala je prije 25
godina odvajanjem tridesetak jedinki iz Jadra.
Uoena heterozigotnost po pojedinom lokusu se bitno razlikuje (Tablica
8). Najmanja vrijednost uoene heterozigotnosti (Ho=0,000) naena je na
veem broju lokusa: na lokusu BFRO001 kod populacija mekousne pastrve iz
rijeka rnovnice i Neretve, na lokusu BFRO002 kod populacija mekousne
pastrve iz rijeka rnovnice i potone pastrve iz Krke i Zrmanje, na lokusu
OmyFgt1TUF kod populacija mekousne pastrve iz rijeka rnovnice, Jadro i
Neretve i na lokusu StMSLDH4 kod populacije mekousne pastrve iz rijeke
rnovnice. Najvea vrijednost uoene heterozigotnosti naena je na lokusu
Ssa197 kod populacija mekousne pastrve iz rijeke Neretve (Ho=1,000) i
potone pastrve iz rijeke Zrmanje (Ho=1,000), te na lokusu SsoSL438 u
populaciji mekousne pastrve iz Neretve (Ho=1,000) i potone pastrve iz Krke
(Ho=0,909).
Pri

odreivanju

odstupanja

stvarnih

od

oekivanih

frekvencija

genotipova u populaciji, koji su Hardy-Wenbergovoj ravnotei potrebno je

naglasiti da je u veini populacija istraen mali broj uzorka.
Pri analizi udjela alela po populacijama uoavamo da se kod tri uzorka
u populaciji mekousne pastrve u rijeci Jadro (J13, J15 i J17), javljaju specifini
aleli, bliski onima koje nalazimo kod potone pastrve. Takova pojava navodi
nas da je kod tih uzoraka dolo do mjeanja genetskog materijala sa
potonom pastrvom, odnosno za te uzorke smatramo da su hibridi mekousne
pastrve sa potonom.

99

3.4.2.2. Analiza glavnih koordinata

Predstavnici svih prouavanih populacija bili su ukljueni u analizu

glavnih koordinata. Iz rezultata multivarijantne analize dobili smo matricu s
rasporedom jedinki po osi, iz koje je napravljen dvodimenzionalni graf (Graf
10).

Graf 10: Analiza glavnih koordinata jedinki koje pripadaju razliitim

populacijama.

Iz grafa analize glavnih koordinata je vidljivo da jedinke ine dvije

zasebne skupine: u jednu skupinu ulaze populacije mekousnih pastrva, a u
drugu, populacije potonih pastrva. Tri uzorka mekousne pastrve iz rijeke
Jadro (J13, 15 i J17) pomaknuta su prema potonoj pastrvi, smatramo da su ti
uzorci hibridi.
U tablici 12 prikazali smo alele pojedinih lokusa koji se javljaju kao
zajedniki u populacijama mekousne pastrve u Jadru i rnovnici te u
populaciji potone pastrve u rijeci Krki. U tablici 13 prikazali smo alele koje
dijele populacije mekousne pastrve iz rijeka Jadra, rnovnice i Neretve.

100

Tablica 12: Udio pojavljivanja zajednikih alela u postotcima kod populacija

mekousne pastrve u Jadru i rnovnici i u populaciji potone pastrve u rijeci
Krki.

Jadro mekousna

rnovnica mekousna

Krka potona

BFRO001 alel 214

0,0263

0,0455

Ssa197 alel 132

0,526

0,2917

Strutta24 alel 206

0,0789

0,0526

0,0417

Strutta58 alel 175

0,0263

0,0455

Str591INRA alel 149

0,0556

0,0417

Str591INRA alel 171

0,7778

0,8889

0,0833

1,0000

1,0000

0,1250

OmyFgt1TUF alel
206

Tablica 13: Udio pojavljivanja zajednikih alela u postotcima za populacije

mekousne pastrve iz rijeka Jadra, rnovnice i Neretve.

Jadro mekousna

rnovnica mekousna

Neretva mekousna

Ssa 197 alel 145

0,5263

0,5789

0,0714

Str591INRA alel 171

0,7778

0,8889

0,7857

Str591INRA alel 173

0,1389

0,1111

0,0714

1,0000

1,0000

1,0000

SsoSL438 alel 111

0,0333

0,4000

0,0833

StMSLDH4 alel 237

0,9375

1,0000

0,5833

OmyFgt1TUF alel
206

101

3.4.2.3. Izraunavanje vrijednosti FST

Pomou kompjutorskog programa GENETIX izraunali smo parametar
, gdje je FST vrijednost prilagoena po Weir i Coockerham (1984). Izraunate
FST vrijednosti prikazane su u tablicama 14a i 14b.

Tablica 14a: Vrijednosti FST parametra u istraivanim populacijama.

rnovnica
mekousna
Jadro mekousna

0,04626

rnovnica
mekousna

Zrmanja

Neretva

potona

mekousna

0,58461

0,71070

0,55623

0,63975

0,77979

0,62983

0,32426

0,41067

Krka potona

Krka potona
Zrmanja

0,53516

potona

Tablica 14b: Vrijednosti FST parametra u istraivanim populacijama, pri emu

uzorci J13, J15 i J17 nisu bili uvrteni u istraivanje.
rnovnica
mekousna
Jadro mekousna
rnovnica
mekousna
Krka potona
Zrmanja
potona

0,04364

Zrmanja

Neretva

potona

mekousna

0,61893

0,76681

0,61218

0,63975

0,77979

0,62983

0,33023

0,41370

Krka potona

0,53516

102

3.5. ANALIZA SEKVENCIONIRANJA NUKELARNE DNA

Sekvencioniranjem uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke
Neretve, uoili smo da nema varijabilnih mjesta u sekvenci gena laktat
dehidrogenaze (LDH)-C1* izmeu njih. Analizirane sekvence gena laktat
dehidrogenaze (LDH)-C1*, dune 440 bp prikazane su na slici 28.
Jadro me_
Neret me_
jadranska_

TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT
TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT
TGTTACCACGACGATACGAGAGTTCGCCGTCACAGAGTAGTCTGACCGTGGGAGAACAAT
************************************************************

Jadro me_
Neret me_
jadranska_

CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT
CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT
CAATCAATGAGAGTACTGTGTATCATTTGTGTCTAGTATTTCTTCAGTAATTTGTCATAT
************************************************************

Jadro me_
Neret me_
jadranska_

CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTAGGATTTCAGAAATTGCTTT
CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTAGGATTTCAGAAATTGCTTT
CATTAATAGATCTAATGGCAGGACTATTACATGTCAAAGTGGGATTTCAGAAATTGCTTT
**************************************** *******************

Jadro me_
Neret me_
jadranska_

GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCCTTTTCCCCCCCATCTCCCTTTCATACA
GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCCTTTTCCCCCCCATCTCCCTTTCATACA
GAGAAACTTCATTCATACATTTCCCTTTCACCC------CCCCCATCTCCCTTTCATACA
*********************************
*********************

Jadro me_
Neret me_
jadranska_

CTTCCCCTCTCAGAGAGACTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT
CTTCCCCTCTCAGAGAGACTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT
CTTCCCCTCTCAGAGAGAGTACTTCATTTAACACACAGACATTTGACATGCAGATGGTGT
****************** *****************************************

Jadro me_
Neret me_
jadranska_

CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC
CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC
CCATCTTGGTTTTCTGGTTTCCTGGTGCCCAATTGCTACACACTCACCTTTGCTGGCGAC
************************************************************

Jadro me_
Neret me_
jadranska_

TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA
TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA
TATCTTGGGCGTTTTGAGGAA
*********************

Slika 28: Sekvence gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod mekousne

pastrve iz rijeke Jadro (Jadro me), rijeke Neretve (Neret me) i jadranske linije
potone pastrve. Crvenom bojom su oznaena varijabilna mjesta. Plavom
bojom su oznaena mjesta koja prepoznaje restrikcijski enzim Rsa I.

103

3.5.1. Analiza odsjeaka gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1*,

DNA molekule s tehnikom RFLP (Restriction Fragment Lenght
Polymophism)

Na umnoenom dijelu nuklearne DNA, genu laktat dehidrogenaze

(LDH)-C1*, provjerili smo polimorfizam nukleotidnih mjesta koja prepoznaje
restrikcijski enzim Rsa I. Restrikcijska endonukleaza Rsa I cijepa produkte na
prepoznatljivoj sekvenci gt/ac (Slika 29).
Potonu pastrvu (Jadranski oblik) restrikcijski enzim ree na 2 mjesta, na 74
bp i na 240 bp, pri emu stvara tri odsjeka razliite duine: 74, 135 i 166 bp.
Mekousne pastrve restrikcijski enzim Rsa I ree na jednom mjestu, na 74 bp,
pri emu stvara dva odsjeka duine 74 i 300 bp.

Slika 29: Restrikcija gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* s restrikcijskim

enzimom Rsa I, uzorci 1 i 5 su potona pastrva, a 2, 3 su mekousna pastrva
iz Jadra, a uzorak 4 je mekousna pastrva iz rijeke Neretve

104

4. RASPRAVA
U podruju Mediterana obitava veliki broj endemskih slatkovodnih ribljih
vrsta. U zapadnoj Europi riblje populacije su vrlo dobro istraene to nije
sluaj u ovom dijelu Europe. Ovdje nalazimo brojne riblje vrste koje su slabo
opisane, sa sistematikom koja je nedovoljno definirana, a i njihova distribucije
nije sasvim poznata. Stoga je potrebno je napraviti reviziju sistematike brojnih
vrsta i podvrsta riba.
U rijekama jadranskog sliva obitavaju etiri izdvojene populacije
mekousne pastrve, koje se meusobno morfoloki razlikuju. Predmet naeg
istraivanja bila je podvrsta mekousne pastrve koja obitava u rijekama Jadru i
rnovnici (S. o. salonitana). Opisali smo je i usporedili s podvrstama
mekousne pastrve iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), kao i potonim
pastrvama (Salmo trutta) iz rijeka Krke i Zrmanje.
Osnovni cilj naeg rada je pronai i opisati genetske razlike izmeu
mekousnih pastrva S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus i potone pastrve
(Salmo trutta). Stoga smo prikupili uzorke od tri populacije mekousne pastrve
koje obitavaju u rijekama jadranskog sliva, te od dvije populacije potone
pastrve, koje pripadaju jadranskim linijama pastrva (Bernatchez, 2001). U
ovom radu eljeli smo napraviti i usporedbu s podvrstom mekousne pastrve iz
rijeke Krke (S. o. krkensis), ali prilikom uzorkovanja nismo uoili niti jedan
primjerak.
Sadanje populacije mekousnih pastrva su vrlo male i neprestano
bivaju ugroene s mnogo imbenika stoga je analiziran mali broj uzoraka.
Svjesni smo da zakljuci izvedeni nakon analize malog broja uzoraka nisu
statistiki opravdani, no unato tome, oni su zanimljivi i temelj su novim
raspravama i istraivanjima. Dobivene rezultate stavili smo u odnos s ranije
istraenim linijama i vrstama pastrva, u oblik filogenetskog stabla.

105

4.1. Morfoloke analize

Jedna od osnovnih karakteristika Salmonida je fenotipska plastinost.
Njihove predstavnike nalazimo u velikom broju varijacija boje tijela, meristikih
obiljeja, izbora hrane, rasta, ponaanja i razmnoavanja. Te varijacije su
najee ekoloki uvjetovane, kao to je sluaj kod ekolokih oblika potone
pastrve S. trutta gdje razlikujemo potoni, jezerski i morski oblik. No, one
mogu biti i rezultat ivotne specijacije ili mogu biti genetski uvjetovane.
Genetski uvjetovane morfoloke razlike uoene su kod nekih predstavnika
roda Salmo, kod S. marmoratus, S. carpio, S. ferox (Kottelat, 1997).
Na osnovu morfolokih i morfometrijskih obiljeja mekousne pastrve su
podijeljene u etiri podvrste, pa smo nae istraivanje zapoeli usporedbom
morfolokih obiljeja mekousne pastrve iz rijeke Jadro (S. o. salonitana) i
mekousne pastrve iz rijeke Bune (S. o. oxyrhynchus), sa potonom pastrvom
jadranskog sliva (S. trutta).
Na osnovu morfometrijskih izmjera tri primjerka mekousne pastrve iz
rijeke Jadro (S. o. salonitana), moemo dati njezin kratak opis.
Oblik tijela mekousne pastrve iz rijeke Jadro vrlo je slian potonoj
pastrvi. Masna peraja postoji, repna peraja je u sredini dosta usjeena sa
izraenim vrhovima. Na tijelu se nalaze crne pjege nepravilnog oblika koje su
rasporeene uglavnom sa bone strane i to na prostoru od glave do kraja
lene peraje. Crvene pjege su rjee, no one su vee i proteu se esto po
itavom tijelu. Peraje nisu pigmentirane, osim lene peraje na kojoj nalazimo
tragove crvenih i crnih toaka.
Mekousna pastrva ime je dobila po karakteristinom izgledu glave,
odnosno usta, karakterizira je zaobljena njuka, mala i mesnata usta, a
gornjoviline kosti su joj kratke i iroke.

Morfoloka obiljeja mekousne pastrve iz rijeke Jadro (S. o. salonitana)

usporedili smo s mjerenjima koja su obavljena na mekousnoj pastrvi iz rijeke
Neretve (S. o. oxyrhynchus), (Jankovi, 1961).
Morfometrijske oznake koje su imale vrlo sline vrijednosti kod dviju
podvrsta mekousne pastrve S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus su: duina

106

glave, duina donje vilice, uzduni dijametar oka, duina osnove leene i
podrepne peraje, duina prsne i trbune peraje, zatim najvea i najmanja
visina tijela. Izuzetnu slinost u nekim morfolokim osobinama objanjavamo
slinim uvjetima stanita u kojima obitavaju obje podvrste, stoga se i
parametri u kojima su S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus bliske odnose na
one osobine na koje najvei utjecaj ima njihov nain ivota (obje vrste
obitavaju u brzim tekuicama).
Meutim u nekim morfometijskim oznakama postoje signifikantne
razlike izmeu dviju promatranih podvrsta, a to su ponajprije duina i irina
gornje vilice. Gornja vilica koja prelazi preko donje je karakteristika podvrste
mekousne pastrve S. o. oxyrhynchus, dok su jako zaobljene vilice znaajka
mekousne pastrve S. o. salonitana. Mnogo vea razlika kod promatranih
podvrsta uoena je pregledom meristikih osobina. Meristike osobine se
znatno slabije mijenjaju u nekoj populaciji pod utjecajem razliitih ekolokih
uvjeta, odnosno posjeduju vei heritabilitet (Treer i sur., 1995). Na promjenu
meristikih osobina utjecaj ima genetski faktor. Bitnu razliku izmeu S. o.
salonitana i S. o. oxyrhynchus uoili smo u broju bica u perajama, broju ljuski
u bonoj liniji, broju branhiospina na prvom krnom luku te broju kaudalnih
kraljeaka. Stoga moemo pretpostaviti da su ove dvije podvrste nekada bile
u

znatno

bliem

srodstvu,

no

uslijed

duge

geografske

izolacije

prilagoavanja na specifine uvijete stanita, te radi utjecaja hibridizacije sa

potonom pastrvom dobile su posebne morfoloke i ekoloke osobine koje ih
danas jasno razlikuju.
Morfoloke vrijednosti kod S. o. salonitana prikazali smo i u odnosu na
totalnu duinu tijela, da bismo je mogli usporediti sa potonom pastrvom
jadranske linije S. trutta (Mari, 2002) i sa endemskim salmonidom
Platysalmo platycephalus iz Turske (Behnke, 1968).
Duina i irina vilica su morfometrijske oznake koje su u najveoj mjeri
odstupale kod dviju podvrsta mekousne pastrve izmeu S. o. salonitana i S.
o. oxyrhynchus, no te su vrijednosti vrlo sline kod S. o. salonitana i potone
pastrve S. trutta. Potona pastva je relativno mlada vrsta na ovim prostorima,
injenica to S. o. salonitana dijeli sa njom neke fizike osobine vodi nas
prema zakljucima o njihovoj moguoj povezanosti tijekom evolucije.

107

Platysalmo platycephalus je endemski salmonid sa uskim stanitem na

jugu Turske. Sa mekusnom pastrvom S. o. salonitana dijeli neke slinosti kao
npr. najvea visina tijela, duina prsne, trbune, lene i podrepne peraje. Kod
nekih meristikih osobina veliki slinost pokazuju u broju branhiospina na
prvom krnom luku, broju ljuski u bonoj liniji, broju redova ljuski od bone
linije do trbue peraje te broju kaudalnih kraljeaka, no signifikantno se
razlikuju u broju pilorikih nastavaka (P. platycephalus (15,660,57),
mekousna pastrva (57)).
Morfoloku razliitost podvrsta roda Salmothymus koji obitavaju u
rijekama jadranskog sliva, moemo usporediti s primjerom razliitih ekotipova
vrste Coregonus clupeaformis koja obitava u jezerima bazena rijeke St. John
u Sjevernoj Americi (Lu i sur., 2001). Postojanje razliitih ekotipova kod tih
populacija, moe biti rezultat od oboje; sekundarnog kontakta izmeu rodova
udaljenih kroz ledeno doba ili poetnog razvoja kod jedne populacije
(Bernatchez i Dodson, 1991). Lu i Bernatchez (1999) smatraju da su razlike
izmeu stanita, jezera, bitno utjecale na morfoloku specijaciju ekotipova.
Stoga smatraju da stanine razlike izmeu razliitih jezera imaju gotovo
jednako vanu ulogu u nastanku razliitih ekotipova i njihovog stupnja
razliitosti, kao i sekundarni kontakt izmeu udaljenih evolucijskih linija.
Pronalazak jezera koja su u ledeno doba nastanile dvije razliite linije, iako
danas u njima nalazimo samo jedan ekotip, predstavljaju hibridnu populaciju.
Radi

dugotrajne

izoliranosti

razliitim

stanitima,

procesom

specijacije dolo je do nastajanja razliitih morfolokih oblika mekousne

pastrve, koju smo danas odvojili kao podvrste. S. o. salonitana morfoloki se
znatno razlikuje od S. o. oxyrhynchus, a vie je slina potonoj pastrvi.
Meutim obje podvrste imaju isto razdoblje mrijesta (proljetni mrijest), to ih
razlikuje od potone pastrve koja ima zimski mrijest. S obzirom na njenu
slinost sa oboje S. o. oxyrhynchus i S. trutta bilo je interesantno istraiti i
njihov odnos na molekularnoj razini.

108

4.2. Prehrana mekousne pastrve iz rijeke Jadro

Analizu prehrane izvrili smo na tri primjerka mekousne pastrve iz
rijeke Jadro od kojih su dva naena uginula u donjem toku rijeke, a jedan je
uginuo prilikom uzorkovanja. Analizom eluanog i crijevnog sadraja
ustanovili smo da sva tri primjerka imaju potpuno prazno probavilo. Prazno
probavilo kod ovih primjeraka je razumljivo jer se ribe esto prestaju hraniti
ako postoji neki zdravstveni problem.

4.3. Analiza molekularno-genetskih podataka

Analizirali

smo

varijabilnost

dviju

regija

mitohondrijske

DNA,

nekodirajue kontrolne regije i kodirajue regije gena za citokrom b.

Analizu mitohondrijske DNA zapoeli smo restrikcijom kontrolne regije
s restrikcijskim enzimom Alu I. Rezanje 1200 bp dugog segmenta omoguilo
je nastajanje polimorfnih restrikcijskih fragmenata, to je omoguilo prvotno
razlikovanje

populacija

mekousne

potone

pastrve.

Analizom

sa

restrikcijskim enzimom uoili smo razliku izmeu podvrste S. o. oxyrhynchus i

ostalih, podvrste S. o. salonitana i vrste S. trutta. Kako ne postoji restrikcijski
enzim koji bi prepoznao populaciju S. o. salonitana, za tipiziranje iste, koristili
smo sloeniju metodu sekvencioniranja.
Daljnju analizu proveli smo sekvencioniranjem dijela kontrolne regije od
540 bp. Unutar sekvencioniranog dijela nali smo 13 varijabilnih mjesta, to
znai da na svaka 41,5 nukleotida dolazi jedno varijabilno mjesto. Osim
podataka o zastupljenosti pojedinih mutacija koje smo dobili od naih
uzoraka, takoer smo koristili i podatke iz literature (GenBanka), pomou kojih
smo eljeli pribliiti to realnijem broju postojeih genetskih varijanti. Osim
naih uzoraka mekousne pastrve i potone pastrve jadranskog tipa, prikazali
smo i Salmo salar, Acantholingua ohridana te potone pastrve dunavskog,
mediteranskog i atlantskog tipa. Kad smo u analizu ukljuili ranije analizirane
haplotipove iz literature (Tablica 6), varijabilnost se znatno poveala. Uoili

109

smo 35 varijabilnih mjesta, to znai da na svaka 15,4 nukleotida dolazi jedno

varijabilno mjesto.
Prilikom sekvencioniranja kontrolne regije uoili smo 5 razliitih
haplotipova (Zrm1, Zrm2Ad4, Krka, ZRN, Soxy), a pri sekvencioniranju gena
za citokrom mtDNA b 3 haplotipa (Ad1, ZRN i Soxy). Uzrok veeg broja
haplotipova pri sekvencioniranju kontrolne regije je vea varijabilnost te
sekvence u odnosu na gen za citokrom b. Analiziranjem istog podruja kod
potonih pastrva iz rijeka Krke i Zrmanje uoili smo da one pripadaju haplotipu
pastrva jadranske filogenetske linije (Bernatchez i sur., 1992). Sekvence
potone pastrve iz rijeke Zrmanje su se meusobno razlikovale u 1 bp, te smo
kod njih opisali dva razliita haplotipa Zrm1 i Zrm2Ad4, koji su se meusobno
razlikovali radi tranzicije izmeu timina i citozina. To polimorfno mjesto
vjerojatno predstavlja jednu od vruih toaka (engl. hot spot), pa su istovrsne
tranzicije prisutne na vie haplotipova, bez obzira na njihov geografski izvor.
Pri sekvencioniranju gena za citokrom b kod tih uzoraka nisu uoene
varijabilnosti.
Sekvencioniranjem uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i rnovnice
ustanovili smo da uzorci dijele isti haplotip. Populacija mekousne pastve u
rijeci rnovnici je nastala odvajanjem dijela jedinki iz Jadra prije 25 godina,
stoga nas nije iznenadilo to te populacije imaju jednak haplotip. Haplotip koji
smo opisali kod ovih populacija nazvali smo ZRN. Haplotip ZRN je prvi
genetski marker koji opisuje populaciju mekousne pastrve iz rijeka Jadro i
rnovnice. Novi haplotip se razlikuje od ostalih po dodatnoj tranziciji TC na
261 bp sekvencioniranog dijela.
Sekvencioniranjem dijela kontrolne regije mtDNA kod mekousne
pastrve iz Neretve (S. o. oxyrhynchus), uoili smo ranije opisan haplotip
soxy (Snoj i sur., 2002b). Iako su supstitucije tipa GC transverzija poprilino
rijetke, takve dvije supstitucije su prisutne kod haplotipa soxy u kontrolnoj
regiji. Radi sloenosti nastanka takovih supstitucija, veina ih je vjerojatno
posljedica mnogostrukih supstitucija jednom mjestu (npr. GAC). Za
haplotip soxy na kontrolnoj regiji su znaajne jo tri transverzije: AG, AT i
CA, dok kod gena za citokrom b, transverzije nisu prisutne.

110

Kontrolna

regija

je

vrlo

varijabilna

kod

pastrvskih

populacija.

Bernatchez i suradnici (1992) su kod 24 istraene populacije uoili 12 razliitih

haplotipova, gdje je prosjean broj supstitucija iznosio 2,4%. Prosjean broj
supstitucija nukleotida izmeu haplotipova mekousne pastrve iz Neretve i
Jadra iznosio je 2,2%. U kontrolnoj regiji kod mekousne pastrve (S. o.
salonitana) nismo uoili delecije i insercije koje su znaajne za neke
haplotipove u kontrolnoj regiji kod mekousne pastrve iz Neretve (S. o.
oxyrhynchus) (Snoj, 1997). Haplotip soxy karakterizira delecija gvanina u
kontrolnoj regiji.
Kod vrsta koje pripadaju istom rodu, uoili smo manji broj tranzicija s
obzirom na transverzije. Tokaste delecije unutar vrsta nismo opazili, no nali
smo ih izmeu rodova (jednu izmeu S. o. oxyrhynchus i potone pastrve), te
izmeu porodica unutar podreda Salmonoidae (jednu izmeu atlantskog
lososa i pastrve).
Berantchez i suradnici (1992) uoavaju da postoje razlike izmeu
prirode nukleotidnih supstitucija kod potone pastrve i sisavaca na mtDNA.
Ope je poznato da tranzicije uvelike nadmauju transverzije (10:1) u
kontrolnoj regiji sisavaca, no u njihovoj studiji taj odnos je bio znatno manji.
Na osnovu toga, oni zakljuuju da postoje bitne razlike u procesu mutacija
izmeu sisavaca i riba.
Odnos izmeu tranzicija i transverzija u kontrolnoj regiji mtDNA iznosio
je 4:2, taj odnos je za salmonide slian; za lipljena (Sunik, 2001) je 14:7, za
pastrvu (Bernatchez i sur., 1992) 17:6. Meutim kod veine kraljenjaka u tom
odnosu tranzicije prevladavaju u mnogo veem postotku, ak do 32 puta pred
transverzijama (Moritz i sur., 1987).
Velika varijabilnost znaajna je za 5'-kraj gena za citokrom b kod
promatranih populacija, gdje smo na 276 bp dugom odsjeku pronali 8
varijabilnih mjesta, to prosjeno iznosi jedno varijabilno mjesto na svakih
34,5 nukleotida. Izmeu podvrsta mekousne pastrve broj supstitucija na
nukleotidu izmeu para haplotipova iznosio je 0,026, to je mnogo vie nego
to su uoili drugi autori (0,015 kod lipljena (Sunik. 2001)). Svih 8 varijabilnih
mjesta na genu za citokrom b kod sekvencioniranih jedinki su transverzije.
Broj tranzicija i transverzija izmeu dvaju nukleotida ovisi o srodnosti
organizama kojima nukleotidne sekvence pripadaju. to su organizmi u uoj
111

vezi to su razlike izmeu sekvenci manje, a prilikom supstitucije prevladavaju

tranzicije nad transverzijama. Kod viih taksonomskih skupina odnos izmeu
tranzicija i transverzija se smanjuje.
Mutacije koje nalazimo na nekodirajuem dijelu mtDNA, kontrolnoj
regiji, pripadaju veinom tokastim mutacijama, koje nastaju kao rezultat
supstitucije, delecije ili insercije. Razlog takvim mutacijama je proces
pogrenog spajanja nukleotida prilikom replikacije. Mehanizam za uklanjanje
pogreno sparenih nukleotida zasluan je za popravljanje takovih mjesta u
molekuli, on prepoznaje i izrezuje nukleotide prilikom polimerizacije i ligacije
novog lanca (Lewin, 2000). Meutim, postojei mehanizmi nisu uvijek
uspjeni, pa se neke mutacije zadre u genomu i dalje prenose na potomstvo.
Kod

greki

koje

nastaju

prilikom

pogrenog

sparivanja

nukleotida,

prevladavaju supstitucije, npr. na adenin se umjesto timina (pirimidin) vee

citozin (pirimidin), ili gvanin ili adenin (purin), no zamjena pirimidina
pirimidinom uzrokuje manju steriku konformaciju nego druge zamjene. Kod
nekodirajuih

regija

DNA

tranzicijske

supstitucije

prevladavaju

nad

transverzijskima. Supstitucije su ee od delecija ili insercija, a meu

supstitucijama tranzicije su teoretski dva puta ee od transverzija. Unutar
tranzicija prevladavaju supstitucija CT. Stoga je pri ocjenjivanju razliitosti
nekog para u sekvenci DNA potrebno ocijeniti odreeni tip mutacija (Irwin i
sur., 1991). Osim ocjene tipa mutacija potrebno je imati u vidu da li se redi o
pojedinanoj,

viekratnoj,

usporednoj,

istovremenoj,

konvergentnoj

ili

povratnoj supstituciji. to je stupanj razliitosti izmeu dvije nukleotidne

sekvence manji, mogunost da doe na odreenom mjestu do vie
supstitucija je gotovo zanemariva, broj uoenih supstitucija izmeu takovih
dviju sekvenci bi trebao koincidirati sa stvarnim brojem supstitucija. Suprotan
je sluaj kad postoji velika razlika izmeu sekvenci, uoeni broj razlika je
manji od stvarnog broja, to je posljedica viekratnih supstitucija na istom
mjestu (Snoj, 1997).

112

Za filogenetsku analizu prikazali smo odnose na osnovu kontrolne

regije, gena za citokrom b, te zajedniki prikaz udruenih sekvenci kontrolne
regije i gena za citokrom b.
Filogenetsko drvo dobiveno spajanjem sekvenci kontrolne regije i gena
za citokrom b prikazuje slian genetiki odnos s onim koji je dobiven prema
sekvenci kontrolne regije. Potona pastrva iz Zrmanje (ZRM1 i ZRM2) ulazi u
isti ogranak s ranije istraenim haplotipovima Ad1 i Ad3 u jadransku liniju
pastrva. Mekousna pastrva iz rnovnice S. o. salonitana (ZRN) se pokazala
znatno blia potonoj, nego mekousnoj pastrvi iz rijeke Neretve (Soxy).
Prema kontrolnoj regiji mekousna pastrva iz rnovnice ini poseban ogranak
izmeu potonih pastrva, a prema citokormu b ona ulazi isti ogranak sa
potonim pastrvama dunavske linije (Da1, Da2, Da). Udruivanjem obaju
istraivanih sekvenci, solinka (ZRN), zauzima poseban ogranak unutar
filogenetskih linija potone pastrve. Istom analizom mekousna pastrva iz
Neretve ulazi u ogranak sa belvicom (bel), dok je posve suprotan sluaj kada
njeno mjesto promatramo samo analizom kontrolne regije. Pri analizi
kontrolne regije u populaciji mekousne pastrve iz Neretve odnos izmeu
tranzicija i transverzija odstupao je od uobiajnih, zabiljeen je povean broj
transverzija, stoga analizu te regije na smatramo informativnom pri
istraivanjima izmeu rodova. Za odnose izmeu rodova informativniji prikaz
u filogenetskom stablu daje kombinacija sekvenci kontrolne regije i gena za
citokrom b.
Na osnovu podataka od citokroma b i kontrolne regije, podvrste S. o.
salonitana i S. o. oxyrhynchus, znatno se razlikuju, no sa druge strane S. o.
salonitana pokazuje izuzetnu slinost sa populacijom S. trutta (Jadranske
filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. Sa obzirom na
te rezultate S. o. salonitana bila bi smjetena sa S. trutta kao njezina posebna
linija. Sekvencioniranjem gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod uzoraka
mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke Neretve, uoili smo da nema
varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci izmeu njih, odnosno naena je
100% identinost nukleotida. Takav konflikt izmeu podataka dobivenih od
mtDNA i nuklearne DNA je ranije zabiljeen kod salmonidnih riba (Bernatchez
i sur., 1995; Wilson i Hebert, 1993), to je mogue da u ovom sluaju ukazuje
na polifiletsko porijeklo podvrste S. o. salonitana.
113

Filogenetsko drvo pokazuje grananja populacija s obzirom na

geografsko mjesto. Uoili smo grupiranje populacija iz istog porijeja. Potone
pastrve iz Krke pripadaju pastrvama jadranske linije, to se moe objasniti
njihovom vezom u prolosti.
Dananja rairenost slatkovodnih riba povezana je s paleogeografskim
dogaajima u zemljinoj prolosti, koji su utjecali na hidrografske sustave. Za
vrijeme mlaeg i srednjeg miocena, prvotno more Tethys se razdijelilo na dva
morska bazena: na Sredozemno more i Paratethys more. Djelovanjem
geolokih dogaaja dolo je do otvaranja Gibraltarskih vrata i ulaska slane
vode, te Sredozemno i Paratethys more postaju slana mora. Taj dogaaj bio
je poguban za slatkovodne ribe, koje su ivjele u Paratethys moru jo od
razdoblja srednjeg miocena. U kratkom vremenu dolo je do nestanka,
vjerojatno, jedne od najbogatijih slatkovodnih fauna. Razdoblje pleistocena
oznaava vie ledenih doba, ije su se posljedice osjetile i u kolebanju razine
oceana. Najvee snienje razine Sredozemnog mora dogodilo se u zadnjem
Wrmskom ledenom dobu prije 15000 do 18000 godina. Posljedica snienja
razine mora je poveanje Padskog porjeja sve do rijeke Krke. Sve zemlje
centralne Europe bile su proete mreom rijenih sustava (Sunik, 2001).
U to vrijeme veinu podruja koje danas zauzima Jadransko more,
prekrivalo je kopno. Upravo tada, postojala je veza izmeu slivova rijeka
talijanskog podruja sa rijekama Jadranskog porijeja (Apostolidis i sur.,
1996). Za vrijeme pleistocena dolo je do otapanja velike koliine leda,
zaostalog iz ledenog doba, koje je doprinijelo znatnoj promjeni zemljine
povrine na prostoru dananjeg Jadranskog mora (Steinenger i Rogl, 1984).
Pod utjecajem geolokih promjena dolo je i do mijenjanja stanita u kojima
su obitavale tadanje populacije pastrva. Geoloki procesi su doveli do
odvajanja prvotnih populacija u stanita koja su meusobno razdvojena
nepremostivim barijerama. Razliiti uvjeti u novim stanitima doveli su do
njihove diferencijacije i do stvaranja skupina koje postoje i danas.
Potona pastrva jadranske linije (Ad haplotip) opisana je prema obliku
pastrva koje naseljavaju Ohridsko jezero i neke talijanske i francuske rijeke
koje se ulijevaju u Jadransko more (Bernactchez i sur., 1992). Potona
pastrva danas zauzima ista stanita kao i mekousna, no ona je zauzela ove
prostore znatno kasnije. Stoga smatramo da je podvrsta S. o. salonitana
114

nastala kao posljedica davne hibridizacije poetnog oblika S. o. oxyrhynchus i

naprednije S. trutta, koja je kolonizirala rijeke Jadranskog sliva mnogo kasnije.
Takva introgresija, karakterizirana sa zapljenom mtDNA je rijedak, ali
ve opisan fenomen kod nekih salmonida. On je dio prirodnog evolucijskog
procesa. Zatitu takve vrste nipoto ne treba iskljuiti radi toga to je nastala
takovom vrstom hibridizacije (Allendorf i sur., 2001)

Radi ispitivanja podudaranja evolucijske dinamike mitohondrijske i

nuklearne DNA, genetsku strukturu populacija odredili smo i pomou
koeficijenta Fst koji se temelji na frekvencijskoj distribuciji alela. Pomou te
vrijednosti uoili smo da se neke prouavane populacije meusobno znatno
ne razlikuju. To se posebno odnosi na populaciju mekousne pastrve "solinke"
koja je translokacijom iz rijeke Jadro zauzela novo stanite u rijeci rnovnici.
Stoga je niska Fst vrijednost od 0.04626 izmeu populacija mekousne pastrve
iz rijeka Jadro i rnovnice bila za oekivati. Manja razlika izmeu populacija je
posljedica razlika u frekvencijskoj distribuciji alela. Analizirane populacije
karakterizira slinost njihova stanita, sve ive u uskom ivotnom prostoru u
kojem vrlo lako, sluajnim tokom gena, dolazi do fiksacije odreenih alela u
populaciji. Ta pojava vodi ka monomorfnosti genotipova iz koje proizlazi efekt
uskog grla. U ribljim populacijama koje ive na uskom ivotnom prostoru,
efekt uskog grla je vrlo esta pojava. Za populaciju mekousne pastrve u rijeci
rnovnici znaajan je i mali broj alela po pojedinom mikosatelitskom lokusu,
pa je na ak pet alela (BFRO001, BFRO002, Strutta58, OmyFgt1TUF i
StMSLDH4) cijela populacija monomorfna. Mali genetski polimorfizam ove
populacije stoga je vjerojatno je posljedica viekratnog efekta uskog grla.
Mala heterozigotnost nas je navela na zakljuak da ta populacija nije u
ravnotei. Razlog neravnotee te populacije ne vidimo u migraciji jedinki,
budui da kod te populacije nismo nali vei udio tuih alela, poput populacije
mekousne pastrve iz Jadra. Uzrok neravnotee mogu je u tome to je u tom
specifinom

okruenju,

procesu

selekcije,

dolo

do

favoriziranja

homozigota. Budui da se radi o malom stanitu u kojem boravi mala riblja

populacija, prilikom izlova obuhvatili smo itavo stanite. Stoga razlog
neravnotee ne vidimo u obuhvaanju samo dijela uzorka. Smatramo da je

115

manjak polimorfizma u populaciji mekousne pastrve u rijeci rnovnici

posljedica rekolonizacije sa populacijom male efektivne veliine.
Razlog za veliku monomorfnost unutar pojedinih populacija i relativno
veliku polimorfnost izmeu nekih populacija je mali broj jedinki u uzorku i
izoliranost izmeu populacija. Broj jedinki u populaciji u prirodnom stanitu je
bio izuzetno nizak, izuzev populacije mekosne pastrve u rijeci Neretvi i
njezinim pritocima. Kako su promatrane populacije ivjele u razliitim
okoliima, na njih su djelovali razliiti selekcijski dogaaji i sluajni tokovi
gena, sve je to dovelo do vee razlike izmeu njih.
Pratili smo introgresiju, s obzirom na prouavane lokuse, potone
pastrve i mekousne pastrve iz Neretve na populacije mekousnih pastrva u
rijekama Jadro i rnovnica. Rezultate analize glavnih koordinata prikazali smo
grafiki. Istraivane populacije razdvojile su se na dvije strane: na jednoj
strani su bile mekousne, a na drugoj potone pastrve. Populacije mekousnih
pastrva iz Jadra i rnovnice su se uvelike preklapale. Pregledom njihovih
alela, uoili smo da te populacije imaju znatan broj zajednikih alela. Da
bismo utvrdili vezu mekousne pastrve iz Jadra, odnosno rnovnice i potone
pastrve iz Krke, promatrali smo njihove zajednike alele. Uoili smo da one
dijele 8 alela na 5 razliitih lokusa (Tablica 12). Veina od tih zajednikih alela
bila je prisutna samo kod populacije mekousne pastrve iz rijeke Jadro.
Pregledom grafikog rezultata analize glavnih kooridnati (Graf 10) mogu se
jasno uoiti 3 uzorka mekousne pastrve iz rijeke Jadro koja su pomaknuta
prema populaciji potone pastrve iz rijeke Krke. Upravo ti uzorci, (J13, J15,
J17) smatramo da su hibridi izmeu mekousne i potone pastrve. Ti uzorci
imali su jedan alel od solinke, a drugi alel od potone pastrve, koji su bili
rasporeeni na osam od devet analiziranih mikrosatelitskih lokusa. Radi
specifine distribucije hibridnih genotipova prema kojima je preostali dio
analizirane populacije solinke iz Jadra i rnovnice homogen, dokaz je da ta tri
uzorka predstavljaju posljedicu nedavnog krianja solinke sa potonom
pastrvom. Smatramo da u ovom stanitu solinka ima prednost u opstanku
pred potonom pastrvom i njihovim hibridima, kao u prilog tome navodimo
podatak o elektrinom ribolovu 1998. godine (Anii, usmeno priopenje)
kada su u rijeci Jadro zabiljeena 3 primjerka potone pastrve, a 2003. godine
nije naen niti jedan primjerak potone pastrve. Mogunost fizioloke
116

hibridizacije potvrdio je i Kosori (usmeno priopenje), on je na pastrvskom

uzgajalitu vrio hibridizacijske pokuse mekousne S. o. oxyrhynchus i potone
pastrve koji su rezultirali tvorbom hibrida, danas znanih od lokalnog
stanovnitva pod imenom kosor. Taj podatak govori nam da ne postoji jaka
barijera koja bi sprijeila krianje mekousne i potone pastrve. Ovo je
izuzetno bitan podatak pri planiranju zatite solinke, stoga smatramo da je za
uspjenu rehabilitaciju ove ugroene vrste potrebno hitno zaustaviti svako
unoenje potone pastrve u njena stanita.
Analizom Fst vrijednosti izmeu istraivanih populacija, kada smo
izuzeli 3 uzorka za koje smatramo da su hibridi populacije mekousne pastrve
iz Jadra i rnovnice pokazale su se jo bliima 0,04364. Najveu udaljenost
pokazale su populacije mekousne pastrve iz Jadra i rnovnice s potonom
pastrvom Fst=0.76681, odnosno 0.77979. Koeficijent Fst je pokazivao manju
vrijednost izmeu populacija potonih pastrva iz Krke i Zrmanje Fst=0.32426,
a njegova vrijednost iznosila je 0.41067 izmeu populacija mekousne pastrve
iz Neretve i potone iz Krke, odnosno 0.53516 s potonom iz Zrmanje.
Mekousna pastrva iz rijeke Jadro dijeli s mekousnom pastrvom iz rijeke
Neretve 6 alela na 5 razliitih lokusa, a s potonom pastrvom takoer dijeli 7
alela na 6 razliitih lokusa. To nam takoer ukazuje na to da je S. o.
salonitana polifiletska vrsta, nastala kao produkt introgresije izmeu S. o.
oxyrhynchus iz rijeke Neretve i potone pastrve autohtone za jadranski rijeni
sustav. Zajednike alele kod tih populacija tumaimo kao posljedicu
istosmjernih mutacija, te kao ostatak zajednikog davnog polimorfizma.

Razliku izmeu istraivanih populacija, odnosno intrapopulacijski

polimorfizam, prikazali smo i ocjenom heterozigotnosti. S obzirom na openito
izuzetno veliku heterozigotnost kod mikrosatelitskih lokusa, heterozigotnost
mikrosatelitskih lokusa kod populacija mekousne pastrve, bila je razmjerno
niska, dok je kod populacija potone pastrve ona bila ipak neto via (Tablica
12). Odnos oekivane i stvarne heterozigotnosti po lokusu kod pojedinih
populacija (mekousna pastrva u Jadru i rnovnici) ukazuje na znatan broj
homozigota u tim populacijama. Pomanjkanje heterozigotnosti kod tih
populacija objanjavamo efektom uskog grla i sa parenjem u srodstvu.
Vjerujemo da je mali broj uzoraka kod pojedinih populacija utjecao na
117

frekvencijsku distribuciju alela, naroito radi mogue prisutnosti rijetkih alela

koje radi malog uzorka nismo mogli uoiti ili smo njihovu frekvenciju
precijenili.
Radi visokog stupnja mutacije mikrosatelita, interpretacija rezultata
analize mikrosatelitskih lokusa ne moe biti apsolutno sigurna. Rezultati
analize

ukazuju

na

upotrebljivost

mikrosatelitskih

lokusa

pri

analizi

razlikovanja populacija i otkivanju hibrida kod pastrvskih populacija.

Prilikom vrednovanja mitohondrijskih genotipova treba imati na umu
princip njihova nasljeivanja. itav mitohondrijski genom nasljeuje se po
majci, te stoga nita ne govori o porijeklu oca. Prilikom unosa potone pastrve
u novo stanite, njezin potpuni utjecaj na postojeu populaciju moe se vidjeti
preko nuklearne DNA, preko mikrosatelita, dok mtDNA ima manji utjecaj, to
se naroito odraava prilikom unosa mujaka potone pastrve.

118

5. ZAKLJUCI
Osnovne zakljuke naeg rada iznosimo u nekoliko glavnih toaka.

Rijeke Jadro i rnovnica stanite su endemske mekousne pastrve (S.

o. salonitana), koja se odlikuje nizom morfolokih obiljeja, meu kojima se
istiu zaobljena njuka, mala i mesnata usta, te kratke i iroke gornjoviline
kosti.
Usporeujui morfoloka obiljeja mekousne pastrve iz rijeke Jadro s
mekousnom pastrvom iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), uoili smo mnoge
zajednika obiljeja, ali i niz vidljivih razlika koje ukazuju na njihovo zajedniko
srodstvo i na posljedice prostorne i ekoloke izolacije. Prilikom usporedbi
morfolokih obiljeja uoili smo bitne razlike u duini vilice, koja je izraenija i
dua kod S. o. oxyrhynchus, a kod S. o. salonitana gornja vilica je ira.
Samtramo da su ove dvije podvrste nekada bile u znatno bliem srodstvu, no
uslijed duge geografske izolacije i prilagoavanja na specifine uvijete
stanita dobile su posebne morfoloke i ekoloke osobine koje ih danas jasno
razlikuju.
Potona pastva je relativno mlada vrsta na ovim prostorima, injenica
to S. o. salonitana dijeli sa njom neke fizike osobine vodi nas prema
zakljucima o njihovoj moguoj povezanosti tijekom evolucije.
Prilikom usporedbe morfolokih osobina sa endemskim salmonidom
Platysalmo platycephalus iz Turske (Behnke, 1968), jasno je izraena razlika
u promatranim morfometrijskim osobinama, posebno u broju pilorikih
nastavaka. Sve to ukazuje na injenicu da mekousna pastrva i Platysalmo
platycephalus iz Turske predstavljaju posebne vrste endeminih salmonida.

119

Pomou genetskih markera pokuali smo definirati strukturu populacije

endemske mekousne pastrve iz rijeka Jadro i rnovnice (S. o. salonitana).
Analizom uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i rnovnice ustanovili smo
da uzorci dijele isti haplotip (ZRN), to nije neobino budui da je populacija
mekousne pastve u rijeci rnovnici je nastala odvajanjem dijela jedinki iz
Jadra prije 25 godina. Haplotip ZRN je prvi genetski marker koji opisuje
populaciju mekousne pastrve solinke iz rijeka Jadro i rnovnice.
Genetsku strukturu populacija odredili smo pomou koeficijenta Fst.
Pomou te vrijednosti uoili smo da se populacije iz rijeka Jadro i rnovnice
meusobno znatno ne razlikuju. Manja razlika izmeu populacija je posljedica
razlika u frekvencijskoj distribuciji alela. Uzrok neravnotee vidimo u tome to
je u tom specifinom okruenju u procesu selekcije dolo do favoriziranja
homozigota. Stoga smatramo da je manjak polimorfizma u populaciji
mekousne pastrve u rijeci rnovnici posljedica rekolonizacije s populacijom
male efektivne veliine.
Analizom mikrosatelitiskih lokusa uoeno je da populacije mekousnih
pastrva iz Jadra i rnovnice imaju odreen broj zajednikih alela s potonom
pastrvom. Analizom su utvrena tri uzorka mekousne pastrve (J13, J15 i J17)
iz rijeke Jadro koja dijele zajednike alele s potonom pastrvom. Smatramo
da su upravo ti uzorci hibridi izmeu mekousne i potone pastrve. Radi
specifine distribucije hibridnih genotipova prema kojima je preostali dio
analizirane populacije solinke iz Jadra i rnovnice homogen, smatramo da ta
tri uzorka predstavljaju posljedicu nedavnog krianja solinke sa potonom
pastrvom.
Postojanje hibrida govori nam da ne postoji jaka reprodukcijska barijera
koja bi sprijeila krianje mekousne i potone pastrve to je izuzetno bitnan
podatak pri planiranju zatite mekousne pastrve solinke. Smatramo da je za
uspjenu rehabilitaciju ove ugroene vrste potrebno hitno zaustaviti svako
unoenje potone pastrve u njena stanita, u protivnom je mogue da doe
do izumiranja ove reliktne vrste.
Aleli koji su znaajni za populacije mekousne pastrve u Jadru i
rnovnici pronali smo u populaciji mekousne pastrve u rijeci Neretvi.

120

Zajednike alele kod tih populacija tumaimo kao posljedicu davne

introgresije.

Analizirajui

podvrstu

S.

o.

salonitana,

rezultati

bazirani

na

mitohondrijskoj DNA razlikuju se od onih dobivenih analizom nuklearne DNA.

Na osnovi podataka sekvencioniranja od citokroma b i kontrolne regije,
podvrste S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus znatno se razlikuju. S druge
strane, S. o. salonitana pokazuje izuzetnu slinost s populacijom S. trutta
(jadranske filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. S
obzirom na te rezultate, S. o. salonitana bi bila smjetena s S. trutta kao
njezina posebna linija.
Analizom

nuklearne

DNA,

sekvencioniranjem

gena

laktat

dehidrogenaze (LDH)-C1*, kod uzoraka mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz

rijeke Neretve uoili smo da nema varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci,
odnosno, naena je 100% identinost nukleotida.
Takav konflikt izmeu podataka dobivenih od mtDNA i nuklearne DNA
je ranije zabiljeen kod salmonidnih riba (Bernatchez i sur., 1995; Wilson i
Hebert, 1993), to bi u ovom sluaju moglo ukazivati na polifiletsko porijeklo
podvrste S. o. salonitana. Stoga smatramo da je solinka prirodna hibridna
vrsta, koja je nastala kao posljedica davne hibridizacije izvornog oblika
mekousne pastrve (S. obtusirostris oxyrhynchus) s naprednijom potonom
pastrvom, koja je mnogo kasnije kolonizirala rijeke jadranskog sliva.

121

6. LITERATURA
1.

Aganovi, M. (1979): Salmonidne vrste riba i njihov uzgoj. IGKRO

Svjetlost, Sarajevo.

2.

Alegria Hernandez V. (1985): A contribution to the study of

heterogeneity of the Adriatic sardine (Sardina pilchardus Walb.)
population. Acta Adriatica, 26: 109-122.

3.

Aliah R. S., Sato S., Taniguchi N. (2000): An Evaluation fo Genetic

Variability in Nishikigoi,

Cyprinus carpio, Stocks from Niigata

Prefecture, Based on Microsatellite DNA Markers. Suisanzishoku.

48(1): 25-31.
4.

Allendorf, F. W., Leary, R. F. (1988): Conservation and distribution of

genetic

variation

in

polytypic

species:

the

cutthroat

trout.

Conservation Biology, 2: 170-184.

5.

Allendorf, F. W., Leary, R. F., Spruell, P., Wenburg, J. K. (2001): The

problems with hybrids: setting conservation guidelines. Trends in
Ecology and Evolution, 16 (11): 613-622.

6.

Allendorf, F. W., Thorgaard, G. H. (1984): Tetraploidy and the evolution

of salmonid fishes. Evolutionary Genetics of Fishes, B. J. Turner,
Plenum Press, New York, str.: 1-53.

7.

Apostolidis, A., Karakousis, Y., Rryantaphyllidis, C. (1996): Genetic

divergence and phylogenetic relationships among Salmo trutta L.
(brown trout) populations from Greece and other European countries.
Heredity, 76: 551-560.

8.

Avise, J. C. (1994): Molecular markers, natural history and evoluton.

Chapman & Hall, Inc., New York.

9.

Avise, J. C. (2000): Phylogeography. The History and Formation of

Species. Harvard University Press, Cambridge, MA.

10.

Avise, J. C., Saunders, N. C. (1984): Hybridization and introgression

among species of sunfish (Lepomis): analysis by mitochondrial DNA
and allozyme markers. Genetics, 108: 237-255.

11.

Barton, N. H., Hewitt, G. M. (1989): Adaptation, speciation and hybrid

zones. Nature, 341: 497-503.

122

12.

Beaumont, M. A., Bruford, M. W. (1999): Microsatellites in conservation

genetics. U: Microsatellites: Evolution and Applications. (Goldstein, D.
B., Schltterer, C., urednici). Oxford University Press. str.: 165 182.

13.

Behnke, R. J. (1968): A new subgenus and species of truout:

Platysalmo platycephalus from southcentral Turkey with comments on
the classification of the subfamily Salmoninae. Mitt. Hmbg. Zool. Mus.
Inst., 66: 1 15.

14.

Behnke, R. J. (1986): Brown trout. Trout, 27: 42 47.

15.

Belkhir, K., Borsa, P., Goudet, J., Chikhi, L., Bonhomme, F. (1998):
GENETIX, logiciel sous Wimdows TM pour la genetique des
populations. Laboratoire Genome et Populations, CNRS UPR 9060,
University Montpellier II.

16.

Berg, L. S. (1908) Vorlufige Bemerkungen ber die europischasiatischen

Samoniden,

insvesondere

die

Gattung

Thymallus.

Annuaire du Muse Uoologieque de l'Academie Imperiale des

Sciences de St. Petersbourg 12: 500 514.
17.

Bernatcherz, L., Guyomard, R., Bonhomme, F. (1992): DNA sequence

variation of the mitochondrial control region among geographically and
morphologically remote European brown trout Salmo trutta populations.
Molecular Ecology 1: 161 173.

18.

Bernatchez, L. (2001) The evolutionary history of brown trout (Salmo

trutta L.) interred from phlylogenetic, nested clade, and mismatch
analyses of mitochondrial DNA variation, Evolution, 55 (2): 351 379.

19.

Bernatchez, L., Danzmann, R. G. (1993): Congruence in control-region

sequence and restriction-site variation in mitochondrial DNA of brook
charr (Salvelinus fontinalis Mitchill). Molecular Biology and Evolution,
10: 1002 1014.

20.

Bernatchez, L., Dodson, J. J. (1991): Phylogeographic structure in

mitochondrial DNA of the Lake whitefish (Coregonus clupeaformis) and
its relation to Pleistocene glaciations. Evolution, 45: 1016-1035.

21.

Bernatchez, L., Glemet, H., Wilson, C.,C., Danzmann, R.,G. (1995):

Introgression

and

fixation

of

arctic

char

(Salvelinus

alpinus)

mitochondrial genome in an allopatric population of brook trout

123

(Salvelinus fontinalis). Canadian Journal of Fisheries & Aquatic

Sciences 52, 1: 179-185.
22.

Bernatchez, L., Wilson,C. C. (1998): Comparative phylogeography of

Neoarctic and Paleoarctic fish. Molecular ecology, 7: 431-452.

23.

Berrebi, P., Duguid, A., Garcia-Marin, J. L., Guyomard, R., Ferguson

A., Hansen, M. M., Hindar, K., Koljonene, M. L., Laikre, L., Largiarder,
C., Martinez, P., Nielsen, E. E., Palm, S., Ruzzante, D., Ryman, N.,
Trianaphyllidis, C. (1999): Conservation genetic management of brown
trout (Salmo trutta) in Europe. (Second draft).

24.

Berrebi, P., Pov, M., Jesenek, D., Cattaneo-Berrebi, G., Crivelli, A. J.

(2000): The genetic diversity of native, stocked and hybrid populations
of marble trout in the Soa river, Slovenia. Heredity, 85 (3): 277-287.

25.

Bianco, P. G. (1990): Potential role of the palaeohistory of the

Mediterranean and Paratethys basins on the early dispersal of EuroMediterranean freshwater fishes. Ichtyoi. Explor. Freshwaters, 1 (2):
167 184.

26.

Bianco, P. G., Kneevi, B. (1987): The Leuciscus cephalus complex

(Pisces, Cyprinideae) in western Balcanic area. Proc. V Congr. Eur.
Ichthyol., Stockholm 1985, 49 55.

27.

Bonacci, O., Kerovec, M., Roje Bonacci, T., Mrakovi, M., Plenkovi
Moraj, A. (1998): Ecologically acceptable flows definition for the
rnovnica river (Croatia). Regulated Rivers - Research & Management,
14: 245-356.

28.

Bowling, A. T., Del Valle, A., Bowling, M. (2000). A pedigree-based

study of mitochondiral D-loop DNA sequence variation among Arabian
horses. Animal Genetics, 31: 1 7.

29.

Brown, W. M., George, M. J., Wilson, A. C. (1979): Rapid evolution of

animal mitochondrial DNA. Proceedings of the National Academy od
Scinces, USA, 76: 1967 1971.

30.

Brown, W. M., Prager, E. M:, Wang, A., Wilson, A. C. (1982):

Mitochondrial DNA sequences of primates: Tempo and mode of
evolution. Jurnal of Molecular Evolution, 18: 225 239.

124

31.

Bruford, M. W., Ciofi, C., Funk., S. M. (1998): Characteristics of

Microsatellites. U: Molecular Tools for Screening Biodiversity (Karp, A.,
Isaac, P. G., Ingram, D. S., urednici). Chapman & Hall, str.: 202 205.

32.

Brunner P. C., Douglas M. R., Bernatchez L. (1998). Microsatellite and

mitochondrial DNA assessment of population structure and stocking
effects in Arctic charr Salvelinus alpinous (Teleostei, Salmomidae) from
Central Alpine lakes. Molecular Ecology. 7: 209-223.

33.

Cables, L. (2001): Mitochondria. Horsepower. alsalkjlkjlkjlkjlkjsalkjlj

http://homepages.ihug.co.nz/~lcables/mitochondria.htm

34.

Campton, D. E. (1987): Natural hybridization and introgression in

fishes: Methods of detection and genetic interpretations. U: Population
Genetics and Fishery Management (Ryman, N., Utter, F., urednici).
Universety of Washington Press, Inc. Ann Arbor, MI: 242-258.

35.

Carvalho, G. R. (1993): Evolutionary aspects of fish distribution:

genetic variability and adaptation. J. Fish Biol., 43: 53-73.

36.

Carvalho, G. R., Hauser, L. (1998): Advances in the molecular analysis

of fish population structure. Ital. J. Zool., 65: 21-33

37.

Chakraborty, R., Kimmel, M., Stivers, D. N., Davison, L. J., Deka, R.

(1997): Relative mutation rates at di-, tri-, and tetranucleotide
microsatellite loci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1041 1046.

38.

Constable, J. J., Packer, C., Collins, D. A., Pusey, A. E. (1995):

Nuclear DNA from primate dung. Nature: 373 - 393.

39.

Crivelli A., Poizat G., Berrebi P., Jesensek D., Rubin J. F. (2000).
Conservation biology applied to fish: The example of a project for
rehabilitating the marble trout (Salmo marmoratus) in Slovenia.
Cybium. 24(3): 211-230.

40.

Crivelli, A. J. (1996): The freshwater fish enedmic to the northern

Mediterranean region. Le Sambuc, Arles, France.

41.

Cronin, M. A., Spearman, W. J., Wilmot, R. L. (1993): Mitochondrial

variation in Chinook (Oncorhynchus tsawytscha) and Chum salmon (O.
keta) detected by restriction enzyme analysis of Polymeraze Chain
Reaction (PCR) products. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic
Sciences, 50: 708 715.

125

42.

Delling B., Crivelli A. J., Rubin J-F., Berrebi P. (2000): Morphological

variation in hybrids between Salmo marmoratus and alien Salmo
species in the Volaria stream, Soca River Basin, Slovenia. Journal of
Fish Biology. 57: 1199-1212.

43.

Dirienzo, A., Peterson, A. C., Garza, J. C., Valdes, A. M., Slatkin, M.,
Freimer, N. B. (1994): Mutational processes of simple-sequence repeat
loci in human populations. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 91(8): 3166-3170.

44.

Domanico, M. J., Phillip, R. B., Oakley, T. H. (1997): Phylogenetic

analysis of the Pacific salmon (genus Oncorhynchus) using nuclear
and mitochondrial DNA sequences. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 54:
18651872.

45.

Dowling, T. E., Moritz., C., Palmer, J. D. (1990): Nucleic acids. II.

Restriction site analysis. U: Molecular Systematics, (Heillis,D. M.,
Moritz, C, urednici), Sinauer Associates, Sunderland, MA, str.: 25317.

46.

Dowling, T. E., Secor, C. L. (1997): The role of hybridization and

introgression in the diversification of animals. Annu. Rev. Ecol. Syst.,
28: 593 619.

47.

Drofejeva, E. A. (1989): The basic principles of classification and

phylogeny of the salmonid fishes (Salmoniformes: Salmonoidesi:
Salmonidae). Biology and phylogeny of fishes, St. Perersburg, USSR
Academy od Sciences: 5 16.

48.

Economidis P. S., Banarescu P. M. (1991). The Distribution and Origin

of Freshwater Fishes on the Balkan Peninsula, Especially in Greece.
Int. Revue. Ges. Hydrobiol. 76: 257 283.

49.

Estoup A., Presa P., Krieg F., Vaiman D., Guyomard R. (1993). (CT)n
and (GT)n microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo
trutta L. (brown trout). Heredity. 71: 488 - 496.

50.

Ford-Llyoyd, G. (1996): Measuring genetic variation using molecular

markers. University of Birmingham, Kevin Painting, IPGRI, Rome.

51.

Gavin P., Taggart J., Ferguson A., OFarrell M., Cross T. (1996).
Population genetics of Atalntic salmon (Salmo salar) in the River
Shannon system in Ireland. Canadian Jounal of Fisheries Sciences.
53: 1933-1942.
126

52.

Giuffra, E., Guyomard, R., Forneris,

G. (1996): Phylogenetic

relationships and introgression patterns between incipient parapatric

species of Italian Brown trout (Salmo trutta l. complex). Molecular
Ecology, 5 (2): 207-220.
53.

Glubokovsky, M. K. (1995) Evolutionary Biology of Salmonid Fishes.

Nauka, Moscow.

54.

Goudet, J. (1995): FSTAT (vers. 1.2): a computer program to calculate

F-statistic. J. Hered.: 485-486.

55.

Hadie, S. (1962): Ka poznavanju roda Salmothymus Berg. Izdanija,

T. III, 2, Specijalno izdanje, Skoplje.

56.

Hansen, M. M., Ruzzante, D. E., Nielsen, E. E., Mansberg, K. L. D.

(2001): Brown trout (Salmo trutta) stocking impact assessment using
microsatellite DNA markers. Ecological Appliocations, 11 (1): 148
160.

57.

Harrison, G. (1989): Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in

population and evolution biology. Tree, 4 (1): 6 12.

58.

Harrison, R. G. (1993): Hybrid zones and the evolutionary process.

Oxford University Press, New York.

59.

Heckel, J. J. (1851): Bericht einer ichtyologischen Reise. II. Beitrge zr

den Gattungen Salmo, Fario, Salar, Coregonus, Chondrostoma und
Telestes. Sitzungsbarrichte der Akademie der Wissenschoften. Wien:
347 390.

60.

Heckel,

J.,

Kner,

R.

(1857):

Die

Ssswasserfische

der

sterreichischen Monarchie. Wien.

61.

Hening, W. (1966): Phylogenetic systematics. Univ. Illinois Pres,

Urbana, str.: 263.

62.

Hurst, C. D., Bartlett, S. E., Davidson, W. S., Bruce, I. J. (1999): The

complete mitochondrial sequence of the Atlantic salmon, Salmo salar.
Gene, 239: 237 242.

63.

Hutchinson W. F., Carvalho G. R., Rogers F. I. (1999): A non

destuctive technique for the recovery of DNA from dried fish otoliths for
subsequent molecular genetic analysis. Molecular Ecology, 8: 893 894.

127

64.

Irwin, D. M., Kocher, T. D., Wilson, A. C. (1991): Evolution of the

cytochrome b gene of mammals. J. Fish Biol., 35: 687-701.

65.

Jankovi, D. (1961): Taksonomska i ekoloka ispitivanja na mekousnoj

pastrmci iz reke Bune. Bioloki institut NR Srbije. Zbornik radova,
Knjiga 5. Beograd, Nauno delo: 3 31.

66.

Jarne, P., Lagoda, P. J. L. (1996): Microsatellites, from molecules to

populations and beck. Trends in Ecology and Evolution. 11/10: 424
429.

67.

Johnson, G. D., Patterson, C. (1996): Relationship of lower

euteleostean fishes. U: Interrelations of Fishes (Stiassny, M. L. J.,
Parenti, L. R., Johnson, G. D., urednici). Academic Press, San Diego:
251-332.

68.

Jordan, W. C., Verspoor, E. (1993): Incidence of natural hybrids

produce gynogens and triploids when backcrossed to male Atlantic
salmon. Aquaculture, 57: 245-358.

69.

Karaman,

M.

(1966):

Beitrag

zur

Kenntnis

der

Salmoniden

Sdeuropas. Hydrobiologia, XXVIII, Fasc.1.

70.

Karaman, S. (1927): Salmonidi Balkana. Glasnik Skopskog Naunog

Drutva, Skoplje.

71.

Kendall, A. W., Behnke, R. J. (1984): Salmonidae: Development and

relationship. U: Ontogeny and Systematics of Fishes (urednik: Moser,
H. G.). Am. Soc. Ichthyol. Herpetol. Spec. Publ. 1, str.: 142-149.

72.

Kosori, ., Vukovi, T. (1969): Ispitivanje mogunosti hibridizacije

salmonidnih vrsta sliva Neretve. Ichtylogia, vol. 1, 1, Beograd.

73.

Kumar, S., Tamura, K., Jakobsen, I. B., Nei, M. (2001) MEGA2:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis software, Bioinformatics.

74.

Lewin, B. (2000): Genes VII. Oxford University Press, University of

Oxford, Oxford, United Kindom.

75.

Li, W. H., Grauer, D. (1991): Fundamentals of Molecular Evolutin.

Sinauer Associates, Sunderland, MA.

76.

Lu, G., Basley, D. J., Bernatchez, L. (2001): Contrasting patterns of

mitochondrial

DNA

and

microsatellite

introgresive

hybridization

128

between

lineages

of

lake

whitefish

(Coregonus

clupeaformis);

relevance for speciatin. Molecular Ecology, 10: 965-985.

77.

Lu, G., Bernatchez, L. (1999): Correlated trophic specialization and

genetic divergence in sympatic lake whitefish ecotypes (Coregonus
clupeaformis): support for the ecological speciation hypothesis.
Evolution, 53: 1491-1505.

78.

Magoulas, A., Zouros, E. (1993): Restriction-site heteroplasmy in

anchovy (Engraulis encrasiocholus) indicates incidental biparental
inheritance of mitochondrial DNA. Mol. Biol. Evol. 10 (2): 319 325.

79.

Maitland, P. S. (1995): The conservation of freshwater fish: past and

present experience. Biological Conservation, 72: 259-270.

80.

Mari, D. (1995): Endemic fish species of Montenegro. Biological

Conservation 72: 187 - 194.

81.

Mari,

S.

(2002):

Morfoloki

varijabiliteti

pastrmki

(subfamilija

Salmoninae) znaaj za bioloku konzervaciju. Magistarski rad,

Bioloki fakultet, Univerzitet u Beogradu.
82.

Mayr, E. (1963): Animal species and evolution. Harward University

Press, Cambridge.

83.

McMeel, O. M., Hoey, E. M., Ferguson, A. (2001): Partial nucleotide

sequences, and routine typing by polymerase chain reaction-restriction
fragment length polymorphism, of the brown trout (Salmo trutta) lactate
dehydrogenase, LDH-C1 *90 and *100 alleles. Molecular Ecology, 10:
29 34.

84.

McMillan, M., Wilcove, D. (1994): Gone but not forgotten: Why have
species protected by Endangered Species Act become extinct?
Endangered Species Update, 11: 5-6.

85.

Meffe, G. K. (1986): Conservation genetics and the management of

endangered fishes. Fisheries, 11: 14-23.

86.

Miller, L. M., Kapuscinski, A R. (1996): Microsatellite DNA Markers

Reveal New Levels of Genetic Variation in Northen Pike. Transactions
of the American Fisheries Society, 125: 971 - 977.

129

87.

Moritz, C. (1994): Applications of mitochondrial DNA analysis in

conservation: a critical review. Molecular Ecology, 3: 401-411.

88.

Moritz, C., Dowling, T. E., Brown, W. M. (1987): Evolution of animal

mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics.
Annu. Rev. Ecol. Syst., 18: 269-292.

89.

Moritz, C., Hillis, D. M. (1996): Molecular Systematics: Context and

Controverses. U: Molecular systematics. Sunderland, Sinauer, str. 113.

90.

Mrakovi, M., Kerovec, M. (1997): Slatkovodne ribe i krunouste

Hrvatske. portski ribolov, 2: 14-16.

91.

Mrakovi, M., Mieti, S., (1989): Status, distribution and conservation

of the salmonid Salmothymus obtusirostris (Heckel) and the cyprind
Aulopyge hugeli (Heckel) in Yugoslavia. Journal of fish biology, 37A:
241 242.

92.

Mrakovi, M., Mieti, S., Pov, M. (1995): Status od freshwater fish in

Croatian Adriatic river system. Biological Conservation, 72: 179 185.

93.

Neave, F. (1958): The orgin and speciation of Oncorhynchus.

Transactions of the Royal Society of Canada, Series 3, 52, (5): 25
49.

94.

Nei, M. (1972): Genetic distance between populations. American

Naturalist, 106: 283-292.

95.

Nei, M. (1987): Molecular Evolutionary Genetic. Columbia University

Press, New York.

96.

Nei, M., Tajima, F. (1981): DNA polymorphism detectable by restriction

endonucleases. Genetics, 105: 207-217.

97.

Nicholas, F. W. (1996): Introduction to Veterinary Genetics. Oxford

University Press.

98.

Norden, C. R. (1961): Comparative osteology of representative

salmonid fishes, with particular reference to the grayling (Thymallus
arcticus) and its phylogeny. J. Fish. Res. Bd. Can., 8: 679-791.

99.

OReilly, P. T., Hamilton, L. C., McConnell, S. K., Wright, J. M. (1996).

Rapid analysis of gnenetic variation in Atlantic salmon (Salmo salar) by

130

PCR mutiplexing of dinucleotide and tetranucleotide microsatellites.

Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 53: 2292-2298.
100.

Oakley, T. H., Phillips, R. B. (1999): Phylogeny of salmonine fishes

based on growth hormone introns: Atlantic (Salmo) and Pacific
(Oncorhynchus) salmon are not sister taxa. Molecular Phylogenetics
and Evolution, 11: 381 393.

101.

Ohno, S. (1970): Evolution by Gene Duplication. Springer Verlang,

Berlin

102.

Ohno, S. (1974): Chordata 1: Protochordata. Cyclostomata, and

Pisces. Animal Cytogenetics, Gebruder Borntrage, Berlin, 4: 1 92.

103.

Osinov, A. G. (1999): Salmonid fishes of the genera Salmo, Parasalmo

and Oncorhynchus: genetic divergence, phylogeny, and classification.
Journal of Ichthyology, 39: 571 587.

104.

Osinov, A. G., Lebedev, V. S. (2000): Genetic divergece and

phylogeny of the Salmoninae based on allozyme data. Journal of Fish
Biology, 57: 354-381.

105.

Oxnard, C. E. (1078): One biologists view of morphometrics. Ann. Rev.

Ecol. Syst., 9: 219-214.

106.

Page, R. D. M., Holmes, E. C. (1998): Molecular evolution, A

Phylogenetic Approach. Blackwell Science, Oxford.

107.

Palumbi, S. R., Baker, C. S. (1994): Contrasting population structure

form nuclear intron sequences and mtDNA of humpback whales.
Molecular Biology and Evolution, 11: 426-435.

108.

Park, L. K:, Morgan, P. (1994): Developments in molecular genetic

technique in fisheries. Review of Fish Biology and Fisheries, 4: 272
279.

109.

Perez, J., Martinez, J. L., Moran, P., Beall, E., Garcia-Vazquez, E.

(1999): Indentification of Atlantic salmon x brown trout hybrids with a
nuclear marker useful for evolutionary studies. Journal of Fish Biology,
54: 460-464.

110.

Phillips, R. P., Oakley, T. H. (1997): Phylogenic relationship among the

Salmonidae Based on Nuclear and Mitochondrial DNA Sequences.

131

Molecular systematics of fishes, San Diego, Academic Press: 145

162.
111.

Phillips, R.,B., Matsuoka, M., P., Konon, I., Reed, K, M. (2000):

Phylogenetic analysis of mitochondrial and nuclear sequences
supports inclusion of Acantholingua ohridana in the genus Salmo.
Copeia, 2: 546-550.

112.

Pipas, J. C., Bulow, F. J. (1998): Hybridization between redeye bass

and smallmouth bass in Tennessee Streams. Tran. Am. Fish. Soc,
127: 141-146.

113.

Popovi, J. (1985): Zatitimo nae endemine vrste riba. Ribarstvo

Jugoslavije, 40: 92-93.

114.

Poteaux, C. (1995): Interactions Genetiques entre formes sauvages et

formes domestiques chez la truite commune (Salmo trutta fario L.).
Dokt. Dis, Universite Montpellier II, Montpellier: 110.

115.

Poteaux, C., Bonhomme, F., Berrebi, P. (1999): Microsatellite

polymorphism and genetic impact of restocking in Mediterranean
brown trout (Salmo trutta L.). Heredity, 82 (6): 645-653.

116.

Pov, M., Jesenek, D., Berrebi, P., Crivelli, A. J. (1996): Soka pastrv
Salmo trutta marmoratus, Cuvier 1817, v poreju Soe v Sloveniji.
Zatitni nacrt.

117.

Presa, P. i Guyomard, R. (1996): Conservation of microsatellites in

three species of salmonids. Journal of Fish Biology, 49: 1326 1329.

118.

Queller, D. C., Strassmann, J. E., Hughes, C. R. (1993): Microsatellites

and kinship. Trends in Ecology and Evolution, 8/8: 285 288.

119.

Razpet, A., Jug, T., Sunik, S., Dov, P., Snoj, A. (2003): Molecular
evidence of natural hybridisation between Salmo obtusirostirs and
Salmo trutta in the river Neretva. 3rd congress of the genetic society of
Slovenia, Bled, 31. svibanj 4. lipanj, 2003, Zbornik saetaka: 54-55.

120.

Rhymer, J. M., Simberloff, D. (1993): Hiybids and hybrid zones:

historical perspective. U: Hybrid Zones and the Evolutionary Process
(Harrison, R. G., urednik). Oxford University Press, str.: 3-12.

121.

Rice, W. R. (1989): Analyzing tables of statistical tests. Evolution, 43:

223-225.
132

122.

Rieseberg, L, H. (1998): Moelcular ecology of hybridization. U:

Advances in Molecular Ecology (urednik: Carvalho, G. R.). IOS Press,
Amsterdam, str.: 243-265.

123.

Sakamoto, T., Okamoto, N., Ikeda, Y., Nakamura, Y., Sato, T. (1994):
Dinucleotide-repeat polymorphism in DNA of rainbow trout and its
application in fisheries science. Journal of Fish Biology, 44: 1093-1096.

124.

Saunders, R. L., Schom, C. B. (1985): Importance of the vaiation in the

life history parameters of atlantic salmon (Salmo salar). Canadian
Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 42: 625-618.

125.

Schltterer, C. (1998): Microsatellites. U: Molecular Genetic Analysis of

Populations, 2. izd. (Hoelzel, A. R., urednik). Oxford University Press.
str.: 237 261.

126.

Schltterer, C., Pemberton, J. (1994): Molecular Ecology and

Evolution: Approaches and Applications, Birkhauer Verlag Basel,
Switzerland, str.: 203 113.

127.

Schltterer, C., Tautz, D. (1992): Slippage synthesis of simple

sequence DNA. Nucleic Acids Research 20: 211 215.

128.

Schmidt, D. Y. (1947): Migrations of Fishes. USSR Academy of

Sciences, Leningrad.

129.

Schneider, S., Roessli, D., Excoffier, L. (2000): Arlequin ver. 2.000: A

software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry
Laboratory, University of Geneva, Switzerland.

130.

Shaposhnikova,

G.

C.

(1975):

Systematics

relation

of

some

representatives of the familiy Salmonidae. Ichthyologia, 7 (1): 61-70.

131.

Shedlock, A. M., Parker, J. D., Crispin, D. A., Pietsch, T. W., Burmer,

G. C. (1992): Evolution of the salmonid mitochondrial control region.
Molecular phylogenetics and evolution, 1, 3: 179 192.

132.

Simon, R. C., (1963): Chromosome morphology and species evolution

in the five North American species of Pacific salmon (Oncorhynchus).
Jour. Morphol. 112 (1): 77-95.

133.

Slatkin, M. (1995): A measure of population subdivision based on

microsatellite allele frequencies. Genetics, 139 (3): 1463.

134.

Slettan, A. (1995): GenBank Acc. no. Z49134.

133

135.

Smith, G. R. (1992): Introgression in fishes significance for

paleontology, cladistics, and evolutionary rates. Syst. Biol., 41: 41-57.

136.

Smith, G. R., Swirydczuk, K., Kimmel, P. G., Wilkinson, B. H. (1982):

Fish biostratiography of late Miocene to Pleistocene sediments of the
western Snake River plain, Idaho. Cenizoc Geology of Idaho. IBMG
Bulletin 26, str.: 519 541.

137.

Snoj, A. (1997): Molekularno bioloka karakterizacija soke postrvi

(Salmo marmoratus, Cuvier 1817). Dokt. Dis, Domale, Oddelek za
zootehniko: 7 9.

138.

Snoj, A. (2001): Preservation biology: a case of preserving Marble

trout. Winter School in Molecular Genetics, Lecture notes.

139.

Snoj, A. (2003): Molecular phylogeny of "arhaic trouts" and their

taxonomic classification. 3rd congress of the genetic society of
Slovenia, Bled, 31. svibanj 4. lipanj, 2003, Zbornik saetaka: 73-74.

140.

Snoj, A., Mareta, B., Sunik ,S., Melki, E., Megli, V., Dov, P.
(2002a): The taxonomic status of the sea trout from the north Adriatic
Sea, as revealed by mitochondrial and nuclear DNA analysis. Journal
of Biogeography, 29: 1179-1185.

141.

Snoj, A., Melki, E., Sunik, S., Muhamedagi, S., Dov, P. (2002b):
DNA phylogeny supports revised classification of Salmothymus
obtusirostris. Biological Journal of the Linnean Society, 77: 399 411.

142.

Snoj, A., Pohar, J., Dov, P. (1996): A set of new microstellite DNA
markers for Salmo marmoratus (Cuvire, 1817). Procedding of the 3rd
International Conference, Life Sciences 1996, Slovenija: 93-94.

143.

Snoj, A., Pohar, J., Dov, P. (1997): The first microsattelite DNA
marker for marble trout, BFRO001. Journal of Animal Sciences, 75:
1983.

144.

tambuk-Giljanovic, N. (2002.): Vode Cetine i njezina porjeja.

Biblioteka Zavoda za javno zdravstvo upanije splitsko-dalmatinske,
Split.

145.

Stankovi, S. (1960): The Balkan lake Ohrid and its living world.
Monographiae biologicaea, 9, Den Haag.

134

146.

Stearley, R. F., Smith, G. R. (1993): Phylogeny of the pacific trout and

salmons (Oncorhynchus) and genera of the family Salmonidae.
Transaction of the American Ficheries Society, 122: 1 33.

147.

Stefanovi, D. (1948): Rasna i ekoloka ispitivanja na ohridskim

salmonidima. Srpska Akad. Nauka. Kn. CXXXIX. Beograd.

148.

Steindachner, F. (1882): Ichthyologische Beitrge (XII). Akad. Der

Wissenschaften, LXXXVI, Band I, Heft II: 75-78. Wien.

149.

Stepien, C. A., Kocher, T. D. (1997): Molecul and morphology in studes

of fish evolution. U: Molecular systematics of fishes, (Kocher, T. D.,
Stepien, C. A., urednici), Academic Press, str.: 1 11.

150.

Strachan, T., Read, A. P. (1996): Human Molecular Genetics. Bios

Scientific Publication, Oxford.

151.

Stryer, L. (1995): Biochemistry, 4 th Ed Rerrman, New York.

152.

Sunik, S. (2001): Polimorfize kromosomske in mitohondrijske DNA

lipna (Thymallus thymallus) in filogenetski odnosi med njegovimi
geografsko loenim populacijami. Dokt. Dis, Domale, Oddelek za
zootehniko: 1315.

153.

Sunik, S., Snoj, A., Dov, P. (2001): Evolutionary distinctness of

grayling (Thymallus thymallus) inhabiting the Adriatic river system, as
based on mtDNA variation. Biological Journal of the Linnean Society,
74: 375-385.

154.

Sunik, S., Snoj, A., Pohar, J., Dov, P. (1997): The microsatellite
marker (BFRO002) characteristic for different geographically remote
brown trout, Salmo trutta L., populations. Animal Genetics, 28: 370383.

155.

Svrdson, G. (1945): Chromosome studies on Salmonidae. Report of

the institute of Freshwater Fisheries Research, Drottningholm 23: 1
151.

156.

Taberlet, P. (1999): Noninvasive genetic sampling: look before you

leap. Trend Ecol. Evol., 14: 323-327.

157.

Taler, Z. (1951): Mekousne. Slatkovodno ribarstvo Jugoslavije, 3: 60 64.

158.

Taler, Z. (1952): Problem reke Bune. Ribarstvo Jugoslavije. 7: 11-12.

135

159.

Taler, Z. (1953): Znamenite i osobite ribe u Bosni i Hercegovini.

Ribarski list, 28: 4.

160.

Taler, Z. (1954): Mekousna. Ribarski list, 29: 1.

161.

Tave D. (1993): Genetics for Fish Hatchery Managers. AVI Book, New
York, str.: 415.

162.

Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins,

D. G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for
multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic
Acids Research, 24: 4876-4882.

163.

Treer, T., Anii, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003a): Note on the
growth of endemic soft-muzzled trout Salmothymus obtusirostris
translocated into a Dalmatian river. Biologia, Bratislava, Section
Zoology, 58 (5): 999-1001.

164.

Treer, T., Anii, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003b): Growth and
condition of endemic trout Salmothymus obutusirostris in a Dalmatian
river Jadro. 4th World Fisheries Conference, Vancouver.

165.

Treer, T., Safner, R., Anii, I., Kolak, A., Drai, M. (2000):
Morphological variation among four strains of common carp Cyprinus
carpio in Croatia. Folia Zoologica 49 (1): 69 74.

166.

Treer, T., Safner, R., Anii, I., Lovrinov, M. (1995): Ribarstvo,

Nakladni zavod Globus, Zagreb.

167.

Utter, F. M., Seeb, J. E. (1990): Genetic marking of fishes: overview

focusing on protein variation. American Fisheries Society Symposium,
7: 426 438.

168.

Verspoor, E. (1988): Widespread hybridization between Atlantic

salmon, Salmo salar and brown trout, Salmo trutta, in eastern
Newfoundland. Journal of Fish Biology, 32: 327-334.

169.

Vida, G. (1994): Global issues of genetic diversity. U: Conservation

genetics (urednici: Loeschecke, V., Tomiukm J., Jain, S. K.).
Birkhauser Verlag.

170.

Vladykov, V. D. (1963): A review of salmonid genera and their broad

geographical distribution. Transactions of the Royal Society of Canada,
Series IV, Section III, 1: 459 504.
136

171.

Vukovi, T., Ivanovi, B. (1971): Slatkovodne ribe Jugoslavije

(Freshwater fish of Yugoslavia). Zemaljski muzej BIH, Sarajevo, str.:
115.

172.

Waples, R. S. (1991): Genetic risk associated with supplementation of

Pacific salmonids: Captive brodstock programs. Canadian Journal of
Fisheries and Aquatic Sciences, 51: 310-329.

173.

Weir, B. S., Cockerham, C. C. (1984): Estimating F-statistics for the

analysis of population structure. Evolution, 38: 1358-1370.

174.

Wheeler, A. (1992): Freshwater fishes of Britain and Europe. Rainbow

Books, London: 54 - 55.

175.

White, P. S., Densmore, III L. D. (1992): Mitochondrial DNA isolation.

V: A molecular genetic analysis of population. A practical approach.
New York, Oxford University press, str.: 37 43.

176.

Wilson, C. C., Hebert, P. D. N. (1993): Natural hybridization between

arctic charr (Salvelinus alpinus) and lake trout (S. namaycush) in the
canadian arctic. Canadian Journal of Fisheries & Aquatic Sciences, 50,
12: 2652-2658.

177.

Wright, S. (1951): The genetical structure of populations. Annals of

Eugenics, 15: 323-354.

178.

Zhang, D., Hewitt, G. (1996): Nuclear integrations: challenges for

mitochondrial DNA markers. Tree, 11, 6: 247 252.

137

7. SAETAK
Mekousna pastrva (Salmothymus obtusirostris salonitana) je endemska
pastrva sa izvornim stanitem u rijeci Jadro, pokraj Splita. Dio populacije
naknadno je prebaen i u rijeku rnovnicu, gdje i danas obitava. Pripada u
porodicu Salmonidae. Kao i ostale podvrste roda Salmothymus, ograniena je
na usko podruje rasprostranjenja, te i najmanji utjecaji na njeno stanite
imaju veliko djelovanje na malu populaciju.

Budui da je osnovni cilj naeg rada bio pronai i opisati genetske

razlike izmeu mekousnih pastrva S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus i
potone pastrve (Salmo trutta), prikupili smo uzorke triju populacija mekousne
pastrve koje obitavaju u rijekama jadranskog sliva (Jadro, rnovnica i
Neretva), te dviju populacija potone pastrve, koje pripadaju jadranskim
linijama pastrva (Krka i Zrmanja).

Sadanje populacije mekousnih pastrva su vrlo male i neprestano

bivaju ugroene od mnogih faktora. Zbog toga smo mogli analizirati mali broj
uzoraka. Svjesni smo da zakljuci izvedeni nakon analize malog broja
uzoraka nisu statistiki opravdani, no unato tome, oni su zanimljivi i temelj su
za nove rasprave i istraivanja. Dobivene rezultate stavili smo u odnos s
ranije istraenim linijama i vrstama pastrva, u oblik filogenetskog stabla.

Na podruju gdje zajedno ive esto je postojanje hibrida izmeu

potone i mekousne pastrve. Prepoznati hibride vrlo je teko, stoga su uz
morfoloke, koritene i molekularne metode razlikovanja populacija.
Usporeujui morfoloke osobine mekousne pastrve iz rijeke Jadro s
mekousnom pastrvom iz rijeke Neretve (S. o. oxyrhynchus), uoili smo mnoge
zajednike osobine i niz vidnih razlika. To ukazuje na njihovo zajedniko
srodstvo, kao i na posljedice prostorne i ekoloke izolacije.

138

Pomou genetskih markera i statistike analize pokuali smo definirati

strukturu populacije endemske mekousne pastrve iz rijeka Jadro i rnovnice
(S. o. salonitana).
Razlikovanje

genetske

varijabilnosti

provedeno

je

na

nivou

deoksiribonukleinske kiseline (DNA), pri emu su upotrebljena dva razliita

genetska sistema: mitohondrijska DNA, koja je jedan od najprimjenjenijih
alata za molekularno genetske i populacijske studije, te mikrosatelitska DNA,
koja zbog svoje lokusne specifine hipervarijabilnosti predstavlja odlian
molekularni alat, sa kojim je mogue utvrditi razlike na nivou roda, ali i niih
taksonomskih jedinca.

Analizom uzoraka S. o. salonitana iz Jadra i rnovnice, ustanovili smo

da uzorci dijele isti haplotip (ZRN), to je razumljivo budui da je populacija
mekousne pastve u rijeci rnovnici nastala odvajanjem dijela jedinki iz Jadra
prije 25 godina. Haplotip ZRN je prvi genetski marker koji opisuje populaciju
mekousne pastrve iz rijeka Jadro i rnovnice.
Populacije iz rijeka Jadro i rnovnice meusobno se znatno ne
razlikuju, a manjak polimorfizma u populaciji mekousne pastrve u rijeci
rnovnici posljedica je rekolonizacije s populacijom male efektivne veliine.

Analizom mikrosatelitiskih lokusa uoeno je da populacije mekousnih

pastrva iz Jadra i rnovnice imaju odreen broj zajednikih alela s potonom
pastrvom. Analizom su utvrena tri uzorka mekousne pastrve iz rijeke Jadro,
koja dijele zajednike alele s potonom pastrvom. Upravo ti uzorci smatramo
da su hibridi izmeu mekousne i potone pastrve.
Alele koji su znaajni za populacije mekousne pastrve u Jadru i
rnovnici pronali smo u populaciji mekousne pastrve u rijeci Neretvi.
Zajednike alele kod tih populacija tumaimo kao posljedicu istosmjernih
mutacija, te kao ostatak zajednikog, davnog polimorfizma.
Analizirajui

podvrstu

S.

o.

salonitana,

rezultati

bazirani

na

mitohondrijskoj DNA razlikuju se od onih dobivenih analizom nuklearne DNA.

139

Na osnovu podataka sekvencioniranja od citokroma b i kontrolne regije,

podvrste S. o. salonitana i S. o. oxyrhynchus, znatno se razlikuju, no sa druge
strane S. o. salonitana pokazuje izuzetnu slinost sa populacijom S. trutta
(jadranske filogenetske linije) koja obitava u istoj rijeci kao i Salmothymus. Sa
obzirom na te rezultate S. o. salonitana bila bi smjetena sa S. trutta kao
njezina posebna linija.

Sekvencioniranjem gena laktat dehidrogenaze (LDH)-C1* kod uzoraka

mekousne pastrve iz rijeke Jadro i iz rijeke Neretve, uoili smo da nema
varijabilnih mjesta u promatranoj sekvenci izmeu njih, odnosno naena je
100% identinost nukleotida. Takav konflikt izmeu podataka dobivenih od
mtDNA i nuklearne DNA je ranije zabiljeen kod salmonidnih riba, to je
mogue da u ovom sluaju ukazuje na polifiletsko porijeklo podvrste S. o.
salonitana. Smatramo da je podvrsta S. o. salonitana vjerojatno nastala kao
posljedica davne hibridizacije poetnog oblika S. o. oxyrhynchus i naprednije
S. trutta, koja je kolonizirala rijeke Jadranskog sliva mnogo kasnije.

140

8. SUMMARY
Endemic soft-muzzled trout (Salmothymus obtusirostris salonitana) inhabit
the Jadro River, near Split. Part of the population has been translocated to the
rnovnica River and belongs to the Salmonidae family, genus Salmothymus.
It has a very restricted distribution, so any interference with its habitat has a
negative influence on this small population.
The objective of our work was to find and describe genetic differences
between soft-muzzled trout (S. o. salonitana and S. o. oxyrhynchus) and
brown trout (Salmo trutta). Therefore, we collected samples of three
populations of soft-muzzled trout that inhabit the Adriatic rivers (Jadro,
rnovnica and Neretva), and two populations of brown trout (Krka and
Zrmanja).
Because the populations of soft-muzzled trout are very small and are
endangered by many factors, we were able to analyze only a small number of
samples. Hence, we are aware that our conclusions are not statistically
significant, but despite that, the results are interesting and may serve as a
base for new discussions and research. We have compared our results with
literature data from other authors in the phylogenetic tree form.
Hybrids are common in the area where brown and soft-muzzled trout
live together. It is very difficult to recognize them, so in addition to
morphological methods we have also used molecular methods to distinguish
populations.
In comparing morphological characteristics of soft-muzzled trout from
the Jadro River and soft-muzzled trout from the Neretva River (S. o.
oxyrhynchus), we have found many similarities but also many differences.
This is the result of their mutual relationship and also the result of the area
they cover in terms of space and ecological isolation.
We used genetic markers and statistical analysis to define the
population structure of soft-muzzled trout (S. o. salonitana) found in the Jadro
and rnovnica Rivers.
Distinction of genetic variability has been done at the DNA level. We
have used two different genetic systems: mitochondrial DNA (one of the most

141

useful tools for molecular-genetic and population studies), and microsatellite

DNA, (which, because of its locus specific hyper variability is an excellent
molecular tool for determining differences at the general level as well as on
smaller taxon units).
In analyzing S. o. salonitana samples from the Jadro and rnovnica
Rivers we have learned that those samples share the same haplotype (ZRN).
This is understandable because soft-muzzled trout populations from the
rnovnica River are the result of separation from a part of the population from
the Jadro River 25 years ago. Haplotype ZRN is the first genetic marker that
describes the population of soft-muzzled trout population from the Jadro and
rnovnica Rivers.
There are no significant differences between the populations of softmuzzled trout from the Jadro River and those from the rnovnica River. The
lack of polymorphism in soft-muzzled trout populations from the rnovnica
River is the result of recolonization with small-sized but effective populations.
By analyzing microsatellite locuses, we have determined the number of
shared alleles between the soft-muzzled trout populations from the Jadro and
rnovnica Rivers and the brown trout population. The samples with shared
alleles are the hybrids between the soft-muzzled and the brown trout. We
concluded that the presence of mutual alleles was the result of an crossing
between these two species and of mutual mutation.
The important alleles for soft-muzzled trout populations from the Jadro
and rnovnica Rivers have also been found in soft-muzzled trout populations
from the Neretva River. We believe the shared alleles from those populations
result from mutual mutations and from the remains of mutual, ancient
polymorphism.
While analyzing the subspecies S. o. salonitana, the results based on
mitochondrial DNA proved to be different from those obtained from nuclear
DNA.
The results of cytochrome b gene and control region of mtDNA
sequencing showed that there are many differences between the subspecies
S. o. salonitana and S. o. oxyrhynchus. On the other hand, S. o. salonitana
shows great similarity with S. trutta population (Adriatic phylogenetic line)
which as Salmothymus, inhabits the same river.
142

Those results taken into consideration, S. o. salonitana should be

positioned with S. trutta as its special line.
Sequencing (LDH)-C1* gene in the samples from the Jadro and
Neretva Rivers, the analyzed sequence showed no variable spots; moreover,
a 100% nucleotide identity was found.
This data conflict between mtDNA and nuclear DNA was documented
previously with salmonid fishes. It is possible that in this case it reflects the
polyphyletic origin of subspecies S. o. salonitana. We think that the
subspecies S. o. salonitana was the result of an ancient hybridisation of the
initial form of S. o. oxyrhynchus and advanced S. trutta that colonized the
Adriatic rivers much later.

143

9. IVOTOPIS
Tea Odak roena je 28. 12. 1974. godine u Splitu, gdje je zavrila osnovnu
i srednju kolu. Godine 1993. upisala se na Agronomski fakultet u Zagrebu,
gdje je 2000. obranila diplomski rad.
Od 2000. stalno je zaposlena na Zavodu za ribarstvo, pelarstvo i
specijalnu zoologiju pri Agronomskom fakultetu, gdje upisuje i poslijediplomski
studij iz Ribarstva.
Kao asistent aktivno sudjeluje u nastavi na predmetima zoologije,
hidroekologije, ihtiologije, ribarstva i lovstva.
Posjetila je mnoge znanstvene institucije u ekoj, Maarskoj, Poljskoj,
Sloveniji i Kini, sudjelovala je na strunim i znanstvenim skupovima.

144

Popis radova:
Odak, T., Treer, T. (2000): Pregled istraivanja vodenih makrofita u
Hrvatskoj. Ribarstvo, 58 (3), 101-109.
Safner R., Treer T., Anii M., Piria M., Odak T. (2001): Ribolovnogospodarska osnova RU ZRD Zagreb. Agronomski fakultet, Zagreb, 38.
Piria, M., Treer, T., Safner, R., Anii, I. & Odak, T. (2001): Metodika
istraivanja prirodne prehrane slatkovodnih riba. 37. znanstveni skup
Hrvatskih agronoma. Opatija, 19.-23. veljae, 2001. Zbornik saetaka.
Piria, M., Treer, T., Safner, R., Anii, I. & Odak, T. (2001): Metodika
istraivanja prirodne prehrane slatkovodnih riba. Ribarstvo, 59 (1), 9-23.
Treer, T., Odak, T., Safner, R., Anii, I., Piria, M. & Kolak, A. (2001):
Bioloka raznolikost u hrvatskom slatkovodnom ribarstvu. HAZU, Bioloka
raznolikost u stoarstvu republike Hrvatske, 18.-19. rujna, Zbornik radova,
131-139.
Odak, T., Treer, T., Anii, I., Safner, R. & Piria, M. (2002): The use of
molecular methods in fisheries. I. Hrvatski kongres za molekularne
bioznanosti uz meunarodno sudjelovanje, 9.-13 June, Opatija, Zbornik
saetaka.
Odak, T., Treer, T., Anii, I., Safner, R., Piria, M. (2002): Primjena
molekularnih metoda u ribarstvu. Ribarstvo, 60 (3), 116-126.
Treer, T., Safner, R., Anii, I., Piria, M. & Odak, T. (2002): The introduction
of the fish from the Danube area into the Mediterranean Vransko lake,
Croatia. EIFAC, Symposium on inland fisheries management and the
aquatic environment The Effect of Fisheries Management on Freshwater
Ecosystems. Windermere, United Kingdom, 12-15 June.
Debeljak, Lj., Faai, K., Odak, T. (2002): Djelovanje vodnih makrofita na
proizvodnju arana. III. Nacionalno znanstveno-struno savjetovanje s
meunarodnim sudjelovanjem, 20.-21. lipnja, 2002., Bizovac, Zbornik
saetaka.

145

Snoj, A., Sunik, S., Odak, T., Safner, R., Dov, P. (2003): Phylogenetic
relationship between two subspecies of soft-mouth trout: Salmothymus
obtusirostris oxyrhynchus and S. obtusirostris salonitana. Plant and
genomes XI conference, 11.-15. Sijeanj, 2003., San Diego, CA, Zbornik
saetaka.
Odak, T., Treer, T., Safner, R., Anii, I., Piria, M. (2003): Mekousna pastrva
(Salmothymus obtusirostris salonitana) u rijeci rnovnici. 38. znanstveni
skup Hrvatskih agronoma. Opatija, 19.-21. veljae, 2001., Zbornik
saetaka.
Treer, T., Varga, B., Safner, R., Anii, I., Piria, M., Odak, T. (2003): Growth
of the common carp (Cyprinus carpio) introduced into the Mediterranean
Vransko Lake. J. Appl. Ichthyol., 19, 1-5.
Debeljak, Lj., Faai. K., Odak, T. (2003): Relations between the
developmnet of submersed macrophytes and carp production in fishponds.
Bulletin VURH Vodnany, 4, 175-180.
Bakota, R., Treer, T., Odak, T., Mrakovi, M., aleta, M. (2003): Struktura i
kondicija ihtiofaune Lonjskog polja. Ribarstvo, 61 (1), 17-26.
Treer T., Anii I., Safner R., Odak T., Piria M. (2003): Note on the growth of
endemic soft-muzzled trout Salmothymus obtusirostris translocated into a
Dalmatian river. Biologia, Bratislava, Section Zoology, 58 (5): 999-1001.
Treer, T., Anii, I., Safner, R., Odak, T., Piria, M. (2003): Growth and
condition of endemic trout Salmothymus obutusirostris in a Dalmatian river
Jadro. 4th World Fisheries Conference, Vancouver.
Treer, T., Opaak, A., Anii, I., Safner, R., Piria, M., Odak, T. (2003): Growth
of bream, Abramis brama, in the Croatian section of the Danube. Czech J.
Anim. Sci., 48 (6), 251-256.

146

10.

PRILOG

Prilog 1: Pregled mikrosatelitskih lokusa BFRO001, BFRO002, Ssa197,

Strutta24, Str591INRA, Strutta58, OmyFgt1TUF, SsoSL438 i StMS-LDH4.
Sa zvjezdicom su oznaeni uzorci na kojima su vrena morfometrijska
istraivanja.

BFRO001

Ssa197

Strutta24

Str591INRA

Strutta58

OmyFgt1TUF

140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
145/145
140/140
140/140
140/140
125/140
140/140
140/140
140/140
125/140
140/140

141/145
141/141
141/141
141/145
141/145
145/145
145/145
141/145
141/145
141/145
145/145
141/145
145/145
132/145
145/145
132/145
141/145

202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/206
202/202
202/202
192/206
202/202
202/206
202/202

169/171
171/171
171/171
171/173
171/171
171/173
171/171
171/171
171/171
171/173
171/173
149/171
149/171
171/171
171/171
171/171

147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/151
147/147
147/175
147/147

206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206

198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198
198/198

140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140
140/140

141/145
141/145
141/145
141/145
141/145
141/145
141/141
141/145
145/145
145/145
145/145
145/145
145/145
141/145
141/145
145/145
141/141

202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/202
202/206
202/202
202/206
202/202

171/171
171/171
171/173
171/173
171/173
171/171
171/173
171/171
171/171
171/171
171/171
171/171
171/171
171/171
171/171
171/171
171/171

147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147
147/147

206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206

111/123
123/123
123/123
111/123

123/125
111/123
111/111
111/125
123/123
111/125
111/125
111/125
125/125
111/123

237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237

214/244

116/116

132/132

180/212

159/159

158/166

226/245

104/106

253/265

Jadro mekousna
J2
198/198
J3*
198/198
J4
198/198
J5
198/198
J6
198/198
J7*
198/198
J8
198/198
J9
198/198
J10
198/198
J11*
198/198
J12
198/198
J13
198/214
J14
198/198
J15
198/202
J16
198/198
J17
198/202
J18
198/198
rnovnica
mekousna
1
4
5
6
7
9
11
12
13
14
15
17
19
20
21
22
23
Krka
potona
K1

SsoSL438

StMSLDH4

BFRO002

123/125
123/125
123/123
123/123
125/125
123/125
123/123
123/123
109/125
125/125
123/123
111/123
123/123
123/123

111/111

237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/237
237/276
237/237
237/276
237/237
237/237
237/237

147

K2
K3
K4
K5
K6
K7
K8
K11
Krkic 2
Krkic 3

238/242
222/246
222/242
222/238
242/242
222/242
222/246
242/242
222/242
222/246

116/116
116/116
116/116
116/116
116/116
116/116
116/116
116/116
116/116

132/154
137/154
132/154
150/154
154/159
132/154
154/211
137/154
132/156
132/215

208/224
224/224
212/218
212/224
224/224
180/224
220/220
206/214
214/222
214/214

159/171
159/159
159/183
159/159
171/183
159/159
183/193
159/183
149/159
159/183

166/168
166/170
158/166
104/170
166/166
104/158
145/166
151/166
145/175
104/166

Zrmanja
potona
Zrm1
Zrm2
Zrm4
Zrm6

226/256
230/258
226/230
226/242

Neretva
mekousna
MP3
MP6
MP8
MP9
MP12
MP13

206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206

218/218

106/114
106/109
106/106
104/114
98/106

253/253
247/253
253/253
253/265
247/253
247/265
253/265
253/265
253/253
253/265

116/116
116/116
116/116
116/116

137/163
159/171
159/167
159/163

200/214
200/214
200/200
200/200

189/189
189/189
189/189
189/189

187/187
181/181

241/241
241/241
245/245
241/245

104/104
104/104
104/104
104/104

247/265
247/265
247/265
247/265

131/131
135/135
133/137
133/137
131/133
135/135

155/175
175/179
159/179
145/175
175/183
179/183

176/176
176/176
176/196
176/176
176/176
172/178

171/171
159/171
171/173
159/171
171/171
171/171

93/93
91/95

206/206
206/206
206/206
206/206
206/206
206/206

116/120
116/120
118/120
116/120

237/237
237/245
245/245
237/245
237/237
237/245

91/93
93/93
93/93

218/226
226/226
226/226
204/204
218/226
226/226

104/106
106/109
96/106
106/114

111/116

148