1

1. BYOTEKNOLOJNN TANIMI
Biyoteknoloji terimi ilk olarak Macaristanl mhendis Kroly (Karl) Ereky
tarafndan 1909 ylnda kullanld. Karl Ereky biyoteknolojiyi;
Mikroorganizmalar yardmyla ham maddeden rn elde etmek amacyla
kullanlan bir dizi teknikler gurubu olarak ifade etti ve Biotechnology of Meat,
Fat and Milk Production in an Agricultural Large-Scale Farm adl kitabn
1919 da Berlinde yaynlad (Fri ve Kralovnszky, 2006).
Amerikan bilim ve teknoloji aratrma kurumu tarafndan yaplan
tanmlamaya gre bioteknoloji; Canl organizmalar veya onlarn rnlerini
kullanarak yeni rnler modifiye etmek veya retmek yoluyla verimlilii
artrmak veya spesifik amalar iin mikroorganizmalar elde etme iin kullanlan
herhangi bir tekniktir.
1990 ylnda yaplan bir tanma gre biyoteknoloji: Canl materyal
zerinde yaplan ok sayda ve deiik maniplasyonlar (rnegin; genetik,
reme ve metebolizma ile ilgili maniplasyonlar) ifede eden komplike bir
terimdir (Brand, 1990).

1.1. BYOTEKNOLOJNN TARH

250 bin yldan beri dnya zerinde Homo sapiens olarak bilinen nsan tr
yaamaktadr. Bu srenin ounu insan avclk ve toplayclkla geirdi (Resim
1.1.).

Resim 1. 1. Avc (a) ve toplayclkla insan (b).

nsann evrim srecinde zaman zaman devrim niteliginde deimeler oldu. Bu

deimelerden en nemlisi avc ve toplayc insann bitkileri ve hayvanlar
evciletirip zirai faliyete balayarak yiyecek remesidir. Bu tarmsal devrim ya
 2

da neolitik devrim olarak ifede edilmektedir. Neolitik devrimin oluumunu

salayan durumlar hakkndaki mevcut bilgiler 40-50 bin yl ncesi vuku bulan
byk deyimeleri inceleme konusunda nemli derecede yardmc olur. Neolitik
devrim yalnzca Homo sapiens olarak bilinen insan trnn baarsyd (Bar-
Yosef, 1998).
Neolitik devirdeki insanlarn yiyecek retme faaliyeti muhtemelen bilinli
ve planl yaplan bir faaliyet deildi nk neolitik adaki ilk iftcilerin
evrelerinde bilinli yiyecek retmelerini salamaya model oluturacak iftlikler
yoktu. Ksaca neolitik adaki iftcilerin aba gstermeleri gereken bir
evciletirme amalar da yoktu. Onlar yalnzca yiyecek retme maksadyla
evciletirme yaptlar ve bu evciletirmenin kendilerine ne getirecegini ve
sonularnn ne olacan ngremediler.
Buzul ann sonunda iklimde meydana gelen tahmin edilemeyen byk
deimeler, avclarn tercih ettigi byk av hayvanlarnn saysndaki azalmalar
ve uygun habitatlarn insanlar tarafndan igali avclk ve toplayclk
davrannn deimesine sebep oldu (Binford, 1968; Flannery, 1969). Yiyecek
salamadaki belirsiz durumlarn etkilerini azaltmak iin insanlar diyet
tercihlerini genileterek kk av hayvanlarn ve bitkileri de diyet tercihlerine
eklediler (Binford, 1968; Stiner ve ark., 2000). Nihayet insanlar ellerindeki
vahi budaygilleri daha verimeli habitatlarda ekimini yapmaya baladlar
(Hillman ve Davies, 1990). Evciletirmeyle avclkla yaamn devam ettiren
insanlar yerleik dzene geip, tarmla uramaya balaladlar (Harlan, 1979:
Zeder, 2006). Tarmn yapld yerlerde evciletirlen bitki ve hayvanlarn yabani
akrabalar doal olarak o blgede bulunuyordu. nsanlar ilk nce evrelerindeki
bitkileri evciletirdiler sonra srayla evrelerinde bulunan koyunu, keiyi,
domuzu ve sr evciletirdiler (Flannery, 1983; Smith,1995; Legge ,1996).
Arkolojik bulgular ilk buday ve arpa ziraatnn rann gney batsndaki
Huzistan blgesini, Irak, sraili, Suriyeyi ve Anadolunun gney dousunu iine
alan corafyada milattan 8000 nce yapldn gstermektedir (Harlan ve
Zohary, 1966). Haclar (Burdur) ve atal hykte (umra), milattan 6000-7000
yl nce arpann ekildiini arkolojik almalar gstermektedir (Harlan, 1979).
Evciletirme insann avclk ve topayclktan yerleik dzene gemesini
salamtr. Gnmzde halen insanlar 13000 yl nce insanlarn
evciletirdikleri bitki ve hayvanlarla besleniyorlar.
Tarmm ilk yapld yerlerde ortaya kan ilk iftcileri lokal toplayc ve
avc insalara kar rekabet stnlg saladlar, yayldlar ve yaadklar
blgenin dna tatlar. Avc ve toplayc insanlar ldrp onlarn yaad
verimli habitatlar igal ettiler. Bu nedenle bitki ve hayvanlarn evciletirilmesi
kresel demorafinin deiimine neden olan ve uygarln gelimesini salayan
nemli bir balangtr. Halen modern dnyada insanlar iin ekonomik deeri
olan buday, arpa, bezelye, koyun, kei, sr ve domuz doal olarak
Mezopotamyada yayorlard. Milattan 8500 yl nce Mezopotamyadaki avc ve
toplayc insanlar evrelerinde bulunan bitkileri ve hayvanlar evciletirerek
 3

dnyann ilk iftcileri oldular (Diamond, 1997; Lev-Yadun, ve ark., 2000;

Smith, 2001). Bu yiyecek retebilmesinin balangcyd ve bu durum o
insanlara dnyada ilk metal aralarn iadn, ilk yaznn iadn, ilk
imparatorluklarn ve profsynel ordularn oluturmasn salad. Bu insanlarn
avc ve tolayc insanlara kar igal vastalarna sahip olmas sonucu
gezegendeki verimli topraklar igal ettiler genlerini Avrupaya, Kuzey
Amerikaya, Kuzey Afrikaya, Hindistana ve Orta Asyaya yaydlar. Tarihte niin
belli toplumlar iyi ve kt zamanlar atlatp gnmze kadar yaama ans
yakalarken nicin baz toplumlar yok olup gittiler sorusu aslnda basit bir soru
deildir. Tarih zaten bir tarafta kazananlarn ve dier tarafta ise hep
kaybedenlerin olduu olaylar plgdr.
Gemite insanlarn hayvan yetitiricigi konusanda (bakm, besleme,
barndrma ve seleksiyon) yaptklar uygulamalar hakknda pek birey
bilinmiyor. Fakat Msrllarn, Babillilerin ve Romallarn hayvanlarn verim
potansiyelini artrmaya ynelik bir takm seleksiyonlar yaptklar ifade
edilmektedir.
sann doumundan nce, 35004000 ylllar arasnda, fermantasyon
teknii kullanlarak alkoll iecekler (Bira ve arap) retildi. Babiller ve
Smerler ilk biray milattan 4000 yl nce rettiler, nk ekerin funguslar
tarafndan alkole dntrleceini biliyorlard. Asurlular ilk arap retimini
isann doumundan 3500 yl nce gerekletirdiler. sann doumundan 4000
yl nce; inliler yourt yapmak iin laktik asit bakterilerini, peynir yapmak
iin funguslar, sirke ve arap yapmak iin ise asetik asit bakterilerini
kullanmlardr (Demain ve Fang, 2000).
Milattan 1500 yl sonra; istenilen zellikler sahip, hastalklara dayankl
bitkiler gelecekte oaltlmak amacyla toplanlm ve bylece ilk bitki gen
bankas kurulmutur. Bu alanda Rus genetiki Nikolai I. Vavilov budaygilleri
de iine alan bitkisel gen kaynaklar zerine planl almalar yapt.
On dokuzuncu yzylda mikroorganizmalarn kefi, pastrizasyon, Gregor
Mendelin 1866 ylnda tohum ve bitki zerine yapt genetik almalar
biyoteknolojide salanan nemli gelimelerdir.
Yirminci yzyln banda; Niastadan aseton elde etmeyi salayan
fermantasyon tekniinin gelitirilmesi ve retilen asetonun otomobil boya
sanayinde kullanlmas ile biyoteknoloji; ziraat ve sanayiyi bir araya getirdi.
1929 ylnda Aleksandr Fleming tarafndan penisilinin bulunmasyla
bilim adamlarnn dikkati farmakolojiye kayd. Bu dnemde savalar sz konusu
olduu iin bilim adamlar olas bir biyolojik savatan korunmak maksadyla
geni apl antibiyotik retimi iin fungus ve bakteriler zerine almalarn
younlatrdlar (Brown, 1995).
19301952 yllar arasnda bilim adamlar daha ok genler ile proteinler
arasndaki ba zerine dikkat vererek genlerdeki mutasyonlar ile proteinlerdeki
aminoasit dizisi arasndaki direkt ilikiyi buldular.
 4

1950li yllarda britanyal Maurice Wilkins, Rosalind Franklin, Francis H.

C. Crick ve Amrikal James D. Watson DNAnn kimyasal yapsn kefederek
molekler biyolojide yeni bir sayfa atlar. Amrikal James D. Watson ve Crick
DNA moleklnn bir modelini oluturdular. Kaltmn genler tarafndan
determine edildiini ispatladlar.
1957 ylnda Amerikal Arthur Kornberg DNAy test tpnde
sentezlemeyi baard. 1963 ylnda Britanyal F. Sanger DNA zincirindeki
nkleotidleri sra ile belirleme prosedr gelitirdi. 1966 ylnda genetik kod
kefedildi bylece bilim adamlar DNA zerinde alarak karakterleri tahmin
etme imkn yakaladlar. Bu da genetik mhendisliinin douunu salad.
1972 ylnda Amerikal Paul Berg ilk rekombinant DNA molekln
sentezledi. 1983 ylnda Amerikal Barbara McClintock genlerin kromozom
zerinde yer deitirdiini ispatlad ve yapt almaya Nobel dl verildi.
1980li yllarn sonlarna doru uluslararas bir bilim kurulu insan
genomundaki genlerin yerini belirlemeyi ama edinen bir proje zerinde
almaya baladlar. 1990 ylnda ilk gen terapisi uyguland.
1993 ylnda Dr. Kary Mullis polimeraz zincirleme reaksiyonunun
prosedrn kefetti ve yapt bu alma Nobel dlne layk grld.
1994 ylnda tad ve raf mr uzun olan ilk transgenik domates elde edildi.
1997 ylda ilk klonlanm kuzu (Dolly) elde edildi.
2000 ylnda J. Craig Ventor ve Francis Collins insan DNAsnn
tamamnn nkleotid zincirini belirlediklerini ilan ettiler.

1.2. BYOTEKNOLOJNN HAYVACLKTAK NEM

Gnmzdeki endokrinoloji, hcre ve embriyoloji konularndaki bilgi birikimi
hayvancl biyoteknoloji ile tantrd. St srclnda, tavukulukta
bioteknolojiden yararlanlmaktadr. Sr somatotropini (Byme hormonu)
kullanlarak yem tketiminde herhangi bir deiiklik olmadan st verimi
artrlmaktadr. Ayrca tavuklar iin ise yeni byme faktrleri konusunda
aratrmalar devam etmektedir.
Hayvanlarn genetik potansiyellerinden daha fazla yararlanmak mmkn
olabilir. Hayvanlardaki mevcut reme kapasitesini belirleyen binlerce sex
hcresi diinin veya erkein vcudu ierisindedir fakat optimum seviyede
kullanlmamaktadr. rnein bir koyunun ovaryumu 230,000120,000
primordial folikl ihtiva eder fakat bunlarda sadece 250-1500 byme
kabiliyeti gsterir (Mariana ve ark., 1991) geri kalanlar dejenerasyona urar. Her
folikl bir oosit (yumurta) ierirdiine gre neredeyse bir koyun ovaryumundaki
mevcut oositlerin yaklak %99u kaybedilmektedir. 1987 ylndan beri, canl
hayvanlarda olgunlamam oositlerin kltrde olgulatrlmas, dllenmesi,
embriyonun gelimesi ve alcya transferi mmkn olmaktadr (Kruip, 1990). Bu
ekilde mevcut genetik materyallerden daha iyi ekilde yararlanlabilir. n-vitro
koullarda olgunlatrlan oositler embriyo klonlama iin kullanlabilirler.
 5

Embriyoya muamele edip bir embriyodan bir ka embriyo oluturularak

ineklerden daha fazla yavru alnabilir. Bu teknik sayesinde iyi genotipte saf inek
stoku oluturulabilir bu yolla tarmn geri kald lkelerde ksa srede tarmsal
ilerlemeyi salamak mmkndr.
Son zamanlarda gen klonlamann gndeme gelmesiyle biyoteknoloji daha
fazla dikkat ekmitir. Bahsedilen mikrop kltryle salanan farmakolojik
maddelerin retimi; kullanlan mikroplarn doal kabiliyetiyle snrldr. Birok
nemli ila ok hcreli organizmalar tarafndan retilmektedir. Kltr yoluyla
mikroorganizmalardan ie yarayan farmakolojik maddeler retmek mmkn
olabilir. Bu durum; gen klonlamann biyoteknolojide kullanmn gndeme
getirmitir. Gen klonlamann esas; herhangi bir proteine ait genin bir vektre
(plazmite veya virse) eklenerek bakteriye transfer edilmesidir ( ekil 1.2.1).
 6
Hayvan hcresi stenen proteini
reten gen alnr

Vektre(Plazmide)
yklenir

DNA zerindeki zel

genin yeri belirlenir
mRNA
Rekombinant
Protein

Proteini reten
Mutant bakteri

Resim 1.2.1., Rekombinant DNA yntemiyle memelilere ait yarayl proteinler (rnek olarak;
inslin) ve alar bakteriler tarafndan retilebilir.

Mikroorganizmalar zerinde yaplan genetik maniplasyonlar sayesinde alar

retilmektedir.
Biyoteknoloji sayesinde daha etkili yeni ilalar gelitirilerek hayvanlarn
bakteriel ve paraziter hastalklara kar korunmas salanm bylece retim
maliyeti drlmtr. rnein: Bilim adamlar biyoteknoloji yardmyla ap,
brusella, kudus ve dier hastalklar iin yeni alar ile hayvanlarda kullanlan
antibiyotiklerin yerini alan yeni anti-bakteriel ilalar kefettiler.
Hastalklarn tehisinde biyoteknolojiden faydalanlmaktadr gnmzde
gelitirilen piyasaya sunulan diyagnostik test kitleri yardmyla hastalklarn
tehisi abuk yaplmaktadr.
Biyoteknoloji sayesinde transgenik hayvanlar elde edilebilir. DNA doal
olarak niversaldir nk DNA zerindeki drt degiik baz (Adenin, Guain,
Timin, Stozin) tm canllarda ayndr. Bu nedenle bir canlya ait gen dier bir
canlda da ayn fonksiyonu gsterir. Bu ekilde yeni bir genin herhangi bir
canlya ait genoma ilavesi sonucu oluan canl transgenik veya genetik olarak
modifiye edilmi canldr. Bu metotla transgenik st srlar elde edilerek stte
yeni ve yarayl proteinlerin mevcudiyeti salanabilir.
Hemofili genetik bir hastalktr, eklemlerin ve kaslarn iinde ara sra
grlen epizodik kanamalarla kendini gsterir. Bu kanamalar daha sonra
enfeksiyona urar. Hasta bacaklarn ve kollarn kullanamaz hale gelir. Bu
hastalarda kann phtlamasn salayan Faktr VII (Hemofili A) veya Fiks
(Hemfili B) genleri yoktur. Hastalk kz ocuklarnda 1/5000 orannda
grlrken erkek ocuklarda 1/23000 orannda grlr. Bu insanlardaki
 7

kanamalarn durmas problemdir. Hemofili hastalnn tedavisi pahaldr. Bu

durum saflatrlm Faktr VII ve Fiks proteinlerinin fyatnn ok yksek
olmasndan kaynaklanr. Bu nedenle gelimekte olan lkelerde bu hastalarn
%80I tedavi edilemez. Bu proteinleri rekombinanat yolla bakterilerden veya
hayvan hcrelerinden kltr ortamnda elde etmek mmkndr fakat talebi
karlayacak ekilde yeterterli ve saf elde etme zorluu var. Bu proteinlerin
tarnsgenik yolla domuz stnde bulunmasn salamak mmkndr. Domuzlar
fazla miktarda st retliyorlar, bu ekilde protein fazla miktarda retilmi
olacak. Ayn zamanda bu proteinlerin domuz stnden ayrlmas ve saflatrlmas
daha kolaydr. Domuz stnden ayrlan bu proteinlerin biyokullanl da
bakteri ve hcre kltr sonucu elde edilen proteinlerden yksektir (Lubon ve
ark., 1996; Paleyanda ve ark., 1997; Lindsay ve ark., 2004).

REFERANSLAR
Bar-Yosef, O. 1998. On the Nature of Transitions: the Middle to Upper Palaeolithic and the Neolithic
Revolution. Cambridge Archaeological Journal 8(2), 141-63
Brand A., (1990) Biotechnology in perspective. Tijdschr Diergeneeskd 115(12) 563-9.
Binford, L. F. 1968. in New Perspectives in Archaeology (eds Binford, S. R. & Binford, L. R.) 313341 (Aldine,
Chicago).
Brown TA., (1995) Production of protein from cloned genes. In: Gene cloning, 3rd edition, Chapman and Hall,
Chap. 12. p 253, 254.
Demain A.L. ve Fang A., 2000. History of Secondary Metabolism. In: Advances in biochemical
engineering/Biotechnology, Vol. 69,History of modern Biotechnology, Editr: Armin Fiechter, Springer-Verlag,
Berlin Heidelberg, pp 2.
Diamond J., 2002. Evolution, consequences and future of plant and animal domestication. Nature, 418(8), 700-
7.
Diamond, J. 1997. Guns, Germs, and Steel: the Fates of Human Societies (Norton, New York).
Diamond, J. 1992. The Third Chimpanzee: the Evolution and Future of the Human Animal (HarperCollins, New
York).
Fri, M.G. VE Kralovnszky, U. P., 2006. The founding father of biotechnology: Kroly (Karl) Ereky
.International Journal of Horticultural Science, 12 (1): 912.
Flannery, K.V., 1983. Early pig domestication in the Fertile Crescent, a retrospective look, in The Hilly Flanks
and Beyond, eds. T.C. Young, P.E.L. Smith & P. Mortensen. Chicago (IL): Oriental Institute, 163-88.
Flannery, K. V. 1969. in The Domestication of Plants and Animals (eds Ucko, P. J. & Dimbleby, G.W.) 73100
(Ducksworth, London).
Kruip TA., (1990) Biotechnology or the revelation of reproduction in farm animals Tijdschr Diergeneeskd
115(12):558-62
Mariana JC, Monniaux D, Draincourt MA and Mauleon P (1991) Folliculogenesis. In Reproduction in
domestic animal. 4th ed., Chapter 4 p119-171, Edited by PT Cupps, Academic press, San Diego.
Harlan J.R. ve Zohary D., (1966). Distribution of wild weats and barley. Science, 153: 1074.
Harlan J.R., 1979. On the origin of barley. In: Barley: origin, Botany, Culture, WinterHardiness, Genetics,
Utilization, US Department of Agriculture, Handbook No. 336, pp 10-36.
Harlan, J. R., and D. Zohary. 1966. Distribution of wild wheats and barley. Science 153:10741080.
Hillman, G. C., Davies, M. S. 1990. Measured domestication rates in wild wheats and barley under primitive
cultivation, and their archaeological implications. J. World Prehist. 4, 157222.
Legge, A., 1996. The beginning of caprine domestication ation in Southwest Asia, in Harris (ed\), 238-62.
Lev-Yadun, S., Gopher, A., Abbo, S. 2000. The cradle of agriculture. Science 288, 16021603.
Lindsay M, Gil G, Zhang C, Cadiz A, Velander WH, Van Cott KE. Purification of recombinant DNAderived
Factor IX and fractionation of active and inactive subpopulations. J Chromatogr 2004; 1026: 14957.
Lubon H, Paleyanda RK, Velander WH, Drohan WN. Blood proteins from transgenic animal bioreactors.
Transfus Med Rev 1996; 10: 13143.
Paleyanda RK, Velander WH, Lee TK ve ark. Transgenic pigs produce functional human factor VIII in milk.
Nat Biotechnol 1997; 15: 9715.
Randy V.,(2002) Virginia StateUniversity; technical publication NO: 443-003.
Smith, B.D., 1995. The Emergence of Agriculture. New York (NY): Scientific American Library
 8

Smith, B. D. 2001. Documenting plant domestication: the consilience of biological and archaeological
approaches. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 13241326.
Stiner, M. C., Munro, N. D., Surovell, T. A. 2000. The tortoise and the hare: small-game use, the
broadspectrum revolution, and paleolithic demography. Curr. Anthropol. 41, 3973.
Wray C, Woodward MJ., (1990) Biotechnology and veterinary science: production of veterinary vaccines. Rev
Sci Tech 9(3) 779-94.
Zeder, MA. 2008. Domestication and early agriculture in the Mediterranean Basin: Origins, diffusion, and
impact. PNAS, 105(33), 1159711604.
Zeder M.A., (2006) Archaeological approaches to documenting animal domestication. Documenting
Domestication,editr Zeder MA, Emshwiller E, Smith BD, BradleyDG (Univ of California Press, Berkeley), pp
171180.
 9

2. GEN KLONLAMA
Uzun bir zamandr mikroorganizmalar yararl maddeler retmek amacyla
kullanlmaktadr. rnek olarak Penicillium fungusundan penesilin retimini,
Streptomyces griseus bakterisinden streptomisin retimini gsterilebilir.
Gen klonlama biyoteknolojide yeni bir a at. Artk mememli
hayvanlarn proteinleri bakteriler tarafndan retilmektedir. Hayvana ait genler
bakteriler ierisinde normal faliyetine devam ediyor. Bu metotla ilalar ve
hormonlar mikroorganizmalardan elde edilmektedir (Brown, 1995). Yaplan
genetik maniplasyonlar ilk olarak insan sal iin gerekli ilalarn elde
edilmesinde kullanld daha sonra ziraatte de bu konuda nemli gelimeler
saland.
Gen klonlama yoluyla as mevcut olmayan hastalklara kar alar
gelitirildi. Bu teknik sayesinde genetik hastalklarn (rnein: cystik fibrosis,
meme kanseri, hemofili ve dier kaltsal hastalklarn) tehisi embiryonik
safhada yaplmakta ve yakn gelecekte tedavi edilebilmeleri mmkn grnyor.

2.1. Gen klomlamada kullanlan nemli faktrler

Gen klonlama DNAy test tpnde maniple etmeyi ve yaayan canllara
transfer etmeyi mmkn klan deiik teknikleri ierir. Bu teknoloji bize bir
organizmann genomundan herhangi bir DNA parasn izole etme imkan sunar.
Belli bir DNA parasn izole etmek; bu konuyla ilgili bilimsel ve teknolojik
almalarda rnein hastala neden olan genleri belirleme konusunda yaplan
bilimsel almalara ve farmakolojik maddelerin mayalardan elde edilmesine
ynelik teknolojik almalarda ilk adm oluturur.
Gen klonlama normalde bir canldan bulunup ve ona ait olan bir DNA
parasnn alnarak baka bir canlya rneyin Escherichia coliye transferini
ierir. Bylece transfer edilen gen allabilir veya o genin kodlad protein
sentezlenebilir. Klonlanm DNA paras baka bir canlya transfer edilebilir
fakat klonlama yaygn olarak E. Coli bakterilerine yaplr.
Gen klonlama nasl yaplyor meselesine bakmadan nce klonlamada
nelerin nemli olduunu bilmek nemlidir. DNA enzimlerle kesilerek paralara
ayrlr ve bu paralar iinde oalabilecei yeni bir hosta (E. Coli) ye transfer
edilir. Bir gen yle gelii gzel dier bir canlya transfer edilemez nitekim
transfer edilen genin host ierisinde paralanmas sz konusu olur. Ayrca
transfer edilen gen paralanmasa dahi oalmayabilir ve bir sonraki kuaa
aktarlmayabilir. Transfer edilen DNA parasnn oalabilmesinden ve bir
sonraki kuaga aktarlabilmesinden emin olmak iin transfer edilecek DNA
parasnn bir vektre yklenmesi gereklidir. Bu i iin vektrn kesilmesi ve
klonlanacak DNA parasnn vektre yklenmesi gerekir ve bu enzimler
vastasyla yaplr. Bu ilemi yaparak elde edilen rekombinant vektr genetigini
deitirmek istenilen bakteriye taransfer edilir. Bu ileme tranformasyon denir.
Transfer edilen gen bakterinin blnmesini paralel olarak oalr.
 10

2.1.1. Vektrler
Bir DNA parcasnn vektr (tayc) olabilmesi iin 2 zellii tamas gerekir.
1- Vektr oalma zelligi gstermelidir
2- Kulanlan vektr kk olmaldr.
Vektr iin ideal byklk 10.000(10kb) bazdr. Vektr olarak ya plazmidler ya
da virsler kullanlr.

a) Plazmitler
Plazmidler daire eklinde olan DNA moleklleridir bamsz olarak bakterilerin
ierisinde bulunurlar. Plazmidler bir veya birka genden oluur. Bu genler
vastasyla iinde bulunduu bakterinin karekteristik zelliklerini
gstermelerini salarlar. rnegin bakterinin antibiyotige dayankll gibi.
Bir bakterinin chloramphenicole veya ampiciline dayankl olmasnn
nedeni; bu bakterinin ierisinde bulunan plazmitin bu antibiyotiklere kar
dayankllk genini tamasdr.
Plazmidler ierisinde bulunduu bakteri DNAsndan etkilenmeden
oalrlar. Kk plazmidler iinde bulunduu bakterinin DNA elemesi iin
kuland mevcut enzimlerini kullanarak kendilerini elerler ve oalrlar.
Byk plazmidler kendilerinin oalmasn salayan enzimlere ait geni talar
bu nedenle oalmak iin kendi enzimlerini kullanrlar. Baz plazmidler
kendilerini bakterinin DNA sna balar ve bakterinin blnmesine paralel olarak
oalr bu plazmidlere epizom denir (Resim 2.3.1).
Plazmidler

Blnme

Bakteri DNA s
Epizom plazmidin
DNA s Bakterinkine
balanr ve oalr

Blnme

Resim 2.1.1.1. Plazmidler bamsz olarak bakterilerin ierisinde bulunan daire eklindeki
DNA moleklleridir. Plazmitler; bakterilerin karektesik zelliklerini gstermesini salarlar.
rnegin bakterinin belli bir antibiyotige dayankl olmas bakteri ierisindeki plazmid DNA
snn o antibiyotie kar dayankllk geni tamasna baldr. Kk plazmidler iinde
bulunduu bakterinin DNA elemesi iin iinde bulunduu bakterinin enzimlerini kullanarak
kendilerini elerler ve oalrlar. Baz plazmidler kendilerini bakterinin DNA sna balayarak
bakterinin blnmesine paralel olarak oalr.
 11

Gen klonlamada en yaygn olarak kullanlan vektrler plazmitlerdir.

Plazmit genomundaki belli bir DNA zinciri plazmidin hcre blnmesine parlel
oalmasn salar. Bu DNA zinciri orijin of replikasyion (ori) olarak
tanmlanr.

Figr 2.1.1.2. A panelindeki pBR322 plazmidindeki anfisiline dayankllk geni (Apr),

tetrasiline dayankllk geni (Tetr) genleri, orijin of replikasyon ksm ve baz zel restriksiyon
enzimlarinin balanma ksmlar grlyor. B panelinde pUC18 plazmidindeki anfisiline
dayankllk geni (Apr) ve lacZ geni ve Z geninin 10 zel restrilsiyon noktas ieren ve
multipi klonlama yaplabilen ksmnn nkleotit dizisi grlyor

Eer gen orijin of replikasyon (ori) tayan plazmite klonlanrsa gen plazmitin
oalmasna parelel oalr. Gen klonlamada kullanlan plazmitlerin birdizi
baka zellikleri de vardr. Doal plazmitler oldukca byktrler, bazlar 100 kb
lk genoma sahiptirler. Ama gen klonlamada kullanlan plazmitler genelde 10 kb
dan kktrler. Kk olmalardan dolay gen klonmada kullanlan plazmitler
izole ve maniple edilebilirler. Gen klonlamada kullanlan plazmitler genelde
ayrt edilebilmeyi salayan markar gen ierirler ve ounlukla bu markar gen
antibiyotige dayankllk genidir. Basitce bu antibiyotige dayankllktan
faydalanrak hangi bakteri kolonisinin iinde rekombinant plazmit var
bulunabilir. nk antibiyotige dayankllk genini plazmit tar ve hangi bakteri
antibik ieren agar pleyti zerinde canl kalbiliyorsa o koloni plazmiti ieriyor.
Antibiyotige dayankllk genini tamayan plazmitlere sahip bakteriler lrler.
 12

Yanlz antibiyotige dayankllk genini tayan plazmitlerin iinde bulunduu

bakteriler oalr ve koloni oluturabilirler.

b) Virsler
Gnmzda in vivo ve in vitro koullarda gen transferi iin ok sayda viral
vektr gelitirilmitir. Bu vektrlerin ou rodentiyalardan ve primatlatdan elde
edilmi, rekombinant vektr olarak kullanma uygun, genomu kolay maniple
edilen virslerdir.
Gen transferinde vektr olarak kullanlan virsler genel olarak
retrovirslerden, lentinovirslerden, adnovirslerden ve herpes virslerinden
salanmtr. nk bu vrslerin genomlar, enfeksiyon durumlar, gen tama
kapasiteleri ve rekobinant virsn infekte ettii hcrelerde oalma durumlar
hakknda fazla bilgi birikimi vardr. Son zamanlarda vaksiniya virslerinden,
insan sitomegalovirslerinden ve iek hastal (pox) virslerinden fakl viral
vektrler gelitirilmeye allyor.

1) Retroviral Vektrler
Retroviral vektrler RNA virslerinden gelitirilmitir. Virs kendi RNAsn
infekte edecei hcrenin revers transkriptaz enzimini kullanarak ters
transkripsiyonla ift zinirli viral DNA ya dntrr ve infekte edii hcrenin
DNAsyla viral DNA entegrasyona girer. Bu ekilde bir infeksiyonu moloney
lsemi virsleri ve lentino virsler yaparlar. Enok bu virsler vektr olarak
kullanlrlar. nk:
a) Bu virslerin genomu infekte ettii hcrenin genomuyla kararl ekilde
integrasyona girerek kalc ekspresyonu salar
b) Fakl hcreleri etkin ekilde infekte ederler
c) Gen transfer potasiyelleri yksektir, byk genlari tayabilirler

a) Moloney lsemi virs vektrleri: Bu virsler retrovirsler grubuna aittir.

Vektr olarak gen terapisinde kullanlan bu virs; moloney murin (ev ve
yaban faresi) lsemi virsnden gelitirilmitir. Bu virs murin
hcrelerini ve insan hcresi dahil olmak zere birok hayvan hcresinin
infekte eder. nfeksiyon hedef hcrenin yzey zarndaki phosfat transfer
eden Ram-1 (Pit-2) e balanan kapsl proteni tarafndan salanr. Virs 3
farkl gen tar bu genler; gag, pol ve env genleridir. Bu genler iki tane
viral uzun terminal tekrarlar (LTR) arasnda bulunurlar. LTR ksm viral
gen ekspresyonunu dzeler. Bu dzenlemeler poliandenlasyon,
replikasyon ve hedef hcenin genomula entegrasyonun salanmas
eklinde olur. Bu virsler ifade edilgii gibi RNA virsleridir. Vrsn
RNAs hcre iinde ters transkripsiyonla virisn kopya DNAsna
(cDNAv) dnr. Ters transkripsiyon onemlidir. nk, bu virisn
kopya DNAsndan istenilen zellie sahip viral vekr dizayn edilebilir.
 13

b) Lentiviral Vektrler: nsan immno yetersizlik (HIV) virs bir

lentinovirsdr, immno yetersislik sendromuna (AIDS) neden olur.
Moloney virsleri sadece aktif mitoz geiren hcreleri infekte ederken,
HIV virs mitoz geirmeyen hcreleri bile infekte eder. HIV
vrslerinden aktif mitoz geirmeyen sinir dokusu hcrelerine,
hematopoietik hcrelere ve miyofibrillere gen transfer edilebilir.

2) DNA Viral vektrleri

Retrovirslere benzemezler, DNA virsleri tek veya ift zincirli DNA tayan
genoma sahiptirler. Bu virslerin en nemlileri; adenovirsler, adano virslerle
alakal virsler ve herpes virsleridir vektr olarak yaygn ekilde
kullanlyorlar. nk:
a) Fakl hcreleri infekte edebilirler
b) Oldukca infektifdirler
c) Gen transfer potasiyelleri yksektir.

a) Adenoviral Vektrler: 1953 ylda kefedildiler. ounlukla

kapslszdrler, 35 kb byklnde ift zincirli DNA tarlar. Yaklak
49 farkl tipi mevcuttur. Bu virsler insanlarda ddi hastala sebep
olamdklar iin in vivo olarak gen transferinde vektr olarak
kullanlyorlar. Bu vslerin genomunda bulunan ve virsn oalmasn
salayan E1A ve E3 genleri karlarak yerine 7-8kb byklnde gen
yklenebilir.
b) Adano virslerle alakal viral vektrler: Bu virsler parvovirsler
familyasna aittirler, tek zincirli DNA tarlar. oalmalar iin adeno
virslere gerek duyarlar. Bu nedenle adenovirslerle alakaldrlar. Farkl
hcreleri infekte etme poansiyeline sahiptirler. Genomlarnda iki farkl
gen vardr. Bu genler; kapsln oluumunu saplayan Cap ve oalmay
salayan Rep genleridir. Bu genler iki tane ters terminal tekrar(ITR)
arasnda bulunurlar.

c) Herpes Viral Vektrler: ift zincirli linear DNA tarlar. DNAlar 150kb
byklndedir, yaklak 70-80 gen kodlar. Bu nedenle gen tama
kapasiteleri oldukca yksektir. Yaklak 30-50kb byklnde genler
yklenebilir. Hem mitoz geiren hem de mitoz geirmeyen farkl hcreleri
infekte etme kabiliyetleri vardr. Bu virslerin DNAs infekte ettii
hcrenin DNAsyla entegrasyona girmiyor. Bu yzden sadece geici gen
ekspresyonu salarlar.
d) iek hastal viral vektrleri: Pox virsleri familayasna aittirler. Bu
familyaya vaksiniya virsleri ve ku iek virsleri de girir. Gen tama
kapasitesi yksektir. 25 kbdan byk DNA paralar yklenebilir. Bu
vektrlere taransfer edilecek geni ykleme ilemi tekniksel olarak dier
vektrlere gen ykleme prosedrnden farllk gsterir. Gen ykleme ii
 14

genelde homolog rekombinasyonla ya da in vitro ligasyonla yaplr.

Transfer edilecek genin ekspresyonu iin viral promoterler gereklidir.
nk pox virslerinin genomu hcre stoplazmasnda kendi
transkripsiyon faktrlerini kullanarak oalr.

2.1.2. DNA MANPLASYONUNDA KULLANILAN ENZMLER

a) Restriksiyon enzimleri: DNA y kesmek iin kullanlr
b) Ligazlar: DNA nn iki parasn birbirine balamak iin kullanlr
c) Alkaln fosfatazlar. Restriksiyon enzimiyle kesilerek linear hale gelmi
dairesel genomun 5uundaki Pyi keserek tekrar dairesel hale gemesini
nler.
d) Polimerazlar: Bir DNA zincirini kopyalayarak diger DNA zencirinin
sentezlenmesinde grev alr.
e) Topoizomerazlar: Kovelent bala kapanmi diresel DNA (rnegin
plazmid DNA s) nn eklini deitirirler.

2.1.2.1. Restriksiyon Enzimleri

DNA kolayca zarar grr (Bir tpn ierisinde bulunan byk DNA molekl;
tp basit ekilde alkalannca krlr ve kk DNA paralarna ayrlr). Eer bir
DNA paras klonlanacaksa; o DNA parasnn genom ierisinden spesifik ve
tutarl ekilde kesilip alnmas lazmdr. Bu i iin enzimler kullanlr. Doal
olarak bu enzimler bakteriler tarafndan retilirler ve DNAy belli bir nkleotit
dizisi zerinden keserler. Bu enzimler restriksiyon enzimleri veya
endonkleazlar olarak bilinirler. Restriksiyon enzimleri hangi
milroorganizmadan elde edilmilerse onun adn alyorlar. Restriksiyon
enzimlerinin yzlercesi mikroorganizmalarda ayrt edilmitir. Yaygn olarak
kulanlan endonleazlar ve DNAy kestikleri yerlerin nkleotit sras tablo
2.1.2.1.1. de gsterilmektedir. rnegin E. Coli den elde edilen restriksiyon
enziminin ad EcoRI dir. Bu enzim DNA zincirinin neresinde bir GAATTC
bulursa keser. Bu GAATTC zinciri plasmid pBR322de sadece bir kez var.
Grldg gibi enzimin tanyp kestigi DNA zinciri 6 baz ifti uzunluundadr.
Bylece EcoRI enzimi alt baz iftinden olumu zinciri tanr (Recognition site).
Her iki DNA zincirde aada belitildigi yerlerden EcoRI enzimi tarafndan
kesilir ve bu enzim yapkan son oluturarak keser ( ekil a ve b).
 15

Bu enzimlerin ou DNA y 4-6 baz zerinden keser ve bu durum DNA nn

hangi canlya ait olduuna bal deildir. Tm DNA lar zerinde ayn ii
yaparlar. Bakteri DNAs yaklak 3 milyon eli baz ierir. Bakteriye ait DNA
bu enzimlerle birka bin paraya ayrlr. Memeli hayvanlarn DNAs daha
byktr bu yzden birka milyon parcaya ayrlabilir. Bu rakamlar DNA daki
fosfat-eker balarnn saysyla karlatrlrsa ok kk kalr. Belli bir DNA
moleklnn zel bir enzim ile kesilmesi sonucu homojen DNA paralar oluur
nk enzim belli noktalardan DNA y keser. Her enzimin DNA y kestigi nokta
farkldr. Bu nedenle farkl enzimler farkl DNA fregmentleri oluturur.
 16

Tablo 2.1.2.1.1.; Spesifik DNA pararn kesip ayrmada kullanlan endonlkeazlar,

endonkleazlarn elde edildigi mkroorganzmalar ve bu enzimlerin DNA y kestigi yer ve bu
yerlerin nkleotit sras.
Enzimin Elde edildigi DNA y kestigi yerin nkleotit
Ad mikroorganizma siras ve DNA y kestigi yer
EcoRI E.Coli G-AATTC
CTTAA-G
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H1 G-GATC C
CCTAG-G
HaeII Haemophilus aegyptius GC-GC
CG-CG
Hind III Haemophilus influenza A-AGCTT
TTCGA-A
Pst I Providencia stuartii CTGCA-G
G-AC-GTC
TaqI Thermus aquaticus T-CGA
AGC-T
Bal I Brevibacterium albidum TGG-CCA
ACC-GGT
Sma I Serratia marcescens CCC-GGG
GGG-CCC

Bakteri ierisinde bulunan enzimlerin yabanc DNA molekllerini kestigi fikri

bakteriofaj DNAsnn baz bakteri trleri iinde paralanm olmasnn
bilinmesiyle ortaya kt. Bakterinin kendi enzimleri kendi DNAsn
kesmiyordu nk enzimin baland yerlere metil gruplar balanyordu ve
DNA korunuyordu. Restriksiyon enzimlerinin 3 tipi vardr fakat ncelikle ikinci
tip restriksiyon enzimleri gen klonlamada kullanlyor. Bu enzimlere restriksiyon
enzimleri deniliyor nk bu enzimlerin kesim faaliyeti; ierisinde bulunduu
canlnn kontrol altndadr. Bu enzimlerin kesmek iin baland DNA
zincirine kesim yeri (Restriksiyon site) ve bu enzimlerin kestigi DNA paralar
ise restriksiyon fregmentleri olarak adlandrlr. Restriksiyon enzimleri 1978
ylnda Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans tarafndan
kefedildiler. Bu enzimlerin kefini ve molekler biyolojide kullanmn salan
bu alma Nobel dlne layk grld.
Birok bakteri tr restriksyon enzimine sahip olup olmadklarn bilmek
iin incelenmitir. Gnmzde bakterilerden birok enzim izole edilmitir. zole
edilen enzimlerin ou gen klonlamada ie yaryor.
 17

Farkl restriksiyon enzimlerinin var olmas DNAnn farkl ekillerde

maniplasyonuna olanak salar. Bu enzimlerin tand DNA zincirleri aadaki
figr 2.1.2.1.de de belirtilmitir. Bu enzimlerin kombine kullanm sayesinde
DNA istenilen ekilde kesilebilir.
Eyer bir restriksiyon enzimi DNA zincirinde 6 bazlk bir zincir tanyp
balanyorsa tm DNA boyunca her 4096 (46 = 4096) baz iftinde kendisine
balanma iin bir yer bulur.

Figur 2.1.2.1. Gen klonlamada yaygn olarak kullanlan restriksiyon enzimlerinin DNAy
tanma zincirleri ve kesim noktalar. Oklar enzimin kestigi yerleri gsteriyor. Restriksiyon
enzimlerinden BamHI, BglII, HindIII, PstI ve XmaI DNA zerinde 6 bazlk bir zincir tanr ve
yapkan son oluturur. Sua3A1 enzimi sie DNA zerinde 4 bazlk bir zincir tanr gine
yapkan son oluturur. PvuII ve SmaI enzimleri de DNA zerinde 6 bazlk bir zincir tanr
fakat dz son olutururlar.
 18

DNA zerinde 6 bazlk zincir tanyan restriksiyon enzimleri gen klonlama iin
daha kullanldrlar. nk bu enzimlerle kesilen DNA paralarnn byklg
klonlama iin istenen byklktedir. Dnn ki insann 3. kromozomundan 10
kblk bir ksm klonladnz. Bu klanladnz DNA paras DNAy 6 baz
zerinden kesen belli bir grup restriksiyon enziminin tand DNA zincirleri
dolaysyla kesim yerleri ierecektir. Belli bir DNA parasnn farkl ksmlarn
izole etmek veya bir restriksiyon haritas oluturmak amacyla bu enzimler
birlikte kullanarak DNA birka deiik ekilde kesilebilir. rnein pBR322
plazmit DNAs 22 tane bu enzimler iin 6 bazlk restiksiyon zinciri tar.
Restriksiyon enzimiyle kesilmi DNA parasnn yklenecei vektr tek bir
yerden kesilmelidir. Eer plazmiti farkl birok noktadan kesmise o zaman
vektrn nemli bir parasn kaybedebilirsiniz.
Restriksiyon enzimlerinin baland zel yerler pBR322 plazmidinin
etrafnda dank haldedir. Bu kesim yerlerinden bazlar ise genelde klonlama
iinde kullanlmayan ksmdadr. Modern klonlama vektrleri ounlukla
modifiye edilmitir bylece birok kesim yeri biribire yakn ve plazmitin bir
tarafnda bulunur. rnein pUC18 plazmiti bu kesim yerleri bakmndan
modifiye edilmi bir plazmittir. Bu plazmite zerinde 10 restriksiyon noktas
bulunan sentetik DNA paras yklenmitir. Bu ekilde klonlanm pUC18
plazmiti multipi klonlama zinciri ya da polilinker olarak adlandrlyor.
Bilindigi gibi her restriksiyon enzimi DNA zerinde 6 bazlk ksm
tanmaz rnein Sau3AI enzimi DNA zerinde 4 bazdan oluan zinciri tanr ve
DNA zerinde her 256 bazda (4n) bir kendine balanma yer bulur.
DNAy 4 bazlk zincir zerinden kesen Sau3AI enziminin kestigi DNA
paralarn klonlamadaki problem bu enzimin kestigi vektr DNAsnn 6 baz
zerinden kesen enzimlerin kestii paralardan daha fazla olmasdr. Bu
problemi zmenin basit bir yolu vektr 6 baz zerinden kesen ve yapkan son
oluturan enzimlerle kesmektir. Bu enzimlerin kestigi yapkan sonlar Sau3AI
enziminin kestigi DNA paralaryla uyumlu olmaldr. rnein DNA BamHI ve
BglII enzimleriyle kesildikten sonra oluan yapkan sonlar Sau3AI enziminin
kestigi yapkan sonlarla ayndr. Bylece Sau3AI enziminin kestigi DNA
paralar BamHI veya BglII enziminin kestigi plazmite yklenebilir.
 19

Figr 2.1.2.2. DNAy 4 baz zerinden kesen Sau3AI enziminin oluturduu fregmenler ile
DNAy 6 baz zerinden kesen BamHI veya BglII enzimlerinin oluturduu fregmenlerle
ligasyonu. Oluan rekombinant molekl tekrar Sau3AI enzimiyle kesilebilir.

Birok restiriksiyon enzimi DNAy keserken 5ucunda yapkan tek zincirli

ksm brakr ve tek zincirli ksm fosfatla biten sona sahiptir. Diyerleri rnein
KpnI 3 ksmnda tek zincirli yapkan son birakr ve bu tek zincirli ksmn
sonunda OH vardr. Klonlamada daha ok DNAnn 5 ucunda yapkan son
brakan enzimler kullanlr nk ligasyona daha kolaydr.

Figur 2.1.2.3. KpnI ve Asp718 enzinleri DNA zerinde ayn zinciri tantrlar fakat keserken
farkl tek zincirli uzantlar olutururlar.

DNAnn her iki zincirini da ayn yerden kesen ve dz son oluturan enzimler
vardr rnein SmaI ve PvuII enzimleri. Byle dz sona ship DNA paralarn
ligaz enzimiyle birbirine balamak zordur nk DNA molekln bir arada
tutacak tarns baz elemesi yoktur. Byle dz sona sahip DNA paralarnn
ligasyonunu salayan enzimlar mevcuttur rnein T4 DNA ligaz enzimi byle
durumlarda kullanlmaktadr. Bu enzimlerin kullanm ok esnektir. Kesilmi
DNA paralarnn vektre ligasyonunu salamak iin vektr de ayn enzimle
kesmeye gerek yok vektr dz son oluturan herhangi herhangi bir vektrle
 20

kesilebilir. Dz sona sahip DNA paralar linker enlenerek yapkan sona sahip
hale getirilebilir.
Bazen bakteriler restriksiyon enzimleri sentezlerler ve bu enzimlerin
tand DNA zinciri dier bakteriler tarafndan salglanan enzimlerin tand
DNA zinciriyle ayndr. Bu enzimler izoizomerler diye isimlendirilir. Baz
izoizomerler her ne kadar ayn DNA zincirini tansalarda o zinciri farkl
yerlerden keserler. rnein SmaI ve XmaI enzimleri izomerdirler nk her
ikisi de DNA zerinde GGGCCC zincirini tanrlar fakat SmaI bu zincir dz
keser fakat XmaI yapkan son oluturacak ekilde keser. Dier izoimerik
enzim ifti ise Asp718 ve KpnI enzimleridir. DNA KpnI enzimiyle kesildigi
zaman 3 sonunda OHla biten tek zincirli koessiv son oluturur. Asp718 enzimi
ise ise DNAy 5 ucunda Pye bal koessif son oluturarak keser ve bu
enzimlerin kestigi DNA paralar klonlamaya yakndr.
Baz restriksiyon enzimlerinin DNAy kesme frekans imdiye kadar
bahsedilen enzimlerinkinden dtr. Bu enzimlere seyrek kesiciler denir.
Serek kesicilerin kesme frakasnn dk olmasnn sebebi bu enzimleri tand
DNA zincirinin uzun olmasdr. rnein NotI enzimi DNa zerinde sekiz
nkleotitten olumu bir zincir (GC-GGCCGC) tanr. Diyer enzimler ise DNa
ok nadir keserler nk DNA zerinde yle bir zincir tanrlarki o zincir
genellikle pek bulunmaz. Eyer ama kromozomu veya tm genomu kesim
znluuu polimorfim haritalama ve genom sekans yapmaksa bu enzimleri
kullanmak uygundur.

2.1.2.2. DNA Ligazlar

ki DNA molekln kovalent bala birbirine balamak iin DNA ligaz enzimi
kullanlr. Eyer DNA restriksiyon enzimi rnein EcoRIle kesilirse yapkan
son oluturur. ki yapkan sona sahip DNA paras birbirine e olan bazlar
arasndaki hidrojen balarnn tekrar teekkl etmesiyle birbirine balanrlar;
bunun iin iki DNA parasna yapkan sona sahipler denir. Fakat bu balanma
geicidir yani srekli deildir daha sonra bu iki DNA tekrar birbirinden
ayrlabilir. Bu nedenle gen klonlama iin bu iki DNA parasnn birbirine
kovalent balanmas gerekir; bunu da ligaz enzimi salar. Ligazlar ayn
zamanda DNA nn bir zinciri salam dier zincirde kopuk varsa kopuk zinciri
tamir eder.
Ligaz enzimleri proteindirler; bakteriofajlar veya T4 fajlar tarafndan
sentezlenirler. Bu enzimler faliyetleri iin enerjiye ihtiya duyarlar ve bu
enerjiyi ATPden salarlar. Basitce klonlama zel bir DNA parasnn bir
plazmit vektrn (pBR322) DNAsina entegre edilmesidir. Bunun iin linear
plazmit DNAs elde etmek iin plazmit genomu belli bir notadan kesilir.
Plazmite entegre edilecek DNA parasnn elde edilecegi DNA da linear DNA
elde elmek iin ayn restriksiyon enzimiyle kesilir. Kesim ileminden sonra
restriksiyon enzimi inaktif hale getirilir. Restriksiyon enzimi inaktif hale
 21

getirildikten sonra kesilmi plazmit ve DNA paralar T4 DNA ligaz enzimin

mevcut olduu ortamda kartrlr.

Figr 2.1.3.1. a) Eco RI restriksiyon enzimiyle kesilen DNA yapkan sona sahip iki paraya
ayrlr. EcoRI in kesim zinciri (Restriction site) mavi renkli gsterilmitir. b) Ebazlar
arasnaki hidrojen balar tekrar oluarak kesilmi paralarn geici olarak bir arada
tutulmasna neden olur. Bu sadece geicidir. Yukarda gri yuvarlak ligaz anzimini temsil
ediyor be bu enzim kesilmi paralarn 5 fosforu ile kesilmi dier parann 3 OH arasnda
fosfodiester bann olumasn salar ve bu ba kalcdr. Ligaz dier zincirde de ayn ii
yapar. c) Fosfodiester ba olutuktan sonra alt zincirdeki boluk (Nik ksm) ligaz enzimiyle
birletirilir.
 22

Figr 2.1.3.2. Genomik DNAnn bir vektre (pBR222) klonlanmas. a) Vektr DNAs
EcoRIle kesilerek tek zincirli linear DNAya dntrlyor. Genomik DNAda EcoRI
enzmiyle kesilip homojen DNA paralar elde ediliyor. Kesilen paralar kartrlyor ve
zerine ligaz eklenerek birletiriliyor. Bu birlemede birka farkl ihtimal sz konusudur.
Genomik DNAnn bir paras baarl bir ekilde EcoRI enziminin kestigi zincir ierisine
yerletirilebilir ki bu istenen klonlama eididir (c) Alternatif olarak EcoRI enzimiyle kesilmi
vektrn yapkan sonu genomik DNA inserti olmakszn birbirine balabilir (d), ya da
kesilmi genomik DNA paralar random ekilde birbiriyle birleebilirler (e).

2.1.2.3. Polimerazlar
Bu enzimler DNA nn veya RNA nn bir zinciri mevcut iken dier zincirin
mevcut zincir zerinden sentezlenmesini salarlar. Bu enzimlerin ou
kopyalamay yapabilmek iin kapyalyacaklar DNA nn bir ksmnn ift
sarmal olmasna gerek duyarlar. Bu ift sarmal ksm polimerleme iin
balatc (primer) olarak grev alr. Piyasada polimeraz enzimin eidi vardr
a) Polimeraz-1: E.Coli bakterisinden elde edildi
b) Klenov: Polimeraz-1 enziminin modifiye edilmesinden elde edildi
c) Revers trankriptaz: Wisconsin niversitesiMadisondaki genetikci ve
virolog Howard TEMIN tarafndan kansere sebep olan retrovirslerde
kefedildi. Daha sonra 1970 de David BALTIMORE tarafndan
Massachusetts Institute of Technologyde izole edildi. Bu iki bilim adam
Renato DULBECCO ile beraber Nobel Fizyoloji veya Tp dln
aldlar. Bu enzim RNA dan cDNA sentezlemek (ters transkripsiyon) iin
kulanlyor
 23

2.1.2.4. DNA Modifiye edici enzimler

zel bir kimyasal grubun (bir nkleotidin veya fosfat grubunun) DNA ya
balanmasn veya ayrlmasn salayan enzimlerdir. DNA y medifiye eden
birok enzim vardr bunlarn en nemlileri:
a) Alkalin fosfatazlar: Bu enzimler E.Coli bakterilerinden veya buzagnn
basak dokusundan elde edilir. Enzim DNA nn 5 sonundaki posfat
gurbunu keser.
b) Polinkleotit kinazlar: T4 faj ile infekte edilmi E.Coli bakterisinden
elde edilirler. Alkalin fosfataz enziminin yapt iin tersini yapar ve
DNA nn 5 ile biten ksmna fosfat gurubu ekler
c) Terminal deoxynkleotit transferazlar: Buzann timus dokusundan
alnmlardr. Bu enzimler DNA nn 3 ile biten ksmna nkleotit
eklerler.

2.1.2.4.1. Alkaline Fosfatazlar

Uygun ekilde yaplan bir ligasyon reaksiyonu rekombinant molekl oluturma
ansn artrabilir. Bir vektr kesildikten sonra tekrar birleerek dairesel hale
geer ve ligasyon yaplamaz. Vektrn kesildikten sonra dairesel hale gemesi
nlenmelidir ki ligazyon yaplabilsin ve rekombinant molekl elde edilebilsin.
Vektrn kesildikten sonra dairesel hale gelmesini nlemek iin vektre zel
mumale etmek gerekir. Bilindii gibi DNA-ligaz enziminin iki DNA
molekln kovalent bala balayabilmesi iin 3ucuna bal bir OHe ve 5
ucuna bal bir Pa gereksinim gsterir. Belli bir DNA parasnn vektre
ligasyonu ancak vektr aksa yaplr. Vektr kesildikten sonra 5 ucundaki
fosforun kesilmesi o vektrn kendi kendine ligasyonunu yani dairesel hale
gelmesini engeller. Bu i vektre alkalin fosfatazla ksaca yaygn olarak bilinen
dana (calf) intestinal alkalin fosfataz (CIAP) ile muamele etmek gerekir. Bu
DNA modifiye edici enzim kesilen vektrn iki zincirindeki 5 ucuna bal
Plar keser ve bylece kesilmi vektr tekrar birleerek dairesel hale gelmez.
Eyer vektre yklenecek DNA parasnn (insertin) 5 ucuna P bal ise vektr
zerindeki 3ne bal OHa balanabilir bylece insertin vektre ligasyonu
salanr. Ligasyondan sonra oluan rekombinant moleklde tek zincirli (nik)
ksmlar vardr bu ksmlar bakteriye transferden sonra bakterinin iinde tamir
edilirler. Vektre belli bir inserti yklemeden nce alkalin fozfataz aktivitesinin
yok edilmesi gerekmektedir.
 24

Figure 2.1.2.4.1.1. DNA parasn (inserti) yklemeden vektrn dairesel hal

almasn engellemek iin vektre alkalin fosfataz ile muamele edilir. a) Vektre
alkalin fosfatla muamele edildiyinde 5 uclarndaki her iki fosfat kopar. b) Bu
durumda vektr geici olarak dairesel hal alsa dahi DNA-ligaz bu P ayrlm
sonlara balanamaz. Alkalin fosfatazla muamele edilmemi vektrde 5 ucunda
her iki fosfatta mevcuttur ve bu vektr dairesel hal alr sonuta DNA inserti
klonlanamaz. c) DNA-ligaz tek zincirde kovalant ba oluturabilir fakat her
zincirde tak zincirli ksmlar oluturur.Molekl hidrojen balaryla bir arada
tutulur ve bu vektrdeki nik ksmlar bakterinin iinde tamir edilir.

2.1.3. Rekombinant vektr insertisyonel inaktivasyonla belirleme

Klonlamada pBR322 ve pUC18 plazmidlerinin kullanmnn baz avantajlar
vardr. Restriksiyon enzimleriyle kesmek gvenirlidir fakat ligasyonu ve
transformasyonu etkili bir ekilde yapmak zordur. Gvenilir ve istikrarl
rakombinant bir molekl elde etme yollar aratrlmaldr. Antibiyotik anfisilin
veya tetrasiline dayanklla gre seimde oalabilen bakteriler ya orjinal
pBR322 plazmitini ya da bu plazmitin EcoRI restriksiyon ksmna zel DNA
klonlanm rekombinant vektr tar. Bu iki ihtimali sadece plazmidler
incelenerek, yani plazmitleri hazrlamak ve o onlar restriksiyon enzimiyle veya
enzimleriyle kesmek ve kesilen paralarn byklgn orijinal vektr
paralaryla karlatrarak birbirinden ayr edilebilir.
Birden fazla antibiyotige dayankllk geni tayan pilazmitler, rnein
pBR322 plazmiti, alternatif klonlama stratejisi sunar. Bu klonlama stratejisi
insertisyonal inaktivasyon olarak adlandrlr. nsertisyonal inaktivasyon
rekobinant vektrle dairesel haldeki normal vektr birbirindan ayrt etmeyi
mmkn klar. Eer pBR322 plazmiti BamHI ile restrikysiyon yaplp
klonlanrsa plazmitteki tetrasinine daynkllk geni knok out edilir bu nedenle
terasiline dayankllk genini kodlamaz fakat anfisilin genini halen kodlar.
Normal vektr hem tetrasiline hem de anfisiline dayankldr. Ksaca normal
plazmit tayan bakteriler hem tetrasiline hem de anfisiline dayankldr fakat
rekombinant plazmit tayanlar sadece anfisiline dayankldr tetrasiline
dayankl deildir. Antibiyotige dayanllkla gre rekombinant plazmit
tayan bakteri kolonisini belirleme pratik bir yntemdir. Bu ekilde normal
vektr ve rakombinant vektr tayan bakteri klonlar birbirinden ayrt edilir.
 25

Antibiyotige dayankllktan faydalanlp rekombinant bakteri kolonisini

belirlemek iin nce plazmitle transfekte edilen bakteriler gece boyunca anfisilin
ieren agar pleytinde inkbasyona braklr. Rekombinant ve normal plazmit
tayan bakteriler bu pleyt zerinde oalacak. Bizim bilmemiz gereken ise
mevcut bakteri klonilerinden hangisi tetrasiline kar hassatr. Bunun iin
koloniler anfisilin veya tetrasilin ieren agar pleytlerinde gece boyunca
inkbasyona braklr. Pleytlere konulan klonilerden tetrasilin ieren pleytte
oalamyan koloni rekobinant plazmiti tayan kolonidir.

Figur 2.1.2.1. pBR322 plazmitindeki tetrasileine dayankllk geninine insertiyonal

inakstivasyonla knok out edilmesi a) Plazmit ve genomik DNA BamHIle kesilir ve ligazla
kartrlarak ligasyon yaplr b) Baarl bir konlamada tetrasilin geni fonksiyonel deildir
nk tetrasiline dayankllk geninin iine DNA paras yerletirilmi integrasyonu
bozulmutu. c) Eyer kesilmi vektre DNA paras yklenememise vektr tekrar dairesel hal
alr ve tetrasiline dayankllk geni tekrar fonsiyonel hale gelir.

Figur 2.1.2.2. kinci kez agar pletinde inkbasyon neticesi amfisiline dayankl ve tetrasiline
hassas rekombinant bakteri kolonisi belirlenir. kinci playtteki koloniler birici pleytin kopyas
olmal ki amfisilin ve tetrasilin ieren pleytte kaybolan koloniler belirlenebilsin. Kaybolan
koloniler amfisilin iren pleyt ozerinde daire iine alnr ve belirlenir. kinci pleyt zerindeki
 26

konilerin birinci pleyttekiyle ayn pozisyonda olamas iin; nce steril bir yzeyle birici playte
dokundurulur ve her koloniden belli bir miktar ikici pleyte bular ve her iki pletteki koloniler
birbirinin ayns olur. Birinciyle ayn koniye tayan yzey amfisinin ve tetrasilin ieren playt
iinde inkbasyona braklr. Rakombinant koloniler kaybolur. Koybolan kolonilerin yerine
baklarak birinci pleytteki ayn pozisyondaki koloniler daire iine alnr ve belirlenir.

Rekombinant vektr tayan koloniyi belirlemenin en pratik yolu pUC18

plasmidini klonlamada kullanmaktr. Bu plazmit ve variyeteleri rekombinant
bakteri kolonisini tek basamakta belirleme imkan sunar. Bu plazmitler -
galaktozidaz kodlayan lacZ geninin kullanmn mmkn klar. -galaktozitdaz
laktozu substrat olarak kullanr ve onu glikoz ve galaktoza paralar. -
galaktozitdaz any zamanda 5-bromo-chloro-3- indolyl--D-galactoside (X-gal)
molekln de paralar. -galaktozitdaz X-gal molekln paraladktan sonra
mavi bir renk olumasna sebep olur. Eyer bakteri kolonisi fonksiyonel lacZ
genini tayan bir plazmit tayorsa mavi renkli grnrler. pUC18 plazmitinin
ait olduu plazmit familyasndaki plazmitler lacZ geninin sadece bir parasn
ierirler ve bu ierdikleri ksm sadece -galaktozitdazn peptidini kodlar. Bu
plazmitlerin ierdikleri bu ksm lacZ geni lacZ geni olarak adlandrlr. Bu
plazmitler -galaktozitdaz enziminin geri kalan ksmn kodlayacak ekilde
dizayn edilmi host plazmitlerle birlikte kullanlr. -galaktozitdazin aktif
olabilmesi iin hem -peptidin hem de enzimin geri kalan ksmna gerek vardr.
Multipi klonlama ksmlar pUC18 DNAs zerindeki lacZ geninin ortasna
lokalize olmutur. Bylece bu ksmlara bir DNA paras yklenirse lacZ geni
inaktif hale geer (Knok out edilir) veya lacZ geni insertiyonal inaktivasyona
uratlr. Bu ekilde inaktive edilen lacZ geni -galaktozitdaz kodlamaz ve X-
gal paralanamaz neticede mavi renk olumaz. Normal vektr tayan
kolonilerde ise X-gal paralanr ve mavi renk oluur. Bu ekilde rekombinant
plazmiti tayan koloni belirlenir.
 27

Figr 2.1.2.3. Genomik DNA ve pUC18 plazmidine insetiyonal inaktivayson yntemiyle

yaplan klonlama. a) Plazmiti restriksiyon enzimiyle kes; enzim plazmit zerindeki multipi
klonlama ksmn (MKK) keser sonra ligazla kartr. b) Baarl bir rekobinasyon yapldysa
lacZ geni fonksiyonel deildir nk bu genin integrasyonu klonlanan DNA paras
tarafndan bozulmutur. c) Eyer klonlama baarl deilse o zaman vektr tekrar dairesel hal
alr ve lacZ geninin integrasyonu tam ve gen fonksiyonel haldedir ve -galactosidazn
senteszlenmesini salar.
 28

2.1.4. zel amalar iin kullanlan vektrler

pBR322 ve pUC18 plazmitleri arasndaki en nemli farklardan biri ise bir
bekteri iindeki kopya saysdr ve her bir bakteriyel kromozoma karlk gelen
kopya says olarak ifade edilir. Bir bakteri ierisinde bulunan plazmitin kopya
says eleme orijini tarafndan regle edilir. pBR322 plazmiti orta seviyede
kopya saysna sahiptir bir bakteriel kromozom iin 12-20 kapyas vardr.
pUC18 plasmitinin ise bakteri ierisinde ok fazla kopyas vardr her bakteriel
kromozoma en fazla 100 plazmit kapyas karlk gelir. Baz uygulamalar iin
bakteri iersinindeki plazmitin kapya saysnn fazla olmas istenir ve klonlamda
en fazla tercih edilir. Bazen klonlanan gen baz toksik maddelerin salglanmasn
salayarak bakteri zerinde bir bask oluturur bu durumda bakteri ierisinde az
kopya saysna sahip plazmitler tercih edilir.
Gen klonlamann amac belli bir proteini kodlayan genin ekspersyonunu
salamaktr. Birok biyoteknolojik ve medikal uygulamann amac hastalklarn
tedavisinde kullanlan ve ticari deyeri olan proteinlerin retilmesini salamaktr.
Ama aratrma almalarnda gen klonlama daha ok proteinlerin fonksiyonel
analizi iin nemlidir. Artk gnmzde gen ekspresyonunun ve protein
sentezinin kontroln mmkn klan ok sayda farkl klonlama vektr
mevcuttur.

2.1.5. Restriksiyon haritalama ytemiyle klonlanan DNA parasn analiz

etme
Rekombinant plazmitin ya antibiyotige dayankllk geninin ya da lacZ geninin
insertisyonel inaktivasyonla belirlenmesine imkan veren plazmitler klonlamada
ok ie yarar. Fakat halen rekombinant plazmitin restriksiyon haritalamayla
analiz edilmesi gereklidir. Bu metotta plazmitler belli bakteri klonilerinden
ayrlr, restriksiyon enzimleriyle kesilir ve kesilen paralarin bykl analiz
edilir. Diyelimki EcoRI enzimiyle kesilimi tepleyt DNAnn 1kb ksmn gine
EcoRI enzimiyle kesilmi pUC18 plazmitinin multi klonlama ksmna (lac Z
geninin bulunduu ksm) ykledik. Eer klonlama baarl yapldysa bakteri
anfisiline dayankl olacak fakat lacZ geni fonksiyonel olmayacak. Eer takrar
rekombinant plazmiti EcoRI enzimiyle kesersek iki paraya ayrmamz beklenir
birincisi plazmite yklenen 1kb ksm diyeri ise plazmidin yeri kalan 2.7 kb
ksm. Ayn rekombinant plazmit dier enzimlerle rnein HindIIIle kesilirse
3.7kb lik bir DNA paras oluur bu durum klonlanan DNA parasnn HindIII
iin kesim noktas tamadn gsteriyor. Eyer HindIII enzimi plazmide
yklenen DNA parcasn yani inserti de keserse o zaman birden fazla fergment
oluur ve her bir fregmentin boyu 3.7kb olur. zerinde tm restriksiyon
ksmlarn gsteren bir rekombinant vektr resmi elde elmek iin rekobinant
vektr farkl restriksiyon enzimleriyle ayr ve birlikte kullanlarak kesilir ve
buna restriksiyon haritas denir. Bunu yapmak iin kesilen fegmentlerin
byklgn leme metoduna gerek vardr.
 29

2.1.5.1. DNA Fregmentlerinin Byklgn lme

Kesilen DNA fregmentlerin byklgn lmede kullanlan en yaygn metot
jel elekroforezidir. Bu teknikte kesilen DNA aralar byklgne gre ayrlr
her bir fregmentin byklg bilinen markar DNAayla (Merdivenle)
kyaslanarak bulunur. Jel oluturmak iin esas meteryal olarak agaroz kullanlr.
Fakat poliakrilamit jel de siklkla kullanlr bilhassa DNA fregmentleri ok
kkse. Agaroz jel 100 baz ifti (bp) den 2 kilo baza (kb) DNA paralarn
birbirinden ayrmada kullanlr. Agaroz toz halinde piyasadan temin edilen bir
polisakkarittir, mikrobiyojide kullanlan agarn saflatrlm halidir. Agaroz
iyonik bafr ierisinde kaynama noktasna kadar stlarak zlr. zlen
agaroz jel oluturmak iin kalba dklr. Kalba dklen agaroza tarak
yerletirilir. Souduktan sonra tarak karlr ve rnek ykleme yeri oluur.

Figr 2.1.5.1.1. Agaroz jelin zerinde bununan rnek ykleme yerleri ve DNA byklgn
gsteren parametre (Merdiven). Jel zerinde farkl byklkte bantlar grlyor. Okla
gsterilen rnek ykleme yerile bandn arasndaki mesafe fregment byklgne gre deiir.
Kk fregmentler daha hzl hareket ettikleri iin bu mesafe uzundur, byk fregmentlerde
ise ksadr.
 30

Figr 2.1.5.1.2. Agaros jel elektroforezi iin gerekli olan elektroforen tank ve jel kalb.

Figr 2.1.5.1.3. Agaroz jel fotoraf. M: Merdiven (Kesilen DNA paralarnn byklg
merdivenle karlatrlarak bulunur). Bakteriofaj DNAnn HindIII enziyle kesilmesi
sonucu oluan DNA fregmentleri grlyor. Grld gibi byklkleri 1.7-6.6 kb arasnda
deien 10 tane DNA fregmenti grlyor.

Jel zerindeki DNA fregmentlerini grebilmek iin rnekleri jele yklemeden

nce floresan boya etidyum bromidle kartrdktan sonra jele yklemek lazm.
Etidyum bromid DNAdaki bazlara balanr ve jelde DNA ile birlikte hareket
eder. Eletroforezden sonra ultraviyole (UV) iinda bantlar grlr ve fotoraf
ekilir. Etidyum bromit boyas ok hassastr ve 0.05 g DNA tayan bant dahi
grlebilir. Etidyum bromit DNA da mutasyona neden olabilmektedir. UV ise
ciddi yanmalara neden olabilmektedir ama buna ramen grntlemede yaygn
olarak kullanlyorlar.
DNA fregmentlerinin bykl ile jeldeki rnek ykleme yeriyle
fregmentin bulunduu nokta rasndaki mesafe fregmentin byklg arasnda
alaka var. Jele bilinen byklkle bir seri restriksiyon fregmenti (Merdiven)
yklenip yrtlerek jelin kalibrasyonu salanr. Dier DNA frementleri
merdivenle karlatrlarak byklg bulunur. Yaygn olarak kullanlan DNA
merdiveni bakteriofaj DNAsnn HindIII enzimiyle restriksiyonu sonucu elde
 31

edilmitir. Bu enzimle kesme sonucu byklkleri 125bp-23.13kb arasnda

deien 8 DNA band oluur. DNA fergmentinin byklg ile o fregmentin
blunduu yer ile rnek ykleme yeri arasndaki alaka dorusal deildir. rnek
ykleme yeri ile bandn bulunduu nokta arasndaki mesafe daha ok o bandn
10 tabanna gre molekler arlnn logaritmasna (log 10) eittir. Eyer DNA
fregment byklnn log10a gre mesafeyle karlatrlrsa o zaman dorusal
bir mesafe elde edilir. Bu doruya gre dier bantlarn bykl bulunur.

Her fregmentin byklnn log10 deeri hesaplanr ve mesafeye gre bir

grafik izilir. Bu grafie gre bykl bilinmeyen banlarn mesafelerine
karlk gelen byklk deeri hesaplanr. Sizce yukardaki verilere gre rnek
ykleme yerinden 60 mm mesafede bulunan bir bandn bykl nedir?
hesaplaynz.
Jeldeki agaroz konsantrasyonu jeldeki por byklgn etkiler bu da jel
iinde alnan mesafeyii ve jelde ayrlabilen fregmentlerin molekler byklk
deiim araln etkiler. Eyer agaroz %1 konsantrasyonda olursa 200bp ile 2kb
byklgndeki fregmentler ayrlr, eyer agaraz konsantrasyonu 0.5% ise o
zaman byklg 1kb-20kb arasnda olan fregmentler ayrlr.
Jel icerisindeki DNAnn haraket mesafesini etkileyen diyer bir faktr ise
DNA moleklnn konformasyonudur. Plazmit DNAs fakl
konformasyonda bulunabilir. Bu konformasyonlar; kk sk sarlm dairesel
DNA, tek zinciri kopuk geni dairesel DNA ve iki zinciri de kesik dorusal
DNA dr. Jel ierisinde alnan mesafe DNA paralarnn konformasyona gre
deiir.
 32

Figur 2.1.5.1.4. Plazmit DNAsnn 3 farkl konformasyonu; a) Kk sk sarlm dairesel

DNA; b) Tekzinciri kopuk geni dairesel DNA; c) ki zinciri de kesik dorusal DNA

Agaroz jel hem DNAy analiz etme hem de saflatrma iin kullanlabilir. Bazan
jel iersindeki bir DNA parasn bir adm ileri analize tabi tutmak iin
saflatrma gerekebilir. Dnn ki jel iersisindeki bir DNA parasn
klonlamak istiyorsunuz o zaman klonlamak isteginiz paray jelden ayrmanz
gerekir. DNA y enzimle kesip elektroforeze tabi tutmak, DNA paralarn
birbirinden ayrmak sonra da bu fragmantlardan isteneni kesip ayrma ve
klonlama ok pratiktir ama fragmentler birbirinden iyice ayrlmal ki kolay ayrt
edilsin ve kesilsin. Jel ierisinde istenilen band grebilnek iin jele DNA
rnekleri yklenirken ethidyum bromit kartrlr. Bu boya DNAya balanr ve
jel ierisinde birlikte hareket eder. Jele ultraviyole iig altnda baklrsa bantlar
grlr ve istenilen bant jelden kesilerek ayrlr. Jel ierisindeki DNA ayrlr ve
klonlanr.

2.1.5.2. Transformasyon
Gen klonlamada son adm rekombinant plasmitin E. Coliye geiini
salamaktr. Bu ileme transformasyon denir ve iki adm ierir. lk adm
rekombinant plazmiti bakteriye trasfer etmektir ikinci adim ise rekombinant
plazmiti tayan bakteri kolonisini tespit etmektir. Baz bakteriler hali hazrda
doal olarak dardan yabanc DNA molekl alma potansiyeline sahiptirler. Bu
bakteriler doal transformasyon kabliyetine sahip bakteilerdir rnein Neisseria
gonorrhoea bakterisi byledir. E. Coli bakerisi doal transformasyon
kabiliyetine sahip deildir bu nedenle dardan DNA molekl alabilmesi iin
zel muameleye ihtiya gsterirler. Bu durumda yabanc DNA E. Coli
bakerisine ya kimyasal yolla ya da elektroporasyonla transfer edilir.
E. coli bakterisinin dardan yabanc DNA molekln alma yeteneini
salama ya ynelik kimyasal muamele E. coli bakterilerine diardan yabanc
DNA alma yetenegi kazandrmak iin bakteri kltre alnr ve hcre
blnmesinin en abuk oldua zamanda (log faznda) kltrden santrifjle
 33

ayrlr ve CaCl2 gibi divalent katyonlar ieren bafrla ykanr. Ykamadan sonra
bakteriler tekrar az bir miktar bafr ierisine sspansiyon yaplr. Bu az
miktardaki bafr ierisinde bakteri younluu ok fazladr. Bu hcrelerin
ierisine rekombinant plazmit geiini salamak iin az mikra bakteri
sspanziyonu alnr bir miktar rekombinant plasmit (ligasyon karm) ile
kartrlr. Karm buz ierisinde (+4C de 30 dakika) inkbasyona braklr ve
sonra scaklc aniden 1 dakikada 42C ye getirilir takiben plazmit grii iin 37C
de 30 dakika inkbasyona braklr ve takiben seici agar pleti zerine datlr.
Antibiyotige dayankllktan faydalanarak rekombinant bakteri kolonisi
belirlenir. Bu teknik ok eskiden belli kullanlyor fakat bu teknigin rekombinant
plazmitin bakteri ierisine girmesini neden olan spesifik mekanisma ancak imdi
anlalmaya balam. Rekombinant plazmit bakteri duvarnnn d yzeyindeki
lipoplolisakkartlere balanr. Bakterilerin Ca+2 iyonlar ieren bafrla ykanmas
ve ani scaklk ykselmesi bakteri duvarna zarar verir ve rekombinant plazmiti
zarar grm bakteri duvarndan geip bakteri ierisine girmesine neden olur.

Figr 2.1.5.2.1. Bakterileri plazmit geiine uygun hale getirmek iin +4C deki CaCl2 ile
yakamak gerekir. a) plazmit griine uygun hale getirilen bakterilerden youn bir suspansiyon
hazrlanr ve rekombinant plazmitlerle kartrlr. Kartrlan plazmitler bakteri duvarnnn
d yzeyindeki lipoplolisakkartlere balanr. b) Saklk oku neticesi baz bakteriler
plazmiti alr ve sonra selektif agar pleytine yaylr. Antibiyotige dayankllktan fakdalanarak
plazmiti alan koloni belirlenir.
 34

2.1.5.3. Elektroporasyonla E. coli bakterilerine dardan yabanc DNA

moleklnn geiini salama
Santrifjle pellet haline getirilen bakteriler dk iyon konsantrasyonuna sahip
bafrla ya da distil su ile ykanr. Ykamadan sonra bakteri says fazala olan bir
szpansiyon zel bir kvete konur sonra rekombinant plazmitle kartrlr.
inde plazmit ve bakteriler bulunan kvete yksek voltajda (1800-2500 V)
kesik kesik elektrik verilir sonuta rekombinant plazmit bakterinin iine geer.
Bu ilemde plazmitlerinin bakterinin ierisine gei makanizmas halen
aklanmamtr. Fakat byk bir ihtimalle bakteri duvarndaki porlarn plazmit
geecek ekilde genilemesi nedeniyle plazmit bakterinin iine geer.
Elektroporasyon kimyasal transformasyondan daha etkindir ayn zamanda tm
memeli ve bitki hcrelerinde kullanlabilir.
ster kimyasal yntem, ister elektroporasyon yntemi kullanlsn her
ikisininde transformasyonu salama etkinligi oldukca dktr sadece bir
milyon bakteriden ortalama biri bir plazmiti baarl bir ekilde bnyesine alr.
Bu nedenle antibiyotige dayankllktan faydalanarak ksaca secmeyi salayan
markar kullanarak plazmiti alan koloni balirlenir. Rekombinant plazmit
antibiyotige dayankllk genini de tamali ki koloni atibiyotik eklenerek
belirlensin.
Elektroporasyondan sonra bakteri plazmit karm 37C de 30-60 dakika
inkbasyona braklr. Bu sre zarfnda antibiyotige dayankllk genin
ekspresyonu balayacak. Sonra inbasyondaki bakteriler antibiyotik ieren agar
pleyti zerinde aktarlr ve 37C de koloniler oluuncaya kadar gece boyunca
inkbasyona braklr. Antibiyotik ieren agar ierisinde sadece plazmitle
transforme olmu bakteriler oalacak. nk gen yklenmi rokombinant
plazmit ayn zamanda antibiyotige dayankllk geni tayor. Plazmiti tamayan
bakteriler lr. Burada seici markar antibiyotiktir. Gee boyunca 37C de
inkbasyona braklan agar pleyti ierisinde koloniler grlmeye balar. Pleyt
zeride grlen her bir koloni tek bir bakterinin birok kez blnmesiyle
olumutur bu nedenle her koloni ayn genetik yapya sahiptir ve bu durum klon
olarak ifade edilir. Rekombinant plazmiti alan bakterinin blnmesiyle oluan
koloninin her bakterisinde ayn plazmit vardr ksaca genetik yaps ayndr ve
klondur. Bylece sizin plazmite yklediginiz genin milyonlarca kopyas olumu
olur.
 35

Figr 2.1.5.3.1. Agar pleyti zerinde grlen kolonilerden her biri tek bir
bakterinin birok kez blnmesi sonucu olumutur. Bir kolonide bulunan bir
bakteri klondur nk kolonideki dire bakterilerle ayn gentik yapya sahiptir.
Rekombinant plasmiti alan klonideki her bakterini genetik yaps ayndr ve
dier kolonideki diyer plazmiti alan bakterilerden farkldr.

2.1.5.4. Bakterilerden plasmid ayrma

E. Coli bakterilerininden plazmitlerin ayrlmas ou kez gereklidir. Plazmitlere
gen ykleme ve transformasyon ilemlerinin doru yapldn grebilmek iin
plazmitlerin ayrlmas gerekir. Baarl bir klonlamadan sonra plazmitleri ileri
seviyede bir maniplasyona tabi tutmak iin de plazmitlerin ayrlmas gereklidir.
Aslnda plazmitlerin bakterilerden ayrlmas rutin bir prosedrdr. Bu prosedr
sz konusu plazmiti ihtiva denen bakterileri kltrde oaltma, ayrma, lyze
etme, nkleik asit dndaki hcre komponentlerini ayrma ve etenolla nkleik
asit presipitasyonunu ierir. Baz zel amalar iin, plazmit DNAsn da dier
nkleik asitlerden (RNA ve kromozomal DNAdan) ayrmak gerekir. Geleneksel
olarak plazmitlerin ayrlma ii iin de ethidium bromidin bulunduu cesyum
klorid (CsCl) gradient santifj yntemiyle ayrlr. Bu yntem halen kullanlyor.
Plazmit ayrma yntemi; ayrlan plazmitlerin saflk derecesine, plasmitlerin
ayrlca numune saysna ve ihtiyaca gre deiir. Plazmit ayrma metotlarndan
en doru ve gvenilir olan alkalin liziz teknigidir. Bu teknik restriksiyon,
haritalama ve klonlama amacyla kullanlacak plazmitlerin abuk ve yeteri kadar
elde etmesini salayan etkin bir yntemdir. Bu teknikle yaklak 1g plazmit
DNAs saflatrlr ve bu miktardaki plazmit analitik ve klonlama ilemleri iin
yeterlidir. Bu metot literatirde miniprep metodu olarak da bilinir.
Plazmit ayrmada kullanlan miniprep metodu yksek kalitede ve miktarda
plazmit DNAs elde etmek amacyla modifiye edilebilir. Bu metotta bakteriler
byk hacimde gece boyunca kltre alnr ve sonra plazmitler prosedure gre
 36

ayrlr. DNA ayrtrlrken dardan yabanc DNA veya RNA konataminasyonu

olmamaldr. Ham lizat iyon deitirme kolonundan geirilerek bir basamak ileri
saflatrmaya tabi tutulur. Kolon sadece nkleik asitlere balanr geriye kalan
protein ve karbonhidratlar uzaklatrlm olur. Kolon RNA kalntsn
uzaklatrmak iin bafrla ykanr sonra plazmt DNAs elde edilir.

Figr 2.1.5.4.1. Miniprep prosedrne gre plazmit ayrma. Gece boyunca kltr otamnda
tutulan E. Coli baterilerinin blunduu ortamn 1.5mlsi defalarca restriksiyon yapmay
mmkn klan yeterli miktarda plazmit salar. a) Agar pleytinden bir bakteri kolonisi seilir
ve antibiyotik ieren kltr ortamna aktarlr, gece boyunca oalmaya braklr. oalan
bakterilerin bulunduu kltr ortamndan 1.5ml alnr. Bakteriler ortamdan santrifj
yardmyla pellet olarak tpn dibinde elde edilir. c) Pellet zerine glikoz ihtiva eden bafr
eklenir ve pellet datlr. d) Sspansiyon halindeki bakterilerin bulunduu ortama sodyum
hidroksit ve deterjan (Sodyum Dodesil Slfat veya SDS) eklenerek bakteriler liyze edilir. Bu
alkali ortamda bakteri DNAs denatre olur bu nedenle ortam olduka vizkoz hale gelir. Buz
derecesindeki potasyum asetatn eklenmesi hcre artklarnn ve membranlarnn birbirine
balanmasna neden olur. f) Santrifjle hcre kalntlar, bakteriel DNA ve membranlar
(bakteriyek kromozomlar membrana balanr) tpn altnda pellet halinde ayrtrlr. Ham
lizatn st ksmda (spernatantda) plazmit DNAs RNA ve protein vardr. Elde edilen plazmit
DNAs yksek oranda ribozomal RNA ile kontamine edilmitir fakat bunun daha sonra
plazmitler zerinde yaplan ilemlere bir zarar yoktur hatta RNA plazmit DNAsnn
ayrtrlmasna yardm eder.
 37

Ham lizattaki RNA ve protein iyon deiim kolonundan geirilerek ayrtrlr

Figr 2.1.5.4.2. yon deiim kolonu yardmyla plazmid ayrma. Temiz lizat iyon deiim
kolonundan geirilir. Lizattaki proteinler ve karbonhidratlar kolona balanmaz akar gider.
Sonra kolon 1 M tuz ieren solsyonla ykanr ve ylama RNAy uzaklatrr. Sonra kolun
1.25 M tuz ieren solsyonla ykanarak ift zincirli plazmid DNas kolondan ayrlr.

2.1.5.5. Hayvan hcrelerinden DNAy ayrmak

Eer byk dokulardan DNA ayrlacak ise; doku nce hcre dzeyine kadar
kltlr. Bu ilem sv nitrojende dondurrulup havanda ezilerek salanr. Eyer
bir hcre kltrnden DNA extrakte edilecek ise bu ileme gerek yoktur. ki
metotta da ama; bir hcre pelleti elde etmek ve o pelletten DNA y ayrt
etmektir. Bunun iin hcre sspansiyonu santrifje tabi tutularak pellet haline
getirilir ve zerine arlk veya hacim esasna gre 10 kat fenol eklenerek bir
ka dakika elle alkalanr. Bu alkalama sonunda fenol ve proteinler altta
(krmz svda), DNA ve RNA ise stteki affaf ksmda bulunur. Pipetle bu
affaf ksm alnarak baka bir kaba konur sonra RNA yi yok etmek iin zerine
reneaz enzimi ilave edilir ve geriye sadece DNA kalr. Elde edilen DNA 70
derecede kullanlmak zere muafaza edilir.
 38

Fenol

10 kat
fenol ekle alkala
Santrifj

Hcre Hcre Fenol + hcreler

sspansiyonu pelleti

RNA az

RNA y enzim
Reneaz paralar sadece
ekle DNA kalr.

DNA +RNA DNA

Alta oken
fenol

Resim 2.1.5.5.1. DNA hayvan hcrelerinden fenol ve RNA az kullanarak ayrlr.

2.1.5.6. Bitki hcrelerinde DNAy ayrma

Bitki DNA sn ayrt edbilmek iin iin yaplmas gerekr.
1- Proteinleri ayrmak
2- RNA y ayrmak
3- Karbondidratlar ayrmak.
Proteinleri ayrmak iin behsedildigi gibi fenol ekstraksyonu veya proteaz ile
muamele yaplr. RNA y ayrt etmek iin ise ribonkleaz ile muamele yaplr ve
geriye DNA kalr. Fakat DNA nn blunduu ortamda baz karbohidratlar
bulunabilir nk fenol extraksiyonu ile bu karbonhidratlar uzaklamamtr. Bu
karbonhidratlar uzaklatrmak iin deterjan (Cetyltrimethylammonium
bromide) eklenerek sanrifj yaplr. Bu deterjan nkleik asitlere balanr ve
santrifj sonunda DNA+deterjan kopleksi tpn altnda pellet olarak bulunur.
 39

Usttek svda ise karbonhidratlar ve proteinler bulunur. stteki sv doklerek

geriye kalan pelletin zreine ribonkleaz ieren etenol eklenr sonra santrifje
tabi tutulur ve saf bitki DNA s pellet olarak tpn altnda grlr.

2.1.6. Rekombinant DNA teknolojisinin salad yararlar

1- Bu teknik ile saf genler DNA daki diger genlerden ayrt edilerek belirlenir.
Sonra da bu genin yeri, yaps ve zelligi allr.
2- Bir zelligi belirten geni DNA zerinde bulmak iin DNA
endonkleazlarla kesilerek jel zerinde yaylp sonra her bir fregment
plazmidlere eklenip bakterilerin tepkisine bakarak bilinmiyen genin DNA
zerindeki yeri bulunur ve allr.
3- Bu teknik sayesinde bakterilerden hayvansal protein elde edilebilir.
4- iftlik hayvanlarnn DNAsnn modifiye edilmesi sonucu bu hayvanlarn
stnden ve yumurtasndan ilalar salanabilir.
5- Hayvanlarn gen transferi sayesinde abuk gelimeleri ve kesime abuk
ulamalar salanabilir.
6- Hayvanlarn yn verini ve st verimi artrlabilir.
7- Gen nakli sayesinde organlar insanlar iin kullanlabilen hayvanlar elde
edilebilir. Bu havvanlar organ naklinde kullanlacak organlarn kaynan
olutururlar.
8- Hastalklara dayankl hayvanlar elde edilebilir. rnegin ok sayda
hayvann bulunduu bir ortamda yaayabilme veya hijyenik olmayan
iftlik ortaminda hastalanmama gibi zellikler klonlamayla salanabilir.

3. GEN KLONLAMA YOLUYLA REKOMBNANT PROTENLERN

SENTEZLES
Bakteriye ait olmayan yabanc genlerin (rnein hayvana ait genlerin) standart
vektrlere balanarak bakterilere (rnein E.coli ye) transferi sonucu transfer
edilen genin karl olan proteini sentezlemek mmkn deildir. nk
hayvana ait genin yapsnda bulunan biyokimyasal mesajlar bakteri
alglayamaz. Bunun sonucu bakteri ierisinde transkripsiyon ve translasyon iin
gerekli fizyolojik mesajlar ilgili birimlere iletilemez. Bylece sz konusu
rekombinant protein sentezlenemez. rnein E coli bakterisine ait bir genin
yapsnda deiik mesajlar verme yoluyla genin genom ierisinde var olduunu
belirten takibeden transkripsiyonu ve translasyonu salayan ksa nkleik asit
zincirleri vardr. Bakteriye sinyal veren bu mesaj ksmlar unlardr.
1- Genin promoter ksm: Gen transkripsiyonunun balad yere karlk
gelen ksmdr. Bu ksma RNA polimeraz balanr ve transkripsiyon
balar. E.coli bakterilerinde genin promoter ksm transkripsiyonu
salayan RNA polimeraz enziminin sigma alt nitesi tarafndan tannr.
2- Genin terminal ksm: Gen transkripsonu ileminin sonlanmas iin
gerekli ifreyi kodlar ve transkripsiyon ii sonlanr. Bu ksm kendi
kendine e baz ifterinden olumu ksa nkleotit zinciridir.
 40

3- Genin ribozoma balana ksm (Ribozom entry site). Ribozom

tarafndan tannan ksa nkleotid zinciridir. Ribozom bu noktadan eli
RNA ya balanr. Ribozomda antikodon sentezi bu noktadan itibaren
balar.
Bakterilerde olduu gibi hayvanlarn genleri de gen transkripsiyonunu,
tanslasyonunu salayan nkleik asit zincirleri ierir. Bu zincirler E.coli
bakterisine ait genlerinkine benzemezler. Aada E.coli ve insan genine ait
promoter ksmlar karlatrlmaktadr.

a) E. Coli

TTGACATATAAT.. Gen
35 tekrar 10 tekrar

b) nsan
Farkl mesajlarTATAAAT.. Gen
25 tekrar

Her iki promoter arasnda benzerlikler var fakat E.coli bakterisindeki RNA
polimerazn transkripsiyonu salamak zere insan genin promoter ksmna
balanmas mmkn grnmemektedir. Bu nedenle insana ait bir gen E.coli
bakterisi ierisinde aktif deildir nk bakteri gen tarafndan gnderilen mesaj
tanmyor.
Bu durumda yabanc gen E.coli baktersine ait biyokimyasal mesajlarn
kontrol altnda olmaldr ki yabanc gen ile bakteri arasndaki transkripsiyona
ve translasyona ynelik biyokimyasal iletiim salansn. Bu nedenle yabanc
genin klonlanaca vektr bakteriye ait bu biyokimyasal mesajlar tamas
gerekir. Bu vektrlere ekspresyon vektrleri denir. Bu vektrler bu zellikleriyle
klasik vektrlerden farkldrlar. Aada gsterildii gibi yabanc gen ekspresyon
vektrne yklenerek E.Coli bakterinse transfer edilir. Artk bakteri gen
tarafndan gnderilen mesajlara tepki verir bylece rekombinant proteinin
salglanmas mmkn olur.
P
R
P: E.Coli bakterisne ait promoter
R: E.Coli bakterisine ait poli A kuyruu Yabanc gen
(Ribozomun baglandg ksm, Ribozom
entry site) T
T:E.Coli bakterisine ait terminatr ksm
 41

3.1. Ekspresyon vektrlerinde promoterin nemi

Ekspresyon vektrlerin en nemli bileeni promoterlerdir. Promoterler gen
ekspresyonunun balang safhasn kontrol ederler. nk RNA polimeraz
enzimi promoter ksmndan DNA ya balanr ve transkripsiyon balar bylece
DNA zerinden eli RNA sentezlenir. Ksaca eli RNA sentezini ve miktarn
belirler. Bu nedenle rekombinant protein sentezi nitelik ve nicelik olarak
ekspresyon vektrlerindeki promoterin yapsna ve potansiyeline bamldr. Bu
sebeple promoter secerken ok dikkatli davranmak gerekir. E.coli bakterisine ait
genelde kabul grm iki tane promoter vardr. Bu promoterler TTGACA ve
TATAAT dir. E.Coli bakterisine ait genlerin promoter ksmlarn oluturan
zincirler genelde bahsedilen iki tip zincirden farkl deildirler. Bu promoterlerde
meydana gelen kk bir farkllk gen transkripsiyonunun seyrini deitirir.
Promoterler gl ve zayf promoterler olmak zere iki snfa ayrlabilir.
Gl promoterler yksek derecede transkripsiyon salayabilen promoterlerdir.
Bu promoterler translasyon rnlerine hcre tarafndan fazla gereksinim
duyulan genleri kontrol ederler. Zayf promoterler ise fazla aktif deillerdir.
Hcreler baz genlerin translasyon rnlerine az miktarda gereksim duyarlar.
Zayf promoterler bu genlerin tarnskripsiyonunu kontrol ederler. Bu nedenle bir
ekspresyon vektr gl promoter iermelidir ki klonlanan genin
transkripsiyonu ve translasyonu yksek seviyede salansn.
Promoterlerin foksiyonlarn kontrol etmek yoluyla genleri inaktif veya
aktif hale getirmek (Gen regulasyonunu salama) mmkndr. E.coli
bakterilerinde genleri aktif hale getirilebilen veya inaktif hale getirilebilen
genler olarak iki gruba ayrlabilir.
a) Aktif hale getirilebilen gen: Transkripsiyonu belli bir kimyasal
maddenin ortama ilavesiyle balayan gendir. lave edilen kimyasal madde
aktif hale getirilebilen genin kodlad enzimin substratlarndan biridir.
b) naktif hale getirilebilen gen: Regle edici bir kimyasal maddenin
ortama ilavesiyle aktivitesini kaybeden gendir.
Genleri aktif veya inaktif hale getirme ii iin nemli olan zincirlerin birou
genin promoter ksmnda bulunur. Bu zincirler ayn zamanda ekspresyon
vektrlerinde mevcuttur. Promoter tarafndan regle edilen geni inaktif hale
getiren kimyasal maddeler ayn zamanda klonlanan genin ekspersyonunu da
regle ederler. Bu durum rekombinant proteinlerin retilmesinde nemli
avantajlar salar. rnein bakteri tarafndan retilen rekombinant protein
kltrdeki bakteri zerinde toksik etki yapabilecek kadar fazla olabilir bu
durumda rekombinant proteini kodlayan genin promoter ksmn kimyasallarla
inaktif hale getirmek sretiyle rekombinant proteinin toksik etki yapacak kadar
fazla olmas engellenebilir. Fazla protein retimi nedeniyle rekombinant
plazmitin oalmas engelleyebilir sonuta plazmit kltr ortamndan yok
olabilir.
 42

3.1.1. Ekspresyon vektrlerinde kullanlan E.Coli promeoterleri

Baz E.Coli promoterleri gen reglasyonunda etkinlik ve kolaylk salarlar. Bu
tip promoterlerden en fazla kllanlanlar

a) lac promoteri: -galaktosidaz kodlayan lacZ geninin transkripsiyonunu

kontrol eden promoterdir. Bu promoter kltr ortamna isopropyl--D-1-
thiogalactopyranoside (IPTG) ilave edilerek aktif hale getirilir. Bylece
ekspresyon vektrndeki genin transkripsiyonu balar.
b) trp promoteri: Triptofan aminoasitinin biyosentezinde grev alan
enzimleri kodlayan bir grup genin fonksiyonunu kontrol eden
promoterdir. Bu genler promoterin yukarsnda (restriksiyon noktasna
uzak) bulunurlar. Kltr ortamna triptofan amino asit eklendii zaman trp
promoteri inaktif hale gelir. Bylece bu genlerin transkrisiyonu durur ve
triptofan sentezlenmez. Bu promoter ortama 3--indolikrilik asit
ilavesiyle aktif hale getirilir.
c) tac promoteri: trp ve lac karm bir promoterdir fakat ikisinden
oldukca gldr. Bu promoter de IPTG ilavesiyle kolayca inaktif hale
getirilir.
d) PL promoteri: Bu promoter DNA nn transkripsiyonundan sorumludur.
PL oldukca gl promoterdir E.coli RNA polimeraz tarafndan tannr.
Bu promoter cI genin kodlad proteinlerle inaktif hale getirilir.
Promoteri inaktif hale getiren protein yksek scaklkla inaktif hale
getirilir ve transkripsiyon balar. Dk scaklkta (30 oC nin altnada)
protein promoteri inaktif hale sokar.

3.1.2. Expresyon vektrlerinde ribozoma balanma ksmnn ve terminal

ksmnn nemi
Etkin bir ekspresyon vektr sadece gl kontrol edilebilir promotere (P)
ihtiyac gstermez ayn zamanda ribozoma balanan ksma (R) ve terminal ksma
(T) de gereksinim gsterir. Bu i iin kullanlan ekspresyon vektrlerine P, R ve
T ksmlar nceden yklenmi haldedir. Vektr zerindeki restriksiyon
noktasna (genelde bu ksm R ve T arasndadr) klonlanmak istenen gen
yerletirilir.
R
P Restriksiyon noktas
P: E.Coli bakterisne ait promoter

R: E.Coli bakterisine ait poli A kuruu T

(Ribozomun baland ksm, Ribozom
entry site)

T:E.Coli bakterisine ait terminatr ksm

 43

Bu ekilde hazrlanm vektrler ayn zamanda kaset vektr olarak da

adlandrlr. Bu durumda promoter ksm, ribozoma balanan ksm ve terminal
ksm E.coli bakterisine ait genin dier ksm ise donor hayvana aittir. Bylece
translasyon sonucu retilen rekombinant protein yabanc genin kodlad
proteinin ayns deildir, hibrit proteindir. Bu durum ayn zamanda bir takm
avatajlar salar.
1- Rekombinant proteinlerin yarlanma mr ayn proteinin doal
formundan ok uzundur. Bunun sebebi rekombinant proteinin E.coli
bakterisine ait ksm tamas nedeniyle yabanc hcrelerin bakteriye ait
ksm tanmamas ve paralayamamasdr. Eer bu hibrit protein ila veya
hormon olarak farkl hcre kltrne eklenirse veya hayvanlara verilirse
yarlanma mr ayn proteinin doal formundan ok daha uzundur. Bu
edenle hayvanlara enjeksiyon iin daha ok rekombinant from tercih
edilir.
2- Rekombinant proteindeki bakteriyel ksm proteinin balanma
kromatorafisiyle saflatrlmasna yardm eder. Bakteriyel ksma
glutatyon-S-transferaz enzimi balanr. Karmn iindeki balanm
rekombinant protein kromatorafyle ayrlr.

Elde edilen rokombinant protein iin tek dezavantaj bakteriye ait ksm
tamasdr. ou zaman bu ksm proteinden uzaklatrmak gerekir. Bu i iin
enzimlerden yararlanlr.

3.2. ekirdekli (eukaryotik) hcrelerden rekombinant protein sentezleme

Mayalar ve funguslar bakteriler kadar kolay kltre alnrlar. Fuguslara ve
mayalara ok hcrelilere ait genler transfer edilerek kltr ortamnda
rekombinant protein sentezi salanabilir. ekirdekli hcreler iin de ekspresyon
vektrleri bulmak mmkn. Bylece maya ve funguslar kullanarak E.Coli
bakterilerinden daha randmanl protein sentezi salanabilir. Gnmzde birok
hayavansal protein ekirdekli hcrelerden sentezlenmektedir. Hayvansal
proteinlerin ekirdekli hcrelerden etkin sentezi iin ekspresyon vektorlerine
gereksinim vardr. Rekombinant protein sentezi iin kullanlan en popler
ekirdekli mikrop Saccharomyces cerevisiae mayasdr. Aktarlacak gen GAL
promoteri tayan ekspresyon vektr yardmyla mayaya transfer edilir. GAL
promoteri galaktoz epimeraz enzimini kodlar. Bu enzim galaktozun
metabolizmasnda grev alr. Ekspresyon vektrndeki GAL promoteri ortama
galaktoz eklenerek aktif hale getirilir ve transfer edilen genin karl olan
protein sentezlenir. Bu ekilde transfer edilen yabanc genin regulasyonu
 44

salanr. Maya hcreleri fazla miktarda rekombinant protein retirler fakat

Saccharomyces cerevisiae mayasnn retii rekombinant proteinin
glikolizasyon kabiliyeti yoktur ayrca kltr ortamna salglayamaz,
rekombinant protein hcrelerin ierisinde kalr. Bylece proteini saflatrmak
ok kolay deildir. Buna ramen Saccharomyces cerevisiae mayasnn tercih
edilmesinin nedeni bu mikrobun biyokimyas ve genetii hakknda fazla bilginin
mevcut olmas ve elde edilen rekombinant proteinlerin tpta ve beslemede
kullanlmas iin bu mayann gvenilir bir organizma olarak tercih edilmesinden
kaynaklanr. Fazla miktarda rekombinant protein retebilen dier bir maya tr
ise Pichia postaris dir (toplam hcre proteininin yaklak %30 u kadar
rekombinant protein retir). Bu maya trnden elde edilen rekombinant
proteinin hayvansal proteinler gibi glikozilasyon kabiliyeti vardr. Bu mayadan
elde dilen glikolize edilmi rekombinant protein damardan verilirse antijenik
reaksiyona sebep olmaz. Saccharomyces cerevisiae mayas iin de bu durum
ayndr. Pichia postaris mayasna gen transfer iin kullanlan ekspresyon
vektrndeki promoter alkol oksidaz (AOKS) promoteridir ve metonolla aktif
hale getirilir.
Bu konuyla ilgili almalarda tercih edilen dier maya trleri Aspergillus
nidulans ve Trichoderma reesei dir. Bu mayalarla almann avantajlar:
1- rettikleri rekombinant proteinlerin glikolizasyon kabiliyeti iyidir.
2- rettikleri rekombinant proteini kltr ortamna salglama kabiliyetleri
vardr.

3.2.1. Hayvan hcrelerini kullanarak rekombinant protein retimi

Mikroorganizmalardan tamamen aktif rekombinant hayvansal proteinlerin elde
edilmesindeki zorluklar biyoteknolojiyle ilgilenen bilim adamlarn hayvan
hcrelerinden rekombinant protein elde etme yoluna itmitir. Proteinlerin
kompleks yaplar ve glikolizasyon durumlar nedeniyle aktif protein sentezi iin
uygun host hayvan hcresidir. Hayvan hcrelerinin kltr 1960 ylndan beri
yaplyor. Fazla miktarda hcreyi kltre almak ve devaml kltr ortam
oluturmak mmkn. Baz hcre kltrnde karlalan nemli bir problem bu
hcrelerin oalmas iin kat yzeye balanmaya ihtiya gstermeleridir. Bu
durum kltr kaplarnn dizaynlarn daha kompleks hale getirir. Bu nedenle
yzey alan oluturmak iin kltr ortam ierisine pleytler yerletirilir. Bu
problemi zmenin baka bir yolu ise kltr ortamna kk kat partikller
(rnein kk selloz partiklleri) koymaktr. Konulan partikllere hcreler
balanr ve oalr. Kltr ortamndaki hayvan hcrelerinin younluu mikro
organizmalarn kltr ortamndaki younluundan azdr. Bu da hayvan
hcrelerinden retilen rekombinant proteinin az olmasna sebep olur. Bu duruma
tlerans gsterilebilir nk hayvan hcrelerinden elde edilen rekombinant
protein aktiftir.
Hayvan hcrelerine gen transferi iin kullanlan ekspresyon vektrnde
insan hsp-70 genine ait heat-shock promoteri vardr. Bu promoter 40C nin
 45

zerinde aktif hale geer ve rekombinant protein sentezi balar. Kullanlan dier
bir promoter ise fare metelotionin geninin promoter ksmdr. Bu promoter inko
tuzunun (ZnSO4) kltr ortamna ilavesiyle aktif hale gelir ve rekombinant
protein sentezlenir.
Bcek hcre kltr rekombinant hayvansal protein elde etme konusunda
hayvan hcre kltrne alternatif tekil etmektedir. Bcek hcre kltr hayvan
hcre kltr gibidir fakat rekombinant protein sentezleme potansiyelleri doal
olarak hayvan hcrelerinkinden iyidir. Bceklerde bir grup virs mevcuttur. Bu
virslere bacolovirsler olarak isimlerdirilirler ve omurgal hayvanlar infekte
etmezler. Bu virslerin genomu polihedrin genini ierir. Bu genin karl olan
protein toplam hcre proteininin %50 sini tekil eder. Eer bu genin yerine
yabanc yen yerletirilirse ayn miktarda protein ine sentezlenebilir.

3.3. Alarn rekombinant yolla elde edilmesi

Bir virse spesifik antobodi sadece virsn tamamna kar vicut tarafndan
gelitirilmez ayn zamanda o virsten izole edilmi bir viral bileene kar
(mesela antijenik kapsl proteinine kar) da gelitirilir. rnein o virsn
kapslnden izole edilmi bir proteine kar da vicut o virsn tamamna kar
antikor retir. Bir virse ait antijenik proteini kodlayan gen belirlenebilir ve
eksperesyon vektrne nceden belirildii gibi yklenerek bakteriye transfer
edilir. Bakteri kltr ortamna virse ait rekombinant kapsl proteinini fazlaca
salglar. Daha nce de ifade edildii gibi bu protein hibrit proteindir, a olarak
kullanlabilir. Bu ekilde elde edilen alar hastalk amilini iermedii iin
hastala sebep olmazlar, yan etkileri yok denecek kadar azdr. Bu tip alar
yeterli miktarda ksa srede elde edilirler. Fakat bu metotla a elde etme
yntemi tamamen baarl deildir. nk kapsl proteini virsn tamam iin
antijenik zellik bazen tamayabilir. Bu metot kullanlarak en baarl a
hepatit B virsne kar gelitirildi. Hapatit B virsn kapsl proteinini
kodlayan gen 2 m apnda bir ekspresyon vektrne yklendi (p.133). Vektr
saccharomyces cerevisiae mayasna transfer edildi. Maya kltr ortamna yeteri
kadar hepatit B virsnn kapsl proteinini sentezledi. Kltr ortamndan
ayrtrlan protein maymuna enjekte edildi ve tam koruma salad. Bu ann
insanlar iin de kullanlmasna karar verildi.

3.3.1. Canl rekombinant alarn elde edilmesi

Canl vaccinia virslerinin iek hastal (smallpox) enfeksiyonuna kar
kullanm 1796 ylna dayanr. Vaccinia virusu insan salna zarar verir fakat
bu virsle infekte olan birey dier tm tehlikeli somallpox virslerine kar
baklk kazanr. Vaccinia virsnn a olarak kullanlmas dnya apnda
tehlikeli iek hastal virslerinin 1980 ylnda yok edilmesini salamtr.
Son zamanlarda ileri srlen bir fikir gergince canl rekombinant vaccinia
virsleri dier viral hastalklara kar canl a olarak kullanlabilirler. rnein
hastalk amili virsn kapsl proteinini kodlayan gen (rnein Hepatit B yzey
 46

antijenini kodlayan gen) belirlenerek vaccinia virsnnn genomu ierisine

konursa (vaccinia promoterinin muvcut olmas durumunda) Hepatit B virsnn
yzey antijenini kodlayan gen vaccinia virsnde fonksiyonel hale geer. Bu
ekilde elde edilen rekombinant vaccinia virs damara enjekte edilirse oalr.
Boylece vicutta hem vaccinia virsleri hem de nemli derecede Hepatit B
virsne ait yzey antijeni miktar artar. Bylece hem smallpox virisne kar
hem de Hepatin B virsne kar baklk kazanacaktr.
Bu yntem byk potansiyel arz ediyor. Zaten birka yabanc gen ihtiva
eden vaccinia virsleri elde edilmi durumda. Dizayn edilen bu virslerin
baklk zerine etkisi deney havanlar zerinde incelenmektedir.

3.4. Hastala sebep olan genlerin tespit edilmesi

Genetik hastalklar kaltsaldrlar. Sendrom problemi olan bireyin yann belli bir
dneminde hastalk kendini gsterir. Baz kaltsal hastalklarda hastala sebep
olan gen genozom kromozomlar zerindedir. Hemofilide durum byledir,
hastaln sebebi olan gen X kromozomu zerindedir. Bu nedenle geni tayan
erkeklerin hepsi hemofili hastasdr. Sadece bir X kromozomu zerinde hastalk
sebebi geni tayan diiler tayc, her iki X kromozomu zerinde de ayn gen
bulunuyorsa kadn hemofili hastasdr. Bazen de sebep gen otozomal kromozom
zerinde bulunur ve ounlukla ressesivdir. Bu nedenle her iki ift kromozomun
da ayn geni tamas gerekir ki hastalk meydana gelsin. Birka genetik
hastaln sebebi olan gen otozomal kromozom zerinde dominant haldedir.
Genin sadece bir kromozom zerinde bulunmas hastala sebep olur. Baz
genetik hastalklarn semptomlar erken yalarda grlmesine karn baz
genetik hastalklarnki ise orta ya ve yallk dnemlerinde grlmeye balar.
Genetik hastalklarn semptomlar dormant halde iken metabolik veya evresel
etkenler nedeniyle semptomlar grlmeye balar. Genetik hastalklar hayvan
poplsyonlarnda srekli mevcuttur. Genetik hastalklarla mcadele git gide
nem kazanmaktadr. nk alarn ve etkin antibiyotiklerin elde edilmesi
sonucu lmcl hastalklarn etkin kontrol mmkn olmu bu da genetik
hastalklara verilen dikkatin artmasna sebep olmutur. Medikal bilimler bulac
hastalklarn kontrolnde baarl oldu. Ayn baar genetik hastalklarn
kontrolnde salanabilir.

3.4.1. Genetik hastala sebep olan genlerin belirlenmesi niin nemlidir?

a) Kromozom zerinde genin tespit edilmesi, izole edilmesi, o genin
biyokimyas hakknda bilgi sahibi olmay salar bu da hastala uygun
terapi stratejisinin gelitirilmesini mmkn klar.
b) Genin kromozom zerindeki yerinin ve zincirinin belirlenmesi o gende
meydana gelen mutasyonlarn ve bu mutasyonlarn farkl fertlerde ne
ekilde ve derecede etkili olduu gzetlenebilir. Homozigot ve tayc
olanlar belirlenir. Tayc durumda olanlara rehberlik edilerek gelecekte
 47

olmas muhtemel problemin olumas engellenir bu ekilde genetik

hastalk poplasyondan eradike edilebilir.
c) Genin terapisi iin o genin belirlenmesi bir gereksinimdir.
Son yllarda genetiksel hastalklara yol aan birka gen tespit edilmi
durumdadr. rnein kadnlarda meme kanserine sebep olan genin yeri
belirlenmi ve izole edilmitir. Artk bu defektif gen iin uygun terapi metotlar
mevcuttur.

3.4.2. Gen terapisi

Genetiksel hastala sebep olan mutasyona uram genin doru kopyasn
uygun metotlar kullanarak probleme sebep olan genle deitirilmesi ilemine
gen terapisi denir. Bu metotlar germinal hcre terapisi metodu ile somatik hcre
terapisi metodudur.
a) Germinal hcre terapisi: Dllenmi yumurta hcresine probleme sebep
olan genin doru kopyas mikro enjeksiyonla aktarlr sonra zigot diiye
transfer edilir. Eer doru gen baarl bir ekilde transfer edilmi ise o
zigottaki genetik problem zlr, oluacak yeni bireyde hastalk
grlmez.
b) Somatik hcre terapisi. Vcuttan ayrlmas kolay kk hcrelerine (rnein
kemik iligi hcrelerine, embryonik kk hcrelerine) doru genin
retrovirslerle transfeksiyonu ve vicuda tekrar geri verilmesini ierir.
Doru gen izole edilir sonra retrovirsler araclyla kk hcrelerine
nakledilir. Doru genle transfekte olan kk hcrlerinden kan hcreleri
oluur ve oluan yeni kan hcreleri doru geni tar. Bu metot kaltsal kan
hastalklarnn tedavisinde baar vaat etmektedir.
Retrovirsleri vektr olarak kullanmann nedeni bu virslerin transfeksiyon
kabiliyetlerinin ok yksek olmasdr. Bylece ok sayda kk hcresi ksa
srede normal genle transfekte olur.
Bir gende meydana gelen bir mutasyon sonucu o gen fonksiyonel bir
proteini kodlamaz. Bu durumda mutasyona urayan genin transferi gereklidir
fakat mutasyona uram genin genomdan uzaklatrlmas gerekli deildir.
Genin dominant olmas durumunda ilem daha zordur. nk bu durumda hem
genin doru kopyasnn transferi hem de probleme sebep olan genin
uzaklatrlmas gereklidir.
 48

4. DNA POLMORFZMLERNN TESPT (DNA Fingerpirint)

Her ferdinin genomu kendine zeldir (Tek yumurta ikizleri hari). nk DNA
zerinde kaltmla nesilden nesile deimeden geen nkleotit zincirleri vardr.
Bu zincirlerin says ve uzunluu her fertte farkldr. Bu nedenle DNA
dzeyindeki bu farkllar (polimorfizmler) tekrar says polimorfizminden (Short
Tandem Repeats, STR) veya kesim uzunlu polimorfizminden faydalanlarak
tespit edilirler.

a) Tekrar says polkimorfizmi (TRP, Temden Repeat Prlimorfizm): Bir

fertin DNAs zerinde belli bir nletit dizisi (ortalam 2-5 bazlk ksm) hep ard
arda tekrar eder. Bu arda arda genlen ksa zincirli DNA paralar kk uydu
DNA lar ve mikro uydu DNA lar veya deiken sayl arda arda gelen tekrarlar
diye ifade edilir. Belli bir lokusta bu uydu genlerin tekarlanma says her fert iin
farkldr. Bir veya birden fazla lokusta bu tekrarlanma saysndan faydalalanarak
bir ferdin DNA s deerlerinden ayr edilir. Bu teknik son derece doru ve kesin
sonu verir. Bu metot yardmyla daha etkin seleksiyon yapmaya, deiik
hayvan ve bitki rklarnn akrabalk derecelerinin belirlenmesine, soy aalarnn
ortaya karlmasna, paleontolojiye ve forensik bilime hzmet eder. Aada bir
fertin DNAsnn 334 nkleotitlik ksm grlyor. Koyu yazlm ksnlarn
(gatag) nasl arda arta tekrar etikti grlmektedir. ernekte tekrar says 6 dr bu
say her ferd iin farkldr.
1 aatttttgta ttttttttag agacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg actatggagt
61 tattttaagg ttaatatata taaagggtat gatagaacac ttgtcatagt ttagaacgaa
121 ctaacgatag atagatagat agatagatag atagatagat agatagatag atagacagat
181 tgatagtttt tttttatctc actaaatagt ctatagtaaa catttaatta ccaatatttg
241 gtgcaattct gtcaatgagg ataaatgtgg aatcgttata attcttaaga atatatattc
301 cctctgagtt tttgatacct cagattttaa ggcc

Uygun primerler kullanlarak bu tekrar eden ksmlar PCR ile oaltlr sonra jel
elektroforezi yaplr. Jel zerimde farkl srada ve sayda bantlar grlr bu her
fertte farkldr.

b) Kesim uzunluu polimorfizmi (RELP, Restriction Lenght

Polimorphizm): Belli bir lokusun veya iki lokusun PCR ile oaltlmas ve
endonleaz ile kesilmesi sonucu oluan DNA paralarnn uzunluu her fert iin
farkldr. Bu durum kesim uzunluu Polimorfizmi (RELP) olarak ifade edilir.
Belli bir lokustaki DNA zincirinde meydana gelen bir nkleotitteki
deiiklik bir endoknleaz enzimine balanma yeri olutur veya balanma
yerinin yok olmasna sebep olur. Diyelimki o lokusta bulunan DNA zincrindeki
nkleotit siras ferdin birinde AGATCC ile balyordu fakat diger fertte
mutasyonla A yerine G gelirse o zaman zincir GGATCC olur. nce PCR
yaplarak bu lokuslar oaltlr sonra bu lokuslar endonkleazla kesilir ve
elektroforeze tabi turulursa her fertte farkl sayda ve srada banlar grlr.
 49

Resim 11. DNA serindeki bir lokusdaki veya iki lokustaki DNA paras uygun primerler kullanlark PCR
yardmyla oaltlr ve saf DNA rnekleri elde edilir. Her iki fertten elde eilen Saf DNA rnekleri ayn
endonkleaz enzimiyle kesilir. Yukardaki ekilde bir fertin DNAs birbirinden farkl 3 dirininki ise iki bant
vermitir. Bu iki fert ayn kii deildir, nk bantlar ayn hizada deil ayn zamanda sayllar da farkl.

4.1. Bir veya birden fazla lokustaki polimorfizmden faydalarak DNA tipini
tespit etmek.

Tek lokustaki polimorfizm PCR primerleri kullanlarak tespit edilir. Birden fazla
lokustaki polimorfizmi tespit etmek iin tek lokus problarn karm
kullanlarak yaplr. Bu ilem daha ok DNAnn genotipinden ziyade fenotipini
tespit etmeye yarar. Bilinmeyen bireyin tespiti iin tek lokus zerindeki parmak
izini bilmek daha etkilidir. Birden fazla lokustaki parmak izini bulmak tm bu
bilgilere ek olarak DNA nn fenotipi hakknda da bilgi sunar.
 50

Aada ekil 4.1.1 de PCR sonucu bir lokustaki DNA parnak izi grlmektetir.
(A=Anne, B= Baba, C= ocuk). Aada grldg gibi ocuun genotipi hem
erkegin hem de kadnn karmdr.

Aada ekil 4.1.2. de ise birden fazla lokustaki DNA parmak izi grlyor (K=
Kadn; =ocuk, E1= spheli birinci erkek, E2= pheli ikinci erkek). Acaba
ocuun babas kim?

Aada olay yeri incelemesi sonucu elde edilen nmnelerden (X) DNA elde
edildi. ldrlen() ferdin katili olduundan phelenilen 3 farkl kiiye ait
DNAlarn PCR ile oaltlp endonkleazla kesilmesi sonucu elde edilen
bantlar grlyor. Olay yerinden alnan numunenin (X) katile ait olduu
sanlyor. Acaba katil kim?
51
 52

5. GENETK MODFFKASYONLARIN HAYVANCILIKTA

KULLANILMASI
Gelimi lkelerde hayvanclktan salanan gelir ziraattan salanan toplam
gelirin yaklak yarsn oluturur. Gelimekte olan lkelerde ise hayvanclktan
salanan gelirler ziraattan salanan toplam gelirlerin n oluturur. Gelimekte
olan lkelerde hayvancln ziraattaki nemi hzla artmaktadr bunun nedeni
nfusun artmas, gelir seviyesinin ykselmesi ve dolaysyla hayvansal tketim
maddelerine olan talebin artmasdr. Dnya nfusunun fazla artmas dnyann
birok yerinde beslenme yetersizliklerinin artmasna sebep olmutur. Bu nedenle
insanlk hayvanlardan elde edilen tketim maddelerinin miktarn ve kaltesini
artrmk zorundadr.
nceleri hayvanlarn gelimesini ve verimi artran hormonlar
salglandklar bezlerden extrakte edilerek elde ediliyordu imdi ise rekombinant
DNA teknolojisi sayesinde mkroorganizmalardan yksek saflkta ve fazla
miktarda elde edilmektedirler.
Kaynak:nternet: http://www.nlm.nih.gov/visibleproofs//education/dna/rflp.pdf
Cichoz-lach H., CelinSki K., Omka SL M., 2008. Alcohol-metabolizing enzyme gene polymorphisms and alcohol chronic pancreatitis
among Polish individuals. HPB, 10: 138-143

5.1. Sr somatotropini (Bovine Somathotrophin, BST) enjeksiyonu ile st

verimini artrmak
Uzun yllardan beri st srlarna hipofiz bezinden salglanan hormonlarn
dardan verilmesinin st verimini artrd bilinmektedir. Sr somatotropini
sr hipofizi tarafndan salglanan byme hormonudur. Ksaca ya BST ya da
bST eklinde litaretrde bilinir. Protein yapsnda bir hormondur. Bu hormon iki
formda bulnur; birincisi 191 amino asitten oluur ve terminal (en sadaki)
amino asit alanindir. Dier formu ise 190 amino asit ierir terminal amino asit
ise fenilalanindir. 1936 ylnda Rus bilim adam sr hipofizinden ekstrakte
edip saflatrd BST hormonunu st srlarna enjekte etmi, st veriminin
artrdn bildirmitir. Bu hormon kesimhaneden salanan hipofizlerden
ekstrakte edilme yoluyla yeterli miktarda ve saf olarak elde edilememitir. Bu
nedenle hormonun ticari amal kullanmn engellemitir. Aadaki resim bu
hormonun st verimine ynelik fizyolojisini zetlemektedir.
 53

Resim 5.1.1. BST hormonun st verimini artrmadaki etki mekanizmas.

Bugn ise sr byme hormonunu (bST) determine eden genin sr DNAs

zerindeki yeri bilim damlar tarafndan biliniyor. Bu gen sr DNAsndan
alnarak E.Coli bakterisine transfer edilmitir. Bu bakteri hayvanlarn sindirim
kanalnda yaar. Gen transferi sonucu E.Coli bakterisi sr byme hormonu
retmektedir. Bu ekilde hormon ucuz ve ok miktarda retilibiliyor. Aada
(Resim 5.1.2) biyoteknolojik yolla bu hormonun elde edilmesi ve kullanlmas
zetleniyor.
 54

Resim 5.1.2. BST hormonunu rekombinant DNA teknolojisi yardmyla E.Coli

bakterilerinden sentezlenmesi.

Rekombinant DNA teknolojisi ile retilen hormon st ineklerine doumu

takiben 6080 gn mddetle mg lik dozlarla, deri altna veya kas ierisine
injekte edilmektedir. Yaplan bir aratrmada inekler iki guruba ayrlm; bir
gurba her gn 10.3 mg dier gruba ise 20.6 mg BST injeksiyonu yaplm.
neklerin her drt hafta boyunca verdikleri st miktar kg esasna gre
karlatrlmtr. Sonu olarak BST injeksiyonunun stn bileiminde nemli
deiikliklere sebep olmadan st verimini artrdi bildirilmitir (Resim 12.1.3).
 55

Resim 5.1.3. St sgrlarina doumu takiben verilen rekombinant BST hormonu

stn bileiminde herhangi bir degiiklige sebep olmadan st verimini artrmtr.
5.1.4. BST njeksiyonunu yemden yaralanmaya etkisi
Uzunsre BST injeksiyonu st ineklerinin yem tketiminive yemden
yararlanmay nemli lde artrmitir (Tablo 12.1.4).
Tablo 12.1.4. Gnlk artan miktarlarda BST enjeksiyonunu yem tketimi ve st
verimi zerine etkileri
Gnlk enjekte edilen BST miktarlar (mg)
0 12.5 25.0 50.0
17,2 18.6 17,6 20,1
Yem tketimi (kg KM/gn)
St verimi (kg/gn) 24.2 28,9 29.5 33.1

5.1.5. Rekombinat DNA teknolojisini kullanarak yn verimini artrmak

Avusturalya ve yeni zelandada byk koyun iftlikleri vardr bu nedenle bu
lkelerde yn verimini artrmak iin birok aratrma yaplmtr. Yn verimi
gerekli besin maddelerinin koyun trafndan alnmasna baldr. Yn verimi iin
zellikle kkrt ieren sisteyn amino asitine gereksinim vardir. Normal koyun
tarafndan bu amino asit sentezlenememektedir. Sisteyn amino asitinin diyetle
birlikte verilmesi ekonomik degildir. nk rumendeki bakteriler sisteyni
absorbsiyondan nce parcalarlar (OBrien 1998) Sisteyn amino asitinin
esansiyel olmayan amino asit Serinden sentezlenmesi iki gene baldr.
 56

Avusturalyada bir aratrma grubu bu genlerin koyuna transferi zerinde

alyordu. Bu genleri tayan be tane transgenik koyun ve ko elde edildi.
Elde edilen transgenik hayvanlarn yn veriminin daha fazla olduu bildirildi
(Tablo 13.1).

Tablo 5.1.5.1; Siteyn amino asitlerini determine eden genlerin transferi sonucu elde
edilen transgenik koyunlarla normal koyunlar arasndaki yn verimi farklar.
Normal Normal
Ko Transgenik Koyun Transgenik
Ko koyun
Yn verimi 4.67 0.12 5.10 0.14 4.97 0.13 5.14 0.17
(kg)

5.1.6 Gen transferi ile hayvanlarn daha etkin beslenmesinin salanmas

Ruminant hayvanlarn sindirim siteminde bakteriler vardr. Bu bakteriler sellaz
enzimi salglarlar. Bu enzim yemlerdeki selilz paralayarak ya asitlerine ve
basit ekerlere ayrrlar. Bilim adamlar selulaz enzimini determine eden geni
ruminant olmayan hayvanlara (Domuza ve kmes hayvanlarna) transfer
edebilme imknn aratrdlar. Eer bu aratrmadan sonu alnabilirse otluyan
domuz elde edilecekti. Fakat yaplan bu gen tarnsferinin domuzlarn fizyolojisini
ve evreyi nasl etkiliyecei bilinmiyor.
imdiye kadar bu teknik birok kere uygulanm fakat bir takm teknik
zorluklar nedenyle yeterli gelime salanamamtr.
Bu teknik zorlular:
1. Rumen mikroorganizmalarnn ayrlmasnda ve trlerine gre hangi
taksonomik guruba girdiini belirlemedeki zorluklar. Buna bal olarak
rekombinant DNA teknolojisini uygulamadaki zorluklar.
2. Rekombinant enzime ait genin yerini belirlemedeki zorluklar.
3. Rekombinant bakterilerin ortama uyum zorluklar gibi problemlerdir.

5.1.7. Hayvan islahnda molekler tekniklerin kullanlmas

Hayvan islahnn amac hayvanlarn genetik potansiyelini artrmaktr. Bunun
iin temel i: Yksek genetik potansiyele sahip hayvanlar belirlemek ve gelecek
generasyonlarn ebeveyinleri olarak kullanmaktr. Genetik lmler iin u anda
kullanlan metotlar fenotipik verilere ve pedigri kaytlarna dayanmaktadr. Son
zamanlarda genom zerinde yaplan almalar sayesinde fenotipik farklar DNA
dzeyinde gstermek mmkndr. Gelitirilen DNA mikrositelitleri (markarlar)
hayvan slah programnda seleksiyon arac olarak kullanlmaktadr. Bu teknoloji
yardmyla hayvanclkta youn ve doru seleksiyon yapmak mmkndr.
DNA-Mikrostellitlerinin gelitirilmesi deiik hayvan trleri iin linkage
(zerinde durulan karektere ait gen ile uydu genin birlikte birlikte F1 dlne
geii durumu, birlikte kaltm) haritalarnn elde edilmesine neden olmutur. Bu
 57

haritalar yardmyla stn verim gn determine eden genlerin (Kuantitatif

verim lokusunun) DNA zerindeki yeri belirlenebilmektedir. Bylece islah
amacyla kullanlan metotlar daha derinlik kazanmtr. Bu ekilde verimle
alakal genlerin bulunduu lokusa quatitatif verim lokusu (Quantitative trait loci,
QTL) diye adlandrlr. evre faktrleri ve bilinmeyen verim lokuslarnn says
hayvann belli yndeki verim gn tain eder. Hayvann DNA s zerindeki
stellit DNA nn bulunduu lokus kuantitatif verim lokusunun bir sonraki kuaa
transfer edilip edilmedigi hakknda bilgi verir nk bu DNA stelliti (uydusu) ile
sz konusu verim lokusu arasnda linkage (birlikte kaltm) vardr ve birlikte bir
sonraki kuaa geer. Bu bilgileri kullanarak markarn bal olduu verim
lokusu yardmyla yeni nesilin bu verim lokusunu tayp tamad
belirlenebilir.
Bu teknolojisi sayesinde genetik varyasyonlar daha iyi anlalr ve
deerlendirilir. Bylece rk ierisindeki veya irklar arasdaki varyasyonlar
abuk ve etkin bir ekilde verim gn ykseltmek amayla daha etkili
maniple edilebilir. Ayrca bu teknoloji sayesinde genetik kayplar nlenebilir.

6. HASTALIKLAR LE MCADELEDE BYOTEKNOLOJDEN

YARARLANMA

iftlik hayvanlarnda meydana gelen hastalklar ok fazla para kaybna sebep

olmaktadr. Bunlarn banda samal ineklerin yakaland mastitis gelir. Son
zamanlarda hastalklara dayankllk genini tayan transgenik hayvanlarn elde
edilmesine allmaktadr. Bu alanda alan bilim adamlar herhani bir
hastala kar antibodi sentezleyen genlerin transferi konusuna arlk
vermektedir. Bu amala tavanlarn, domuzlarn ve koyunlarn genotipleri
modifiye edilmitir fakat henz bu hayvanlarn transfer edilen genden dolay
antibodi rettikleri spatlanmamtr. Mastitise dayankllk konusunda baz
almalar devam etmektedir. Bu amacla mastitis mikrobuna balanan
liyzostafin (lysostaphin) enzimini reten gen belirlenmi ve ev faresine
klonlanmtr (Hall ve ark., 1993)) fakat klonlama sonucu bu enzim
retilememitir.
Viral hastalklara kar dayankl kmes hayvanlar elde etmek iin
bilimsel almalar balam durumdadr. Kumes hayvanlar birok
retrovirslere kar hassastr. Bu virslerin DNA snn kmes hayvanlarnn
DNA s ile interaksiyonu sonucu kanser hastal oluur. Bu viruslerden biri ile
infekte olan hayvan ayn gurubtaki dier virslere kar baklk kazanr
(Donovan ve ark., 1997). Kazanlan bu bagklk Amerikal bilim adamalarn
ku Leukosis virsne kar dayankllk geni tayan transgenik kmes
hayvanlarn elde etme almasna itmitir. Bu amala bu virsun DNA snn
tamam veya bir ksm alnarak kmes hayvanlarnn embryosuna transfer
edilmitir (Salter ve Crittebden, 1989). Hernekadar bu ekilde elde edilen
transgenik kmes hayvanlar iflik hayvanlar zerinde yaplan gen transferi
 58

konusunda kazanlan baarnn simgesi olarak gsterilse de sonraki almalar

embrioya transfer edilen virs DNA snn hayvann kendi bnyesindeki virslere
balanp lymphoid leukosise neden olduunu gstermitir. Bu nedenle bu
tekniin ticari olarak pratigi nem kazanmad.

6.1. Alar
Alar hayvan hastalklarn kontrol altna alma imkn sunar. Halen bulac
birok hastaligin as mevcut deildir. Geleneksel yolla a gelitirme uzun
zaman alr yaklak 2030 yl bazen 100 yl. Bu nedenle gnmzde her
hastaln as mevcut deildir. Rekombinant DNA teknolojisi kullanarak
ksa srede a gelitirilebilmektedir.
Geleneksel alarn elde edimesinde hastalk yapan l mikroplar veya
hastalk yapamayacak derecede zayflatlm mikroplar kullanlr. Bazen
mikroplar tamamen lmedii ve zayflatlmad iin engellenmesi dnlen
hastalk a yoluyla bulaabilir. Rekombinant DNA teknolojisi yoluyla elde
edilen alar hastalk yapan geni iermez. Bu nedenle rekombinant alar
hastalga neden olmadan o hastalga kar bakln kazanlmasna imkn
verir.
ap hastalg viral bir hastalktr. Bu hastalk srlar, koyunlar ve diger
hayvanlar infekte eder. Trkiye ve dier gelimekte olan lkelerde byk maddi
kayplara sebep olmaktadr. Bu hastalk iin rekombinant alar
gelitirilmektedir. Hastaln bulat iftliklerde hayvanlar lrlp kadavralar
hastalk etmeninin bulamasna ve yaylmasna neden olmayacak ekilde ileme
tabi tutulmaldr. Bu hastala kar korunmak maksadyla gelitirilen a
hastala sebep olan virsn zayf hale getirilmesiyle elde edilmitir. Bazen
adaki bu virs hastalk yapabilme yetegi gstererek hastala neden
olmaktadr. Bu hastalk iin gelitirilen rekombinant alarda byle bir risk sz
konusu degildir. Rekombinant DNA teknolojisi yoluyla ruminantlar ve kanatllar
iin birok hastala kar alar geltirilmitir (regin solunum yollar
hastalklar iin gelitirilen alar). Bu alarn bir ksm direkt olarak yumurtaya
injekte edilmekte ve yumutadan kmadan nce hayvan baklk
kazanmaktadr. Alarn ou viral ve bakteriel infeksiyonlara kar
gelitirilmitir fakat yeni Zelandal ve Avusturyal bilim adamlar gen
mhendisligi sayesinde paraziter hastalklara (rnegin; Sestot (tapeworm)
hastalna) kar da a gelitirmilerdir.

6.2. Hastalkarn tehisinde ve bakln salanmasnda biyoteknolojiden

faydalanlr
Hastalklarn erken tehisi hayvanclkta olamas muhtemel zararlarn
azaltlmasn salar. Hastalklar nedeniyle hayvanclkta parasal kayplar
olmaktadr. Bu zararlar zellikle gelimekte olan lkelerde daha fazladr.
Hastaln asnn mevcut olmas ve hastaln erken tehisi bu zararlar azaltr.
Paraziter hastalklarn ve dier birok hastaln diyagnozu zor olabilir. Eer
 59

hastala neden olan antijeni belirlemek gerekiyorsa bu daha zor bir durumdur.
Bir hastaln diyagnozu bazen saatlerce bazen de gnlerce srr. Bazen de
veterinerler yanl tehis ve tedavi uygularlar.
Antijenler vcuda zararl olan yabanc faktrlerdir (rnein hastala
sebep olan bakteriler, virsler ve dier biyokimyasal faktrler). Antijenler
vicudun baklk sistemi tarafndan hedef kabul edilirler. Antijen ile uyarlan
beyaz kan hcreleri (lenfositler veya B hcreleri) antibodi salarlar. Aadaki
resim antibodilerin vcutta nasl sentezlendiini gstermektedir.
 60

Sentezlenen antibodiler antijene balanr sonra fagositozla yok edilirler.

 61

Antibodiler iki zellige sahiptir

1. Oldukca spesifiktirler: Bir antibodi sadece zel bir antijene balanr.
2. Bir antijene kar gelien antibodi o zel antijene ka uzun sre
baklk salar
rnegin iek hastalnda bir sefer kazanlan baklk hayat boyu devam eder.
Antibodi moleklnn bu ikinci zelligi a gelitirmeyi mmkn klar.
Geleneksel olarak antibodiler laboratuarda hayvanlara periyodik aralklarla
devaml antijen injeksiyonu ile elde edilirler.

Bu ekilde elde edilen antibodi miktar hem az hem de saf degildir yabanc
maddeler ierirler. Saf antibodi retimi uzun yllar bilimsel aratrmalarn
konusu olmutur. Bu problem gnmzde monokolonal antibodi retim
teknigiyle zlmtr. Artk monokolonal antibodi teknigiyle ok miktarda saf
antibodi elde etmek mmkndr. Monokolonal antbodiler zel bir antijene kar
belli bir hcre klonisi tarafndan retilen antibodilerdir. Bu hcreleri kltre
alarak kltrde monokolonal antibodi retmek mmkndr. Monoklonal
antibodi tekniginde ar oalan timr hcreleri ile B hcrelerinin birlikte
 62

kltre alnmas sonucu B hcreleri ile tmr hcreleri birbirine balanarak

hibrit hcreleri (hibridomalar) olutururlar ve oluan hybridomalar ok mktarda
ve devaml antibodi retilirler. retilen antibodi monoklonaldir nk sadece
belli bir antijene kar retilir. Aagdaki resim monokolonal antibodilerin nasl
elde edildigini gstermektedir.

Monoklonal antibodiler geleneksel a veya ilalardan daha etkilidir.

nk geleneksel ilalar sadece antijeni hedef almaz vicudun kendi hcrelerini
de hedef alabilir. Bu nedenle istenmeyen yan etkilere sahiptirler. Monoklonal
antibodiler sadece hedef antijene kar reaksiyon gsterir, yan etkileri yok
denecek kadar azdr.
Antibodiler sadece terapik amalar iin kullanlmazlar anyn zamanda
birok hastaln tehisinde, kandaki zaral maddeleri, viral veya bakteriel
artklarn tesbitinde de kullanlrlar. retilen monoklonal antibodiler antijenleri
spesifik olarak belirlemede prob olarak kullanlr. Bylece hastalklarn daha
doru ekilde tehisini mmkn klrlar. rnek olarak monoklonal antibodi testi
sayesinde iftiler hayvanlarnn gebe olup olmadklarn ifliklerinde kolayca
anlamaktadrlar. Ayn ekilde insandaki gebeliklerde bu metotla anlalr.
 63

rnegin: Gebeligin tehisi iin gelitirilen kit yardmyla kadnlar gebeliklerini

kendi evlerinde kolayca anlamaktadrlar.
iflik hayvanlarndaki hastalklarn geleneksel metotlarla antijeninin
tesbiti youn igc, kalifiye eleman ve uygun ekiman gerektirir. Biyoteknoloji
sayesinde hastalklar iin diyagnostik testler gelitirilmektedir. Biyoteknolojik
metotlarla gelitirilen tehis kitleri sayesinde hastalklar daha ksa bir srede,
daha doru olarak, daha ucuz, daha kolay olarak tehis edilmektedir.
 64

7. HAYVAN BESLEMEDE BYOTEKNOLOJDEN FAYDALANMA

Ruminantlarn rumenlerinde lignini, selilz ve hemiselilz sindirmeye yardm
eden mikroorganizmalar bulunur. Bu mikroorganizmalar: Bakteriler, protozoalar
ve funguslardr. Salgladklar enzimler yardmyla yemlerdeki selilozu,
hemiselilzu ve pektini paralarlar. Aadaki tabloda bitki hcre duvarlarnn
paralanmasnda grev alan mikroorganizmalar ve enzimik fonksiyonlar
gsterilmektedir.
 65

Rumendeki bakteriler besin degeri dk fibre yemleri; amino asitleri, prinleri,

pyrimidinleri, ekerleri, yalar, vitaminleri ve beslenme iin dier ntrientleri
salayan yemler haline gelmesini salarlar. Rumen bakterilerini kullanarak
fermentasyonla vitaminlerin elde edilmesi ticari bakmdan ok nemli bir
olaydr ve japonlar uzun bir sredir bu iin nclgn yapmaktadrlar.

Esophagus
Kaln barsak
Sekum

Rumen

Az
Redikulum

nce Barsak Abomasum Omasum

Esophagus: Monogasrik hayvanlardaki grtlak ile ayn fonksiyonu gsterir.

Ruminantlarn midesi komplekstir drt blmeden oluur
1-Rumen: Olduka byk bir organdr. Hayvann vcut arlnn yaklak %
20sini oluturur. Rumen yaklak 270 litre sv ve 27.7 kg kuru madde
alabilecek hacme sahiptir. Ruminantlar mono-gastric hayvanlarn
deerlendiremedii fibrz yemleri deerlendirirler. St srlarnn rumeni 150
kg kadar sindirilmek iin yem alr. Bu miktardaki yemin sindirilmesi tamamen
mikroorganizmalar tarafndan yaplr. Rumendeki mikroorganizmalar
anaerobiktirler ve yemlerle dardan alnan selilz ve niastay sindirirler.
Fibre yemleri sindirerek uzun zincirli ya asitlerine dntrrler.

Fibre yemlerdeki selloz Uzun zincirli ya asitleri (UZA)

Rumen MO
Msr (Niasta)

Bu asitler:
1-Asetik asit (2 karbonlu)
2-Propiyonik asit (3 karbonlu)
3- Buturik asit (4 karbolu) gibi asitlerdir
 66

Rumen fibrz yemleri sindiren mikroorganizmalarn fonksiyonundan

faydalanmak iin ekillenmitir. Mikrobial fermantasyon sonucu oluan UZA
ruminantlar tarafndan enerji kayna olarak kullanlr. Bu asitler rumen
duvarndan direkt olarak absorbe edilirler. Uzun zincirli ya asitleri Rumen
duvarndan geerek enerji ve protein sentezinde kullanlrlar. Hayvann enerji
ihtiyacnn yaklak %5070 ni kalarlar.

Rumendeki fermantasyon esnasnda oluan mikroorganizmalar sindirilen

yemlerle birlikte abomasuma sonra barsaklara geer ve sindirilerek
bnyelerindeki amino asitler absorbe edilirler. Yemlerdeki protein rumende
kontrolsz bir ekilde mikroorganizmalar tarafndan paralanr. Abomassuma ve
barsaklara geen bu mikroplar yaklak olarak % 50 ham protein ierir. Bu
nedenle mikroorganizmalar mkemmel protein kaynadr. Ayn zamanda B
vitaminlarini ve K vitaminini sentezlerler. Mikroorganizmalarn yaplarnda %1-
2 CHO ve %3 ya bulunur.
Rumen mikrobik gelime iin uygun bir ortamdr. nk pH belli
seviyededir, scaklk 3739 C seviyesi de sabittir, sv bir ortamdr, her gn taze
yemler rumene gelir, her gn artk maddeler ile sindirilmi maddeler rumenden
uzaklatrlr. Sonu olarak rumen tamamen anaerobik bir ortamdr.
2-Retikulum: Retikulumda yemlerin paralanmas mikroorganizmalar
tarafndan salglanan enzimler yardmyla olmaktadr. Yeni domu
ruminantlarda rumen ve retikulum ok kktr. Retikulumun az dardr, tp
andrr. Bu oluum retikular tp olarak adlandrlr. Kk ruminant st ierken
bu ksmda kaslar kaslarak iilen stn rumen ve ritikulumun stnden
omassuma ve abomasuma gemesini salar. Bylece gen ruminantn
gelimemi rumenine stn gemesi engelenir. Rumen 46 hafta sonra
gelimeye balar.
3-Omassum: Rumenden dajestann dar kn kontrol etme rol vardr.
nk omassum dajestann komposyonundaki deimelere tepki verir. Bu
ksmda ozmotik basn artarsa hayvann kuru madde tketimi azalr ve buna
bal olarak retiklo-rumenden dajestann dar k mktar azalr. Eer
omassuma gelen dajestada uzun zincirli ya asitlarinin konsantrasyonu yksekse
hayvann kuru madde tketimi azalr sv k oran ise artar (Afzalzadeh ve
Hovell, 2002). Bu ksm epitel membranlar tarafndan kaplanmtr. Bu ksmda
salg bezleri bulunmaz bu nedenle salg yoktur. Rumene, retikuluma ve
omassuma birlikte esas mide veya karn ( Forestomachs) denir.
 67

4-Abomasum: Monogasrik hayvanlarn midesi gibidir. Buras salg bezleri ve

mukoz membranlar ile kaplanmtr. ine sindirim iin gerekli svlar salglanr.
Monogastrik hayvanlar; rnein tavuklar, kular ve insanlar optimum seviyede
gelimeleri ve bymeleri iin dengeli beslenmek zorundadrlar. Bu nedenle
tavuk rasyonlarna saf aminoasitler, vitaminlar ve minareller eklenmelidir.
5-nce barsak: nce basak 3 ksmda ele alnr
a) Duodenum: nce barsan abonasuma bal olan ilk ksmdr. Bu
ksma pankreasdan, karacierden ve safra kesesinden gelen salg
kanallar alr. Buraya akan salglar yardmyla sindirimin ou burada
yaplr. Pankreas salgs sindirim enzimleri ve bikarbonat bakmndan
zengindir. Bikarbonat dodenuma gelen dajestann asitligini ntralize eder.
Bylece dodenumdaki sindirm enzimleri dajestann asitliginden zarar
grmez.
b) Jejunum: nce barsan orta ksmdr. Bu ksmda sindirim biter
absorbsiyon balar. Jejunumun lmen epiteli karbonhidrat ve
proteinlerin absorbsiyonu iin zellemi ve parmak eklinde villuslarla
kapldr. Bu ekilde sindirim kanalindaki besin maderinin absorbsiyonu
iin yeteri yzey alan salanm olur. Buradaki villuslarn boyu
duodenum ve ileumdaki villuslardan ok uzundur. Bu ksmdaki
absorbsiyon ya pasif tama (ozmoz) yada aktif tamayla selanr.
Kisiloz ekeri pasf tamayla geerken aminao asitler, kk peptitler,
vitaminler ve glikoz aktif tamayla absorbe edilirler.
c) leum: Bu ksm ince bagrsan uzun ve son ksmdr. Bu ksmn
fonksiyonu; B12 vitamininin absorbsiyonu ve konjuge edilmi safra
tuzunun reabsorbsiyonunu salamak. Bu ksmn Sekuma yakn ksmnda
dajestann ince barsaa tekrar geri gelmesini egelleyecek valf grevi
gren anatomik oluum vardr. Bu anatomik oluuma ileosekal valf
adverilir.
6-Sekum (Caecum): nce bursan kaln barsakla birletii kese eklinde
bir oluumdur. Bu ksm ilyumdan ileosekal valf yardmyla ayrlr ve kaln
basan balang noktas olarak kabul edilir. Rumianatlarda bu ksm
byktr. Bu ksmda yemler depolanr ve selilzn daha ileri mikrobiyal
sindirime uramasna olanak salar.

7-Kaln barsak: Sindirim kanalnn kaln ve ksa ksmdr. Bu ksmda

dajestataki sodyum aktf tamayla, su ise ozmozla absorbe edilir. Bu ksm ayn
zamanda bakterilerin oalmas iin uygun ortam oluturur. Bu ksmda oalan
bakteriler hayvann salkl bymesi iin gerekli olan K, B 1, B2 vitiaminlerini
retirler. Sonu olarak bu ksm sindirlemeyen, absorbe edilmeyen ve vicuttan
atlan artk maddelerin dk formunda elimine edildii ksmdr.
 68

7.1. Rumende protein metabolizmas

Yemlerdeki proteinler

RUMEN
Proteinler
Parcalanmam
proteinler ve bir
Peptitler miktar microbial
protein dk ile
dar atlr

Amino asitler MKROBAL

PROTEN

Amonyum

Amonyum re

Yemlerin paralanmas sonucu rumende amonyum oluur ve sonuta idrarla

nitrojen kayplar meydana gelir. drarla dar atlan bu nitrojen ekonomik
kayba sebep olur. Bakterilerin proteinleri hali hazr sindirimi sonucu oluan
amonyum hayvanda metabolik strese sebep olur. Rumendeki birok farkl
mikroorganizma tr proteinlerin ilk paralanmarnda grev alan proteolitik
enzimler salglarlar. Deiik proteolitik mikroorganizmalarn rumende mevcut
olmas; rumendeki proteinlerin paralanmasnn kontrol altna alnabilmesini
zorlatrr. Bu nedenle proteinli yemleri hayvana yedirmeden nce bu yemlere
bir takm muameleler yaplmaldr. rnegin; yemlemeden nce yemi stma gibi.
Bu amala; tanen rumendeki proteinleri sindirilmekten korumak iin
kullanlmaktadr fakat tanen rumendeki fermantasyonun seyrini deitirerek,
fibrz yemlerin sindirimini engellemektedir. Son zamanlarda, rumendeki
proteinleri sindirilmekten korumak iin, rasyona niasta ilavesi yaplmaktadr.
lave edilen niasta rumendeki proteinlere balanarak onlar rumendeki
sindirimden korumaktadr. Bu ekilde rasyona niasta ilave etmek tanen ilave
etmekten daha iyidir. Rumendeki mikroorganizmalarn belli bir fraksiyonu
peptitleri ve amino asitleri paralarlar. Bu mikroorganizmalarn fonksiyonlarn
azaltmak iin rasyona antibiyotikler ve iyonoforlar ilave edilmektedir. Rasyona
lave edilen bu maddeler peptit ve amino asitleri paralayan
mikroorganizmalarn oalmalarn engeller.
 69

Rumende daha az amonyum retilmesini salamak ve fibrz yemlerin

sindirimini artrmak iin rumendeki silli protozoalarn saysnn bask altnda
tutulmas gerekir. Rumendeki protozoalar rumendeki bakterileri yiyecek olarak
tketirler. Bunun sonucu olarak da bakterilerin says azalr bu durum direkt
olarak rumendeki retilen mikrobial proteinin azalmas demektir. Bu azalma %
50ye kadar varabilir.

7.2. HAYVAN BESLEMEDE KULLANILAN BYOTEKNKLER

Biyoteknlojinin hayvanclkta oldukca geni kullanm alannn yannda, ok
sayda dier faydal uygulamalarda da biyoteknolojiden yararlanlmaktadr.
Ruminantlar tarafndan alnan yemler rumendeki mikroorganizmalar tarafndan
paralanr. Ruminant hayvanlarn verimliligini artrmak iin yemlerin kalitesini
artrmak, rumendeki yemlerin mikrobial paalanmasn ve fermentasyonu uygun
seviyeye getirme yolu ile yemden yararlanmay artrmak gibi konularda
aratrmalar yaplmaktadr.
Gemiten imdiye kadar yaplan almalarda: Yemlere kimyasal
maddelerle muamele edilmi, rasyonlara iyonoforlar, antibiyotikler ve rumen
mikrofloras zerine etkili probiyotikler ilave edilmidir. Gen mhendisliinde
salanan gelimeler neticesi transgenik bitkiler ve mikroorganizmalarn elde
edilmesi, hayvanlarn verimliliinin artrlmas ve hayvansal rnlerin
kalitesinin ykseltilmesi mmkn olmutur.
Tropik lkeler bata olmak zere tm gelimekte olan lkelerde
hayvancl snrlayan en nemli faktr beslemedir. Bu lkelerdeki otlaklarn
hem kalitesi hem de quantitesi; zellikle kurak mevsimlerde yetersizdir. Bu
lkelerde; hayvanlara iyi beslenme imknlar oluturmak iin biyoteknolojik
uygulamalar mevcuttur. Bu konu ile ilgili temel biyoteknolojik uygulamalar
aada sralanmtr.
1- Rumen fonksiyonunun artrlmas
2- Kuru mera otlarnn sindirilebilirliinin artrlmas
3- Dane yemlerin besin deerinin ykseltmesi
4- Besin maddelerinin sindirilmelerini engelleyen faktrlerin yemlerden
uzaklatrlmas
5- Silaj ve bezeri yemlerin besleme deerinin ykseltilmesi
Rumen biyoteknolojisi bize ruminantlar tarafndan tketilen fibrz yemlerin
besin deerlerini artrma imkn sunar. Ruminantlar mono gastrik hayvanlarn
deerlendiremedii yemleri deerlendirirler.
Biyoteknoloji sayesinde yemlerdeki protein ve karbonhidratlarn miktar ve
oran deitirilebilir. Ayn zamanda karbonhidrat ve proteinlerin rumendeki
fermentasyon derecesi ve metabolizmas da deitirilebilir. Rumendeki mikro
organizmalar zerinde ok sayda potansiyel biyoteknolojik aratrmalar
yaplm fakat baars bir takm teknik zorluklar tarafndan snrlandrlmtr.
Bu teknik zorluklar unlardr:
 70

1. DNA rekombibasyonu ve DNA transferi iin gerekli rumen mikro

organizmalarnn ayrlmas ve trlerine gre belirlenmesindeki zorluklar.
2. Bu mikroorganizmalara ait enzimlerin karakterize edilmelerindeki ve ayrt
edilmelerindeki zorluklar.
3. Salglanan enzimlerin miktarn belirlemedeki zorluklar
4. Rekombinant enzimlerin salglanma yerini ve salglanma etkinliini
belirlemedeki zorluklar.
5. Transfer edilen genin duraanlndan dolay oluan zorluklar
6. Transgenik bakterilerin rumendeki ortama uyma zorluklar.

7.2.1. Hayvan beslemede biyoteknolojik rnlerin kullanlmas

Biyoteknolojik rnlerin kullanm yem endstrisindeki yerini almtr.
Gelecekte bu maddeler daha yaygn kullanlacaktr. Biyoteknolojik rnlerin
hayvan besleme ile ilgili kullanm alanlar aada sralanmtr.
1. Silaja fibre sindirimi artran ilaveler yapmak
2. Yemlere aminoasit ilavesi
3. Yemlerdeki zaral maddeleri (mikotoksinleri ) tehis etme.
4. Enzimlerle yemlerdeki beslenmeye mani olan maddeleri ve mikotoksinleri
uzaklatrma
5. Monogastrik ve ruminantlarda besin maddelerinin sindirimini artran
enzimlerin yemlere ilave edilmesi
6. Sindirimi artrmak iin endojen enzimlerin desteklenmesi (Hayvann mevcut
doal enzimlerine ayn enzimleri ilave etmek)
7. zel hastalklara kar antibodilerin yemlere eklenmesi
8. Hormonlarn ve probiyotiklerin yemlere katlmas yolu ile sindirim sistemini
gelimesini ve hayvann salk durumunun iyi hale gelmesini salamak
9. Dk ile kaybolan besin maddelerini azaltmak iin rasyonlara enzim eklemek

7.2.1.1. Rasyonlar besin maddeleri ile takviye etmek

Endstriel fermantasyon sonucu elde edilen kristalin aminoasitleri (Lisin,
methionin, threonin vb.) hayvan yemlerine yaygn olarak ilave edilmektedirler.
Bu ekilde rasyon formlasyonu daha uygun hale gelmekte ayn zamanda
rasyonun maliyeti de dk olmaktadr. Bu konu ile ilgili son zamanlarda
yaplan almalar; aminoasitleri rumendeki paralanmaya ve sindirilmeye kar
korumak zerine yaplan aratrmalar iermektedir. Bylece hayvanclktaki
retim ve verim nemli derecede artabilecektir. Geleneksel olmayan aminoasit
ilaveleri; arginin ilavesini ve aspartik asit ilavesini ieririr. Aspartik asit ilavesi
hipofizden (pituitariden) salglanan somatotrophin hormonunun salglanmasn
artrr. Bu hormon bymeyi hzlandrr, ayn zamanda karkas kalitesini de
yksektir.
Yeni katk maddelerinin (Gulutamin, arginin ve nkleotitlerin) (Kuhara
ve ark., 1991; Hurson ve ark., 1995 ) gen hayvanlarda sindirim ve baklk
 71

sisteminin gelimesi zerine etkileri gelecekte aratrlabilecek nemli

konulardr.

7.2.1.2. Rasyona enzim ilavesi

Rasyonlarn kalitesini artrmak amac ile rasyonlara enzim ilavesi yaygn olarak
kullanlmaktadr. Bu kanuda ok sayda derleme yaynlanmtr (Cambel ve
Bedford, 1992; Classen, 1993; Bedford,1996). Rasyona enzim ilave etmenin
amalar aada sralanmtr.
1. Sindirimi engelleyen maddeleri ve toksinleri yemden uzaklatrmak
2. Mevcut besin maddelerinin sindirimini artrmak
3. Niasta olmayan polisakkaritlerin sindirimini artrmak
4. Hayvan bnyesindeki doal enzimleri artrmak
Bu enzimlerin geni bir kullanm alanlar yoktur ancak zel baz yemler iin
kullanlmaktadrlar. Kanatl rasyonlarnda enzim kullanm gnmzde yaygn
olarak kullanlmaktadr. Ruminant rasyonlarnda da bu enzimlerin kullanlmas
fazla kabul grmemitir.
Gulukanaz enziminin vizkoz yemlerdeki (rnegin arpa ve yulaf ieren
yemlerde) niasta dndaki dier polisakkaritlerin sindirimini artrd
bildirilmitir. lave edilen bu enzimin sindirilecek yemlerin sindirim kanalndan
yava geiini salad savunulmakta, bu ekilde sindirim kanalnda sindirim
iin hammadde mevcudiyeti salanmaktadr. Fakat bu konuda yaplan
almalarn ou selilozn ve ksantinin paralanmasn salayan enzimlerin
ilave edilmesi zerine yaplmtr. Ksilenaz enzimleri buday avdar ve tritikale
ieren rasyonlarda kullanlmaktadr. Bu konuda yaplan son aratrmalar
ksilenaz, proteaz ve amilaz enzimlerinden oluan karmlarn msr ve sorgum
ieren ve vizkositesi dk olan yemlerin etkin sindirimi iin kullanldn
rapor etmektedir (Pack ve ark., 1998).
Besin maddelerinin sindirimini engelleyen fitatn sindirimini artrmak ve
yenilen yemdeki fosfat miktarn drmek yolu ile gaitann fosfat miktarn
drmek iin yemlere fitaz enzimi eklenmektedir (Joungbloed et al., 1997). Bu
ekilde fitaz ilavesinin ayn zamanda kuru maddenin ve ham proteinin
sindirimini artrd da bildirilmitir. Bu konularda yeni uygulamalar
gelitirilmektedir. Bu uygulamalar: Lektin ve tripsin inhibitrlerinin enzimler ile
yok edilmesi, enzim ilave etmek yoluyla hayvann sindirim sistemindeki doal
enzimik fonksiyonu salamak iin yemlere fitaz, amilaz ve lipaz enzimlerini
ilave etmek, monogastrik hayvanlarn fibrzl yemleri sindirebilmelerini
salamak iin rasyona sellaz enzimini ilave etmek gibi uygulamalardr.
Beauchemin ve ark., (1996) tarafndan yaynlanan makalede; zellikle sellaz
ilavesini yksek oranda arpa ieren rasyonlar iin, tavsiye etmektedir. Bu
aratrmaclar, eklenen enzim arpa tanelerini saran selilozl ksmn
paralanmasn salayarak danenin iindeki niastay paralanmaya hazr hale
getirdiini bildirmilerdir.
 72

Ruminant rasyonlarna enzim ilavesi sonucu salanan yararlar belirsizlik

gsterir. Bu belirsizliin sebepleri eklenen enzimlerle rumen fermentasyonu
arasndaki kompleks etkilemeler ve rasyonlara katlan yemlerdeki (zellikle
kuru ot ve silajdaki) byk kalite farklardr. Enzim ilavesi geni apta
uygulama potansiyeline sahiptir. Bu geni apl uygulama potansiyeli; yeni
enzimlerin gelitirilmesine, yem prosesinde fizkokimyasal etkilemeleri bilmeye
ve optimum koullar belirlemeye baldr.

7.2.1.3. Pre ve pro-biotiklerin yemlere ilavesi

Prebiotikler ve probiotikler kullanlarak ruminantlarn sindirim sistemlerindeki
mevcut mikroflory etkileyerek besin maddelerinin sindirimi artrlabilir. Ayrca
hastalklara dayankllk salanarak hayvanlarn salk durumlar iyiletirilebilir
(Kelly ve ark., 1994 ; Salminen ve ark., 1998). Hayvann sindirim sistemindeki
mikroflora komposizyonu ve patojenlerin sindirim sisteminde yok olmas
hayvann saln ve byme performansn etkileyen nemli bir faktrdr. Pre-
biyotikler rasyona katlan besin maddesi deillerdirler sadece katk maddeleridir.
Bu katk maddeleri hayvann sindirim sistemindeki mikroflora dengesinin
ayarlanmasn ve faydal mikroorganizma trlerinin oalmalarn salayarak
besin maddelerinin sindirimi iin, sindirim sisteminin uygun salkl hale
gelmesini salarlar.
Probiyotikler mikroorganizma olarak tanmlanabilirler. Bu
mikroorganizmalar hayvana verildikleri zaman sindirim sistemindeki evre
artlarn mevcut mikroflora iin uygun hale getirerek faydal olabilirler. Pre-
biyotiklerin ve pro-biyotiklerin hayvanlara verilmesi sonucu sindirim sisteminde
oalan mikroorganizmalar; sindirim sistemindeki patojen mikroplarn
saylarn ve etkilerini azaltr. Bylece; hastalklarn meydana gelme riski der.
Pre ve pro biyotiklerin hayvanlara verilmesi belirsiz sonular vermitir. Bu
nedenle bu maddelerin ilavesi sonucu iyi ve tekrarlanabilir sonular elde etmek
iin yemlere katlma ekillerini ve dozlarn belirlemek iin aratrmalar halen
yaplmaktadr. Ruminantlarda; stten kesimden sonra, sindirim sistemindeki
mikroflora kompozisyonunda byk deimeler meydana gelmektedir. Bu
dnemde pre ve probiyotiklerin uygulanmas ok olumlu sonular vermektedir.

7.2.1.4. Baklk maddelerinin rasyonlara ilavesi

Rumendeki mikrofloray deitirmek ve patojenlere kar hayvan korumak iin
yemlerlere baklk maddeleri ilave edilir. rnek olarak sprey ile kurutulmu
antibodi ieren plazma protenleri rasyona ilave edilir. Eklenen bu proteinlerdeki
antibodilerin yaygn patojen trlerine kar etkileri farkllklar gsterir. Sprey ile
kurutulmu plazma proteinlerinin erken stten kesilmi domuz rasyonlarna
ilavesi sonucu bu hayvanlarn yem tketiminin art ve bymelerinin
hzland rapor edilmitir (Bonneau and Laarveld, 1999). Plazma proteinleri
mezbahalarda kesilmi hayvanlarn kanlarndan elde edilir. Dolaysyla kesilen
 73

bu hayvanlarn kesimden nce patojenler tarafndan infekte edilmesi gerekir ki

kannda gerekli baklk maddeleri bulunabilsin.
Hayvan rasyonlarna plazma proteinleri ilave ederek hayvanlar
patojenlere kar koruma konusunda deiik yaklamlar mevcuttur ve bu
alandaki almalar devam etmektedir. rnegin hayvanlarn ve bitkilerin erken
gelime dnemlerinde yaplan gen transferleri sonucu belli hastalklara kar
yararl antibodiler elde edilmeye allmaktadr. Bu konu ile ilgili almalar
ksa dnemde baar vaad etmektedir. Ayn ekilde stten kesilen domuzlarda
yksek oranda lmlere neden olan patojen trlerine kar korunmak iin
yumurta tavuklarndan yararlanlabilir. Bu patojenler; yumurta tavuklarna a
edilerek bu tavuklarn yumurtalarnn sar ksmnda belli hastalklar iin
baklk maddelerinin oluumu salanabilir. Yumurta sarsndaki bu baklk
maddeleri sprey ile kurutularak domuz rasyonlarna eklenebilir. (Yokoyama ve
ark., 1992). Bu ekilde alama yolu ile antibodi elde etme protokol son
zamanlarda grlen hastalk amillerini de iine alacak ekilde
gncelletirilebilir. Elde edilen bu antibodiler meydana gelen hastal maximum
derecede tedavi etmek iin yemlere titre de edilebilir.
Rasyonlara antibodi ilave etmenin amac hayvan bulac hastalklara
kar koruma olsa da tedavi etme amac iin de kullanlabilirler (Kellner ve ark.,
1994). Bu ekilde elde edilen antibodiler pre ve pro-biyotiklerde olduu gibi
sindirim sistemindeki mikrofloray degitirir ve patojenlerin sindirim sistemi
mukozasna balanmalarn engeller (Imberechts ve ark., 1997). Yemlere
antibodi ilavesi yem tketimini artrmas ve bymeyi hzlandrmas yannda
hastalklara kar korunmak iin antibiyotik kullanma zorunluluunu da azaltr.
Hormon salglamay ve sindirim kanalndaki mukozann baklk
kapasitesini etkileyen faktrler elde edilmeye allmaktadr.
Imminostimlant olarak -gulucan oral yolla fareye verilmitir. Bu
maddenin sindirim kanalndaki mukozal bakl artrd rapor edilmitir.
(Yun ver ark., 1997). Ayn zamanda Yun ve arkadalar 1995 ylnda ev faresine,
somatotropin hormonunun salglanmasn bask altna almak iin, somatostatin
hormonuna spesifik monoklonal antbodiyi damardan verdiler. Somatostatin
hormonu sindirim kanaln etkileyen bir hormondur bakl azaltan faktrler
ierir. Bu ekilde ev farelerinin koksidiyoz hastalna kar dayankll artt.
Oral yolla sz konusu hormon iin monoklonal antibodi vermek de etkili
olabilir.
Ayn ekilde Epidermal Byme Faktr (EGF) de sindirim kanaln
etkileyen bir hormondur. Sindirim kanalnn gelimesini salar, ayn zamanda
sindirim kanalnda bakteri birikmesini azaltr. E-Coli bakterileri tarafndan
infekte edilmi tavana oral yolla EGF hormonu verilmesi sonucu hayvann
sindirim kanalndaki bakteriel klonileme azaltlmtr. Bu almalar gsteriyor
ki sindirim sisteminin gelimesini ve salkl olmasn salayacak direkt besleme
ile ilgili olmayan rnler de kullanlabilir.
 74

7.2.1.5. Hayvan beslemeyi ilerletmek iin bitkiler zerinde yaplan genetik

mameleler
Hayvan beslemede kullanlan bitkiler dhil olmak zere birok bitki tr
zerinde genetik modifikasyonlarn uygulanmas hzla yaygnlamaktadr.
zerinde genetik modifikasyonlar yaplm tarla bitkilerinin doal olarak
hayvan yemlemede kullanlabilecei bildirilmitir. Hayvan yemlemede
kullanlan bitkilerin besin deerini artrmaya ynelik genetik muameleler; bu
bitkiler zerinde zirai amalar iin yaplan genetik muameleler kadar
ilerlememitir. Fakat bu bitkilerin besin deerini ykseltmeyi amalayan genetik
almalar iin byk potansiyel vardr. Bu konuya rnek olarak; yemlerin
rumendeki paralanmasn artrmaya ynelik almalar ve bitkilerdeki lignin
salglanmasna neden olan enzimi yok etmeye ynelik genetik maniplasyonlar
gsterilebilir. Alternatif ekilde genetiksel olarak modifiye edilmemi bitkilerin
rumende etkili bir ekilde paralanmasn salamak iin hayvanlara
yedirilmelerinden nce bu bitkileri bir takm muamelelere tabi tutmak veya bu
amala yemleri genetik maniplasyon sonucu elde edilmi enzimler ile
etkilemeye sokmaktr. Bu enzimler; bitkiler zerinde yaplan genetik
modifikasyonlar sayesinde fazla miktarlarda elde edilebilirler.
Bitkiler zerinde yaplan genetik almalarn bir dier amac ise; bitkisel
proteinlerdeki esansiyel amino asit miktarn artrmaya ynelik tekniklerdir.
Bitki tohumlarndaki proteinlerin amino asit kompozisyonunun gen transferi ile
deitirilmesi mmkndr.

7.2.1.6. Silaj bakterileri zerinde yaplan genetik modifikasyonlar.

Fibre sindirimini artrmann indirekt yollarndan biri de silaj bakterileri zerinde
yaplan genetik modifikasyonlardr. Silaj koruma; dardan ilave edilen veya
endojen olarak yemlerde bulunan lactobacilli bakterilerinin silaj oluturan
bitkilerdeki ekerler zerinde oalarak laktik asit oluturmasn ierir. Dk
seviyede karbonhidrat ieren silaja amilaz, selulaz veya hemisellaz gibi
enzimlerin ilave edilmesi silaji oluturan yemlerdeki karbonhidratlarn
lactobacilli bakterileri tarafndan daha etkin kullanmn salar ve slajda laktik
asit miktar artm olur.
Amilaz, sellaz veya hemisellaz gibi enzimleri retebilen transgenik silaj
bakterilerilerinin elde edilmesi konusunda grler bildirilmitir. Bylece fibrz
yemlerin rumende daha etkin sindirimi mmkndr. rnek olarak; genetiksel
yolla modifiye edilmi silaj yapan rekombinant Lactobacillus plantarum
bakterisi; -amilaz, sellaz veya ksilenaz enzimlerini determine eden genleri
tamaktadr. Bu tansgenik bakteri, silaj ortamnda oalma ve yaama gcne
sahiptir. Fakat bu bakterinin silaj sindirimine etkisi daha henz llmemitir.
Bylece laktik asit bakterileri iin uygulanabilen transgenik teknikler mevcuttur.
Lactobacillus plantarum bakteri trleri zerinde yaplan genetik modifikasyonlar
bu bakterilerin etkinliini artrma asndan byk potansiyel arz etmektedir.
 75

7.2.1.7. Rumen mikrofloras zerinde yaplan genetik modifikasyonlar

Transgenik mikroorganizmalar hayvanlarn beslenmesini, gelimesini ve
saln iyiletirme potansiyeline sahiptir. Sindirim kanalna yerleme kabiliyeti
gsteren bu mikroorganizmalar enzimleri, pre-biyotik bileikleri, bakl
gelitiren maddeleri, mukozal alar ve hormonlar da ieren bir takm
transgenik rnler salglarlar. Bu ekilde rekombinant mikroorganizmalarn
gelitirilmesi bitotektolojik olarak ok caziptir ve transgenik hayvanlarn aksine
geni bir ifti kesimi tarafndan kullanm mmkndr. Ar derecede fibre
sindirebilen transgenik rumen mikroorganizmalarnn gelitirilmesi aktif bir
aratrma konusudur ve bu konu ile ilgili birok makale yazlmtr.
Rumen mikroorganizmalar zerinde yaplan genetik modifikasyonlarn
ncelikli amac; rumende fibrz yemlerin paralanma derecesini artrmaktr. Bu
ama dorultusunda yemlerdeki polisakkaritleri paralayan enzimleri reten
transgenik rumen mikroorganizmalarnn elde edilmesidir.
Hayvan besleme konusunda yaplan almalar yemlere sellaz ve
ksilenaz enzimlerinin ilavesinin ruminantlarn performanslarn gelitirdiini
gstermitir. zellikle ekstensiv hayvanclkta bu konu daha fazla nem arz
etmektedir. nk her gn yemlere enzim ilave etme yerine sadece bir sefer
transgenik mikroorganizma ilavesi yeterli olmaktadr. Bu konuda yaplan
almalarn esas amac rumende belli bal bulunan birka bakteri trnde
rnein; Prevotella ruminicola, Butyrivibrio fibrisolvens veya Streptococcus
bovis de deiik polisakkaritlerin paralanmasnda grev alan enzimleri
determine eden genlerin bulunmasn salamaktr. Fibrolitik enzimlerin
Prevotella ruminicola veya Streptococcus bovis gibi bakterilerde retilmesini
salamann amalarndan biri de konsantre yemlerin arlkl bulunduu
rasyonlarda fibre yemlerin paralanmasn artrmaktr. Konsentre yemlerin bolca
kullanld rasyonlarla beslenen hayvanlarn rumenlerindeki pH der. Bu
durum rumen pHnn 6 nn altna dmesine kar hassas olan ve doal olarak
selilz paralayan rumen mikroorganizmalarnn yok olmasna sebep olur. Bu
konuda son almalar Ruminococcuss flavefaciens bakterisinden alnan bir
endogulukanaz geninin Streptococcus bovis e transferi, Prevotella ruminicola
bakterisinden alnan endogulukanaz/ksilenaz genlerinin dier bakteri trlerine
transferi zerinde younlamtr.
Aratrlan dier bir konu ise detoksifikasyondur. Birok bitki
ruminantlarn verim gn dren bileikler veya ruminantlar iin zararl
toksik bileikler retebilirler. Bu bileikler; okzalik asit, fluoroacetate ve dier
bir takm tanen veya tanen benzeri fenolik yaplar kapsar. Bu bitkiler tarafndan
retilen toksinleri detoksifikasyon ile etkisiz hale getirecek ekilde rumen
mikroorganizmalarnn kapasitesinin artrlmas hayvanlar tarafndan yenilebilen
bitkilerin eitliliini artrr.
Doal olarak; birtakm rumen mikroorganizmalar toksinleri zararsz hale
getirdikleri belirlenmitir. 3-hidroksi-4(1H)-pyridon (DHP) rumende mimosinin
metabolizmas sonucu oluan toksik bir ruminal metabolittir. Topraa yapk
 76

gelien baz yonca trlerinde mimosin amino asiti mevcuttur. Bu amino asitin
metabolizmas sonucu oluan DHP nin etkisini yok eden bakterilerin
Australyadaki keilerin ve ineklerin rumenlerinde mevcudiyeti saland.
Bylece bu hayvanlarn toksik madde ieren yonca trnden faydalanmalar
mmkn oldu. Benzer ilemler aacl bitkiler ile beslenen koyunlarda toksik
madde tanenin etkisini azaltmak iin gine toksik maddenin etkisini yok eden
bakteriler koyunlara inakule edildi. Bu gelimeler toksik maddelerin etkisini yok
eden transgenik bakterilerin gelitirilme meselesini gndeme getirdi. Acasia
georgina alsnda ve dier Avustralya, Afrika ve orta Amerika bitkilerinde
mevcut olan toksik monofluoroacetate maddesinin etkisini yok etmek iin
Butyrivibrio fibrisolvens bakterisinin transgenik tipi elde edilmitir. Ayrca
toprak bakterisi olan Moraxella sp., nin DNAsnda bulunan ve fluoroacetate
dehalogenase enziminin retilmesini determine eden gen vektrler arcl ile
Butyrivibrio fibrisolvens bakterisine transfer edilmitir. Elde edilen bu
transgenik bakteri koyunlarn rumenine transfer edildi. Transfer edilen bakteri
toksik maddeye kar tam koruma salamasa da bu toksik bileiin koyunda
neden olduu semtomlar olduka azald.
Rumendeki ekosisteme kar yaplan mdahalelerin bir dier amac ise;
rumende protein paralanmasn snrlamak veya baka bir deyile rumendeki
mikroorganizmalar tarafndan amino asit retimini artrmaktr. Rekombinant
DNA teknolojisinin esas nerdii ey; hayvanlarn temel amino asit
ihtiyalarn karlayan proteinlerin sentetik genler tarafndan retilmesini
salamakt. Bu ama dorultusundaki almalar 15 yl ncesine kadar dayanr.
On be yl nce protein sentezlemeyi snrlayan amino asitleri (lysin, methionin
ve threonin) yapsnda bulunduran polipeptitleri determine eden sentetik
genlerin rumen bakterilerinde bulunmas iin almalar yaplmaya balad.
Son zamanlarda bu ekilde protein retimi E. Coli bakterilerinden salanm
durumdadr. Ayn yntemle rumen bakterilerinin esansiyel amino asitleri ieren
zel proteinleri sentezlemeleri iin sentetik genler zerinde almalar devam
etmektedir. rnein bu konu ile ilgili Butyrivibrio fibrisolvens bakterisi zerinde
almalar yaplmaktadr. Fakat bu konularla ilgili aneorobik rumen bakterileri
zerinde yaplan almalar ok yava ilerlemektedir. Bunun nedeni bu konudaki
almalara yeterli kaynak aktarlmamas, teknik zorluklar ve bu konu ile ilgili
nceden alma yapan bilim adamlarnn olmaydr. Gnmzde rumen
bakterilerine gen transferini salamaya ynelik sistemler mevcuttur. Toksik
floroasetat etkisiz hale getiren rekombinant Butyrivibrio fibrisolvens
bakterisinin elde edilmesi bu konudaki teknolojinin ne kadar etkin olduunu
gstermektedir. Ayn zamanda bu sistem; genetik modifikasyonlarn hayvan
saln ve hayvansal retimi optimize etmek iin byk potansiyele sahip
olduunu gstermektedir. Rumen mikroorganizmalar zerinde yaplan genetik
modifikasyonlarn bir dier hedefi ise hayvansal yem maddelerinin besin
deerinin ykseltilmesi iin; biohidrogenizasyonun kontroln ve fitaz
enziminin retilmesini artrmaktr.
 77

7.2.1.8. iftlik hayvanlarnn performansn artrmaya ynelik

biyoteknolojik uygulamalar
Daha nce hayvanlarn performanslarn artrmaya ynelik almalar
hayvanlarn bymesini ve st verimini artrmay salayan faktrler ile byme
kabiliyeti yksek transgenik hayvanlarn elde edilmesi zerinde younlamt.
Yeni doal hormonlarn (Myostatinin ve Leptinin) kefi ve hayvanlarn
bymelerini, karkas kalitelerini kontrol eden fizyolojik olaylar hakknda bilgi
art bu konuyla ilgili alma alanlarnn genilemesine neden oldu.

7.2.1.8.1. Miyostatin
skelet kas hcrelerindeki hiperplasia ifte kasllk olarak bilinir. Baz sr
rklarnda grlen bu karakter kaltsaldr. Kas hcrelerinde hiperplasia
oluumunu aklayan molekler ve fizyolojik mekanizmalar aklanamamtr.
Grobet ve arkadalar 1997 ylnda verdikleri bir rapora gre: Belika mavisi
rknn 2. kromozomunun ikinci ekzonunda 11 nlleotitlik silinmi ksm
(deletion ksm) olduunu bildirdiler ve bu deletion ksmnn muskular
hyperplaziye sebep olduunu bildirdiler. Son zamanlarda bu mutasyonun arole
rk srlarnn kromozomlarnn ekzon3 ksmnda da olduu gsterilmitir.
Myostatin: Transformasyonu Salayan Byme Faktr- (Transforming
Growth Factor-, TGF- ) familyasna ait bir faktrdr. Bu faktr determine
eden genin belirlenmesi srlarda ve dier hayvanlarda seleksiyon iin
diyagnostik testlerin yaplmasna olanak salayacaktr. Transforming Growth
faktr familyas ierisinde tanmlanan bu faktrn kefi; faktrn kas
geliimindeki fizyolojik roln bilmek iin yeni aratrma konularn gndeme
getirmitir. Bu ekilde; zamanla kas geliimi salamaya ynelik yeni yaklamlar
geliecektir.

7.2.1.8.2. Leptin
Leptin ya dokusunda sentezlenen oldukca yeni bir protein yapsnda
hormondur. imanlk (Obese) geni tarafndan determine edilir. Ya dokusuna
spesifik leptin reten imanlk geninde ve bu genin rettii hormonun
baland reseptrleri determine eden gendeki mutasyonlar sunucu imanlk
meydana gelir.
Kandaki leptin miktar ile yalanma miktar arasnda korelasyon vardr.
Kandaki leptin seviyesinin yksek olmas yem tketiminde azalmalara sebep
olur. Leptin hipotalamusdaki spesifik reseptrler zerine etki ederek yem
tketimini dzenler. Leptin sadece yem tketimini regle etmez ayn zamanda
enerji metabolizmasn, vcut kompozisyonunu, remeyi ve baklk sistemini
de regle eder. Leptinin kefedilmesi: Yem tketiminin reglasyonunu ve
metabolik etkinliini ilgilendiren dier konularda yeni aratrma alanlar
amaktadr. Leptini ve leptin reseptrn determine eden genin kromozom
zerindeki yeri birok trde belirlenmitir. Leptin esas alnarak yaplacak
 78

genetik seleksiyon iin birok mikro stellit gen (uydu gen veya markar)
gelitirilmitir. Fitzsimmons ve arkadalar 1998 ylnda mikro sitellit gen
yardm ile leptin genini esas alarak et srlarnda genetik seleksiyon yaparak bu
konuyu ispatlamlardr.

8. SNDRM KANALINDAK MKROORGANZMALAR ARASI GEN

TRANSFERNN MEKENZMASI
Gen transferi kt evre artlar altnda, mikroorganizmalarn yaama kabiliyeti
gstermelerini salayan doal bir olaydr. Bylece mikroorganizmalar kt
evre artlarna adapte olurlar. Mikroorganizmalara ait DNA nn nkleotit
yapsnn son yllarda aklanmas; mikrobiyal genomun deiik genlerden
meydana geldiini gstermitir. Bu deiik genlerin genom zerinde var oluu
ve zamanla bu genler zerindeki mutasyonlar mikrobiyal evrimin oluumunu
salayan en nemli faktrdr. Sindirim kanalndaki mikroorganizmalarda doal
olarak cereyan 3 deiik gen transfer mekanizmas bilinmektedir.
1. Transformasyon
2. Konjugasyon
3. Transdksiyon

1.Transformasyon: evreden veya dardan gelen serbest haldeki yabanc

DNA moleklnn dier bir mikroorganizma tarafndan alnmasdr. Baz
bakteri trleri yabanc DNA molekln alma kabiliyeti gsterir. Bu dardan
alnan yabanc DNA molekl herhangi bir mikroorganizma trne ait
kromozamal DNA paras ya da plazmidler olabilir. Bu tr bakteriler bu olay
yaamlarnn belli bir dneminde yaparlar.
2-Konjugasyon: Hcrelerin birbirine yaklamas ve temas etmesi durumunda
hcreler aras gen transfer ilemi ile ilgili fonksiyonlar determine eden genleri
tayan plazmid tarafndan bakteriye yaplan gen transferidir. Gram negatif
bakterilerde plazmid bakterinin gei iin zel olarak oluturduu filus
ksmndan ieri geer. Bu filus ksm plazmid zerindeki zel reseptlere
balanr.
2-Transdksiyon: Bakteriofajlar tarafnadan yaplan gen transferi bu guruba
girir. Bu olayda faj bakterinin ierisine girir DNA sn eler, oalr ve bakteriyi
terk ettigi zaman bakteriye ait DNA parasn veya plazmiti kapslne balar.
Faj dier bir bakteriyi infekte ettii zaman nceden infekte ettii bakteriye ait
DNA parasn veya plazmiti bu bakteriye transfer eder.
 79

Rumen; bakteri trlerinin ierisinde veya bakteri trleri arasnda oluan gen
transferine uygun bir ortamdr.
nk:
1. Rumen ierisinde mikroorganizma younluu ok fazladr ( yaklak 1011
hcre/ml).
2. Bakterilerin ou rumen epitelini ve yem parackarn saran biyofilm
zerinde yaar. Ayn zamanda baz bakteri trleri; funguslara veya
protozoalara bal halde yaar.
3. Rumendeki bakterilerin baz trleri gen transferinde grev alan
plazmidleri ve virsleri bnyesinde tar.
4. Rumendeki mikrobiyal populasyon sindirilen mikraorganizmalara ait veya
sindirilen yemlerden gelen yabanc DNA ile devaml kontak halindedir.

8.1. Laboratuar artlarnda rumen bakterilerine gen transfer etmek

Doal plazmitler belli bal rumen bakterilerinden ayrlm durumdadr. Birka
istisna dnda ayrlan bu plazmidlerin rol bilinmemektedir. Fakat bu
plazmidlerden bazlar rumen bakterilerine yaplan gen transferlerinde vektr
olarak kullanlmaktadr. Rumen bakterilerine gen transferi daha ok
elektroporasyon ve konjugasyon ile yaplmaktadr. n vitro koullar atnda
birok bakteri trnde plasmitlerin konjugasyon ile transferi ispatlanmtr.
Prevotella ruminicola bakterisinden alnan ve tetrasiline dayankllk geni ieren
plazmid konjugasyon yoluyla ayn trn dier alttrlerine transfer edilmitir.
Rumende olduka fazla sayda bakteriofaj tespit edilmitir (yaklak 10 10 faj/ml).
Buna ramen transdksiyon yolu ile gen transferi bilimsel olarak
aratrlmamtr.
Sindirim sistemindeki bir ok bakteri doal transformasyon kabiliyeti
gsterir. nceden de belirtildii gibi; transformasyon yabanc DNA
moleklnn mikroorganizmann veya hcrenin ierisine geerek
mikroorganizmann genetik yapsn deitirmesidir.
Rumen mikroorganizmalar endonkleaz enzimleri bakmndan
zengindirler. Bu nedenle nkleik asitleri hzl bir ekilde paralarlar. Fakat
rumene eklenen DNA birden bire kaybolmaz. nsan salyasndaki plazmid DNA
s salyadaki S.gordoni bakterisini birka dakika ierisinde transforme etme
kabiliyetine sahiptir. Dardan bakterinin bnyesine alnan yabanc DNA,
bakteri tarafndan DNAaz enzimine kar direnli hale getirilmesi birka dakika
alr. Buna karlk fareye oral yolla verilen yabanc DNA paralara ayrlm
halde sindirim kanalnda grlmtr. DNA nn abuk paralanmas sindirim
kanalnda transformasyon olasln azaltmaktadr.
leri srlen bir fikir gereince: Anaerobik koullar nedeni ile rumendeki
bakterilere plazmid transferi iin gerekli enerjinin snrl olmas, bu bakterilere
konjugatif yolla yaplan gen transferi iin rumen uygun bir ortam olmayacaktr.
Buna ramen iki E.Coli bakterisi arasnda plazmitlerin konjugatif yolla
(antibiyotie dayankllk plazmidinin) transferi rapor edilmitir. Transfer
 80

tamamen rumenin dolu olduu aneorobik koulda yaplmtr. Bu ekilde yaplan

plazmit transfer orannn in vitro koullar altnda yaplan transferden dk
olduu fakat bu yaplan transferin belirlenebildii rapor edilmitir.
Konjugatif transfere uygun plazmidler Butyrivibrio fibrisolvens bakterisin
ieririnde tespit edilmitir. Ayn plazmidler Prevotella bakteri trnn ierisinde
de bulunmutur. Ayn ekilde kojnugatif yolla plazmid transferi ev farelerinin ve
yaban farelerinin sindirim kanalndaki mikroplara yapld da rapor edilmitir.
Bu konuda daha youn almalar tetrasilin geni zerinde olmutur.
Tetrasilin halen dnya ziraatnda yaygn olarak kullanlmaktadr hatta srlarda
bymeyi hzlandrmak iin de kullanlyor. Son zamanlarda tetrasiline
dayankllk geni Gram-negatif Prevotella ve Gram-pozitif butyrivibrio bakteri
guruplarnda tespit edilmitir.

9. GEN MHENDSL SONUCU ELDE EDLEN SOMATOTROPN

BENZER BLEKLERN HAYVANLARA VELMESNN
PERFORMANS ZERNE ETKLER

Daha ncede bahsedildii gibi; doal veya rekombinant yolla elde edilen
somatotropin hormonun hayvanlara uygulanmas sonucu; birok hayvan
trnde kas geliiminin artt ve ya depolanmasnn azald rapor edilmitir.
Bu hormon; srlardan ok domuzlar zerine daha etkilidir tavuklarda ise
etkisi en azdr. Byme hormonunun salglanmasn balatan hormon (Byme
hormonun salgsn balatan hormon, GHRH) veya GHRH hormonunun
analou da sr somatotropini ile ayn etkiye sahiptirler. Fakat bu hormonlarn
byme zerine etkisi somatotropin hormonundan dktr. Byme hormonun
salgsn balatan hormonun zellikle domuzlarda bymeye etkisi ok azdr
nk bu hayvanlarda fazla miktarda endojen olarak sentezlenmektedir. Bu
nedenle bu hayvanlar GHRH hormonun dardan verilmesini kar direnleri
vardr.
Byme ile ilgili bir dier hormon ise nslin benzeri byme hormonu
olan IGF1 (nslin benzeri byme faktor1) dir. Bu hormonun kandaki
konsantrasyonu ile byme arasnda pozitif korelasyon vardr. Hormonun
salglanmasn ve etkisini dzenleyen fizyolojik olaylar ok komplekstir. Bu
durum; hormonun iftlik hayvanlarna verilmesi sonucu bu hayvanlarn dk
performans gstermelerinin nedenidir.
Rekombinant sr somatotropninin 20 000 inek zerinde uygulanmas st
veriminin artn gstermitir. Bu hormonun ticareti yaygn olarak yaplmakta
ve birok lke tarafndan kullanlmaktadr.
GHRH hormonunu determine eden genin fareye transferini Draghia-Akli
ve ark., 1997 de gsterdiler. Bylece bu genin farenin kasnda mevcut olmas
saland. Bunun sonucunda bu hayvanlarn kan plazmasndaki stomototropin
miktar artt.
 81

9.1. Gen transferi ile metabolizmann seyrini deitirmek

Gen transferi; ruminantlarn bnyesinde devam etmesi mmkn olmayan faydal
biyokimyasal olaylarn oluumunu salamaya imkn verir. Bu teknik; hayvansal
retimi limitleyen spesifik maddelerin retilmesi iin gerekli mekanizmay tekil
eder. Buna rnek olarak yn verimini artrmak iin sisteyn amino asidinin
endojen olarak sentezini determine eden genlerin koyuna transferi gsterilebilir.
Hayvanlar ve mikroorganizmalar zerinde yaplan genetik
modifikasyonlar nemli avantajlar salar. Fakat bu iler nemli lde zaman ve
finansal kaynak gerektirir. Metabolik olaylarn seyrini transgenik yolla
deitirmek ve normal koullarda metabolik olaylarn oluumunu snrlayan
faktrleri devre d brakmak hayvanlarn yem sindirme kabiliyetini nemli
lde artrabilir. Hayvanlarn vcutlar ierisinde devam eden biyokimyasal
olaylar; hayvanlarn binlerce yl geirdikleri evrim ile balantldr. Evrim
sresince canlya seleksiyon avantaj salayan genler; onlarn genomlar
zerindeki dier genlerin yerini almtr. Hernekadar, bu ekilde bir genetik
deiim yava ise de hayvann bulunduu evre koullarna uyumunu salamas
iin yeterlidir. Modern tarmn gelimesi ile doal seleksiyon yerini
reticiler tarafndan yaplan planl seleksiyona brakmtr. Yaplan planl
seleksiyonlarda istenen zellie sahip elit hayvanlar gelecek kuaklarn
ebeveynleri olarak kullanlrlar. Yaplan ilem doal seleksiyonda olduu
gibidir. nk her iki selesiyonda da genom ierisinde random mutasyonlar ile
istenilen zellie sahip mutant variyetelerin seilmesi sz konusudur. Random
mutasyonlarn kesin sonularndan biri; biyokimyasal olaylarn herhangi zel bir
basamanda grev alan genlerin inaktif hale gelmesidir. Hernekadar, oluan
random mutasyonlar letal olarak nitelendirilse de bazen alternatif olarak
sentezlenemeyen metabolit hayvann yemine katlarak hayvann random
mutasyonun sonucunu tlere etmesi salanabilir. Dardan yeme katlmas
gereken bu metabolitler vitaminler ve dier esansiyel ntrientlerdir.
Ruminant metabolizmasnn karekteristik zelliklerinden biri; gilikoz
absorbsiyonunun snrl seviyede olmas ve yksek oranda glikoneogenezis
olaynn mevcut olmasdr.
Rumen fermantasyonu sonucu en fazla asedat ve propiyonat retilir. Fakat
yalnzca propiyonat glikoz sentezlemede kullanlr. Fermantasyon sonucu
rumende retilen asetattan da glikoz sentezlemeyi salamak amac ile;
transgenik yolla metabolik olaylarn seyri degitirilerek rumendeki metabolik
etkinlik artrlabilir (Saini ve ark., 1996).
Rekombinant DNA teknolojisi ve ilgili gen transferleri sayesinde trler
aras kesin izgiler alm ve hayvan bnyesindeki bozuk biyokimyay tamir
etme imkn domutur. Biyokimyasal olaylarn fonksiyonel halde bulunmasn
salayan genler trler aras farklar gz nne alnmakszn transfer edilebilir.
Saini ve arkadalar 1996 ylnda, bu ekilde farede metabolik etkinlii
artrdklarn rapor ettiler. Bu aratrmaclar bakteriye ait glyoxylate emberinde
 82

grev alan genlerin farenin karacierinde ve sindirim organlarnda bulunmasn

saladlar. Bu genlerin benzer ekilde ruminantlara transfer edilmesi kuru otlarla
beslenen hayvanlarn yemden yararlanmasn artrabilir.
Daha nce de bahsedildii gibi; koyunda yn verimi Sisteyn aminoasiti
tarafndan snrlandrlmaktadr.Bu aminoasit koyun tarafndan
sentezlenememektedir. Sisteyn amino asitinin dardan rasyona ilavesinin
maliyeti ok fazladr. Ward ve Nancarrow 1992 ylnda kuyunun rumen
epitelinde; serine acetyltransferaz ve o-asetylserine slfidraz enzimlerini
determine eden genlerin transgenik yolla bulunmasn ama edindiler. Bylece
serin amino asitinden sisteyn amino asitinin sentezlenebilecegini dndler.
Daha sonra australyada yaplan aratrmalar sonucu bu durum kantland.
Bylece yn verimindeki snrlayc faktr ortadan kaldrlm oldu.
Dier aratrmalar; gen transferi yolu ile mono gastrik hayvanlarn
sindirim kabiliyetini artrmak iin bu hayvanlarn pankreaslarndan sellaz
enziminin salglanmasn salama zerine younlat. Bu konuya ilaveten dier
birtakm aratrmalar ise; hayvan tarafndan esansiyel amino asitlerin de-novo
olarak sentezlenmesini ve hayvanlarn besin maddelerini sindirme kapasitesinin
artrlmas iin transgenik yolla metabolizmay deitirme konusuna dikkat
verdiler.

9.2. Normal metabolizmann modifiye edilmesi

Doal evrim sonucu hayvan bnyesinde devam eden bir takm biyokimyasal
olaylarn kayb sz konusu olur. Oysa basit organizmalarda bu olaylar halen
devam ediyor olabilir. Hayvan bnyesindeki biyokimyasal aksakl gidermek
iin gnmzde basit mikroorganizmalardan hayvanlara gen transferi
mmkndr.
Fonksiyonel genler iin en nemli kayna bakteriler oluturur.
Bakterilere ait enzimlerin ekirdekli hcrelerde ayn fonksiyonu gstermesi bu
gr desteklemektedir. Bu ekilde metabolizmann tamir edilmesi modern
tarmn baz sektrleri iin ok nemlidir. nk; hayvanlarn biyosentetik
kabiliyetlerinin snrl olmas, hayvansal rnlerin retimini snrlayan spesifik
besin maddelerinin oluumuna engel olur. Bu konudaki almalar daha ok
cystein, threonine ve lysin gibi esansiyel aminoasitlerin sentezini salamaya
ynelik olmutur. Bu konuda hayvanlarda baz ilerlemeler saland. rnein:
Fonksiyonel bir glyoksilat emberinin hayvan bnyesinde oluumunu salamak
gibi. Gen transferi sayesinde systein aminoasidinin hayvan tarafndan
sentezlenmesinin salanmas hayvan metabolizmasnn gen transferi ile
modifiye edilebileceinin ispatdr.
 83

9.2.1. Sistein Biyosentezi

Sistein amino asiti koyunda yn verimini snrlar. Normal olarak sisteyn amino
asiti koyun tarafndan sentezlenmemektedir unk; koyun esansiyel olmayan
serin amino asitinden systeyn amino asitinin sentezlanmesinde grev alan
enzimlerden yoksundur. Bu alanda yaplan almalar sisteyn amino asitinin
hayvan bnyesinde serbest kullanlabilir halde olmas; yn verimini nemli
lde artrdn rapor etmitir. Bu amino asitin yeme katlarak hayvana
verilmesi pratik olarak mmkn deildir. nk hem pahaldr hem de
rumendeki mikroorganizmalar bu amino asiti hemen paralar.
Hayvan tarafndan bu amino asitin sentezlenmesini salamaya ynelik
gen transferi ile ilgili almalar 1960l ylllarn ortalarnda bu amino asitin yn
verimindeki neminin kefedilmesi ile balamtr. E. Coli bakterilerinde bu
amino asiti sentezlemeye ynelik biyokimyasal reaksiyon fonksiyonel haldedir.
(ekil 23.2.1.)
Serin

Asedat
Acetyl-CoA Serin transasetilaz

O-Asetilserin

H2S

O-Asetilserin slfhidraz

Sisteyn

ekil 9.2.1. Asetil- CoA nn ve Serin transasetilaz (SAT) enziminin mevcut bulunduu
ortamda; serin amino asiti O-acetylserine dntrlr. O-acetylserine; slfid ve O-Asetilserin
slfhidraz (OAS) enziminin mevcut olduu ortamda sisteine dntrlr. Koyunun
rumeninde slfid konsantrasyonu 0,6288 mikro gr/ml dir. Ksaca rumende sisteyn sentezi
iin yeteri kadar slfid vardr. Eer, SAT ve OAS enzimleri rumen epitel hcrelerinde mevcut
olur ise sisteyn sentezi mmkn olabilecek.
 84

E.Coli bakterilerinde CysE geni SAT enzimini, cysK veya cysM geni ise
OAS enzim varyantlarn determine eder. CysE ve cysK genleri bakteri
genomundan ayrlm ve promoter ilave edilerek ekirdekli organzmalara
transferleri iin uygun hale getirilmitir. Kullanlan promoter metallothionein Ia
promoteridir. Bu promoter transfer edilen genlerin rumen epitelinde
ekspresyonunu denetler. Transfer iin kullanlan plazmid 8385 baz ifti ihtiva
eden pMTCEK1 plazmitidir (ekil 23.2.2.).

MTCEK1 plazmiti ile ekirdekli organizmalara gen transferi yapmak

mmkndr. Bu plazmit ekirdekli hcre kltrnde denendi ve hcreler
kltrde SAT ve OAS enzimi sentezledi. Bu ekilde bu plazmid kullanlarak
bakteriyel enzimlerin ekirdekli hcrelerde de sentezlenebilecei ispatlanm
oldu. Ayn plazmit kullanlarak fareye CysE ve cysK genleri transfer edildi.
Transferden sonra bu iki genin farenin sindirim sistemindeki ve hayvann dier
organlarndaki dokularda mevcut olduu bildirildi. Bu olay ispatlamak iin
farenin sindirim kanalndan alnan doku rnekleri kltre alnd ve kltr
ortamna slfhid ilave edildi. Sonra kltr ortamndan alnan rneklerde sisteyn
analizi yapld. lmler neticesi; dokularn sisteyn sentezledii bildirildi.
Bu aratrmaya ynelik en tatmin edici alma transgenik fareler ile
normal farelere bir diyet hazrland hazrlanan diyete Na 2S ilave edildi fakat bu
diyette slfr aminoasitlerinin (Systeyn ve methiyonin) miktar en dk
seviyeye getirildi. Fareler 7 gn bu diyet ile beslendi. Yedi gn sonra normal
 85

farelerde kilo ve ty kayb grlr iken transgenik farelerde kilo art ve ty

bymesi grld.
Bu alma gsteriyor ki mikroorganizmalarn ierisinde devam eden
biyokimyasal olaylarn seyrini denetleyen genlerin hayvanlara transfer edilmesi
ile ayn biyokimyasal olaylarn hayvanlarn vcutlarnda da herhangi bir
aksaklk sz konusu olmadan devam edebileceini gstermektedir.
MTCEK1 plazmitini kullanarak yaplan gen transferinin amac koyun
bnyesinde yn verimi ilgili biyokimyasal olayn oluumunu salamakt fakat
bu plazmidi kullanarak imdiye kadar koyunda baarl bir sonu elde
edilmemitir. Dier plazmitler kullanlarak imdiye kadar 28 tane vcutlarnda
systeyn amino asiti sentezleyen transgenik koyun elde edilmitir. Bu hayvanlarn
vcutlarnda SAT ve OAS enzimini determine eden DNA paralar E. Coli veya
Salmonella typhimurium bakterilerinden ayrlmtr. Ayrlan bu genlerin
fonksiyonu deiik okaryotik promoter tarafndan kontrol edilmektedir. Bu
elde edilen 28 hayvandan yksek seviyede Systein sentezi grlmedi sadece
dk seviyede grld. Dk seviyede olsa da sentezlenen miktar llebilen
dzeydeydi.
Mikro enjeksiyon yntemi ile Systein sentezleyen transgenik koyun elde
etme oran dier genler kullanlarak yaplan mikroejeksiyon ile transgenik
koyun elde etme oranndan ok dktr. Bu dk seviyedeki expresyonun
nedeni ve bu alanda koyun zerinde yaplan almalarn baarl olmamasnn
nedeni halen bilinmiyor.

9.3. Threonin ve Lysin biyosentezi

Gen transferi ile Systein biyosentezinin salanmas genetik mhendisliinin
metabolizmay ynetebileceinin bir gstergesidir. Benzer almalar halen
gelime aamasndadr. Bu almalardan biri de lysin ve threonin biyosentesinin
ruminant olmayan hayvanlarda sentezlenmesini salamaktr.Yemlerdeki
proteinlerin hayvan tarafndan etkin bir ekilde kullanlmas bu amino asitlere
baldr. Systein biyosntezinde bahsedilen metodun ayns uygulanr fakat biraz
daha karmaktr. nk threonin biyosentezi drt, lysin biyosentezi ise sekiz
ayr gen tarafndan determine edilmektedir. Bu nedenle transfer iin uygun
plazmiti tasarlamak karmak ilemler gerektirir. yle grnyor ki Systein
biyosentezine ynelik yaklamlarla bu amino asitlerin sentezinde baarya
ulalmas zordur. Fakat ok sayda genlerin transferindeki zorluklar ortadan
kaldracak modeller nerilmitir. Yaplan bir neriye gre bir enzim birden ok
gen tarafndan kodlanyorsa; her bir gen iin ayr promoter kullanmak yerine bu
genleri birletirip tek bir okaryotik promoter kullanmak daha pratiktir.
Aadaki ekil 9,3.1a da systeyn biyosentesi iin her geni ayr ayr
promoter ile birlikte plazmite yklenmitir. ekil 23,3.1b de iki gen arasna poli
Adenin zinciri (Ribozoma giri ksm) eklenmitir. Eer iki gen arasna poli (A)
zinciri eklemez ise iki genin kodlad rnler birbirine karr ve ok
fonksiyonlu bir protein ortaya kar (ekil 23,3.1c).
 86

ek

a)
P GEN-1 P GEN-2

mRNA mRNA

Enzim-1 Enzim-2

b) P GEN-1 Poli (A) GEN-2

mRNA

Enzim -1 Enzim-2

c) P GEN-1 GEN-1

mRNA

Enzim-1 +Enzim-2 (ok fonksiyonlu protein)

il 9.3.1. Birden fazla enzimin salglanmasn determine edecek ekilde plazmidler dizayn
edilebilir. ekildeki 26,3.1b. de iki gen arasna; ribozama balanma ksm veya poli Adenin
zinciri (poli A) eklenmitir. Bu ekilde her iki genin rn birbirine karmaz.

Bir multifonksiyonel DNA paras zerinden sentezlenen mRNAdan

istenilen enzimleri elde etmenin iki yolu vardr. Birincisi encephalomyocarditis
virsne ait DNA zincirinin ribozama giren poli (A) ksmn kullanmak. Bu
ksm tek mRNA y kodlayan iki DNA zincirinin arasnda olup mRNAnn
translasyonunun RNAnn uc ksmnda veya ortasnda bir yerde balamasn
salar. Bu tarnslasyon sonucunda iki ayr polipeptit oluur. Bu mesele artk
ticari bir hal almtr. zerine deiik DNA paralar yerletirip tasarma uygun
birok vektr piyasada mevcuttur. kicisi ise tersiyer yapda ve zerinde deiik
katalitik yerler bulunan tek bir polipeptitin elde edilmesidir (ekil 26,3.1c). Bu
gr gnmzde proteinlerin yapsn ve fonksiyonunu belirlemedeki teknik
gelimelerin yardm ile nem kazanmaktadr.
 87

Bu teknik biyokmyasal olaylar kodlayan DNA miktarn azaltma imkn

sunmaktadr. rnek olarak; bitkilerde mannitylopine biyokatalizini enzim
birlikte determine eder. Bu enzimleri kodlayan DNA paralar birletirildi ve
bunlara yalnz bir tane bitki promoteri eklendi sonra her enzimi kodlayan DNA
zincirleri arasna ksa bir DNA paras yerletirildi. Bu yerletirilen DNA paras
proteaz enziminin tand DNA zincirini kodluyordu. Bu ekilde dzenlenmi
ve plazmide balanm DNA paras hcreye verildii zaman; proteaz enzimi
tand bu yerlere balanarak onlar keser ve genler hcre ierisinde serbest
hale geerek ayr ayr fonksiyon gsterir.

9.4. Glyoxylate emberi

1990 ylnda Australyadaki, Sidney Macquarie universitesinde, glyoxylate
emberinin ruminantlarda oluumunu salamaya ynelik bir proje yrtld.
Bylece, hayvan bnyesinde asedatlardan gilikoz sentezlemek mmkn
olacakt.
Ruminantlarn yemdeki besin maddelerini kullanmadaki kabiliyeti
monogastrik hayvanlarnkinden dktr. Bunun nedeni glikoz miktarn az
olmas nedeniyle sindirim kanalndaki absorbsiyonun dk olmasdr.
Ruminanlarn vcutlarndaki baz dokularn asedatlardan direkt olarak
glikoz sentezleme olayndan fayda salarlar. Bu dokulara rnek olarak
karbonhidratlara ar gereksinim duyan meme bezlerini oluturan dokular ile
yapa folikllerini meydana getiren dokular gsterebilir. nk stte yksek
oranda karbonhidrat vardr ve yapadaki foliklarde ise pentoz fosfat olaylar
cereyan etmektedir. Bu pentoz fosfat reaksiyonlar keratin-protein biyosentezi
srasnda ceryan eder.
Fonksiyonel bir glyoxtlate biyokimyasnn hayvann vcudunda oluumu,
iki enzimin hazr olmasna baldr. Bu enzimlerin biri izositrat lizas dieri ise
malat sentezasdr. zositrat lizas enzimi izositrat sksinata ve glyoxylata ayrr.
Malat sentezas ise glykozilatn asetyl-CoA ya balanmasn salayp malat
sentezlemeyi katalize eder.
 88

Bu iki enzimi kodlayan ace A ve ace B genleri E.Coli bakterilerinin

genomlarnda mevcuttur. Bu bakterilerden bu iki gen ayrlmtr. Ayrlan bu
genler MTaceAB 1 plazmitine yklenmitir. Bu plazmitin yaps daha nce
bahsedilen MTCEK1 plazmitininkine benzerdir. Sadece fark Cys E ve CysK
genlerinin yerini ace A ve ace B genleri almtr. Bu genlerin yklendigi
plazmid kltrde memeli hcrelerine geii salanm. Rapor edildiine gre
transferden sonra memeli hcrelerinde bu iki genin translasyonu salanarak bu
iki enzim sentezlenmitir. Ayn ekilde farelere de transfer yaplm ve genlerin
determine ettii enzimler bu hayvanlarn karacierlerinde, sindirim kanallarnda
ve dier organlarnda retildii bildirilmitir.
 89

10. REME LGL BYOTEKNKLER

10.1. Nkleer trasnfer

Biyoteknolojik olarak klon kelimesinin anlam genetik yaps bilinen
yavrularn retimesidir. Embriyodaki hcreler ve tm vicut hcreleri 2n
kromozomludur. Bu hcrelerin ekirdeklerindeki DNA bireyin tm zlliklerini
determine eden genleri tar. Bu nedenle elit hayvanlarn hcrelerinin
ekirdekleri baka bir oosit ierisine transfer edilerek genetik yaps bilinen
hayvanlar elde edilir. Bu hayvanlar ebeveynlerinin kopyasdr. Son 10 yl
ierisinde memeli hayvanlarn klonlanmasnda nkleer transferin
kullanlmasnda nemli ilerlemeler salanmtr. Nkleer transferde balang
materyali olarak metefazII safhasndaki ekirdei ve polar cismi karlm
oosite veya sitoplasta gerek vardr. Stoplastn grevi transfer edilecek nkleusun
yeniden programlanmasn salamaktr. Metefaz-II safhasndaki olgun oosit
canl kaynaklardan salanabildii gibi in vitro ortamda oosit ongunlatrma
sonucu da elde edilebilirler. Nkleer transfer iin oosit kayna olarak
kesimhanelerden yararlanmak isabetlidir. Bu ekilde yzlerce oosit hcresi
kesilmi hayvanlarn ovaryumlarndan alnr ve olgunlatrlr. Olgun oositlerden
mikro pipet yardmyla polar cisim ve nkleus aspire edilir. Bu aspirasyon
srasnda toplam sitoplazmann %10 da aspire edilmi olur. Darda mikro
pipetle oosite girildii zaman dtaki zona zar mikro pipete kar bir lastik engel
gibi diren gsterir. Giri esnasnda oositin eklinde katlanma ve ukurlama
gzlenir. Pipeti karrken de sanki pipete yapm gibi uzayp kopacakm gibi
bir grnt sergiler. Nkleus olgunlam oositten karlrken oositte, polar
ismin alnd noktada ve kullanlan pipete DNA kalntsnn olamadndan
emin olmak gerekir. DNA kalntlarn grebilmek iin DNA-spesifik
florokromla oosit hcresi nceden boyanr. Bu floresan boya DNA ya balanr,
ultra viyole altnda DNAnn floresan grnm arz etmesine sebep olur.
Bu ekilde oositte DNA kalnts olup olmad grlr. Daha sonra transfer
edilecek hcre ekirdei mikro pipet ierinse alnarak sitoplast ierisine
nakledilir veya bu ilem elektrofzyonla yaplr. Transferi istenen nkleusun
hcrenin iine elektrofzyonla gemesi salanma yntemi baz hayvan
trlerinde baarl olmu embriyonik gelime salanabilmitir. Bu metotta
embriyo geliimini kimyasal olarak balatmak iin iin iine ionofor ile birlikte
bir protein kinaz inhibitr eklerler. Oluan embriyolar senkronize edilmi
diilere transfer edilmeden nce canllklarn test etmek iin belli bir sre kltr
ortamnda tutulurlar. Nkleer tansfer tekniginin baarsn etkilen faktrler
arasnda transfer edilen nkleusun alnd hcrenin kayna nemli olabilir.
Baar durumu hcrenin embronik, fetal, ergin hcresi olup olamamasna gre
deiebilir. Demek oluyor ki doku farkll klonlamann baarsn etkiliyor. Bu
sonuca fareler zerinde yaplan almalar sonucu ulalmtr (Wakayama ve
ark., 2001). Nkleosu transfer edilecek hcrenin hcre emberinin neresinde
 90

olduu da nkleer transferin baarsn etkiler (Mitalipov ve Wolf, 2000).

Koyunda somatik hcreleri G0 safhasnda tutmak iin bu hcrelere serum
eklenmedi. G0 safhasndaki hcrelerin nkleusu transfer edildi. Son zamanlarda
kolanlama ileminin G0 /M ve G2/M safhasnda bulunan hcrelerin
nkleuslaryla da saland bildirildi (Mitalipov ve Wolf, 2000). Baar durumu
ayrca oositin in vivo veya in vitro koullarda olgulam olup olmamsna gre
de deiir. Ayn zamanda ekirdei transfer edilecek hcreyle sitoplast
arasndaki senkronizyonunda da etkisi vardr.

Resim 10.1. Doli 6 yandaki Finn-Dorset koyunun memesinden alnan hcrenin

ekirdeginin iskoc karayzl koyununa ait oosite transferi sonucu elde edilmitir. Doli bu
ekide yaplan klonlamadan elde edilen ilk kuzudur. Doliyi elde etmek iin Wilmut ve
arkadalar 1997 ylnda 227 defa oosite nkleus transferi yaplar. Bu yaplan
transferlerden sadece 29 transfer edilebilir embryo gelitirilerek 13 tane alcya transfer
edildi bu transferden sadece Dolly elde edildi (Champell, 1997).

10.2. Trasngenik hayvanlanlar

Transgenik hayvanlar: DNAlarna bir veya daha fazla yabanc gen
yerletirilmi veya DNA larndan baz genlerin silindigi hayvanlardr. Bu
hayvanlar genomlarna transfer edilen zel DNA parasn vucutlarn oluturan
tm hcrelerin genomlarnda tarlar. nk zel DNA paras onlarn zigolar
ierisine veya embryolarndaki kk hcrelerine transfer edilmitir. Transferi
mteakip, zigot veya embriyo blnr sonunda yeni bir fert oluur. Bylece bu
yeni ferdin tm hcrelerinin nkleosunda bu zel DNA veya onun bir paras
mevcuttur. Eger transfer edilecek DNA zerinde belli hcreye veya dokuya ait
farkllamay salayan genler (promoter genler) de mevcutsa o zaman
 91

transgenik hayvann belli hcreleri veya dokular bu genden dolay fizyolojik

deiklikler gsterir (Markula ve Huhtaniemi, 1996).
Farkl trlere, cinslere hatta filumlara mensup canllar arasnda gen
transferinin mmkn olmas rekombinant DNA teknolojisinin gelimesine neden
oldu. Gnmzde insan inslini bakteriler tarafndan, insan kuagulasyon faktr
ise ineklerin stnden elde edilmektedir. Gen transferinde, klonlamada ve
yardmc reme tekniklerinde salanan ilerlemeler transgenik iftlik hayvanlar
elde etme konusundaki beklentileri artrmtr.
fede edildii gibi; transgenik hayvanlar veya genetiksel modifiye edilmi
organizmalar (GMO); genomlar ierisine yabanc genler yerletirilmi ya da
genomlarndan baz genlerin karld canllardr. Nasl rekombinant DNA
teknolojisi yardmyla bir bakterinin genomu ierisine bir gen yerletiriliyorsa
veya karlyorsa ayn ey hayvanlar ve bitkiler zerinde yaplarak genetiksel
olarak modifiye edilmi transgenik hayvanlar ve bitkiler (GMO lar) elde edilir.
Genetiksel Modifiye Edilmi Organizmalar (GMO) konusundaki almalar 43
yldan beri devam ediyor (Jackson ve ark., 1972, Cohen ve ark., 1973).
Genetiksel olarak modifiye edilmi ilk bakteri Escherichia Colidi (Cohen ve
ark., 1973). O zamandan beri canllarn genetik manplasyonu konusundaki
almalarda nemli ilerlemeler saland. Deiik bakteri trleri, funguslar,
protistalar, bitkiler ve hayvanlar GMO olarak elde edildiler. lk tarnsgenik fare
41 yl nce elde edildi ( Jaenisch ve ark., 1975). Gnmzde de memeliler
zerinde yaplan genetik almalar iin en nemli model faredir. Fare DNAsn
oluturan nkleotitler (sekans analizi) 2002 ylnda tespit edildi (Waterston ve
ark., 2002). Fare genomunun nkleotit dizisinin tespit edilmesi srlarn,
koyunlarn ve keilerin genomlarnn manplasyonu konusuna nemli bilimsel
bilgiler salayacaktr. Transgenik hayvan elde etmek iin yaplan ilk
almalarda ama ucuz yolla bol miktarda farmakolojik maddeler elde etmekti.
Bu amala genler zigottaki pronkleus ierisine enjekte ediliyordu. Fakat bu
yntem etkin deildi ayrca tek ovulasyon yapan hayvanlarda uygulanmas
pahalyd. Fakat Wilmut ve arkadalarnn 1997 ylnda somatik hcre
ekirdeklerinin yumurta zarnn ierine nakliyle gerekletirdikleri nkleer
transfer ksa srede ve ucuz yolla transgenik hayvanlarn elde edilmesi konusuna
yeni bir yaklam getirdi (Polejaeva ve Campbell, 2000). Bylece iftlik
hayvanlarnn kalitatif ve kuantitatif verim zelliklerini gelitirmeye ynelik
genetik modifikasyonlarn salanmas konusundaki gen transferi almalarna
yeni bir yn kazandrld.
Trasngenik hayvan etme konusunda yaygn olarak kullanlan metotlar
1. Pronkleus injeksiyonu (Mikro injeksiyon) ile gen trasnferi
2. Emriyonik kk hcreleri yardmyla gen transferi
3. Vrsler yardmyla gen transferi
4. Spermlerle gen transferi
5. Yapay kromozom yardmyla gen transferi
 92

Gen ilavesi daha ok mikroenjeksiyonla ya da embriyonik kk hcrelerinine

elektroporasyonla salanr. Her iki metotta da nce o genin DNA zerindeki yeri
belirlenir sonra sz konusu gen DNAdan kesilerek baka bir hayvana ait
dllenmi yumurta ierisine enjekte edilir veya embriyonik kk hcrelerine
transferi salanr. Enjeksiyon ii mikroskop altnda mikro cam pipetler
yardmyla yaplr. Enjekte edilen DNA yumurtann DNAs ile entegrasyona
girer ve bunu embriyo blnmesi takip eder. Bylece elde edilen transgenik
hayvan o geni kendinden sonraki fertlere kaltmla transfer ederler.

10.2.1. Pronkleus enjeksiyonu

Bu teknik trasngenik hayvan elde etmede baar salayan tekniklerin ilkidir.
lknce farede uyguland (Gordon ve Ruddle 1981) daha sonra deiik hayvan
trlerinde rnein yaban farelerinde, tavanda, koyunda, domuzlarda, kularda
ve balklarda uyguland. Bu teknikle iftlemi diinin yumurta kanalndan
dllenmi yumurta alnarak zel gen kk cam mikropipet kullanlarak byk
pronkleusun ierisine enjekte edilir. Dllenmi yumurta iki tane pronkleus
ierir. Bunlarda biri erkek pronleus digeri ise dii pronkleusdur. Dii
pronkleus byk erkek pronkleus ise kktr. Enjeksiyon byk pronkleus
ierisine yaplr. Gen enjekte edilen zigot nceden vasektomi edilmi erkek ile
iftletirilen diinin yumurta kanalna yerletirilir. Farelerde uterusun
yumurtann balanmasna hazr hale gelmesi cinsel temas ile salanr ksaca bu
hayvanlarda dllenme olmadan sadece temas ile hayvann reme kanal gebe
hayvann reme kanal ile ayn hale gelir.
 93

Resim 10.2.1. Pronkleus injeksiyonu ile transgenik fare elde etme prosedur. 1. Hormonla
farede ovulasyon salanr sonra dii fare ayn rktan bir fare ile ifletirilir. Dii fareden
dollenmi yumurtalar alnr (2). Kmulus hcreleri ile evrili olan dllenmi yumurtalar
oviduktan toplanr. (3) Dollenmi yumurtalarda kumulus hcreleri ayrlr ve zel geni tayan
DNA paras dii pronkleusa injekte edilir. (45) Alc dii farenin reme kanaln transfer
iin hazr hale getirmek iin erkek fare ile iftletirilir nk bu hayvanlarda iftleme sonucu
gebelik fizyolojisi geliir. Sonra bir veya iki hcreli transgenik embriyolar reme kanal hazr
hale gelmi farelerin oviduklarna transfer edilir.(6) Bu embryo transferinden 19 gn sonra
transgenik yavrular doar (Markula ve Huantemi, 1997).

Enjekte edilen DNA nn enjekte edilen hayvann genomuna integrasyonunun

nedeni bilinmemektedir. Transfer edilen bu geni yeni doan hayvanlarn
genomlar zerinde gstermek ve dolaysyla transgenik olup olmadklarn
DNA zerinde gstermek iin polimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) veya
southern transfer teknikleri kullanlr.
Mikro enjeksiyondan sonra, transgenik hayvan elde etmek iin
retrovirsler yardmyla gen transferi (Jaenisch, 1976) ve embryonik kk
hcreleri yoluyla gen transfer metotlar gelitirildi (Gossler ve ark., 1986).
 94

10.2.2. Emriyonik kk hcreler yardmyla gen transferi

Zigota gen enjeksiyonu ile transgenik hayvan elde etmede grlen
problemlerden biri enjekte edilen genin yumurtann genomu ile integrasyonu
kontrolnn ok az olmasdr. Enjekte edilen genin binlerce kopyas random
olarak yumurtann genomu ile integrasyona geer. Enjekte edilen genin hcrenin
genomu ile integrasyonunun kontrol embroyonik kk hcreleri metodunda
daha fazladr. Embryonik kk hcreleri balastosit safhasndaki embryonun
ierisinde bulunan hcre yndr bu hcre yn tropoekdoderm tarafndan
paketlenmitir. Blastosit halindeki bu embriyolar fareden alnp kltr ortamna
konur. Kltr ortamnda bu hcreler birbirinden ayrlr ve kltrde bu hcreler
oaltlr. Yabanc DNA kltrdeki kk hcrelerine retrovirsler yardm ile
elektroporasyon veya mikroenjeksiyon gibi metotlarla verilirler.

10.2.3.Virslerle gen trasnferi

Virs DNAs kullanlarak memelilere ilk baarl yabanc DNA transferi 1974
ylnda yapld. Blastosit ierisine Seminan 40 virsnn (SV40) DNAsnn
mikro enjeksiyonu sonucu viral kopya DNA tayan salkl fareler elde edildi
(Jasenisch ve Mintz, 1974). Daha sonra germinal hcrelere viral DNA
transferinin; direkt olarak Moloney lsemi virsnn (MLV) implantasyon
ncesi embriyolara enjensiyonuyla saland gsterildi (Jaenisch, 1976). Bu
alma retroviral genomu vektr olarak kullanp transgenik hayvanlar elde etme
almalarna balang tekil etti.
imdiye kadar transgenik hayvanlar elde etmeye hizmet edecek iki tip
retroviral vektr gelitirildi. Bu vektrlerden biri protip retrovirs genomundan
elde edildi (rnein MLV virsleri), dieri daha kompleks retrovirs
genomundan (rnein Lentinovirslerden) elde edildi. Protip retrovivslere
kyasla Lentinovirsler daha kopleks bir genoma sahiptirler. nk bu virsler
genomlarnda daha fazla gen tarlar (MLV virslerinden en az 3 gen fazla
tarlar) (Desrosiers, 2001). Gerekte protip virslerle lentinovirsler arasnda en
nemli fark protip virsler gen transferi iin mitoz geiren hcrelere gereksinim
gstermeleri, lentinovirslerin ise genomunun aktif olarak ekirdee transfer
edilebilmesi nedeniyle trasngenik almalarda blnme potansiyeli olan
hcrelere gereksinim gstermemeleridir. Lentinovirsler vektr olarak kullanlp
blnmeyen hcrelere de gen transferi yaplabilir (Follenzi ve ark., 2000).
Transgenik hayvan elde etme almalarnda nceleri protip virsler
(MLV virsleri) vektr olarak kullanlyordu. iftlik hayvanlar dahil birok
hayvan trnde bu virsleri kullanarak gen transfer etmede baar saland fakat
bu virslerle yaplan gen transferinde baz nemli snrlamalar vardr. Bu
snrlamalar:

1. Porotip retrovirslerle transfer edilen genler transfer edilen

hayvanlarda ekspre edilmeyebilir. Transfer edilen genin
fonksiyonel hale gemememsinin nedeni ise transfer edilen viral
 95

DNAnn terminal ksmnda bulunan ve ard arda tekrar eden

promoter ve transkipsiyonu salayan faktrlerin transferin
yapld hayvann hcrelerinde gen basklama mekanizmasnn
devreye girmesi ve viral DNAnn promoter ksmnn de novo
DNA metilasyonuyla hipermetilasyona uramasdr (Jahner ve
Jacnisch, 1985).
2. Protip virsler ok kktrler. Bu nedenle byl 10 kb
geen byk genlerin bu virslerle transferi ok zordur. Bu
durum bu virslerin kullanmn snrlamaktadr.
3. Transfer edilen viral DNAnn son ksmda bulunan ard arda
gelen tektarl uzun nkleotik zinciri transferin yapld memeli
hayvann hcrelerindeki promoterlerle etkileime girmesi
sonucu transfer edilen gen bask altna alnabilinir veya gen
ekspresyonunun beklenmedik bir ekilde vuku bulmasna neden
olabilir.
4. Protip virslerle enfeksiyonun salanabilmesi iin bu virslerin
enfekte ettii hcrelerin blnmesi zorunludur. Ksacas
hcreler mitoz geirme potansiyeline sahip omal, germinal
vezikln mitoz esnasnda dalm olmas gerekir ki
enfeksiyon salanabilsin. Bu nedenle zel genin yklendii bu
virslerin blastosit ierisine enjeksiyonu ou zaman hcre
DNAsyla entegrasyonunda gememe durumuyla sonulanr.
Bu da imerik hayvanlarn olumasna neden olur. imerik
hayvanlar kendine transfer edilen geni bir sonraki kuaa
aktarmazlar. imerik hayvanlarn tekrar kendileriyle
iftletirilmeleri gerekir ki transgenik hayvan elde edilebilsin.
Bu da zaman ve maddi kayba neden olur.
Retrovirslerin sebep olduu yukardaki snrlamalar ortadan kaldrmak, mitoz
geirme yetenei olmayan hcrelere de gen transferini salamak iin DNA
virsleri (Adenovirsler) transgenik hayvan elde etmek iin farede (Tsukui ve
ark., 1996), yaban faresinde ve srda kullanld ( Kubisch ve ark., 1997). Her
ne kadar adenovirsler kullanlarak imerik olamayan transgenik fareler elde
edilebildiyse de bu metot dier hayvan trlerinde baarya ulaamad.
Viral vektrler kullanp transgenik hayvan elde etme almalar Lentino
virslerin vektr olarak devreye sokulmasyla a atlad (Naldini ve ark., 1996;
Poeschla et al., 1996; Lois ve ark., 2002; Pfeifer ve ark., 2002). Bu virsler
birok canl trn infekte eder. Bunlarn infeksiyon spekrumu oldukca geni.
Lentino virslerin vektr olarak kullanma yntemi gnmzde trasngenik iftlik
hayvan elde etmenin en etkili metodudur. Transfer edilen genlerin
ekspresyonunu artrmak iin ekspresyonu artrc elementleri (enhansrlar)
ieren lentinovirsler gelitirilmitir. Retrovirs DNAsnn son ksmndaki ard
ardna tekrar eden nkleotit dizilerinin neden olduu gen ekspresyonundaki
beklenmedik gelimeleri engellemek iin bu ksmlardaki promoter ve enhansr
 96

zincileri silinmi yerlerine doku spesifik promoter dizileri yerletirilmitir

(Miyoshi ve ark., 1998; Zufferey ve ark., 1998; Pfeifer ve ark., 2002). Baz
durumlarda tetrasilin geni tayan viral vektre tetrasilin ekspresyonunun
kontroln salayan genler de yerletirilmitir. Bylece tetrasilin ekspresyonu
istendii zaman salanabilir istendii zaman da bloke edilebilir.
Lentinovirslerin vektr olarak kullanlmas neticesi taransgenik hayvan
trlerinin says artmaktadr. Son zamanlarda lentinovrs vektrleri kullanarak
%13-31 arasnda transgenik domuz elde edildii rapor edilmitir. Ayrca elde
edilen transgenik havyalarn %90nndan fazlasnda ekspresyonun yksek
seviyede olduu bildirildi (Hofmann ve ark., 2003; Whitelow ve ark., 2004). Bu
sistem srlarda da baarl olmutur. stenilen zel genin entegre edildii
lentinovirslerle dllenmeden nceki sr oositleri enfekte edildii zaman bu
oositlerin dllenmesi sonucu meydan gelen embriyolardan oluan buzalarn
hepsi transgenikti (Hofmann ve ark., 2004). Fakat ok ilgintir, implantasyon
ncesi buza embriyolarnn zel geni tayan ayn lentiviral vektrle
enfeksiyonu sonucu oluan buzalarn hibirisi transgenik deildi (Hofmann ve
ark., 2004).
Hernekadar lentinovirsler kullanlarak transgenik hayvanlar elde
edilebilse de bu sistemde baz yetersizlikler vardr. En nemli yetersizlik bu
virslerin genomlarnn konvansiyonel protip retrovirslerde olduu gibi kk
olmalar sonucu 10kb uzunluundaki byk genlerin bu virslerle transferi ok
zordur. Lentinovirsleri kullanarak baz hayvan trlerinde baarl gen
transferlerinin salanmas her hayvan trnde de ayn baarnn salanmasn
garanti altna almaz. rneim lentinovirsler vektr olarak kullanlp transgenik
fare, domuz, sr ve tavuk elde edilebilmitir fakat trasngenik maymun elde
edilememitir (Wolfgang ve ark., 2001). Tm transgenik uygulamalarda olduu
gibi baka bir snrlama ise transfer edilen gen random olarak endojen genomun
ierisine yerleiyor bu da endojen genomda mutasyona neden olabilmektedir.

10.2.4. Sperm yardmyla gen transferi

1971 ylnda memelilere ait sperm hcresinin dardan verilen DNAya
balanma yeteneinin olduu bildirildi (Brackett ve ark., 1971). Daha sonra,
1989 da, sperm hcresinin DNAya balanma kapasitesinden faydalanlarak zel
genlerin dllenme srasnda yumurta hcresine transfer edilebilir raporu fareler
zerinde yaplan almalar sonucu ileri srld (Lavitrano ve ark., 1989). Bu
durum bilim adamlarnn dikkatini ekti nk bu yntem basit ve ucuzdu. Daha
sonra bu metodun transgenik hayvan elde etmedeki dk istikrar ve etkinlii
konusunda yllarca farkl grler ileri srld. Buna ramen son yllarda sperm
hcresini vektr kullanarak birok hayvan trne (livestok hayvanlarda, kmes
hayvanlarnda ve balklarda) gen transferi yaplabildiini ispatlayan ok sayda
makale yaynland. Bu yntemin baars hayvann trne gre, laboratuar
koullarna gre deiir. Domuzda bu metotla baaryla uygulanrken srda
baarl olunamamtr (Lavitrano ve ark., 1989; Schellander ve ark., 1995). Tre
 97

gre, laboratuar koullarna gre farkl sonularn elde edilmesinin nedenleri

halen bilinmiyor. Bu nedenle sperm hcresini vektr kullanarak transgenik
hayvan elde etme metodunun yaygn kullanm alan yoktur.
Bu konuya baka bir yaklam ise istenilen genlerle sperm hcresini
inkbasyona soktuktan sonra yumurta hcresinin stoplazmas ierisine enjekte
etmektir. Bu yntem Perry ve arkadalar tarafndan 1999 da uyguland. Bu
bilim adamlar membran intakt veya distrbe edilmi memrana sahip fare
spermlerini yabanc DNA ile inkbasyona soktular. Daha sonra bu spermleri
yumurta hcresinin stoplazmas ierisine enjekte ettiler ve bu dllenmeden
meydana gelen yavrularn yaklak %20sinin transgenik olduunu rapor ettiler.
Yabanc DNA ile kotlanm sperm hcrelerinin mikro enjeksiyonuyla yaplan bu
gen transferi sadece domuzda baarl olmutur. Bu nedenle bu teknik geni
kullanm alanna sahip deildir (Lai ve ark., 2001; Kato ve ark. 2004;
Hirabayashi ve ark., 2005; Kurome ve ark., 2006).
Aratrmaclar transferi istenilen zel genin sperm hcresinin DNAsyla
entegrasyonunun daha fasilite hale gelmesi iin elektroporasyon veya lipozom
muamelesi yaptlar (Smith ve ark., 2005). Son zamanlarda trasnfer edilecek gen
nce sperm hcresinin yzey atijenlerine balanan monoklonal antibodiyle
kartrlp sonra dllenme salanr. Bu yntemle farede ve domuzda yksek
seviyede baarya ulalmtr (Chang ve ark., 2002).
Bu metotta yabanc DNAn sperm hcresi tarafndan alnabilirlii bu
yntemin baarsn snrlayan bir faktr deildir. Nitekim dondurulmu veya
taze boa spermlerinin yabanc DNA molekllerini etkin olarak ald son
zamanlarda gsterilmitir (Anzar ve Buhr, 2006). Ayn zamanda transferi
istenilen genin sperm DNAsna entegrasyonunu arttrma konusunda almalar
younlat. Transfer edilecek genin sperm genomuna entegrasyonunu artrmak
iin restriksiyon enzimi yardmyla sperm DNAsyla entegrasyonun
artrlmasna alld. Bu yntemin transgenik hayvan elde etmede baarl
olduu bildirildi (Shemesh ve ark., 2000). Sperm hcresiyle yaplan gen
transferinde transfer edilen genin sperm DNAsyla entegrasyonunun
mekanizmas halen bilinmiyor. Ksaca bu tekniin etkin bir ekilde kullanm
iin daha fazla almaya gerek vardr.

10.2.5. Yapay kromozom transferi

Yapay kromozom vektrleri hcre ierisinde kendini eleyen bamsz
kromozomlardr. Random kromozom paralarndan insan yapay kromozom
vektr elde edildi (Tomizuka ve ark., 1997; Tomizuka ve ark., 2000; Kuroiwa
ve ark., 2000). Yapay kromozom vektrlerinin megabaz uzunluundaki DNA
zincirlerini tama kapasitesi vardr. Bu vektrler bir sentromer, iki tane telomer
ve elenmeyi salayan temel elementleri tamak zorumdadrlar. Yapay
kromozom vektrleri fareye transfer edildi ve formlarn korudular. Fetal
fibroblast hcrelerine yapay kromozom vektrleri transfer edildi ve takiben bu
hcrelerin ekirdekleri yumurta hcresine transfer edilerek transkromozomik
 98

buzalar elde edildi (Kuroiwa ve ark., 2002). Bu almada zerinde biri ar

ve dieri ise hafif lamda zinciri bulunan, 110 Mb lk insan suni kromozomu
kullanld. Orijinal olarak bu yapay insan kromozomu (HAC) in hamsterinin
ovaryum hcrelerine transfer edildi sonra sr fibroblast hcrelerine transfer
edildi. Fibroblast hcreleri kltre alnarak koloni oluturmalar saland. Sonra
yapay kromozomu tayan hcreler seildi ve nkleuslar sr oositlerine
transfer edildi. ine nkleus transfer edilen oositler kzgnlktan sonra 7. gnde
alcya transfer edildi. Embriolar 77. ve 119. gnlerde; transfer edilen yapay
kromozomun var olup olmadn ve deiip deimediini renmek iin
alclarn reme kanalndan alndlar. nsan yapay kromozomunun hcrelerdeki
bulunma durumu, hcrelerin DNAsn PCR yaparak ve antibiyotik G418 kar
dayankllna bakarak, tespit edildi. Bu hcrelerin klonlanmas sonucu elde
edilen 13 fetsten 9u G418e kar dayanklyd ve fetslerin sekizinde ise hem
lamda ar hem de lamda hafif lokus nkleotit dizleri vard. Tm fetslerde
yapay kromozomun boyunda bir deime gzlenmedi. Bu alma sonucu 21
tane transkromotik buza elde edildi. Ayrca bu buzalardan 4 tanesinin
fibroblast hcrelerinde ve periferal kan lenfositlerinde transfer edilen yapay
kromozomun mecudiyeti floresan in st hibridizasyonla belirlendi. n st
hibridisazyon yaparak kromozomun hcrelerin ierisinde bamsz olarak
bulunduunu ve bir deiime uramadn gsterdi. Bu buzalarn hcrelerinin
%78-100inde yapay kromozom bulunuyordu. u anda elde edilen buzalarn 3
yan gemelerine ramen periferal kan lenfositlerinde bulunan yapay
kromozomda yala alakal bir deime gzlenmedi.
nsan immunoglobulin geninin lokusunda ve ekspresyonunda bir
deimemenin olup olmadn anlamak iin periferal kan lenfositlerinde RT-
PCR analizi yapld (Robl ve ark., 2007). Analiz sonucu insan immnoglobulin
genin iki allelinin de (lamda ar ve Lamda hafif nkleotit zincilerinin) tm
buzalarn kan lenfositlerinde olduu grld. Bu allelerde meydana gelen
deimeleri grmek iin ise DNA sekans analizi yapld. Analiz sonucu her iki
allelde germinal hcrelere ait olamayan nkleotit eklenmesi ve silinmesi
gzlendi. Bu neden daha kolostrum almam buzalarda dk miktarda insan
immunoglobulin proteini tespit edildi.

10.2.6. Hcre genomundaki geni belirleme ve gen yerletirme

Somatik hcrelere transfer edilen genlerin rekombinasyon frekans dktr. Bu
nedenle ilk baarl gen belirleme ii aktif traskripsiyon geiren genlerin
bulunduu koyun ve domuz hcrelerinde yapld (McCreath ve ark., 2000;
Denning ve ark., 2001; Lai ve ark., 2002; Dai ve ark., 2002). Gen belirlemeye
aktif transkripsiyon geiren genler dormant haldeki genlerden daha yatkndr.
Belli bir genin hcrelerde var olup olamad o hcrelerdeki genin
promoterinden faydalanlr. Bu ekilde geni tayan hcreler belirlenir. Yaplan
bu ilem promoter-less pozitif seleksiyon diye tanmlanr.
 99

Yaplan genetik modifikasyonlarnn sonularn grebilmek ve analiz

edebilmek iin hedef genin iki allelinin de belirlenmesi gerekir. Domuzda -
(1,3)-galaktosil trasnferaz geninin ikinci allelini tespit etmek iin iki farkl
yntem uyguland. Bu genin devre d brakld fibroblast heterozigot hcreler
in vitro kuullarda secildi. Seme ii genin ikinci allelinin bir noktasndaki
random mutasyon veya mitotik rekombinasyon sonucu enzimatik aktivitenin
olmamasndan faydalanarak yapld. Belli bir notadaki random mutasyonun veya
mitotik rekombinasyonun sonuclarndan faydalanarak genleri belirlemek sadece
transkripsiyon kabiliyeti olan genlerde yaplabilir. Hatta aktif genler iin bile bu
yntemlerin geni kullanm alan yoktur. Dormant haldeki genler zaten bu
metotla tespit edilemez. Son zamanlarda homozigot dormant bir genin, rnein
hemoklobin geni, srda belirlendi (Kroiwa ve ark., 2002).

10.2.7. Genomunda belli bir genin devre d brakld (gen knock-out)

farenin elde edilme usul
Gen ekleme veya silme (gen knock out) yoluyla hayvanlarn verim kalitesini,
verim miktarn ve adaptasyonunu artrmak amalanmaktadr (Markula ve
Huhtaniemi, 1996). Hayvann genomundaki belli bir doal genin fonksiyonu
uydu veya markar bir genin homolog rekombinasyonla doal genin iine
yerletirilmesiyle doal genin fonksiyonu bloke edilebilir. Genelde doal genin
iine yerletirilen kk gen harhangi bir antibiyotige kar dayankl salayan
gendir. Bu dayanklktan faydalanarak knock-out kk hcre kolonisi belirlenir ve
blastosit iresine enjekte edilir sonuta knock-out hayvan %25 orannda elde
edilir. Bu ilem belli genlerin zelliklerini ve fonksiyonlarn almak iin
yaplmaktadr ve daha ok fareler model alnarak yaplmaktadr. Bunun iin zel
gen (diyelimki bu gen X geni olsun) nce izole edilmeli sonra uygun transfer
vektrne yklenmesi gerekir. Takiben vektre yklenen X geninin exon
ksmna kk bir markar gen gerletrilir. Bu markar gen hcrelerin antibiyotige
kar dayankllk gstermesini salayan gendir. zerinde knock-out edilmi
geni tayan transfer vektr embryonik kk hcreleri kltrne eklenir. Kk
hcreleri antibiyotik ieren rtamda oaltlr. Sadece markar geni tayan kk
hcreleri yaayabilirler dierleri lrler. Yaayan hcrelerde ayn zamanda X
geni knock out edilmitir. Knock-out edilmi geni tayan kk hcreleri erken
bastasit safhasndaki fare blastositine enjekte edilir. Blastosit; cinsel temesla
utarusu hazr hale getirilm fareye tansfer edilir. Dogan farelerden numuneler
alnarak Polimeraz zincirleme reaksiyonu veya Sorthern transfer matoduyla X(-)
genini tayan fareler belirlenir. Bu fareler kendi aralarnda iftletirilir. Doan
farlerin %25inde X geni knock-out edilmitir. Bu tenik sayesinde suni faydal
mutasyonlar yaplarak hayvanlarn genetik potansiyeli ksa srede artrlabilir
(Capecchi, 1989; Bradley ve ark., 1992). Aada bu metodun stratejisi ve
genetik kurallar ekille zetlenmektedir.
 100

ekil 24.2.1.7. Belllir bir

genin knock out edildii
farenin elde edilmesinde
kullanlan yagn metot
(Homanics ve Hillier-
Stumhotel, 1997).
 101

10.2.8. Tekrarl genetik modifikasyonlar

iftlik hayvanlarnn reme peryodu ok uzundur. Bu nedenle slah yoluyla
istenen geni tayan homozigot bireylerin veya istenilen multipi genetik
modifikasyonlar tayan hayvanlarn elde edilmesi ideal bir yaklam deildir.
Eer iftlik hayvanlarnn embrionik kk hcrelerini elde etme ve kltre alma
imkn varsa bu hcrelerde multipi genetik modifikasyonlar kltr ortamnda
yaplabilir. iftlik hayvanlarndan kk hcreleri elde etme konusunda nemli
almalar yapld. Baz ilerlemeler saland fakat elde edilen kk hcreleri
genel olarak genetik modifikasyonlar iin kullanlmad. Transfeksiyon ve
seleksiyon gibi genetik modifikasyonlar bir hcrenin yaam sresi ierisinde
yaplabilir. Kltr ortamnda bir hcre populasyounun elde edilebilmesi iin o
hcrenin kltr ortamnda mitoz geirme kabiliyetinin olmas gerekir. Bu
nedenle her genetik modifikasyondan sonra bu hcrelerin her klonlamadan sonra
yenilenmesi gereklidir.
Ard arda yaplan klonlamada uygulanan proseslerden kaynaklanan
epigenetik hatalar olabilir. Bu hatalar klonlamann etkinliini drr. Fakat bu
hcrelerin genetii deitirilip kolanlama ileminin birok sefer tekrar etmesinin
hcre canllna ve klonlarn gelime potansiyeline etkisi konusunda yeterli
bilgi yoktur. Ard ardna yaplan klonlamalarn etkisi konusunda en dikkat
ekici rapor fareler zerinde yaplan bir alma sonucu ileri srld (Wakayama
ve ark., 2000). Bu rapora gre kmls hcrelerinden alnan nkleuslar fare
oositleri ierine transfer edilerek klonlanm ilk fare grubu elde edildi. Ayn
hcrelerin drdnc defa konlamasndan sonra elde edilen gruptaki fareler
reme yeteneini kaybetti. Altnc konlama sonucu elde edilen grupta ise
kannibalizm gzlendi. lk generasyonda klonlama etkinlii dkt fakat ayn
hcrelerin klonlanma etkinlii giderek azald. Klonlama baz anormalliklere
neden oldu, hepsinde plasenta normal derecede bykt, klonlama sonucu elde
edilen ilk generasyonda erken yalanma gibi bir problem gzlenmedi. Srda
ayn somatik hcrelerin seri halde iki defa klonlanmas baarl oldu fakat
nc klonlanmadan yavru elde edilemedi (Kubota ve ark., 2004). Srda
ikinci klonlama sonucu elde edilen buzalar normal grnyorlard ve
fertildiler. Her ne kadar seri halde klonlama neticesi normal grnl yavrular
elde edilse de bu konuda yazlm makalelere gre klonlama etkinlii klonlama
says arttka azalmaktadr. Bu azalma canl yavru elde edememe noktasna
kadar varabilir. Klonlama bir hcrenin yaam sresi ierisinde olur. Bu sre ise
ksadr. Hcreleri seri klonlamayla yenilemek gerekir. Bu da bir hcre
kolonisinde sekanssal genetik modifikasyon iin yaplmas planlanan genetik
modifikasyonlarn saysn snrlar. Belirtildii gibi srda ayn somatik somatik
hcrelerin G1 ve G2 safhasnda iken istenen genlerin yklenip klonlanmasyla
normal yavrular elde edilmektedir.
 102

KAYNAKLAR
Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Robeerts K., and Watson JD., (1983) Molecular
biology of the cell. Nw York and London: Gerland publishing.
Bradley A, Hasty P, Davis A and Ramirez-Solis R., (1992) Modifying the mouse:design and
desire Biotechnology 10 534-539
Campell,K. H.S.,(1997) Embryo colonin in livestock: Satellite Symposium II-Innovativ
Reproduction techniques in Animal Production. 48. EAAP, Wien
Capecchi M., (1989) Altering the genom by homolog recombination. Science 244 1288-
1292.
Docherty K., (1996) Transgenic animals. Proceedings of the Nutrition Society 55 613-618
Donovan PJ ve ark., (1997) Towards the use of primordial germ cells for germline
modification. In: Transgenic anmals; generation and use. Edr LM Houdebine. Published
by Harwood Acedemic Publishers, Amsterdam; p 179.
Gordon, J. W. ve Ruddle, F. H., (1981). Integration and stable germ line transmission of
genes injected into mouse pronuclei. Science 214, 12441246.
Gossler, A. et al. (1986). Transgenesis by means of blastocyst-derived embryonic stem cell
line. Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9065-9069.
Hall J ve ark.,(1993) manipulation of the repertoire of digestive enzymes secreted into the
gastrointestinal tract of transgenic mice . In; Biotechnology 11 376-379.
Homanics GE; Hiller-Stumhotel S., (1997). New genetic technologies in alcohol research.
Alvohol Health& Research World. 21(4): 298-309.
Jaenisch, R. (1976). Germ line integration and Mendelian transmission of the exogenous
Moloney leukemia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. 73:1260-1264.
Kelly KF., (1996) Southern bloting. Proceedings of the Nutrition Society, 55 591-597.
Markula M and Huhtaniemi I., (1996) Transgenic animals and gonadotrophins. Reviews of
Reproductiion 1 97-106
OBrien T., (1998) Farm animal genetic enginering. Second edition. Published by
Caommpassion in world farming Trast. Pp 7-17.
Salter D and Crittebden LB (1989) Artificial insemination of a dominant gene for to avian
leukosis virus into the germ line of the chicken. Theoretical and Applied Genetics, 17 457-
461.
 103

10.Suni tohumlama
Suni tohumlama havanlarn reme ve genetik potansiyellerini artrmaya ynelik
biyoteknolojilerin en ilkidir. lk sperm 1678 ylnda Leeuwenhoek ve asistan
tarafndan grld. Leeuwenhoek resmi olarak tahsilli saylmazd fakat ok
merakl ve dikkatlyd. Kendi imknlaryla 270 kez bytme gcne sahip
mikroskop gelitirmiti. Kendi gelitirdii mikroskopla spermleri grmeyi
baard.
Rapor edilmi bir kayt olmasa da suni tohumlamann 1300l yllarda ilk
olarak atta yapld bildirilmektedir. lk olarak suni tohumlama ile yavru elde
etme 1780 ylnda talyan fizyolog Spallazani tarafndan rapor edildi. Spallazani
nce papaz olmak iin eitim gryordu fakat onun natural bilimlere olan ilgisi,
25 yanda Pavia niversitesinde doal tarih prfsr olmasna neden oldu.
Spallazani kpei suni olarak tohumlad bu tohumlamadan 62 gn sonra 3 yavru
dnyaya geldi. Bundan bir asr sonra, 1897 de Heape ve dier bilim adamlar
suni tohumlamay atta, tavanda ve kedide yaptklarn rapor ettiler. Heape
reme konusunda iyi yetimi bir bilim adamyd. lk olarak sezonal deime ile
reme arasndaki ilikiyi aklad. Bu konuda daha sonra Marshall, Hammond,
Walton ve rencileri Chang verimli almalar yaptlar. Bu bilim adamlar
sayesinde kembri niversitesi reme konusunda bir bilim merkezi haline geldi.
Suni tohumlamay pratik ve ekstensiv olarak iftlik hayvanlarna ilk
uygulayan Rus bilim adam ivanow dur daha sonra bunu Japon bilim adamlar
iftlik hayvanlarnda uygulad.
Suni tohumlamann dnya apnda yaygnlamas; sperm dondurma,
sperm de sex tahini, kzgnln kontrol, hayvandan embryo alma, embryo
dondurma, embriyo kltr, embriyo transferi ve embriyo klonlama gibi
tekniklerin gelimesine neden olmutur.Bu teknik en youn olarak st
srclnda kullanlyor olmakla beraber koyunda, keide, atta, kularda ve
yaban hayvanlarda da kullanlmaktadr.

10.1. Suni tohumlamann hayvanclktaki nemi

Suni tohumlama genetik ilerlemeyi salamaya ynelik nemli bir
tekniktir. Bu teknik sayesinde birka tane seilmi genetik kabiliyeti yksek
hayvandan alnan semenle her yl binlerce dii insemine edilir. Bu metot
srlar, koyunlar, keileri, atlar, kpekleri, kedileri, kanatllar ve laboratuar
hayvanlarn hatta vahi hayvanlar insemine etmek iin kullanlmaktadr. Suni
tohumlamann hayvanclktaki avantajlarn yle sralayabiliriz.
1- Genetik ilerlemeyi hzlandrr
2- iftleme sonucu bulaabilen hastalklarn bulama riskini azaltr.
3- Islah amacyla doru kaytlarn mevcut olmasn salar
4- Tehlikeli erkekleri iftlikten elenmesini salar
5- Daha ekonomiktir.
Suni tohumlama genetik ilerlemeyi hzlandrr. Bir hayvandan alnan
enjegulat birok inseminasyon dozuna ayrlarak birok diinin inseminasyonu
 104

salanr. Bunun sonucunda iftlikte kullanlmak zere beslenen boa says

azaltlr. Bylece suni tohumlama ile erkee yonelik seleksiyon doal servis ile
karlatrlrsa ok youndur.
St srclnda mevcut ineklerin ancak %1 damzlk boa annesi olarak
belirlenir. Bu ineklerden doan erkek yavrulardan sadece %13 boa olarak
beslenir. St sarclnda grlen bu seleksiyon younluu et srclndan
yksektir.
Suni tohumlama ile verimli yeni rklarn lkede yaylmas ksa srede
salad gibi yerli hayvanlarn genetik havuzunun hzl deiimini de salar.
Yerli hayvanlarn verimli hayvanlara ait semen ile inseminasyonu sonucu bu
hayvanlarn ksa srede genetik potansiyelleri artar. Az sayda ithal edilmi
boalardan alnan semen seyreltilip dondurularak memleketin her tarafna
ekonomik bir ekilde transfer edilebilir. D lkelerden genetik potansiyeli
yksek olan hayvanlar satn alarak transfer etmek yerine onlarn semenlerini
satn alarak transfer etmek ok daha ucuzdur. Bylece ithal edilen rklarn yeni
evreye uyumu konusunda grlen problemler suni tohumlama yoluyla
zlm olur.
Suni tohumlama sayesinde iftiler damzlk iin daha az sayda boa
beslerler ve iftliin giderleri azalm olur. nk bu erkekler iin barnak, i
gc ve besleme harcamalar sz konusudur.
Suni tohumlama sayesinde iftleme ile bulaan hastalklar (rnegin:
Tritrichomonas fetus ve Campylobacter fetus) kontrol altna alnr. Bunun terside
mmkndr; hastalkl bir boadan alnan semen hastaln yaylmasna neden
olur. Bu nedenle suni tohumla iin kullanlacak boalar sk bir salk
kontrolnden geirilir.
Suni tohumlama yapabilmek iin insemine edilecek diilerin kzgnlkta
olup olmadn ve tohumlama iin en uygun zaman bilmek gerekir. Yalnzca
tohumlama zaman kayt edilmez kzgnlk zaman da kayt edilir. Bu kayt
ikinci kzgnln ne zaman olabileceini bilmek asnda nemlidir. Bu
bilgilerin iletme kaytlarnda bulunmas gerekir.
Bu nedenle kzln bilinmesi iin fertil olamayan erkekler (Vazektomi
edilmi erkek) kullanlr veya kimyasal, biyokimyasal ilalarla kzgnlk suni
olarak balatlr. Kzgnl belirlenen diiler dier hayvanlardan ayrlarak suni
tohumlama yapmak zere zel blmeye konur. Suni tohumlama bu konuda
tecrbeli personel tarafndan yaplr. Bu personel intra vaginal veya
laporoskopik intra-terin inseminasyonu pratik olarak yapabilen kiidir.

10.2. Erkekten semen alma

Srda semen genellikle boann baka bir hayvan veya hayvan eklindeki
nesneyi at zaman alnr. Boa insemine etmek amacyla hayvana kt
zaman boann penisi dar kar ve grevli personel penisi el ile tutarak semen
alma cihazna yerletirir sonra boa bu aletin iine semenini aktarr. Boalan
 105

semen alttaki toplama tpnde birikir. Tm memeli iftlik hayvanlarndan

semen bu yolla alnr iken kanatllarda direkt mastrbasyon yaplarak alnr.
Semen alnacak erkek birka sefer dier hayvan veya robotu amas
salanr fakat semeni boaltmasna msaade edilmez. Bu ekilde alnan
enjegulatta sperm younluu daha fazla olur. Bir boadan haftada drt kez
semen alnr. Aadaki resimde semen almada kullanlan suni vajina
grlmektedir. Bu aletin i tarafn saran kaygan astarn ii 45 C scaklktaki su
ile doldurulur. Operatr yan tarafta durarak hayvann penisini aletin iine sokar.
Aletin iten kavisli bir ekilde daralarak alttaki tp ile birleir. Semen bu tp
ierisinde birikir. Alnan semen likfikasyon iin birka dakika bekletilir.
Likfikasyon spermlerin deiik ynlere yzmesinden dolay semenin
beyazms rengini kaybederek berrak ve viskoz hale gelmesidir bu enjegulattan
23 dakika sonra olur. Liqfiye olan semen kltr medyumu ierisinde
ykamaya tabi tutulur.

Semen alma ve tohumlama arasndaki gecen sreye paralel olarak

spermlerin yaam sresi ve hareketlilii de azalr. Bu nedenle semen
hazrlamada ilemler ksa srede yaplmaldr. Hayvandan alnan semende sperm
younluunu ve sperm hareketliliini lmek gerekir nk bu lmler
yardmyla inseminasyonda kullanlan her bir payet (straw) iin istenilen sperm
saysn salamak mmkn olur.

Semen salkl hayvanlardan alnr

 106

Semen alnacak bualarn sk bir salk kontrolnden geirildikten sonra semen

alnmas, semen almnda grev alan personelin sk bir eitimden geirilmesi,
semen almnn uygun artlarda, hijyenik kurallara uyan kalifiye elemanlar
tarafndan alnmas, semen rneklerine mikrobiyal bulama riskini minimuma
indirecektir. nk; semendeki patojenik mikroorganizma says lkeler aras
semen mbadelesini snrlayan en nemli faktrdr. Bu patojenler, bakteriler,
virsler, protozoalar, kfler, mantarlar vs. hayvansal rnler yoluyla insana
bulaabilirler, birou zoonozdur. Patojenlerin mevcut olduu semenle insemine
edilen hayvanlar bu patojenlerle infekte olurlar. Uluslararas ticareti mmkn
olan semenlerin elde edilebilmesi iin suni tohumlama istasyonlarnda tutulan
boalarn salkl olmas gereklidir. Ksaca; nce buann salkl olmas sonra
semenin aseptik ekilde alnmas kolay mubadele imkan salar.

A-Boalar suni tohumlama merkezine getirmeden nce aadaki

testlerin yapldn gsteren raporun mevcut olmas gerekir (ister
pozitif ister negatif olsun). Bu rapor havyalara hangi testlerin yapldn
ve durumlarn aka gstermelidir. Aadaki testlerin yaplmad
hayvanlar, kesinlikle suni tohumlama istasyonuna kabul edilmezler.

a) Sr Brusellas
Brucella bakterilerin sebep olduu bulac bir hastalktr. Bu bakteriler ilk
nce hayvanlar arasnda gei yaparlar ve birok deiik omurgal
hayvanlarda hastalklara sebep olurlar. Deiik brucella trleri, koyun, kei,
sr, geyik, domuz, kpek ve dier hayvanlar etkileyen zoonoz bir
hastalktr

b) Sr tberkilozu
Sr tberklozu Mycobacterium bovis tarafndan oluturulan bulac bir
hastalktr. Hastalk, insanlar, srlar, dier evcil hayvanlar ve baz yabani
hayvanlarda grlr. Sr tberklozu birok lkede olduu gibi, lkemizde
de zerinde durulmas gereken zoonoz bir hastalktr.

c) Sr BVD virus
Bovine viral diarrhea (BVD) ve Mucosal hastala (MD)'e neden olan bovine
viral diarrhea virus (BVDV) enfeksiyonu tm dnyada yaygn olarak
grlmektedir. Pestiviruslar grubunda snflandrlan etken, srlarda BVD
olarak kabul edilen ve haff klinik deiikliklere sebep olan iyi seyirli bir
enfeksiyon oluturabildii gibi ldrc MD'e de neden olabilmektedir.

d) Bulac Bovine Rhinotracheitis- Infectious Pustular Vulvovaginitis

(IBR-IPV).
Hastaln etkeni Bovine Herpesvirus-I (BHY-I). Bu hastalk srlarda
grlen son derece bulac, akut ve latent seyirli viral bir hastalktr. Hasta
 107

hayvanlarda arlk kayb, st veriminde azalma, yavru atma, l doum,

fertilite bozukluklar grlmektedir. Hastalk; st solunum yolunda klinik
semptomlar (IBR) ile erkeklerde infeksiyz pustler balonopostitise (IPB)
sebep olur. Solunum ve genital kanal hastalklar ayr olarak meydana
gelebildii gibi, bazen birlikte de grlebilir.
Yukardaki testlerin yapld hayvanlar suni tohumlama istasyonuna kabul edilir
ve 21-28 gn sreyle karantina altnda tutulur.

B-Karantina sresince yaplmas gereken testler

a) Sr Brusellas

b) Sr BVD virus

c) Campylobacter fetus ssp.veneralis

Hastaln etkeni ounlukla S tipi koloni oluturan gram negatif bir frsat
bakteri yemlerden bular. zellikle srda yavru atmaya ve ksrla neden
olur. Zoonoz bir hastalktr.
d) Trichomonas fetus
Hastaln etmeni bualarn ve ineklerin reme kanalda yaayan hareketli
protozoa Trichomonas fetus dr. Srda dk yapmaya ve ksrlaa sebep
olur. nfekte olmu buadan iftleme neticesi veya semen yoluyla inege
bular. Yeni infekte olmu ineklerin vulvasndan yapkan beyazms sv
akar. Gebe inekte embriyoya bular, sonuta embrio lr.
e) Bulac Bovine Rhinotracheitis- Infectious Pustular Vulvovaginitis
(IBR-IPV)

C-Semen almaya yakn yaplmas gereken testler

a) Daha nce sr BVD virus bakmnda pozitif olan hayvanlarn

tekrar serolojik BVD testine tabi tutulmas
Semen almaya doru bu hayvanlara tekrar ELISA testi yaplmaldr. Halen
positiv durumda olan boalar suni tohumlama istasyonundan uzaklatrlmal
ve bu hayvanlardan alnan semenler yok edilmelidir.

D- Bulac Bovine Rhinotracheitis- Infectious Pustular Yulvovaginitis

(IBR-IPV) iermesi dnlen dondurulmu semenlerin IBR-IPV
testine tabi tutulmas

E- Semen alma sresince aadaki testler suni tohumlama istasyonunda

ylda bir defa yaplmaldr.

a) Sr Brusellas
 108

b) Sr tberkilozu

c) Sr BVD virus

d) Campylobacter fetus ssp.veneralis

e) Trichomonas fetus

f) Bulac Bovine Rhinotracheitis- Infectious Pustular

Vulvovaginitis (IBR-IPV)

lke iinde retilen ve ital edilen semenlerin saland istasyonlardan ilgili

raporlar istenmelidir. Bylece hem hastalklarn yaylmas nlenecek hem de
semen rneklerinin tacari mbadelesi kolaylam olacaktr.

10.3. Laboratuarda yaplacak iler

Semen hayvandan suni vajina ile alnr ve devaml vcut scaklnda
bekletilmeye zen gsterilir. Dk scaklklar spermlerin yaam sresini
olumsuz etkiler. Bu nedenle semen toplama tp 37C kadar stlm su banyosuna
koyulur ve likfikasyona braklr. Likfication spermlerin deiik ynlere yzmesinden
dolay semenin beyazms rengini kaybederek berrak ve viskoz hale gelmesidir bu
enjegulattan 23 dakika sonra olur. Semen alnp laboratuara gelirken bu ilem de yaplm
olur. Tpten 58l rnek alp makler veya hemacytometre zerine konulur. Sonra, sperm
hareketlerinin kalitesi ve semendeki dalgalanma derecesine gre semene aadaki
parametreler kullanarak deer verilir.
Rakamsal Semenin
Deger kalitesi Gzlenen

0 ok kt Hi doru ileri hareket yok,

Zayf ve dairesel hareketlerle ilerleme. Direkt
1 Kt
hareketler ok az,
Normal ileri hareketler fakat ok hzl deil, bir ksm
2 Normal
spermalar direkt hareket etmeyebilir.
3 yi Hzl ileri hareketler
4 ok iyi ok hzl sert direkt ileri hareketler.

10.3.1. Seminal plazmann uzaklatrlmas

Seminal plazmann uzun dnemde sperm yaamna olumsuz etkisinin olduu
savunulmaktadr. Bu nedenle seminal plazma tamamen veya ksmen ykanarak
spermlerden uzaklatrlmaktadr. Eer semen ileriki bir tarihte kullanlmak
zere dondurulacaksa likfikasyondan hemen sonra semen 50 ml lik santrifj
tplerine konur zerine bafr eklenerek santrifj yaplr. Bu santrifj seminal
 109

plazmay spermlerden uzaklatrmak amacyla yaplr. Santrifj sonunda

spermler yumuak pellet halinde tpn dibinde bulunur. st ksmdaki sv
tpten boaltlr.
Santrifj dk hzda yaplr ki spermler santrifjden zarar grmesin. Bu
nedenle santrifj dnme gc 300-800g olmaldr ve 510 dakika sreyle
santrifj yaplmaldr. Fazla gl santrifj yapmak spermlerin yaamn
kaybetmesine sebep olur. Baz durumlarda hi santrifj yaplmaz direkt olarak
spermler saylr ve sperm konsantrasyonu saptamak iin bafr eklenir. Eklenen
bu bafr genelde trish bafrdr. Bu bafra giliserol, st tzu, Laktoz ve
antibiyotikler eklenir sonra spermler payet (straw) ierisine alnr ve dondurulur.
 110

10.3.2. Semenin seyreltilmesi

nseminasyon iin kullanlacak semen volmndeki sperm saysnn istenen
dzeye getirmek iin ve semeni birok enjegulasyon dozuna blmek iin semen
seyreltilir. Yaygn olarak enjegulattaki sperm konsantrasyonu 50 defa az olacak
ekilde semen seyreltilir. Seyrelme semene bafr eklemek suretiyle yaplr.

10.3.3. Semen seyreltmede kullanlan bafrlar

Semene bafr ilave etmenin amac semeni seyreltme, spermlerin metabolik
faaliyeti sonucu retilen laktik asitin sebep olduu pH deiimi engelleme ve
spermler iin izotonik ortam oluturmaktr.
Sperm metabolizmas sonucu retilen laktik asit nedeniyle semenin pH
deiir. Bu deime spermlere zarar verir. Semenin seyreltilmesi ile birlikte
pH da sabit tutmak gerekir. En ok tercih edilen bafr sitrat bafr olmakla
birlikte fosfat bafr ve Trish bafrlar da bu ama iin kullanlmaktadr.

a) Fosfat bafrnn hazrlanmas

2g Na2HPO4.12H2O ve 0.2g KH2PO4 tartlarak 100ml saf su ierisine konur
sonra (pH 7.3). Bu bafr sperm canllna olumsuz etki yapt iin pek tercih
edilmiyor.

b) Sitrate bafrnn hazrlanmas

2,9 gr Na3C6H5O7.2H2O tartlr ve 100 ml saf suya ilave edilir (pH 7,3) . Bu
bafra yumurta sars ve glyserol ilave edilip yava dondurma metodu
uyguland zaman sperm canllna herhangi bir zarar yoktur. Bu nedenle en
ok tercih edilen bafrdr.

c) Trish bafrnn hazrlanmas

Hazrlamak iin 4,028gr tris(hydroxymethyl)aminomethane ve 1 gr Fruktoz
tartlarak 100ml saf su ierisine konur ve homojen hale getirilir sonra pH 6,5 e
ayarlanr.

10.3.3.1. Semen seyreltmede kullanlan bafra yaplan ilaveler

Semen seyreltme iin kullanlan bafra; sperm nakletme ve depolama sresince
spermleri koruyan ve besleyen ilaveler yaplr. Yaygn olarak semen seyreltme
iin kullanlan bafra aadaki ilaveler yaplr.
a) Yumurta sars: Semeni vcut scaklndan daha dk scakla
getirme esnasnda spermleri souk nedeniyle karlatklar oktan
korumak iin ilave edilir.
b) Gliserol: Semenin dondurulmas esnasnda spermler ierisinde
oluan kk buz kristallerine kar spermleri korumak iin ilave
edilir.
 111

c) Gikoz veya dier ekerler: Spermlere enerji salamak iin ortama

ilave edilir.
d) Antibiyotikler: Spermleri patojenlere kar korumak iin ortama
eklenir.
Semen seyreltme iinde grev alacak personel yukardaki ilave edilen
maddelerin fonksiyonlarn iyi bilmelidir. Bahsedilen ilaveleri ieren bafr ile
seyreltilen semen; sperm says 20 milyon olacak ekilde 0.25ml lik dozlara
ayrlr ve gelecekte suni tohumlama amacyla kullanmak ve uzak bir mesafeye
tamak iin plastik payet ierisine alnr ve etiketlenir sonra -196C deki sv
nitrojen ierisine alnarak muhafaza edilir.
Semen seyreltildikten sonra payetlerin ierisine tek inseminasyon dozu
olacak ekilde alnr. Dolu payetler sonra programlanabilir dondurucu
kullanlarak istenilen protokole gre dondurulur. Gnmzde semen veya
embriyo dondurmak iin progranabilir dondurucular kullanlmaktadr. Bylece
teknisyenler donduracaklar semen iin zel dondurma programn seme
ansna sahiptirler (Resim 24.3.3.1.).
a b

Resim 10.3.3.1. Payetler semen ile doldurulduktan sonra programl

dondurucuda dondurulur (a). Sonra nitrojen tanklar ierisinde (c) muhafaza
edilirler. Semen bu tank vastasyla ehirleraras lkeler veya ktalar aras transfer
edilebilir.
 112

10.3.4. Sperm saylarnn bulunmas

a) Hemositometre ile hasaplama
Hemositometre (Resim 25.1.1.) kan hcrelerini saymak iin gelitirldi
fakat sperm konsantrasyonu ve kuantitatif motiliteyi hesaplama iin de
kullanlmaktadr.

10.3.4.1.Sperm konsantrasyonunu hesaplama

Sperm konsantrasyonunun hesaplanabilmesi iin spermlerin hareket etmemesi
gerekir. Bu nedenle spermler nce iinde formaldehit bulunan bafr iine
konularak ldrlr sonra pipetle emberlere yklenir. Konsantrasyonu
hesaplarken semenin ka kez seyreltildii kayt edilmedilidir. Eer saym
alannda (Ortadaki byk karede) 2025 aras sperm varsa syereltme uygun
yaplmtr. Saym alann oluturan 25 kk karenin komu byk kareye snr
olan izgisinn zerindeki (Sol st ve yan taraf izgi) spermler de sayma dhil
edilir. Her kk karenin iinde ise 16 ok kk kare vardr. Saym yaparken
ya byk kare ierisindeki tm spermler ya da ramdom olark 4 kedeki ve
ortadaki kk karedeki spermler ve yahutta sol keden sa alt keyeapraz 5
kk karedeki spermler saylr. Eer sadece 5 kare sayldysa toplam saylan
 113

sperm says 5 ile arplmaldr. nk saym lannda 25 kare vardr. Ortadaki

saym alan 0.1 mm3 veya 0.1 mikro litredir. Bu nedenle saym alannda saylan
sperm says 104 ile arplmaldr. leme syretlme faktrde eklenerek sperm
konsantrasyonu hesaplanr.

10.3.4.2. Kuantitatif motilityi hesaplama

Hayvandan alnan semen rnegindeki ileri, dairesel, kmldayan ve duran sperm
saylar yzde olarak bulunabilir. Bu ilem kuantitatif motilte hesaplanmas
olarak bilinir. Doru bir saym yapabilmek iin sperm seyreltme doru saym
yapmaya uygun ekilde ayarlanmaldr. Eer pipetle alnan semende sperm
hareketlerini gzlemek zor ise (bu ar sperm saysndan kaynaklanr) alnan
semen rneinin hacmi; bafr eklemek sratiyle 10 kat bytlr. Sonra 810l
rnek pipetle alarak hemocytometrenin her iki tarafndaki karelerin zerine
braklr. 12 dakika bekledikten sonra zerine lamel kapatlr ve mikroskop
altnda 20X magnifikasyonla spermler saylr. Saym alannda toplam en az 200
sperm saylmaldr.
Makler ile sperm saylarnn bulunmas
Makler cemberi zerindeki saym alannn (gridin) taban ile setteki cover glass
arasndaki dey mesafe hemositometreninkinden 10 kat daha sdr. Makler
emberinin ortasndaki saym alan (grit) 1mm2 yzey alanna sahiptir. Saym
 114

alan ise 100 kk kareden ibarettir. Bu kk karlerin birinin yzey alan ise
0,01 mm2 dir.

Saylabilecek kadar syretilmi semen pipetle (2-5l) ve ya rod kullanarak alt

diskin zreine konur ve cover glass hemen kapatlr. Konsantrasyon
hesaplancaksa spermlerin alta kmesi iin 1520 dakika inkbatrde bekletilir
sonra 20X bytmede mikroskop lannda saylr.
Konsantrasyon(milyon/ml)= (100 karede saylan toplam sperm
6
says)x( Seyreltme faktr) x 10
Motilite hesaplanacaksa o zaman hemen lme geilir. nce hareket
etmeyen spemler mikroskop altnda, saym alannn ortasndaki 9 veya 16 kare
iindeki spermler 20X bytmede saylr. Sonra ayn yerdeki hereketli
(kmldayan, dairesel ve ileri hareket eden spermler) saylr. Bu ilem birka
farkl alanda tekrar eder. Her saymda toplam olarak en az 200 sperm saylr ve
% olarak ifede edilir.

10.4. Kzgnln gzetlenmesi

Suni tohumlama kzgnlk gsteren hayvanlara yaplr. Hayvann kzgnlkta
olup olmadnn bilinmesi gerekir. Mera ortamnda hayvann kzgnlnn
bilinmesi iin inein kuyruk stne veya boann ene altna iaretleyici boyalar
 115

vurulur. Bylece inein alp almad belirlenir. Kzgnlk grsel davranlar

veya fizyolojik iaretler yardmyla da bilinir.

10.4.1. Grsel kzgnlk belirtileri

a) Kzgnlktaki inek boann kendini amasna musade eder.

b) Kzgnlktaki inek dier ineklere kar.

c) Kzgnlktaki
inek yrrken baka
bir inek tarafndan alr
 116

d) Kzgnlktaki inek baka bir inegi amaya alr.

10.4.1.1. Kzgnla zg davranlar

a) Devaml hareketlilik
b) Baka hayvanlar koklama ve yalama

10.4.2. Fiziksel iaretler

a) Vulvadan mukoz akar

b) Vulva ier

c) Vajinal mukoza krmzms bir hal alr

 117

En nemli iaret kzgnlktaki inein boann kendisini amas iin durmasdr.

kinci olarak hayvann baka diilerin kendisini amasna msaade etmesidir.
Srda kzgnlk ortalama 18 saatten az srr ( Hurnik et al., 1975), St verimi
yksek olan srlarda kzgnln sresi daha ksadr. ifti kzgnlk ile ilgili
iaretleri dikkate alarak hayvanna suni tohumlama yaplp yaplmamasna karar
verir.

10.5. Srda kzgnlk periyodu

ki kzgnlk arasnda geen sreye kzgnlk periyodu denir. Normal artlar
altnda srda kzgnlk periyodu 21 gndr. Gebe olmayan hayvanlar her 3
haftada bir kzgnlk gsterirler.
 118

10.5.1. Srda kzgnln kontrol

Kzgnlk biyokimyasal metotlarla kontrol altna alnabilir. Kzgnlk kontrol
iin prostaglandin veya progesteron gibi ilalar kullanlr. Kzgnlk
gstermeyen sra PGF2 enjekte edilir sonra bu injeksiyonu mutakip ikinci bir
PGF2 injeksiyonu 12 inci gnde yaplr. kinci injeksiyondan 48 saat sonra
hayvanda kzgnlk grlr. lk kzgnln grlmesinden 1224 saat sonra
tohumlama yaplr. Ayn eklide kzgnl salamak iin inegin vaginas
ierisine perogesteron veren implant yerletirilir ve 12 gn sonra ikarlr.
mplantn karlmasndan 48 saat sonra hayvan kzgnla gelir.

PGF2 PGF2 Kzgnlk

12 14
0 Kzgnln balamasndan
1224 saat sonra
tohumlama yaplr
Vaginaya mplant
Progesteron karlr
implant
yerletirilir

10.5.1.1. Suni tohumlamada kullanlan aletler steril olmaldr.

Eger inseminasyon ilemi hijyenik ve iyi yaplmaz ise semenin alnmas,
hazrlanmas ve depolanmas esnasnda hijyen iin verilen dikkatin faydas
yoktur. Suni tohumlama esnasnda kullanlan inseminasyon tabancas, payetleri
kesmek iin kullanlan makaslar; kullanlmadan nce %70 lik zopropil alkol ile
silinmeli ve kurutulmaldr. Bir sefere mahsus olarak kullanlp atlan plastik
materyaller kullanm anna kadar bulunduklar ambalajlardan dar
karlmamaldr. Her kullanmdan sonra tm aletler steril edilmelidir. Metal
ekipman sterilizasyon iin 10 dakika kaynatlmal ve sonra kurutulmaldr.

10.5.1.2. Suni tohumlamada kullanlan tohumlama metotlar

Srlarda kullanlan balca iki tohumlama metodu vardr.
 119

a) Speklm metodu
b) Rekto-vaginal metot
Rekto-vaginal metot en yaygn olarak kullanlan metottur. Bu metotta
tohumlanacak inek kolay kontrol edilebilir bir yere konulur. Tohumlamay
yapacak personel izme ve plastik nlk giymeli, trnaklarn kesmeli ve omuza
kadar plastik eldiven takmaldr. Eldiven hangi kol kullanlacaksa ona giyilir.
ncelikle 35C de su hazrlanr. Azot tankndan iinde spermler bulunan
dondurulmu payet (Straw) alnr ve 15 saniye 35C deki suya biraklr. Daha
sonra payet kanulaya ve tabancaya yerletirilir sonra tabanca kat havlular ile
sarlr. Eldiven giyilmi kol lbrikasyon jeli ile kayganlatrlarak rektuma
sokulur sonra serviks akl parmaklar yardmyla hissedilerek bulunur. Sonra
vulvann d kat mendil ile temizlenir. Tabanca alnr ve tabancann dnda
kalan payetin yaklak 1 cm ksm kesilir. Vulva dudaklar alr sonra tabanca
vulva dudaklar arasndan ve vaginann ortasndan sokulur. Tabancaya idrar
yoluna ve vaginann duvarna zarar vermemesi iin yukar doru 30 derecelik
a yaptrlr. Ayrca serviksi tutan eldivenli el serviksi ileri doru iterek
vajinadaki katlanmalar dzeltilir. Vajina hassas bir blgedir eer tabancann ucu
vajinaya taklrsa tabanca hafif yer deitirilerek itilir. Tabancann ucu servikse
deerse bir sertlik hissedilir. Servikse girmek iin tabanca 2.5 cm kadar geri
ekilir ierideki el saatin dnme ynnn tersine dndrlerek (eger sa el
ieride ise saat istikametinde dndrlr) baparmak ve ilk iki parmakla
serviksin ucu tutulur dier parmaklar tabancann servikse girmesine rehberlik
eder. Tabanca serviksin ortasndaki dar delikten ieri sokulur. Sokulurken fazla
g verilmemeli aksi halde serviks membranlar zarar grr. Bu operasyonun
her safhasnda yava hareket etmek gerekir. Tabanca servikal halkalarn
arasndan geirilebilmesi iin ileri doru kk hareketlerle kaydrlr. Bu
ekilde tabancann ucu uterus boluunda olacaktr veya belki de uterus
boynuzunda olacaktr.

10.5.1.3. nseminasyon
nseminasyon iin payet inseminasyon kanulasnn ierisine yerletirilir. Kanula
inegin viginasnn ierisine (semenin serviksin hemen nne baatlmasn
salayacak ekilde) uygun ekilde yerletirilir. Aadaki resim suni tohumlama
esnasnda yaplan ileri zetlemektedir.
 120

nekte ilk kzgnln grlmesinden 1224 saat sonra inseminasyon yaplr. Bu

ekilde ovulasyonun olmasndan bir ka saat nce spermler oviduka ulam
olur. Suni tohumlamann daha baarl olmas iin iftinin kzgnln ne zaman
baladn bilmesi gerekir. Aadaki resim tohumlama iin payetin (straw) n
nasl kanula ierisine yerletirildiini gstermektedir.

Tohumlama annda payetsv nitrojen ierisinden alnarak vcut scaklndaki

lk su ierisine birka saniye spermlerin aktif hale gelmesi iin braklr sonra
payet kanula ierisine yerletirilerek inseminasyon yaplr.

REFERANSLAR
ISO, 2000, 4833 standaratlar
Kozanda M., (1983) Srlarda suni tohumlama metotlar ve gebelik tehisi.
Lala han zootekni aratrma enstits, yetitiriciye gtler ve halk yaynlar
No:6 sayfa 8,9.
Hurnik, J.F., G.J. King and H.A Robertson., (1975) . Estrus and related
behaviour in postpartum Holstein cows. App. Anim. Ethol. 2 5568.
 121

10.6. Erkek ve dii spermlerin ayrt edilmesi

Gametler (Spermler ve Oositler) X veya Y kromozomu tayan haploid
hcrelerdir. Dii hayvanlar iki benzer sex kromozomuna (XX) sahiptirler. Erkek
havanlarda ise biri X dieri Y olmak zere iki farkl kromozom bulunur. Bu
nedenle tm oositler diidirler. Spermlerin ise yars dii yars da erkektir. Dii
hayvanlarn diploid somatik hcreleri sadece X kromozomu tar iken erkek
hayvanlarn diploid somatik hcreleri XY kromozomu tarlar.
Genetik sex ovidukta, fertilizasyon esnasnda spermlerdeki sex
kromozomu tarafndan belirlenir. Eer yumurta X kromozomu tayan sperm ile
dllenirse dii embriyo; Y kromozomu ile dllenirse erkek embriyo oluur.
Semende sex tahini srlarda domuzlarda ve dier hayvanlarda
uygulanmaktadr (Seidel ve ark., 1999a). Srclk iletmelerinde istenen
cinsiyette yavru elde etmek iletmenin verimliliini artrr. Eer iletme st
retimi yapyorsa dii buzalar tercih eder. Bu buzalar srden ayrlan
ineklerin yerini alrlar. Eer iletme et retimi yapyorsa erkek buzalar tercih
edilir. Erkek buzalar hem satlan erkek hayvanlarn yerini doldurur hem de
suni tohumlama amacyla kullanlrlar.
Gnmzde erkek ve dii spermleri ayrmak iin kullanlan ekipman
(Cytomation MoFlo sorter) mevcuttur. Bu makine 6 miyon spermi cinsiyete gre
bir saat ierisinde %90 saflkla ayrt edebilmektedir (Johnson ve Welch, 1999).
X ve Y kromozomu tayan spermleri ayrmada kullanlan teknikler yavatr
ayrca pahal ekipmanlar ve tecrbeli operatrler gerektirmektedir. Bu konuda
gelitirilebilecek baarl tekniklere dnya apnda ihtiya vardr ve ticari deeri
ok yksektir.
Gnmzde mevcut teknikler kullanlarak yaplan intra-uterin
inseminasyonda yaklak %90 erkek veya %90 dii yavru elde edilebilmektedir
(Seidel ve ark.1999b)
Suni tohumlama yapmadan nce X ve Y kromozomu tayan spermleri
ayrt etmek iin youn almalar yaplmtr. Ayn zamanda embriyonun
cinsiyetini belirlemek iin embriyodaki diploid hcreler belli zamanlarda
hcresel dzeyde incelenmektedir. rnein: Flouresan mikroskobu kullanlarak
hcrelerdeki Y kromozomu belirlenebiliyor.
X ve Y kromozomu tayan spermler arasnda birok potansiyel farklar
vardr. Spermlerde X veya Y kromozomunun mevcudiyeti spermlerin
byklnde, eklinde, arlnda, hareketliliinde, yzeysel elektiriksel
ekimde, spermin dnda veya iinde biyokimyasal farkllklara neden olur.
X ve Y kromozomu tayan spermleri birbirinden ayrt etme metotlarnn ou
sedimentasyon (aa ak) esasna dayanr. Ayrca Y kromozomu tayan
spermler; Y kromozomununun uzun kolunun spermlerin Qinacrine boyasyla
byanmas sonucu folouresan grne sahip olmas ile ayrt edilir. Bu boya ile
boyama sonucu grlen flouresan iaret spermin Y kromozomu tad ve erkek
olduunu gsterir.
 122

Erkek ve dii spermleri ayrt etmek iin kullanlan kliniksel tekniklerden

en yaygn olanlar; Albumin ile ayrma teknii ile Sefadeks filtrasyon teknii dir.
Bu teknikler hem insana hem de hayvana ait dii veya erkek spermlerin
belirlenmesinde kullanlmaktadrlar. Albumin yntemiyle ayrlan spermlerin
%75-80i Y kromozomu tar. Sephadex filtrasyon yntemi ile ayrlan spermlerin
spermlerin %7075 i X kromozomu tar. Bu metotlar dii ve erkek spermler
arasndaki arlk fark, younluk fark ve byklk fark gibi esaslara dayanr.

10.6.1. Albumin kolonu yardmyla ayrma methodu

Bunun iin 8x75mm cam boru (kolon) ierisine %7,5 serum albumini ieren
solsyon konur. Albumin kolona yerletirilir ve dikey olarak kolon sabitletirilir.
Sonra 0,5 ml semen 0.5ml Tyrode solsyonu ile kartrlr. Karm pipetle ile
yavaa albumin kolunu stne boaltlr. Bir saat bu ekilde bekletilir. Bir saat
sonra albumin kolonunun en st ksmndaki sperm fraksiyonu pipetle alnr ve
atlr. Geriye kalan albumin ksm dakikada 28003000 devir ile 10 dakika
santrifje tabi tutulur. Bu santrifj sonunda spermler tpn tabannda pellet
haline gelir. Tpn stndeki sv atlr ve yerine Tyrode solsyonu konur. Elle
alkalanr ve spermlerin homojen dalm salanr. Bu arda baka bir kolon
hazrlanr ve bu kolona alta % 20 albumin ieren solsyon ve zerine %13
albmin ieren solsyon konulur. Kolonun zerine pipetle tyrode solsyonu
ierisindeki spermler yavaa boaltlr. Bir saat beklenir steki sperm
fraksiyonu pipetle atlr yarm saat sonra da %13 albumun solisyonu ieren
tabaka alnr geriye kalan % 20 albumin ieren ksm 28003000 devir ile 10
dakika santrifje tabi tutulur pellet halindeki spermlerin zerine 0.25 ml tyrode
solsyonu eklenir alkalanr ve uterusa insemine edilir. Bu ekilde oluan
bireyin erkek olma olasl %7580 dir.

10.6.1.1. Tyrode solisyonunu hazrlanmas

Trode solsyonunu hazrlamak iin aadaki kimyasal maddeler belirtilen
miktarlarda hassas terazi ile tartlarak 1litre ultra saf su ierisine eklenir.
Eklendikten sonra pH istenilen seviyede ayarlanr.
-8gr NaCl
-0.2gr KCl
-0.2gr CaCl2
-0.1gr Mg2Cl2.6H2O
-0.05gr NaH2PO4.H2O
-1gr Glikoz

10.6.1.2.Albumin solsyonlarnn hazrlanmas

Albumin slisyonun hazrlanmasnda throde solisyonu kullanlr. % 7.5
ambumin solisyonu hazrlamak iin 100ml throde bafrna 7.5gr sr serum
albumini (Drdnc fraksiyon) eklenir. Eklerken sadece bafrn yzeyine
braklr sonra scak yzey zerinde tutularak albuminin erimesi salanr.
 123

Ayn ekilde %13 lk albumin solisyonu hazrlamak iin 13gr ve %20 lik
solisyon iin ise 20gr albumin 100 ml bafrda eritilerek solsyonlar hazrlanr.

10.6.2. Ak stometresi (Flow cytometry) metoduyla erkek ve dii spermleri

ayrma
Otuz yldan fazla bir sredir dllenme esnasnda cinsiyeti kontrol edebilmek iin
sperm hcreleri deiik muamelelere tabi tutulmaktadr. Bilgisayar biliminde,
biyofizikte, hcre biyolojisinde ve pratik reme fizyolojisinde salanan
ilerlemeler neticesi gnmzde srlarda dii ve erkek spermler %85-95
dorulukla ayrt edilebilmektedir. Ayn baar dier trlerde de
salanabilmektedir.
Bilimde 19701980 aras nemli ilerlemeler saland. lk nemli gelime
ak stometresi yardmyla sperm hcresindeki DNA miktar doru bir ekilde
lld. Sperm hcreleri florokromla boyand ve ak stometresine brakld.
Aaya doru akan sperm hcrelerinin her biri zel bir dalga boyuna sahip
ikla floresen grt verirler. Her sperm hcresinin verdii floresan k
toplanarak entegre edilmi bilgisayara gnderilir. Sperm hcreleri yaydklar
floresan k miktarna gre snflandrlr. Bu yntemde floresan n
younluundaki deiimler ok hassas llr. Bylece bu metodu kullanlarak
X ve Y kromozomu tayan spermler arasndaki DNA miktarndaki kk
farklar tespit etmenin mmkn olaca dnld (Van Dilla ve ark., 1977).
Sperm hcrelerindeki DNA miktarn ak sitometresi yardmyla
belirlemeye ynelik ilk almalarda marjinal baar saland. nk sperm
bann ekli farldr, nukleusdaki kromozomlarda youn katlanmalar vardr. Bu
da kantitatif floresan lmn zorlatrmaktayd. Bu problem 1980ne doru
stetten ine gibi ince bir boruyla braklan spermlerin tek sra halinde ba aa
geiine olanak salayan aletin gelitirilmesiyle zld. Bu ekilde spermlerin
yatay yzeyindeki floresan doru bir ekilde lld (Fulwyler, 1977; Dean ve
ark., 1978). Bu aletle memeli spermlerinin DNAsn yksek rezlasyonda
lmek mmknd (Pinkel ve ark., 1982a). Sperm hcrelerindeki DNA
miktarn lmek o zamanlarda radyasyon gibi evre faktrlerinin neden olduu
mitogenik zararlar lebilmek bakmndan nemliydi (Gledhill ve ark., 1976).
Normal farelerin ve Katanak farelerin spermlerindeki DNA miktarlar
arasndaki farkn ak stometresiyle tespit edilmesi X ve Y kromozomu tayan
spermlerin ak stometresiyle birbirinden ayrt edilebilecei fikrinin ortaya
kmasna neden oldu (Gledhill ve ark., 1982; Pinkel ve ark., 1982a). Katanak
fareleri (Cattanach, 1961; Disteche ve ark., 1981) genetiksel olarak anormal
imerik hayvanlardr. Bu hayvanlarn spermlerindeki 7. kromozom X
kromozomu zerine transloke olmutur.
Memelilerde genetik cinsiyeti erkek gamet belirler. Kularda genetik
cinsiyetin belirlenmesinde erkek gametin bir fonksiyonu yoktur cinsiyeti
yumurta belirler. Kular tek tip Z spermi retirler. Ak stometerinde tek pik
olumasna neden olurlar. Memelilerin spermleri ise iki pik olumasna neden
 124

olurlar. nk memeliler X ve Y kromozomu tayan iki tip erkek gamet

retirler. Bu durumda ak stometresi yardmyla X ve Y kromozomlarn ayrt
etme dncesi iin bir ip ucudur diye dnld (Garner ve ark., 1983).
Takiben ak stometresi memeli hayvanlarn spermlerindeki DNA miktarn
bulmak ve karlatrmak iin hemen kullanlmaya baland (Gardner ve ark.,
1983).
Enjeksiyon
inesi

Resimde enjeksiyon inesinin u taraf ile ak stometresinin ak ucu grnyor.

Bu ine ak sitometresi iin zel dizayn edilmitir. ne resimde sol ve sadan
oklarla gsterilen ynde hidrostatik basn yaparak spermlerin tek sra halinde
aaya doru hareket etmesini salar. Basnla hareket saland iin spermlerin
ba taraf daha fazla basnca maruz kalr. Bu nedenle her zaman spermler ba
aa akarlar. Bu basn ayn zamanda sperm nkleus orannn artmasna neden
olur. Bylece spermlerin nkleuslarndaki DNA miktar hassas bir ekilde llr
(Fulwyler, 1977; Pinkel ve ark., 1982).

Bu elet kullanlarak boann, domuzun, koun ve tavann spermlerinin ortalama

DNA miktarlar bulunup birbiriyle karlatrld. Bu hayvanlarn X vey Y
kromozomu tayan spermleri arasndaki DNA faklarnn srayla %3,7; % 4 ve
%3,9 olduu bildirildi ( Garner ve ark, 1983). Bu metotta spermler stometrik
analize hazrlanmas srecinde zarar grrlerdi. Hazrlama ilemi srasndan
spermlerin kuyruu, sitoplazmas ve hcre zarnn byk bir blm
uzaklalrd. Artk bu spermleri baka bir biyolojik uygulamada kullanmak
mmkn deildi ( Gledhill ve ark., 1984; Gledhill, 1988).
Ak stometersi ayn zamanda dier metotlar (Sedimantasyon,
elektroforez, sefadeks-G50 filtrasyonu, albumin gradient santrifigasyonu,
convection-counterstreaming galvanization, ve galvanik elektrik yk farklar)
 125

kullanarak ayrt edilen X ve Y kromozomu tayan spermlerin doru ayrlp

ayrlmadn gstermek iin kullanld. Ak stometresi spermlerin cinsiyet
tayininde ilk defa ifade elden tekniklerle ayrt edilen semen rneklerinin daha
fazla X kromozomu mu veya Y kromozomu mu tayan spermlerle zengin olup
olmadn gstermek iin kullanld.
lk olarak spermlerin cinsiyete gre baarl bir ekilde ayrlmas kuzey
Amerika ve Avrupada yaayan fareye benzeyen Microtus oregoni memelisinde
yapld. Bu hayvanda spermlerin yars Y kromozomu tayor dier yarsnda ise
seks kromozomu yok. Bu da spermler arasnda DNA miktar bakmndan
yaklak %9 orannda bir farka neden olmaktadr. Bu hayvanda Y kromozomu
tayan spermler %72-83 saflkla ayrld. Ak stometrsinin gelitirilmesi ve
evcil memeli hayvanlarnn spermlerin ayrt edilmesinde kullanlmas Amerika
Bileik Devletlerindeki Lawrence Livermore Nasyonel Labaratur ile Oklohama
devlet niversitesi, ziraat fakltesi arasndaki birlikte alma neticesi sonucu
olumutur. Bu alma 1981 de Beltsthille Zirai Aratrma Merkezinde balad.

10.6.3. Ak stometerisnin gelitirilmesi ve X ve Y Kromozomu tayan

spermlerin ayrt edilmesi konusunda yaplan almalar
Sperm analizinde kullanlan ak stometersinde X ve Y kromozomu tayan
spermleri birbirinden ayrt etmek mmknd fakat bu sistemde canl
spermlerdeki X ve Y kromozomlar ayrt edilemiyordu. Lawrence Livermore
Nasyonel Laboratuarnda gelitirilen sperm ayrma metodu X ve Y kromozomu
tayan canl spermleri ayrt etmede etkili deildi. Canl spermleri cinsiyete gre
ayrmak iin Beltshille Zirai Aratrma Merkezinin kulland ortogonal ak
stometre sistemi yeniden dzenlendi. Stometrenin numune ykleme tpnn ucu
ine ucu gibi al ekilde keskinletirildi, sisteme ileri dorusal al florsan
dedektr ve optik fiber bant eklendi. Bu ekilde floresan daha doru
llebilirdi (Johnson ve Pinkel, 1986). Bu modifiye edilmi ak stometresi X
ve Y kromozomu tayan spermleri birbirinden ayrt etmek iin kullanld
(Johonson ve ark., 1987b). Modifie edilen bu aletle X ve Y kromozomu tayan
spermleri %95 saflkla ayrt etmek mmkn oldu. Sperm nkleuslarnn
sitokimyasal boyanmas. Hcre allna zarar veren bir takm prosedrler
iermekteydi. rnein boyamak zere sperm DNAs elde etmek iin, nce
hcre zarnn ayrlmas gerekiyordu. Bunu salamak iin spermler dimetil
slfooksit (DMSO) ile ykanyordu, etanolla fikse ediliyordu sonra da proteaz
enzimiyle muamele ediliyordu (Garner et al, 1983; Johnson et al, 1987b). Bu
konuda yaplan ilk almalarda daha ok inilla spermleri zerinde yapld.
nk bu hayvanlarda X ve Y kromozomu tayan spermler arasndaki fark
%7,5 di. Bu almayla birlikte yeni bir floresan boya, Hoechst 33342,
denendi. Sperm DNA s nceden kullanlan boyalardan daha etkin ekilde
boyand (Johnson et al, 1987b). Bu boyama prosedr sperm hcrelerine
verilen zarar azaltmak iin gelitirildi. Bu metotta boyama ileminden nce
hcre membrannn entegrasyonunu boyann geiine msaade edecek ekilde
 126

deitirmek iin 10 saniye sreyle spermlere sesle muamele edilirdi (spermler

sonike edilirdi). Bylece DMSO da ykama, etanolle fiske etme ve proteaz
enzimiyle muameleye gerek kalmad (Johnson et al, 1987a,b; Johnson and
Clarke, 1988). Daha sonra canl spermlerin morfolojisine ve motilitesine zarar
vermeden Hoechst 33342 ile boyanabilecei grld (Johnson, 1990). Bu
boyaya propidyum iyodid (PI) ilavesi sonucu canl spermleri X ve Y
kromozomu tamalarna gre ayrt etmekle birlikte l ve zarar grm
spermleri de ayrt etmek mmknd. Propidyum iyodid hcre zar zarar grm
spermleri boyuyordu. Bu boya daha sonra food coloring (FD&C40) boyasyla
deitirildi. Bu boya Hoechst 33342 boyasnn canl ve l spermlerde farkl
floresan grn gstermesini salad (Johnson et al, 1994, 1999; Rens et al,
1998, 1999;Johnson and Welch, 1999).

10.6.3. 1. X ve Y kromozomu tayan spermlerin doru ayrldn gsteren

almalar
Ak stometresiyle ayrlan tavan spermlerinden canl yavrularn elde edilmesi
daha nce bu konuda yaplm ispatlayc almalar dorulayc nitelikteydi
(Johnson ve ark., 1989). Ak stometersinde floresan boyann grn
younluuna bal olarak aletin iki pals gstermesinin sebebi X ve Y
kromozomu tayan iki fakl gametin olmasyd. X ve Y kromozomu tayan
tavan spermleri DNA miktarna gre ayrt edilmiti. Ayrlan spermler
operasyonla tavann uterusuna transfer edildiler (Johnson ve ark., 1989). X
kromozomu tayan spermlerle insemine edilen tavanlar %94 dii yavrular
doururlarken Y kromozomuyla insemine edilenler %81 erkek yavrular
dourdular. Bu alma fenotipik cinsiyetin dllenmeden nce kontrol
edilebileceini gsteriyordu (Johnson et al, 1989; Johnson, 1990, 1991, 1992).
Ak sitometresi yardmyla sperm hcrelerini genomik cinsiyete gre
snflandrma domuzda da uyguland fakat etkinlii tavannkinden dkt
(Johnson, 1991). Canl domuz spermlerinden Y kromozomu tayanlar mnkn
mertebe en saf ekilde elde edildi ve dii domuzun terusunun uterus tpyle
birletii ksma, isthimusa, transfer edildi. Bu inseminasyon sonucu elde edilen
yavrularn %68i erkekti (Johnson, 1992 Johnson, 1992). %80 orannda X
kromozomu tayan spermlerle insemine edilen domuz ise %74 dii yavru
dourdu. Bu alma iftlik hayvanlarnda cinsiyet orannn nemli derecede
deitirilebileceini gsteriyor.

10.6.3. 2. Genomik cinsiyete gre ayrlan spermlerin in vitro fertilizasyonda

kullanlmas
n vitro ortamda embriyo elde etmek amacyla olgunlatrlm oositleri
dllemek iin genomik cinsiyet ayrmna tabi tutulan spermler kullanld (Cran
ve ark., 1993). X ve Y kromozomu tayan spermler modifiye edilmi Becton
Dickinson FACStar Plus flow cytometer/cell sorter kullanld. Cinsiyet ayrmna
tabi tutulan spermler Hoechst 33342 ile boyand. %79 X ve %70 Y kromozomu
 127

tayan iki sperm poplasyonu elde etmek iin saniyede 100 sperm cinsiyete
gre ayrld (Cran ve ark., 1993). Elde edilen embriyolar ift halde alclara
transfer edildiler. Bu transferler sonucu 4 hayvanda gebelik saland. Gebelik
sonunda 3 erkek 3 dii olmak zere 6 yavru dnyaya geldi. Bu alma
genomik cinsiyet ayrmna tabi tutulan sr spermlerinden canl yavru elde
etmenin mmkn olduunu gsteriyordu. Daha sonra yaplan almalar Y
kromozomu tayan boa spermlerini %90 saflkla ayrabilmenin mmkn
olduunu gsterdi (Cran ve ark., 1995).

10.6.3.2.1. X ve Y kromozomu tayan spermlerin dondurulmas

X ve Y kromozomu tayan spermleri 5C de tutma baars 250lsinde bir
milyon sperm bulunacak ekilde payetler ierisinde dondurma teebbsne
neden oldu (Schenk ve ark., 1999). Bu sayda sperm daha nce genomik cinsiyet
ayrmna tabi tutulmu ve dondurulmadan inseminasyon yaplm
uygulamalarda kullanlan sperm saysndan iki kat fazlayd. Bunun nedeni
dondurma zme srasnda len sperm saysn telafi etmek iindi. Genomik
cinsiyet ayrmna tabitutulan spermlerin konsantrasyonu santrifjle 80
milyon/mL ye getirildi. Bu younluktaki spermlerin tekrar says 20 milyon/mL
ye ayarlanabilir ve 0.25 mL lik payetlere konulabilirdi. Cinsiyet ayrmna tabi
tutulmu ve dondurulmu spermlerle salanan gebelik oran %52 di (Seidel,
1999a,b; Schenk et al, 1999). Bu baaryla spermleri genomik cinsiyete gre
ayrma ilemlerini yapld yerin semen alnan iftlie yakn olmasnn yararl
olacan gsteriyordu (Aman, 2000). Bylece cinsiyet ayrmna tabi tutulan
spermlerin canlnda daha fazla kayp meydana gelmeden dondurulabilirlerdi.
Spermler dondurulmu halde inseminasyon iin her tarafa rahata gtrlebilir.
Her ne kadar spermleri cinsiyet ayrmna tabi tutma prosedr sonucu
spermlerin motilitesinde ve akrozom btnlnde zarara neden olsa da bu zarar
rutin semen dondurma srasnda spermlere verilen zarardan daha azdr (Amann,
2000). Cinsiyet ayrmna tabi tutulan ve suni tohumlama amacyla payetlere
doldurulan sperm says 16 milyon/payet dr. Oysa normal bir suni
inseminasyon iin payetlere doldurulan sperm says 1020 milyon/payet dr.
Gnmzde spermler cinsiyete gre daha etkin bir ekilde ayrlmakta, her
cinsiyet iin saniyede yaklak 4000.

10.6.3.2.2. Spermleri cinsiyete gre ayrma hz

Spermleri cinsiyete gre ayrma hz spermlerin ak sitometresindeki
oryantasyonuna baldr. Ayrma ilemi srasnda spermlerin ak
sitometresindeki oryantasyonunu artran bir metot Amerikada gelitirildi (Rens
et al, 1998, 1999; Johnson et al, 1999; Welch and Johnson, 1999; Johnson,
2000). Bu ekilde spermlerin ard ardna aa ini hznda salanan bu ilerleme
%25-60 orannda bir ayrma etkinlii salar (Rens et al, 1998, 1999). Bu
tasarm ayn zamanda hzl sperm sayma sistemine entegre edildi bylece saatte
X ve Y kromozomu tayan spermlerin her biri iin 2-6 milyon sperm ayrmak
 128

mmkn oldu. (Rens et al, 1998; Johnson et al, 1999). Daha sonra spermlerin
tek sra halinde aa inme frekansn artran yeni tasarm Cytomations SX
MoFLo (Cytomations, Fort Collins, Colo)e entegre dilerek X ve Y kromozomu
tayan spermleri ayrma iini daha da etkinletirdi.

Figr 24.4.2.1.1.3. DNAya balanan floresan boyayla boyanan spermler

stometrenin ucundan aaya doru pompalanrlar. 1. Pizoeletrik kristal vibratr; 2.
Ak ayarlayc; 3. Lazer ilimnatr; 4. X ve Y kromozomlarn floresan intensite
farkyla alglayan detektr. X kromozomu Y kromozomundan %4 defa fazla
floresan boya tar; 5. algnan floresan intensite farklar bilgisayara gnderilir.
Bilgisayar bu farka gre spermleri X, ayrlmam ve Y olarak ayrr; 6. Spermler
yukardan aaya basnla iner levhalar arasndan geerler; 7. Spermler levhalar
arasndan geerken ak frekansna uygun +,- ve ntr yke maruz kalrlar ve
belirlenirler; 8. Fazla floresan sinyal veren spermler X, az floresan verenler Y ve
ayrlamayanlar olarak toplanrlar.

Bu gn yeni aletle saatte 15 milyon X veya Y kromozomu tayan sperm ayrmak

artk mmkn. (Seidel, 2000; Schenk, 2001).

10.6.3.2.4. X ve Y kromozomu tayan spermlerle salanan gebelik ve

doum oranlar
Spermlerin cinsiyete gre optimum ekilde ayrlmasna ve inseminasyon
yaplma zamanna ok dikkat edilmelidir. Yeni kzgnla gelen dvelerin
cinsiyet ayrmna tabi tutulmu ve dondurulmu spermlerle dllemeleri sonucu
 129

normale yakn gebelik soranlar saland. Fakat laktasyondaki ineklerde ayn

gebelik oranlarnn salanp salanmad konusunda yeterli alma
yaplmamtr (Seidel et al, 1999a,b,c). Cinsiyet ayrmna tabi tutulan spermlerin
baarl bir ekilde dondurulmas, kzgnlklar kontrol edilmi veya edilmemi
ineklerin insemine edilmesi bu spermlerin iftliklerdeki islah programnda
kullanabilme imkan dourmutur.
Bir aratrmada 1000 tane inek ayrlm, dondurulmu spermlerle
insemine edilmi. 1-1,5 miyon cinsel ayrma tabi tutulmu ve dondurulmu
spermle insemine edilen hayvanlarn gebelikleri ile ayn spermlerin 3
milyonuyla dllendirilen ineklerin gebelik oranlar arasnda fark gzlenmemitir
(Seidel et al, 1999a). Son zamanda yaplan bir almaya gre cinsi ayrma tabi
tutulmu ve dondurulmu spermlerle yaplan inseminasyon sonucu salanan
gebelik oran ile ayn spermlerin saysnn 720 kat fazla olduu durumda
salanan gebelik orannn yaklak %90 olduu ifade edildi. nseminasyonun
sperm saysna bal olarak dllenmenin olduu yere yakn verilmesinin
dllenme oranna olumlu etki yapaca belirtilmiti. Fakat yaplan bir almada
hayvanlara 11 defa intra uterin ve intra oviduktal iniseminasyon yaplm.
Yaplan 11 inseminasyondan sadece birinde ovidukta yaplan inseminasyon
sonucunda gebelik oran yksek bulunmu (Seidel et al, 1999c).

10.6.3.2.5. Genomik cinsiyet ayrmna tabi tutulan spermlerin anormal

yavru oluumuna etkisi
Alt hayvan trnde cinsel ayrmna tabi tutulmu spermlerle yaplan
inseminasyonlar sonucu 1000 den fazla yavru dnyaya gelmitir. Bu yavrularn
hibirinde nemli bir anormallik gzlenmemitir. (Seidel et al, 1999a,b; Cran,
2000). Fakat bunu ispatlamak iin bilimsel almalar gerekmektedir. Bir ihtimal
spermlerde cinsiyet ayrm spermlerin DNAsna zarar verebilir ve bunun
sonucunda genetik anormalliklerin meydana gelme olasl artabilir. imdiye
kadar cinsel ayrma tabi tutulmu spermlerle yaplan inseminasyonlar sonucu
oluan gebeliklerin 1. ve 2. aylarnda embriyonik lmlerde bir at
gzlenmemitir fakat gebeliin 2. aynda ve douma yakn zamanda bir ka
yavru atma olay gzlenmitir (Seidel et al, 1999c).

10.6.3.2.6. Genomik cinsiyet ayrmna tabi tutulmu spermlerin ticareti

Genomik cinsiyet ayrmna tabi tutulmu spermlerin ticari rn olarak piyasaya
srme konusundaki ilk teebbsler baarszlkla sonulanmtr. Dardan gzle
bakarak spermlerin erkek mi yoksa diimi olduunu anlamak imkanszdr.
Ancak DNA dzeyinde anlalabilir. Ak sitometresinin 1989 da icadndan nce
spermlerde cinsiyet tahini iin basitten karmaa doru deiik metotlar
uyguland. Uygulanan metotlarn hem etkinlii azd hem de tutarl sonular
vermiyordu. Ak sitometresinin Beltsville zirai aratrma merkezinde Larry
Johnson (Johnson et al, 1989) tarafndan gelitirilmesiyle spermlerde cinsiyet
tahini daha etkin ve tutarl yaplma baland ve tarm bakanl tarafndan
 130

patentlendirildi. Daha sonra ak sitometresi kullanarak spermlerde cinsiyet

ayrm yapp piyasaya srme lisans Mastercalf Ltd irketine verildi. Bu irket
cinsiyet ayrmna tabi tutuu spermlerle in vitro fertilizasyon yaplarak embriyo
elde edebilmeyi ve sonra bu embriyolar taclara transfer edebilmenin mmkn
olabileceini ispatlad (Cran et al, 1993, 1995). Fakat bu yaklam ticari olarak
rabet grmedi. u anda ak sitometresi kullanarak spermlerde cinsiyet ayrm
yapma ve ticaretini yapma lisans zel bir irket olan XY incorporationa
verilmitir.

10.6.3.2.7. Az sayda spermle inseminasyon

Ak stometresi 1996 da daha da gelitirilerek intra sitoplazmik sperm
enjeksiyonu, in vitro fertilizasyon ve oviduktal inseminasyon iin yeterli sayda
genomik cinsiyete gre ayrlm sperm elde edilmesi saland. Srda suni
dllenmenin salanabilmesi iin her suni dlleme payetinde 20 milyon sperm
bunmaldr. Bu nedenle ak stometresi yardmyla suni tohumlama iin yeterli
sayda genomik cinsiyete gre ayrlm sperm elde etmek mmkn deil. Ama
yumurta hcresini sadece bir sperm dllyor. Bu nedenle az sayda spermle
dllemenin yollarn bulmak ie yarayabilir. ster intra vajinal, intra servikal ve
ister intra uterin inaminasyon olsun spermlerin baarl bir dlleme yapabilmesi
iin yumurta hcresinin bulunduu yere kadar olan mesafeyi kat etmek
zorundadrlar. Bu yolculuu ok az sayda sperm tamamlar. Yolculuk yaplacak
mesafeyi baypas etmek iin genomik cinsiyet ayrmna tabi tutulan domuz
spermleri direkt olarak domuzun reme kanalnn isthmus ksmna transfer
edildi. Bylece dlleme olaynn olduu noktaya daha fazla sayda spermin
gelmesi saland. (Johnson, 1992). Domuz zerinde yaplan bu alma srlar
iinde geerli olabilecei dnld. As sayda sr spermini dllenmenin
olaca yere mmkn mertebe yakn transfer yaplrsa dllenme
salanabilirimiydi? Bunu test etmek iin ineklerin oviduktlarna 100 000-500
000/doz sperm nakledildi ve normal gebelik oranlar saland. Takip eden
almalarda ise genomik cinsiyet ayrmna tabi tutulmu boa spermleri ile
gebelikler saland (Seidel ve ark., 1997). lk almada boa spermleri
Pennsylvaniada alnd Marylantda genomik seks ayrmna tabi tutuldu ve iinde
100 000-200 000 dondurulmam boa spermi bulunan insminasyon dozlarn
uterus boynuzuna transfer etmek iin Coloradoya uakla getirildi. Yaplan
inseminasyon sonucu 17 buza elde edildi. Bunlardan 14 dnn cinsiyeti
nceden tahmin edildii gibi oldu (Seidel ve ark., 1997). Bu alman sonunda
Coloradoda ak stometresinin performans saniyede 500-600 sperm ayracak
ekilde gelitirildi. Clorado insaminasyonun yaplaca yere arala ulamak iin
uygun mesafedeydi. Takip eden almada bir inseminasyon dozunda yaklak
300 000 X kromozomu tayan dondurulmam spermlerle 35 inek insemine
edildi (Seidel et al, 1998). Yaplan inseminasyonlar sonucu %42 gebelik oran
saland oysa gebelik oran normal ekilde insemine edilen ineklerde %54 d. X
 131

kromozomu tayan spermlerle dllendirilen hayvanlardan 19 buza elde edildi.

Bu buzalarn 18 tanesi diiydi (Seidel et al, 1998).
11. Gonatlar ve gametler zerinde yaplan
mikromaniplasyonlar
11.1. Ovaryumlardan folikllerin ayrlmas
Memeli ovaryumlar deiik byklkte binlerce folikl ierir. Her foklde bir
yumurta hcresi vardr. Kemirgen hayvanlarda (rnein farede) bir foliklde
bazen iki yumurta hcresi bulunabilir. Ovlasyon ncesi safhaya kadar
geliebilen folikller (Bu folikller ounlukla bir bazen ikidir) patlar ve
yumurta hcresi dar kar buna ovulasyon denir. Yumurtann dar kt
folikl ise korpus luteum denilen beze dnr. Ovulasyon sonucu yumurta
hcresi ya olgundur ya da olgunlaarak dllenmeye hazr hale gelir. Yapay
olarak, ovaryumdaki folikller veya yumurtalar ayrlarak kltre alnp
dllenmeye hazr yumurta hcresi elde edilmeya allabilinir. Ayn zamanda
folikller deneysel amalar iin, diyagnostik testler iin veya biyopsi amac iin
kullanlabilirler.

Resim 10.1.1. Ovaryumun d ve i grnts. Soldaki ovaryum zerinde biri hemorajik,

dier ikisi ise albikan olmak zere toplam 3 tane korpus luteum var. Olgun korpus luteum;
korpus hemrajium ve korpus albikan arasndaki korpus luteumdur. Sada ovaryum
parankimasnda gelimi ve gelimekte olan folikller grlyor. Ovaryum parankimas
deiik byklkte binlerce folikl erir.
 132

Folikller ovaryumlardan balca iki teknik kollanlarak ayrlr

a) Enzimik yntem (Kimyasal yntem)
b) Mekanik yntem

a) Enzimik yntem
Birok hayvan trnn ovaryumlarndaki kk folikller enzim yardm ile
ayrlr. Genellikle bu i iin kollagenaz ve bir miktar DNAaz karm enzimler
kullanlr. Bu ekilde enzimik metot kullanlarak henz domam hayvanlarn
ovaryumlarndaki veya yeni domu hayvanlarn ovaryumlarndaki primordial
folikller ayrlabilir. Bu yntemle hayvanlarn ovaryumlarndan ok sayda
kk folikl ayrmak mmkndr. Hayvandan alnan ovaryumlar 1 saat sre ile
37C de takiben 36 saat 4C de braklmas sonucu bu ovaryumlardan biyopsi
amac ile ortalama 140 folikl ayrlabilir. Bu metot; monapoz halindaki bayan
ovaryumlarndan ve polisistik ovari sendromu gibi problemi olan bayanlarn
ovaryumlarndan folikl ayrmada baarl deildir. Enzimik ytemle thecal
hcrelerden yoksun olarak folikller ayrlr. Bu metotta granulosa hcrelerini
dtan saran membrana (bazal laminaya) zarar grebilir. Enzimik yntem
kullanlarak ayrlan folikller kltr ortamnda ok yava byrler ve zamanla
kltre alnan folikllerin entegrasyonu bozulur. Enzim ile muamele sonucu
folkl oluturan hcrelerin reseptrler zarar grebilir.
b) Mekanik yntem
Eer foliklerden kltr ortamnda olgun yumurta elde edilmek isteniyosa
veya herhangi bir kimyasal maddeye kar verdikleri tepki aratrlmak
isteniyorsa bu durumlarda reseptrlerin zarar grmesi istenmedii iin fiziksel
yntem tercih edilir. Bu metotda enzim kullanlmad iin reseptrlere zarar
verilmez. Ayn zamanda fiziksel metotlarla ayrlan folkllerde bazal membran
saran bir theca hcre tabakas ihtiva eder. Bu metodun dezavantaj ise az sayda
folikln ayrlabilmesidir.
Fiziksel metot ile ayrlm folikller tek bir folikl olarak ayr ayr kltre
alndklar zaman kltrde uzun sre karakteristik yaplarn muhafaza ederler.
Theca tabakas kltrde folikl apnn bymesine ve antrumun oluumuna
yardmc olur. Ayn zaman theca hcre tabakas yumurta hcresinin bymesini
de biyokimyasal olarak etkiler. Bu etki nerdeyse tamamen dolayl olarak
granulosa hcreleri zerine yaplan etki nedeni ile olur. Kk labaraturar
hayvanlarna ait kk folikller ovaryumdan mikroskop altnda kk ineler
yardm ile ayrlr. Byk hayvanlarn ovaryumlarnn stromasnda ok youn
fibrz ba dokusu mevcuttur. Bu nedenle mikroskop altnda koyun ve sr
ovaryumlarndaki foliklleri grebilmek mmkn deildir. Bunun iin bu
hayvanlarn ovaryumlar nce kk paralara ayrlr sonra da folikller bu
paralardan ine ile dar karlr.
 133

Folkl Ayrma Metodun Avantajlar Metodun Dezavantajlar

Metotlar
ok kk yataki (dnyaya gelmemi Byk folikllerin ayrlmasnda
Kimyasal yntem veya yeni gelmi hayvanlar) hayvanlarn uygun deildir nk theca
ovaryumlarndan ok sayda kk tabakasnn foliklden ayrlmasna
folikllerin ayrlmasnda etkilidir. sebep olur. Bazal membrana ve
hcre zarlarndaki reseptrlere zarar
verir.
Theca hcreleri bu yntemle foliklden Bu yntem ile ok az sayda folikl
Mekanik yntem ayrlmaz, Basal membran zarar grmez, ayrlabilir
Fazla fibrz ovaryumlar iin bu metodun
zorluu var ise de kk ve byk
folikllerin ayrlmas iin uygun bir
metottur
Fiziksel+Kimyasal Fazla fibrzl ovaryumlarda etkilidir.
yntem

11.2. Granulosa hcrelerinin ayrlmas

Granulosa hcreleri bazal membran iten saran yumurtay dtan evreleyen
hcrelerdir. Pre-antral folikllereden granulosa hcrelerini ayrmak iin nce
folikller iinde kltr svs bulunan petri kabnda ine ile ikiye ayrlr sonra
ayn medyum ile doldurulmu steril cam kap ierisinde steril pipet kullanlarak
ya fula yaplr ya da ine ile bu hcreler kaznr veya ikisi birlikte yaplr. Sonra
12 dakika bekletilir. Bu sure iinde folkl membranlar ve dier paralar alta
ker stteki effaf ksmda ise granulasa hcreleri mevcuttur bu ksm alnarak
10 dakika 400500 RPM de santrifj yaplr. Santrifj sonunda granulosa
hcreleri pellet olarak tpn altnda elde edilir. Granolasa hcreleri ile yaplmas
planlanan in-vitro almalarda ve dier aratrmalarda (rnein gen
ekspresyonu ile ilgili almalarda) granulosa hcreleri bu ekilde hazrlanr.
Antral folikllerden granlosa hcrelerini ayrmak iin hemen hemen ayn metot
kullanlr. nce folikln iindeki antral sv alnr sonra folikl ine ile kk
paralara ayrlr ve bazal membrann i tarafndaki hcreler ine ile kaznr sonra
pipetle fla yaplr. Dier ilemler tamamen ayndr. Aadaki resim 11.2.1 de
folkler anatomi gsterilmektedir.
 134

nterstinal
hcreler
Bazal lamina
Granulosa hcreleri

Korona radiata hcreleri

8Yumurta
(( hcresi (Oosit, Ovum)
Antrum (Boluk)
Antral sv ( Folikler likr)

Resim 11.2.1. Bazal laminann d tarafnda interstinal hcreler, oosite yakn tarafnda ise
granuloza hcreleri vardr. Resimde yumurtay (oositi, ovumu) evreleyen boluk
(Antrum) temamen olumutur. Bu folikller antral folikllerdir. Antrumun ii antral
svyla doludur. Oosit bu svnn iinde sebest haldedir bir taraftan ise granuloza
hcrelerine tutunmu haldedir. Oositi saran bir veya iki sra granulosa hcre tabakas
var. Bu hcelere kmulus hcreleri veya korona radiata hcreleri denir. Antral
folikllerden granuloza hcrelerini ayrmak iin bazal lamina ineyle yrtlr sonra fula
yaplr. Tripan mavisiyle boyanan hcreler k mkroskobu altnda 400X
magnifikasyonda grlebilir. Bu hcreler ekillere nedeniyle granuloza diye
adlandrlmtr.

11.3. Ovaryumlardan in vitro koullada yumurta aspirasyonu.

Kesilen hayvanlardan veya duruma gre canl hayvandan alnan ovaryumlar
aspirayon medyumu ierisine konur. Bu medyuma besin maddeleri ve
antibiyotik ilave edilir. Medyum ierisindeki ovaryumlardan yumurtalar
mikroskop altnda hipodermik ine kullanlarak vakumla aspire edilir.
Folikllerdeki antral svy, hcreleri ve yumurta hcresini ieren ksm 1520
mm lik cva basnc salayan vakum yardm ile emilerek toplama tpne
doldurulur sonra bu tp ierisindeki yumurtalar, hcreler ve sv ksm ayrt
edilerek deiik amalar dorultusunda kullanlr.
 135

11.4. n-vivo ortamda yumurta aspirasyonu

Yumurta aspirayonu in vitro dlleme iin yumurta salamak amac ile yaplr.
Ultrasound ile ynlendirilmi ine yardmyla ovaryumlara girilerek ovulasyon
ncesi safhada bulunan graf folikllerin iindeki yumurtalar vakumla alnrak
toplama kabna aktarlr. Toplama kabnda biriken hcre ve svlardan
yumurtalar seilerek alnr.

11.4.1.Yumurtalarn elle dllenmesi (Mikrodlleme)

Mikrodlleme olduka yenidir. Bu teknik in-vitro fertilizayon ve embriyo
transferi yaplacak hayvanlarda dllenme ansn artrmak iin kullanlyor.
nsanda zona zar altna yaplan sperm enjeksiyon ile ilk gebelik 1988 ylnda
Singapurda saland. Bunu takiben kuzey Amerikada, Avrupada, Japonyada ve
 136

Australyada medikal bilimlerle uraan kliniksel guruplar tarafndan

mikroinseminasyon sonucu gebelikler ve doumlar rapor edildi.
Yksek verimli baz hayvanlarda suni tohumlama veya doal am
sunucu dllenme olmayabilir. Bu durumdaki hayvanlarn dllenme problemleri
mikrodlleme ile zlebilir. Yumurta zarnda veya sperm hcresinin
akrozomunda mevcut bir anormallikten dolay dllenme salanmayabilir. Bu
durumda yumurtann sitoplzmas ierisine sperm enjeksiyonu yaparak
dllenmeyi salamak mmkndr.
Bu tekniin uygulanmas iin gerekli sperm ve yumurta; in-vitro dllenme
iin alnan yumurta ve spermlerin alnma teknikleri ile ayndr. Semen
laboratuarda ayn ileme tabi tutularak en hareketli spermler alnr ve kltr
ortamna konulur. Bu ortama sperm canlln ve hareketliliini salayan besin
maddeleri ilave edilir. Olgun yumurta hcresi enzim ieren (Bu enzim
hyolorinidaz olabilir) kltr ortamnda mikroskop altnda, mikro cam pipet
yardm ile nazikce fula yaplarak yumurtay evreleyen kmulus hcreleri
ayrlr. Sonra tek bir sperm ok az miktarda kltr ortam ile birlikte kk,
lumen ieren ve ok keskin cam ine ye benzer mikropipet ierisine alnr. Sonra
mikromaniplatr yardmyla keskin cam mikropipet; jel benzeri yumurtay
saran zar (zona pellicida) ve stoplazma zarn delerek sitoplzma ierisine
enjekte edilir (Resim 26.1.5.1)

Sper
Resim 11.4.1.1. Olgun yumurta bir
polar cisim (P) ve bir pronleus
tayan hcredir. Resimde nkleus
ierisine cam mikropipetteki sperm
enjekte ediliyor. Bu teknik yardm
ile yumurtadan kaynaklanan ksrlk
problemlerinin birounun nne
geilir.
p

m enjeksiyonundan 1618 saat sonra enjekte edilen yumurtalar mikroskop

altnda incelenerek yumurtaya herhangi bir zararn verilip verilmedii ayn
zamanda yumurtann dllenip dllenmedi kontrol edilir.
Dllenmi bir yumurta (zigot) iki farkl pronleus ve iki ayr polar cisim ihtiva
eder. Dllenmi yumurtann kltre alnmasndaki ve transferindeki ilemler in-
vitro fertilizasyonda kullanlanlarn aynsdr.

11.4.1.1. Mikrodlleme ile salanan yararlar

Erkee bal ksrlk problemi; olgun yumurta hcresinin kltrde tek bir sperm
ile dllendirilmesi ile zlebilecei fikrinden hareketle, mikro dlleme
kliniksel olarak uygulama alan bulmutur. Sperm kalitesinin dk olmas
 137

sonucu meydana gelen ksrlklar bu ekilde zlebilir. Mikro dlleme

konusunda salanan en nemli gelime: Tek sperm hcresinin yumurtann
sitoplazmas ierisine enjekte edilmesi sonucu dllemenin salanmasdr. Bu
metot intra-sitoplazmik sperm enjeksiyonu olarak bilinir. Sitoplazma iine
sperm enjekte edilirken spermin hareketli veya motil olmasa da canl olmas
koulu vardr. Bu sperm erkein reme kanalnn herhangi bir ksmndan
alnabilir. rnein testislerin ierisinden veya epididiymisden.
Ejegulatlarnda dllenmeyi salayacak kadar sperm bulunmayan
(Oligospermia problemi olan erkekler) erkek hayvanlarn testislerinden veya
epidiymislerinden tek sperma alnarak dllenme salanabilir. nk sitoplzma
ierisine enjekte edilen spermi kapasiteletirmeye gerek yoktur. Hernekadar l
spermler kullanlarak dllenme salansa da bu spermlerdeki DNA dejenere
olduu iin dlleme sonunda anl embriyonun olumas mmkn deildir.
Oligospermia probleminin olumasnn nedeni ya erkein reme kanalndaki bir
tkanklk ya da testisin ierisinde yeterli sperm retimini engelleyen mevcut
fizyolojik dengesizliktir. Baz durumlarda testis yeteri kadar sperm retir fakat
retilen spermler enjegulasyondan nce lrler (nekrozoospermia). Bu durumda
l spermleri mikrofertilizsasyonda kullanma yerine testise biyopsi yaplmas
sonucu taze anl spermler alnabilir.
Mikrodlleme iin kullanlan alternatifler in vitro dllenme iin kullanlan
sperm saysn artrmay hedefler. zellikle erkekten kaynaklanan ksrlk
problemlerinde dllenme iin kullanlacak sperm saysnn artrlmas
yumurtann dllenme ansn artrr fakat sperm saysn ok fazla olmas kltr
ortamndaki yumurtann evre artlarn olumsuz etkileyebilir.

11.5. Tek yumurta ikizlerinin elde edilmesi

Dllenen yumurta zigotu oluturur. Daha sonra zigot blnerek blastosit ve k
safhasna gelir. Aadaki resim 11.5.1 embriyonun oluma aamalar
grlmektedir.

a b c d e

Resim 11.5.1. Dllenmeden sonra zigot blnmeye balar. Resimde 4 hcreli embryo (a)
blnmeye devam ederek 3264 hcreli emryoya (b) dnr. Blnme devam eder ve
embryo erken blastosit sonra da blastosit (c) safhasna gelir takiben zona zarndan dr ka
hazrlanr (d) sonra dr kar (e) daha sonra endometriyuma balanr.

Embriyolardaki (2, 4, 8 hcreli ve daha byk embiryolardaki) blastomerler

mikro maniplasyonla ayrlarak tek yumurta ikizleri oluturulabilir. Ayrca
embriyoyu morula safhasnda, erken blastosit safhasnda veya blastosit
safhasnda da ikiye blmek suretiyle tek yumurta ikizleri oluturulabilir.
 138

Embriyoyu ikiye blmek ile elde edilen embriyolarn fetse dnm drde
blme ile elde edilenlerden ok yksektir. Bu metotla koyunda drt, srdan
ve attan ise iki tane tek yumurta ikizi elde edilmitir. Bu metot bir hayvandan
olduka fazla sayda yavru elde etme imkn sunar. Sonu olarak generasyonlar
aras sre ksalr ve yksek verimli varyantlarn sr ierisindeki says artar.
Embriyo dondurma (karyoprezarvasyon) tek yumurta ikizlerinin elde
edilmesine ok yardmc olur. rnein: kiye blnen bir embriyonun yalnz bir
paasn transfer edebilme imkn varsa dier paras transfer yaplacak uygun
diinin hazr olabilme zamanna kadar dondurularak saklanabilir. Ksaca
karyoprezervasyon teknigi bize tek yumurta ikizlerini elde etmede zaman
kazandrr. Bu ekilde dondurulmu dier para baka bir zamanda transfer
edilebilir.

11.5.1. Nkleer transfer

Herhangi bir vcut hcresinin ekirdeinin polar cismi ve ekirdei alnm
yumurtann ierisine transferine nkleer transfer denir. Bu ekilde genetik yaps
ayn olan fertler elde edilir. Genetik yaplar tamamen ayn olan fertlerin
oluturduu guruba klon yaplan bu ilemede klonlama denir. Aadaki resimde
koyunda yaplan klonlama gsterilmektedir. Bu resim ayn zamanda bu amala
yaplan ilemleri zetlemektedir. Bu ilem tm memelilerin klonlanmas iin
geerlidir. Zona pellucida iine yaplan nkleer transfer ya mikro enjeksiyon,
ya da elektroporasyonla salanr.

11.5.2. Embriyoyu evreleyen zona pellucidann embriyonun dar

kmasn salayacak ekilde yrtlmas
Baz durumlarda blastosit safhasndaki embriyoyu evreleyen jel benzeri klf
(Zona zar) fizyolojik dengesizlikten dolay embriyo tarafndan yrtlamaz.
Embriyonun uterus duvarna balanmas iin zona zarndan dar kmas
gerekir aksi halde ksrlk meydana gelir. Dllenmemi yumurtay saran zona
zar transparant grnmde giliko-protein klfdr. Yumurtay evreleyen bu
klfn iki grevi vardr.
a) Morula safhasna yaklarken blastomerlerin birbirinden ayrlmasn
engellerek embriyonun kompak halde kalmasn salar.
b) ki farkl embriyonun birbirine yapmasn engeller
Zona pellucida embriyoyu implantasyona ya da embriyonun geliip uterusa
balanmak zere kt ana kadar, emriyoyu korur. Bu klftan dar kan
embriyo uterusun emdometriumuna balanmak zere temasa geer.
Hayvann ar yal olmas nedeniyle veya dier faktrler nedeniyle
ovaryumlarn ierisinde baz fizyolojik dengesizlikler oluabilir. Bunun
sonucunda yumurtay saran zona pellucida ar derecede kalnlaabilir. Bu
durumda; embriyo blastosit safhasnda iken bu klf yrtp uterusa balanamaz.
Bunu iin mikro maniplasyon ile embriyoyu saran bu klf karlr (Resim
11.5.2.1.)
 139

Resim 11.5.2.1.Blastosit safhasndaki

embriyoyu evreleyen zona klfnda
bir delik alyor. Bylece embriyonun
klftan dar k kolaylatrlyor.
Kliniksel olarak bu tekniin yararn
gsteren somut bir rapor yok fakat
deneysel bir metot olarak
bildirilmektedir.

Zonada oluturulan bu delik yukardaki gibi mekaniksel olarak yaplabildii gibi

kimyasal veya lazer ile de yaplabilir. Bu ilem dllenmeden gn sonra
yaplmaktadr. Kltr ortamnda blastosit safhasna kadar gelien embriyolar
transfer etmeden nce embriyoyu evreleyen zona pellucidann tamamen
embriyodan ayrlmas uygundur.

11.5.3. Embriyonik Biyopsi

Bazen fertilite problemi spermlerdeki anormal kromozom says veya anormal
kromozom yaps sonucu oluabilir. Bu spermlerin yumurtaya enjeksiyonu
sonucu dllenme salanabilir. Bu nedenle oluan embriyonun doumdan nce
normal olup olmadnn bilinmesine gerek vardr. Bunun iin doumdan nce
embriyoyu gzetlenmesi nerilmektedir.
Embriyodaki kromozomal anormallikler biyopsi yaplarak belirlenebilir.
Biyopsi ilemi dllenmemi yumurtadan polar cism karlarak veya 6-12
hcreli embriyodan bir ka blastomer alnarak yaplr. Ayrca biyopsi blastosit
halindeki embriyoyu eviren tropoekdodermden alnarak da yaplabilir. Alnan
hcreler embriyoda oluan genetik mutasyonlar veya kromozamal
anormallikleri belirlemek iin kullanlr. Biyopsi ilemi in-vitro fertilizasyon
laboratuarlarnda el mahareti iyi ve kesin tecrbeli kiiler tarafndan yaplmaldr
nk biyopsi yaparken yumurta veya embriyonun zarar grme riski vardr
(Resim 11.5.3.1).
nsanlarda kaltsal genetik anormallik sz konusu ise hamile bayanlar bu
ekilde embriyolarnn incelenmesine musade etmektedirler. Yksek oranda
genetiksel olarak anormal yumurta reten bayanlarn yumurtalar veya
embriyolar biyopsiye tabi tutularak kromozamal anormallikler belirlenmelidir.

Resim 11.5.3.1. Sekiz hcreli

bir embriyoda genetik
anormallikleri belirlemek iin
hcreler biyopsi iin
alnmaktadr.
 140

11.5.4. Embriyoda sex tahini

Hayvanclk iletmesinin retim amacna gre erkek veya dii hayvanlar tercih
edilir. Daha ncede belirtildii gibi st retimi yapan iletmeler daha ok dii
hayvanlar tercih eder iken et retimi yapan iletmeler erkek hayvanlar tercih
ederler. Doumdan nce erken embriyonik safhada oluan embriyonun
cinsiyetini bilmek parasal ynden kazan salad gibi abuk genetik
ilerlemeye de hizmet eder.

REFERANSLAR
Atrhur GH., Noakes DE., Pearson H. Ve Parkinson T.J., (1996). Embryo
transfer in large domestic animals. In: veterinary reproductiom and obstetrics,
Seventh ed., Saunders, Chap 34, p 690.
Hafez ESE (1993) Asisted reproductive technology:Ovularion manipulation, n-
vitro fertilization/ Embryo transfer (IVF/ET)., Reproduction in farm animal,
6.Bask, editr; ESE Hafez, 23. Bolm, pp 461-498
Hatshorne GM.,(1997) In-vitro culture of ovarian follicles. Reviews of
Reproduction 2 94-104
Seidel, Jr GE, Johnson LA (1999) Sexing mammalian sperm-overview.
Theriogenelogy. 52: 1267-1272.
Seidel, Jr GE, Schenk JL, Herickhoff LA, Doyle SP, Brink Z, Green RD,
Cran DG. (1999). Insemination of heifers with sexed sperm. Theriogenology.
52: 1407-1420.
Johnson LA, Welch GR, (1999). Sex preselection: High-speed flow cytometric
sorting of X and Y sperm for maximum efficiency. Theriogenology. 52: 1323-
1334.
 141

12. IN-VTRO FERTLZASYON VE EMRRYO GELTRME

Memeli hayvanlarn ovaryumlar binlerce primordial folikl ierir. Bu folikller
in-vitro ortamda embriyo gelitirmek iin kaynaktr. Bu konuda ilk alma 1971
ylnda Ryle tarafndan rapor edildi. Ryle; in-vitro koullarda fare folikllerini
bytmeyi salad. O zamanlar; Rylenin bu almas kltr ortamnda folikl
geliiminin mmkn olabileceinin gstergesiydi. Kemirgen hayvanlarn
folikllerinden ayrlan oositlerin kltrde olgulatrlmas, dllenmesi, embiryo
geliiminin salanmas ve canl bireyin doumu ayn tekniin iftlik hayvanlar
iin de uygulanabilirliini gndeme getirdi (Telfer, 1998).
1976 ylnda yaplan folikl kltrnde (yeterli oksijen, gonadotrophin
ve oestradiol-17 nn bulunduu bir ortamda) gelitirilen koyun folikllerinden
elde edilen yumurtalar olgunlatrlarak nceden insemine edilmi koyunlarn
reme kanalna transfer edildi. Bu transfer sonunda normal yavrular elde edildi
(Cran ve ark., 1976; Moor ve Trounson 1977). Takip eden almalar kltrde
folikl geliimini etkileyen faktrleri belirlemek iin daha ok ilgili hcre
kltrleri zerinde younlat. Sonu olarak ovaryumlardaki primordial
folikllerin in-vitro koullarda Graaf folikller haline gelmelerini salayacak
deiik metotlar gelitirildi (Nayudu et al., 1990; Boland et al., 1991; Nayudu
and Osborn, 1992; Hardstone and Clark, 1992, Boland et al., 1993).
Gnmzde in-vitro koullarda embriyo gelitirmeye ynelik tekniklerin
baars: Pre-antral veya antral folikllerden ayrlan oositlerin olgunlamasn,
spermlerin normal dlleme kabiliyetini, oosit dllenmesini ve embriyonun
gelierek transfer edilebilir hale gelmesini salayan kltr ortamnn
formlasyonuna ve rutin embriyo transferi iin pratik ve standart protokollerin
gelitirilmesine baldr (Hafez,1993).
Kltr ortamnda oosit bymesini, farkllamasn kontrol eden
faktrlerin tespiti ve analizi zor bir konudur. n-vitro koullarda oosit
bymesini salayan ortamn oluturulmas oosit bymesini kontrol eden bu
faktrleri belirlemeye ve kltr ortamnda oosit retimi iin gerekli teknolojinin
oluturulmasna yardm eder.

12.1. In-vitro koullarda embrio elde etmenin hayvanclktaki nemi

Kltrde oosit olgunlatrma iinde en uygun materyal kaynan kesimhaneler
oluturur. Bu ekilde yeteri kadar ucuz matereyal salamak mmkndr (Nandi
et al.,2002). Kesimhanelerden salanan ovaryumlardan karlan oositlerin
kltre alnmasyla yksek sayda evcil hayvan embriyosu retmek mmkn
(Armstrong ve ark., 1997).
 142

Embriyo retimi iin uygun In-vitro koullarn oluturulmas ve embriyo retimi

bize iftlik hayvanlarnn projenisini kontrol altna alma imkan sunar (Berg ve
ark., 2002). nk hem diinin hem de erkein kimlii ve genetik potansiyeli
bilinir sonuta planl olarak kontrol altnda birletirilir. Bu teknik; ekonomik
deeri olan yeni genetik kombinasyonlar (hibritleri) da elde etmek asndan
nemlidir (Wani ve ark., 2000). nk trler aras hibrididizasyonun baars
ok dktr. Bu baarszlk ounlukla fertilizasyon ve embiryo blnmesi
srasnda grlmektedir. Bu durum; kullanl in-vitro fertilizasyon protokolleri
sayesinde zlebilmektedir (Bazer ve ark., 1993).
n vitro koullarda embriyo retimi ve transferi suni tohumlama gibi
hayvanlarn reme etkinliini artrmaya ynelik nemli bir biotekniktir. Bu
teknik yardmyla genetik deeri yksek olan hayvanlardan etkin ekilde
yararlanmak mmkndr (Hafez, 1993). nk bu teknik yardmyla
hayvanlardan bir reme ylnda ok sayda yumurta elde edilebilir ve bu
yumurtalar cansz ortamda olgunlatrldktan sonra belirli bir erkee ait
spermle dllenmesi sonucu oluan embriyo tayclara transfer edilip verim
gc yksek hayvanlarn says artrlabilir (Staigmiller ve Moor, 1984;
Armstrong ve ark., 1994, Wani ve ark., 2000). Embriyolardan blastomerler
mikro maniplasyonla ayrlarak tek yumurta ikizleri oluturulabilir. Embriyoyu
ikiye blmek ile elde edilen embriyolarn fetse dnm drde blme ile elde
edilenlerden ok yksektir (Arthur ve ark., 1996). Bu metotla koyunda drt,
srdan , ve attan is iki tane tek yumurta ikizi) elde edilmitir (Arthur ve ark.,
 143

1996). Bu ekilde bir hayvandan olduka fazla yavru elde etme imkan doar;
sonu olarak generasyonlar aras sre ksalr ve sr ierisindeki yksek verimli
varyantlarn says artar (Berg ve ark., 2002). Ayrca doal afetler ve hastalklar
sonucu kaybedilme tehlikesi olan genetik materyallerden yararlanma imkn
doar. nk bu hayvanlarn testisleri ve yumurtalklar kltrde kullanlmak
zere alnr ve sunucunda o hayvanlara ait embriyolar retilerek bu genetik
kayp nlenir.
n vivo koullarda; bir hayvandan salanan progeni saysn, o hayvan
periyodik olarak gebe brakp sonra embriyolarn alp uygun taycya transfer
etmek yolu ile artrmak mmkn. Bu ekilde embriyo transferi zerine alan
ticari irketler: Australia da, Arjantin de, Kanada da, Yeni Zelanda da, ABD de,
ve dier avrupa lkelerinde 1970 den beri faaliyet gsteriyorlar (Hafez, 1993).
Fazlaca retilen embriyolar bilimsel aratrmalarda (rnein; embriyoda
cinsiyet tayininde, gen enjeksiyonunda ve klonlamada) kullanlabilir.
Gnmzde genetik hastalklar ( rnegin: cycstic fibrosis, Hemofili ve dier
benzer hastalklar) embriyonik safhada tespit edilmektedir. Embriyonun 4
hcreli safhasna gelmesinden itibaren herhangi bir blastomerinin
mikromaniplasyonla alnp ve analiz edilmesi sonucu genetik hastalklar tespit
edilir.
12.2. In-vitro ortamnda oosit olgunlatrmann, fertilizasyonun ve emnbiyo
geliiminin salanmas
Kltr ortamndaki bir oositin profaz-I safhasndan metefaz-II safhasna
gecmesine oosit olgunlamas denir (Resim 26.2.1.). Yeni doan bir hayvanda
tm oositler profaz-I safhasndadr. lk kzgnlk dnemiyle salanan oosit
olgunlamas endokrin (Hipotalamus, hipofiz ve ovaryumlardan salglanan
hormonlar) ile parakrin ve autokrin gibi folikler dzeyde sentezlenen
faktrlerin etkisi altndadr (Hafez, 1993). Bu faktrler gonadotropinler (FSH,
LH hMG, PMSG, hCG), steroidler (Oestradiol-17, progesterone ve
testosterone) ve lokal olarak ovaryumlar tarafndan sentezlenen hormonlardr
(IGF, EGF, TGF, inhibin ve aktivin) (Dode ve Graves, 2002). Oositler ilk
ovulasyon ncesi gonadotropin salgsn mteakip olgulamaya balar.
Ovulasyon esnasnda koyun ve kei oositleri metefaz-II safhasnda iken atta ve
domuzda profaz-II safhasndadr (Hafez, 1993). Ovulasyon ncesi LH salgs
oositi evreleyen granulosa hcreleri tarafndan saglanan ve mayozun tekrar
balamasn engelleyen hormonlarn etkisini yok eder ve oosit olgulamaya
balar. Bylece, in vivo ortamda LH oositlerin potansiyel dllenmeye hazr hale
gelmesini salar (Richard et al., 1990). Eer oositler granuloza hcreleri ile
birlikle veya folikl ile intakt halde kltre alnrsa mayoz balamaz. Bunun
nedeni, belirtildii gibi, granuloza hcreleri maturasyonu veya mayozu durduran
faktr salglar. Bu faktr (Mayozu Durduran Faktr, Meiosis Inhibiting
Substance, MIS) bir plipeptittir, kltrde oositlerin olgulamasn engeller
(Downs and Eppig, 1984).
 144

Resim 12.2.1.Preantral folikllerdeki oositler mayoz blnmenin Profaz-Inin diploten

safhasndadrlar. Bu safhada nkleer materyal karyolemma trafndan saldr ksaca oosit
nkleer vezikl safhasndadr (a). Olgunlama balad zaman kromozomlarda
younlamalar grlr, germinal vezikl paralanr ve tamamen dalr. Bylece oosit
metafazI e gemeye balar (b). Sonra sentrioller kutuplara gider mikrotbller
kromozomlara balanr hcre zarna dik sipindil oluturmuturlar. Bu safha ge metefaz-I
safhasdr (c). ekirdekik daha sonra AnafazI ve telofazI geer ve blnr. Bu blnmenin
sonunda bir polar cisim ile bir dii pronkleus oluur. Bu polar cisim (p) oositin previtellin
ksmnda bir knt eklinde grlr (d). Bu durumda oosit Metefaz-II safhasndadr ve
dllenmeye hazrdr.
 145

Dllenmenin salanmasndan sonra ikinci bir polar cisim ve dii pronkleusa

ilave olarak bir erkek pronkleus daha oluur. Sonra embriyo gelierek blastosit
safhasna kadar gelir ve zona zarndan dar kar ( Resim 12.2.2.).

b Resim 12.2.2. Uygun bir spermle oositin dllenmesi

(a) sonucu ikinci bir polar cisim ve pronkleus oluur
(b). Bu aamadan sonra zigot blnmeye balayarak
blastosit aamasna gelir(e). Sonra zona zarndan
uterusa tutunmak zere ayrlr (g,).
d e f g
c
) ) ) )
)

Gnmze kadar degiik kltr ortamlar oosit olgunlatrma iin kullanla

gelmitir. nceleri; kltr ortam olarak serum ihtiva eden basit tuz zeltileri
kullanlm daha sonra bu tuz zeltilerinin yerini bikarbonat veya fosfat ihtiva
eden kopleks doku kltr ortamlar almtr (Moor and Trounson, 1977).
Zamanla in vitro kltr konusunda salanan gelimeler dorultusunda kltr
ortamna ilave olarak kullanlan serumun yerini %2-3 sgr serum albumini veya
%10-20 koyun serum albumini almtr. Bu ekilde oluturulan kltr
ortamlarnn ozmolaritesi 300mOSm ve pH 7,27,6 ivarnda belirlenmitir.
In vitro maturasyon ve fertilizasyon iin protein kayna olarak kullanlan
serumun bymeyi salayan mitogenik faktrler ierdigi; bu nedenle
embriyonun geliimini etkileyebilecei bildirildi (Brown ve Radzevic, 1998).
Gnmzde serum ilavesi yaplm kltr ortamlarndan salanan embriyolarn
ar bymesi sonucu doum glklerinin olduu bilinmektedir fakat bu her
zaman geerli deildir. Ayni ekilde kltrde kullanlan bikarbonat zeltilerinin
yerini fosfat zeltileri almtr. nk fosfat baffrnnn pHsn sabit bir
seviyede tutmak iin karbondioksit ve oksijenin gereken seviyede ve srekli
mevcut bulunmasna gerek yoktur.
Gnmzde oosit olgunlatrmak iin kullanlan kltr ortamlarna
genelde gonadotrophin olarak FSH ve LH; steroid olarak da oestradiol17
ilavesi yaplmaktadr. Bu ekilde kltr ortamna gonadotropinler ile birlikte
 146

oestradiol ilavesi oosit olgunlamasn salad ve takiben dllenmeye ve

embrio geliimine olumlu ynde etki yapt savunuluyor (Moor ve Trounson
1977; Hafez, 1993). n-vitro maturasyon, fertilizasyon ve embriyo gelitirme
iin deiik kltr ortamlar kullanlabilir. Kltre alma ii; scakln 37-38C
olduu, %5O2, %5CO2 ve %90 N2 gazlarnn mevcut bulunduu inkbator
ierisinde test tplerinde veya mikro miktarlarda (ortalama 25l) kltr ortam
eklenen zel kltr kaplarnda parafin ya kullanlarak veya kullanmadan
yaplr (Steirghem ve ark., 1996).
12.3. lm hayvanlardan sperm alma
Kesimhaneden semen salamak iin kesilmi hayvanlarn testisleri kaynak
olarak kullanlr. Kesilen hayvanlarn epididiymislerinden veya testisteki
seminiferous tplerinin herhangi bir yerinden alnabilir.

Resim 12.3.1. Kaput ve korpus

epididymisde spermler olgunlaarak
kaudalepididymisde depolanrlar.
Depolanan spermler kaudal
epididiymisin ve vas deferensin
kaslmas sonucu da doru
itiler.kesimden sonra kaudal
epididiymisten spermler alnabilir.

Kaudal epididymisde depolanan spermler testis parankimasndaki seminiferous

tpleri ierisinde retilirler (Resim 12.3.2.).
 147

a b

.3

.2 d

.7
c 7

.4

.5 .6

Resim 12.3.2.Testiste sperm retimi endokrin faktrlerle inter ve intra tbler dzeyde
sentezlenen parakrin veya autokrin faktrlerin kontrol altindadr. Spermatogoniumlar
embiryonik gelime esnasnda endodermden orjin alr ve sonra genital kntlara yerleirler.
Mitozla oalp srasyla A, nt ve B spermatogonium lar oluturlar. B spermatogoniumlar
mayoza geie hazrlanarak primer spermatozitleri (Pro-leptoten) olutorurlar (c4) .
Proleptoten spermatozitler srasyla Leptoten, zigoten, diploten ve diyakinez amasna gelip
skonder spermatozitleri oluturur (c5). Oluan sekonder spermatozitler ikinci mayoza girerek
spermatidleri oluturur (c6). Daha sonra spermatidler elongasyona balayrak adlumnal
ksma doru itilirler (d7). Sonunda lmene geip efferens kanalyla epdidymse geerler.
Spermlere seminiferous tpler ierisindeki sertoli hcreleri (d8) yataklk eder. Sertoli
hcrelerinin ve spermlerin fonksiyonu miyoid hcrelerin ile intestinal dokuda bulunan
Leydik hcreleri(b3), mezenim hcreleri, fibroblastlarin ve dier hcrelerden salglanan
salglarn etkisi altndadr.
 148

12.3.1. Semen ykama

Semen ykamann amac spermleri seminal plazmadan ve motilitesi yksek canl
spermleri anormal spermlerden ayrmaktr. Seminal plazma sperm
kapasitasyonunu olumsuz ynde etkiler. n vitro ortamda sperm kapasiteletirme
ve dlleme ileminden nce hareketli ve morfolojik yaps iyi olan spermler
anormal ekilli, zayf hareketli veya l spermlerden ayrt edilmelidir k bu
spermlerin dlleme g dktr.

12.3.1.1. Semen ykama ekilleri: Semenin ykanma ekli semen rneinin zel
durumuna gre deiir. Ykama ii genelde ekilde yaplr:
a)Yukari yzme metodu (Swim up): Ykanacak semen uygun bir tp ierisine
konur ve zerine bafr eklenir. Sonra inkbatorda 1 saat bekletilir bu sre
zarfnda hareketli ve salkl spermler yukar doru yzer iken anormal ve l
spermler yabanc maddelerle birlikte altta kalr. sten salkl spermler alnarak
kapasitasyona tabi tutulur. Bu metot; normal semen rnekleri iin uygundur,
ar akc, yksek oranda olgunlamam spermler ile yabanc maddeler ieren
semen iim nerilmez.

b) Deiik younluktaki perkolden geirerek ykama: Bir tpn ierisine iki

deiik younlukta perkol konur ve bu iki tabakann zerine semen eklenerek
santrifj yaplr. Santrifj srasnda normal ve hareketli spermler perkol
tabakalarn geerek altta toplanr. l ve anormal spermler ise perkol tarafndan
tutulur. Bu metot; sperm says ve motilitesi normal olup vizkositesi ar yksek
ve fazla miktarda olgunlamam spermlerle birlikte yabanc maddeler ieren
semen rnekleri iin uygundur.

c) Sanrifjle ykama metodu; Semen rneine bafr eklenerek santrifj

yaplr. Sanrifj sonucu tpn altndaki pellete istenilen sperm konsantrasyonuna
gre bafr eklenir ve spermler kapasitasyona braklr. Bu metot sperm says ve
motilitesi dk semen rnekleri iin uygundur. Olgulamam spermler ve
yabanc maddeler ieren semen rnekleri iin uygun deildir.

12.3.2. Semendaki anormal ekilli ve ol spemlerin tespit edilmesi

Semen rneinde bulunan anormal ve l spermlerin oran semenin kalitesini
belirler. Sperm anormallikleri; akrosom anormalliklei, ba anormallikleri, ba ve
kuyruk aras anormallikleri ve kuyruk anormallikleri eklinde grlr (Resim
12.3.2.1; 12.3.2.2; 12.3.2.3; 12.3.2.4) Anormal spermler, dllenme orann
drr ve hatta embriyonun geliimini olumsuz etkileyebilir.
 149

a b c d

Resim 12.3.2.1.Normal spermler oval ekilli ba yapsna sahiptirler (a). Baz spermlerin
ise ba ksmlarnn kuyruk ksmna baland yer dar iken ba akrozoma doru ar
derecede genileyerek armudu andrr. Bu spermler armut kafaldrlar (b,c).Kkbal
sperm (d).

Stoplazmik kntlar spermlerin olgunlamadnn gstergesidir. Resimlerde

grlen anormal spermlerin dlleme g yoktur. Bu spermlerin ykama yoluyla
semenden ayrlmas gerekir

d e f g

Resim 12.3.2.2. Bir ejagulatta her trl morfolojik anormallii grmek mmkn. Akrozom
yok (d). Akrozom yok ayn zamanda nkleer membran balon gibi knt yapm (e). ift
bal sperm ayn zamanda orta ksm anormallii de tayor (f). Uzun kafal sperm ayrca
orta ksm anormallii var (g).
 150

h i j k

Resim 12.3.2.3. Yapk kuyruk (stamp tail (h); Sadece kafa (detached head) (i);
Kuyruk orta ksmda dm yapm (Dag problemi)(j,k).
 151

l m n

o p r s

t u v y z

Resim 12.3.2.4. Spermlerde grlen baz orta ksm ve kuyruk anormallikleri.

Orta ksm anormallii (l,m); Katlanm kuyruk (n,t,u); Kuyruun bir ksm
kopmu (o); Yzk eklinde kvrlm kuyruk(p,r); st ste katlanm kuyruk (s);
Dag problemi (v;y); Sadece kuyruk (z).
 152

12.4. Kltr ortamnda spermlere dlleme yetenei kazandrma

(Sperm kapasiteletirme)
Kapasitasyon ilemi: Spermin epididiymisden gemesi ve seminal plazmayla
karmas srasnda spermin kazand gliko-proteinden oluan klfn ayrlmas,
sperm sitoplzmasnda kolesterol konsantrasyonun artmas sonucu sperm zarnn
kalsiyum iyonununa kar permabilitesinin artmas gibi deimeleri ierir. Bu
nedenle diinin reme kanalnda; spermin yumurtay dllemesinden nce
spermlerde bu biyokimyasal ve biyofiziksel deimelerin tamamlanmas gerekir.
Belli bir sre sonra bu deimeler tamamlanr ve sperm yumurta zarn delme
yetenei kazanr. Bu deimeler sreci kapasitasyon olarak tanmlanr. Ksaca
kapasitasyon; spermin yumurtay dlleme yetenei kazanmasdr.
In-vitro ortamda dllenmenin salamas iin sperm kapasitasyonun
salanmas arttr. Gemite in-viro fertilizasyon konusunda yaplan deneyler
baarsz olmutur nk spermlerin kapasitasyonu salanmadan yumurtalar
dllenmeye allmtr. Kltrde sperm kapasitasyonu iin kullanlan kltr
ortam aratrmacnn tercihine ve dier aratrclarn tavsiyelerine gre
belirlenir. Kapasitasyon ortamna kapasitasyona yardmc ilaveler yaplr bu
ilaveler: Heparin/Kafein, Hypotaurine, sr serum albumini veya serum (BSA /
Serum) ve kalsiyum ionofordur. Bu ilavelerin yapld kltr ortamnda
spermler kapasitemek zere scakln 38.5C, pH n 7.4, ozmolaritenn 274-
320mOSm, havadaki karbondioksitin % 5CO2 olduu bir ortamda 4560 dakika
inkbasyona tabi tutulur. Bu sre sonunda spermler In-vitro fertilizasyona hazr
hale gelir (Izquierdo et al., 1998).

12.4.1. Kltr ortamnda dlleme (in-vitro fertilizasyon)

n-vitro fertilizasyon ilk olarak, tavann reme kanalnda kapasitemi spermle
tavana ait oositin kltrde dllenmesi ile saland (Dauzier et al., 1954;
Thibault ve Dauzier 1960; 1961). Daha sonra in-vitro fertilizasyon metodunun
iftlik hayvanlar zerinde kullanm gndeme geldi ve Wringht ve Bondioli
1981 de bu konuya youn dikkat verdiler.
In-vitro fertlizasyon insanda baz bilinen ksrlklarn giderilmesinde ie
yarayan nemli bir tekniktir. Bu teknik insanda 1978 de kullanlamaya baland
ve 39 yldr baarl bir ekilde kullanlyor. O zamandan bu zamana kadar in-
vitro fertilizasyon konusundaki prensiplerde ve kltr ortamnda fazla bir
deiiklik olmad sadece optimum dllenmeyi ve embriyo geliimini salamak
iin evre artlarnda dzeltmelere gidildi. rnein; mikrobial bulamay
nlemek iin iyi kontrol edilen steril evre koullar oluturuldu. Bu teknik
insanlarda bilinen kesin ksrlklar nlemede dier tedavi metotlarnn baarsz
ve mmkn olmad durumlarda kullanlmaktadr.
 153

Uterus tplerine gamet transferinde veya zigot transferinde baar tplerin

normal fizyolojide olup olmamasna baldr. Gnmzde in-vitro
fertilizasyondaki baary artrmak iin oosite direkt sperm enjeksiyonu
yaplmaktadr (Resim 12.4.1.1) ve sperm kalitesi dk olan atlardan yavru elde
edebilmek iin bu yntem nerilmektedir. Bu teknik yardmyla ilk embriyo
1992 elde edildi. Oluturulan embriyonun taycya nakli sonucu ilk gebelik ve
doum saland. Ayrca srda ve tavanda baaryla uygulanp normal yavrular
elde edildi ( Steirteghem ve ark., 1996).

Resim 12.4.1.1; Resimde mikro

maniplatr yardimiyla yumutaya
sperm injeksiyomu yaplyor.
Yumurta mkropipet trafndan
vakum yardmyla tutuluyor iken
dier bir pipetle intra-stoplazmik
sperm injeksiyonu yaplamaya
aliilyor. Bu teknk yumurtaya
veya spermaya bal birtakm
ksrlklar nlemek bakmndan
nem tair.

Spermlerde kapsitasyon salandktan sonra polar cisim ve pronkleus

ihtiva eden oositlerin bulunduu ortama final sperm konsantrasyonu 100.000
200.000 sperm/ml olacak ekil de sperm ilave edilerek inseminasyon yaplr.
anli ortamda spermin oositi dllemesi en az 4 saat alr, bu sre kltrde 1618
saat olmaldr. Fertilizasyonu artrmak iin kltr ortamna hipotaurin, heparin
ve serum albumini veya serum gibi ilaveler yaplr. Bu sre sonunda dllenmeyi
tespit etmek iin yumurtay eviren kmulus hcreleri fiziksel olarak veya
hiyolorinidaz eklenerek pipetle 12 dakika fula yaplarak ksmen ayrlr.
Bylece polar cisimleri ve pronleuslar daha belirgin grmek mmkndr.
Ayrca spermlerin dlleme gcn artrmak iin kmulus hcreleri dllenmeden
nce de ayrlabilir. Polar cisimlerin tespiti iin floresan boya ile oositler boyanr
ve floresan mikroskupu kullanlarak 200X magnifikasyonda tespit edilir.
Dllenmeden 24 saat sonra embiryonk gelimeyi izlemek iin oositler normal
k mikroskop altnda 200X magnifikasyonda incelenir.

12.5. Embrio kltr

Embriyo kltr iin enfazla kullanlan ortam; HEPES ile baffrlanm TCM-
199 dur. Bu ortam Wang ve Niwa, (1997); Izquierdo ve ark., (1998) tarafndan
kullanlmtr. Protein kayna olarak embriyo kltrne koyun serumu
( Murzamadiev ve ark., 1983), BSA ( Gardner ve ark., 1994) ya da insan
serumu (Walker ve ark., 1992) ilave edilmitir. Embriyo kltrne gelimeyi
artrnak iin eklenmesi nerlen maddeler (mg/ml): 0.55mg/ml sodyum piruvat,
 154

146 mg/ml L-Glutamin, 4mg/ml BSA, 0.05 mg/ml gentamisin ve 0.05mg/ml

streptomisin slfat dr.

Kaynaklar
Atrhur GH., Noakes DE., Pearson H. Ve Parkinson T.J., (1996). Embryo transfer in large
domestic animals. In: veterinary reproductiom and obstetrics, Seventh ed., Saunders, Chap
34, p 690.

P. Barahona, F. Saravia, A. Santa Mara, M. Briones and Cox J. F. ,(1997) Effect of

oviductal secretions and cells on fertilizing ability of goat spermatozoa in vitro,
Theriogenology, 47(1) p 331.

Bazer FW, Geisert RD,and Zavy MT (1993) Fertilization, cleavage and implantation.
Reproduction in farm animal, 6.Bask, editr; ESE Hafez, 8. Bolm, sayfa 194.

Boland NI, Humpherson PG, Leese HJ and Gosden RG (1991) Carbohydrate metabolism
by mouse ovarian follicles. Journal of Reproduction and Fertility, Abstract series 8 (5).

Boland NI, Humpherson PG, Leese HJ and Gosden RG (1993) Pattern of lactate
production and steroidogenesis during growth and maturation of mouse ovarian follicles in
vitro. Biology of Reproduction 48 798-806.

Crosby et al., (1971) Culture and fertilization of sheep ovarian oocytes: observation on sperm
penetration in oocytes transfered to the sheep oviduct. Journal of Agricultural science 76
379.

Dauzier L., Thibault C. And Wintenberger S., (1954) La fecontation in- vitro de Ioeuf de
la lapine. C.R.. Acedemic Science., Paris, 238 844-845.

Dode MA and Graves C., (2002) Involvement of steroid hormones on in vitro maturation of
pig oocytes. Theriogenology 57(2) 811-821.

Downs S.M. and Eppig J.J.,(1984) Cyclic adenosine monophosphate and ovarian follcular
fluid act synergistically to inhibit Mouse oocyte maturation. Endocrinology 114 217-418.

Gali C. and Moor R. M., (1991) Gonadotrophin requirement for the n-vitro maturation of
sheep oocytes and their subsequent embryonic development. Theriogenology 35 1083-1093.

Gardner et al., (1994) Enhanced rates of cleavage and development for sheep zygotes
cultured to the blastocytes stage in-vitro in the absence of serum and somatic cells: amino
acids, vitamins and culturing embryos in groups stimulate development. Biology of
Reproduction 50 390-400.

Gutierrez et al., (1993) Ram spematozoa co-cultured with epithelial cell monolayers: an in-
vitro model for the study of capacitation and acrosome reaction. Mollecular Reproduction

Fortune JE (1994) Ovarian follicular growth and development in mammals. Biology of

Reproduction 50 225-232.
 155

Hafez ESE (1993) Asisted reproductive technology:Ovularion manipulation, n-vitro

fertilization/ Embryo transfer (IVF/ET)., Reproduction in farm animal, 6.Bask, editr; ESE
Hafez, 23. Bolm, pp 461-498.

Hillensjo T (1976) Oocyte maturation and glycolysis in isolated preovulatory follicles of

PMS-injected immature rats Acta Endocrinologica 82 352-359.

Izquierdo et al., (1998) Effect of sperm capacitation and fertilization media on IVF and early
embryo development of prepubertal goat oocytes. Theriogenology 49 1501-1513.

Nagai T., and Moor R.M., (1990) Effect of oviduct cells on the incidence of polyspermy in
pig eggs fertilized in-vitro. Mollecular Reproduction and Development 26 377-382.

Nandi S., Ravindranatha B. M. ,. Gupta P. S. P and Sarma P. V., (2002) Timing of

sequential changes in cumulus cells and first polar body extrusion during in vitro maturation
of buffalo oocytes. Theriogenology 57 (3) 1151-1159.

Nayudu PL and Osborn SM (1992) Factors influencing the rate of preantral and antral
growth of mouse ovarian follicles in vitro. Journal of Reproduction and fertility 95 349-
362 .

Mariana JC, Monniaux D, Draincourt MA and Mauleon P (1991) Folliculogenesis. In

Reproduction in domestic animal. 4th ed., Chapter 4 p119-171, Edited by PT Cupps,
Academic press, San Diego.

McNeilly AS, Picton HM, Campbell BK and Baird DT (1991) Gonadotrophic control of
follicle growth in the ewe. Journal of Reproduction and Fertility, Supplement 43 177-186

Moor RM and Trounson AO (1977) Hormonal and follicular factors affecting maturation of
sheep oocytes in vitro and their subsequent developmental capacity. Journal of
Reproduction and Fertility, 49(1) 101-109.

Murzamadiev et al., (1983) Effect of sheep serum obtained at different stage of oestrous
cycle on the maturation of oocytes in intact follicles. Izvestiya-Akedemii-Nauk-kazarhskoi-
Ssr-Sriya-Biologicheskaya 4, Abs. 67-70.

Ledda S, Bogliolo L, Leoni G, Naitana S. ,(1999) Production and lambing rate of

blastocysts derived from in vitro matured oocytes after gonadotropin treatment of
prepubertal ewes. Journal of Anim Science, 77(8) 2234-2239.

Lee, Y L; Lee, K F; Xu, J S; Wang, Y L; Tsao, S W and Yeung, W S, (2001) Establishment

and characterization of an immortalized human oviductal cell line. Mol. Reprod. Dev. 59
400-409.
 156

O'Brien JK, Beck NF, Maxwell WM, Evans G., (1997) Effect of hormone pre-treatment of
prepubertal sheep on the production and developmental capacity of oocytes in vitro and in
vivo.Reproduction Fertility and Development 9(6) 625-31.

Pollard et al., (1991) Fretilizing capacity of bovine sperm may be maintained bu binding to
oviductal epithelial cells. Biology of Reproduction 44 102-107.

Richard et al., (1990) Mechanism of ovulaton. In: Gamet physiology. Chap. 13th. Serono
symposia, Norwell, Masachusetts, USA pp 167-168.

Ryle M (1971a) The time factor in responses to pituitary gonadotrophins by mouse ovaries in
vitro. Journal of Reproduction and Fertility 25 61-74
Ryle M. (1971b) The activity of human follicle stimilating hormone preparations aas
measured by a response in vitro. Journal of Reproduction and Fertility 51 97-107

Scaramuzzi RJ, Adams NR, Baird DT, Campbell BK, Downing JA, Findlay JK,
Henderson KM, Martin GB, McNatty KP, McNeilly AS and Tsonis CG (1993) A model
for follicle selection and the determination of ovulation rate in the ewe. Reproduction
Fertility and Development 5 459-478.

Steirteghem AV; Liebaers I ve Devro P., (1996) Assisted reproduction. In: Scientific
essentials of reproductive mediciine. Editors: SG Hillier, HC Kitchener; JP Neilson. WB
Sounders Company Ltd., Chapter 2.11, p 232.

Suarez et al., (1991) Attachment of boar sperm to mucosal explants of oviduct in-vitro:
possible role in formation of a sperm reservoir. Biology of Reproduction 44 998-1004.

Sun T; Lei Z M; Rao C V, (1997) A novel regulation of the oviductal glycoprotein gene
expression by luteinizing hormone in bovine tubal epithelial cells. Molecular and Cellular
Endocrinology 131 (1) 97-108.

Telfer EE., (1998) In-vitro models for oocyte development. Theriogenology 49 451-460.

Thihault C. and Dauzier I., (1960) Fertlisines et fecondation in-vitro de Ioeuf de la lapine.
C.R. Acedemic Science (Paris) 250 1358-1359.

Thihault C. and Dauzier I., (1961) Analyse des conditions de la fecondation in-vitrode
Ioeuf de la lapine. Ann. Biol. Anim. Biochim. Biophys. 1. 227-294.

Walker et al., (1992) In-vitro culture of sheep embryos without co-culture:success and
perspectives Therriogenology 37 11-126.

Wang W-H and Niwa K., (1997) Transformation of sperm nuclei into metaphase
chromosomes in maturing pig oocytes penetrated in-viro. Zygote 5 (2) 183-192.

Van den Hurk R, Bevers MM and Beckers JF (1996) In-vivo and in-vitro development of
preantral follicles. Theriogenology 47 73-82
 157

12.5.1. Embrio transferi

Embriyo transferi teriminin ilk zamanlardaki anlam: Donor hayvandan alnan
embrionun resepient hayvann uterus tpne transfer edilmesiydi. Gnmzde
embrio transferi terimi bu teknikle balantl dier teknikleri (rnein; sper
ovulasyonu, embrio karyoprezervasyonunu ve kltrde embriyo zerinde
yaplan mikromuameleleri) de kapsamaktadr.
lk embryo transferi 1891 tarihinde Heape tarafndan tavanda yapld.
Bunu takiben iftlik hayvanlarnda kullanlmaya baland. Warwick ve Berry,
1949 ylnda embriyo transfer tekniini kullanarak ilk kuzuyu elde etmeyi
baardlar. Daha sonra willett ve arkadalar 1951 de embriyo transferi ile ilk
buzay elde ettiler. Bunu takiben embrio transferi hayvanlarn (rnein; at,
sr, koyun, kei ve domuzlarn) reme etkinliini artrmak iin baarl olarak
kullanlmtr. Sonra bu tekniin hayvan slah programnda kollanlmas
dorultusunda youn aratrmalar yaplmtr (Rowson ve ark., 1969).
Embrio transferi youn olarak srlar iin kullanlm ve bu nedenle
tekniin srlkta uygulanmasnda hzl gelimeler salanmtr. ngilterede ve
kuzey amerikada ithal edilmi yksek verimli et srlarnn saysn artrmak
amacyla; ithal edilmi hayvanlarn embriolar laparotomi yntemi ile alnarak
transfer edilmitir. Zamanla hayvandan embrio alma ve transfer etme ii hayvan
zerinde operasyon yaplmadan salanm ve alnan embriolarn dondurularak
saklama teknikleri gelitirilmitir. Embrio transferi yoluyla salanan ekonomik
avantajlar st ve et srclnn dikkatini ekmitir. Bu sektrler tarafndan
embrio transferi yapan servislere ka talep ar derecede artmtr.
Gnmzde gelimekte olan lkeler; hayvancln gelitirmek iin
damzlk ithal etme yerine dondurulmu embriolar ithal etmektedirler.
Dondurulan embriolarn veya semenlerin devletler ve ktalar aras ticari
mubadelesi yaplmaktadr.

12.5.1.1. Embriyo transferinin hayvanclktaki nemi

Srclkta embrio transfer tekniinin younluk kazanmasnn amac suni
tohumlama ile salanan genetik ilerlemeyi daha hzlandrmak iindir. Canl
damzlk hayvanlarn lkeler aras ticareti pahal ve zor bir itir. Damzlk yerine
genetik potansiyeli yksek embrio ithal etmek ucuz ve kolaydr. Ayrca ithal
edilen embriolardan oluan hayvanlar bulunduklar lkenin evre artlarna daha
iyi uyum salarlar. Embrio transferi sayesinde verimli olaca dnlen yeni
rklarn srye kazandrlmas mmkndr. Bu yeni rklarla yerli hayvanlarn
aprazlanmas sonucu ile elde edilen hayvanlar evre artlarna daha iyi uyarlar.
Embriyo transferi ile sper verimli hayvanlar periyodik olarak dllendirilir ve
alnan embriyolar dier tayclara transfer edilir. Ayrca embriyolardan
blastomerler mikro maniplasyonla ayrlarak tek yumurta ikizleri oluturulabilir
(Arthur ve ark., 1996). Bu teknik ile yksek verimli elit hayvanlarnn sr
ierisindeki says artar ve generasyon ars sre ksalr. Sonu olarak gen
verimli stok elde edilir.
 158

Verimli hayvanlardan alnan oositlerin kltrde kontroll olarak

dllendirilmesi ile daha ucuz embriyo elde etme imkn domutur. Kesilen et
srlarna ait oositlerin kltrde dllendirilmesi sonucu elde edilen embriolar
st srlarn et srlar ile deitirmek isteyen iletmelere satlmaktadr.
Hastalklardan veya doal afetlerden dolay len verimli hayvanlarn
ovaryumlarndaki oositlerin alnp kltrde dllendirilmesi sonucu elde edilen
embriyolar alc hayvanlara transfer edilerek muhtemel bir genetik kayp
nlenmi olur. Bu ekilde salanan yarar multipi ovulasyon ve embriyo transferi
metoduyla salanan ilerlemeden daha fazladr.

12.5.1.2. Multipi ovulasyon ve embrio transferi (MOET)

Bu metot 1983 ylnda Nicholas ve Smith tarafndan dnld. Teknik;
kzgnlk kontrol, sperovulasyon, suni tohumlama, uterustan embriyo alma ve
transferi gibi teknikleri ierir. Pratik olarak st srclnda et srclnda ve
koyunculukta kullanlmaktadr.
Hayvanlardan doal ovulasyondan sonra tek embrio almak pratiktir fakat
genetik potansiyeli yksek hayvanlardan etkin yararlanmak, generasyonlar aras
sreyi azaltmak ve daha ucuz embrio elde edebilmek iin hayvanlarda sper
ovulasyon salanmaya allr. Sperovulasyon ve suni tohumlama ileminden
sonra uterusdan emriyolar alnr. Bu ilem belli zaman aralklar ile tekrarlanr
ve sonunda tek bir hayvandan ok sayda embriyo elde edilir. Bu metot
hayvanlarn tek bir saf rka mensup elit hayvanlardan oluturmak isteyen
iletmeler tarafndan daha ok tercih edilmektedir. Bu metotta belli ineklere
hormonlarla sper ovulasyon yaptrlr sonra bu inekler belli hayvanlara ait
semenle suni olarak insemine edilirler. Suni tohumlama sonucu elde edilen
emriyolar tayclara transfer edilir.

12.5.1.2.1. Donor ve resepient hayvann reme kanallarnn ayn safhada

olmasn salama
Srda kzgnlk (oestrus) periyodu 20 gndr bu 20 gnn 17 gn luteal safha
3 gn ise folikler safhadr. Koyunlarda ise oesrus periyodu 17 gndr bunun
14 gn lteal safha 3 gn ise folkler safhadr (Resim 27.2.10.1.1 ve27.2.10.1.2).
Sper ovulasyonu salamak, suni tohumlamay yapmak ve embrio almak iin
hayvanlarn kzgnlklar kontrol altna alnmaldr. Hem embrio alnan hayvann
hem de tayclarn kzgnlk periyodunun ayn safhasnda olmas gerekir.
 159

Resim 12.5.1.2. 1. Srda oestrus periyodu 20 gndr bu 20 gnn 17 gn luteal safha

3 gn ise folikler safhadr.

Resim 12.5.1.2. 2. Koyunlarda oesrus periyodu 17 gndr bunu 14 gn lteal safha 3 gn

ise folkler safhadr

Hayvanlarda kzgnlk konrol iin prostoglandinler, progesteronlar veya

bu hormonlarn ayn etkiye sahip analoglar kullanlr. Bu ekilde hayvanlarn
tm lteal ya da folikler safhaya getirilir. Lteal safhaya getirilen hayvanlara
enjekte edilen hormonlarn uygulamadan kaldrlmas ile folikler safha balar.
Aadaki ekil srda kzgnlk kontrol, sper ovulasyonu salama ve
embriyo alma gibi ilemleri zetlemektedir.
 160

Uterusdan
PGF2 PGF2 PGF2 emriyolarn
Enjeksiyonu Enjeksiyonu Enjeksiyonu alnmas

1.Oestrus PMSG
A A

48 saat 48 saat
0 11 0 10 12 21
CIDR CDR
Yerletir karlr
2. estrus

Yukardaki eklin st tarafnda ineklere 11 gn aralklarla iki sefer PGF 2

enjekte edilerek korpus luteumun lteolize ediliyor. Bu enjeksiyolar sonucu
hayvanlarn hepsi folikler safhaya getiriliyor. Hormonun devreden
karlmasndan 48 saat sonra hayvanlar kzgnlk gsteriyorlar. Altta ise nce
ineklerde suni olarak lteal safhay balatmak iin 11 gn boyunca progesteron
ieren impland (CDR) yerletiriliyor. Bylece tm hayvanlar sanki bir korpus
luteum varm gibi lteal safhaya geer. Progesteronon verme ilemini kesilmesi
ile hayvan folikler safha balar ve 48 saat sonra hayvanlarda kzgnlk grlr.
Bylece hayvanlarn byk bir ounluu ayn anda kzgnlk gsterir. Bu ilem
strs senkronizasyonu olarak tanmlanr. Kzgnlk gsteren havanalarn
ovaryumlarndaki folikler byme de senkronize edilmi olur. Bu havanlarda
sper ovulasyonu salamak iin kzgnln grlmesinden 10 gn sonra gebe
ksrak serumu (PMSG) enjekte edilir. Bu hormon FSH ve LH etkisine sahiptir
multipi folikler gelimeye neden olur. Gebe ksrak serumu verilmesinden iki
gn sonra PGF2 enjekte edilir. PGF2 enjeksiyonundan iki gn sonra ikinci
kzgnlk grlr. Kzgnlktan sonra sper ovulasyon olur. Kzgnln
grlmesinden sonraki 12. ve 24 saatlerde iki sefer suni tohumlama yaplr ve
takip eden 6. gnde embriolar uterustan ykanark alnr. Bu ekilde bir
hayvandan bir kzgnlk periyodunda birden fazla embrio elde edilir. Elde edilen
embriolar ya direkt olarak ya da blnerek uygun tayclara taranfer edilirler.
Bu metot sper ovulasyon ve embrio transfer teknigi (MOET) olarak
adlandrlr.
Srda sper ovulasyonu salamak iin deiik hormonlar
kullanlmaktadr. Bu hormonlar; Gebe ksrak serumu (Pregnant Mare Serum
Gonadotrophin, PMSG) veya ksrak koriyonik gonadotropini (equine Chorionic
Gonadotrophin, eCG), Folikl stimle eden hormon ( Follicle stimulating
hormone, FSH) ve insana ait monoposal gonadotrophin ( Human monoposal
gonadotrophin, hMG) gibi hormonlardr. PMSG veya eCG nin yarlanma mr
FSH ve hMG den daha uzundur. Bu nedenle 20003000 i PMSG sper
ovulasyonu salayacaktr. FSH ve hMG in yarlanma mr ok ksadr bunun
iin sperovulasyonu salamak iin bu hormonlar birka sefer enjekte
 161

edilmelidir. rnein optimum bir ekilde sper ovulasyonu salamak iin FSH
45 gn boyunca gnde iki sefer enjekte edilmelidir. PMSG nin yarlanma mr
ok uzun olduu iin ovulasyonda sonra dahi etkisi srmektedir. PMSG nin
ovulasyondan sonra etkisini srmesi bir dez avantajdr nk bu durum baz
srlarda emrio transferini kt ynde etkilemektedir. Bu olumsuzluk ok
sayda ovulasyonun olmas fakat dk sayda oosit elde etme eklinde
grlmektedir.

12.5.1.2.2.Multipi ovulasyon ve suni tohumlamadan sonra hayvandan

embrio toplama (Emrio flushing)
1970li yllarn ortalarna kadar embrio toplama ii ounlukla genel
anestezi altnda operasyonla yaplyordu. Bu metot; 1955 ylnda Hunter ve
meslektalar tarafndan ilk olarak koyunda uyguland. Operasyon yaplmadan
serviksten geilerek toplanan embriyo says operasyon yaparak embriyo
toplama metoduna kyasla yaklak %10 daha dktr. Buna ramen bu metot
daha basit ve ucuzdur ayrca anestezi uygulamasnn sebep olabilecei riskler de
sz konusu deildir. Bu sebeple ticari ama dorultusunda yaplan embriyo
toplama ileminde daha ok operasyon gerektirmeyen metot tercih edilir.

12.5.1.2. 3.Operasyonla embriyo toplama metodu (Laporotomi)

Bu metot ile inein sol yanna snrl uyuturma yaplr sonra ufak bir
delik alr. Bu delikten hayvann ovaryumlar ve uterusun ovaryumlara yakn
ksm dar karlr. 20 ml lik bir enjektor ykama bafr ile doldurulur. Uterusa
bir kanula yerletirilir ve kanulann altnda skca tutulur. Bafr dolu enjektor
gcl bir ekilde uterusun bandan boaltlr (Resim 27.2.11.1.1). Enjektordan
boanan bafr blastosit safhasndaki emriyolar ykar. Ykanan embriyolar alttaki
kanuladan toplama kabna geer. Ayn ilen ters yonl olarak (nfundibuluma
doru) da ykama yaplabilir. Koyunda ayn ii yapmak iin; koyun srt yere
gelecek ekilde dndrlr sonra n iki ayandan tutularak tukar kadrlr
sonra ayaklar yksekte balanr veya tutulur. Memenin hemen nndeki kllar
tra edilir ve antiseptik madde ile iyice temizlenir. Temizlenen blgeye snrl
uyuturma yaplr. Tam ortadan aadan yukar doru kck bir kesik
oluturulur. Sonra uterus bulunarak bu kesikten dar karlr. Ksaca srlar
iin yaplan ilemin benzeri yaplr. Aadaki ekil oprasyon ile embrio ykama
ilemini zetlemektedir.
 162

Resim 12.5.1.2.2. Lokal

ansenteziden sonra ineklerin sol
tarafna koyunlarn ise meme
bezinin hemen n tarafna kaslarn
durumu ve pozisyonu dikkate
alnarak kk bir kesik atlr.
Kesikten reme kanal bulunarak
dar karlr. Sonra
infundibuluma yakn veya
ovidukun uterusa yakn ksma
kanula (boru) yerletirilir. Bir
enjektora yaklak 20 ml ykama
solsyonu doldurulur. Ykama
yn dikkate alnarak enjektrn
inesioviduku lmenine veya
infundibulun ovaryuma yakn
ksmna sokulur. Ykanan
embriyolarn toplama kabna
akn salamak iin kanulann alt
taraf elle skca tutulur. Gl bir
ekilde fula yaplarak
embriyolarn toplama kabna ak
salanmaya allr. Ykama ii
uterusa doru veya infuldibuluma
doru yaplabilir.

12.5.1.2. 4. Operasyon yaplmadan embrio ykama metodu

Ayn zamanda embriolar serviks yolu ile ykanarak da alnabilirler. Serviks yolu
ile embrio ykama ilemi; oluan embriolarn uterusa gecmeleri sonucunda
yaplr. neklerde embriyo ovulasyondan 4 gn sonra uterusa geer. Ovlasyonun
olmas dakikalar srr. Ovulasyonda sonra emrionun ikiye blnmesi yaklak
48 saat srr. Ovulasyondan 3 gn sonra embrio morula safhasna gelir.
Ovulasyondan 4 gn sonra embrio uterusa geer. Ovulasyondan sonra
embrionun blastosit halna gelmesi 69 gn srr (Resim 12.5.1.2.4.1). Embrio
ovulasyondan 4-9 sonra operasyona bavurmadan uterusun ykanmas yolu ile
alnabilir.
 163

Resim 12.5.1.2.4.1. Fertilizasyon

ovidukun infundibuluma yakn ksmnda
olur ve dakikalar srer. Fertilizasyon
ileminden embriyonun ikiye blnme
aamasna kadar geen sre yaklak iki
gndr. Emabrio gnde morula
safhasna gelir. Emriyonun ureuse geii
srda 46 gn alr sonra implantasyon
gerekleir.

Embriyo alnacak inek kontrol iin zel blmeye konularak hareket etmesi ve
saa sola zarar vermesi engellenir. Hayvan n ayaklar arka ayaklarndan daha
yksekte olacak ekilde bulunur ve daha sakinletirmek iin anestetik
enjeksiyon yaplr. Embriyolar uterusda 3 ynl foley kanulas kullanlarak
alnr. Bu kanulann ucundaki delikten ykama bafr verilir. Verilen bafr
embriolar uterusdan ykayarak hava yastnn nndeki deliklerden kanulaya
gemesini salar. Kanulaya geen embriolar toplama kabnda birikir.
Embriyolarn alnp alnmadndan emin olmak iin toplama kab mikroskop
altnda gzetlenir (Resim 12.5.1.2.4.2 ve 12.5.1.2.4.3.).

Lastik ska. Hava yast. Bafr ve ykanan

Hava yastn Ykanan embriolarn embriolar bu
iirmek iin arka tarafa geerek deliklerden kanulaya
kaybolmasn geer
engeller

Bu delikten uterusa verilen

bafr embriolar uterusdan
ykar. Ykanan embriolar hava
yastnn nndeki
deliklerden kanulann iine
girer. Kanlann iine giren
embriolar bafr ile toplama
Toplama kab. Ykanan kabna gelir.
embriolar bu kap
ierisindedir. Embriolar
grmek iin bu kap
mikroskop altna incelenir Enjektor
Ykama bafr. Bafr
enjektor ile kanulaya
basnl bir ekilde verilir.

Resim 12.5.1.2.4.2. yl foley kanulas yardmyla blastosit safhasndaki

embriyolar uresutan ykanarak alnr. Uterustan ykanan embriyolar toplama kabnda
toplanr. Toplama kab mikroskop altnda gzetlenerek embryolarn mevcut olup
olmad bilinir.
 164

Resim 12.5.1.2.4.3.
Foley kanulasn kullanma
emas. Hayvan sakinletirmek
iin snrl uyuturma yaplr.
Sonra sol elle rektuma girilerek
konula kontrol edilir ve oviduka
gemesi salanr.

Embrio veya oosit ykamak iin kullanlan bafr; ounlukla fosfat ile
bafrlanm tuz zeltisi (PBS) dir. Bu bafr piyasadan hazr olarak alnabilir
veya embrio transfer laboratuarnda hazrlanabilir.

Laboratuarda bu bafr hazrlamak iin:

0.132gr CaCl2.2H2O
0.121gr MgSO4.7H2O
hassas terazi ile tartlarak 1litre saf suda zlr, pHs 7.3 e ayarlanr sonra
filtre edilerek steril hale getirilir ve kullanlr.

12.5.1.2. 4.1.Ykanan embriyolaru tayc (resepient) hayvana transferi

Daha ncede ifade edildii gibi embrio transferi operasyon yaparak veya
operasyonsuz olarak yaplr. Operasyon ile hayvann sa tarafndan snrl
uyuturma yaplarak kck bir yark alr sonra uterus bu yarkdan dar
karlr. Takiben uterus keskin bir ine ile delinir ve kanula yerletrilir. Kanula
3cm kadar reme kanalnn iine itilir sonra embriyo bu kanulann ierisinden
uterusa braklr takiben kesilen dokular dikilir ve kapatlr. Konroll artlar
altnda alnan emriyolarn ayn gnde transfer edilmesi ile salanan gebelik
oran yaklak %70 dir.
Operasyona bavurmadan yaplan embrio transferinde suni tohumlamada
kullanlan aletler kullanlabilir. Bu ekilde yaplan transferde aseptik kurallara
skca uyulmal ve embrio korpus luteumun bulunduu tarafdaki uterus
boynuzuna transfer edilmelidir. Genelde tarnsfer korpus luteumun bulunduu
tarafa yaplmaktadr. Bu nedenle korpus luteumun hangi tarafta bulunduunu
bilmek gerekir. Bunun iin ultrason kullanlr ve korpus luteum monitorda
grlr, hangi tarafta olduu bilinir. Bu ekilde yaplan transferde uterin
endometriyumuna fiziksel zarar vermekten kanlmaldr. Yaplan fiziksel zarar
derecesine gre baar salanr. Bu nedenle transferi yapan kiinin el becerisi
baary etkileyen nemli bir faktrdr.
 165

12.5.1.2. 4.2. Koyunda ve keide emriyo transferi

Koyunlar zerinde yaplan aratrmalar sgrlar zerinde yaplan almalardan
daha ucuzdur. Bu nedenle embrio transferi konusunda alan bilim adamlar
koyunu sra tercih etmilerdir. Koyunlara ticari amala embrio transferi
yapmak henz yayglamamtr. Koyunlarda embrio transferi daha ok ithal
edilen rklarn abuk oaltlmasnda ve rklarn daha verimli hale
getirilmesinde kullanlan MOET (Multipi Ovulasyon ve Emriyo transferi)
metodunda kendini gstermitir. Keiler zerinde yaplan emrio transferi; 1980
li yllarn sonuna doru ngiltere ve Australyada verimli saf Ankara veya Kemir
keilerinden oluan stoklar elde etmek amacyla yaplan almalarla younluk
kazanmitr.
Hem koyunlarda hem de keilerde sper ovulasyonu salama teknii ok
benzerdir. Sgrda, koyunda ve keide sperovulasyonu salama amacyla
kullanlan hormonlar ve hormonlarn uygulanma ekilleri ile dier teknikler
ayndr. Srlarda olduu gibi kei ve koyunlardada kzglk peryodunun
ortasna doru gonadotrophin (PMSG, FSH, hMG) muamelesi yaplr bu
enjeksiyondan 2472 saat sonra prostaglandin enjeksiyonu yaplr ve 2436 saat
sonra hayvanda kzgnlk grlr. Ayn amacla vaginal implantlar kullanlabilir.
Kzgnl ve ovulasyonu salamak iin kullanlan implantlar koyunlarda 1214
gn sre ile biraklr keilerde ise 1418 gn biraklr. Bu ekilde reme
mevsimini dnda hayvanlarda sperovulasyon salanabilir.
Ovulasyondan sonra hayvanlar ya doal olarak ya da suni tohumlama ile
dllendirilirler. Koyun ve keiler zerinde yaplan embrio transfer teknii;
embrio transferinin ilk sefer Hunter ve arkadalarnn 1955 ylnda yaptklar
bildiriden bu yana ok az degimitir. Temamen ayn tekniknikleri ierir.
Tekniklerin tmde; anestezi, operasyon (Laparotomy), uterusa veya uterus
tplerine kanula yerletirme ve ykama (flush yapma) gibi ilemler vardr.
Koyun ve keilerde operasyona bavurmadan embrio transfer etme teknii
1986 ylnda Coonrod ve arkadalar tarafndan rapor edilmitir. Bu hayvanlarda
serviks fazla girintili kntldr bu da kanulann geiini ok zorlatrmaktadr.
Bu hayvanlardan embrio alma ii; kzgnln ilk grlmesinden 37 gn sonra
yaplr. Tansfer genel anestezi altnda laparatomi veya laparoskopla yaplr.
Sekiz hcreden kk embriolar uterus tplerine; sekiz hcreden byk
embriolar ise uterusa transfer edilir. Koyunlarda, 67 gnlk embriolarn
laparoskop ile transfer edilmesi laparatomi ile yaplan transfer kadar etkilidir.
Laparoskop yntemi ile reme kanalnn dar karlmasna gerek yoktur.
Tayc hayvanlarn reme kanaln transfer iin hazr hale getirmek iin
hayvann kzgnl: Prostaglandin enjeksiyonu veya vaginaya yerletirilen
progestogen insertler ile senkronize edilir ve hayvann ilk kzgnlk gsterdii
zaman vezektomi edilmi ko kullanarak veya dier metotlarla belirlenir.
Srlarda olduu gibi Koyunlarda da embrio transferi iin kullanlan donor ve
tayc hayvanlarn reme kanal ayn zamanda parelel bir ekilde senkronize
edilmelidir.
 166

13. Gebelik ve gebeligin tehisi

Memeliler viviparos hayvanlardr. Fetal gelime uterusun ierisinde tamamlanr.
Uterus ierisindeki gelime periyodu gebelik sresi olarak adlandrlr.

13.1. Gebelik sresi ve gebelik sresini etkileyen faktrler

Gebelik sresi, dllenme ile doum aras geen sredir. Gebelik sresi hayvann
genotipi tarafndan determine edilir, fakat gebelik sresi maternal, fetal ve evre
faktrleri tarafndan da modifiye edilebilir.

Gebelik sresindeki
deimeleri etkileyen
fakrrler

Fetal faktrler evre faktrleri

Meternal faktrler 1-Fets says Genetik faktrler 1-Beslenme
1. Gebe hayvann ya 2-Fetsn cinsiyeti 2-Scaklk
1-ins,tr, rk
3- Pituitari ve 3- Sezon
2-Fetal genotip
adrenal bezlerin
fonksiyonu

13.1.1. Metarnal faktrlerin gebelik sresine etkisi

Farkl trlerde, gebe hayvann ya gebelik sresini etkiler. Sekiz yandaki bir
gebe koyunda; gebelik sresi ortalama olarak 2 gn daha uzundur. Gen
ineklerin gebelik sresi yal ineklerden daha ksadr.

13.1.2. Fetal faktrlerin gebelik sresine etkisi

Bir batnda birden fazla yavru veren hayvanlarda (domuzlar hari) gebelik
sresi ile doan yavru says arasnda dolayl bir ilginin bulunduu konusunda
olduka fazla rapor vardr. Tek doum yapan hayvanlarda; birden fazla fets
tanmas durumunda gebelik sresi daha ksa olur. Bu nedenle ift fets tayan
gebe inekler tek fets tayan ineklerden 36 gn daha erken doum yaparlar.
Fetsn cinsiyeti de gebelik sresini etkiler. Srda erkek fetsler dii
fetslerden 2 gn fazla uterusta kalrlar. Gebelik sresi ayn zamanda fetsn
endokrin fonksiyonunun etkisi altnda deiebilir.
 167

13.1.3. Genetik faktrlerin etkisi

Trler aras gebelik sreleri arasndaki kk farklar genetiksel, sezonal veya
lokal etkilerden dolay olabilir (Tablo 28.1.3.1). St srlarnda bir otozomal
ressesiv geni tayan fetsler daha ge doarlar. At ve eek arasnda yaplan
aprazlama sonucu oluan hibrit ftsler daha ok iftlemede kullanlan erkek
hayvann gebelik sresine yakn bir srede uterusta kalrlar. Bu rnek fetal
genotipin gebelik sresine etkisini gstermek iin iyi bir rnektir. Eer ksrak at
fets tayor ise gebelilk sresi yaklak 320360 srr. At ile eek arasnda
yaplan iftlemede, eer ksrak bir hibrit fets tayor ise gebelik sresi uzar
yaklak 360380 gn srer. Eger dii eek hibrit fets tayor ise gebelik sresi
ksalr atnkine yakn hale gelir.

Tablo 13.1.3.1. iftlik hayvanlarnn gebelik sreleri arasndaki farklar.

Hayvan Ortalama gebelik sresi ve deiim aral (gn)

Sr rklar
St rklar
Ayrshire 278
Brown swiss 290 (270-306)
St shorthornu 282
Friesian 276 (244-303)
Guernsey 284
Holstein-Friesian 279 (262-309)
Jersey 279 (270-285)
sve- Friesian 282 (260-300)
Zebu (Brahman) 292 (271-310)
Et rklar
Aberdeen-Angus 279
Herefort 285 (243-306)
Et sorhornu 283 (273-294)
Koyun 148 (140-159)
At rklar
Arap at 337 (301-371)
Morgan 344 (316-363)
Belka at 335 (304 354)
Clydesdale 334
Pencheron 321-345
Shire 340
Thoroughbred 388 (301-349)
 168

13.1.4. evre faktrlerinin etkisi

Yln sezonu gebelik sresini etkileyebilir. Yaz mevsiminin sonunda veya gzn
gebe kalan ksraklarda gebelik sresi ilkbahar sezonunun ilk aynda gebe kalan
ksraklardan daha uzundur. yi beslenen gebe ksraklarda gebelik sresi bazal
metabolik dzeyde beslenen gebe ksraklardan 4 gn daha ksadr.

13.2. Gebeliliin tehis edilmesi

Hayvann gebe olup olmadnn bilinmesi ekonomik bakmdan nemlidir.
iftlemeden sonra gebeliin mmkn olduu kadar erken bilinmesi; gebe
olmayan hayvanlar belirlemek ve gebe olmayan hayvanlarn tekrar gebe
kalmasn salayacak ilemleri yapmak yoluyla srde ksrlk oran
drlebilir. Ayrca, hayvanlarn sat ve sigorta ilemlerini yapmak iin
gebelik tehisi gerekmektedir. letmede gebelik erken, doru ve gvenli ekilde
tehis edilmedir. Gebelik grsel, kliniksel ve laboratuar teknikleri kullanlarak
tehis edilir (Doize ve ark. 1997; Karen ver ark. 2006). Grsel metotlara gre
gebelik tehisinde ifti tohumlamadan sonra hayvann kzgnlk gstermemesi
ve kuyruunu yukarda tutmas gibi belirtileri dikkate alarak hayvann gebe
olduunu anlamaya alsa da bu metodun gvenirlii yoktur (Banerjee ve ark.
1981). Kliniksel tekniklerin banda ise rektal muayene gelir. Bu yntemle
gebelik tehisi ilk defa 1800l yllarda st srlarnda tanmland (Cowie
1948). Bu teknik inekte gebelik tehisinde 65 yldr etkin ekilde
kullanlmaktadr (Noakes 1996). Bu bakmdan rektal muayene gebelik
tehisinde kullanlan en eski metottur ve olduka doru sonu vermektedir.
Radyografi 1913 ylndan beri medikal bilimlerde kullanlmaktadr.
Veterinerlikte ise 1960l yllardan beri, gebelik tehisinde kullanlyor (Ardran
ve Brown 1964). Koyunda, keide ve domuzda gebelii tespit etmekte nadiren
kullanlan bir metottur. Fets iskeletinin x nlar yardmyla grlmesi esasna
dayanmaktadr. Radyografinin veterinerlikte kullanmn snrlayan faktrler
arasnda; pahal donanm gerektirmesi, doru gebelik tehisinin ge yaplmas,
radyasyon nedeniyle fetse genetik zarar verme, anormal fetal gelimeye neden
olabilmesi, intra-uterin lme sebebiyet verebilmesi ve onkogenik zararlara
neden olabilmesidir (Lowe 2004). Bu teknikle doru gebelik tehisi ge yaplr,
nk gebeliin ikinci yarsna yakn doruluu artar. rnein koyunda gebelik
ancak 50. gnden sonra doru tehis edilebilir (Lowe 2004).
1959 ylnda hormon analizlerinin gelitirilmesiyle (Yalow ve Berson
1960) gebelikle alakal antijenler vcut svlarnda tespit edilerek gebelik tehisi
yaplmaya baland. Bu yntemle gebelik tehisi pahalyd. nk pahal
ekipmanlar ve sarf malzemeleri gerektiriyordu. Zamanla monoklonal
antikorlarn kefedilmesiyle gebelik tehisinde daha ucuz, basit ve daha tutarl
immnotestler kullanlmaya baland (rnein balanma keltme esasl testler
ve sandvi ELISA). 1982 ylndan beri gebelik, ovaryum kistlerinin, ovaryum
lezyonlarnn, uterusdaki tmrlerin tespiti gibi durumlarda rektal muayenenin
 169

ve hormon testlerinin yerini daha ok gerek zaman B-mod ultrasonografi

almtr. nk ucuzdur, kullanm kolaydr, operatre, hayvana ve fetse
herhangi bir zarar olmamaktadr. Gerek zaman B-mod ultrasonografi rektal
muayeneye ve hormon testlerine kyasla daha fazla bilgi salar (fetsn ya
cinsiyeti, canll ve gelime durumu hakknda). Ayrca bu metotla gebelik
tehisi daha erken ve daha doru olarak yaplmaktadr (Ginther 1995, Szencive
ark. 1998). Gebelik tehisinde baar operatrn tecrbesine, yaplacak ie
uygun probun ve ultrason modunun seilmesine baldr.

Gebelik tehisinde
kullanlan teknikler

Grsel teknikler Kliniksel teknikler Laboratuar teknikleri

Tekrar kzgnla Rektal muayene a) Vaginal biyopsi

gelmeme Vaginal muayene b) Gebelikle alakal
Kuyruu yukarda Radyografi hormnlar yadmyla tehis
tutma Ultrasonografi
-Progestoron testi: Stteki ve
kandaki progesteronu
belirleme

-Kandaki chorionik
gonadotrophini belirlemek
yoluyal tehis

-Estron slfat testi yaparak

gebelii tehis etmek
 170

Kiliniksel teknikler

a) Rektal muayene
Atlarda, mandalarda ve srlarda kullanlan bir metottur. Pelvik aklnn
kk olduu koyunlarda ve keilerde kullanlmaz (Ganaie ve ark. 2009). Bu
metotta amniyotik kese, fets, plasentamlar ve fetal membranlar elle bulunarak
gebelik tehisi yaplmaktadr (Mortimer 2007). Amniyotik kesenin elle
bulunarak ilk gebelik tehisi Ball ve Carroll (1963) tarafndan yapld. Fetal
membranlar ve plasentomlar elle bularak ilk gebelik tehisini ise Zemjanis
(1970, 1971) yapt. Bu drt faktrle birlikte uterus bykl de dikkate
alnarak gebelik tehis edilmektedir.
a
)

b
)

c
)

ekil 13.2.1; Srda gebeligin a) 70. gnnde b) 90.gnde c) 110 gnde uterusun bykl.
 171

Rektal muayene ok ucuzdur ve olduka doru sonu verir. Tecrbeli bir

operatr gen ineklerde gebelii tohumlamadan sonraki 30-35. gnlerde doru
ekilde tespit edebilir (Zemjanis 1970, Roberts 1971, Momont 1990). Fakat
tutarl ve doru sonu daha ok tohumlamadan 45-60 gn sonra elde edilir.
Rektal muayene dikkatli uyguland srece fetse ve gebe hayvana herhangi bir
zarar yoktur. Fakat personel pek tecrbeli deilse erken gebelik dneminde
uyguland takdirde fetal mortaliteye neden olabilir. Nitekim bu konuda baz
raporlar da mevcuttur (White ve ark. 1989). Buna ramen dier aratrmaclar
gebeliin erken dnemlerinde elle muayenenin nihai embriyonik mortaliteye
herhangi bir olumsuz etkisinin olmadn belirtmilerdir (Studer 1969,
Thurmond ve Picanso 1993). Rektal muayeneyi yapacak kii nce trnaklarn
kesmeli, koluna takaca rektal muayene eldiveni temiz olmaldr. Kola taklan
eldiven 2-5 muayeneden sonra yenisi ile deitirilmelidir. El rektumda iken,
rektuma ve fetse fiziksel zarar vermeyecek ekilde hareket ettirilmeli sert ve
iddetli hareketlerden kanlmaldr. Peristaltik hareketlerin olduu anda el
hareket ettirmemelidir. Rektumun duvar incedir kapillar damarlar yze olduka
yakndr bu nedenle fiziksel darbelere kar hassastrlar. Sert hareketler
kanamaya neden olabilir.
Koyunda rektal muayene elle yaplmaz. Gnmzde koyunda ve keide
reme kanalnn tamamnn muayene edilmesine olanak salayacak bir teknik
mevcut deildir. Bunun yerine koyunda rektoabdominal muayene, keide ise iki
elle muayene yntemi kullanlarak gebelik durumu anlalmaya allr.
Koyunda rekto-abdominal yntem in defa Hulet (1972) tarafndan tanmland.
Gebeliin en erken tohumlamadan 45 gn sonra tehis edilebildii, gebeliin 60-
70. gnlerinde ise doruluk orannn artarak %100 seviyesine geldii bildirildi
(Hulet 1972). Farkl aratrmaclar gebeliin erken safhasnda rekto-abdominal
muayeneyle hassasln dk olduunu fakat gebeliin 85-100. gnlerinde
hassasln artarak %100 seviyesine geldiini bildirdiler (Hulet 1973, Chauhan
ve ark. 1991). Bu metotta, koyun dz bir zemin zerinde, srt st yatay
pozisyonda tutulur, sonra 1.5 cm apnda, 50 cm uzunluunda cam veya plastik
ubuk kayganlatrc antiseptik solsyona konulduktan sonra yavaa rektuma
yerletirilir. Bir elle ubuk tutularak ventral abdominal duvarn internal
yzeyinde; bir taraftan dier tarafa bir engele rastlanncaya kadar ubuk yatay
hareket ettirilir. Eer engele rastlanrsa, engel ubuk yardmyla abdomenin
ventral duvarna yaklatrlr. Dier el memenin hemen nndeki ventral
abdominal duvar zerine konularak bu engelin ekli, bykl ve yeri
hakknda bilgi edinilmeye allarak hayvann gebe olup olmadna karar
verilir. Gebe olmayan hayvanlarda sadece ubuk elle hisedilir. Dikkat edilmesi
gereken ey; ubuun uterusun ventraline kaymamasn salamaktr. Aksi halde
hayvan gebe olsa dahi ventral abdominal duvardan sadece ubuk elle his edilir
ve hayvann ksr olduuna karar verilir. Bu durumda gebelik yanl tehis
edilmi olur (ekil 2).
 172

Rekto-abdominal metot ansn 10-12 cm ilerisinde, rektumun ventral

duvarnda tahrie, ezilmeye, delinmeye, hatta fetal mortaliteye neden
olabilmektedir (Tyrrell ve Plant 1979).

ekil 13.2.2. Koyunda rekto-abdominal muayeneyle gebelii tehis etmek amacyla hayvan
dz bir zeminde srt st yatay pozisyonda tutulur. Sonra bir cam veya plastik ubuk rektuma
yerletirilir. ubuk ventral abdominal duvarn internal yzeyinde bir engele rastlanncaya
kadar yatay hareket ettirilir. Eer bir engele rastlanrsa bu engel ubukla abdomenin ventral
duvarna yaklatrlr. Dier el memenin hemen nndeki ventral abdominal duvar zerine
konularak bu engelin ekli, bykl ve yeri hakknda bilgi edinilmeye allarak hayvann
gebe olup olmadna karar verilir (Hulet 1972, resim 1adan uyarlanmtr)

Keilerde ise iki elle gebelik muayenesi yaplr. Teknisyen hayvann sa

tarafnda, pelvik yksekliine uygun ekilde ker. Sol ele operasyon eldiveni
takar, elin yzk ve kk parman avu iine katlar, iaret parmayla orta
parma biletirilir, el kayganlatrc svya daldrlr ve rektuma sokulur.
Rektumdaki dk paralar dar atlr. drar torbas doluysa, hafif rekto-
abodminal basn uygulanarak boaltlr. Sa elin parmaklar birletirilir, ular
posterior abdomenin ventral yzeyine deecek ekilde dikey tutulur sonra sol
 173

elin iaret ve orta parmana doru itilir. Sol elin iaret parmayla sa elin
parmaklar yardmyla gebelik tehis edilmeye allr (ekil 3).

ekil 13.2.3. Keilerde iki elle gebelik muayenesi. Sol elin iaret parmayla orta parma
rektuma sokulur. Sa elin parmaklar birletirilir, ular posterior abdomenin vetral yzeyine
deecek ekilde dikey tutulur sonra sol elin iaret ve orta parmana doru itilir. Sol elin iaret
parmayla sa elin parmaklar yardmyla gebelik tehis edilmeye allr (Kutty 1999).

Bu teknik kullanlarak tohumlamadan sonra 28-30. gnler arasnda gebelik %56

orannda doru tehis edilebilir (Kutty 1999). Rektal muayene gebeliin her
aamasnda kullanlabilir. B-mod transrektal ultrasonografiyle kyasla hem ge
sonu verir hem de doruluu dktr. B-mod transrektal ultrasonografiyle
doru gebelik tehisi tohumlamadan sonra 26-30. gnde yaplrken, rektal
muayenede 45-60. gnde yaplabilir. Ayn zamanda rektal muayenede fetsn
canl olup olmad anlalamaz (Romano ve Magee 2001).

b) Vajinal muayene
Genellikle vaginal speklm yardmyla veya elle yaplr, daha ok grsel
kriterlere dayaldr. Bu teknik; ksrak ve inekte gebelik tehisinde kullanlr,
fakat kk ruminantlarda kullanlmamaktadr. Muayenede serviks lmeninden
anterior viginaya doru mukoz akntsnn var olup olmamasna dikkat verilir.
Gebe olmayan hayvanlarda servikal bezlerin salglarnn vizkositesi dktr ve
 174

serviks lmeninden vaginaya doru devaml bir aknt grlmektedir. Gebe

hayvanlarda ise servikal bezlerin salglar jeltinleir, katlar ve serviks
kanaln kapatr. Servikal plag atta gebeliin 40. gnnde, srda gebeliin 60.
gnnde oluur. Bu metotla gebelik ge tehis edilmekte, ayn zamanda
gvenirlii de dk olmaktadr. Muayenede, vaginal mukoz membrann
kuruluk derecesine ve rengine de baklr. Gebe hayvann vaginal mukozas
yapkan ve ak pembe renklidir. Benzer belirtiler uzam diestrs dneminde
de mevcuttur. Bu bakmdan belirtilerin; gerek gebelik belirtisi mi yoksa uzam
diestrus belirtisi mi olduu konusunda karklk vardr. Bu durum ise pozitif
gebelik tehisinde hata orann ykseltmektedir. Bylece, mukoz membrann
durumuna bakarak hayvann gebe olup olmadna dair gvenilir klinik sonu
elde etmek mmkn grnmemektedir (Noakes 1996).

c) Radyografi
Radyografi; fets iskeletinin X nlar yardmyla grlmesi esasnsa dayanr.
Koyunda gebeliin 70. gnnden itibaren tehiste doruluk ve tutarllk oran
artar (Ford ve ark. 1963). Radyografik grntlemeyle bir gnde ok sayda
hayvan gebelik muayenesine tabi tutulabilir ve gebeliin 50. gnnden sonra
olduka doru sonu verir. Doru ve tutarl sonu elde etmede; teknisyenin
tecrbesi, tekniin uygulanma yntemi ve hayvann grntleme iin uygun
pozisyonda tutulmas da nemlidir (Rendano 1983, Toal ve ark. 1986). Gebelii
ve fets saysn tespit edebilmek iin abdomenin sadece leteral bir radyografisi
yeterlidir. Eer fazla bilgiye gerek duyuluyorsa (fetsn ya ve pelvik kanalnn
byklyle fetsn ba bykl arasndaki oran hakknda bilgi gibi) o
zaman ventro-dorsal bir radyografi (zellikle koyun ve keilerde) uygundur
(Rendano, 1983, Toal ve ark. 1986). Radyografiyle fets says gebeliin 70.
gnnden sonra en fazla %93 orannda doru tespit edilebilir (West 1986). Bir
almada 322 koyun, gebeliklerinin 70. gnde, radyografik yntemle gebelik
tehisine tabi tutulmu ve %90100 orannda gebelik ve fets says doru tespit
edilmitir (Ford ve ark. 1963). Koyunlarda yaplan baka bir radyografik
muayene sonucunda fets saysnn %94-100 orannda doru tespit edildii
bildirilmitir (Grace ve ark. 1989). Bu doruluk oran bir batnda birden ok
fets tayan kpek ve domuzda dktr. Radyografiyle fets says kpekte
ovulasyon ncesi LH pikinden sonraki 45. gnde, kedide ise 36-45 gnleri
arasnda tespit edilebilir. Bazen yavrular uterusta st ste ylr, bu durum fets
saysnn doru tespit edilmesini zorlatrr (Rendano, 1983; Toal ve ark. 1986).
Ayn zamanda abdominal ierik de (gaita ve gaz) radyografik grntlemeyi
zorlatrr.
Radyografiyle tutarl gebelik tehisi ok ge yaplr. Ancak gebeliin 50.
gnnden sonra tutarl sonu elde edilebilir. Ayrca, fetsn canl olup olmad
da tespit edilemez. Radyografi pahal donanm ve tecrbe gerektirir, ayrca
 175

cihaz kullanan operatr radyasyona maruz kalr. Bu durum metodun iftlik

koullarnda kullanmn snrlar (West 1986).

d) Ultrasonograf
Gnmzde gebelik tehisinde yaygn olarak kullanlan ultrason cihazlarnn
gelitirilmesi Paul-Jacques ve Pierre Curienin 1880 ylnda pizoelektrii
kefetmeleriyle balad. Bu bulutan 35 yl sonra ilk ultrason cihaz Paul
Langevin tarafndan gelitirildi (Hunt 1982). nce gemilerde deniz dibini
gzetlemede, buz dalarn tespit etmede, takiben radarlarda kullanld. Daha
sonra 1960l ylardan itibaren medikal bilimlerde, orbital tmrlerin tehisinde
kullanlmaya baland (Baum ve Greenwood 1960, Oksala 1964). Grntleme
kalitesi 1970 ylndan itibaren gri-skala ve takiben gerek zamanl (parlak skala)
ultrason cihazlarnn icad neticesi iyiletirildi. nce insanda sonra da
hayvanlarda gebelik tehisinde 1980li yllardan itibaren kullanlmaktadr.
Tm ultrason cihazlarnn en nemli paras probdur. Kullanlan probun
frekans ve tipi (sektr, lineer veya konveks oluu) gebelik tehisinde doruluk
derecesini etkiler (Rajamahendran ve ark. 1994). Piyasada 3.0, 3.5, 5.0 ve 7.5
MHz frekansl problar vardr. Probun iinde bulunan pizoelektrik kristallerin
titreimiyle yaylan ultra sesin dokuya penetrasyonu ve grnt znrl
probun frekansna gre deiir. Maksimum penetrasyon 3.0 MHz frekansl
probla salanr fakat znrl dktr. En iyi znrlk 7.5 MHz frekansl
probla salanr fakat penetrasyonu azdr. Genel amalar iin (detayl uterus ve
ovaryum grnts iin) daha ok 5.0 MHz frekansl problar kullanlr (Tablo
1.).
 176

Tablo 13.2.1. Veterinerlikte kullanlan farkl frekanstaki problarn doku penetrasyonu ve

kullanm alanlar.
Derinlik Kullanm alan

Dk Frekans 0-20cm leri gebelikte,

(3.5 MHz) doum sonras uterusu gzetlemede

Orta Frekans 0-12cm Folikl ve korpus luteumu grntlemede,

(5 MHz) gebelik tehisinde, fetal cinsiyetin tespitinde

Yksek Frekans 0-12cm Folikl ve korpus luteumu grntlemede,

(7.5MHz) gebelik tehisinde

Srda erken gebelik tehisi iin 5 MHz veya 7.5 MHz frekansl problar 3.0
MHz veya 3.5 MHz frekansl problardan daha gvenilir sonular vermektedir.
nekte B-mod ultrasonografiyle, tohumlamadan 25 gn sonra, 3.0 MHz frekansl
problarla yaplan gebelik tehisinde doruluk orannn %94 olduu bildirilirken
(Haznen ve Delsaux 1987), Boyd ve arkadalar (1990) 7.5 MHz frekansl
problar kullanarak, tohumlamadan 20 gn sonra doruluk orannn %100
olduunu bildirdiler. phesiz sonular arasndaki fark sadece kullanlan
problarn frekans farkndan kaynaklanmyor. Operatrn tecrbesi de nemlidir.
Kullanlan probun tipi yaplacak iin amacna uygun olmaldr. Sektr,
konveks ve lineer al problar veterinerlik uygulamalar iin piyasada
mevcuttur. Lineer al problar ierisinde ok sayda pizoelektrik kristalleri
vardr ve bu kristaller olduka yksek frekansta ultra ses dalgalar yayarlar.
Buna karlk sektr ve konveks problarn iresindeki pizoelektrik kristallerinin
says azdr ve dk frekansl ultra ses dalgalar yayarlar. Dier bir fark ise
ekrandaki grnt eklindedir. Lineer al prob kullanldnda monitrn
ekrannda iki boyutlu dikdrtgen eklinde bir grnt grlrken, sektr ve
konveks problar kullanldnda ekranda yelpaze eklinde grnt oluur.
Genellikle srda, sektr ve konveks problar trans-vaginal ultrasonografide
kullanlrken, trans-rektal ultrasonografide ise daha ok linear al problar
kullanlr.
Gebelik tehisindeki baary en fazla kullanlan ultrasonun modu etkiler.
Veterinerlikte farkl modlarda ultrasonlar kullanlmaktadr.

A-Mod ultrasonografi (Pik derinlii veya pals-eko)

Ekranda tek boyutlu grnt verir. Probdaki pizoelektrik kristallerinin
titreimiyle oluan ultrases deri altndaki dokulara penetrasyon yaparken gebe
uterusa veya ii sv dolu yaplara rastlarsa proba geri yansr. Geri yansyan ses
 177

dalgalar prob tarafndan alnr ve yansma derinliini gsteren piklere

dntrlr. Monitrn ekrannda pikler dey eksende, yatay eksendeki
zamanla balantl olarak, grafik halinde grlr. Yansma derinliine gre
gebelik tehisi yaplr. rnein koyunda tohumlamadan sonraki 61-151 gnleri
arasnda yansma derinlii 9 cm veya daha fazla ise bu durum hayvann gebe
olduuna dair pozitif iaret olduu bildirilmitir (Ganaie ve ark. 2009). Koyunda
bu metotla tohumlamadan sonraki 15-30. gnlerde gebelik tehis edilemez
(Ganaie ve ark. 2009). Gebeliin 30. gnnden sonra tehiste kullanlabilecei
nerilmektedir. Gebeliin 31-45 gnleri arasnda gebelik %58.8 hassaslk ve
%56 dorulukla tehis edilebilir. Hassaslk ve doruluk gebeliin 95-105.
gnlerinde artarak %93.2 ve %94 seviyesine gelmektedir (Ganaie ve ark. 2009).
Gen koyunlarda yaplan baka bir almada, tohumlamadan sonra 73-105
gnleri arasnda, hassaslk ve spesifikliin %86.7 ve %69 olduu bildirilmitir
(Madel 1983). Bu yntemle tohumlamadan sonraki 69-112 gnleri arasnda
gebelik tehisinin %91 dorulukla yapld Trapp ve Slyter (1983) tarafndan
bildirilmitir. Fakat, Watt ve ark. (1984) 51. gnden itibaren doruluk orannn
%97 olduunu bildirmilerdir. A-mod ulrasonorafinin gebeliin 31-45 gnleri
arasnda hassasl ve doruluu dktr. Ayrca bu yntemle fets says ve
canll bilinemez.

D-Mod ultrasonografi (Dopler)

Probdan yaylan dopler ultra ses dalgalar vcut iinde hareken eden objelere
arparsa frekans artm veya azalm halde proba geri yansr. Bu art ve
azallar proba yaklamaya ve uzaklamaya gre oluur. Bu ekilde hareket eden
objenin probdan uzaklat veya yaklat bilinir. Daha ok kardiyolojide,
damar tkanklnn tehisinde kullanlr. Eer spektral dopler kullanlyorsa
ekranda grafik grlr, eer renkli dopler kullanyorsa ekranda resim grlr.
Dopler gebelik tehisinde kullanlabilir. Yaplan bir almaya gre dopler
kullanlarak koyunda tohumlamadan sonraki 31-45 gnleri arasnda gebelik %56
orannda doruluk ve %54.5 orannda hassaslkta tehis edilebilmektedir
(Ganaie ve ark. 2009). Dopler kullanlarak yaplan erken gebelik tehisinde
doruluk ve hassaslk dktr. Baka bir almada, tohumlamadan 71 gn
sonra gebe olan hayvanlar tehis etmedeki doruluk orannn %85, gebe
olmayanlarn doruluk orannn ise %94 olduu bildirilmitir (Watt ve ark.
1984). Buna ramen Trapp ve Slyter (1983) tohumlamadan sonraki 60-96
gnleri arasnda gebe hayvanlar %68 orannda, gebe olmayanlar ise %84
orannda doru tehis ettiklerini bildirmilerdir. Gebeliin 111. gnnden sonra
vcut dndan dopler probu kullanlarak gebeliin %100 doru tehis edildii
rapor edilmitir (Watt ve ark. 1984). Doplerle fetsn kalp atlar, dolaysyla
fetal canllk ve fets says tehis edilebilir. Tecrbeli bir operatr vcut
dndan dopler probu kullanarak gebeliin 85-95. gnleri arasnda fets saysn
%83-93 orannda doru tehis edebilir (Fukui ve ark. 1986).
 178

A-mod ve dopler ultrasonografi kullanarak yaplan gebelik tehisinin doruluk

ve hassasl dktr. Rektal muayene bu metotlara kyasla daha iyidir. Ayrca,
A-mod ultrasonografiyle fets saysn belirlemek mmkn deilken rektal
muayene ile ikiz fetsler %17-54 orannda doru tespit edilir. Dopler kullanarak
fets says doru tespit edilebilir fakat alma srasnda evreden hi ses
gelmemelidir. Bu da ahr ortamnda mmkn deildir. Ayrca dopler kullanan
kii tecrbeli olmaldr. Bu nedenlerle A-mod ve Doppler ultrasonografinin
iftlik baznda gebelik tehisinde kullanmnda ilerleme salanmamtr
(McCaughey ve Gilmore 1990, Cameron ve Malmo 1993). Portatif gerek
zamanl B-mod ultrason cihazlarnn ve bu cihazlarla kullanlan yksek frekansl
problarn gelitirilmesi ultrasonun iftliklerde kullanmn tevik etmitir.

B-Mod ultrasonografi (Gri veya parlak mod)

B-mod ultrasonografide genelde lineer al problar kullanlr. Bu problar vcut
ierisinde bir alan ayn anda tarayarak gri veya parlak skalaya dntrr.
Ekranda bir grnt belirir. Ayn zamanda bu grntnn pozisyonu ve derinlii
bilinir. Gerek zamanl B-mod ultrasonografi incelenen nesnenin hareketini de
gzlemeyi mmkn klmaltadr. Gebelik tehisinde bu metot gvenli olup,
kullanm kolaydr, abuk ve doru sonu verir. Ayrca, fetsn yan, fets
saysn, cinsiyetini ve canlln bilmek mmkndr. Operatre, hayvana ve
fetse herhangi bir zarar da yoktur. nekte gerek zaman ultrasonografiyle
gebelik tehisi 3.5 MHzlik prob kullanlarak ilk defa 1982 ylnda yapld
(Chaffaux ve ark. 1982). Zamanla veterinerlikte kullanm giderek yaygnlat.
Grnt kalitesinde salanan gelimeler, portatif ultrason cihazlarnn mevcut
olmas ve cihaz fiyatndaki dmeler neticesi veterinerlikte kullanm olduka
kabul grd.
B-mod ultrasonografiyle gebelii doru tehis etmek oran; operatrn
tecrbesine, tohumlamadan sonra geen sreye, hayvann yana, probun tipine
ve frekansna gre deiir (Rajamahendran ve ark. 1994).
Srlarda trans-rektal B-mod ultrasonografiyle ovaryumdaki foliklleri,
korpus luteumu, uterusu, fets, fets canlln, fets saysn grmek ve
cinsiyetini bilmek mmkndr. Operatr gebelii erken tehis etmeye alrken
daha ok gebe olmayan hayvanlar tespit etmeye dikkat eder. B-mod
ultrasonografiyle gebe olmayan hayvanlar daha erken bir srede tespit edilerek
takip eden serviste gebe kalmalar salanr. Bylece srnn reme etkinlii
artar. Tohumlamadan 26-28 gn sonra trans-rektal ultrasonografiyle gebelik
tehisinde doruluk oran olduka yksektir. Doru tehiste operatrn tecrbesi
nemli rol oynar. Rektal muayene konusunda tecrbeli olanlar daha doru sonu
elde ederler. Gebelii erken yata belirlemeye ynelik baz almalarda et
srlarnda tohumlamadan sonra embriyonik vezikller en erken olarak;
gebeliin 9. (Boyd ve ark. 1988), 10. (Curan ve ark. 1986) veya 12. gnnde
(Pierson ve Ginther, 1984) grlebildii ifade edilmitir. Fakat bu almalarda
tohumlama tarihi aratrmaclar tarafndan biliniyordu. Dier taraftan, ilk kez
 179

tohumlanm dvelerde gebeliin 10-16 gnleri arasnda, gebelii doru tehis

etme orannn %50den az olduu akland (Kastelic ve ark. 1989). Ayrca
gebeliin 18, 20 ve 22. gnlerinde doru tehis orannn srasyla %85 ve %100
olduu bildirilmitir. B-mod ultrasonografiyle 5.0 MHzlik lineer al prob
kullanlarak gebeliin 20. gnnden balamak zere fets gebelik sresince
uterusta grntlemek mmkndr. Fakat 90. gnden sonra fetsn tamamn
grmek mmkn deildir. St srlarnda B-mod ultrasonografiyle, gebelii
tohumlamadan sonra 20-25 gnleri arasnda, doru tehis etme oran %65 iken
gebeliin 26-33. gnlerinde doruluk orannn %93e kt bildirilmitir
(Pieterse ve ark. 1990).
B-mod ultrasonografiyle fetsn kalp atlar gebeliin 22. gnden itibaren tespit
edilebilir, embriyonun canl olup olmad kolayca bilinir. Et srlarnda
dllenme oran ortalama %90 dr. Gebeliin 8. gnnde canl fets tayanlarn
oran yaklak %93 dr, fakat gebeliin 12. gnnde bu oran %56 ya der
(Diskin ve Sreenan 1980). St srlarnda embriyonik kayplar et srlarna
kyasla daha fazladr. Gebeliin 25-45 gnleri arasnda et srlarndaki
embriyonik kayp orannn yaklak %6.5 olduu bildirilmektedir (Beal ve ark.
1992). Baka bir almada ise gebeliin 30. gnnde yaplan ultrasonik
tehisler %4.2 olduu aklanmtr (Lamb ve ark. 1997). St srlarnda
gebeliin 28-56 gnleri arasnda embriyonik kayplarn %13.5 olduu
bildirilmitir (Fricke ve ark., 1998). Bu orana yakn sonular Smith ve
Stevenson (1995) ayrca Vasconcelos ve ark. (1997) tarafndan da elde
edilmitir. Gebeliin ve l embriyolarn erken zamanda tespit edilmesi suni
tohumlama yaplacak zamann erkene alnmasn salayarak srnn reme
etkinliinin artmasn salar. Hedef her hayvandan her yl salkl bir yavru
almak olmaldr. Aksi takdirde ekonomik kayplar sz konusu olur. St
srlarnda fets saysn B-mod ultrasonografiyle gebeliin 20-25. gnlerinde
bilmek mmkn olsa da fets says en doru ekilde gebeliin 49-55 gnleri
arasnda tespit edilir (Davis ve Haibel 1993).
B-mod ultrasonografiyle gebeliin 50-70. gnlerinde fetstn cinsiyetini
iri csseli srlarda (zellikle Holstein ve Simmental) en doru ekilde tehis
etmek mmkndr. Kk csseli hayvanlarda (rnein Jerseyde) ise cinsiyet
gebeliin 55-80 gnleri arasnda en doru olarak tehis edilebilir.

Laboratuar teknikleri

a) Viginal biyopsi
Biyopsi aleti ile kk bir miktar vaginal mukoza alnr ve histolojik olarak
incelenir. Alnan doku mum veya resin ierisine alnr sonra hemetosilin veya
eosin ile boyanr mikroskop altnda incelenir. Bu i ok fazla zaman alr ve
pahaldr. Bu nedenle pratikte snrl kullanlmaktadr. Arthur (1975) anstrsteki
koyunlarda 12 adet hcre kat bulunduunu bildirmektedir. Yzeysel epitel
 180

hcreleri yasslam olup ekirdekleri koyu renklidir. Daha derindeki hcreler

ise poliherdaldirler, ekirdekleri ak renkli ve yuvarlaktr. Gebclikte, ilk aydan
balayarak douma 20 gn kalncaya kadar vaginann epitel kat 3-6 sra
hcreden oluur.

b) Gebelikle alakal hormonlar yadmyla tehis

Gebelige ilgili spesifik maddeleri kanda ve idrarda belirleme esasna dayanr.
Gebelik srasnda maternal kan dolamnda baz protein benzeri maddeler
vardr. Bunlarn bir ksm fets tarafndan maternal kan dolamna geer. Bu
maddeler gebeliin gstergesi olarak dikkate alnr. rnek olarak atlartda;
maternal kan plazmasnda, at chorionik gonadotrophin (eCG) belirlemek veya
insanda, gebeliin erken safhasnda idrardaki insan chorionik gonadotrophinini
belirlemek sreti ile gebelik testi yaplr. Dier bir yolu ise kandaki idrardaki
ve stteki progesteronu belirlemektir.

Gebelikle ilgili hormon miktarlarnn rodioimmunoessey (RIA) ile vcut

svlarnda lmek esasna dayanr.
Progesteron testi
iftlik hayvanlarnda gebelii tespit etmede en yaygn kullanlan metottur.
Gebe olmayan hayvanlarda kandaki stteki idrardaki progesteron miktar git
gide azalr iken gebe hayvanlarda korpus luteum devaml mevcuttur ve
progesteron salglar. Bu neden ile gebe hayvanlarn kannda stnde ve idrarnda
progesteron vardr. iftlemeden veya suni tohumlamadan sonra; kan, st, idrar
rnekleri bir estrus periyodu kadar srede alnr. rnein; srda 22-23 gn,
koyunda 17-18 gn ve domuzda 21 gn boyunca alnr. Alnan rneklerde
progesteron miktar llr. Gebe olmayan hayvanlarda progesteron
konsantrasyonu dk kar.

Estron slfat testi

Fetos tarafndan en fazla retilen estrojen; estron slfattr. Tm iftlik
hayvanlarnda, fetste retilir ve sonra maternal svlara karr. Domuzda
dllenmeden 20 gn, atta 40 gn, kei ve koyunda 40-50 gn, srda 72 gn
sonra maternal svlarda llebilir.

Chorionik gonadotropin (CG) testi

Chorionik gonadotropinin kanda, idrarda tespit edilmesi hayvann gebe
olduunun iaretidir. Bu hormon gebe ksran kannda iftlemeden 40 gn
sonra llebilir. Kandaki konsantrasyonu, gebeliin 50-120 gnleri arasnda,
en yksek seviyededir.

Kaynaklar
Ardran GM, Brown TH (1964). X-ray diagnosis of pregnancy in sheep with special reference to the
determination of the number of foetuses. The Journal of Agricultural Science. 63: 205-207.
Arthur GH (1975). Veterinary Reproduction and Obstetrics. 4 th Ed., BailIiere-Tinda, London, 616.
 181

Arthur GH, Noakes DE., Pearson H., Parkinson TJ., (1996) Embryo transfer In: Veterinary reproduction and
obstetrics, Seventh edition, Saunders, Part 8 pp 675-693.

Ball L, Carroll EJ (1963). Induction of fetal death in cattle by manual rupture of the amniotic vesicle. J. Am.
Ve. Med. Assoc. 142: 373-374.
Banerjee SP, Vyas KK, Pareek PK, Deora KS, Vyas UK (1981). Note on clinical diagnosis of early pregnancy
in camel. Indian J Anim Sci. 51: 909-910.
Baum G, Greenwood I (1960). Ultrasonography-an aid in orbital tumor diagnosis. Arc. Ophthalmo. 64: 180-
194.
Beal WE, Perry RC, Corah LR (1992). The use of ultrasound in monitoring reproductive physiology of beef
cattle. J. Anim. Sci. 70: 924-929.
Boyd JS, Omran SN, Ayliffe TR (1990). Evaluation of real time B-mode ultrasound scanning for detecting
early pregnancy in cows. Vet. Rec. 127: 350-352.
Boyd JS, Omran SN, Ayliffe TR (1988). Use of a high frequency transducer with real time B-mode ultrasound
scanning to identify early pregnancy in cows. Vet. Rec. 123: 8-11.
Cameron AR ve Malmo J (1993). Evaluation of an ultrasonic Doppler probe for pregnancy diagnosis in cattle.
Aust. Vet J. 70: 109-111.
Chaffaux S, Valon F, Martinez J (1982). Evoluation de l'image echographique du produit de conception chez la
vache. Bull. Acad. Vet. Fr. 55: 213-221.
Chauhan FS, Sandabe UK, Oyedipe EO (1991) Predicting number of fetus(es) in small ruminants. Indian
Vet. J. 68: 751-754.
Coonrod SA., Coren BR., McBride BL., Bowen MJ and Kraemer DC., (1986)Theriogenology,
Abstract series 25, Abstract no 149
Cowie TA (1948). Pregnancy diagnosis tests: A review. Commonwealth Agricultual Bureaux Joint Publication.
13: 11-17.
Curan S, Pierson RA, Ginther OJ (1986). Ultrasonographic appearance of the bovine conceptus from days 10
through 20. J. Am. Vet. Med. Assoc. 189: 1289-1294.
Davis ME, Haibel GK (1993). Use of real-time ultrasound to identify multiple fetuses in beef cattle.
Theriogenology. 40: 373-382.
Diskin MG Sreenan JM (1980). Fertilization and embryonic mortality rates in beef heifers after artificial
insemination. J. Reprod. Fertil. 59: 463-468.
Doize F, Vaillancourt D, Carabin H, Belanger D (1997). Determination of gestational age in sheep and goats
using transrectal ultrasonographic measurement of placentomes. Theriogenology. 48: 449-460.
Ford E, Clark JH, Gallup JW (1963). The detection of fetal numbers in sheep by means of X-rays. Vet. Rec.
75: 958-960.
Fricke PM, Guenther JN, Wiltbank MC (1998). Efficacy of decreasing the dose of GnRH used in a protocol
for synchronization of ovulation and timed AI in lactating dairy cows, Theriogenology. 50: 1275-1284.
Fukui Y, Kobayashi M, Tsubaki N, Tetsuka M, Shimoda K, Ono H (1986). Comparison of two ultrasonic
methods for multiple pregnancy diagnosis in sheep and indicators of multiple pregnant ewes in the blood. Anim.
Reprod. Sci. 11: 25-33.
Ganaie BA, Khan MZ, Islam R, Makhdoomi DM, Qureshi S, Wani GM (2009). Evaluation of different
techniques for pregnancy diagnosis in sheep. Small Rum. Res. 85: 135-141.
Ginther, O.J. 1995. Ultrasonic imaging and animal reproduction, pp 54-97, In: Fundamentals Book 1,
Equiservices publishing, Cross plains, Wisconsin, USA.
Grace ND, Beach AD, Quinlivan TD, Ward B (1989). Multiple pregnancy diagnosis of using real time
ultrasonic body scanner and video-fluoroscopy systems. Proc. NZ. Soc. Anim. Prod. 49: 107-111.
Hanzen C, Delsaux B (1987). Use of transrectal B-mode ultrasound imaging in bovine pregnancy diagnosis.
Vet. Rec. 121: 200-202.
Heape W, (1891) Proceedings of Royal Society, London 48 457
Hunter GL., Adams CE., and Rawson LEA., (1955) Journal of Agricultural Science., 46, 143
Hulet CV (1972). A rectal-abdominal palpation technique for diagnosing pregnancy in the ewe. J. Anim. Sci. 35:
814-819.
Hulet CV (1973). Determining fetal numbers in pregnant ewes. J. Anim. Sci. 36: 325-330.
Hunt FV (1982). Electroacoustics: The Analysis of Transduction and ts Historical Background. 2nd ed,
Acoustical Society of America, New York.
Karen A, El Amiri B, Beckers J-F, Sulon J, Taverne MAM, Szenci O (2006). Comparison of accuracy of
transabdominal ultrasonography, progesterone and pregnancy-associated glycoproteins tests for discrimination
between single and multiple pregnancy in sheep. Theriogenology. 66: 314-322.
Kastelic JP, Curan S, Ginther OJ (1989). Accuracy of ultrasonography for pregnancy diagnosis on days 10 to
22 in heifers. Theriogenology. 31: 813 (abstr).
 182

Kutty CI. (1999). Gynecological examination and prenancy diagnosis in small ruminants using bimanual
palpation technique: A review. Theriogenology. 51: 1555-1564.
Lamb GC, Miller BL, Traffas V, Corah LR (1997). Estrus detection, first service conception, and embryonic
death in beef heifers synchronized with MGA and prostaglandin. AES Report of progress, Kansas, 783: 97
(abstr.).
Lowe SA (2004). Diagnostic radiography in pregnancy: risks and reality. Aust. N.Z. J. Obstet. Gynacol. 44:
191-196.
Madel AJ (1983). Detection of pregnancy in ewe lambs by A-mode ultrasound. Vet. Rec. 112: 11-12.
McCaughey WJ, Gilmore JG (1990). A note on pregnancy diagnosis in suckler cows using a Doppler
ultrasonic detector. Irish Vet. J. 43: 83-85.
Momont H (1990). Rectal palpation: Safety issues. Bov. Pract. 25: 122-23.
Mortimer R (2007). The future of pregnancy testing in beef cattle.In: Proceedings, Applied Reproductive
Strategies in Beef Cattle. September 11 and 12, Billings, Montana.
Nicholas FW nad Smith C., (1983) Aninal Production 36 341
Noakes DE (1996). Pregnancy and its diagnosis, pp. 79-81, In: Veterinary Reproduction and Obstetrics, 7th ed.
Arthur GH, Noakes DE, Pearson H, Parkinson TJ (eds), WB Sounders Company Limited, London.
Oksala A (1964). The clinical value of time-amplitude ultrasonography. Am. J. Ophthalmol. 57: 453-460.
Peters AR. And Ball PJH.,(1996) Embryo transfer and related techniques. In: Reproduction in cattle, Second
editon, Blackwell science, chapter 12 pp 183-198.
Pierson RA, Ginther OJ (1984). Ultrasonography for detection of pregnancy and study of embryonic
development in heifers. Theriogenology. 22: 225 (abstr.).
Pieterse MC, Szenci O, Willemse AH, Bajcsy CSA, Dieleman SJ, Taverne MAM (1990). Early pregnancy
diagnosis in cattle by means of linear-array real-time ultrasound scanning of the uterus and a qualitative and
quantitative milk progesterone test. Theriogenology. 33: 697-707.
Rajamahendran R, Ambrose DJ, Burton B (1994). Clinical and research applications of real-time
ultrasonography in bovine reproduction. Can. Vet. J. 35: 563-572.
Rendano VT (1983). Radiographic evaluation of fetal development in the bitch and fetal death in the bitch and
queen, pp. 947-952, In: Current Veterinary Therapy. 8th ver. WB Sounders Company Limited, Philadelphia.
Roberts SJ (1971) Veterinary Obstetrics and Genital Disease. Published by the autor, Ithaca NY, USA.
Romano JE, Magee D (2001). Applications of transrectal ultrasonography in cow/heifer reproduction, pp. 99-
104, In: Proceedings of the Annual Food Conference. Conception to Parturition: Fertility in Texas Beef Cattle.
Rowson L.E.A., Moor RM., nad Lawson R.A.S., (1969) Journal of Reproduction and Fertility 18 517
Smith MW, Stevenson JS (1995). Fate of the dominant follicle, embryonal survival, and pregnancy rates in
dairy cattle treated with prostaglandin F2 and progestins in the absence or presence of a functional corpus
luteum. J. Anim. Sci. 73: 3743-3751.
Studer E (1969). Early pregnancy diagnosis and fetal death. Vet. Med/Small. Anim. Clin. 64: 613-617.
Szenci O, Beckers JF, Humblot P, Sulon J, Sasser G, Taverne MAM, Varga J, Baltusen R, Gy Schekk
(1998). Comparison of ultrasonography, bovine pregnancy-specific protein B, and bovine pregnancy-associated
glycoprotein 1 tests for pregnancy detection in dairy cows. Theriogenology. 50: 77-88.
Thurmond MC, Picanso JP (1993). Fetal loss associated with palpation per rectum to diagnose pregnancy in
cows. J. Am. Vet. Med. Assoc. 203: 432-435.
Toal RL, Walker MA, Henry GA (1986). A comparison of real-time ultrasound, palpation and radiography in
pregnancy detection and litter size determination in the bitch. Vet. Radiol. 27: 102-108.
Trap MJ, Slyter AL (1983). Pregnancy diagnosis in the ewe. J.Anim. Sci. 57:1-5.
Tyrrell RN, Plant JW (1979). Rectal damage in ewes following pregnancy diagnosis by rectal-abdominal
palpation. J. Anim. Sci. 48: 348-350.
Vasconcelos JLM, Silcox RW, Lacerda JA, Pursley JR, Wiltbank MC (1997). Pregnancy rate, pregnancy
loss, and response to heat stress after AI at 2 different times from ovulation in dairy cows. Biol Reprod 56(Suppl
1), 140 (Abstr).
Warwick BL and Berry RO., (1949) Journal of Heredity, 40 297
Watt BR, Anderson GA, Campell IP (1984). A Comparison of six methods used for detecting pregnancy in
sheep. Aust. Vet. J. 61: 377-382.
West, D.M. 1986. Pregnancy diagnosis in the ewe, pp. 850-852. In: Current Therapy in Theriogenology, Morrow
DA (ed), WB Saunders, Philadelphia.
White ME, LaFaunce N, Mohammed HO, (1989). Calving outcomes for cows diagnosed pregnant or non
pregnant by per rectum examination at various intervals after insemination. Can. Vet. J. 30: 867-870.
Yalow RS, Berson SA (1960). Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. Journal of Clinical
Investigation. 69: 1157-1175.
Zemjanis R (1970). Diagnostic and therapeutic techniques in animal reproduction, pp. 29-45. 2nd ed. Williams
and Wilkins Co., Baltimore.
 183

Zemjanis R (1971). Pregnancy examination, p.29. In: Diagnostic and Therapeutic Techniques in Animal
Reproduction, 2nd ed. Williams and Wilkins Co., Baltimore.

14. BYOTEKNOLOJDE KULLANILAN LABORATUAR TEKNKLER

14.1. POLMERAZ ZNCRLEME REAKSYONU (PCR)

Bu teknik DNA nn belli bir parasnn (belir bir genin) hzl bir ekilde
oaltlmas iin kullanlr. Bu oaltmann yaplabilmesi iin oaltlacak DNA
parasnn 3`ve 5` ularndaki nkleotid zincirinin bilinmesine gerek vardr.
Ayrca bu teknik toplam RNAdan cDNA sentezlemede ve dier bir ok
alanlarda kullanlyor.
1980 li yllarn sonlarna kadar klonlama yapabilme; ilgilenilen zel geni
DNA zeride tespit etmeye ve o genin saf rneinin elde edebilmesine balyd.
imdi bu durum artk bir problem deil. nk uygulanmas basit fakat olaan
st ekili bir teknik olan Plimeraz zincirleme reaksiyonu (PCR) gelitirilmitir.
PCR gnmzdeki biyologlara gen izolasyonu konusunda yeni bir yaklam
kazandrmaktadr. Bu metotta DNA moleklnn belli bir segmenti birok defa
kopya edilmekte. Bylece ilgi duyulan geni tayan DNA paras istenildii
kadar oaltlabilmektedir. Sonu olarak ilgilenilen tek bir genin saf halde
birok rnei elde edilir. Ksaca doal (templeyt) DNA zerindeki herhangi bir
genin binlerce kopyas bu teknik sayasinde elde edilir.
PCR gen klonlamadan ok basittir ve abuk sonu verir. ok hassas bir
tekniktir. Bu nedenle bir tane hcreden veya dier materyallerden rnein;
kurumu kan lekesinden, ok nceden lm bir insann kemik hcresinden
PCR yardm ile genler ayrlabilir.

14.1.1. Tekniin prensipleri

Bir DNA moleklnn herhangi bir yeri (zel bir gen) kopya edilebilir. Kopya
edilecek yer DNA moleklnn neresinde olursa olsun bu yeri snrlayan iki
ucun nkleotid srasnn bilinmesine gerek vardr. PCR reaksiyonunu uygulamak
iin bu yerlerdeki nkleotid zincirinin bilinmesi arttr. Bu nedenle iki tane
oligo nkleotid sarmal haldeki DNA moleklnn her bir iplii ile bir utan
elenmelidir. Bu oligo nkleotidler primerler olarak DNA sentezide grev
alrlar. Primerler ayn zamanda kopya edilecek yeri DNA zerinde snrlarlar.
DNA kopyalama ii DNA polimeraz-I enzimi ile yaplr. Bu enzim
Thermus aquaticus bakterisinden izole edilmitir. Ayn bakteri Taq-I enzimini de
retir. Thermus aquaticus bakterisi scak ilkbahar aylarnda yaar. Bakterinin
rettigi enzimlerin bir ou (Taq polimeraz dahil olmak zere) scakla
 184

dayankldr. Ksaca bu enzimler scakln etkisi ile paralanmazlar. Bu nedenle

PCR reaksiyonu iin; scakla dayankl Taq polimeraz enzimine temel
gereksinim vardr. PCR reaksiyonu balatmak iin templeyt DNA ya iki primer
ve enzim eklenmeli takiben inkbasyona braklmaldr. Bylece templeyt DNA
zerinden yeni bir DNA sentezlenir. Scaklk 94C ye ykseltilir ve tepleyt DNA
ile yeni sentezlenen DNA birbirinden ayrlr. Yeni sentezlenen DNA zincirlerinin
ve nceki DNA zincirlerinin belirlenmi yerlerine daha fazla pirimer balanr.
ncede ifade edildigi gibi Taq polmeraz scaklkla paralanmaz bu yzden daha
sonraki DNA sentezinde de grev alr. ift sarmal DNAnn ayrlmas
(denaturasyon), pirimerlerin temleyt DNA ile elenmesi (Anneling) ve yeni
DNA zincirlerinin sentezlenmesi (Extentension ) zincirleme halinde devam eder.
Genelde 2530 defa tekrar eder. Sonunda istenilen genin milyonlarca kopyas
elde edilir.

3`
5`
5` 3`
Ayrlma

3` 5`

5` 3`

Oligonkleotit primerlerinin
3` eklenmesi 5`

3` 5`

5` 3` 5` 3`

Kopyalanacak DNA ksm

Polimeraz zincirleme reaksiyonun balangcnda oligonklotit primerleri templeyt
DNA ya balanr
 185

3`
e) Birinci a) DNA
reaksiyon tamamland. Ayn ilem tekrar eder, nn 2530
genelde
,
reaksiyon yaplr. Reaksiyon says; 5` denaturasyonu
teknii uygulayan ve Oligo
kiinin tercihine
, nkleotitlerin
baldr. Sentezlenen DNA fregmentleri Agaroz elektroforezine tabi tutulur
ve incelenir (primerlerin) eklenmesi

5` 3`
, , lerin ve Taq prlimeraz
b) dNTP
enziminin eklenmesi

3`
, 5`
,

c) Yeni DNA zincirlerinin

sentezlenmesi
3` 5`
, ,

5` 3`
, ,
3`
, 5`
,

d) Ayrlma

Deneyin sonunda, reaksiyon rnnden rnek alnr ve agaroz jel elektroforezi

yardm ile analiz edilir. Kopyalanan genlerin jel zerinde grlebilmesi iin
nce rnekler ethidium bromidle boyanr ve jele yklenir. Ethidium bromid bir
eit floresan boyadr. Ultra Viole altnda boyanan DNA paralar jel
ierisinde floresan grnm sergiler. Bu ekilde kopyalamann doru yaplp
yaplmad jele baklarak grlr. nk ilemde yanl primerler kullanlabilir
ve DNA nn yanl bir yeri kopya edilmi olabilir veya prosedrde bir yanllk
yaplarak hi kopyalama yaplamayabilir. Bu problemler jel elektroforezi
yardm ile grlebilir. Elde edilen PCR rnleri plazmid DNAsna veya
bakteriofaj DNA sna ligasyon yaplarak veya direkt olarak PCR rnlerinin
nkleotid zinciri okunabilir.
 186

Agaroz jel

l,
parametre

PCR sonucu genin elde

edilen kopyalar

Her ne kadar, PCR tekniini uygulamak kolay olsa da elde edilen sonularn
dikkate alnabilmesi iin, deney dikkatli planlanmal ve uygulanmaldr.
Primerlerdeki nkleotid dizisinin doruluu deneyin baars asndan
nemlidir. Ayn zamanda reaksiyon iin doru scaklk ve soukluk derecesinin
uygulanmas da deneyin baars asndan nemlidir. Ayrca elde edilen genler
ile neler yaplabileceini bilmek de deney iin nemlidir.

14.1.1.1.Tipik DNA kopyalama ii iin gereken maddeler

Aadaki maddelere ihtiya vardr.
a) zerinde allan anlya ait DNA rnei (Tepleyt DNA)
b) Scakla dayankl DNA polimeraz
c) ki tane primer veya oligo nkleotit (P1 ve P2)
d) Deoksionkleotit trifosfatlar (dNTP ler)
e) Reaksiyon bafr
f) Magnezyum ve semeli dier bir iyon

a) DNA nn elde edilmesi (Trizol metoduna gre DNA izolasyonu)

Dokulardan DNA veya RNA izolasyonu iin burada trizol metodu dikkate
alnarak anlatlmtr fakat ayn amaca ynelik farkl metotlar da mmkn.
Trizol toksik bir maddedir. Elbiseye ve ele bulamamasna dikkat edilir. Bu
madde ile alrken ele daima eldiven, gze gogol taklmal ve eker ocak
ierisinde allmaldr. Bir organdan; rnein testisten veya ovaryumdan veya
vcudun herhangi bir yerinden DNA y ayrmak iin: alnan doku veya organ
nce hcre dzeyine kadar kltlr. Bunun iin organ; 30 dakika sv nitrojen
ierisine braklr sonra donmu haldeki organ havanda ezilerek toz haline
 187

getirilir. Bylece organ hcre seviyesine kadar kltlr. Bu ilem yksek

titreimli ses dalgalar ile de yaplabilir. Eer hcrelerden DNA ayrlacak ise bu
ileme gerek yoktur.
Trizoln eklenmesi: Toz halindeki doku spatula yardm ile nkleaz iermeyen
tp ierisine konur ve hassas terazide tartlr sonra zerine 10 kat trizol eklenir.
Eer bir hcre sspansiyonundan DNA veya RNA ayrlacak ise hcre
sspansiyonu santrifj yaplr sonra elde edilen hcre pelleti zerine trizol
eklenir. Eer terazide bulunan doku arl 100 mg ise zerine en az 1ml Trizol
eklenmelidir.
Homogenizasyon: Trizolu ekledikten sonra doku rnegi ve trizolun iyi
karmas iin 12 dakika elle alkalanmaldr.
Faz ayrma : Trizol ve hcre karm 5 dakika oda scaklnda (15-30 derece
aras) bekletilir. Sonra tpn iinde iki ksm grlr (stteki DNA ve RNAnn
bulunduu affaf ksm ve alttaki krmz fenol ksm). stteki affaf ksm pipet
alnp yeni bir tpe aktarlr (Tpe yava hareketler ile muamele edilmeli aksi
halde ayrlan ksmlarda tekrar karmalar olur. Bu durum DNA veya RNA nn
kalitesini bozar ksaca alttan protein karm olabilir) ve zerine; tpe eklenen
her bir ml trizol iin 0,2 ml kloroform ilave edilir ve santrifje konulur.
12000xG de, 15 dakika, 28 C de santrifj yaplr. Santifj sonunda bir DNA ve
RNA karm bir pellet elde edilir
DNAnn ayrlmas (presipitasyon): DNA y ayrmak iin: balangta
kullanlan trizolun her ml si iin 0,3 ml %100 luk etanol eklenir. Sonra tp
birka kez ba aa yukar olacak ekilde evrilir ve iyice karmas salanr.
Sonra oda scaklnda 23 dakika bekletilir. Sonra tp 28 C de 2000 g de 5
dakika santrifje tabi tutulur. Santrifj sonunda DNA pellet halinde tpn
altnda grlr. stteki fenol-etenol ksm yavaca alnr. Alnan st ksm ya
proteinleri ayrnak iin saklanr veya atlr.
DNA nn ykanmas: Etanol kullanlarak (%10) 0.1M sodyum sitrat zeltisi
hazrlanr. Bu solisyondan balangita kullanlan trizolun her 1 ml si iin 1 ml
tpn dibindeki DNA pelletinin zerine braklr ve kartrlr. Sonra tp 30
dakika oda scaklnda braklr. Takiben tp 28 C de, 5 dakika 2000g de
santrifje tabi tutulur. stteki sv atlr, DNA pellet halinde tpn altnda kalr.
Bylece DNA ykanm olur. Bu ilem iki kere tekrarlanr. DNA miktar ok
fazla ise bir sefer daha fazla ykama yaplabilir.
DNA nn elde edilmesi: Ykama ileminin sonunda DNA tpn altnda pellet
halinde elde edilir. Elde edilen pellet 510 dakika vakum altnda kurutulur.
Sonra pellet 8mM lk NaOH zeltisi yardm ile zlr. Bu zeltiden
balangta DNA izolasyonu iin kullanlan organn her 5070mg m iin veya
her 1x107 hcre iin 8mM lk NaOH solsyonundan 0,30,6 ml alnr sonra kuru
DNA pelleti zerine braklr. Pipetle hafif fla yaplarak pellet dalr. Halen
elde edilen DNA da zlmeyen jel benzeri maddeler vardr. Bu maddeleri
uzaklatrmak iin santrifj yaplr. Santrifj 28 derecede 12000g de 10 dakika
 188

yaplr. Bu santrifj sonunda zlmeyen jel benzeri maddeler tpn altnda

pellet halindedir. Tpn st ksm( Sv ksm) pipet ile alnr ve yeni bir tpn
ierisine konur. Bu sv ksm saf DNA y ieren ksmdr. Bylece DNA
ayrlm olur.
Ayrlan DNA miktarnn hesaplanmas: Miktar hesaplamak iin elde dilen
svdaki DNA rneinden 2l pipetle alnr ve RNA-DNA hesaplaycnn
kvetine braklr. zerine 98l nkleaz iermeyen ultra saf su eklenir. Kvet
makine zerindeki yerine doru ekilde yerletirilir. Alette okurken absorbans
degeri A260 olmal ve lm ift zincirli DNA esasna gre yaplmaldr. 1 A 260
nitesi =50 g/ml ift zincirli DNA dr. Bylece elde ettiimiz DNA
solsyonunda ne kadar DNA olduu bilinir. Buna gre PCR iin; DNA
solsyonundan ka mikro litre kullanlaca belirlenir. Elde edilen DNA
solsyonunun pH 0,1M lk hanks tuz zeltisi (HEPES) ile 8.4 de ayarlanr
sonra DNA tp ilerde kullanlmak zere eksi scaklk derecelerinde saklanr.
Elde edilen DNA rneinin pH sna gre eklenecek HEPES miktar aadaki
tabloda belirtilmitir.
 189

Elde edilen DNA solisyonun PH 0.1 M lik HEPES den eklenecek miktar
s
7.5 180l
7.8 135 l
8.0 115 l
8.2 90 l
8.4 66 l

Elde edilen DNA solisyonun 1 M lik HEPES den eklenecek miktar

PH s
7.0 42 l
7.2 30 l

PCR reaksiyonuna elde edilen DNA dan 0.11g DNA eklenir. Buna gre ka l
eklenecei bellidir.
b) Polimeraz emziminin salanmas ve Primerllerin (Oligonkleotitlerin)
dizayn edilmesi
Polimeraz enzimi ticari irketlerden satn alnmaktatr. Ticari irketler
ounlukla enzim ile bilikte PCR iin gerekli olan dier maddeleri kit halinde
satlmaktadrlar. Primerlerler PCR reaksiyonunun baars bakmndan anahtar
rol stlenir. Eer primerler doru dizayn edilirlerse DNA zerindeki ilgi duyulan
gen baarl bir ekilde kopyalanabilir. Eer primerler yanl dizayn edilirlerse
kopyalama ilemi olmaz veya DNA nn yanl bir yeri kopya edilir ya da DNA
nn birka yeri kopyalanr. Bu gibi durumlarda deney baarsz olur. Bu nedenle
primerlerin dizayn iin dikkatli olmak gerekir.
 190

L 1 2 3 4

L: Merdiven (Ladder) veya parametre.

Bu kopyalanan DNA parasnn ka baz
ifti ierdiini belirlemek iin kullanlr.
Kopyalanacak ksmn ka baz ifti
ierdii bilindii iin ladder ile
karlatrlr ve doru ksmn
kopyalanp kopyalanmad bilinir.
1: stenilen gen kopyalanm. nk
kopyalanan ksmn kaln izgi hizasnda
olmas beklenmekte
2: Hi kopyalama yok
3: DNA nn yanl ksm veya yanl bir
gen kopyalanm
4: DNA zerinde birden fazla farkl gen
kopyalanm

Elenmenin ve kopyalann yaplabilmesi iin her bir primer elenecei tepleyt

DNA ile e olan nkleotid dizinine sahip olmaldr. Primerler zerindeki
nkleotidler ile tepyet DNA zerindeki nkleotid dizini ayn olmamaldr.
Aada insan Alfa-1 globulin geni ve gendeki exon ve intron ksmlar
grlyor.Siyah ksmlar genin exon ksmlarn, ak yerler ise genin intron
ksmlarn gsteriyor. Bir genin intron ksm o genin fonksiyonu belirler.

nsan Alfa-1 Globulin geni

3`...GTGTCTGAGTCTCTCTTGGGTG
G...5
AGACTCAGAG
..

5`..CACAGACTCAGAGAGAACCCACC..3`
3`...ATGGGGGCACCAGAAACTTATTT..5`

GGGGCACCAGAAA...

5`..TACCCCCGTGGTCTTTGAATAAA..3`,
,
 191

Kopyalanacak DNA paras 3kbdan daha uzun olmasa iyi olur. deal olarak
kopyalanacak genin 1 kbdan daha ksa olmas istenir. Standart PCR teknikleri
kullanlarak 10kb uzunlundaki DNA fregmentleri kopyalanabilir fakat uzun
fregmentlerin kopyalanmasnda istikral sonu almak zordur. zel teknikler
kullanlarak 40kb uzunluundaki DNA paralar kopyalanabilmektedir.

Primerler ne kadar uzun olmal?

Ksa primerler DNA zerinde yanl yeri kopyalayabilirler ve istenmeyen PCR
rnlerinin elde edilmesine neden olurlar. rnein bir insan DNAs boydan
boya kopyalanmak isteniyor ve kopyalama iin kullanlan primerler 8 nkleotid
boyunda veya `8-Mer` ise bu durumda DNA zerinde birden fazla yer
kopyalanr. DNA zerinde bu uzunluktaki primerler iin birden fazla balanma
yeri vardr. nsan genomu 3 300 000 000 baz ifti uzunluundadr. Sekiz merlik
pirimerlerin DNA zerinde her 48 =65536 baz ifti eder ve bu insan genomundan
ok kktr. Bu u anlama gelir, kullanlan primer her 65536 baz iftinde bir
balanma yeri bulur. nsan genomu 3 300 000 000 kb uzunluunda olduuna
gre genom zerinde 3 300 000 000/65536= 50 000 tane primerlerin balanmas
iin uygun pozisyon vardr. Bu nedenle sekiz nkleotidlik primerlerin insan
DNA zerinde tek bir geni doru kopya etmesi mmkn deil.

Elenme yerleri

3` 5`

5` 3`

Deiik PCR rnleri

Eer primerler 17 nleotit veya 17 mer uzunluunda olur ise DNA zerinde
yanlzca bir hibridizasyon yeri bulunur sonucta tek tip PCR rn elde edilir.
Eer primerler ok uzun olursa reaksiyon yava yrr bu durum reaksiyonun
etkinliini azaltr. Bu yzden pratikte 30 mer den uzun primerler pek
kullanlmaz.
 192

c) Reaksiyon iin doru scaklk derecelerinin salanmas.

Her PCR reaksiyonu srasnda reaksiyon karm eit scaklk
seviyesine getirilir.
1) Ayrlma (Denaturasyon) scakl. Bu scaklk derecesinde ift DNA
zinciri arasnda nkleotitleri birbirine balayan hidrojen balar paralanr
ve DNA nn iki zinciri birbirinden ayrlr. Bu ilem genelde 94 0C de
yaplr.
2) Eleme veya hibridizasyon scakl (Anneling). Bu scaklk
derecesinde primerler teplyt DNA ya balanrlar. Eleme genelde 5153

C de olur
3) DNA sentezleme scakl (Ekstension). Bu scaklk derecesinde her bir
tepyet DNA zerinden yeni bir DNA zinciri sentezlenir. Bu ilem
ounlukla 74 C de yaplr.
Ayrlma
94 C
100 1 dak.
90 Kopyalama
(74C)
80
2 dak
Scaklk (Derece)

70
60
50
Elenme
40 1 dak.
30
51-53C
20
10
En nemli scaklk derecesi
0 eleme (Anneling) scakldr. nk eleme iin
kullanlan scakln derecesi
1 2reaksiyonun
3 4 spesifikliini
5 6 7 etkiler. DNA-DNA
elemesi scakla baml bir olaydr.
ZamanEer scaklk ok yksekse primerler
(Dakikalar)
tepleyt DNA ya balanamazlar ve ayr dururlar. Eer ok dk ise spesifik
balanma olmaz sonuta tepleyt DNA nn yanl yerleri kopyalanabilir. Bylece
istenmeyen PCR rnleri elde edilir. Bu nedenle ideal bir elenme scakl
primerler ile tepleyt DNA arasndaki elenmeyi salayacak derecede dk,
yanl elenmeye neden olmayacak dercede yksek olmaldr. Uygulanmas
gereken eleme (anneling) scakl bulmak iin primerlerin erime noktasndan
hareket edilir. Primerlerin erime noktasnda baz iftleri bir birinden ayrlr.
Erime noktasnn 12 derece alt eleme scakl iin uygundur.

Pirmerlerin erime noktas aadaki forml yardm ile bulunabilir.

Erime Scakl (Tm)=(4X(Guayn says+ Stozin says)+(2x(Adenin says+Timin says) 0C

Tm= (4x (G+C))+ (2x(A+T))0C

 193

rnek: Kullanacamz primerin nkleotit dizini aadaki gibi ise;

3`..AGACTCAGAGAGAACCC ...5`
Bu primerde:
Guayn (G) = 4 tane
Ctozin (C) = 5 tane
Adenin (A)= 7 tane
Timin (T) = 1 tane vardr. O zaman bu primer iin erime scakl yukardaki
formle gre: Tm= 4x(5+4)+2x(7+1) =36+16= 52 0C dir.
Erime doktasn bir iki derece alt anneling iin uygundur. Anneling scakl ise
hesaplanan bu scakln 12 derece alt olmaldr. yle ise seilen bu primer
iin anneling scakl 5051 derece olmaldr.

d) Reaksiyonun salanmas
Diyelimki mevcut DNA solsyonunun 1lsinde 1g DNA var. Eer reaksiyon
karmnn son hacminin 50l olmas isteniyor ise buna gre PCR reaksiyonundaki
bileenlerin miktar aadaki gibi olmaldr.
Bileenin ad Bileenin hacmi (l) Karmdaki konsantrasyonu
DNA 1 1 g/reaksiyon
Primerler (oligo nkleotitler) 1 0.2M/reaksiyon
dNTP 4 0.2 M/reaksiyon
PCR bafr (10X) 5 1X/reaksiyon
Mg+2 (25 mM) 5 2mM/reaksiyon
TaqDNA polimeraz 1 5 unite/ reaksiyon
PCR ya uygun su (final volm 32
50l ye getirmek iin)
Toplam 50l
En son enzim eklenir ve reaksiyon tp PCR cihazna (Termal cycler) konur. Bu
cihaz otomatik su banyosu ilevi yapar. Denaturasyon, eleme ve sentezleme
scaklklar, sreler ve devir says girilir. Alet programa gre PCR ilemlerini
yrtr.

14.1.1.2. Elde edilen PCR rnlerinin analizi.

Polimeraz zincirleme reaksiyonu ou zaman dier deneylerin yaplabilmesi iin
bir balang tekil eder. Elde edilen PCR rnleri; kullanlan orijinal templeyt
DNA hakknda bilgi edinmek iin deiik yollarla allabilir. PCR rnlerini
almak iin deiik teknikler nerilmitir. Bunlarn en nemlileri:
 194

a) Agaroz jel elektroforezi

b) Elde edilen PCR rnlerinin nkleotid dizisini belirlemek (DNA sekans
analizi)
c) PCR rnlerini klonmaya ynelik analizler.

14.1.1. 2.1. Agaroz jel elektroforezi: PCR ile ilgili deneylerin ounda, elde
edilen PCR rnnden bir miktar alnarak aaroz jel elektroforezine tabi tutulur.
Ethidium bromid yardm ile jel zerindeki bantlar grlebilir. Eer PCR rn
olduka az ise bu durumda sentezlenen PCR rnn grmek iin southern
hibridizasyon teknii kullanlr. Daha ncede ifade edildii gibi; eer jel
zerinde bant grlmyor ise veya jel zerinde birden fazla bant grlyor ise
reaksiyonda bir eyler yanl gitmitir bu yzden deneyin tekrarlanmas gerekir.
ou zaman jel elektroforezi sadece PCR tekniinin doru yaplp
yaplmadn bilmek iin yaplmaz ayn zamanda bir takm ek bilgiler elde
etmek iin de jel elektiroforezi yaplr. rnein: Tepleyt DNA nn kopyalanan
ksmlarnda restriksiyon yerlerinin bulunup bulunmadn bilmek iin jel
elektroforezi yaplr. Bunun iin. PCR rnn jelde yaymadan nce restriction
endonkleaz enzimi ile PCR rn kartrlr. Alternatif olarak, belli
byklkteki PCR rn kullanlarak, teplety DNA nn kopyalanan
ksmlarnda bir insert ksmnn veya silinmi (deletion mutation) ksmlarnn
var olup olamadn grmek iin de jel elektroforezi kullanlr.
1 2 3

1: Restriksiyon noktas tamayan PCR

rn
2: PCR rn bir restriksiyon yeri
ieriyor. Enzim rn belli bir yerden
l kesmitir.
3:Teplety DNA nn kopyalanan
ksmnda bir insert noktas var.

14.1.1.2.2. PCR rnlerinde direkt nkleotit zinciri analizi yapmak

Eer jel elektroforezi tek bana yeterli bilgi vermiyor ise bu durumda ikinci bir
adm; kopyalanan DNA parasndaki nkleotid dizisini tespit etmektir.
Nkleotid dizisinin direkt olarak PCR rnlerinden bulma metodu Sanger-
Coulson veya Maxam Gilbert tekniklerinden birine gre yaplr. Sanger-Coulson
 195

tekniinde balang materyali olarak tek zincirli DNA ya gerek vardr. Fakat
PCR rnleri ift zincirlidir. Bu nedenle tek zincirli PCR rnlerini saflatrarak
elde etmeye gerek vardr. Tek zincirli PCR rn elde etmek iin; PCR rnleri;
biri normal primer dieri ise modifiye edilmi primer olmak zere iki primer ile
tekrar PCR yapmak gerekir. Modifiye dilmi primer kopyadala DNA y kolay
ayrt etmek iin baz yerlerinden modifiye edilmitir. rnein primerlerden
birinin ucuna magnetik bir ksm balanabilir. PCR reaksiyonundan sonra
magnetik uclu primerlerin templeyt DNA zerinden kopyalad DNA zinciri de
manetik ucu tar. Sonra bu markalanm DNA paralar dierlerinden ayrlr.
Buna benzer bir metot; primerlerden birinin ucuna manetik son olarak biotin
balamaktr. Daha sonra avidin yardm ile biyotin ile markalanm DNA
paralar ayrlr. nk biotin avidine balanr. Bu ekilde ayrlan tek zincirli
DNA larn Sanger-Coulsan metodunun standart prosedrne gre nkleotit
dizisi tespit edilir.

14.1.1.2.2.1. Bir genin (DNA parasnn) ihtiva ettigi nkleotitleri sra ile
tespiti ve okunmas ( DNA sekans analizi)
Bir genin DNA sekans; o geni oluturan DNA moleklnn pirimer yapsn
temsil eden ve ard arda gelen harflerden olumu zincirdir. Bir baka ifadeyle
DNA sekans yapmak demek; doal DNAnn kopyas olan kopya DNA (cDNA)
zerinde bulunan genin nkleotit zincirinin tespit edilmesi anlamna gelir.
Templeyt DNA dan eli RNA sentezlenir. Eli RNA dan ise cDNA
sentezlenir. cDNA zerindeki genetik ifre templeyt DNA zerindeki ifrenin
kopyasdr ayn zamanda tm eli RNA trlerinin karldr.

Bir genin nkleotit zincirini bilmek ne gibi yararlar salar?

a) Genetik hastalklarn tehisi ve terapisi daha etkili ekilde salanr.
b) Genlerin fonksiyonu, genler ve proteinler arasndaki iliki, genlerin ve
proteinlerin yaps hakknda daha fazla bilgi elde edilir.
Canlnn kendisi ile ilgili tm bilgiler hcrelerinin ekirdeklerindeki DNA
moleklnn ierisindedir. Bilim adamlar DNA sakans yaparak bu genetik
bilgilere ularlar. DNA molekl zerindeki genetik ife kodlad RNA ve
proteinin yapsn tanmlar. Genin nkleotid zincirini bilmek o genin kodlad
proteinin rekombinant trn sentezleme ayn zamanda o genin biyolojik
fonksiyonu hakknda bilgi edinme imkn sunar.

14.1.1.2.2.1.1. DNA zincirini okuma ( skans analiz) metotlar

DNA zincirindeki nkleotidler yaygn olarak iki metot kullanlarak belirleniyor.
Bu metotlar:
a) Maxam-Gilbert metodu
b) Sanger-Coulson metodu
En kullanl olan Sanger ve Coulson tarafndan ileri srlen metottur. Sanger
ve Coulson 1975 ylnda di-deoksi nklotit terminator ad verilen bir metot
 196

gelitirdiler. Bu metot templeyt DNA kullanarak DNA prolimeraz araclyla

deoksinkleotit trifosfatlardan (dNTP) komplement DNA sentezleme esasna
dayanr. Oluan reaksiyona az miktarda di-dioksi trifosfat (ddNTP) ilave edilir.
Di-dioksi trifosfat( ddNTP) deoksinkleotit trifosfatlarn (dNTP) benzeridir
fakat ddNTP lerde hidroksil (OH) yoktur.

DNA sekans yapma reaksiyonu plimeraz zincirleme (PCR) reaksiyonu gibidir.

DNA sekans yapmak iin oluturulan reaksiyon karmnda da templeyt DNA,
serbest nkleotidler (dNTP ler), bir enzim ( genelde Taq polimeraz enziminin bir
eidi) ve bir primer (tek zinzirli templeyt DNAnn elenmesini salamaya
yarayan 20-30 nkleotid uzunluundaki kk tek zincirli DNA paras
(olginkleotit) vardr.
Zincir terminasyonunda ilk adm ksa yapay bir oligonkleotit primerinin
tek zincirli templeyt DNA ile elenmesidir. Tm DNA trlerinin sekansnn
yaplabilmesi templeyt DNAnn saf ve paralanmam olmasn gerektirir.
Kullanlan oligonkleotit primeri templeyt DNA ile kararl ift zincirli (dubleks)
yapy oluturur. Kullanlan primer templeyt DNA zerinde sadece bir yere
balanmal, kendi kendini eleme kabiliyeti olmamaldr.
Pirimer dizayn etmeye yarayan birok bilgisayar program mevcuttur.
Pahal olsa da ticari olarak olgonkleotit sentezleyen aletler (DNA
sentezleyicileri) mevcuttur. Bu aletler her zaman kullanlmazlar bu yzden
sahip olmak gerekmez. Oligo nkleotid sentezi saflatrlmas ile uraan ticari
irketlerden primerlerin salanmas daha isabetlidir. PCR sonucu elde edilen
genler templeyt DNA olarak kullanlabilirler fakat PCR sonucu elde edilen bu
rnlerin saf olmas esastr.
Reaksiyon esnasnda DNA polimeraz templeyt DNA y okur ve temleyt
DNA zincirine komplement olan yeni zinciri sentezler. Eer reaksiyon tpnn
ierisinde bunan toplam nkleotidlerin %5 i ddNTP ise her yeni sentezlenen
DNA zincirine ddNTP eklenir fakat plimeraz enzimi bir sonraki normal
nkleotidi (dNTP) zincire ekleyemez bylece sentez durur. Her yeni sentezlenen
zincir her zaman bir ddNTP ile biter. Her yeni sentezlenen zincir bu ekilde
termine edildii zaman o zincirle polimeraz arasndaki balant kopar. Bundan
sonra o zincirin sentezi durur. Bu nedenle templeyt DNA zerinden sentezlenen
 197

her bir PRC rn bir ddNTP ile son bulur. Polimeraz enziminin herhangi bir
ddNTP ye gelip durmas tamamen randomdur.
 198

29.1.2.2.1.3. Elle DNA Sekanz yapma

Eer sekans yaplacak DNA ksa ise elle normal PCR reaksiyonu oluturulur
fakat eklenen toplam dNTP lerin %5 i UV yla renk oluturan ddNTP
ieriri. Bu deiik ekilde floresanlatrma her ddNTP iin farl renk
oluturacak ekilde yaplr. Tpnn ierisine floresanlatrlm ddNTP
eklenir. Daha nce ifade edildii gibi plimeraz tpteki herhangi bir ddNTP
zincire eklerse bundan sonra yeni zincirin sentezi durur. Sonra sentezi duran
tm PCR rnleri rnlerinin bykl incelenir. Bunun iin elde edilen
rnler ince poliakrilamit jel ierisinde yrtlerek ayrtrlr. Bu ekilde
tm DNA paralar lm yapmak zere byklklerine gre sralanr.
Eklenen ddNTP ler UV altda her biri deiik renk sergileyecek ekilde
floresanlatrlm veya izotopla markalanm ekilde kullanlabilir. Daha
ok UV ile farkl renk sergileyecek ekilde floresanlatrlm ddNTP
ler tercih edilir. Eer her bir ddNTP farl bir renk sergileyecek ekilde
floresanlatrlm ise jel zerine bakarak veya jelin renkli fotorafn
ekilerek DNA fregmentlerinin nkleotid zinciri belirlenir. Jelin rnek
ykleme yerinden en aada bulunan bant DNA sentezinde kullanlan
primere en yakn nkleotiddir. rnek ykleme yerine yakn olan fregment
ise kullanlan pirimere en uzak nkleotiddir. Jel zerindeki herhangi bir
fregmentin boyu bir sonraki fregmentten bir nkleotit kadar uzundur nk
elektroforez sistemi bunu salayacak ekilde ayarlanmtr. rnein
reaksiyon tpne UV altnda mavi renk oluturacak ekilde ddCTP
eklenmi ise jele bakarak aadan yukarya doru her ferment ierisinde
bulunan bir veya iki mavi nokta C nkleotididir. Aadan balayarak yukar
doru listelenir. Grlen C nkleotidleri arasndaki bolularda bulunan
nkleotidlerin neler olduunu bilmek iin dier nkleotidleri de farkl
renklerde floresanlatrlarak PCR ve zincir terminasyonu yaplr ve
boluklar doldurulur.
Manual yolla 250400 baz ifti (bp) uzunluundaki DNA zinciri
okunabilir. Biyoteknoloji rnlerini satan irketlerden DNA zincirini okumaya
yarayan kitler salanabilir. Bu okunan 250-400bp ksm bir genin uzunluuyla
veya bir kromozomun uzunluu ile karlatrlrsa ksadr. Bu nedenle farkl
nkleotid belirleme reaksiyonu sonucu elde edilen bilgiler birletirilmelidir. Ksa
uzunluktaki DNA paralar iin (rnein cDNA klonlar iin) ilk reaksiyonun en
kk paras bir sonraki reaksiyon iin sentetik primer olarak kullanlr ve bu
ekilde tm zincir okununcaya kadar devam edilir.

29.1.2.2.1.4. Makine yardmyla nkleotid srasn belirleme

Uzun DNA zincirine ait veriler ok fazladr bu yzden elle analiz yapmak
zordur. Bu ilem uzun DNA paralarn okumakla sorumlu laboratuarlarda
makine yardmyla yaplr. DNA zinciri doal olarak dorusaldr bu nedenle
ilgili veriler bilgisayar tarafndan analiz edilmektedir. DNA veri analizi yapmaya
yarayan programlar mevcuttur. Bu laboratuarlarda poliakrilamit jeli yrtme ve
 199

deiik renklerlere karlk gelen nkleotidleri okuma ve dzene sokma ii

otomatik DNA okuyucusu tarafndan yaplr. Makinenin iinde UV laser
yayan aparat monte edilmitir. Bu k yardmyla oluan 4 farkl renk en alttan
ste doru okunur. Makineye yklenmi bilgisayar programna hangi rengin
hangi nkleotidi temsil ettii girilmitir. Makine aada grld gibi 4 farkl
rengi tayan grafikle birlikte nkleotid srasn okur ve hafzasnda depolar.
Ayn zamanda yazcdan da verilerin kts alnabilir. Bu ekilde 700 veya daha
fazla sayda nkleotid ieren DNA fregmentleri doru bir ekilde okunur.
Makineden alnan katta veriler aadaki gibi yazlmtr
.

Elde edilen veriler veri bankasnda toplanr. Bu veri bankalar unlardr.

Avrupa molekler biyoloji laboratuar (EMBL), Heidelberg, Almanya
Gen Bankas, ABD
DNA veri bankas, Japonya
Ayrca genlerin nkleotid zinciri ile ilgili verilere NCBI (National Center
for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) internet
sayfasndan ulalabilir.

29.1.2.3. Elde edilen PCR rnlerinin klonlanmas

Eer kopyalanan DNA paralar hakknda daha fazla bilgiye ihtiya varsa
bu durumda kopyalanan paralar bir vektre yklenebilir ve standart
metotlardan biri ile klonlanan DNA paralar analiz edilir. Bu ilem basit
grnse de gerekten ok komplekstir. Bu ilemde problem PCR rnlerinin
sonunun dz (blunt) veya kntl (yapkan) kesilmesiyle alakaldr. Eer
PCR rnleri dzgn kesilmi ise bu durumda bu rnler dz-son ykleme
teknii ile vektre balandrlr. Eer kopyalanan DNA paralarnn ular
yapkan (sticky) ise bu defa yapkan son ykleme ilemi yaplr. Taq
polimeraz ile yaplan PCR ileminde elde edilen PCR rnlerinin sonunda
fazladan bir Adenin nkleotidi vardr. nk bu enzim sentezledii her DNA
zincirinin sonuna bir Adenin ekler. Bu nedenle Taq kullanlarak kopyalanan ift
zincirli DNA larn sonu dz deildir ve 3` ucunda fazladan bir Adenin
nkleotidi eklenmitir. Bu 3`ucundaki ekstra nkleotid, ekzonkleaz enzimi ile
muamele sonucu koparlabilir fakat bu popler bir yaklam deildir. nk,
exonkleaz enziminin ar aktif hale gelmesini engellemek ok zordur bu
 200

yzden enzim molekln tamamna zarar verebilir. Bu problemi zmek iin

fazladan bir Timin nkleotidi tayan vektr bulmak gerekir. Bu vektre
yapkan sona sahip DNA paras yklenebilir. Vektrler standart olarak dz son
(blunt end) olarak hazrlanrlar. Bu haldeki bir vektr, yapkan sona sahip hale
getirmek iin gine vetrre taq polimeraz ve dTTP ekleyerek salanr. Bu
durumda enzim vektr DNA sn 3` sonuna bir Timin nkleotidi balar. Bu
durumda vektr de yapkan sona sahip olmu olur. Bu haldeki vektre elde
edilen PCR rnleri yklenebilir ksaca klonlama yaplabilir.
kinci bir popler yaklam ise yapkan son (restriksiyon noktas) tayan
primerlerin dizayn edilmesidir. Bu durmda PCR ileminden sonra Elde edilen
PCR rnlerine restriksiyon endonkleaz enzimi ile muamele edilir. Bu enzim
ile muamele sonucu yapkan sona sahip DNA paralar vektre yklenebilir.
Yukardaki ilemin yerine restriksiyon noktas, ksa bir segment olarak
primerlerin 5` sonuna eklenebilir. Bu segment, tepleyt DNA ya balanmaz fakat
PCR reaksiyonu esnasnda birok kopyas oluur.

Primerdeki nkleotid
5`..CTCTGGATCCAGATATG..3` dizisi

Elde edilen PCR rnleri

5`..CTCTGGATCCAGATATG..3`

AGAGACCTAGGTCTATAC...
Fazla A

BamHI enzimi ile

restriksiyon

GATCCAGATATG..3`

GTCTATAC

Yapkan son

Tm DNA polimerazlar DNA sentezi esnasnda yanllar yapar. Bazen yanl bir
nkleotidi, sentezlenen DNA zincirinin bir ucuna ekleyebilirler. Fakat
polimeraz enzimlerinin ou yanln zerine tekrar gelerek yaplan yanl
dzeltir. Enzimin yapt bu ileme Enzimin `Proof reading` fonksiyonu denir.
Taq polimeraz enziminin proof reading fonksiyonu yoktur bu yzden yapt
 201

yanl dzeltemez. Bu nedenle taq polimeraz her zaman tam tamna tepyleyt
DNA nn aynen kopyasn yapmaz. Birok uygulamada enzimin yapt hatalar
nemli deildir.

29.1.3. Polimeraz zincirleme reaksiyonu nerelerde kullanlr?

a) PCR teknigi kullanlarak oldukca az miktardaki DNA zerinde
allabilir.
ok hassas bir tekniktir. rnein tek bir sperm hcresinden ayrlan DNA PCR
reaksiyonu ile oaltlp allabilir. Bu nedenle bu teknik forensik ilemler iin
nemlidir. Bu teknik yardmyla tek bir sac telindeki veya kan lekesindeki DNA
oaltlarak DNA testi yaplabilir. Teknik adalete hizmet eder. Bu teknik ayn
zamanda tarihte lm insanlarn kemiklerindeki DNA y kopyalama iin de
kullanlr. Bu teknik yardm ile fosiller zerindeki DNA kalntlar zerinde
allabilir. Bylece teknik arkeolojiye ve paleontolojiye yeni imknlar salar.

b) Hastalklarn tehisinde PCR kullanlr

Bu teknik patojenik hastalklarn tehisinde kullanlr. rnein kan veya vcut
svlarda hastala sebep olan virs DNA s bulunup oaltlarak tespit edilir.
Bylece daha semptomlar belli olmadan hastaln tehisi yaplr. Ayrca, PCR
yardm ile genetik hastalklar tehis edilir. DNA nn zerinde durulan ksm
PCR ile kopya edilir ve oaltlr sonra kopyalanan DNA paralarn direkt analiz
ile nkleotid dizisi tespit edilir. Bu ekilde nkleotid dizisinde meydana gelen
deimeler veya mutasyonlar belirlenir.
c) RNA y kopyalamada kullanlr.
Polimeraz zincirleme reaksiyonu ile sadece DNA kopyalanmaz RNA da
kopyalanr. RNA y kopyalamak iin RNA nce revers transkriptaz enzimile
cDNA ya evrilir. Sonrada Taq polimeraz ve nleotitler eklenerek standart PCR
prosedr kullanlr. Bu ilem RT-PCR metodu olarak bilinir. nk nce RNA,
cDNA ya dztrlr yani revers transkripsiyon yaplr sonra standar PCR
uygulanr.
RNA cDNA PCR
Revers Taq
transkriptaz polimeraz

Revers Transkripsiyon-Polimeraz zincirleme rakasiyonu (RT-PCR) tekinigini

kullanarak her hangi bir gene ait eli RNA (mRNA) miktar bulunur. Bu teknik
 202

yardm ile genlerin fonksiyonlar veya herhangi bir genin ekspresyonunun artp
artmad allabilir. Dokularda deiik zamanlarda zel bir gene ait mRNA
miktar bulunabilir. nceleri bu ilem northern bloting teknii kullanlarak
yaplyordu. Kuantitatif PCR metodunun esas reaksiyon balangcnda
kullanlan DNA veya RNA miktar ile PCR sonucu elde edilen rnlerin miktar
arasnda dorusal ilikiye dayanr.

d) Deiik genomlar karlatrmak iin kullanlr.

Daha ncede ifade edildii gibi, PCR de kullanlan primerler ok ksa ise tek bir
eit fregment deil de deiik paralarn kopyasndan olumu bir karm elde
edilir. Bu ekilde ksa primerler kullanlarak yaplan bir random kopyalama ii
flogenetikte nemlidir. Filogenetik deiik canl trlerinin tarih srecinde
geirdii deimeleri inceleyen bilimdir. PCR ileminden sonra kopyalanan
DNA paralar ile jel elektroforezi yaplr. Jel zerinde grlen bantlama ekli
kullanlan tepleyt DNA yapsnn genel yaps hakknda bilgi verir. Bu ekilde
deiik hayvanlarn geneomlar arasndaki farklar jel zerinde karlatrlarak
grlr. Bylece hayvanlarn ayn rktan olup olmad belirlenir.
 203

30. SOUTHERN TRANSVER (SOUTHERN BLOTTING)

Bu teknik Dr E.Southern tarafndan icat edildi ve 1975 ylnda molekler
biyoloji dergisinde yaynland. Teknik basit fakat ok kullanldr. DNA
zerinde yaplan almalara nemli derecede katks olmutur. Bu nedenle
dnya apnda molekler genetik laboratuarlarnda geni kullanm alan
bulmutur. Bu teknik yardm ile neler yaplr?
a) Belli bir rnekte DNA nn var olup olmad bilinir
b) DNAnn zel bir yerinde veya bir gende mutasyon olup olmad bilinir.
c) Belli bir DNA parasnn ne kadar byk olduu bilinir.
d) DNA nn belli bir yerinde veya bir gende yeniden yaplanma ve
silinmi( deletion) ksmlarn oluup olumad bilinir.
e) Klonlama prosedrnn baarl yaplp yaplamadn bize gsterir.
Yukardaki ifadelerden anlald gibi bu teknik yardm ile genetik hastalklar
tehis edilmektedir.

30.1. DNAnn yaps

DNA heliks eklinde ift sarmal yapdadr. Her sarmaln temel yap tan
nkleotitler oluturur. Nkleotitler drt degiik bazdan olumutur. Bu bazlar:
-Adenin (A)
-Guanin (G)
-Stozin (S)
-Timin (T)
Bu bazlarn her biri riboz ekerine baldr. Bu eker bazlarn heliksi
oluturmak zere bal olduu fosfat grubu tarafndan fosforilize edilmitir.
DNA moleklnn iki zinciri hidrojen balar ile bir arada durur. Bu hidrojen
balar, baz elemesi esasna gre, A ile T; G ile S arasnda oluur. Bu kurala
gre DNA nn bir zinciri zerindeki bazlar biliniyor ise dier zincir zerindeki
bazlar kolayca tahmin edilir.
rnein:
I. Zincir: AGSTTGSTAATGSSG ise
II. Zincir: TSGAASGATTASGGS olur.

Grld gibi ikinci zincir birinci zincire komplementtir bylece Watson ve

Crickin ift heliks formunu oluturur. DNA n ift sarmal heliks formunda
olduu ilk defa X-ray kristalografisi ile anlald. DNA organizmay oluturan
hcrelerin ekirdeklerinde bulunur ve o canly tekrar oluturacak gerekli bilgiyi
tar. Organizmann basit ve karmak oluuna bal olarak DNA molekl
kk olabildii gibi ok fazla byk olabilir. rnein bir haploid insan
genomu yaklak 3x 109 baz ifti ierir. Bu da DNA nn bykln lmek
iin bir parametre olarak kullanlr. Bir insan kromozomu yaklak 6x 10 7 baz
iftinden olumutur. Kromozom zerinde bir genin ortalama uzunluu 3000
baz iftidir. Bylece bir insan genomu zerinde kodlanm yaklak 20.000 tene
 204

gen bulunur. Bu gre eer zel bir gen zerinde alma yaplmak isteniyorsa
bu durumda DNA molekl olduka byk fakat zerinde durulan gen olduka
kktr. DNA zerindeki bir gen zerinde bulunduu DNAdan milyonlarca kez
kktr. Kliniksel koullarda DNA oulukla kandan ekstrakte edilir bylece
elde edilen DNA tm krmozomlarn DNA sn temsil eder. Klinik koullarn da
10 ml kandan yaklak olarak 500 mikro gram DNA elde edilir. zerinde
durulan genin miktar bu 500 mikro gram DNA ierinde oldukca azdr. Bu
nedenle DNA y keserek kk paralara blmek gerekir. lgi duyulan geni
belirlemek iin kesilen paralar baz metotlarla birbirinden ayrmak gerekir. Bu
i biraz zor grnse de gnmzde gen yapsn almak iin gerekli olan
kompleks analizleri yapmay salayacak gl metotlar gelitirilmitir.

30.2.Restriksiyon enzimleri
Bundan 46 yl nce ok zel fonksiyonu olan bir enzim kefedildi. Bu enzim
DNA moleklne eklendii zaman DNA molekln zel bir nkleotid zinciri
zerinden kesti. rnek olarak Eschericha coli den izole edilen ve EcoRI olarak
adlandrlan enzim her zaman dzenli olarak DNA moleklnn neresinde
GAATTC nkleotid zinciri bulursa keser. Staphylococcus auresus bakterisinden
ayrlan Sau enzimi her zaman DNA zerinde nerede bir GATC nkleotid sras
bulursa oradan keser. Baz enzimler DNA molekl zerinde drt bazlar ise
alt baz tanr. Bir DNA molekl zerinde drt nleotit tanyan bir enzim
random olarak kesmek iin her 256 (44) bazda bir yer bulur. Alt baz tanyan bir
enzim DNA molekl zerinde her 4096 (46) bazda kesmek iin bir yer bulur.
Gnmzde ticari olarak benzer birok enzim vardr. Bu enzimlerden biriyle
veya birkann bileimiyle byk DNA molekllleri oldukca kk
fregmentlere ayrlr. Bylece DNA molekl kontrol edilebilir derecede
kltlr. Bir sonraki adm ise restriksiyon enzimyle kesilen DNA
fregmentlerinin birbirinden ayrtrlmas neticesi fregmenlerin belirlenmesini
kolaylatrmaktr.

30.3. Jel elektroforezi

Jel elektroforezi biyolojik bilimlerde yaygn olarak kullanlan bir tekniktir. Bu
teknik DNA dhil olmak zere her eit molekl birbirinden ayrmada
kullanlr. Southern transferde en yaygn olarak kullanlan jel agaroz jelidir.
Agaroz bir polisakkarittir. Suyla kartrlp stlrsa gevek bir matriks
oluturur. Restriksiyon enzimi ile kesilmi DNA paralarn birbirinden ayrmak
iin nce agaroz hazrlanr. Agarozu hazrlamak iin toz halindeki agarozdan 1
gr tartlarak 100 ml 40mM-Trish asedat bafr veya 1mM-EDTA bafr zerine
boaltlr, pH 8. Karm stlr. Istma sonucu agaroz zlr. Scak karm
dikdrtgen eklindeki kalba dklr. Dkldkten sonra rnek ykleme yeri
oluturmak iin bir tarafna tarak yerletirilir. Sonra souyup kat hale gelmesi
iin bekletilir. Katlaan jel her iki taraf elektroda bal zel bir tanka
 205

yerletirilir. DNA moleklnde fosfor vardr. Fosfor negatif ykl olduu iin
DNA da negatif ykldr. Bu nedenle DNA tankn iinde pozitif kutba doru
hareket edecektir. Kk paralar hzl byk paralar ise yava hareket
edecektir. Belli bir sre sonra bir izgi zerinde tm DNA paralar ayrlm
olacaktr. Kk paralar bir ucta byk paralar ise dier ucta olacaktr. Jel
zerinde ayrlm binlerce DNA fregmentinin birisinde bir mutasyon olabilir.
Belki de bu mutasyon daha henz dnyaya gelmemi canlnn hayatn ciddi
ekilde etkileyecek.
30.4. Transfer (Bloting)
Soutma sonucu oluturulan jel ok hassastr kolayca krlabilir. Bu nedenle ok
nazik ve dikkatli davranmak gerekir. Jelin matriksinde ilgilendiimiz gen vardr.
Gen jeldeki binlerce DNA parasnn ierisindedir. Bu nedenle jeldeki geni
analiz etmek mmkn deildir. Bunun iin jeldeki DNA paralarnn dar
karlmas gerekir. Dr E.Southern Jel ierisindeki DNA paralarn dar
karmak iin uygun bir metot gelitirdi. Diar karlan DNA daki zel gen
radyoaktif problar kullanlarak analiz edildi. DNA nn jelden dar karlma
problemi jel zerine yerletirilen nitroselilz veya naylon membran zeyine
jeldeki DNA paralarnn transfer edilmesiyle zld. Jeldeki DNA
paralarnn membran zerine geirilmesi tuz zeltisinin kapillar hareketle
yukar doru hareket etmesi sonucu jeldeki DNA paralarn birlikte ykayarak
stteki membrann jele bakan yzeyine yaptrr (Resim 29.4.1)

Arlk
Dz platform
Kat yn

Whatman filtre kad

Membran
Jel
Whatman
Bafr

Destek

Resim 30.4.1. Alttaki baffr kapillar ekimle yukar hareket ederek jel zerindeki DNA y
membran zerine geirir. Bu transfer 15-20 saat srr.

DNA bu ekilde kapillar hareketle jeden dar karld gibi vakumla da dar
karlr.
 206

30.5. Esleme (Hibridizasyon)

DNA ift zincirli heliks eklindedir. ki DNA zinciri hidrojen balar yardm ile
bir arada tutulur. Eer DNA 65-70 dereceye kadar stlr ise bu iki zincir
birbirinden ayrlr. Fakat scaklk dtke bu iki zincir tekrar birbirine balanr.
ki DNA paasnn tekrar bir araya gelmesine eleme veya hibridizasyon denir.
zerine DNA transfer edilen membran; ierisinde 65 derecede hibridizasyon
ncesi solsyon bulunan tpe DNA nn bulunduu ksm ie gelecek ekilde
konur. Bu scaklktaki solsyon iki DNA zincirinin bir birinden ayrlmasn,
membran zerine iyice balanmasn salar. Ayrca solsyonda bulunan protein
karm, polisakkaritler ve deterjan membran yzeyini kaplar (bylece
kullanlan problarn spesifik olmayan balanmas bloke edilir). Birbirinden
ayrlan DNA zincirlerine problarn balanmas mmkn olur. lgi duyulan zel
DNA paras (gen) enzimik yolla markalanr ve DNA ile elemeye sokulur.
Kullanlan yaygn bir metot radyoaktif nkleotidlerin DNA probuna
eklenmesidir. Markalanan prob membrann bulunduu tpn ierisindeki
solsyona uygun bir pipetle braklr. Brakrken membrana dokunmamasna
dikkat edilmelidir. Eklendikten sonra birka saat ayn scaklkta elemeye
braklr. Hibridizasyon veya eleme esnasnda radyoaktif prob membran
zerindeki tek zincirli DNA zerindeki bazlara e olan kendi bazlaryla balanr
(Kullanlan prob ilgi duyulan genin bizzat kendisidir nemli olan o geni
membran zerinde gstermek ve yapsndan bir deiiklik olup olmadn
grmektir). Hibridizasyondan sonra membran ykanr ve DNA n bulunduu
yzn zerine X-Ray filmi konur. Kasete alnan membran ve film 1224 saat
bekletilir. Eer prob membran zerindeki geni belirlemi ise film zerinde
bantlar grlr. Bu teknik birok ama iin kullanlr zeklilikle genetik
hastalklarn tehisinde ok kullanldr.
30.6. Genetik hastalklar southern transfer medoduyla tespit edilir.
Genetik hastalklarn tehisinde PCR veya Southern transfer metotlar
kullanlmaktadr. rnein miyotonik distrofi genlik dneminde (2025
yalarnda) semptomlar grlen ve otozomal dominant bir gen tarafndan
determine edilen genetik bir hastalktr. Vaka 8000 de bir grlr. Hastalk kas
kayb, gzde katarak, kalp atlarnda anormallikler ve iletiim bozukluklar
eklinde kendini belli eder. Hastala sebep olan genin DNA zerindeki yeri
1992 de tanmland. Gen 19. kromozomun 19q13.3 lokusunda bulunan bir eit
serin-treonin kinaz genidir. Serin-treonin kinaz geninde meydana gelen
mutasyon sonucu hastalk meydana gelir. Bu mutasyonda genin bir ucuna
bazlk (CTG)n ksmn defalarca ayn ekilde ard ardna gelerek balanr. Normal
kromozoma 5-35 arasnda CTG balanmtr bu durumda hastalk grlmez
fakat 50 kez veya daha fazla sayda tekrar varsa orta derecede rahatszlk
grlr. Durumu ok acil olan hastalarda tekrarlanma says 2000 in zerindedir.
Mutasyon neticesi gene eklenen bu triplet saysnn genin fonksiyonunu ne
ekilde etkiledii henz aklanmamtr. Bu gendeki tekrarlanan tripletler
 207

nedeniyle meydana gelen uzamay belirlemek hastaln tehisi iin bir metottur.
Bu hastaln ldrc formu daha domam yavruya anne tarafndan transfer
edilebilir. Eer hastal tayan bayan hamile ise bu durumda duumdan nce
yavruda hastaln var olup olamad tehis edilmelidir. Tehis iin hem Hamile
bayandan hem de domam yavrudan alnan rneklerden DNA ayrlr. Ayrlan
DNA EcoRI ike kesilir ve normal southern transfer teknigi kullanlr. Ksaca
elektoforez yaplr sonra DNA membran zerine aktarlr. Kullanlan DNA probu
tekrarlanan triplet ksmna karlk gelen DNA parasdr. Miyotonik distrofi
genine ait bu radyoaktif probla membran zerindeki DNA elemeye sokulur.
Tekrarlanan ksmn bulunduu DNA parasnn byl 10.000 baz iftidir.
Eer genin bir ucuna 1000 defa CTG balanm ise DNA parasnn bykl
3000 baz ifti artar bu durumda DNA parasnn bykl 13.000 baz ifti
olur. Bu byklkteki farkllk southern transfer metodu ile belirlenir.
 208

31.DOKULARDA VE HCRELERDE GEN EKSPRESYONU

ALIMAYA YENELK METOTLAR
Dokularda ve hcrelerde gen ekspresyonu almak iin birok teknik
gelitirilmitir. Bu teknikler:
a) Ters (Revers) Transkripsiyon-PCR (RT-PCR)
b) Northern transfer
c) RNAaz koruma testi
d) n-sit eleme (Hibridizasyon)
e) Dot blot
f) S1 nkleaz testi
Bu teknikler temel laboratuar teknikleridir ve yksek kalitede saf RNA rnei
gerektirirler. Saf ve kaliteli RNA rnei elde etmek titiz almay gerektirir
nk RNaz enzimini rneklere bulatrmamak gerekmektedir. Aksi halde tm
RNA paralanr.

30.1. Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincirleme Reaksiyonu (RT-PCR)

Bu teknik gen ekspresyon almalarnda kullanlan tekniklerin en hassas
olandr. Herhangi bir transkripitin (genin) mevcut olup olmadn ve o genin
ekspresyon seviyesini bulmada kullanlr. rnein Ovaryumdaki LH hormona
ait reseptrn sentezini determine eden genin ekspresyonu allacak ise; nce
ovaryumdan RNA ayrlr. Ayrlan RNA ters transkripsiyonla cDNAya
dntrlr. Sonra cDNA kullanlarak normal PCR yaplr. Teknii uygulamak
iin nce dokulardan RNA nn ayrlmas ve ayrlan RNA nn cDNA ya
dntrlmesi gerekir.

a) RNA nn dokudan ayrlmas

RNA ile alr iken plak elle tpler tutulmaz devaml eldiven taklr. nk
deri RNAaz enzimi tar. Bu enzim RNA ya bularsa RNA y paralar sonuta
RNA elde edilemez. RNA ve DNA nn dukulardan ayrlma ilemi hemen hemen
ayndr. kisinde de trizol eklenerek santrifj yaplr. Santrifjden sonra tpn
iinde iki tabaka grlr. stteki effaf tabaka ile alttaki krmz tabaka olmak
zere. Buraya kadar olan ilemler tamamen ayn. Bunda sonra RNA y ayrma
ilemi farkllklar gsterir. Bu aamadan sonra yaplacak ilemler sra ile:
1-Santrifjden sonra saffaf ksm pipet ile alnr yeni bir tpn ierisine braklr.
Alrken yava alnz. Alttaki krmz ksmdan hibir ey karmamaldr.
2-Balangta kullanlan her 1 ml trizol iin tpe 0.5 ml izopropanol ekleyiniz
3- Tp 10 dakika oda scaklnda bekletiniz
4- Tp santrifje koyunuz, 12000g de 2-8 0C de 10 dakika santrifj yapnz
 209

5-Santrifjden sonra RNA jele benzer ekilde tpn altnda pellet halde grlr.
6-Tpn st ksmndaki svy yavaa tp eerek boatnz. Pelletin kayp
dmemesi iin dikkatli olunuz
7-Tpn dibindeki pellet zerine; balangtaki kullanlan 1 ml Trizol iin 1 ml
%75 lik etanol ekleyin. Sonra tp 1-2 dakika vorteks zerine koyarak
alkalayn sonra tp 5 dakika 7500g ve 2-8 0C de santrifje tabi tutunuz. Bu
ekilde RNA y ykam olursunuz.
8-Santrifjden sonra RNA pellet halinde tpn altdadr. Tpn altndaki RNA
5-10 dakika oda scaklnda kurutunuz. Bunun iin kat mendillerin zerine
pelletin bulunduu tpleri ters evirerek koyunuz. Kat svy alr.
9-RNA az enzimi iermeyen ultra saf sudan 100 mikro litre her tpe ekleyiniz.
Bylece RNA elde edilir
10-Tplerdeki solsyonun ne kadar RNA ierdiini bulmak iin aynen DNA
ileminde anlatld gibi DNA/RNA hesaplaycs yardm ile bulunur. Tpn
ierisinden 2 mikro litre RNA rnei pipetle alnr ve RNA/DNA
hesaplaycsnn kvetine konur. zerine 98 mikro litre nkleaz iermeyen ultra
saf su konur. Kvet hesaplayc zerindeki yerine yerletirilir ve alet RNA
hesaplamaya ayarlanr sonra absorbans deerinden (A 260/280 ) miktar belirlenir.
Bylece eldeki rneklerde RNA nn bulunup bulunmad ve ne kadar
bulunduu bilinir. Eger RNA yoksa dier ilemleri yapmaya gerek yoktur RNA
tekrar elde edilmeli titizlikle ayn ilemler tekrar edilmelidir.
11-Tpler skca kapatlr ve 2780C de gelecekte kullanlmak zere muhafaza
edilir.

b) Ters (revers) Transkripsiyon (RT)

Revers transkripsiyon toplam RNAnn bir cDNA primeri (random hekzamer)
ve revers transkriptaz enzimi yardmyla belli bir scaklk derecesinde cDNA ya
dntrlmesidir. Elde edilen cDNA tm genlerin karl olan eli RNAlar
bnyesinde bulundurur. Bir hcredeki belli bir gene ait mRNA miktar ile o
genin aktivitesi arasda paralel iliki vardr. Bylece mRNA daki deimelerden
hareketle genin ekspresyonunun art veya azald bilinir.
1-RNA solsyonunun bulunduu tpten 1 mikro gr RNA alnz.
Dietilpiyrokarbonat (DEPC) kartrlm nkleaz iermeyen 10 mikro litre ultra
saf su eklenmi PCR tpne, RNA rneini pipetle koyunuz. Final volm
(RNA+ DEPC iceren su) 12.5 mikro litre olmaldr. Dietilpiyrokarbonat sudaki
RNAaz ve DNAaz (ksaca nkleazlar) yok eder. RNA ile alr iken
kullanlan sulara her zaman bu medde eklenir. Kimyasaln zerinde litreye ne
kadar ve nasl eklenecei belirtilmitir.
 210

2-Tpn zerine 1L random hekzamer primeri eklenir. Bu primer bir cDNA

primeridir; revers tranckriptaz ve dNTP ler yardmyla toplam RNA dan cDNA
sentezlenmesini salar.
c) Sonra karm iki dakika 70 C de tutulur.
d) Tp 70 dereceden alnr aniden karn veya buzun ierisine konur.
e) Sonra aadaki maddeler belirtilen ekilde eklenir.

Bileenler Karmdaki hacmi (l)

5x Rekasiyon bafr 4
dNTP karm (10mM) 1
RNA az inhibitr 0.5
Revers transkriptaz 1

6-Yukardaki ilaveler yapldktan sonra tp pipetle iyice kartrlr sonra 42

derecede 1 saat bekletilir. DNA az aktivitesini yok etmek cDNA sentezini
durdurmak iin tp 94 derecedeki su banyosuna konur. Bu scaklkta 2-3 dakika
bekletilir.
7-Tp santrifje konur. 12000g de 2-8 derecede 1 dakika santrifje tabi tutulur.
Tpteki RNA, cDNA ya dntrlmtr. cDNA gelecekte kullanlmak zere
70 derecede saklanr. Tpn ierisinden bir miktar cDNA alnarak normal PCR
prosedr uygulanr.
 211

31. Northern transfer (Northern Blotting)

Molekler biyolojide kullanlan anahtar tekniklerden biridir. Bu teknik
yardmyla zel bir genin karl olan eli RNA (mRNA) miktar
llmektedir. Her eyden nce bilinmesi gereken ey niin eli RNA miktarnn
llmesi gerektiidir. Eli RNA miktarn lmenin iki sebebi vardr.
1- Hangi dokunun zel bir geni tadn belirlemek. Ksaca gen
ekspresyonunu belirlemek ve o genin kodlad protenin fizyolojik
fonksiyonu hakknda bilgi sahibi olmak.
2- Sz konusu genin ekspresyonunu etkileyen faktrleri belirlemek. Bu
faktrler beslenme faktrleri, hormonal faktrler veya evre faktrleri
olabilir.

Doku

Dokudan toplam RNA

ayrtrlr

Dokudan ayrtrlan toplam RNA dan mRNA ayrtrlr sonra

mRNA agaroz-jel elektro forezi yardm ile byklklerine gre
fraksiyonlara ayrlr.

Byklklerine gre ayrtrlan mRNA selilz veya

Naylon membran zerine geirilir. Membran
zerindeki mRNAy membrana iyice balamak iin
zerinde mRNA bulunan membran 80 derecedeki
frnda 60 dakika kurutulur.

Membran zerindeki RNA ilgi duyulan zel gene ait

radyoaktif ve non-radyoaktif eli RNA probuyla
hibridizasyona (elemeye) tabi tutulur.

Hibridizasyon ileminden sonra spesifik eli RNA

membran zerinde belirlenir ve sonra miktar llr.

30.1. Tekniin prensipleri

Dokudan ayrlan toplam RNA veya eli RNA ayrlarak membran zerine
geirilir. Sonra ilgi duyulan zel eli RNA zerindeki bazlarn tmne veya bir
ksmna e olan radyoaktif eleme probuyla mebran zerine geirilen spesifik
eli RNA belirlenir. Northern transfer kelimesinin asas anlam jel zerindeki
RNA nn stteki membran zerine transfer edilmesidir. Fakat geni anlamda tm
prosedr iin kullanlyor. Bu tekniin ilk basaman dokudan toplam RNA y
ayrtrma ilemi oluturur.
 212

30.1.1. Dukudan toplam RNA nasl elde edilir?

Toplam RNA= eli RNA+ ribozomal RNA dr. Toplam RNA nn ancak % 1-2 si
eli RNA dr. Toplam RNA y hcrelerden ayrmann ilk adm hcre zarlarn
paralayarak RNA y aa karmaktr. Bu da hcre zarn oluturan
proteinlerin paralanmasna baldr. 1979 ylnda John Chirgwin ve
meslektalar nkleik asitlere zarar vermeden hcre zarlarn paralayacak bir
metot gelitirdiler. Bu metodu kullanarak dokuyu guanidinium thiocyanate ve b-
mercaptoethanol iinde homogenize ettiler. Guanidinium thiocyanate bir eiit
protein paralaycdr iken b-mercaptoethanol ise guanidinium thiocyanatn
nkleik asitlere zarar vermesini engeller. Dokuyu bu ekilde homogenize edildi
sonra ultrasantrifj veya etanol ekstraksiyonu ile hcrelerden RNA y ayrdlar
ve saflatrdlar. lk olarak bu teknik bilim adamlarna RNA izole etme imkn
salamtr. Bu tekingin zayf taraf uzun zaman almas ayrca etkin ve tutarl
sonu vermemesidir. 1987 ylnda Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi,
John Chirgwin ve meslektalarnn bulduu metodu gelitirdiler. Guanidinium
thiocyanate ile fenol-kloroformu kartrarak RNA ayrma iini tek basamaa
indirgediler. Bu ekilde RNA ayrma prosedr sresini ve saysn azaltarak
aratrmaclara ok fazla rnekle ayn anda alma avantaj saland. Bu tek
basamakta RNA ayrma ilemi ayn zamanda RNA kaybn da azaltt ayrca
aatrmaclara ok kk dakulardan RNA ayrma imkan sundu.
30.1.1.1. Fenol-Kloform (Trizol) metoduna gre RNA ayrma
a) Dokuyu hcre dzeyine kadar kltme: Toplam RNA nn ayrlaca
doku RNaz enzimi iermiyen ekipman yardm ile hcre dzeyine kadar
kltlr. Kullanlan tm aletlerinin RNaz enzimi iermediinden emin
olunmaldr aksi halde bu enzim tm RNAy yok eder. Doku nitrojen
yadmyla dondurularak sertletirlir sonra RNaz iermeyen havanda
dvlerek gtlr.
b) Homogenizasyon: 50-100mg toz haline gelmi doku RNaz iermeyen
spatula kullanlarak tartlr. Tartlan doku RNaz iermeyen tp ierisine
konur. Sonra zerine 10 kat Trizol eklenir. 100 mg tartlm ise zerine 1
ml trizol eklenir sonra yukar ve aa ynde alkalanr.
c) Faz ayrma: alkalanan tp nukleoprotein komplekslerinin temamen
ayrmas iin 5 dakika 1530 C de inkbasyona braklr. Sonra tpn
zerine nceden eklenen trizoln her 1 ml si iin 0,5 ml kloroform eklenir.
Tp kapatlr ve sert bir ekilde yukar aa istikamette 15 saniye elle
alkalanr ve 23 dakika 1530 C de inkbasyona braklr. Sonra tp
santrifje konulur ve 12000 g de 28C de 15 dakika dndrlr.
Santrifjden sonra tpde; altta krmz rekli fenol kloroform tabakas ve
stteki affaf tabaka olamak zere iki tabaka sv grlr. DNA ve RNA
stteki affaf svdadr. stteki sv pipetle alnr. Alrken dkkatli
olunmal alt tabakadan hibir ey karmamaldr. Bu yzden affaf ksmn
yukar taraf alnmal.
 213

d) RNA y DNA dan ayrma: affaf svda DNA ve RNA birliktedir. RNA
y DNA dan ayrmak gerekir. Tpn indeki DNA+RNA karmn
zerine nceden eklenen trizoln he 1 ml si iin 0,5 ml izopropil alkol
(izopropanol) eklenir. Elle alkalanr ve 10 dakika 1530 C de
inkbasyona braklr. Sonra tp santrifje konulur ve 12000 g de 2-8C
de 10 dakika santrifj yaplr. Santrifjden sonra RNA tpn kenernda
jele benzer ekilde grlr.
e) RNA y ykama: santrifden sonra tpdeki sv dikkatlice lavaboya
dklr. Dkerken alltaki pellet halindaki RNA nn da kayp gitmemesine
dikkat edilmelidir. Kolayca kaybedilebilir. Ykama iin %70 lik etanol
kullanlr. Eklenecek etanol miktar balandta eklenen trizol mktarna
eit olmaldr. Eger 1 ml Trizol eklendiyse 1 ml %70 etanol eklenecek.
Pellet halindeki RNA ni zerine 1 ml etanol eklenerek 1520 saniye
vorteks zerinde alkalanr. Sonra 5 dakika 7500g den fazla olmamak
artyla 28C de 5 dakika santrifjde dndrlr. Santrifjden sonra
RNA pellet halinde alttadr. stteki sv dikkatlice dklr. Sonra tpteki
RNA 510 dakika oda scaklnda kurutulur. Bunun iin tp ters cevrilir
ve altteki emici ktlar zerine konur. Ama svnn tememen RNA dan
ayrlmasn salamak. RNA ok fazla kurutulmamal aksi takdirde tekrar
zlmesi zor olur.
f) Kurutmadam sonra RNA y tekrar zme: Kurutmadan sonra her
tpn zerine 50100l RNaz iermiyen su (DEPC) veya %0.5 SDS
solsyonu eklenir. Sonra pipetle fula yaplarak pelletin dalmas
salanr. Eger dalma zor oluyorsa 5560C de 10 dakika inkbasyona
braklr sonra tekrar pipetle pellet datlmaya allr.
g) Elde edilen RNA nn kaltesini belirleme.
Spektrofotometre yardmyla elde edielen RNA nn kaltesi tespit edilir.

30.1.1.2. Toplam RNA dan mRNA y ayrma

Toplam RNA dan mRNA ayrlmadan da northern transfer teknigi
uygulanabilir fakat mRNA y ayrarak nortern transfer yapmak hassasl artrr.
Bu durum temamen aratrmacnn tercihine baldr. Eli RNA toplam RNA
dan poli-A+ prosedr kullanlarak oligo-T kolonu yardm ile ayrlr. Oligo-T
mRNA nn poli-A+ kuyruuyla eleir ve balanr. Poly(A)+ (mRNA) hibriti
toplam RNA dan kromatografi ile ayrtrlr. Bu ekilde ekirdekli hcrelerden
mRNA izole edilir. Gnmzde mRNA direkt olarak dokudan da ayrlabilir.
Bunun iin ticari amala geklitirlmi kitler mevcuttur. Bu kitler 0.1 gr (1x 10 7
hcre) dokudan (oligo[dT]-selloz kolonu kullanlmadan) 15 dakika ierisinde
mRNA y izole etme imkan sunmaktadrlar.
 214

30.1.1.3. RNA nn veya mRNA nn agaroz jel elekroforezi ile fraksiyonlarna

ayrlmas ve membran zerine geirilmesi (Blotting)
ster toplam RNA olsun ister poli-A+ yontemiyle kromatografi ile seilmi
mRNA olsun molekl arlklarna gre fraksiyonlara ayrmak iin (deiik
RNA trlerini birbirinden ayrmak iin) agaroz-jel elektroforezine yklenir.
Pozitif ykl naylon membranlarn nkleik asitlere yksek balanma
potansiyelleri vardr ayrca yrtlmaya ypranmaya kar dayankldrlar. RNA
nn naylon zar zerine geirilmesi ya kapillar yolla ya da vakumla yaplr. Bu
ilem herhangi zel bir donanm gerektirmez. Zaman kazanmak ve ilemi tutarl
yapmak iin vakumla RNA y zar zerine geirmek tercih edilmektedir. Jel
zerinde deiik bantlar halinde bulunan deiik RNA trleri ayn ekilde
naylon zar zerine geirilir. Naylon membran zerine geirin RNA frnda
kurutularak duraan hale getirilir. Kurutma ile RNA ve naylon zar arasnda
kovalent ba oluturulur. Bu ekilde RNA zar zerinde salamca balanr
bylece ykama vs gibi ilemler srasnda ykanp gitmez.

30.1.1.4. Hibridizasyon (Eleme) ilemi

Zar zerindeki ilgi duyulan genin karl olan mRNA y belirlemek iin
proba gerek vardr. Bunun iin uygun prob hazr hale getirilir. Hazr hale
getirilen prob iztopla markalarak membran zerindeki RNA ile elemeye
sokulur. Elemeden sonra spesifik olmayan balanmalar uzaklatrmak iin
hibridizasyon sonras ykama yaplr ve sonra film zerine geirilir ya da ayn
ilem radyo aktivite kullanmadan da yaplabilir. Film zerindeki deiik mRNA
trlerinin miktarlar densinometre yardm ile hesaplanr.

Hibridizasyon problar
lgi duyulan mRNA nn nkleotit zincirinin tamamna veya bir ksmna
karlk gelen (koplement olan) problara ihtiya vardr. Bu koplementasyon
kesin ve kurall olarak stozin ve guanin, adenin ile timin arasndaki baz
elemesiyle salanr. lgi duyulan genin determine ettigi mRNA y spesifik
olarak belirlemek iin kullanlan problara uzunluu yaklak 25 baz olmaldr.
Kiisel tercihe bal olarak hybridizasyonda kullanlan iki eit problar vardr.
Bu problara komplement DNA (cDNA) problar veya anti-sens oligonkleotit
problardr. Oligonkleotit problar bir takm avantajlar salarlar. Bu avantajlar
eleme sresini ksaltmalar ve plazmid izolasyonunua gerek duyulmamasdr.
Oligo nkleotit primerleri daha ok in sit hibridizasyonda tercih edildikleri iin
northern transferde geni bir kullanm alan bulamamlardr. Hibridizasyon iin
riboproblar da kullanlabilir. RNA problar DNA problarndan daha hassastrlar
fakat RNA az enzimyle kolayca paralanabilirler.
 215

mRNA y membran zerinde belirleme

Membran zerindeki mRNA ya radyoaktif ya da radyoaktif olmayan yolla
belirlenir. Birok laboratuarda radyoaktif metot kullanlr. Problar 32P ile
markalanr. Bu metot daha hassatr fakat radyo aktif maddelerle ramann zor
ynleri nedeniyle giderek daha ok radyoaktif olmayan metot tercih
edilmektedir. Hibridizasyon ve hibridizasyon sonras ykamadan sonra membran
alnarak RNA nn bulunduu yz karanlk bir yerde X-iinlar filmi zerine
gelecek ekilde konur ve kasete yerletirilerek 70 derceye konur belli bir sre
beklenir. Kaset karlr film diar alnr. Film zerinde, ilgi duyulan genin
determine ettigi ayn mRNA nn farkl trleri siyah bantlar halinde grlr sonra
densinometre yardm ile herbirinin ayr ayr miktar bulunur.
 216

31. N-ST HBRDZASYON

Bu teknik 1960l yllarda rapor edildi ve uyguland. O zamandan imdiye kadar
bu tekniin bir aratrma teknii olarak nemi giderek artt. Teknik; nkleik asit
problar kullanarak eli RNA veya DNA trlerini doku, hcre veya kromozom
zerinde belirleme esasna dayanr. Uygun koullar altnda tek zincir halindeki
nkleik asit serisi dbleks (ift zincir) oluturmak iin tekrar elenir.
Gnmzde enzimik veya fotokimyasal yolla izotop veya izotop olmayan
maddeleri iaretleyici (markar) olarak kullanp nkleik asit serisi ierisine
yerletirmek klasiklemi bir tekniktir. Bu ekilde markalanm nkleik asit
molekllerini prob olarak kullanarak doku ve hcre ierisindeki spesifik
genlerin ve gen trlerinin nerede ve ne seviyede bulunduunu belirleyebiliriz.
Spesifik bir nkleik asit probu elde etme; o probun balanaca zel
genin tamamn veya bir ksmn hcrelerden ayrtmay gerektirir. Doku ve
hcrelerden zel geni ayrt etmek zor ve fasilite bir itir. Bunun yerine cDNA
ktphanesinden ilgi duyulan zel genin cDNA zinciri hazr olarak elde edilir.
zel bir gene ait cDNA ayn zamanda o gene ait tm eli RNA trlerinin
karldr. Gen ekspresyon almalarnn ou dokulardan ayrlan,
elektroforeze tabi tutulan, nitroselilz veya naylon membran zerine geirilen
DNA parasna (Southern transfer) veya eli RNA ya (Northern transfer) ok
zel nkleik asit problarnn DNA veya eli RNA ile elenmesini
(hibridizasyonunu) ierir. nsit hibridizayon teknii yardmyla zel bir genin
veya o genin alt trlerinin hcredeki veya kromozomdaki yeri ve miktar
belirlenir.

31.1. Bu teknie niin gerek var?

Proteinler eli RNA zerindeki genetiksel koda gre sentezlenir. nce eli RNA
sentezi gerekleir sonra da eli RNA zerindeki koda uygun protein sentezlenir.
Bir proteinin sentezi o proteinin translasyonundan ve onu kodlayan eli RNA
sentezinden ok sonra olabilir. Veya eli RNA sentezi biter sonra eli RNAnn
kodlad proteinde art gzlenir. Bylece; hcre ierisinde var olan ve zel bir
proteini kodlayan eli RNAy veya eli RNA miktarndaki geici artlar
belirleme bize doku ve hcre ierisinde sentezlenen zel bir proteinin miktarn
ve dalmn belirleyen klasik immno-histokimyasal metottan daha fazla bilgi
sunar. n-sit hibridizasyon tekniinin immno-histokimyasal matotla birlikte
kullanm sz konusu genin doal fonksiyonu ve ekspre edilme mekanizmas
hakknda doru bilgiler sunar. Ayrca in-sit hibridizasyon teknii kullanlarak
spesifik kromozomlar zerindeki zel genlerin yeri tespit edilebilir. Ayrca
koromozom zerinde herhangi bir viss DNAsna ait bir kalnt olup olmad
ve nkleer yapnn organizasyonu hakknda bilgiler elde edilebilir. n-sit
hibridizasyon izotop kullanmadan yani radyo aktif olmayan multi markalama
metodu ile de yaplabilir. nk izotoplarn kullanm uzman kiiler tarafndan
yaplabilir aksi halde radyoaktif bulama durumlar ortaya kabilir ve personel
 217

bundan zarar grebilir. Bu nedenle izotop kullanmn gerekli klmayan metotla

lm yapmak daha uygundur. Bu yolla da hassas lm yaplabilmektedir. Ayn
ekilde belli bir genin ve o genin alt trlerinin doku, hcre veya kromozom
zerinde gstermek mmkndr. Eskiden izotop kullanmann en nemli
gerekcesi hassas lm yapmakt. Gnmzde izotop kullanmadan optimize
edilmi in-sit hibridizasyon metodu kullanarak bir hcrede belli tek kopya eli
RNAnn on kopyasndan daha azn lmek mmkndr. Bylece izotop
kullanmadan da hassas lm yapmak mmkn. Eli RNA trlerinin miktar
ok azdr ve ou zaman sadece birka hcre ierisinde bulunur. Bu durumda in-
sit hibridizasyon norhern transferden daha hassas bir metottur. nk norhern
transferde eli RNA ok fazla miktarda dokudan elde edilir ve miktar fazladr.
Ayrca northern transfer teknii ile eli RNA trlerinin hangi hcrelerde ne
miktarda bulunduunu lmek mmkn deildir.

31.2. Uygulama
Bu teknik pratik uygulamada biraz farkl olsa da klasik mmino-histokimya
teknii ile benzerlik gsterir. Her iki metotta da doku veya organ fikse edilir ve
mum veya resin erisine alnr. Her iki metotta da mum veya resin erisine
alnan doku veya organ mikrotomla kesilir sonra deneye hazrlanr. leme
hazrlanm kesilmi doku paralar in- sit hibridizasyonda nkleik asit problar
ile elemeye sokulur iken mmino-histokimyada ise doku kesitleri pirimer
antibodi ile reaksiyona sokulur. n- sit hibridizasyonda bir ok deiken
(rnein: scaklk, prob konsantrasyonu, probun bykl, NaCl
konsantrasyonu, formamid konsantrasyonu ve dekstran slfatn mevcut olmas)
iin iine girir bu nedenle koullar optimum hale getirmek ok zordur. Bunun
iin her dokuya zel fiske etme metodu nce test edilmelidir.
 218

Doku veya organ fikse edilir

Fikse edilen doku veya organ parafin veya resin

ierisine alnr

Mikrotomla kesilir

Eleme ncesi ilemler yaplr

n-sit hibridizasyon
(zotop kullanmadan) mmuno-histokimya

Nkleik asit problar ile elemeye

sokma (Hibridizasyon) lk (primer) antibodi ile
inkbasyona sokma

Elemede esnasnda scak

ortamda bulam iyonlarn Antibody konjugat ile
Ykanmas inkbasyona sokma
(Stringency wash)

Belirleme

Grntleme

a) Doku veya organ fikse etmek.

Doku veya organ uygun bir ekilde fikse etmek iin:
1. Hedef nkleik asitlerin kaybn nlemelidir.
2. Fikse edilen dokunun morfolojisini korumaldr
3. Fikseleme yntemi kullanlan problarn doku ierisine girmesine
msaade etmelidir.
Fikse ilemi iin aldehid ieren solsyonlar veya presitatif fiksatifler
kullanlabilir. Her doku iin zel fikseleme prosedr vardr. Bu prosedr her
doku veya organ iin optimum hale getirilmelidir. Rapor edildiine gre %4
paraformaldehit ieren fosfatla bafrlanm tuz zeltisi (PBS) ierisinde bitkisel
dokuyu brakmak ve mum ierisine almak iyi sonu vermitir. fade edildii gibi
deiik dokular iin deiik fikse etme metotlar gelitirilmitir.
 219

b)Fiksatif hazrlama ve meteryali fikse etme

erisinde %4 paraformaldehit ve %0.5 gulutaraldehit bulunan 100 ml hacminde
bir fiksatif hazrlamak iin:
4gr paraformaldehit ve 0.5gr gulutaraldehit tartlr
zerine toplam hacim100ml olacak ekilde PBS (pH 7.4) eklenir.
Paraformaldehit PBS ierisinde hemen zlmez. Bunun iin karm scakl
65C ye getirilir. Bu scaklkta bir sre kartrlr. znmeyi artrmak iin
karmn zerine iin %30luk saf NaOH zeltisinden bir damla braklr ve
biraz daha kartrlr. Sonra soutularak oda scaklna getirilir ve Whatman-1
filtre kad kullanlarak filtre edilir. Fiksatif kullanma hazrdr. Fikse edilecek
doku bu solsyon ierisinde 24 saat bekletilir.

c) Fikse edilen dokuyu polietilenglikol (resin) veya parafn (mum) iersine

alma
Fikse edilen materyal parafin veya resin ierisine alnmadan nce materyaldeki
mevcut su tamamen dokudan dihidrasyonla uzaklatrlmaldr. Bunun iin fikse
edilen materyal oda scaklnda 2 saat sreyle sras ile %70, %95 ve %100
etanol ieren zelti ierine alnmaldr. Bu ekilde materyaldeki su tamamen
uzaklatrlm olur ve materyal iyice sertleir. Suyu uzaklatrlm materyal
kalbn ierisine konur sonra zerine erimi parafin konularak parafin ierisine
alnd gibi resin ierisine de alnabilir. Resin doku morfolojisini daha iyi korur.
Mikrotomla kesim ileminden sonra baz dokular kendiliinden ayrlr. Bu
dokularn resin yerine mum ierisine alnmas daha uygun olur. Klasik mino-
histokimya metodu iin kullanlan fikzasyon, mum veya resin ierisine alma
prosedr aynen olduu gibi in-sit hibridizasyonda da kullanlabilir veya iyi bir
balang oluturabilir. n-sit hibridizasyonda fikse etme ve dehidrasyon 0-4 oC
arasnda yaplmaldr ki nkleik asitlerin paralanmas en az dzeyde olsun. Bu
ekilde resin veya parafin ierisine alnan organ ve dokular mikrotomla 7-10m
den kesilir ve cam lamellere balandrlr.

d) Kesilmi doku paralarnn cam lamlara balanmas

n-sit hibridizasyonda kesilmi doku paralar yksek scaklkta formamidin
mevcut olduu ortamda uzun sre inkbasyona braklr. Bu nedenle am
lamlarn zerine kesilen doku kesitlerinin iyi bir ekilde balanmas gerekir ki
yzeyden kayp gitmesin. Bunun iin kullanlacak lamlar bir takm n
muamelelere tabi tutulur. rnein lamlar trietoksisilan (TESPA) veya Ply-L-
Lisin ile kaplanr.
Lamlarn TESPA ile kaplanmas
1. Lamlar 10 dakika %2 3-aminoprophyltrietohoxysilane ieren aseton
ierisinde bekletilir.
2. Sonra lamlar asetonla iki defa ykanr.
 220

3. Asetonla ykanan lamlar dietilpiyrokarbonat eklenmi distile su (DEPC)

ile ykanr ve oda scaklnda kurutulur. Lamlar kullanlacak zaman kadar
steril halde kuru tutulmaldr
Lamlarn Ply-L-Lisin ile kaplanmas
Mililitresinde 50g Ply-L-Lisin bulunan PBS ierisine veya uygun bir tuz
zeltisi ierisine lamlar iki saat braklr sonra distile suda ykanr ve oda
scaklnda kurutulur. Bu ilem steril ortamda (laminar kabin ierisinde)
yaplmaldr. Bu ekilde kaplanan lamlar zerinde kesilen materyal daha sk bir
ekilde durur. Baz lamlar zerindeki doku kesitleri ierisinde bulunan tm
nkleik asitler boyalanr. Bunun nedeni ilemler srasnda nkleik asitlerde bir
kayp olup olmadn abuk grmektir. Ayrca daha nce uygulanan
prosedrlerin ne derece iyi olup olmad hakknda (dier prosedrlerle
karlatrlarak) fikir sahibi olunur. Eer doku ierisindeki toplam RNA ilem
yaplmayacak kadar azalm ise veya yok olmu ise lm yapmaya gerek
yoktur. Zaten bir ey bulunamayacaktr. Bu nedenle dokulara RNaz enziminin
bulamas engellenmelidir. Daha ncede ifade edildii gibi insan derisi RNaz
ihtiva eder. plak elle hi bir eye dokunulmamaldr. Boyama ii genelde
acridine orange ad verilen ve nkleik asitleri boyayan boya ile yaplr.

Doku kesitleri iindeki nkleik asitleri acridine orange ile boyama

Boyama ilemi iin aadaki prosedr aynan uygulanmaldr.
1- Lam zerine balanm doku kesitleri Hidrojen klorr (HCl) ile pH 2
olarak ayarlanm 2M glisin zeltisinin her bir mililitresinde 0.5 mg
acridine orange boyas eklenmi zelti ierisinde karanlkta 30 dakika
braklr.
2- Lamlar floresan olmayan medde ile kapatlr ve zerine lamel konur.
3- Lamlar 470 nm dalga boyundaki floresan mavi k altnda incelenir.
DNA bu k altnda sar/yeil floresan grnm arz ederken RNA
portakal/krmz grnm sergiler.
Bylece doku kesilerinin ierisinde DNA ve RNA nn bulunduu anlalr ve
deneye devam edilir.

e)Eleme (hibridizasyon) ncesi yaplan ilemler

Ykama, eleme ve belirleme iin kullanlan malzeme ve solsyonlar
hacimlerine ve maliyetine gre tercih edilir. Ykama ii iin 200ml lik polietilen
lam kutular uygundur. Dier tm inkbasyon ilemleri iin lamlar nemli
ortamda tamamen solsyon ierisinde braklrlar. Eer kullanlan solsyon
pahal ve inkbasyon sresi uzun ise rnekler uygun bir materyal (lamel) ile
kapatlr. Fikse edilen doku 7-10m kesildikten sonra hibridizasyon ilemine
balamadan nce baz ilemlere tabi tutularak kesilen doku kesitlerinin
permabilitesi (geirgenlii) artrlr. Bylece kullanlacak problarn doku
ierisine grii artrlm olur. Aada verilen prosedr parafin ierisindeki doku
 221

kesitlerinin hibridizasyona hazrlamak iin uygulanmas gereken ilemleri sra

ile zetlemektedir.
1- Kesitleri saran parafini uzaklatrmak iin kesitlerin zerinde bulunduu
lameller 10 dakika histoclear (bir eit saf ya karmdr mumu
kesitlerden uzaklatrmak iin kullanlr) ierisinde braklr.
2- Lamlar 5 dakika %100 etanol ierisinde iki sefer ykanr
3- Lamlar oda scaklnda havada kurutulur
4- Lamlar iki sefer 5 dakika 2xSSC solsyonu (TBS veya PBS de olabilir)
ile rehidrasyona tabi tutulur. 2xSSC solsyonu hazrlamak iin: 0.3M
NaCl ve 30mM Na3 sitrat kartrlr ve pH 7,5 e getirilir.
5- Lamlar oda scaklnda %0,3 Triton X100 ihtiva eden 2xSSC
ierisinde 15 dakika braklr.
6- Lamlar iki sefer 2xSSC solsyonu ile 5 dakika ykanr.
7- Lamlar mililitresinde 100g proteinaz K ihtiva eden proteinaz K bafr
ierinde oda scaklna 10 dakika inkbasyona braklr. Proteinaz K y
hazrlamak iin
1 ml distile suya 20mg Proteinaz K katlr ve -20 oC de saklanr.
Proteinaz K bafrn hazrlamak iin ise
HCl ile pHs 7.8 ayarlanm 10mM Tris
5mM Na2 EDTA
%0.5 SDS
birbirine kartrlarak hazrlanr.
8- Lamlar bir sefer 2xSSC ile ykanr.
9- Lamlar ierisinde %4 paraformaldehit bulunan PBS ierisine konularak
5 dakika oda scaklnda tekrar fikse edilir.
10- Lamlar iki sefer 2xSSC ile ykanr
11- Lamlar asetile edilir. Asetilasyon ilemi aagdaki prosedure gre sra
ile yaplr.
Lamlar 0.1 M trietanolamin, pH=8.0, solusyonu iersine konur.
Lamlar magenetik alkalayc ierisine konularak solsyonun
alkalama ile her tarafa temas salanr. alkalama doku kesitlerini
skecek kadar hzl olmamaldr.
Kartrma ii devem ederken konsantrasyonu %0.25 olack ekilde
diardan solsyonun ierisine asetit anhidrat eklenir ve 10 dakika
oda scaklnda braklr.
12-Lamlar distile su ile 1 dakika ykanr
13-Lamlar oda scaklnda havada kurutulur.
Bu ekilde hazrlan doku kesitleri hibridizasyon ilemine hazrdr. Hibridizasyon
ilemi uygun problar kullanlarak yaplr. Amaca gre, kiinin tercihine gre
deiik problar kullanlr. Aada in-sit hibridizasyonda kukkanlan prob
tipleri, avantajlar ve dezavantajlar hakknda bilgi verilmektedir.
 222

f) Kullanlabilen prob tipleri

Nkleik asitler tek zincirli veya ift zincirli halde bulunabilen molekllerdir.
anl ortamda bulunan eli RNA trleri tek zincirli (sens halde) halde
bulunurlar ve proteinleri kodlarlar. Tek zincirli eli RNAdan in vitro
koullarda iki transkripiti de sentezlenebilir fakat sentezlenen transkripitler in
vivo ortamdaki tek zincirli eli RNA ile elenemezler. Fakat eli RNA zerindeki
genetik koda e olan (koplament olan) anti-sens transkripiti eli RNA ile eleir.
Deiik nkleik asit trleri rnein:
ift zincirli DNA
Tek zincirli DNA
Tek zincirli RNA
-Sentetik (yapay) oligodeoksiribonleotitler (oligonkleotitler)
Prob olarak in-sit hibridizasyonda kullanlabilirler. Ne tr probun seilerek
kullanlaca zerinde allan materyalin doasna ve aratrmacnn molekler
biyolojideki tecrbesine gre deiir. Gelitirilen hazr kitler sayesinde nleik
asitlerin ayrtrlmas, karakterize edilmesi ve markalanmas daha nceden
molekler biyoloji konusunda tecrbeli olmak gerekmiyor. Markanm problar
hazr satan birok ticari irket var.

Kulanlan Avantajlar Dezavantajlar

prob tipi
RNA Vektre balamaya gerek
yi balanr vardr
Prop dentrasyonuna gerek Hibridizasyondan sonra
yoktur yaplan RNaz muamelesi elenmeye
Hibridizasyon srasnda tekrar girmeyen problar zaklatrr
elenme yoktur Kullanlan RNA probunun
Prob eleyecegi nleotit RNaz ile paralanmamas iin ar
zincirine spesifiktir dikkat gerektirir.

ift zincirli Vektre balamaya gerek yok Probu denatre etmeye

DNA zopla marmalama iin ok gerek vadr.
uygundur Bu problarn balanma g
RNA problarna gre dktr
Hibridizayon srasnda
tekrar eleme yaparlar
Oligo Vektre balamaya gerek yok Bu problar markalamak iin
nkleotitler Doku iine girii iyidir kullanlan metotlar snrldr
Kendi kendini elemez Dizayn hatalarna aktr
Proten zincirindeki amino Hibridizasyon iin sadece
asitlere gre dizayn edilebilir. ksa zincirli problar mevcuttur.
 223

Aratrmaclar tarafndan RNA problar in-sit hibridizasyonda daha fazla

kabul grmektedir. nk istikrarl sonu verir, hibridisayon srasnda kendi
kendine eleme yapmaz, DNA problarna gre daha hassadrlar.

g) Problarn markalanmas
Radoaktif maddeleri kullanmak insana ve evreye zarar verir. Fakat ok hassas
lm yaplmak istendii, izotop kullanma imknn ve ortamnn bulunduu
laboratuarlarda kullanlmaktadr. zotopla markalanan problar doku kesitleri ile
birlikte inkbasyona sokulmak sretiyle hibridizasyon (eleme) salanr ve
sonra ykamaya tabi tutulur. Takiben mikro-autoradyografi ve grntleme
yaplr.
Poblar izotopla markalama
Gnmzde membran hibridizasyonlarnn ounda nkleik asit problar
normal olarak 32P ile markalanr. Bu izotopun kullanm hem ie lm hassal
kazandrr hem de autoradyografik emilsiyona brakmadan nce yaplan yakama
(sitringenci wash) ile ileri derecede spesifikliin salanmasna imkn verir.
Fakat membran hibridizasyonu iin markalanm problar in-sit hibridizasyonda
kullnlmazlar. nk in-sit hibridizasyonda rezlasyon hassaslktan daha
nemlidir ve ayrca yksek stringency ykama ile markalanm probu in-sit
hibridizasyonda uzaklatrmak mmkn deildir.
n-sit hibridizasyonda markalama ii iin kullanlan izotoplar aadaki
tabloda listelenmitir.

n-sit hibridizasyonda kullanlabilen izotoplar

zotop Uygulama alan Avantaj Yarlanma mr Rezlasyonu
32
P Makro dzeyde abuk analiz 14.3 gn 20-30m
salar
35
S Hcresel dzeyde Ksa sreli 87.4 gn 10-15 m
maruz salar
125
I Alt hcresel ok hassastr 60.0 gn 1-10 m
dzeyde
3
H Alt hcresel Yksek 12.4 gn 0.5-1 m
dzeyde rezlasyon
salar

zel bir genin ve o genin bir parasnn (probun) 32P ile markalanp tespit etme
arac (markalanm prob) olarak kullanm iin o genin zel paras PCR ilemi
ile daha nce ifade edildii gibi elde eldir veya gen bankasnda salanr. PCR
ileminde ilgi duyulan genin saf rnei elde edilir. Sonra bu saf rnek izotopla
markalanarak Doku kesitleri ile birlikte inkbasyona sokulur. Markananm gen
paras (markalanm prob) doku iindeki o gene kar gelen nkleik asit
zincirine balanr ksaca elemeye girir. Sonuta sz konusu genin hangi
hcrelerde bulunduu belirlenir.
 224

Markalama
Aadaki markalama prosedr Ameram irketinin ticari kitinden
faydalanarak hazrlanmtr (Multiprime DNA labelling systems, Cat RPN,
1600Y)
1. PCR sonucu elde edilen genin 15 l sine 16.27 l distile ve filtre
edilmi su eklenir sonra scakl 100oC ye getirilir. Bu ekilde ift
zincirli Haldeki prob tek zincir haline getirilir. 5 dakika bu scaklkta
tutulur ve hemen 4 C ye konur. Bu ekilde DNAnn tekrar birlemesi
engellenir.

2. Kar erisine braklan tp alnr ve zerine 2.4 l deoksinkleotit

trifosfat karm (dNTP) eklenir.
3. zerine 3l Kit ierisnde bulunan prob solsyonu eklenir.
4. zerine 3 l [-32P] dATP( 3000CI/mmol) eklenir.
5. Final volm 30 l yapmak iin 1.13 l distile su eklenir.
6. En sonunda 1.2l enzim (Klenow) ilave edilir ve nazikce pipet yardm
ile fula yaplrak kartrlr.
Yukardaki ilemler yapldktan sonra kolon hazrlanr

Kolonun hazrlanmas ve rnek ykleme

MikroSipin G-25 kolonu (Amersham irketinden, Katalog numaras
27-5325) alnarak kolondaki resinin kenarlar doru dalmn
salamak iin 1-2 dakika vorteks yaplr.
Kolonun kapa dndrlr ve kolonu alt ayrlr.
Kolon 1.5ml lik apandorf tpn ierisine yerletirilir
Kolon ve tp 735g de veya 3000rpm de 1 dakika santrifje tabi
tutulur
Sonra kolon karlr ve yani bir 1.5ml lik apandorf tpn ierisine
yerletirilir
7. Santrifjden sonra kolonun iindeki resinin ortas ukur konik haldedir.
Bu ukurun ierisine yukardaki karm pipetle konur. Pipetin ucunun
resine demememsi gerekir. Resinin yzeyinde herhangi bir deiiklie
sabep olunmamaldr. Pipetle konulan karm etrafa tamamamldr.
Hepsi resinin zerindeki ukur iinde olmaldr.
8. Dikkatli yklemeden sonra kolon ve tp 735g de veya 3000rpm de 2
dakika santrifje tabi tutulur
9. MikroSipin G25 kolonunun ii bitmitir kartlr ve atlr. Alttaki tpte
ise saf karm elde edilir.
10.Saf karmn bulunduu 1.5ml lik apandorf tpe izotop gereken
miktarda uygun ekilde konur ve 37C deki su banyosuna braklr. Tp su
banyosuna konulduktan sonra su banyosu kapatlr. Yaklak 1012 saat
sonra prob markalanm olur.
 225

) zotop kullanmadan probun markalanmas

Nkleik asitleri izotop kullanmadan markalama yntemi son zamanlarda nemli
derecede yaygnlamtr. nk bu yntem bir takm avantajlar sunar. Bu
avantajlar:
Marakalanan problar 6 aydan fazla bir sre -20C de saklanabilirler
Ysek reslasyon salarlar
abuk sonu verirler
Multimarkalamay mmkn klrlar
nsana ve evreye zarar vermezler
Yukardaki avantajlarnn yannda bir takm dezavantajlar da
vardr. Bu dezavantajlar:
Dk hassaslk
Yksek oranda spesifik olmayan balanma potansiyeli var
Son zamanlarda problarn biyotin ile markalanmas aratrmaclara hassas lm
yapma imkn sunmaktadr. Fakat doku rneklerinde bulunan endojen biyotin
in-sit hibridizasyonda biyotinle markalamann etkinliini olumsuz ynde
etkilemektedir. Endojen biyotinin sebep olduu bu problem alternatif bir
iaretleyici rnein digoksigenin ile zlr.
Digoksigenin ile nkleik asitleri markalama ve belirleme ii iin ticari
kitler mevcuttur. Aadaki tabloda raydoaktif olmayan markarlar, markalanm
nkleik asitleri tespit etme yntemiyle ilgili aklamalar yer almaktadr.
 226

n-sit hibridizasyonda kullanlan radyoaktif olmayan markarlar ve

markalanm nkeik asitleri tespit yntemleri
Markar Tespit yntemi Aklamma
Biyotin Avidin Avidin bir glikopoteindir. ok
fazla spesifik olamayan
balanma yapar
Streptavidin Avidinden iyidir fakat
molekl byk olduu iin
dokuya penetrasyonu
dktr.
Anti-biyotin Balanma g (affinitesi)
avidinden dktr fakat
dokuya penetrasyonu
avidinden iyidir.
Digoksigenin Anti- Digoksigenin Digoksigenin bir steroiddir.
Nkleik asitlere balanr. Bu
balanma spesifik antibodiler
kullanlarak tespit edilir.
Dokudaki endojen
Digoksigenin herhangi bir
probleme sebep olmaz.
Direkt olarak enzimle ------------ Hazrlama ok zaman alr.
markalama Dokuya penetrasyonu zayftr
Direkt floresan ile ------------ Enzim yardm ile
markalama floresanlatrlm nkleik aist
analoglar (rnein:
UTP,dUTP ve ddUTP) ticari
olarak mevcuttur.

j) Kulanlan problarn boylarn kontrol etme

Ksa poblarn doku iine girii daha iyidir fakat markar tama potansiyelleri
azdr. Eleme esnasnda yan hibridizasyona aktrlar. Bir ok hibridizasyon
siteminde 200500 nkleotit uzunluundaki problar optimum sonu verir. Daha
nce oligo nkleotit problarnn boylarnn ksa olduu (genelde 2040 nkleotit
kadar) ifade edilmiti. Bu problarn doku ierisine girii iyidir fakat markar
tama potansiyelleri dktr. ift zinzincirli RNA problarn RNaz
enziminden korumak iin plazmitlere (dual-promoter plazmitler) klonlama
gerektirir. Bu problar boylar uzundur. Alkalin hidrolizis ilemiyle boylar in-
sit hibridizasyonda kullanlacak ekilde ksaltlr.
Fotomarkalama metodu ile DNA ve RNA problar markalanabilir. Bu
ekilde markalanm problarla yaplan lmlerin hassasiyeti enzim kullanlarak
markalanm problarla yaplan lmden 1/10 orannda dktr. Fakat bu
markalama yntemi basittir, dnya apnda kullanm yaygn bir markalama
metodudur. Biyotinin ve digoksineninin fotoreaktif formlarn ticari irketlerden
(rnein sigmadan) salamak mmkndr.
 227

k) Fotoreaktif biyotin kullanlarak nkleik asitlerin fotomarkalamas

1. Karanlk odada uygun bir tpn iine 5l DNA veya RNA ile birlikte
5l fotobiyotini kartr (15 gDNA).Tpn kapa ak olacak
2. Ak tp kar ierisine yerletir ve 10 cm yaknna k kayna (Hg-
discharge lamps , HPLR 400 W, Philips, Belgium) koy
3. Bu ekilde tpteki karm 10 dakika irradyasyona maruz braklr eyer
DNA markalanacaksa bu sre 15 dakika olmaldr.
4. On dakika sonra tpn zerine 90 l 100mM Tris-HCl ve 1.0mM
Na2EDTA, pH 9.0 karm ekle.
5. 5M NaCl zeltisinden 5 l pipetle alnp tp ierisine konur ve tp
iyice alkalanr.
6. Karm iki sefer 100 l distile suyla sature edilmi 2- btanol ile
ekstrakte edilir. Markalanm nkleik asit tpn alt tarafndadr.
Balanmam fotoreaktif biyotin ise stteki btanol ksmndadr.
7. Biyotinle markalanm nkleik asitlerin bulunduu ksma 10 l 4M
LiCl ve 200 l -20 C ye kadar nceden soutulmu etanol eklenir.
8. Karlm 2 saat -20C de veya 40 dakika -70C de inkbasyona
braklr.
9. Tp dar karlarak oda scaklnda 30 dakika 12000g de santrifje
tabi tutulur.
10. Santrifjden sonra markalanm nkleik asitler pellet halinde tpn
altdadr.
11. Pellet -20C deki %70 lik etanol ile ykanr.
12.Fazla etanol pipetle dikkatli bir ekilde tpten alnr ve tp oda
scaklnda kurumaya braklr.
13.Kurumu pellet zerine 50 l TE bafr eklenerek pellet zlr. TE
bafri 10mM Tris-HCl ve 1.0mM Na 2EDTA kartrlarak hazrlanr.
Karmn pH s 8.0 olmaldr.
14.Markalama ii tamamlanmtr. Markalanan prob -20C de kullanlmak
zere saklanr.

l) Hibridizasyon (Eleme)
Hibridizasyon ilemiyle markalanm prob doku iindeki doal gen ile elemeye
girerek dbleks yapy oluturur. Bu durum ncelikle prob konsantrasyonuna,
scakla ve iyon konsantrasyona baml bir olaydr. Dk scaklk ve iyon
konsantrasyonunda (Low sitringency) hibridizasyon yaplsa da doku iindeki
genle prob homolog bir ekilde balanamaz nkleik asit zincirleri farllk
gsterir. Fakat yksek scaklk ve iyon konsantrayonunda (High sitringency)
yaplan eleme ilemi sonucu oluan dbleksteki nkleotitler tamamen birbirinin
karldr (iki zincir arasnda %100 homoloji vardr).
Maksimum seviyede; solsyon iinde nkleik asit hibridizasyonu yksek
iyon konsantrasyonunda (0.4M NaCl den yukarda) ift zincir halinde bulunan
nkleik asitin yarsnnn birbirinden ayrlmasn salayan scaklk derecesinden
 228

(Tm) 25C aada olur. Hibridizasyonda kullanlan problarn boyu 50 nkleitit

kardar veya yukar ise probun Tm scakl aadaki formle gre hesaplanr.

Tm (C)=81.6C+16.6 LogM +0.41 (%G+%C)-500/n 0.61(%formamid)

M=Hibridisazyon solsyonundaki iyon seviyesi (Molar)

n= ift zincir halindeki (dbleks) nkleik asitteki en ksa zincirin
boyu ( bp= baz ifti)
Normal hibridizasyon koullar altnda (0.9M NaCl) 100 baz ifti (bp)
uzunluundaki probta Gunain + stozin miktar normal (%40) ve formamid
yoksa bu durumda Tm deeri 93.7 C olacaktr. Eer %50 formamid mevcutsa
bu durumda Tm deeri 63.2 C olacaktr.
Oligo nkleotitlerdeki nkleik asit kompozisyonu dbleksin Tm deerini
nemli derecede etkiler. Normal hibridizasyon koullarnda dbleksin Tm deeri
aadaki gibi hesaplanabilir.

Tm (C)=4(G+C)+2(A+T)

Bilgisayar programlar kullanarak oligonkleotit problar iin optimum

eleme koullar belirlenebilir. Olgonleotitlerin kullanmnda baz zorluklar
vardr. Bu zorlular; dbleksin erime noktasnn dk olmas ve spesifik
olmayan balanma potansiyelinin yksek olmasdr. Yanl elenen baz
iftlerinin her %1 iin prop: hedef dbleksin erime nokatas 1C der.
Nleik asitlere biyotin balanmas da hibrit stabilitesini ve Tm deerini
yaklak 5C drr. Bu nedenle hibridizasyon scaklnn hibritin Tm deerine
mmkn olduu kadar yakn (yksek stringensi) olmas dnlebilir. Yaygn
bir metot olarak dk scaklk ve iyon konsantrasyonunda (dk stringenside)
hibridizasyon yaplarak hibrit oluumu artrlr sonra spesifik balanma
yapmam problar yksek scaklk ve iyon konsantrasyonunda (yksek
stringenside) bir seri ykama ile uzaklatrlr. Homolog eleme yapmam
markalanm problar yksek scaklkta fakat dk iyon konsantrasyonunda
ykanarak hedef nkleik asitten ayrlr.
n sit hibridizasyonda markalanm prob doku kesitlerinin iinde bulunan
hedef nkleik asitle hibrit oluturur. Sadece snrl miktarda markalanm prob
fikse edilmi ve kesilmi doku kesitleri iindeki hedef nkleik asitle hibrit
oluturur. Bu nedenle Northern ve southern transferde uygulanan uygun scaklk
ve iyon konsantrasyonundaki ykama (siringensi wash) in-sit hibridizasyon iin
uygun deildir.
 229

m) RNaz kontaminasyonunu engelleme.

RNaz moleklleri (ister prob olsun ister hedef nkleik asit olsun) ok abuk
kaybolurlar. zellikle RNaz enzimiyle abuk paralanrlar. Bu enzim RNA
prolarn eli RNAdan daha abuk paralar. Bunun nedeni eli RNAnn doku
kesitleri ierisinde fikse edilmi halde olmasdr. Bu enzimi autoklavla veya
fenol ekstraksiyonu ile yok etmek mmkn deil. Enzim deride, vicut
svlarnda mevcuttur. Bu nedenle in-sit hibridizasyonda kullanlan tm
ekipmalar (cam kaplar, pipetler, pipet ular, tpler vs) ve kiyasal maddeler
(ilalar, su, bafrlar vs.) bu enzimi iermemelidir. plak elle hibir eye
dokunulmamaldr. Kullanlan her maddenin zerinde nkleaz iermiyor diye
uyar bulunmaldr. Kullanlan solsyonlara dietilpiyrokarbonat (DEPC)
katlarak RNaz iermeyen hale getirilmelidir. DEPC ile muamele dilmi
(nkleaz iermeyen) solsyon hazrlamak iin:
1- DEPC eklenecek svy magnetik kartrc zerine konur ve kartrlr
2- Svnn her 1L sine 1 ml DEPC katlr.
DEPC kanserojen bir maddedir. eker ocak ierisinde
katlmaldr. DEPC iesinde basn vardr uygun ekilde
almaldr.
3- DEPC yi ekledikten sonra solsyon iyice alkalanr
4- Solsyon gee boyunca oda scaklnda magnetik kartrc zerinde
kartrlr.
5- Solsyon 121C de 20 dakika autoklav edilir ve kullanma hazr hale
getirilir.

Tm bafrlar DEPC eklenmi su kullanlarak yaplmaldr. Kullanlan cam

malzeme 200 C de en az 4 saat piirilmelidir. Piirilmesi mmkn olamayan
malzeme taze hazrlanm %3 lk hidrojen peroksit solsyonu ve sonra metenol
ile ykanmaldr.
Tm ilemlerden sonra markanm problarn doku kesitlerindeki hedef
nkleik asitle elemeye sokulmas gerekir. Bu ilem iin ya izotopla
markalanm problar ya da biyotinle, digoksigeninle, enzimle veya direkt
floresanla markalanm problar kullanlr.
n) zotopla (35P) markalanm tek zincirli RNA probu kullanarak eli
RNAy doku kesitleri ierisinde tespit etme
1- nce eleme (Hibridizaston) bafr hazrlanr.
Hazrlanacak bafrn son hacmi eklentilerin ilavesinden sonra 10ml
olacaksa
5ml diiyonize formamid (%50 hacim olarak)
2.5 ml 20x SSPE (5x)
20xSSPE (3.6M NaCl, 0.2M Sodyum fosfat pH 7.7, 0.02M Na 2EDTA
kartrlarak hazrlanr)
Yukardaki karm 37C kadar stlr
zerine 1gr dekstran slfat eklenir (%10)
 230

Dekstran slfatn zlmesi iin iyice kartr.

1ml 50x Deterjan solsyonu eklenir (5x)
250l SDS eklenir (%0.5)
zerine 100l paralanm ve ufaltlm balk sperm DNA
(10mg/ml) s ekle (Alabalk veya krmz renkli ssl
balklara ait olabilir). Eklenen balk DNA snn karmdaki
miktar 100g/ml olmaldr.
154 mg DDT (dithiothreitol) ekle (100mM)
DEPC katlm distile su ile hacim tamamlanarak 10ml ye
getrilir. Hibridizasyon bafr kullanma hazrdr.
Kullanlaca ana kadar 37C de saklanr.
2- Markalanm Prob konsantrasyonu 50-100ng/ml olacak ekilde yukarda
hazrlanan hibridizasyon bafrna eklenir.
3- Yukardaki karmdan 50 l alarak am lamlarn zerindeki doku kesitleri
zerine konulur. Svn akp gitmemesi iin kesitlerin etrafn mumla evir
(havuz yaplr)
4- Kesitler slikonize edilmi lamelle kapatlr
5- 50C de rutubetli ortamda lameller gee buyunca braklr. Rutubet 5xSSPE
ve %50 formamit ieren solusyonla salanr.
6- Sabahleyin lamlar karlarak 4xSSC,%50 formamit, 10mM DDT ve %0.1
SDS ieren solsyonu ierisine konularak lamellerin kmas salanr.
7- Her lam (10ml/lam olacak ekilde) 30 dakika 4xSSC,%50 formamit, 10mM
DDT ve %0.1 SDS ieren solsyon ile iki defa ykanr.
8- Lamlar iki defa 30 dakika (10ml/lam olacak ekilde) 2xSSC,%50 formamit,
10mM DDT ve %0.1 SDS ieren solsyon ile ykanr.
9- Lamalar SSC bafr ile durulanr (rinse edilir) Bylece nceden kullanlan
SDS kalnts kalmaz ve RNaz aktivitesi yok edilir.
10- Lamlar ierisinde10l/ml DNaz free RNaz A bulunan 2xSSC
solsyonu ierisinde 37 C de 15 dakika tutulur. DNaz free RNaz A
hazrlamak iin
Pankreas RNaz A s konsantrasyonu 10mg/ ml olacak ekilde bafr (
15mM Na Cl, 10mM Tris-HCl pH 7.5) ierisinde zlr.
Karm 15 dakika 100C de tutulur.
Oda scaklnda yavaa soumas salanr
Ksm ksm ayrlr ve -20C de saklanr.
11-Lamlar %0.3 amonyum asedat ieren etanol ile dehidrasyona maruz braklr.
Bunun iin aadaki solsyonlara sra ille konur.
%70 etanol 30 saniye
%90 etanol 30 saniye
%100 etanol 60 saniye
%100 etanol 60 saniye
 231

12-Lamlar oda scaklnda havada kurutulur ve mikroautoradyorafi ile

grntlenir.
Zayf izotoplarla (32S, 3H) ile balanm, izotopla markalanm problar
lamlar zerinde grntlemek iin; lamlar birka gn autoradyografik
emilsiyona maruz braklrlar. Uygun emilsiyon zeltileri ticari irketlerden
(rnein Amersham, Kodak) salanabilir. Amershamdan alnan (LM-1)
emilsiyon zeltisi nerilmektedir. Bu irketler ilgili prosedr de
vermektedirler. Verilen prosedr dikkatlice uygulanrsa herhangi bir problem
olumaz. Kesitler zerindeki iaretler klasik illmnasyonla grlr.

o) zotop kullanmadan eli RNAy doku kesitleri ierisinde tespit etme

Lamlar zerinde bulunan doku kesitleri ierisindeki eli RNAy digoksigeninle
markalanm ift zincirli DNA problar kullanarak tespit etme ii iin:
1-Hibridizasyon solsyonu hazrlanr. rnek olarak 1ml lik eleme bafr
(20 lam iin yeterli) hazrlamak iin uygun bir tpn iine aadaki
maddeler eklenir.
500l Diiyonize edilmi formamid
200 l SSC (20x)
20 l Denhardnt slsyonu 50x)
50 l Balk sperm DNA s( 10mg/ml)
25 l Yosun tRNA s (10mg/ml)
200 l Dekstran slfat (%50)
eklenerek eleme solsyonu hazrlanr.
2. Markalan ift zincirli probu 95C 10 dakika tutulur sonra kar ierisine
alnr 5 kakiak tutlulur.
3. Yukarda denatre olmu probtan yaklak 5 l rnek alnarak (probun
toplam solsyon iindeki konsantrasyonu 1mg/ml olmaldr) eleme
bafrna katlr sonra iyice kartrlr.
4. Probun eklendii eleme bafrndan 50 l pipetle alnarak hava
kalmayacak ekilde lamlarn zerindeki kesitlerin zerine aktarlr.
5. Kesitlerin zeri silikonize edilmi lamelle kapatlr
6. Lamlar 4xSSC iinde %50 formamitin mevcut olduu 42C deki buhar
emberinde gee boyunca tutulur.
7. Lamelleri karmak iin lamlar 4xSSC ve %50 fromamid ieren 42C
deki solsyonun iine lamellerin ayrlaca zamana kadar konur.
8. Lameller karlr ve lamlar 4xSSC, %0.1 SDS ieren solsyonla 30
dakika 2 sefer ykanr
9. Lamlar42C deki 2xSSC, %0.1 SDS ieren solsyonla 30 dakika 2 sefer
ykanr
10. Balanm problar grntlenir.

Bu metotta biyotinle vaya digoksigeninle markalanm ve doku kesitlerine

balanm problar bir enzimle (rnein peroksidazla veya alkalin fosfatazla)
 232

konjuge hale getirilmi florokromla veya koloidal gold antibodileri kullanlarak

grntlenir. Bu metotlardan hangisi uygunsa o tercih edilir. Karar verirken
hassaslk ve grnt kalitesi gz nne alnr. Grntleme malzemeleri
(rnein 1nm koloidal gold ile balanm anti-biyotin, streptavidin) ticari
irketlerden temin edilebilir (rnein Amesham, BioCell gibi irketlerden).
Ayrca tm malzemeleri ieren kitler de bu irketlerden temin edilebilir. Enzimle
konjge antibodiler dokudaki eli RNAy grntlemek iin, kolloidal gold ile
balanm antibodiler doku veya hcredeki ve florokrom ile konjuge haldeki
atibodiler ise hcredeki mRNA y grntlemek iin tercih edilir.
Aada digoksigeninle markalanm prob kullanlarak yaplm in-situ
hibridisazyon sonras balanm problarn kesitler ierisindeki yerler (gene ait
eli RNA nn bulunduu yerler) alkalin fosfataz enzimiyle konjuge edilmi
antibodi kullanarak grntleme prosedr zetlenmitir.
1. Lamlarn bulunduu kesitler TBS bafr ile rehidrasyona maruz
braklr. TBS bafr PBS ye tercih edilir. nk PBS bafrndaki fosfat
iyonlar alkalin-fosfataz aktivitesini yok eder.
TBS: 100mM NaCl, ve 10mM Tris-HCl pH 8.0 ieren solsyondur.
2. Lamlar iinde %0.3 Triton X-100 ve %2 normal koyun serumu
bulunan TBS bafr ierisinde oda scaklnda 30 dakika tutulur.
3. Anti-digoksigenin (digoksigenine ait antibodi)- Alkalin fozfataz
konjgatn; %2 normal koyun serumu ve %0.3 Triton X-100 ieren
TBS bafna hacim larak oran 1:500 olacak ekilde (rnein 500 ml
bafra 1ml Anti-digoksigenin -Alkalin fozfataz konjugat eklenecek)
eklenir. Bu karm hemen kullanlmaldr.
4. Lam zerindeki tm kesitler yukardaki karmla kaplanr
(yaklak 100l/Lam olacak ekilde) ve nem emberine konularak oda
scaklnda 2 saat bekletilir.
5. Lamlar 1 saatte 5 defa TBS ile ykanr.
Antibodi-enzim konjugatnn substrat solsyonu ile birlikte
kullanm kesitler zerinde eli RNAnn bulunduu yerlerin renkli
grlmesini salar. Alkalin fosfataz enziminin kullanld durumda en
ok tercih edilen substrat solsyonu NAMP/Fast red TR dir.
6. NAMP/Fast red TR substrat solsyonunu hazrlamak iin:
NAMP stok solsyondan 10l ve Fast red TR stok
solsyonundan da 10l alnarak 5ml TBS bafrna eklenir. stege
bal olarak bu rama final konsantrasyonu 50mM Levamisol
kelenebilir. Levamisol endojen alkalin fosfatas aktivitesini bir
ok dokuda yok eder. Fakat tespit etme enzimi olarak kullanlan
danaya ait intestinal fosfataz enzimini yok etmez. Bir miktar
substrat solsyonu ile bir miktar Antibodi-enzim konjgatndan
alnp kartrlr. Kartrld anda renk deimesi gzlenmelidir.
Renk deiiklii oluyorsa subsrat solsyonu alyor demektir.
 233

7. Hazrlanan substrat solsyonundan bir miktar alnarak lamlardaki

kesitler zerine konur ve karanlk odada yeterli renk oluumu
salanana kadar bekletilir. Renk oluumu 10 dakika-16 saat arasnda
deiebilir. Lamlar karalkta 16 saatten fazla tutulmamaldr. nk
zaman uzadka substrat solsyonu spesifik olmayan belirleme yapar.
Eer bu durum sz konusuysa lamlar tekrar durulanr ve taze substrat
solsyonu ile kaplanarak tekrar karanlkta tutulmaldr. Ayrca yksek
scaklk renk oluumunu artrr fakat arka panel renk oluumuna (back
ground) sebep olur. Bu durumda belirgenlik azalr.
8. Lamlar renk oluum reaksiyonunu durdurmak i TE bafr ierisine
konur
9. Lamlar distile su ile durulanr.
10. Eer gerek duyulursa uygun bir boya ile kontur boyama
yaplabilir.Kontur boyama iin:
Kesitler zerine Mayer hematoksilin iyice kaplacak ekilde konur
veya tm lamlar Mayer hematoksilin slsyunu iine konulabilir.
Kullanlan hematoksilin gne bal olarak lamlar 0.5-5 dakika
inkbasyona brak
Lamlar nask bir ekilde ykama iesindeki distile su ile yka
Yava kan eme suyunda 5 dakika yka
11. Lamlar oda scaklnda akta kurutulur.
12. Kesitler uygun bir lam mauntant (glycerol gelatin) ile kaplanr ve
mikroskop altnda incelenir ve fotoraf ekilir.

p) Genin kromozom zerindeki yerini radyoaktif olmayan florokromla

belirleme.
Hayvan hcrelerinden ayrlm kromozomlar zerinde bulunan genlerin yerlerini
belirlemeye ve almaya yarayan bir metottur. Bu ekilde genin hangi
kromuzon zerinde olduu veya genin lokusunda meydana gelen deiiklikleri
gsteyir. Hem biyotin hem de digoksigeninle markalanm problar kullanlarak
ayn hazrl yaparak ayn anda iki veya daha fazla genin koromozon zerindeki
yeri gsterilebilir. ki ayr genin ayn anda yerini tespit etmek iin; iki farkl
ekilde markalanm (rnein biri biyotinle dieri ise digoksigeninle) problar
kullanmak gerekir. Hibridizasyon ileminden sonra bu genlerin yerleri oldukca
spesifik floresan antibodi konjugat kullanlarak belirlnir. Bu konuyla ilgili
prosedr aadadr.
1- Profaz veya metefaz safhasndaki kromozonlar hazrlanr
2- Hazrlanan kromozomlar 100l 2xSSC bafr iine konur ve bir saat
37C de bekletilir (2xSSC bafrna 100g/ml orannda RNaz iermeyen
DNaz eklenmi olmaldr)
3- ki defa 5 dakika 2xSSC bafr ile ykanr
4- Artan oranda etanol kullanlarak dehidrasyona tabi tutulur
 234

5- Mililitresinde 10g proteinaz K bulunan TE bafr ierisinde

inkbasyona braklr
6- 50mM MgCl2 inhtiva eden PBS ile ykanr
7- inde %1 orannda paraformaldehid bulunan ve 50mM Mg Cl 2 PBS ile
10 dakika oda scaklnda fikse edilir.
8- PBS ile ykanr
9- Etanol kullanlarak dehidrasyona tabi tutulur
10- Eleme solsyonu hazrlanr. Hazrlamak iin aadakiler eklenir.
50l Diiyonize farmamid
250l 20xSSC bafr
200 l Dekstran slfat (%50)
25 l Balk DNA s (100 g/ml)
11.Sonra digoksigeninle markalalam prob eeme bafrna konsantrasyonu
1g/ml olacak ekilde eklenir.
12. Eleme solsyonundan 30 l alnarak lamlar zerindeki kesitler zerine
konur. Sonra lamlar zerindeki kesiletler slikonise lamlellerle kapatlr.
Lamellerin zeri plastik imetoyla iyice kapatlr
13.Kormozomlar ve markalanm probu birlikte 80C ye kadar stlr ve
bu scaklkta 3 dakika bekletilir. Bylece kromozomlar ve prob denature
edilmi olurlar.
14. Gece boyunca uygun scaklkta hibridizasyona braklr.
15.Plastik imento uzaklatrlr
16.Lamlar PBS ile 5 dakika ykanr. Fazla PBS uzaklatrlr
17. 20 l foloresan veya rhodaminle konjuge edilmi ant-digotksigenin
antibodisi (1/10 seyretilmi) alnr (Bu ikinci antibudi % 1 orannda
Sr serum albumini ieren PBS solsyonuna eklenmitir) ve kesitler
zerine konur.
18. 30 dakika 37C de inkbasyona braklr
19.Be dakika PBS ile ykanr
20.Uygun bir solsyon (mountant) ile kapatlr
21.Floresan mikroskubu yardm ile grntlenir.
Kaynaklar
Davies J.T., 1993. In-situ hybridization. In:Immunohistochemistry A pratical
Approach. Oxford niversity press. Edited by J.E. Beesley. Chap. 9.
Cloez-Tayarani I., Fillion G., 1997. The in situ hybridization and
immunocytochemistry techniques for characterization of cells expressing
specific mRNAs in paraffin-embeddedbrains. Brain Research Protocols. 1: 195
202
Luo L-G., Jackson I.M.D., 1999. Advantage of double labeled in situ
hybridization for detecting the effects of glucocorticoids on the mRNAs of
protooncogenes and neural peptides TRH in cultured hypothalamic neurons.
Brain Research Protocols. 4: 201208
 235

32. MMUNOHSTOKMYA
Bu teknik 1930lu yllardan beri bilinmektedir. Fakat ilk immunohistokimya
almas 1942 ylnda rapor edildi. O zamandan imdiye kadar doku fikse
etmede, proteinleri konjuge hale getirmede, belirleme markarlarnn
gelitirilmesinde yeni kullanl metotlarn kefi ve mikroskoplarn fasilite hale
gelmesi sayesinde birok laboratuarlarda bu teknik esas ve rutin teknikler
arasna girmitir. mmunohistokimya: Anatomik, immnolojik ve biyokimyasal
teknikleri kullanarak hem dokulardaki hem de hcrelerdeki proteinlerin
mevcudiyetini ve dalmn belirlemeye yarayan ideal bir metottur.
Teknik: Antibodi/antijen reaksiyonunu uygun bir markar yardymyla grlebilir
hale getirme prensibine dayanr. Bu ekilde doku ve hcere ierisinde zerinde
durulan proteinin yeri ve dalm belirlenir. Markar olarak gnmzde enzim-
antibodi konjugatlar veya florofor-antibodi konjugatlar kullanlmaktadr.
32.1. Prosedr
Temel olarak tekniin uygulanmas sra ile:
1- Dokular fikse edilir ve mikrotomla 7-10m mikrotomla kesilir.
2- Kesitler parafn ierinde ise parafinin uzaklatrlr ve rehidrasyona tabi
tutulur
3- Kesitler zerindeki spesifik olamayan yerler bloke edici proteinle veya
bafrla bloke edilir.
4- Kesitler birinci antibodi ile inkbe edlilir (1:100 veya1:1000
seyreltilmi)
5- Birinci antibodi dklerek uzaklatrlr
6- Endojen peroksidaz/avidin/biyotinin foksiyonu bloke edlilir.
7- Non-reaktif yerler bafrla bloke edilir.
8- Kesitler ikinci antibodi-enzim konjugati ile inkbe eldir(1:2000 veya
1:5000 seyreltilmi)
9- Kesitler substratla inkbe eldilir ve grntlenir.
1-Doku veya hcrelerin fikse edilmesi
Fikse etme ilemi; doku ve hcrenin normal morfolojisini korumal ve antijenik
noktalara geirgenlii salamaldr. Bu nedenle doku fiksatif solsyonuna konur.
Daha nce de ifade edildii gibi her doku iin farkl fiksatifler mevcuttur. Bu
fiksatiflerden doku ierisindeki tespit edilecek antijenin tipine gre biri tercih
edilir. Aadaki tabloda dokuda tespit edilecek antijenin tr ve nerilen
fiksatifler yer almaktadr.
 236

Tespit edilecek antijen ve nerilen fiksatif

Antijen nerilen fiksatif
Birok protein ve kk molekl arlna sahip Formaldehit
enzimler ve peptitler Paraformaldehit
Paraformaldehit -pikrik asit
Enzimler ve peptitler Paraformaldehit -pikrik asit
Glutaraldehit
Kk molekller rnein amino asitler Glutaraldehit
ntrastoplazmik antijenler; lenf yumrular Merkrik klorit
biopsileri
Membran proteinleri Asetic asit-inko klorit
Glycoproteinler Periodat-lisin- paraformaldehit
Byk protein antijenleri (immunoglobulinler) Presipite edici fiksatifler (etanol,
metanol, aseton)

Bu fiksatifler hcrelerdeki lizozom enzimlerinin sebep olduu hcresel

paralanmay ayn zamanda doku ierisinde bakteri ve fungus geliimini
engellerler. Bu ekilde dokuyu korurlar. Kullanlan fikastifler duku ile apraz
balanma yaparak kullanlan antibodilerin ve dier ajanlarn dokuya
penetrasyonunu engellerler. Bu nedenle kullanlan fikstifle ilgili prosedr
optimm hale getirilmelidir ki bu problem olumasn. Fikastif seerken dikkatli
davranmak gerekir. Fiksatif secerken; fikzasayon sonras yaplack iler,
kullanlcak meteryal, penetrasyon ve fiksasyon oran, scaklk ve pH gibi
deikenler dikkate alnmaldr.

2-Kesitlerden parafinin uzaklatrlmas ve rehidrasyonun salanmas

a) Scakl 5660 C olan frn ierisinde (bu bir mikrodalga frn olabilir)
lamlar 15 dakika braklr (Scaklk 60C yi gememelidir)
b) Lamlar iki defa 5 er dakika kisilen banyosuna konur.
c) Lamlar karlr ve svlar iyice szlr sonra %100 etanol ierisinde 3
dakika braklr
d) Lamlar dar karlr svlarn iyice szlmesi salanr sonra 3 dakika %90
etanol ierisine konur
e) Lamlar dar karlr svlarn iyice szlmesi salanr sonra 3 dakika %80
etanol ierisine konur
f) Yava akan eme suyunda lamlar 30 saniye ykanr.
g) Lamlar oda scaklnda 30 dakika PBS banyosuna konulur. Bu ekilde
parafin uzaklatrlr ve rehidrasyon salanr.
 237

3-Kesitler zerindeki spesifik olamayan reaktif veya reaktif olmayan yerleri

bloke edici proteinle (Normal serumla) bloke etme
mmunohistokimyasal reaksiyonun oluumu iin dokudaki reaktif yerlerin bloke
edilmesi esastr. Bunun iin yaygn bir ekilde normal serum kullanlmaktadr.
Bu normal serum ikinci antibodinin elde edildii hayvann normal kan
serumudur. Bu serum prosedrn banda kesitler zerine konur ve dokudaki
istenmeyen antijenlere spesifik veya spesifik olmayan ekilde balanarak onlarn
fonksiyonunu engeller. Eer direkt immunohistokimyasal ytem uygulanyor ise
birinci antibodinin elde edildii hayvann normal serumu kullanlr.
4- Birinci antibodi ile inkbasyon
Birinci antibodiyi eklemeden hemen nce arka panel boyamay (back groundu)
azaltmak iin lamlar zerinde bulunan doku kesitlerinin zerine %5 orannda
ikinci antibodinin elde edildii hayvann normal kan serumunu ieren solsyon
konur ve 10 dakika bekletilir. Daha iyi sonu elde etmek iin kullanlan bu
serum albumini ikinci antibodinin gelitirildii hayvan trne ait olmaldr. Eer
ikinci antibodi koyunda gelitirilmi ise koyun serum albumini kullanlmaldr.
Kullanlan her antibodi iin optimum ekilde seyreltme (dilsyon) ve
inkbasyon sresi kullanmadan nce tespit edilmelidir. Birinci antibodi ile
inkbasyon proserr
a) Bloke edici bafr kesitleriden dkr ve kesitlerin etraf silinir.
b) Birinci antibodi optimum ekilde seyretilir (1:100 veya 1:1000
orannda seyretilmi). Negatif kontrol olarak sadece seyreltmede
kullanlan bafr negetif kontrol iin kullanlan kesitin zerine konur.
Pozitif kontrol olarak iinde kesin var olduunu bildiimiz antijenin
bulunduu kesit veya lam kullanlr.
c) Doku kesitlerini kapatacak ekilde seyretilmi birinci antibodiden 100
l alnr ve kesitler zerine konur
d) 60 dakika 37 C de nemli ortamda inkbasyona braklr.
e) Birici antibodi dklr ve lamlar 5 dakika PBS banyosunda bekletilir.

5-Endojen pekroksidaz/avidin/biyotinin foksiyonunu bloke etme

Dokular kompleks biyolojik sistemlerdir. Dokuda mevcut olan baz meteryaller
immmnohistokimya prosedrnde kullanlan ajanlarla etkileime girebilir.
Hcresel bileenler rnein enzimler, vitaminler, biyotin istenmeyen sonular
alnmasna sebep olabilir. rnein dokudaki peroksidaz diaminobenzidini (DAB
) azaltmak iin hidrojen proksitle etkileime girir. Bu durum yan (spesifik
olmayan) sonucun elde edilmesine sebep olur. Bunun iin kullanlan dokuda
endojen proksidaz aktivitesinin bilinmesi lazm. Bylece doku DAP ile
etkileime sokulur eer renk deimesi oluyorsa dokuda endojen proksidaz
antivitesi var demektir. Doku fiksasyonundan sonra kesitlerdeki endojen
proksidaz aktivitesini yok etmek iin birok metot gelitirilmitir. Bu
metotlardan en yaygn kullanlanlar %3 hidrojen proksitle veya hidrojen proksit
 238

eklenmi metenol ile doku kesitlerine muameledir. Daha nce doku kesitleri
zerine konulan birinci antibodiden sonra ve perosidaz konjugatyla
inkbasyondan (konjuge edilmi ikinci amtibodiilavesinden) nce hidrojen
proksit kesitler zerine konur. Bu ekilde kullanlan hidrojen proksit kullanlan
II.antibodinin fonksiyonunu etkilemez. Avidin-biotin boyalama metodu
dukudaki antjeni belirleme ektinlini artrmak iin yaygn olarak
kullanlmaktadr. Baz dokular fazla mktarda endojen biyotin ieririler (rnein
karacier, meme bezleri, ya dokusu ve brekler).Ayrca endojen avidin daha
ok problemlere sebep olur. nk bu sistemde serbest veya markalanm avidin
kullanlmaktadr. Bu nedenle endojen avidin ve biyotin aktivitesi bask altna
alnmaldr. Endojen avidinin bask altna alnmas iin nce endojen biyotinin
fonksiyonu avidinle bloke edilmelidir. Sonra da endojen anvidin biyotinle bloke
edilmelidir. Edojen prosidaz aktivitesini yok etmek (Bu ilem sadece proksidazla
konjuge edilmi ikinci antibodi kullanlyorsa uygulanr) iin:
a) Birici antibodi dklr ve lamlar 5 dakika PBS banyosunda
bekletilir. Lamlar dz bir yer stnde birbirinden ayr durac
ekilde dizilir. Bu arada kesitlerin zerinin devaml nemli
kalmasna zen gsterilmelidir. Kesitler kurumamaldrlar.
b) Her kesitin zerine %3 hirojen peroksit ieren solsyon her
kesiti temamen kaplayacak ekilde konur.
c) Be dakika oda scaklnda inkbasyona braklr.
d) Hidrojen peroksit dklr ve lamlar PBS banyosunda 2
dakika bekletilir. Bylece endojen proksidaz aktivitesi bloke
edilir.
6-Non-Reaktif yerleri bafrla bloke etme
Doku iindeki reaktif olmayan yerleri bloke etmek iin kesitler zerine bloke
edici bafr konulur ve 10-30 dakika beklenir. Lamlar hafif egilerek bafr dklr
(ykanmamaldr) sonra birinci antibodi konur. Daha doru olarak bu bafr brinci
antibodinin konulup uzaklatrlmasndan sonra ve ikinci antibodi kojugatnn
konulmasndan nce kesitler zerine kunulmaldr. Bu ekilkde ikinci
antibodinin spesifik olmayan (non-spesifik) balanma yapmasn engeller.

7-Kesitleri ikinci antibodi-enzim konjugati ile inkbe etme.

kinci antibodi bir poliklonal antibodidir. Bu antibodiler biyotile, floresanla,
rhodaminle, horsradi peroksidazla veya kalf intestinal alkalin fosfatasla
konjuge edilmi halde tiari irketlerden salanr. Doku kesitlerini ikinci
antibodi enzim konjugat ile imkbe etmek iin:
a) Bloke edici bafr lamlardan dklr ve kesitlerin etrafndaki
fazla sv silinir.
b) Proksidala veya alkalin fosfatazla konjuge edilmi ikinci
antibodi (markalanm IgG, 1:2000 veya 1:5000 seyreltilmi)
c) Doku kesitlerini temamen kapatacak ekilde 100l konjuge
edilmi ikinci antibodi konur.
 239

d) Nemli otamda 37C de 30 dakika inkbasyona braklr

e) Lamlar egilir ve konjuge edilmi ikinci antibodi dokolur sonra
iedeki PBS yavaca kesitlerin zerine dklerek ykanr.
f) Lamlar 5 dakika PBS banyosuna braklr.
8- Kesitleri substratla inkbasyona brakma ve grntleme
Kullanlan zlebilir substrat ikinci antibodiye bal enzimle reaksiyona
girerek znmeyen renki rnn olumasn salar. Oluan renklenme dzeyi
zerinda allan antijenin ve kullanlan birinci antibodinin konsantrasyonu ile
alkaldr. En yaygn ekilde kullanlan ikinci antibodi horsradi perosidazla veya
kalf intestinal alkalin fosfatazla konjuge edilir. Enzimik aktivite birok
deikene baldr. Bu deikenler enzim ve substrat konsantrasyonu, bafr, pH,
scaklk ve belki de ktr.
Kullanlan substratlar DAP, NBT, NBT/BCIP, BCIP gibi substratlardr.
Bu substratlar renk oluumunu salarlar rnein: DAP kahverengi, NBT/BCIP
siyah-mavi, NBT ve BCIP ise ak mavi renk oluumunu salar.
DAP (diaminobenzidin tetrahidroklorid) substrat olarak kullanlacaksa :
a) 1ml saf suda 50mg DAP olcak ekilde bir substrat zeltisi hazrlanr ve
dondurlarak saklanr. Kullanlaca zaman zlr ve kullanlr.
b) 50 mg DAP ieren 1ml lik solsyon 100 ml PBS ierisine boaltlr.
c) Yukardaki solsyona %30 hidrojen peroksit ieren slsyondan 33l eklenir
(Son H2O2 konsantrasyonu %0.01 olmaldr) ve aa ubukla iyice kartrlr.
d) Lamlar bu solsyon ierisinde 10 dakika braklr.
e) Sonra lamlar karlr ve zerindeki svlar uzaklatrlr, kesitlerin zeri hari
uygun ekilde silinir.
f) Mikroskop altnda incelenir.
 240

33. VESTERN TRANSFER (Western blotting )

Vestern transfer veya immunoblotting olarak ifade edilen bu teknik Southern
transfer tekniine benzerdir.
33.1.1. Bu teknikle neler yaplr?
1- Bu teknikle spesifik birinci (primer) antibodi kullanarak deiik
numunelerdeki ilgi duyulan zel bir proteinin molekl arl veya
bykl bulunur
2- Deiik dokularda belli bir proteinin bulunup bulunmad belirlenir.
3- O proteinin dokuda bulunu miktar analiz edilir.
4- Deiik rneklerde bulunan zel proteinin miktarlar karlatrlr
5- O proteinin deiik trleri ve ekilleri (alternatif siplizing ve prematr
terminasyon durumlar) belirlenir.

Bu teknigi kullanarak lm yapmak iin:

1. Dokudan veya hcrelerden elde edilen rnekler; ilgi duyulan zel proteini
paralanmaya kar koruyan uygun bir bafr ierisinde homogenize edilir.
2. Homogenize edilen rnekler dikey jel elektroforezine (SDS PAGE
kullanarak) tabi tutularak rneklerdeki proteinler ayrtrlr ve sonra
membran zerine geirilir (Blotting yaplr). Genellikle nitroselilz
membran kullanlyor fakat dier membranlar ve blotting ktlar
kullanlabilir. Transfer sonunda jelde bulunan proteinler ayn posizyonda
ve ekilde membran zerine geer.
3. zerinde protein bulunan membran st proteinleri ile inkbe edilir (St
proteinleri membran zerindeki yapkan yerlere balanr)
4. St proteinleri ile inkbasyon halinde bulunan membrann iinde
bulunduu solsyona miktar llmesi istenen proteinin ilk antibodisi
ilave edilir.
5. Birinci antibodinin proteine balanma yerini tespit etmek iin enzimle
markalanm veya konjge edilmi birinci antibodiyi tanyan ikinci bir
antbodi solsyona ilave edilir
 241

33.1.2. Teknik nasl uygulanr?

33.1.3. Prosedr
a) erisinde zel proteinin miktar llecek dokudan hcreler ayrlr.
Bunun iin doku nce mmkn mertebe kk paralara ayrlr. Kk
paralara ayrlan doku bir epandorf tpne konur sonra zerine tripsin
enzimi ilave edilir ve santrifj (14000 RPM veya 16000 G, 10 dakika +4
derecede) yaplr.
b) Santrifj sonucu tpn altnda hcre pelleti elde edilir. stteki sv ksm
dklr. Pelletin bulunduu tp kar ierisine konur ve hcreleri
 242

paralamak iin liziz bafr tpe konur. Bu bafrdan her 500.000 hcre
iin 25 mikro litre konur.
c) Liziz bafr ilave edilen tp 14000 RPM veya 16000 G, 10 dakika +4
derecede santrifje tabi tutulur.
d) Santrifjden sonra proteinler tpn st tarafndaki sv ksmdadr.
stteki sv pipetle yeni bir tpe transfer edilir ve alttaki pellet atlr.
e) Tpn iindeki svda bulan proteinlerin konsantrasyonunu bulmak iin
spektrofotometrenin kvetine 2 mikro litre sv 98 mikralitre rnek bafr
(sample buffer) koyulur ve A280 dalga boyunda absorbans deeri okunarak
rnekteki protein konsantrasyonu hesaplanr (Hesaplama Bradford testi
yardmyla da yaplr).
f) Tpten bir ksm (rnein 1 mikro litre) alnarak iki ksm ( rnein 2
mikro litre) rnek bafrna eklenir ve iyice kartrlr. Sonra 5 dakika
kaynatlr.
g) Kaynamadan sonra tp oda scaklnda 5 dakika soumaya braklr.
h) Jele yklemeden hemen nce tp vorteks zerinde 15-20 saniye
alkalanr sonra jele yklenir.
i) Poliakrilamit jel (14.5 cm x 16.5 cm) hazrlanr.Jeli hazrlamak iin ce
aadaki hazrlklar yaplr.
j) Agaroz pla hazrlanr. Hazrlamak iin: %1 agaroz 1x zc
(resolving) jel bafr ierisinde zlr.
k) zc (resolviing) jelin hazrlanr: Hazrlamak iin aadaki karm
oluturulur.
-5.4 ml %40 akrilamit/bisakrilamit ieren solsyon (29:1 karm)
-3ml 8x zc (resolving) jel bafr
-15.6 ml diyonize edilmi su
-12mikro litre TEMED
-60 mikro litre %20 amonyum perslfat zeltisi kartrlarak 24
ml %9 jel ihtiva eden resolving jeli hazrlanm olur.
l) Stacking jelin hazrlan Bu jelin 8 ml sinde aadaki ilaveler bulunur..
-1 ml 40% akrilamit/bisakrilamide (29:1 karm)
-2 ml 4x Stacking jel bafr
-5 ml diyonize edilmi su
-8 l TEMED
-21.6 l 20% amonyum persulfat solsyonu kartrlarak
hazrlanr.
Poliakrilamit jelin hazrlanmas
a) Cam kaplar ve ayrclar (1.5 mm kaln) hazrlanr.
b) nce kaba ykseklii 1-2 mm olacak ekilde agaroz pla dklr.
c) Kullanlacak taran gzlerinden 1 cm aa olacak ekilde zc
jel (resolving jel veya running jel) koyulur (yaklak 20 ml
konulmu olur)
 243

d) Jelin zerine 1 ml yardan yarya btanol ieren diyonize su

eklenir. Eklenen su jelin yzeyini kapatr. Jel bu durumda bir gn
bekletilebilir. Tercihe bal olarak ilere ara verilebilir.
e) Jel katt zaman btanol dklr ve jel diyonize su ile ykanr.
f) Jelin zerine daha nce hazrlanm stacking jel dklr (yaklak 5
ml) ve hemen tarak yerletirilir.
g) Stacking jel de katlatktan sonra jel levhas yerletirilir ve jel
bafr ierisine konur. Eletroforez den nce rnek yklenecek gzler
bafr ile fla yaplr.
m) Elektroforez
a) Yklenecek numune (10 mikro gram) vorteksle 15 saniye kartrlr
ve ykanan gzlere pipetle yklenir.
b) nceden boyanm standart markarlar(15 mikro gr, Kaleidoscope
standardlar) da jele yklenir.
c) Jel yaklak 2.5 saat sreyle devaml sabit olarak 35 - 37 mA ve
voltaj > 300 V olacak ekilde yrtlr.
n) Transfer (Blotting)
a) Membrann hazrlan: hazrlamak iin PVDF membranndan bir
para kesilir (Membrann tamam jele gre ok byktr. Transfer iin
kullanlacak membran tam olarak jelin byklnde olmaldr).
Membran metonol ierisine konularak ya edilir(Oda scaklnda 30
dakika hafif eimle kalkp inen alkalayc alet (Roker) zerinde
yaplr), 30 dakika sonra metanol dklr jelin zerine bu defa 1x
transfer bafr boaltlr. Bu arada alkalamaya devam edilir.
b) Transfer. Uygun bir alkalayc platform zerine nceden transfer
bafr ile iyice slatlm spong konur zerine filtre kad (wathman
filtre kad, 3mm) yerletirilir ve zerine jel konulur. Jelin zerine
membran konulur. Membrann zerine iyice slatlm filtre kad
konur. Filtre kadn zerine sponk konur. alkalayc zerinde 1 saat
sreyle, 1 amp akmla +4 derecede transfer salanr.Bir saat sonra
jeldeki proteinler membran zerine geirilmitir. Dar karlan
membran bir gece boyunca bloke edici bafr ierisinde bekletilir.
o) Antibodilerin eklenmesi ve proteinlerin membran zerinde tespit
edilmesi.
a) Gece boyunca bloke edici bafr iine konulan membrandan bafr
dklr ve inde birinci antibodi eklenmi bloke edici bafr konur
sonra oda scaklnda 1 saat inkbasyona braklr.
b) Bir saat sonra membran karlr ve 3 defa 10 dakika %0.05 Tween
ieren PBS de ykanr.
c) Bloke edici bafr ierisine kartrlm ikinci antibodi ile membran 45
dakika oda scaklnda inkbasyona braklr.
d) 45 dakika sonra membran karlr ve 3 defa 10 dakika %0.05 Tween
ieren PBS de ykanr.
 244

e) PBS ile ykamadan sonra 500 l of BCIP/NBT solsyonu eklenir. Bu

solsyon yeil renkli olmaldr kahverengi olmamaldr 15 dakikada
membran zerindeki bantlar grlr. Bu arada membrandan kesilmi
molekler arlklar gsteren nceden kesilmi ksm %0,1 Amido siyah
boya solsyonu ile 1 dakika boyanr. Bir dakika sonra bu ksm karlr
ve tam 10 dakika amido siyah boyasn karc solsyon ierisinde
braklr. !o dakika sonra su ile iyi bir ekilde rinse edilir. Bu arada
BCIP/NBT solsyonu ierisindeki membranda bantlar grlmeye balar.
Bantlar grldkten sonra membran su ile rinse edilir. Bu rinse etmeyle
development durdurulur Ve sonra membrann fotoraf ekilir.

33.1.4. Western tarnsferde kullanlan solsyonlarn ve boyalarn

hazrlanmas
a) Lysis bafrnn hazrlan: Hcrelerden proteinleri ayrtrmak iin
kullanlr.Aadakiler kartrlarak hazrlanr
-0.15 M NaCl
-5 mM EDTA, pH 8
-1% Triton X100
-10 mM Tris-Cl, pH 7.4
Kullanmadan hemen nce :
- 1:1000 5 M DTT
-1:1000 100 mM PMSF in isopropanol
-1:1000 5 M aminokaproik asit
eklenir.

b) 2xrnek (sample) bafrn hazrlan: Hazrlamak iin aadakiler

kartrlr
130 mM Tris-Cl, pH8.0
20% (v/v) Glycerol
4.6% (w/v) SDS 0.02% Bromophenol blue
2% DTT

c) 8xzc (Resolving) jel bafrnn hazrlan : Bu bafrn 100 ml

sinde ;
0.8 g SDS (en sonda eklenecek)
-36.3 g Trizma baz (= 3 M) bulunur. pH gl HCl yardm ile
8.8 e ayarlanr.

d) 4x Stacking gel bafrnn hazrlan: Bu bafrn 100 ml sinde;

0.4 g SDS (en sonda ekle)
6.05 g Trizma baz (= 0.5 M) bulunur. PH 6.8 e ayarlanr
 245

e) d)10xJel yrtme bafr (Running buffer): Bu bafrn 1 litresinde;

-30.3 g Trizma base (= 0.25 M)
144 g Glycine (= 1.92 M)
10 g SDS (= 1%, Bu en sonda eklenir) bulunur. pH ayarlamayn.

f) 10xTransfer bafrnn (Blotting buffer) hazrlanmas: Bu bafrn 1

litresinde;
-30.3 g Trizma baz (= 0.25 M)
144 g Glycine (= 1.92 M) bulunur. pH n kendiliinden 8.3
olmas beklenir. PH ayarlamaya almayn.

g) 1xTransfer (blotting) bafrnn hazrlanmas;

Bu bafrn 2 litresinde;
-400 ml Metanol
-200 ml 10x Blotting bafr
-1400 ml diyonize su
-500ml Bloke edici (Blocking) bafr
-3% Sr serum albumini (Fraksiyon V)
Bu bafr PBS ierisinde hazrla ve filtreden geirerek steril yaplr ve sonra
0.05% Tween 20 eklenir. Hazrlanan bafr bakteriyel bulamadan kurumak
iin 4C de tutulur.

h) Stripping bafrn hazrlanmas

Bu bafr hazrlanr sonra filtre edilerek steril hale getirilir ve 4C de tutulur. Bu
bafrn 0.5 litresinde:
0.2 M Glycine, pH 2.5
0.05% Tween 20 bulunur.
Boyalarn hazrlan
a) 0.1% Fast Green boyas (%10 asetik asit ve %20 metanol ieren
karmda). Hazrlamak iin:
0.2 g Fast Green
20 ml asetik asit
40 ml methanol
140 ml ultra saf su kartrlarak hazrlanr.

b) 0.1% Amido siyah boyas (%10 asetik asit ve %45 metanol ieren
karmda). Hazrlamak iin;
0.2 g Bufalo siyah
90 ml metanol
 246

20 ml asetik asit
90 ml ultra saf su eklenir ve hazrlanr.
c) Amido siyah boyasn zc boya (Amido Black Destain) (%2 asetik
asit ve %45 metanol ieren karmda). Hazrlamak iin:
-225 ml metanol
-10 ml asetik asit
-265 ml ultra saf su eklenerek hazrlanr.
 247

34. TRANSGENK HAYVANLARIN ELDE EDLME TEKNKLER VE

TEKNKLERN SALADII YARARLAR
Hayvanlarn evciletirilmesinden beri insanlar yeni slah metotlarn deiik
hayvan trlerinde uygulamaktadrlar. Gnmzde genetiksel olarak modifiye
edilmi trlerle o trlerin vahi akrabalar arasnda nemli farklar
bulunmaktadr. Bu farklar transfer edilen genler sonucu deil evciletirme
srecinde geirilen evrim sonucu olumutur. Ksaca insan sosyetesinin ve
evciletirdii canllarn (Bitkilerin, mikroorganizmalarn ve hayvanlarn) birlikte
geirdii evrim srecinin yansmasdr. Yaplan genetik mofikasyonlar
seleksiyonun arkasndaki kaltmm kurallaryla ilgili bilgiye sahip olunmadan
hayvanlarn performanslarna baklarak yaplmtr. Gnmzde bilimin
salad avantajla insanlar kaltmn kurallarn daha iyi bilmektedirler. Bilim
ve tekniin salad avantajla insanlar imdi istee gre DNA zincirinde
noktasal ve spesifik demeler yaplabiliyorlar.

34.2. Transgenik hayvanlar elde etme teknikleri

Transgenik hayvanlar hakknda ilk raporlarn yaynland 1970 ve 1980 yallar
arasnda transgenik hayvan elde etmek iin deiik teknikler nerildi. Bu
nerilen tekniklerden birounun uygulanmasndaki problemleri zmek iin
bilimle uraan kiiler halen almaktadrlar. Hatta bu nerilen tekniklerden
bazlarnn uygulanma imkn bile yoktur. Bu nerilen tekniklerde bazlarnn ise
pratii yaplm ve transgenik hayvanlar elde edilmitir. Gelecekte transgenik
hayvanlar ve hayvansal rnleri (rnein transgenik hayvanlardan elde edilen
farmakolojik maddeleri ve biyomleklleri) markette bulmak mmkn olacak.
Memeli hayvanlarn germinal hcrelerine yaplan ilk baarl DNA
transferi retrovirslerle saland (Jaenisch ve ark., 1975). Retrovirsler
memelileri infekte eden ve birka hastala (rnein iek hastalna, kansere
ve immno yetersizlige) neden olan RNA virsleridir. nfeksiyon srasnda virs
hcreye balanr ve RNAsn stoplazma ierisine brakr. Sitoplzmaya geen
RNA ters transkripsiyonla DNAya dnr. Sonra virs DNAs hcre
ekirdeine geerek kendini hcrenin DNAsyla birletirir. Bu nedenle
retrovirsler gen transferinde vektr olarak kullanlmaktadrlar. Bu virsler sr
embriyosuna gen transferinde vektr olarak kullanlyorlar. Virs blastosit
safhasndaki embriyonun zona zar ile tropoekdoremi ve embrionik hcrelerini
paketleyen zar arasna (perivitellin boluuna) enjekte edilerek embrionik kk
hcrelerinin genomunun modifiye edilmi virs genomuyla enteraksiyonu
saland (Chan ve ark., 1998). Her ne kadar retrovirsler kullanlarak gen
transferi salansa da bu tekniin uygulanmasnda bir takm snrlamalar mevcut.
Bu snrlamalar:
 248

a) Bu virslerin entegrasyon iin oalma kabiliyeti olan (mitoz

geiren) hcrelere gereksinim gsterirler
b) Transforme olmu hcreleri belirlemedeki zorluklar var
c) Transfer edilen geni gelecek kuaklara aktarma yeteneine sahip
olmayan imerik hayvanlarn elde edilme olaslnn yksek
olmas
Bu snrlamalar en aza indirmek iin yine retrovirsler familyasndan
lentivirsler vektr olarak kullanlmaya baland. nk bu virsler entegrasyon
iin oalma kabiliyeti olan hcrelere ihtiya duymazlar. Bu virslerin
entegrasyonu iin geni bir konakc hcre spektrumu mevcuttur. Bu
zelliklerinden dolay, bu virsler ciddi bulac hastalk amilleridir rnein
ksrak anemi virs ve srda ve insanda immno yersizlie neden olan virsler
(BV ve HV). Bu sebeple bu yntem kullanlarak ticari transgenik iftlik
hayvanlarnn elde edilmesi mmkn grlmemektedir (Clark ve Whitelaw,
2003).
Transgenik havanlar elde etme konusunda r aan bir alma
transforme edilmi sperm hcresini vektr olarak kullanp in vitro fertilizasyonla
transgenik tavan elde etme almasyd (Bracket ve ark., 1971). Fakat bu
yntemle elde edilen hayvanlar transfer edilen genler bakmndan mozaikti,
ksaca imerikti. Bu sebeple transfer edilen genler her zaman bir sonraki
generasyonda bulunmuyordu. Bu metotla transfer edilen genlerin oosit
hcresinin DNAsyla entegrasyonu snrldr. Spermle transfer edilen genlerin
oosit DNAsyla entegrasyonunun artrlmas iin sperm hcreleri
elektroporasyona tabi tutuldu. Bu ekilde srlar zerinde yaplan almalardan
iyi sonular elde edildi (Rieth ve ark., 2002; Celebi ve ark., 2003).
Sperm hcrelerini kullanarak yaplan DNA transferine alternatif olarak;
testisteki germinal hcrelerinin DNAayla transfeksiyonu ve transfekte olan
erkek germinal hcrelerin alcnn seminifereus tplerine nakli gelitirildi
(Nagano ve ark., 2001). Bu yntem ilk olarak farede denendi ve son zamanlarda
keilerde ve domuzlarda baarl bir ekilde kullanld (Honaramooz ve ark.,
2002, 2003). Transfekte edilmi germinal hcrelerin transplant edildii
hayvanlarn yaklak %5i transgenikti. Bu hayvanlar bir sonraki generasyona
transfer edilen genleri aktardlar (Nagano ve ark., 2001). Bu nedenle bu teknik
kullanlarak gelecekte baarl almalar yaplabilir. Embrionik kk
hcreleriyle yaplan gen transferi imerik embriyolarn olumasna sebep olur.
Bu durumda embrio iki farkl genoma sahip hcrelerden meydana gelir. Bu iki
farkl hcreden sadece birinde istenilen gen mevcuttur. Embrionik kk hcreleri
blastosit amasndaki embriyodan elde edilirler, Bu hcreler puluripotent
hcrelerdir. nk bu hcreler bir bireyin tm dokularn (hatta germinal
dokularn bile) oluturabilen hcrelerdir. Embrionik kk hcrelerini kullanarak
gen transfer etme ilk defa farede denendi. Bu teknikle istenilen genlerle
transfekte edilen kk hcreleri blastosit amasndaki embrio ierisine enjekte
edildi. Bu metot in vitro koullarda embrionik kk hcrelerinin
 249

maniplasyonunun ve transfeksiyonunun mmkn olduu tm hayvanlarda

uygulanabilir (Robertsson ve ark., 1986). Embrionik kk hcrelerinin ayrlarak
kltre alnd ilk hayvan faredir (Evans ve Kaufman 1981; Martin 1981).
Transfekte edilen embrionik kk hcreleri yardmyla transgenik hayvan elde
etmenin bir takm avantajlar da mevcuttur. Bu avantajlardan biri embrionik kk
hcrelerine homolog rekombinasyonla DNA zerindeki gen transgenik hayvan
elde etmeden nce belirlenir ve gzetlenir. Bu ekilde genom ierisindeki
transgenik integrasyonun mmkn olduu yer bulunur ve bu yerdeki genler
istenilen genlerle deitirilir. Bu ekilde gen ekleme (knockin) veya karma
(knockout) yoluyla insan genlerinin fonksiyonlar almaktadr (Thomas ve
Capecchi 1987; Capecchi 1989). Embriyonik kk hcreleri ile yaplan gen
transferi sonucu imerik hayvanlarn elde edilmesi bu tekniin bir
dezavantajdr. Bu imerik hayvanlarn tarnsgenik hale gelebilmeleri iin tekrar
kendileri ile aprazlanmalar gerekmektedir. Bylece hayvanlarn tm dokular
ayn genoma sahip olur. Bu i zellikle srlarda olduka uzun zaman alr.
Ayrca baz hayvanlar iin (srlar ve domuzlar) embrionik kk hcrelerinin
ayrlmas ve uygun in vitro kltr ortamnn oluturulma almalar halen
devam etmektedir. Bu hayvanlardan elde edilen embrionik kk hcrelerinin in
vitro koullarn oluturulmas ve bu hcrelerin in vitro ortamda maniple
edilebilmesi konusunda bilimsel almalara ihtiya vardr (Shim ve ark., 1997;
Saito ve ark., 2003).
Hayvanlara gen transfer etmenin baka bir yolu da pronkleus
enjeksiyonudur. Bu metotta istenilen genler zigottaki pronkleuslardan birine
enjekte edilir. Bu teknik de ilk defa farede denendi (Gordon ve Ruddle 1981:
Palmiter ve ark., 1982). Halen transgenik rodent (kemirgen) elde etmede tercih
edilmektedir. Her eyden nce bu teknik transgenik iftlik hayvan (Tavan,
domuz ve koyun) etmede kullanlan ilk tekniktir. Bu metotla yaban faresine
insan byme hormonunu ifreleyen DNA transfer edilmitir (Hamner ve ark.,
1985). lk transgenik sr da yine pronkleus enjeksiyonu sunucu elde
edilmitir (Krimpenfort ve ark., 1991). Bu metodun baz dezavantajlar var.
Bunlar:
1. Bu metotla homolg rekombinasyonla genleri devre d brakmak
(knocaut etmek) mmkn deildir.
2. Enjekte edilen genler zigotun genomuyla entegrasyon oran olduka
dk.
3. imerik hayvanlarn elde edilme oran olduka yksektir.
4. Transfer edilen genlerin zigot genomunun neresine entegre olduunu
tahmin etmek mmkn deil. Genin entegre olduu pozisyonun etkisiyle
transfer edilen genlerin ekspresyonunda varyasyonlar grlr (Clark ve
ark., 1994).
Yukardaki nedenler bu tekniin etkinliini olumsuz ynde etkilemektedir. Bu
dk etkinlik nedeniyle bir transgenik sr elde etmek iin ortalama 600 tane
sr zigotuna gen enjeksiyonu yapmak gerekir. Bir tansgenik koyun elde etmek
 250

iin 300, bir transgenik kei elde etmek iinse yaklak 200 tane zigota gen
enjekte etmek gerekir. Grld gibi bu tekniin etkinlii odluca az. Bu da
transgenik hayvan elde etmenin maliyetini ar artrmaktadr (Seidel 1993).
Yaklak 10 yl nce meme bezindeki ya hcrelerinin ekirdeinin
ekirdegi ve polar cismi karlm metefaz-II safhasndaki yumurta hcresine
baarl transferiyle ilk klonlanm kuzu Dolli Wilmut ve arkadalar tarafndan
1997 de elde edildi. Transfer edilen nkleus herhangi bir vcut hcresinin
nkleusu olabilir. Transfer edilecek metafaz-II safhasndaki yumurta hcresinin
nlleusu ve polar cismi uygun bir yntemle karlr. Geriye sadece yumurta
hcresinin zona zar ve sitoplzmas kalr. Transfer edilecek ekirdek zona zar
ile sitoplzma zar arasndaki bolua (Previtellin boluuna transfer eldir. Sonra
eletroprasyonla transfer edilen nkleosun staplazmaya geii salanr. Bu
yntemle genetik kabiliyeti bilinen tek yumurta ikizleri elde edilebilmektedir.
Nkleer transferin avantajl taraf hem yumurta hcresinin hem de somatik
hcrenin nkleosunun bir hayvann yaam boyunca her an elde edilebilmesidir.
Nkleer transfer yapmadan nce; transfer edilecek nkleosun genomu ierisine
istenilen genlerin transfeksiyonu ve transfekte olan nkleuslarn belirlenmesi
gereklidir. Gen tarnsfeksiyonunu salamann deiik yollar vardr. Bu yollar:
1. Mikroenjeksiyonla (Sikes ve ark., 1994)
2. Partikl bombardmanyla (Williams ve ark., 1991)
3. Kalsiyum fosfat solsyonuyla (Chen ve Okayama, 1988)
4. Lipozomlarla (Caplen ve ark., 1995)
5. Viral enfeksiyonla (Kovesti ve ark., 1997)
Transgenik iftlik hayvanlar en uygun olarak katyonik lipozomlarla transfekte
edilen hcre ekirdeklerinin nakliyle elde edilmitir (Oliveira ve ark., 2005).
Nkleer transfer yaplmak zere hcre kltr ve kltre alnan hcrelerin
ekirdeklerine insana ait kan phtlama faktr-IX kodlayan genlerin
transfeksiyonu ve takip eden nkleer transfer sonucu faktr IX genini
bulunduran ilk transgenik koyun elde edilmitir (Schnieke ve ark., 1997). Bunu
takiben antibiyotie dayankl 5 tane trasngenik sr nkleer transferle elde
edilmitir (Cibelli ve ark., 1998). O zamandan imdiye kadar dier trlere
mensup birok transgenik hayvan bu yolla elde edilmitir (Keefer 2004; Kues ve
Niemann 2004). Bu metodun pronkleus enjeksiyonuyla karlatrldnda
avantaj; transfer edilecek veya genomdan karlacak genlerin belirlenebilmesi
ksaca homolog rekombinasyonla transfer edilen genin belirlenebilmesi ve
eksperesyonun kontrol edilebilmesidir (McCreath ve ark., 2000). Her ne kadar
bu tekniin etkinlii dk olsa da nemli bir tekniktir. kl bu teknik imerik
hayvanlarn elde edilmesine olanak salamaz. Bylece transgenik havyanlar
dier metotlara kyasla daha ksa srede ve dk maliyetle elde edilirler
(Polejaeva ve Campbell 2000; Melo ve ark., 2005). Genetik kabiliyeti yksek
klonlarn elde edilmesi amacyla senkronize edilmi GI safhasndaki fibroblast
hcrelerinin ekirdeklerinin transferi ( Kesinathan ve ark., 2001; Gibbons ve
ark., 2002) ve bu hcrelerin ekirdeklerinin tekrar programlanmasn ilerletmek
 251

amacyla nkleuslarna mitotik hcre ekstraktlaryla muamele etme halen

allan bir konudur. Ksaca bu teknik trasngenik hayvanlarn elde edilmesinde
kullanlan en nemli metottur.

34.3. Farmakolojik maddelerin ve biyomolekllerin transgenik yolla elde

edilmesi
Transgenik hayvanlarn elde edilmesinin malyeti yksektir. Bu nedenle
transgenik hayvanlardan elde edilen rnlerin ekonomik deerinin yksek
olmas gerkir ki yaplan harcamalar karlanabilsn. Piyasadaki ticari deeri
yksek farmakolojik maddelerin milyar dolarlarla ifade edilen market hacmi
mevcut. Bu durum transgenik hayvan elde etme konusundaki almalar
mitlendirmektedir. Mikroorganizmalardan (bakterilerden ve mayalardan) ucuz
olarak transgenik yolla biyomolekller elde etmek mmkn fakat bu
oragnizmalar translasyon sonras birok modifikasyonu yapmazlar (rnein
nitrojene bal glikozilasyon, oksijene bal glikozilasyon ve elde edilen
biyomolekllerin doru katlanmasn). Bu sebeplerle geni spektrumlu
fonksiyonel insan proteinlerni bu organzlalardan etmede baz zorluklar vardr.
Bu nedenle temamen aktif insan polipeptitlerinin trasngenik yolla elde edilmesi
ancak memeli hcreleri ierisinde olur. nsan polipetitlerinin in vitro ortamda
memeli hcrelrinden tansgenik yolla elde edilmesinin maliyeti ysektir. Bu
yksek maliyet kltr ortamnda yeteri kadar bu biyomolekllerin
sentezlenememesidir. Bu sebeple insan biyomolekllerini fazla miktarda ucuz
yolla elde etnek iin biyoteknoloji irketleri hayvanlar canl fabrika olarak
kullanmay dnmektedirler. Bu irketler dnya apnda bu yntemi
uygulamaya geirmek iin byk abalar harcamaktadrlar. Bu irketlerden
bazlar:

irketin Ad Bulunduu lke

PPL Therapeutics Birleik krallk (UK), Birtanya
GTC Biotherapeutics Amerika Bileik Devletleri
Hematech Amerika Bileik Devletleri
Genzyme Amerika Bileik Devletleri
ZymoGenetics Amerika Bileik Devletleri
Avigenics Amerika Bileik Devletleri
TranXenoGen Amerika Bileik Devletleri
Viragen Amerika Bileik Devletleri
Nexia Biotechnologies Kanada
Pharming Hollanda
BioProtein Technologies Fransa

Transgenik yolla farmakolojik rnleri hayvanlarn vicut svlarndan (Stnden,

kanndan idrarndan, salyasndan, seminal plazmasndan) elde edilebilirler. Bu
 252

durum transfer edilen genlere eklenen promotrlere gre deiir (kandan elde
edilecekse transferi yaplacak genin ona uygun promoterle birlikte, stten elde
edilecekse gine ona uygun promoterle birlikte transfer edilmelidir). romidin
promoteri kullanlarak insan rekombinant eritroproteini ve 1-antitripsin proteini
tarnsgenik farenin idrarndan elde edilmitir (Zbikowska ve ark, 2002a;
Zbikowska ve ark, 2002b). drardan rekombinant protein elde etmenin bir takm
avantajlar var. Bu avantajlar: Hem dii hem de erkek idrar yapar, idrardaki
proteinin kontamine olma olasl dk, doumdan hemen sonra yeni doann
idrarndan rekombinat protein elde edilir, Transgenik hayvan yaam boyunca
idrar karr. Bu avatajlara ramen idrardan rekombinant protein salamak
meme bezlerinden rekombinant protein elde etmeden daha fazla zaman alr,
maliyeti ise daha ysektir. Ksacas en uygunu stten rakombinant protein
salamaktr. Genelde hayvanlar ok miktrada st retirler buna bal olarak
stten fazla miktarda rekombinant protein elde edilir. Bu sebeple daha ok st
tercih edilmektedir. Meme bezlerinden salglanan stn her litresinden 2gr
heterojen rekombinant protein elde edilebilir (Valender ve ark, 1992; van Berkel
ve ark., 1992). Stten rekombinant protein elde etme bu rekombinant proteinin
stte bulunma orana veya ekspresyon derecesine ve stten saflatrlarak elde
etme miktarna baldr. Tm dnyada insan rekopminant serum albuminine
duyulan ihtiyac bir ylda yaklak 100 000 kg dr. Bu ihtiyac karlamak iin
stnden rekombinant protein bulunan 5400 taransgenik inege ihtiyac vardr.
Ayn ekilde ylda -antitripsine duyulan ihtiya yaklak 5000 kg dr. Bu
ihtiyac karlamak iin yaklak 4500 transgenik koyuna ihtiyac vardr. Bu
nedenle stteki transgenik proteinleri ifreleyen genlerin ekspresyonlarnn
artmasn salayan dzenleyici faktrlerin kefedilmesine gerek vardr.
Transgenik yolla elde edilen baz biyofarmakolojik rnlerin Amerikan
gda ve ila bakanl tarafndan kliniksel dzeyde kullanmi dzenlenmekte ve
yaygnlamaktadr. Bu biyofarmatik rnler:
1. Amerikan GTC Biotherapeutis irketi tarafndan st keisinden transgenik
yolla elde edilen rekombinant Antitrombin III. Bu ila tromboz ve
pulmoner embolinin tedavisinde kulanlmaktadr.
2. Hemtech (ABD) irketi taranfndan sirdan transgenik yolla elde edilen
insan rekombinant poliklonal antibodiler. Bu antibodiler a olarak
kullanlmaktadrlar.
3. GTC Biotherapeutis irketi tarfndan insan serum albumini srdan
transgenik yolla elde edildi ve kullanlyor. Bu rnn market fiyat
oldukca yksek.
4. sko irketi PPL Therapeutics tarafndan rekombinant -antitripsin
koyundan elde edildi. Enfisema ve siroz hastalnn tedavisinde
kullanlmaktadr.
5. PPL Therapeutics tarafndan rekombinant olarak koyundan elde edilen
insan Faktr-IX ve domuzdan elde edilen Faktr-VIII proteinleri. Bu
proteinler hemofili-A ve Bnin tedavisinde kullanlmaktadr.
 253

6. Hollanda irketi Pharming tarafndan rekombinant yolla srdan elde

edilen insan Laktoferini. Bu medde antibakteriyel, antiviral ve antifungal
olarak kullanlmaktadr. Ayrca baklk sistemini doal olarak
glendirmek iin de kullanlyor.
Bu almalar baarl olan almalarn bazlar. Fakat hayvanlarn stnden
rekombinant biyofarmatik meddeleri elde etme amac gden almalarn hepsi
baarl olmamtr. Bazen elde edilen rekombinat proteinin yan ekileri vardr.
rnein tavandan elde edilen rekombinant protein erythropoietin etkisi yapar.
Erythropoietin az miktarda karaciger ve daha ok bbrekler trafndan salglanan
glikoprotein yapsnda bir hormondur, kemik iliginde alyuvarlarn oluumunu
salar. Ksaca dengesiss alyuvar oluumu ve fertilite problemi tavanda yan etki
olarak grlr (Massoud ve ark., 1996). Keilerden tansgenik olarak elde edilen
doku plazminojen aktivatr yan etki yaparak laktasyonu sonlandrr (Elbert ve
ark., 1994). Koyundan rekombinant yolla elde edilen isana ait Faktr-VIIIin
biyolojik etkinli oldukca dktr (Niemann ve ark., 1999).
Stnde 1gr/mL rekombinant protein bulunan ve kendisine transfer edilen
geni sonraki kuaklara aktabilen bir transgenik hayvann elde edilmesi; bu
alandaki genetik almalarn en nemli hedefidir. Fakat bu sonuca ulamak ok
uzun zaman, ok fazla bilgi ve aba gerektirmektedir. Rekombinant proteinlerin
elde edilemsinde dier bir problem ise stten saflatrarak elde edebilme
ilemidir. Bu ilemin etkili yaplmas rekombinant protein retimi iin ok
nemlidir. Bu konuda bilimsel almalar yaplmaktadr (Lazaris ve aark., 2002).

34.4. Transgenik almalarn Ekonomik nemi

1980lerde yaban faresine ait byme faktrn kodlayan gene
metalotionin promoteri eklenerek fareye transfer edildi ve bu protein fareden
rekombinat olarak saland (Palmiter ve ark., 1982). Byme hormonu
mitogenik fonksiyona sahip besicilikte kullanlabilen bir hormondur. Bu
hormonun transgenik yolla elde edilmesi besicilikge yarayl yeni bir ara elde
etme dncesi uyandrd. Transgenik uygulamalarla elde edilen rekombinant
biyofarmatiklerin kullanmnn et retiminde kar orann artraca tahmin edildi.
Dier taraftan, yaplan transgenik almalarn maliyetlerinin ar yksek
olmas ve on yldan fazla bir zamandr saylar artan ve bu konuda alan
biyoteknoloji irketleri arasndaki rekabet transgenik iftlik hayvanlarndan elde
edilen rekombinant biofarmatik rnlerin satndan salanacak kar miktarn
drmtr. Ayn zamanda baz irketler iftlik hayvanlarndan elde edilen
birok biofarmatik rnlerin retim patentini ellinde tutuyor olamalarna ramen
finansal zorluklarla karlayorlar. rnein isko PPL Therapeutics irketi;
iftlik hayvanlarndan tansgenik yntemle elde edilen birok biofarmatik rnn
retim patentini tekelinde bulundurmasna ramen 2004 ylnda fnansal
yetersizlie girdiini aklamtr. Yeni bir biofarmatik medenin markette
girmesi yaklak 800.000 dolar ro yapar. Bu sebeple Amerikan gida ve ila
bakanl transgenik biofarmatik maddelerin ucuz yolla elde edilmesi iin
 254

laboratuar ve kliniksel almalar tefik etmektedir. Bu almalar ayn zamanda

uzun zaman almaktadr. Transgenik yolla bir biofarmatik maddenin elde eilmesi
ile markette satlabilir lisans almas arasnda geen sre yaklak 15 yldr
(Miller, 2002). Transgenik rnleri reten irketler arasndaki yksek rekabet, bu
irketlerle ilgili ynetmelikler ve transgenik konusunda salanan bilimsel
gelimeler retim maliyetinin nemli seviyede dmesini salad. Bu durum
iftlik hayvanlarnn verim potansiyelini transgenik yolla artrma konusuna yeni
bir yaklam kazandrd. Hayvanclkta ekonomik deeri olan verimler ( Karkas
komposyonu, et kalitesi, st verimi, yn kalitesi, reme etkinlii ve hastalklara
kar dayankllk) transgenik yntemle artrlabilir.
iftlik hayvanlarndan elde edilen st karmak bir biolojik svdr. St
dnya zerinde birok toplum iin ok nemli besin kaynadr. Dnyada bir
ylda 400x109 litreden fazla st retilmektedir. Bu miktardaki stn piyasa
deeri yaklak 400 milyar dolardr (Karatzas, 2003). St proteinlerinin %80i
kazeinden olumutur. Bu nedenle kazein stn nemli bir bileenidir. nek
stnn kazein fraksiyonu s1, s2, ve K-kazeinden olumutur. Bu
fraksiyonlarn hepsi tek bir gen tarafndan determine edilirler (Karatzas ve
Turner, 1997). Kezein miseller halinde stn ierisindedir ve bu misellerin
birbiriyle agregesyon yetenei vardr. Bu agregasyon neticesi kezein
misellerinin birbiriyle birlemesi, biraz st suyunun ve st yann ounun bu
bileime ilavesi sonucu peynir oluur. Kazein misellerinin bykl penirin
scalk dengesini etkilemetedir. Peynir endstrisinde misel byklgnn ve
sicaklk stabilitesinin nemi byktr. Misel byklnn kk olmas
istenmektedir. Bu misel bykl ise stteki K-kazein miktaryla alakaldr.
Stte K-kazein miktar artarsa o oranda miseller kk olur. Stteki K-kazein
miktarn transgenik yolla artrmak iin ve K-kazeini ifreleyen CSN2 ve
CSN3 genleri inee transfer edildi. Bu tarsfer sonucu stnde 20 kat fazla ve 2
kat fazla K-kazein bulunan transgenik inek elde edildi (Brophy ve ark., 2003).
Bu alma stn bileiminin transgenik yolla deitirilmesine rnek
oluturmaktadr. Peynir retimi dnyada bir milyar dolarlk market hacmine
sahiptir. Transgenik yolla peynir retimini artrmak mmkndr. Dnya
nfusunun yaklak %70i (Bunun daha ounu asya ktasnda yaayanlar
oluturur) Stteki laktaz enziminin yetersiz olmasndan ikayetcidirler. Stte
bulnan esas eker laktozdur. Stte laktaz enziminin dk olmas stn
tketimini snrlayan potansiyel faktrdr. Bu nedenle bilim adamlar laktoz
miktarn drmek iin transgenik almalar yaplmaktadrlar (Stinnakre ve
ark., 1994; Stacey ve ark., 1995). rnegin laktaz enzimini tayan transgenik
hayvanlarn elde edilme almalar (Jost ve ark., 1999). Bu konuyla ilgili
transgenik almalarn baka bir hedefi ise domuzlarn st verimini ve buna
parelel olarak bir ylda yaama g olan yavru saysn artrma almalardr.
Emzirme donemini ksaltmak iin domuzlarda sk seleksiyon yaplm bu
nedenle laktasyon sresi ksalmtr. Bu durum doan yarularn byme
performansn emzirme dneminden kesim aamasna kadar geriletmitir
 255

(Wheeler, 2003). Stte laktoalbumin miktar ile st sentezi arasnda pozitif

korelasyon vardr. Laktoalbumin mikarnn artmas st sentezinin artmas
anlamna geliyor. Bu nedenle srdaki laktoalbumini ifreleyen gen domuza
transfer edildi (Noble ve ark., 2002). Bu yndeki almalar domuz endstrisine
milyon dolarlar kazandracaktr.
Stn bileimini taransgenik yolla deitirme almalar sadece st
bileenleri zerine younlamamtr. Gnmzde hemogenize edilmi inek ve
kei stleri insan salna daha faydaldr. nsan stnde bununan laktoferin
multi fonksiyonel ektiye sahip bir globuler proteindir. nsan laktoferinin
antimikrobial, antifungan, antiviral etkisinin var olduu ve baklk sistemini
glendirdii gsterilmitir (Soukka ve ark., 1992; Hasegawa ve ark., 1994:
Nibbering ve ark., 2001). Laktoferin ayn zamanda emzirilen ocuklarn
barsaklarndaki mikrofloraya (ntestinal mikroflora) zerine olumlu etki
yapmaktadr. Anyn zamanda laktoferinin in vitro ortamda intestinal hcrelerin
bymesini artrd rapor edilmitir (Nuijen ve ark., 1997).
nsan stnde bulunan laktoferinin nek ve kei stlerinde transgenik
yolla bulunmasn salamak insan salna kukusuz olumlu katk salar. Bu
amala yaplan transgenik almalar neticesi 4 tane stnde insan laktoferini
bulunan transgenik inek elde edilmitir. Bu hayvanlarn stnde tespit edilen
laktoferin oran sie 2mg/Lt. dir. Bu insan stnden beslenmesi mmkn
olmayanan cocuklar hatta tm insanlarn sal iin mit verici bir admdr.
Buna parelel bir alma tavanda yapld. Sperm hcresi vektr olarak
kullanld ve tavana insan laktferinini kodlayan gen transfer edildi. Bu
transferden sonra meydana gelen hayvanlarn %81i tarnsfer edilen geni st
bezlerinde tayordu (Li ve ark., 2006). Bu hayvanlarn stnde tespit edilen
laktoferin mikrar ise 10320 g/mLdi. Fakat bu hayvanlarn stndeki
laktoferin miktar laktasyon sresince azald 3. haftadan sonra sttte hi
laktoferin kalmad.
Hastalklara kar direnci artrma tarm alannda uygulanmakta olan
transgenik almalarn hedefidir. Mastitis mikroplarn neden olduu meme bezi
inflemasyonudur. Bu mikroplar:
Staphylococcus aureus
Streptococus uberis
Streptococus dysgalactiae
Streptococus galactiae
Escherichia coli dir.
Bunlardan Staphylococcus aureus klinik vakalara en fazla sebep olandr. nk
bu mikrobun birok antibiyotige kar direnci vardr. Bu nedenle kontrol
olduka zordur (Kerr ve Wellnitz, 2003). Bu yzden mastitis st edstrisi iin
en kt hastalklardan biridir. Bu hastln Amerika Bilei Devletlerinde bir
ylda sebep olduu parasal kayp yaklak 1.7 milyar dolardr (Kerr ve Wellnitz,
2003). Staphylococcus simulans doal olarak lizostafin salglar. Lizostafin
potansiyel bir peptoglikan hidrolazdr, dier Staphylococculara ve
 256

Staphylococcus aureusa kar bakterisidal etkiye sahiptir. Lizostafinin

Staphylococcus aureusa kar koruma etkinlii lizostafni tansgenik olarak
meme bezinde sentezleyebilen transgenik farede test edildi (Kerr ve ark., 2001).
Sonra ayn aratrma grubu stnde lizostafn bulunan transgenik inek elde etti.
Elde edilen inein stundaki lizostafin miktar 14 mg/mL di. (Wall ve ark., 2005).
Bu bilim adanlar ayn zamanda Staphylococcus aureusu 3 tane transgenik
inein ve 10 tane transgenik olmayan inin meme bezine enjekte ettiler.
Transgenik hayvanlar masttise yakalanmad fakat transgenik olmayanlarn hepsi
mastitis hastalna yakaland.
Deli dana hastal (Bovine Spongiform Encephalopathi, BSE) kuzey
yarm kredeki lkeleri korkutan bir hastalktr. Bu hastalk britanyada milyar
dolarlk kayba neden olmutur. Hastaln ana sebebi Prion Protein-c (PrP-c)
dir. Bu protein kk glikoprotein yapsndadr. Nrolojik hastala yakalanan
hayvanlarn enein; yapa dken hayvanlarn (Scrapie), deli dana hastalna
yakalanan hayvanlarn beyinlerinde, azaymr hastalna (Creutzfeldt-Jacob
disease, CJD) ve Parkinson hastalna (Gerstmann-Straussler syndrome, GSS)
yakalanan insanlarn beyinlerinde bu protein fazla miktarda bulunur. PrP-c
proteinini kodlayan gen hayvann hem hasta hem salkl hcrelerinde bulunan
DNA zerindedir. Hastalk olumaya balarken PrP-cnin konformasyonunda
deime olur. Bu deime sonucucu 102. kodondaki Prolin deiir yerine Losin
gelir. Bu deime 20. kromozom zerinde olur Bu da proteinde konformasyonel
deiime sebep olur. Bylece PrP-c proteini baka bir izoformu olan PrP-scye
dnr. Proteinin PrP-sc dmesi baklk sistemini uyarmaz. Bu
hastalklara yakalanan breylerin beyinleri deterjanla ekstraksiyona tabi tutulup
elektron mikroskobuyla incelenirse PrP-cs polimerlerinden olunan fibriller
grlebilir. Hayvansal rnlerin hayvan yemlerine katlarak salkl hayvanlara
yedirilmesi deli dana hastalna yol aabilir (Weissman ve ark., 2002). 1990lar
da PrP-c genin knock-out edildii transgenik fare elde edildi (Bueler ve ark.,
1992). Elde edilen fare normal geliim sergiledi ve deli dana hastalna kar
dayankl olduu belirtildi. Hatta bu hayvana PrP-sc proteini enjekte edilmesine
ramen gine de deli dana hastalna dayanklyd (Bueler ve ark., 1993). Daha
sonra prion genini tamayan transgenik srn ve koyunun elde edilmesi
gelecekte deli dana hastalna yakalanmayan hayvanlarn elde edilme midini
uyandrd (Denning ve ark., 2001: Kuroiwa ve ark., 2004).
Dnyada nemli dier bir hastalk ise Bruselladr. Hastaln amili
brusella baktesidir. Zoonos bir hastalktr. Bu hastala dayankl NRAMP1
genini tayan srlar belirlenmitir. Srdaki bu gen fare makrofajlarna
tarnsfer edilerek farenin brusella hastalna kar korunmas test edilmitir
(Barthel ve ark., 2001). Genin farye transferi hastala kar dire kazandrma
konusuna mit vermektedir.
Et verimini ve karkas kaltesini artrmak; iftlik hayvanlaryla alakal
transgenik almalarn nemli hedeflerinden biridir. Bu konuya yardmc
olacak almalardan biri yaban faresinden byme hormonunu reten
 257

transgenik almadr. Elde edilen transgenik farede byme ve vicut arl

nemli seviyede artt (Palmiter ve ark., 1982). Fakat byme hormonunu
kodlayan geni trasgenik olarak vicudunda bulunduran domuz; farede olduu gibi
byme ve gelime performans sergilemedi. Bunun yannda bir takm olumsuz
yan atkiler (Gastrik lser, eklem arlar, kalp bymesi, deride inflamasyon,
bbrek rahatsizl) gzlendi (Pursel ve ark., 1989). Belcka mavisi ve talyan
srlar zerinde yaplan almalar gsterdi ki miyostatin geninde (Byme ve
Gelime Faktr-8, GDF-8) meydana gelen mutasyon ifte kaslla sebep
olur (Grobet ve ark., 1997; McPherron ve Lee, 1997). Miyostain memelilerde
iskelet kas miktarnn azalmasn dzenleyen bir faktrdr. Miyostatin
yetersizlii kas miktarn ar derecede artrr. Miyostatin geni knock-out
edilmi farede kas geliimi diramatik bir ekilde artt. Tansgenik fadeki kas
miktarndaki art doal ferelerin 2-3 katyd. Bu durum kas miktar ar fazla
olan srlarn elde edilmesine k tutmaktadr. Genelde miyostatin geni
omurgallarda bulunur. Bu gen omurgallar zerinde yaplan trasngenik
almalara azip gelmektedir.
Transgenik almalarn baka nemli bir hedefi ise reme etkinliinin
transgenik yntemle artrlmasdr. Baz koyun rklar multiovulasyon yaparlar.
Bunun sebebi folkler byme gelimede rol alan genlerde meydana gelen
mutasyonlardr. Bu genler GDF-9, BMP-15 ve ALK6/BMPR1B genleridir
(Souza ve ark., 2001; Juengel ve ark., 2002; Hanrahan ve ark., 2004). Sadece X
kromozomu tayan spermlerin retilmesinde grev alan genlerin belirlenmesi
ve sadece X kromozomu tayan spermleri reten transgenik boalarn elde
edilmesi, yksek kalitede yapa reten koyunlarn elde edilmesi, Salyalarndan
fitaz enzimi tayan domuzlarn elde edilmesi tarsngenik almalarn hedefidir.

34.5. Organlar insanlar iin kullanlabilen tansgenik hayvanlarn elde

edilmesi
Bu gn yaklak 250 000 kii organ transferi sayesinde yaamlarn devam
ettirmektedirler. Kalp nakli, karacier nakli ve bbrek nakli yaplan insanlar
ortalama 10-15 yl yaamlardr (Kues ve Niemann, 2004). Dnyada hibir
zaman organ ba ihtiyac karlayacak dzeyde olmad. Ekim 2003 sonuna
kadar, Trkiyede yaklak 4800 bbrek, 320 karacier, 75 kalp, 1 pankreas, 6000
kornea ve 600 kadar da kemik ilii nakli yaplmtr. Dier lkelerle mukayese
edildiinde Trkiyede organ nakli az yaplm. Bunun nedeni halkmzn organ
ban fazla benimsememesidir. Trkiyede binlerce hasta insan organ
beklemektedir. Sadece 18000 kii bbrek bekliyor. Transfer edilecek yeterli
sayda organ bulunamamas nedeniyle alternatif kaynaklara ynelme olmutur.
1963 ylnda empazeden alnan bbrek insana transfer edilmitir. Son
zamanlarda domuz organlarnn insanlara transferinin uygun olaca gr
hakim almaya balad. Bunun sepepleri:
1. Domuz organlar bykluk, anatomik ve fizyolojik olarak insan
organlarna benzer
 258

2. Domuz abuk byr ve abuk oalr

3. Hijyenik standartlarn salanmasnn maliyeti domuzda dktr
4. Bu hayvanlarda yerlemi transgenik metotlarla transfer edilecek organlar
immnolojik probleme sebep olmaz. Transfer edilen bireyin dokusu
tarafndan kabul edilir.

Deiik hayvanlar arasndaki organ transferinde en nemli immnolojik

problemler:
Akut Reddetme Tepkisidir (ART). Bu olay transpalanttan sonra
dakikalar ierisinde olur.
Akut Vaskular Reddetme (AVR tekisi, trasnplanttan sonra gnler
ieriside olur
Hcresel Potensiyel Kronik Reddetme (HPKR) tekisi,
trasnplanttan sonra haftalar ierisinde olur (Auchincloss ve Sachs,
1998).
mmnolojik tepkinin stesinden gelmek iin birok yeni transgenik
uygulamalar geltirildi. mmunolojik tepki bilindii gibi bir antijen ve antikor
reaksiyonudur. Bu antibodi antijen reaksiyonu bahsedilen ART ve AVRnin
balamasna neden olur. Bilim adanlar transgenik metotlar kullarak bu
immnolojik problemi zmeye almaktadrlar. Domuzlardan alnan
organlarn transferinde meydana gelen antikor antijen reaksiyonunu engellemek
iin insan proteinini sentezleyerek organ transferinde probleme sebep olan hcre
yzey glkoproteinlerinin rnein hCD59 (Fodor ve ark., 1994), hCD46
(Diamond ve ark., 2001), ve hDAF (Zaidi ve ark., 1998) etkilerini bertaraf eden
transgenik domuzlar elde edilmitir. Bir deneyde trasngenik domuzdan alnan
kalp pirimata nakledildi pirimat 23 gn yaad (Diamond ve ark., 2001). Akut
Reddetme Tepkisini (ART) yok etmek amacyla yaplan baka bir mit veren
alma; domuz organlarnn yzeyindeki antijenik yapy (ernein 1,3--gal-
antijenlerini) knockout teknii ile yok etmektir. nsanda 1,3--gal-antijeni
yoktur. Domuz organlarnn yzeyinde bulunan 1,3--gal-antijenleri 1,3--
galaktoziltransferaz enziminin aktif hale gemesi sonucu sentezlenirler.
Homolog rekombinasyonla domuz kjromozomu zrindeki 1,3--
galaktoziltransferaz geninin iki alleli de knocout edildildii domuzun
organlarnn transfer edildii bildirilmitir (Phelps ve ark., 2003). Yaban
farelerinde Parkinson hastalnn semptomlarn azaltmak iin sr sinir sistemi
hcrelerinin tanasferi bu hayvanlarda baarya uygulanmtr (Zawada ve ark.,
1998).Ayrca transgenik domuz nronlarnn yaban faresinin rmiriliindeki
lezyonlarda akzonal yenilenmeyi artrd rapor edilmitir (Imaizumi ve ark.,
2000).
Organ transferinde dikkat edilmesi gerken bir konuda zoonoz hastalklarn
organlarla birlikte transfer edilebilme ihtimalidir. 1997 ylnda yaplan bir in
 259

vitro test sonucuna gre dumuz endojen retrovirsnn insan hcrelerini

infekte edebilecei ileri srld (Patience veark., 1997). Fakat davam eden
almalar domuz organlarnn transfer edildii insanlarda 12 yl boyunce
yaplan testler neticesi domuz retrovirsne rastlanmad (Patience ve ark., 1998;
Paradis ve ark., 1999). Son zamanlarda kk hcre almalarnda salanan
gelimeler ve in viro kuullarda kk hcreleri yardmyla insan dokusu ve organ
retmeye ynelik aratrmalar domuzlardan insanlara organ tarsferini
salamaya ynelik almalara duyulan ikginin azalmasna neden olmutur.
nk bu yeni tekniin gelecekte daha etkili olaca dnlmektedir.

34.6. nsan hastalklaryla trasngenik yntemle mucadele

nsan bedeninin oluumunu ve yaamn detremine eden yaklak 20 000-
25 000 gen vardr (nsan Genom Sekans, 2004). imdiye kadar mendel katm
kuralna gre karekterize edilmi binlerce insan hastal var. Bu hastalklarn
ou genetik mutasyonlar sonucu oluur. Bu durum fareler zerinde yaplan gen
tespiti ve knockout almalaryla spatlanmtr. Fareler genetik almalar iin
iyi bir modeldir. Bu hayvanlar birok insan hastalnn hatta kanserin bile
sebeplerini ve smptomlarn almak iin kullanlyorlar (Marx, 2003). Bilindii
gibi farenin anatomisi, fizyolojisi ve mr insannkinden nemli derecede
farkldr. Bu nedenle fareler zerinde insanlarla ilgili genetik allmalar iin
kstlamalar var. Bu kstlamalar amak iin, zellikle veri toplamann uzun
srmesi gerektii durumlarda, fare yerine domuzu, sr, koyunu tercih etmek
daha uygun olacaktr. nsanda ok nadir grlen retinitis pigmentoza senromunu
almak iin transgenik dumuzlarn model alnmas bu hastaln tedavisine
avantaj salamtr. Bu transgenik domuzlarda mutasyona uratlm rhodopsin
geni vardr. Bu gen gece krlgne neden olur. nsandaki gece krlgne ok
benzerlik gsterir (Petters ve ark., 1997). Turner sendromu bulunan kiilerde
byme harmonunu salglamay salayan hormonun (GHRH) salglanmas
dengesizdir. Trasngenik domuzlar kullanlarak turner sendromu, bbrek
yetmezligi ve gastro intestinal kanal inflamasyon (Krons veya Crohn-
Lesniowski hastal) hastal alld (Draghia-Akli ve ark., 1999). Ayrca
azaymr ve parkinson hastlna sebep olan piyro proteinleri kodayan genlerin
farelerde ve srlarda tespit edilip knockout edilmesi benzer hastalklarn
tedavisine ve kar drencin salanmasna yardmc olunmas iin bu hayvanlar
uygun modeldirler (Bueler ve ark., 1992; 1993; Kuroiwa ve ark., 2004).
Transgenik hayvanlar kullanarak dier bir alma konusu yalanmann
geciktirilmesidir. Telomerler kromozomlarn sonlarnda bulunan, ard arda
tekrarlanm baz dizileridir. Hibir proteini kodlamazlar fakat DNAy zarar
gremeden paralanmadan ksacas apoptozisten korurlar. Bu nedenle
telomerlerin yalanmayla ilgileri olabilecegi dnld. Mitoz blnme
srasnda DNA kendini eler. Her mitoz blnmeden sonra telomerlerin boyu
ksalr. Bu ksalmaya parelel olarak da hcrelerin kendini yenileme potansiyeli
de yava yava kaybolur. Bu telomerlerin boylarnn ksalmas geiktirilirse
 260

insann yaam sresi uzayabilecektir (Djojosubroto ve ark., 2003). nsan

telomeraz revers transkriptaz (hTERT); telomerlerin boylarnn ksalnasn
engelleme ve hcrelerin blnme yetenegini korumasna yardmc olmaktadr.
Adeno virsler vektr olarak kullanlp hTERT geni tromboz problemi olan
yal tavana tedavi amacyla transfer edildi (Magford ve ark., 2006). Bu transfer
sonucu taanda olumsuz bir immunorespons grlmedi. Bu da gen terapisinin bu
konuda uygulanabilirliini gsteriyor.
Birok kanser hcrelerindeki telomerlerin yapsnda ve uzunluunda
deimeler gzlendi. Bu deimeler bir takm kanserlerin gelimesinin temel
sebepi olabilir (Rudolph ve ark., 2001; Cawthon ve ark.,. 2003). Telomeraz
revers transkriptaz (TERT) enzimi ifade dildii gibi tlomerlerin oluumundan ve
yenilenmelerinden sorumludur. Bu enzim doumdan sonra birok somatik
hcrede mevcuttur (Djojosubroto ve ark., 2003). Nkler transfer sonucu elde
edilen Dolly de erken yalanma problemi gzlendi. Bu erken yalanmann
sebebi telomer ksalmasna baland. Bir hipteze gre dolinin kopyaland
hayvann telomer uzunluu kaltmla dolye geti. Bylece Dollynin gerek ya
doduu anda donor hayvann yayd (Shiels et al,1999). Fakat bu hiptez sr
ve fareler zerinde yaplan almalar sonuunda dorulanmad. nk yaplan
almalar transfer edilen nkleusdaki telomerlerin kendilerini yeinilediklerini,
klonlanm hayvanlarla normal hayvanlar arasnda ya farknn olmadn
gsterdi (Lanza ve ark., 2000; Wakayama ve ark., 2000). Son almalar
klonlama ile elde edilen hayvann telomerlerinin yeniden oluan nkleer
programlanma neticesi yeniden aktif hale geldiini ve ksalan boylarnn tekrar
eski hallerine dndn gstermitir (Betts ve ark., 2001). Bu sonu sr ve
farelerden elde edilen sonularn nedeni olabilir. Tlomerlerlerde meydana gelen
mutasyonlar inceleyen yeni almalar sphesiz kanser ve yalanma
konusundaki bilgi brirkimini artracaktr.
Son zamanlarda dokularda primer damar oluumunu salayan Vaskular ve
Endotelial Byme faktr (VEGF) terapik angiyogenezi artrma iin ok fazla
kullanld. Bu konudaki bir almada ah damarnda VEGF sitokinini
tanasgenik olarak tayan tavan elde edildi (Suda ve ark., 2005). Bu alma
tavann damar endotelyumunda rekombinat olarak VEGF stokininin bulunmas
damar duvarnda speroksit anyonun sentezini artrdn nermitir. Speroksit
anyon VEGFnun damar oluturma etkisini gstermesini salar. Bu bulu kalp
ve damar hastalklarnn tedavisi iin nemlidir.
 261

KAYNAKLAR
Auchincloss H, Jr., Sachs DH, 1998. Xenogeneic transplantation. Annu Rev Immunol 16: 433470.

Barthel R, Feng J, Piedrahita JA, McMurray DN, Templeton JW, Adams LG, 2001. Stable transfection of the
bovine NRAMP1 gene into murine RAW264.7 cells: effect on Brucella abortus survival. Infect Immun 69:
31103119.

Betts D, Bordignon V, Hill J, Winger Q, Westhusin M, Smith L, King W, 2001. Reprogramming of telomerase
activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle. Proc Natl Acad Sci USA 98: 10771082.

Bleck GT, White BR, Miller DJ, Wheeler MB, 1998. Production of bovine alpha-lactalbumin in the milk of
transgenic pigs. J Anim Sci 76: 30723078.

Brackett BG, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H, 1971. Uptake of heterologous genome by mammalian
spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc Natl Acad Sci USA 68: 353357.

Brophy B, Smolenski G, Wheeler T, Wells D, LHuillier P, Laible G, 2003. Cloned transgenic cattle produce milk
with higher levels of beta-casein and kappa-casein. Nat Biotechnol 21: 157162.

Bueler H, Aguzzi A, Sailer A, Greiner RA, Autenried P, Aguet M, Weissmann C, 1993. Mice devoid of PrP are
resistant to scrapie. Cell 73: 13391347. Bueler H, Fischer M, Lang Y, Bluethmann H, Lipp HP,

DeArmond SJ, et al. 1992. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP
protein. Nature 356: 577582.

Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I, 1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell
line. Nature 380: 6466.

Capecchi MR, 1989. Altering the genome by homologous recombination. Science 244: 12881292.

Caplen NJ, Kinrade E, Sorgi F, Gao X, Gruenert D, Geddes D, et al. 1995. In vitro liposome-mediated DNA
transfection of epithelial cell lines using the cationic liposome DC-Chol/DOPE. Gene Ther 2: 603613.

Cawthon RM, Smith KR, OBrien E, Sivatchenko A, Kerber RA, 2003. Association between telomere length in
blood and mortality in people aged 60 years or older. Lancet 361: 393395.

Celebi C, Guillaudeux T, Auvray P, Vallet- Erdtmann V, Jegou B, 2003. The Making of Transgenic
Spermatozoa. Biol Reprod 68: 14771483.

Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, et al. 1998. Cloned transgenic calves
produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 12561258.

Chan AW, Homan EJ, Ballou LU, Burns JC, Bremel RD, 1998. Transgenic cattle produced by reverse
transcribed gene transfer in oocytes. Proc Natl Acad Sci USA 95: 1402814033.

Chen CA, Okayama H, 1988. Calcium phosphate mediated gene transfer: a highly efficient transfection system
for stably transforming cells with plasmid DNA. Biotechniques 6: 632638.

Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, et al. 1998. Cloned transgenic calves produced
from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 12561258.

Clark AJ, Bissinger P, Bullock DW, Damak S, Wallace R, Whitelaw CB, Yull F, 1994. Chromosomal position
effects and the modulation of transgene expression. Reprod Fertil Dev 6: 589598.

Clark J, Whitelaw B, 2003. A future for transgenic livestock. Nat Rev Genet 4: 825833.

Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB, 1973. Construction of biologically functional bacterial
plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 70: 32403244.
Denman J, Hayes M, ODay C, Edmunds T, Bartlett C, Hirani S, et al. 1991. Transgenic expression of
 262

a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: purification and characterization ofthe
recombinant enzyme. Biotechnology (NY) 9: 839843.

Denning C, Burl S, Ainslie A, Bracken J, Dinnyes A, Fletcher J, et al. 2001. Deletion of the alpha (1, 3)
galactosyl transferase (GGTA1) gene and the prion protein (PrP) gene in sheep. Nat Biotechnol 19: 559562.

Detwiler LA, Rubenstein R, 2000. Bovine spongiform encephalopathy: an overview. Asaio J 46: S7379.

Diamond LE, Quinn CM, Martin MJ, Lawson J, Platt JL, Logan JS, 2001. A human CD46 transgenic pig model
system for the study of discordant xenotransplantation. Transplantation 71: 132142.

Djojosubroto MW, Choi YS, Lee HW, Rudolph KL, 2003. Telomeres and telomerase in aging, regeneration and
cancer. Mol Cells 15: 164175.

Draghia-Akli R, Fiorotto ML, Hill LA, Malone PB, Deaver DR, Schwartz RJ, 1999. Myogenic expression of an
injectable protease-resistant growth hormone releasing hormone augments long-term growth in pigs. Nat
Biotechnol 17: 11791183.

Dyck MK, Lacroix D, Pothier F, Sirard MA, 2003. Making recombinant proteins in animals different systems,
different applications. Trends Biotechnol 21: 394399.

EbertKM,Selgrath JP, DiTullio P,DenmanJ, Smith TE, Memon MA, et al. 1991. Transgenic production of a
variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and
analysisofexpression. Biotechnology(NY)9:835838.

Ebert KM, DiTullio P, Barry CA, Schindler JE, Ayres SL, Smith TE, et al. 1994. Induction of human tissue
plasminogen activator in the mammary gland of transgenic goats. Biotechnology (NY) 12: 699702.

Evans MJ, Kaufman MH, 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature
292: 154156.

Fodor WL, Williams BL, Matis LA, Madri JA, Rollins SA, Knight JW, et al. 1994. Expression of a functional
human complement inhibitor in a transgenicpig as a model for the prevention of xenogeneic hyperacute organ
rejection. Proc Natl Acad Sci USA 91: 1115311157.

Gibbons J, Arat S, Rzucidlo J, Miyoshi K, Waltenburg R, Respess D, et al. 2002. Enhanced survivability of
cloned calves derived from roscovitine treated adult somatic cells. Biol Reprod 66: 895900.

Golovan SP, Meidinger RG, Ajakaiye A, Cottrill M, Wiederkehr MZ, Barney DJ, et al. 2001. Pigs expressing
salivary phytase produce low-phosphorus manure. Nat Biotechnol 19: 741745.

Gordon JW, Ruddle FH, 1981. Integration and stable germ line transmission of genes injected into Mouse
pronuclei. Science 214: 12441246.

Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, Pirottin D, Brouwers B, Riquet J, et al. 1997. A deletion in the bovine
myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet 17: 7174.

Hammer RE, Pursel VG, Rexroad CE, Jr., Wall RJ, Bolt DJ, Ebert KM, et al. 1985. Production of transgenic
rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 315: 680683.

Hanrahan JP, Gregan SM, Mulsant P, Mullen M, Davis GH, Powell R, Galloway SM, 2004. Mutations in the
genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate
andsterility in Cambridge and Belclare sheeo (Ovis aries). Biol Reprod 70:900909.

Hasegawa K, Motsuchi W, Tanaka S, Dosako S, 1994. Inhibition with lactoferrin of in nitro infection withhuman
herpes virus. Jpn J Med Sci Biol 47: 7385.,

Honaramooz A, Behboodi E, Blash S, Megee SO, Dobrinski I, 2003. Germ cell transplantation in goats. Mol
Reprod Dev 64: 422428.
 263

Honaramooz A, Megee SO, Dobrinski I, 2002. Germ cell transplantation in pigs. Biol Reprod 66: 2128.

Human Genome Sequencing C, 2004. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431:
931945.

Iguma LT, Lisauskas SF, Melo EO, Franco MM, Pivato I, Vianna GR, et al. 2005. Development of bovine
embryos reconstructed by nuclear transfer of transfected and non-transfected adult fibroblast cells. Genet Mol
Res 4: 5566.

Imaizumi T, Lankford KL, Burton WV, Fodor WL, Kocsis JD, 2000. Xenotransplantation of transgenic pig
olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration in rat spinal cord. Nat Biotechnol 18: 949953.

Jackson DA, Symons RH, Berg P, 1972. Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of
Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of
Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 69: 29042909.

Jaenisch R, Fan H, Croker B, 1975. Infection of preimplantation mouse embryos and of newborn mice with
leukemia virus: tissue distribution of viral DNAandRNAand leukemogenesis in the adult animal. Proc Natl Acad
Sci USA 72: 40084012.

Jost B, Vilotte JL, Duluc I, Rodeau JL, Freund JN, 1999. Production of low-lactose milk by ectopic expression
of intestinal lactase in the mouse mammary gland. Nat Biotechnol 17: 160164.

Juengel JL, Hudson NL, Heath DA, Smith P, Reader KL, Lawrence SB, et al. 2002. Growth differentiation
factor 9 and bone morphogenetic protein 15 are essential for ovarian follicular development in sheep. Biol
Reprod 67: 17771789.
58 E.O. Melo et al. Kang Y, Jimenez-Flores R, Richardson T, 1986. Casein genes and genetic engineering of the
caseins. Basic Life Sci 37: 95111.

Karatzas CN, 2003. Designer milk from transgenic clones. Nat Biotechnol 21: 138139.

Karatzas CN, Turner JD, 1997. Toward altering milk composition by genetic manipulation: current status and
challenges. J Dairy Sci 80: 22252232.

Kasinathan P, Knott JG, Moreira PN, Burnside AS, Jerry DJ, Robl JM, 2001a. Effect of fibroblast donor cell age
and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro. Biol Reprod 64: 14871493.

Kasinathan P, Knott JG, Wang Z, Jerry DJ, Robl JM, 2001b. Production of calves from G1 fibroblasts. Nat
Biotechnol 19: 11761178.

Keefer CL, 2004. Production of bioproducts through the use of transgenic animal models. Anim Reprod Sci 82
83: 512.

Kerr DE, Plaut K, Branley AJ, Williamson CM, Lax AJ, Moore K, et al. 2001. Lysostaphin expression in
mammary glands confers protection against staphylococcal infection in transgenic mice. Nat Biotechnol 19: 66
70.

Kerr DE, Wellnitz O, 2003. Mammary expression of new genes to combat mastitis. J Anim Sci 81: 3847.

Kovesdi I, Brough DE, Bruder JT, Wickham TJ, 1997. Adenoviral vectors for gene transfer. Curr Opin
Biotechnol 8: 583589.

Krimpenfort P, Rademakers A, Eyestone W, van der Schans A, van den Broek S, Kooiman P, et al. 1991.
Generation of transgenic dairy cattle using in vitro embryo production. Biotechnology (NY) 9: 844847.

Kues WA, Niemann H, 2004. The contribution of farm animals to human health. Trends Biotechnol 22: 286294.

Kuroiwa Y, Kasinathan P, Choi YJ, Naeem R, Tomizuka K, Sullivan EJ, et al. 2002. Cloned transchromosomic
calves producing human immunoglobulin. Nat Biotechnol 20: 889894.
 264

Kuroiwa Y, Kasinathan P, Matsushita H, Sathiyaselan J, Sullivan EJ, Kakitani M, et al. 2004. Sequential
targeting of the genes encoding immunoglobulin-mu and prion protein in cattle. Nat Genet 36: 775780.

Lanza RP, Cibelli JB, Blackwell C, Cristofalo VJ, Francis MK, Baerlocher GM, et al. 2000. Extension of cell
life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science 288: 665669.

Lazaris A, Arcidiacono S, Huang Y, Zhou JF, Duguay F, Chretien N, et al. 2002. Spider silk fibers spun from
soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science 295: 472476.

Li L, Shen W, Min L, Dong H, Sun Y, Pan Q, 2006. Human lactoferrin transgenic rabbits produced efficiently
using dimethylsulfoxide-sperm-mediated gene transfer. Reprod Fertil Dev 18: 689695.

Lipinski D, Jura J, Kalak R, Plawski A, Kala M, Szalata M, et al. 2003. Transgenic rabbit producing human
growth hormone in milk. J Appl Genet 44: 165174.

Maione B, Lavitrano M, Spadafora C, Kiessling AA, 1998. Sperm-mediated gene transfer in mice. Mol Reprod
Dev 50: 406409.

Martin GR, 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium condiyioned
by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 76347638.

Marx J, 2003. Medicine. Building better mouse models for studying cancer. Science 299: 19721975.

Massoud M, Attal J, Thepot D, Pointu H, Stinnakre MG, Theron MC, et al. 1996. The deleterious effects of
human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits. Reprod
Nutr Dev 36: 555563.

McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KH, Colman A, Schnieke AE, Kind AJ, 2000. Production of gene-targeted
sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature 405: 10661069.

McKee C, Gibson A, Dalrymple M, Emslie L, Garner I, Cottingham I, 1998. Production of biologically active
salmon calcitonin in the milk of transgenic rabbits. Nat Biotechnol 16: 647651.

McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ, 1997. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta
superfamily member. Nature 387: 8390.

McPherron AC, Lee SJ, 1997. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad
Sci USA 94: 1245712461.

Melo EO, Sousa RV, Iguma LT, Franco MM, Rech EL, Rumpf R, 2005. Isolation of transfected fibroblast clones
for use in nuclear transfer and transgene detection in cattle embryos.n Genet Mol Res 4: 812821.

Michalak E, Lipinski D, Slomski R, 2006. Loop formation by the transgene WAP: 6 HishGH in transgenic
rabbit fibroblast, revealed by fluorescence in situ hybridization to nuclear halos. J Appl Genet 47: 247249.

Miller HI, 2002. As biotech turns 20. Nat Rev Drug Discov 1: 10071008.

Mogford JE, Liu WR, Reid R, Chiu CP, Said H, Chen SJ, et al. 2006. Adenoviral human telomerase reverse
transcriptase dramatically improves ischemic wound healing without detrimental immune response in an aged
rabbit model. Hum Gene Ther 17: 651660.

Muller M, Brenig B, Winnacker EL, Brem G, 1992. Transgenic pigs carrying cDNA copies encoding the murine
Mx1 protein which confers resistance to influenza virus infection. Gene 121: 263270.

Nagano M, Brinster CJ, Orwig KE, Ryu BY, Avarbock MR, Brinster RL, 2001. Transgenic mice produced by
retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 98: 1309013095.

Nibbering PH, Ravensbergen E, Welling MM, van Berkel LA, van Berkel PH, Pauwels EK, Nuijens JH, 2001.
Human lactoferrin and peptides Animal transgenesis 59 derived from its N terminus are highly effective against
infections with antibiotic-resistant bacteria. Infect Immun 69: 14691476.
 265

Niemann H, Halter R, Carnwath JW, Herrmann D, Lemme E, Paul D, 1999. Expression of human blood clotting
factor VIII in the mammary gland of transgenic sheep. Transgenic Res 8: 237247.

Noble MS, Rodriguez-Zas S, Cook JB, Bleck GT, Hurley WL, Wheeler MB, 2002. Lactational performance of
first-parity transgenic gilts expressing bovine alpha-lactalbumin in their milk. J Anim Sci 80; 10901096.

Nottle MB, Haskard KA, Verma PJ, Du ZT, Grupen CG, McIlfatrick SM, et al. 2001. Effect of DNA
concentration on transgenesis rates in mice and pigs. Transgenic Res 10: 523531.

Nuijens JH, van Berkel PH, Geerts ME, Hartevelt PP, de Boer HA, van Veen HA, Pieper FR, 1997.
Characterization of recombinant human lactoferrin secreted in milk of transgenic mice. J Biol Chem 272:
88028807.

Oliveira RR, Carvalho DM, Lisauskas S, Mello E, Vianna GR, Dode MA, et al. 2005. Effectiveness of
liposomes to transfect livestock fibroblasts. Genet Mol Res 4: 185196.

Paleyanda RK, Velander WH, Lee TK, Scandella DH, Gwazdauskas FC, Knight JW, 1997. Transgenic pigs
produce functional human factor VIII in milk. Nat Biotechnol 15: 971975.

Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG, Birnberg NC, Evans RM, 1982.
Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion
genes. Nature 300: 611615.

Paradis K, Langford G, Long Z, Heneine W, Sandstrom P, Switzer WM, et al. 1999. Search for cross-species
transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue. The XEN 111 Study
Group. Science 285: 12361241.

Patience C, Patton GS, Takeuchi Y, Weiss RA, McClure MO, Rydberg L, Breimer ME, 1998. No evidence of
pig DNA or retroviral infection in patients with short-term extracorporeal connection to pig kidneys. Lancet 352:
699701.

Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA, 1997. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat Med
3: 282286.

Petters RM, Alexander CA, Wells KD, Collins EB, Sommer JR, Blanton MR, et al. 1997. Genetically
engineered large animal model for studying cone photoreceptor survival and degeneration in retinitis
pigmentosa. Nat Biotechnol 15: 965970.

Phelps CJ, Koike C, Vaught TD, Boone J, Wells KD, Chen SH, et al. 2003. Production of alpha 1,3-
galactosyltransferase-deficient pigs. Science 299: 411414.

Polejaeva IA, Campbell KH, 2000. New advances in somatic cell nuclear transfer: application in transgenesis.
Theriogenology 53: 117126.

Powell BC, Walker SK, Bawden CS, Sivaprasad AV, Rogers GE, 1994. Transgenic sheep and wool growth:
possibilities and current status. Reprod Fertil Dev 6: 615623.

Pursel VG, Pinkert CA, Miller KF, Bolt DJ, Campbell RG, Palmiter RD, 1989. Genetic engineering of livestock.
Science 244: 12811288.

Rieth A, Pothier F, Sirard MA, 2000. Electroporation of bovine spermatozoa to carry DNA containing highly
repetitive sequences into oocytes and detection of homologous recombination events. Molecular Reproduction
and Development 57: 338345.

Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M, 1986. Germ-line transmission of genes introduced into cultured
pluripotential cells by retroviral vector. Nature 323: 445448.

Rudolph KL, Millard M, Bosenberg MW, DePinho RA, 2001. Telomere dysfunction and evolution of intestinal
carcinoma in mice and humans. Nat Genet 28: 155159.
 266

Rudolph NS, 1999. Biopharmaceutical production in transgenic livestock. Trends Biotechnol 17: 367374.

Saito S, Sawai K, Ugai H, Moriyasu S, Minamihashi A, Yamamoto Y, et al. 2003. Generation of cloned calves
and transgenic chimeric embryos from bovine embryonic stem-like cells. Biochem Biophys Res Commun 309:
104113.

Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, Wilmut I, et al. 1997. Human factor IX
transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278: 21302133.

Seidel GE, Jr., 1993. Resource requirements for transgenic livestock research. J Anim Sci 71: 2633.

Shiels PG, Kind AJ, Campbell KH, Waddington D, Wilmut I, Colman A, Schnieke AE, 1999. Analysis of
telomere lengths in cloned sheep. Nature 399: 316317.

Shim H, Gutierrez-Adan A, Chen LR, BonDurant RH, Behboodi E, Anderson GB, 1997. Isolation of pluripotent
stem cells from cultured porcine primordial germ cells. Biol Reprod 57: 10891095.

Sikes ML, OMalley BW, Jr., Finegold MJ, Ledley FD, 1994. In vivo gene transfer into rabbit thyroid follicular
cells by direct DNA injection. Hum Gene Ther 5: 837844.

Soukka T, Tenovuo J, Lenander-Lumikari M, 1992. Fungicidal effect of human lactoferrin against Candida
albicans. FEMS Microbiol Lett 69: 223228.

Souza T, MacDougall C, Campbell BK, McNeilly AS, Baird DT, 2001. The (FecB) phenotype is associated
with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B (BMPR1B) gene. J Endocrinol 169: R16.

Stacey A, Schnieke A, Kerr M, Scott A, McKee C, Cottingham I, et al. 1995. Lactation is disrupted by alpha-
lactalbumin deficiency and can be restored by 60 E.O. Melo et al. human alpha-lactalbumin gene replacement in
mice. Proc Natl Acad Sci USA 92: 28352839.

Stinnakre MG, Vilotte JL, Soulier S, Mercier JC, 1994. Creation and phenotypic analysis of alpha- lactalbumin-
deficient mice. Proc Natl Acad USA 91: 65446548.

Suda O, Smith LA, dUscio LV, Peterson TE, Katusic ZS, 2005. In vivo expression of recombinant vascular
endothelial growth factor in rabbit carotid artery increases production of superoxide anion. Arterioscler Thromb
Vasc Biol 25: 506511.

Sullivan EJ, Kasinathan S, Kasinathan P, Robl JM, Collas P, 2004. Cloned calves from chromatin remodeled in
vitro. Biol Reprod 70: 146153.

Thomas KR, Capecchi MR, 1987. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem
cells. Cell 51: 503512.

Van Berkel PH, Welling MM, Geerts M, van Veen HA, Ravensbergen B, Salaheddine M, et al. 2002. Large scale
production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows. Nat Biotechnol 20: 484487.

Van Doorn MB, Burggraaf J, van Dam T, Eerenberg A, Levi M, Hack CE, et al. 2005. A phase I study of
recombinant human C1 inhibitor in asymptomatic patients with hereditary angioedema. J Allergy Clin Immunol
116: 876883.

Velander WH, Johnson JL, Page RL, Russell CG, Subramanian A, Wilkins TD, et al. 1992. High-level
expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein C.
Proc Natl Acad Sci USA 89: 1200312007.

Wakayama T, Shinkai Y, Tamashiro KL, Niida H, Blanchard DC, Blanchard RJ, et al. 2000. Cloning of mice to
six generations. Nature 407: 318319.
Wall RJ, Kerr DE, Bondioli KR, 1997. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J Dairy Sci
80: 22132224.
 267

Wall RJ, Powell AM, Paape MJ, Kerr DE, Bannerman DD, Pursel VG, 2005. Genetically enhanced cows resist
intramammary Staphylococcus aureus infection. Nat Biotechnol 23: 445451.

Waterston RH, Lindblad-Toh K, Birney E, Rogers J, Abril JF, Agarwal P, et al. 2002. Initial sequencing and
comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520562.

Weissmann C, Enari M, Klohn PC, Rossi D, Flechsing E, 2002. Transmission of prions. Proc Natl Acad Sci USA
99: 1637816383.

Wheeler MB, 2003. Production of transgenic livestock: promise fulfilled. J Anim Sci 81: 3237. Willadsen SM,
1986. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320: 6365.

Williams RS, Johnston SA, Riedy M, DeVit MJ, McElligott SG, Sanford JC, 1991. Introduction of foreign genes
into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc Natl Acad Sci USA 88: 27262730.

Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH, 1997. Viable offspring derived from fetal and adult
mammalian cells. Nature 385: 810813.

Wobus AM, Boheler KR, 2005. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy.
Physiol Rev 85: 635678.

Wright G, Carver A, Cottom D, Reeves D, Scot A, Simons P, et al. 1991. High level expression of active human
alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Biotechnology (NY) 9: 830834.

Zaidi A, Schmoeckel M, Bhatti F, Waterworth P, Tolan M, Cozzi E, et al. 1998. Life-supporting pig-to-primate
renal xenotransplantation using genetically modified donors. Transplantation 65: 15841590.

Zawada WM, Cibelli JB, Choi PK, Clarkson ED, Golueke PJ, Witta SE, et al. 1998. Somatic cell cloned
transgenic bovine neurons for transplantation in parkinsonian rats. Nat Med 4: 569574.

Zbikowska HM, Soukhareva N, Behnam R, Chang R, Drews R, Lubon H, et al. 2002a. The use of the
uromodulin promoter to target production of recombinant proteins into urine of transgenic animals. Transgenic
Res 11: 425435.

Zbikowska HM, Soukhareva N, Behnam R, Lubon H, Hammond D, Soukharev S, 2002b. Uromodulin promoter
directs high-level expression of biologically active human alpha1- antitrypsin into Mouse urine. Biochem J 365:
711. Animal transgenesis 61
KAYNAKLAR
Auchincloss H, Jr., Sachs DH, 1998. Xenogeneic transplantation. Annu Rev Immunol 16: 433470.

Barthel R, Feng J, Piedrahita JA, McMurray DN, Templeton JW, Adams LG, 2001. Stable transfection of the
bovine NRAMP1 gene into murine RAW264.7 cells: effect on Brucella abortus survival. Infect Immun 69:
31103119.

Betts D, Bordignon V, Hill J, Winger Q, Westhusin M, Smith L, King W, 2001. Reprogramming of telomerase
activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle. Proc Natl Acad Sci USA 98: 10771082.

Bleck GT, White BR, Miller DJ, Wheeler MB, 1998. Production of bovine alpha-lactalbumin in the milk of
transgenic pigs. J Anim Sci 76: 30723078.

Brackett BG, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H, 1971. Uptake of heterologous genome by mammalian
spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc Natl Acad Sci USA 68: 353357.

Brophy B, Smolenski G, Wheeler T, Wells D, LHuillier P, Laible G, 2003. Cloned transgenic cattle produce milk
with higher levels of beta-casein and kappa-casein. Nat Biotechnol 21: 157162.

Bueler H, Aguzzi A, Sailer A, Greiner RA, Autenried P, Aguet M, Weissmann C, 1993. Mice devoid of PrP are
resistant to scrapie. Cell 73: 13391347. Bueler H, Fischer M, Lang Y, Bluethmann H, Lipp HP,
 268

DeArmond SJ, et al. 1992. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP
protein. Nature 356: 577582.

Campbell KH, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I, 1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell
line. Nature 380: 6466.

Capecchi MR, 1989. Altering the genome by homologous recombination. Science 244: 12881292.

Caplen NJ, Kinrade E, Sorgi F, Gao X, Gruenert D, Geddes D, et al. 1995. In vitro liposome-mediated DNA
transfection of epithelial cell lines using the cationic liposome DC-Chol/DOPE. Gene Ther 2: 603613.

Cawthon RM, Smith KR, OBrien E, Sivatchenko A, Kerber RA, 2003. Association between telomere length in
blood and mortality in people aged 60 years or older. Lancet 361: 393395.

Celebi C, Guillaudeux T, Auvray P, Vallet- Erdtmann V, Jegou B, 2003. The Making of Transgenic
Spermatozoa. Biol Reprod 68: 14771483.

Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, et al. 1998. Cloned transgenic calves
produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 12561258.

Chan AW, Homan EJ, Ballou LU, Burns JC, Bremel RD, 1998. Transgenic cattle produced by reverse
transcribed gene transfer in oocytes. Proc Natl Acad Sci USA 95: 1402814033.

Chen CA, Okayama H, 1988. Calcium phosphate mediated gene transfer: a highly efficient transfection system
for stably transforming cells with plasmid DNA. Biotechniques 6: 632638.

Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, et al. 1998. Cloned transgenic calves produced
from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 12561258.

Clark AJ, Bissinger P, Bullock DW, Damak S, Wallace R, Whitelaw CB, Yull F, 1994. Chromosomal position
effects and the modulation of transgene expression. Reprod Fertil Dev 6: 589598.

Clark J, Whitelaw B, 2003. A future for transgenic livestock. Nat Rev Genet 4: 825833.

Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB, 1973. Construction of biologically functional bacterial
plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 70: 32403244.
Denman J, Hayes M, ODay C, Edmunds T, Bartlett C, Hirani S, et al. 1991. Transgenic expression of
a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: purification and characterization ofthe
recombinant enzyme. Biotechnology (NY) 9: 839843.

Denning C, Burl S, Ainslie A, Bracken J, Dinnyes A, Fletcher J, et al. 2001. Deletion of the alpha (1, 3)
galactosyl transferase (GGTA1) gene and the prion protein (PrP) gene in sheep. Nat Biotechnol 19: 559562.

Detwiler LA, Rubenstein R, 2000. Bovine spongiform encephalopathy: an overview. Asaio J 46: S7379.

Diamond LE, Quinn CM, Martin MJ, Lawson J, Platt JL, Logan JS, 2001. A human CD46 transgenic pig model
system for the study of discordant xenotransplantation. Transplantation 71: 132142.

Djojosubroto MW, Choi YS, Lee HW, Rudolph KL, 2003. Telomeres and telomerase in aging, regeneration and
cancer. Mol Cells 15: 164175.

Draghia-Akli R, Fiorotto ML, Hill LA, Malone PB, Deaver DR, Schwartz RJ, 1999. Myogenic expression of an
injectable protease-resistant growth hormone releasing hormone augments long-term growth in pigs. Nat
Biotechnol 17: 11791183.

Dyck MK, Lacroix D, Pothier F, Sirard MA, 2003. Making recombinant proteins in animals different systems,
different applications. Trends Biotechnol 21: 394399.
 269

EbertKM,Selgrath JP, DiTullio P,DenmanJ, Smith TE, Memon MA, et al. 1991. Transgenic production of a
variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and
analysisofexpression. Biotechnology(NY)9:835838.

Ebert KM, DiTullio P, Barry CA, Schindler JE, Ayres SL, Smith TE, et al. 1994. Induction of human tissue
plasminogen activator in the mammary gland of transgenic goats. Biotechnology (NY) 12: 699702.

Evans MJ, Kaufman MH, 1981. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature
292: 154156.

Fodor WL, Williams BL, Matis LA, Madri JA, Rollins SA, Knight JW, et al. 1994. Expression of a functional
human complement inhibitor in a transgenicpig as a model for the prevention of xenogeneic hyperacute organ
rejection. Proc Natl Acad Sci USA 91: 1115311157.

Gibbons J, Arat S, Rzucidlo J, Miyoshi K, Waltenburg R, Respess D, et al. 2002. Enhanced survivability of
cloned calves derived from roscovitine treated adult somatic cells. Biol Reprod 66: 895900.

Golovan SP, Meidinger RG, Ajakaiye A, Cottrill M, Wiederkehr MZ, Barney DJ, et al. 2001. Pigs expressing
salivary phytase produce low-phosphorus manure. Nat Biotechnol 19: 741745.

Gordon JW, Ruddle FH, 1981. Integration and stable germ line transmission of genes injected into Mouse
pronuclei. Science 214: 12441246.

Grobet L, Martin LJ, Poncelet D, Pirottin D, Brouwers B, Riquet J, et al. 1997. A deletion in the bovine
myostatin gene causes the double-muscled phenotype in cattle. Nat Genet 17: 7174.

Hammer RE, Pursel VG, Rexroad CE, Jr., Wall RJ, Bolt DJ, Ebert KM, et al. 1985. Production of transgenic
rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature 315: 680683.

Hanrahan JP, Gregan SM, Mulsant P, Mullen M, Davis GH, Powell R, Galloway SM, 2004. Mutations in the
genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate
andsterility in Cambridge and Belclare sheeo (Ovis aries). Biol Reprod 70:900909.

Hasegawa K, Motsuchi W, Tanaka S, Dosako S, 1994. Inhibition with lactoferrin of in nitro infection withhuman
herpes virus. Jpn J Med Sci Biol 47: 7385.,

Honaramooz A, Behboodi E, Blash S, Megee SO, Dobrinski I, 2003. Germ cell transplantation in goats. Mol
Reprod Dev 64: 422428.

Honaramooz A, Megee SO, Dobrinski I, 2002. Germ cell transplantation in pigs. Biol Reprod 66: 2128.

Human Genome Sequencing C, 2004. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431:
931945.

Iguma LT, Lisauskas SF, Melo EO, Franco MM, Pivato I, Vianna GR, et al. 2005. Development of bovine
embryos reconstructed by nuclear transfer of transfected and non-transfected adult fibroblast cells. Genet Mol
Res 4: 5566.

Imaizumi T, Lankford KL, Burton WV, Fodor WL, Kocsis JD, 2000. Xenotransplantation of transgenic pig
olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration in rat spinal cord. Nat Biotechnol 18: 949953.

Jackson DA, Symons RH, Berg P, 1972. Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of
Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of
Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 69: 29042909.

Jaenisch R, Fan H, Croker B, 1975. Infection of preimplantation mouse embryos and of newborn mice with
leukemia virus: tissue distribution of viral DNAandRNAand leukemogenesis in the adult animal. Proc Natl Acad
Sci USA 72: 40084012.
 270

Jost B, Vilotte JL, Duluc I, Rodeau JL, Freund JN, 1999. Production of low-lactose milk by ectopic expression
of intestinal lactase in the mouse mammary gland. Nat Biotechnol 17: 160164.

Juengel JL, Hudson NL, Heath DA, Smith P, Reader KL, Lawrence SB, et al. 2002. Growth differentiation
factor 9 and bone morphogenetic protein 15 are essential for ovarian follicular development in sheep. Biol
Reprod 67: 17771789.
58 E.O. Melo et al. Kang Y, Jimenez-Flores R, Richardson T, 1986. Casein genes and genetic engineering of the
caseins. Basic Life Sci 37: 95111.

Karatzas CN, 2003. Designer milk from transgenic clones. Nat Biotechnol 21: 138139.

Karatzas CN, Turner JD, 1997. Toward altering milk composition by genetic manipulation: current status and
challenges. J Dairy Sci 80: 22252232.

Kasinathan P, Knott JG, Moreira PN, Burnside AS, Jerry DJ, Robl JM, 2001a. Effect of fibroblast donor cell age
and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro. Biol Reprod 64: 14871493.

Kasinathan P, Knott JG, Wang Z, Jerry DJ, Robl JM, 2001b. Production of calves from G1 fibroblasts. Nat
Biotechnol 19: 11761178.

Keefer CL, 2004. Production of bioproducts through the use of transgenic animal models. Anim Reprod Sci 82
83: 512.

Kerr DE, Plaut K, Branley AJ, Williamson CM, Lax AJ, Moore K, et al. 2001. Lysostaphin expression in
mammary glands confers protection against staphylococcal infection in transgenic mice. Nat Biotechnol 19: 66
70.

Kerr DE, Wellnitz O, 2003. Mammary expression of new genes to combat mastitis. J Anim Sci 81: 3847.

Kovesdi I, Brough DE, Bruder JT, Wickham TJ, 1997. Adenoviral vectors for gene transfer. Curr Opin
Biotechnol 8: 583589.

Krimpenfort P, Rademakers A, Eyestone W, van der Schans A, van den Broek S, Kooiman P, et al. 1991.
Generation of transgenic dairy cattle using in vitro embryo production. Biotechnology (NY) 9: 844847.

Kues WA, Niemann H, 2004. The contribution of farm animals to human health. Trends Biotechnol 22: 286294.

Kuroiwa Y, Kasinathan P, Choi YJ, Naeem R, Tomizuka K, Sullivan EJ, et al. 2002. Cloned transchromosomic
calves producing human immunoglobulin. Nat Biotechnol 20: 889894.

Kuroiwa Y, Kasinathan P, Matsushita H, Sathiyaselan J, Sullivan EJ, Kakitani M, et al. 2004. Sequential
targeting of the genes encoding immunoglobulin-mu and prion protein in cattle. Nat Genet 36: 775780.

Lanza RP, Cibelli JB, Blackwell C, Cristofalo VJ, Francis MK, Baerlocher GM, et al. 2000. Extension of cell
life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science 288: 665669.

Lazaris A, Arcidiacono S, Huang Y, Zhou JF, Duguay F, Chretien N, et al. 2002. Spider silk fibers spun from
soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science 295: 472476.

Li L, Shen W, Min L, Dong H, Sun Y, Pan Q, 2006. Human lactoferrin transgenic rabbits produced efficiently
using dimethylsulfoxide-sperm-mediated gene transfer. Reprod Fertil Dev 18: 689695.

Lipinski D, Jura J, Kalak R, Plawski A, Kala M, Szalata M, et al. 2003. Transgenic rabbit producing human
growth hormone in milk. J Appl Genet 44: 165174.

Maione B, Lavitrano M, Spadafora C, Kiessling AA, 1998. Sperm-mediated gene transfer in mice. Mol Reprod
Dev 50: 406409.

Martin GR, 1981. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium condiyioned
by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 78: 76347638.
 271

Marx J, 2003. Medicine. Building better mouse models for studying cancer. Science 299: 19721975.

Massoud M, Attal J, Thepot D, Pointu H, Stinnakre MG, Theron MC, et al. 1996. The deleterious effects of
human erythropoietin gene driven by the rabbit whey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits. Reprod
Nutr Dev 36: 555563.

McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KH, Colman A, Schnieke AE, Kind AJ, 2000. Production of gene-targeted
sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature 405: 10661069.

McKee C, Gibson A, Dalrymple M, Emslie L, Garner I, Cottingham I, 1998. Production of biologically active
salmon calcitonin in the milk of transgenic rabbits. Nat Biotechnol 16: 647651.

McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ, 1997. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta
superfamily member. Nature 387: 8390.

McPherron AC, Lee SJ, 1997. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad
Sci USA 94: 1245712461.

Melo EO, Sousa RV, Iguma LT, Franco MM, Rech EL, Rumpf R, 2005. Isolation of transfected fibroblast clones
for use in nuclear transfer and transgene detection in cattle embryos.n Genet Mol Res 4: 812821.

Michalak E, Lipinski D, Slomski R, 2006. Loop formation by the transgene WAP: 6 HishGH in transgenic
rabbit fibroblast, revealed by fluorescence in situ hybridization to nuclear halos. J Appl Genet 47: 247249.

Miller HI, 2002. As biotech turns 20. Nat Rev Drug Discov 1: 10071008.

Mogford JE, Liu WR, Reid R, Chiu CP, Said H, Chen SJ, et al. 2006. Adenoviral human telomerase reverse
transcriptase dramatically improves ischemic wound healing without detrimental immune response in an aged
rabbit model. Hum Gene Ther 17: 651660.

Muller M, Brenig B, Winnacker EL, Brem G, 1992. Transgenic pigs carrying cDNA copies encoding the murine
Mx1 protein which confers resistance to influenza virus infection. Gene 121: 263270.

Nagano M, Brinster CJ, Orwig KE, Ryu BY, Avarbock MR, Brinster RL, 2001. Transgenic mice produced by
retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 98: 1309013095.

Nibbering PH, Ravensbergen E, Welling MM, van Berkel LA, van Berkel PH, Pauwels EK, Nuijens JH, 2001.
Human lactoferrin and peptides Animal transgenesis 59 derived from its N terminus are highly effective against
infections with antibiotic-resistant bacteria. Infect Immun 69: 14691476.

Niemann H, Halter R, Carnwath JW, Herrmann D, Lemme E, Paul D, 1999. Expression of human blood clotting
factor VIII in the mammary gland of transgenic sheep. Transgenic Res 8: 237247.

Noble MS, Rodriguez-Zas S, Cook JB, Bleck GT, Hurley WL, Wheeler MB, 2002. Lactational performance of
first-parity transgenic gilts expressing bovine alpha-lactalbumin in their milk. J Anim Sci 80; 10901096.

Nottle MB, Haskard KA, Verma PJ, Du ZT, Grupen CG, McIlfatrick SM, et al. 2001. Effect of DNA
concentration on transgenesis rates in mice and pigs. Transgenic Res 10: 523531.

Nuijens JH, van Berkel PH, Geerts ME, Hartevelt PP, de Boer HA, van Veen HA, Pieper FR, 1997.
Characterization of recombinant human lactoferrin secreted in milk of transgenic mice. J Biol Chem 272:
88028807.

Oliveira RR, Carvalho DM, Lisauskas S, Mello E, Vianna GR, Dode MA, et al. 2005. Effectiveness of
liposomes to transfect livestock fibroblasts. Genet Mol Res 4: 185196.

Paleyanda RK, Velander WH, Lee TK, Scandella DH, Gwazdauskas FC, Knight JW, 1997. Transgenic pigs
produce functional human factor VIII in milk. Nat Biotechnol 15: 971975.
 272

Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, Trumbauer ME, Rosenfeld MG, Birnberg NC, Evans RM, 1982.
Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion
genes. Nature 300: 611615.

Paradis K, Langford G, Long Z, Heneine W, Sandstrom P, Switzer WM, et al. 1999. Search for cross-species
transmission of porcine endogenous retrovirus in patients treated with living pig tissue. The XEN 111 Study
Group. Science 285: 12361241.

Patience C, Patton GS, Takeuchi Y, Weiss RA, McClure MO, Rydberg L, Breimer ME, 1998. No evidence of
pig DNA or retroviral infection in patients with short-term extracorporeal connection to pig kidneys. Lancet 352:
699701.

Patience C, Takeuchi Y, Weiss RA, 1997. Infection of human cells by an endogenous retrovirus of pigs. Nat Med
3: 282286.

Petters RM, Alexander CA, Wells KD, Collins EB, Sommer JR, Blanton MR, et al. 1997. Genetically
engineered large animal model for studying cone photoreceptor survival and degeneration in retinitis
pigmentosa. Nat Biotechnol 15: 965970.

Phelps CJ, Koike C, Vaught TD, Boone J, Wells KD, Chen SH, et al. 2003. Production of alpha 1,3-
galactosyltransferase-deficient pigs. Science 299: 411414.

Polejaeva IA, Campbell KH, 2000. New advances in somatic cell nuclear transfer: application in transgenesis.
Theriogenology 53: 117126.

Powell BC, Walker SK, Bawden CS, Sivaprasad AV, Rogers GE, 1994. Transgenic sheep and wool growth:
possibilities and current status. Reprod Fertil Dev 6: 615623.

Pursel VG, Pinkert CA, Miller KF, Bolt DJ, Campbell RG, Palmiter RD, 1989. Genetic engineering of livestock.
Science 244: 12811288.

Rieth A, Pothier F, Sirard MA, 2000. Electroporation of bovine spermatozoa to carry DNA containing highly
repetitive sequences into oocytes and detection of homologous recombination events. Molecular Reproduction
and Development 57: 338345.

Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M, 1986. Germ-line transmission of genes introduced into cultured
pluripotential cells by retroviral vector. Nature 323: 445448.

Rudolph KL, Millard M, Bosenberg MW, DePinho RA, 2001. Telomere dysfunction and evolution of intestinal
carcinoma in mice and humans. Nat Genet 28: 155159.

Rudolph NS, 1999. Biopharmaceutical production in transgenic livestock. Trends Biotechnol 17: 367374.

Saito S, Sawai K, Ugai H, Moriyasu S, Minamihashi A, Yamamoto Y, et al. 2003. Generation of cloned calves
and transgenic chimeric embryos from bovine embryonic stem-like cells. Biochem Biophys Res Commun 309:
104113.

Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, Wilmut I, et al. 1997. Human factor IX
transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 278: 21302133.

Seidel GE, Jr., 1993. Resource requirements for transgenic livestock research. J Anim Sci 71: 2633.

Shiels PG, Kind AJ, Campbell KH, Waddington D, Wilmut I, Colman A, Schnieke AE, 1999. Analysis of
telomere lengths in cloned sheep. Nature 399: 316317.

Shim H, Gutierrez-Adan A, Chen LR, BonDurant RH, Behboodi E, Anderson GB, 1997. Isolation of pluripotent
stem cells from cultured porcine primordial germ cells. Biol Reprod 57: 10891095.

Sikes ML, OMalley BW, Jr., Finegold MJ, Ledley FD, 1994. In vivo gene transfer into rabbit thyroid follicular
cells by direct DNA injection. Hum Gene Ther 5: 837844.
 273

Soukka T, Tenovuo J, Lenander-Lumikari M, 1992. Fungicidal effect of human lactoferrin against Candida
albicans. FEMS Microbiol Lett 69: 223228.

Souza T, MacDougall C, Campbell BK, McNeilly AS, Baird DT, 2001. The (FecB) phenotype is associated
with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B (BMPR1B) gene. J Endocrinol 169: R16.

Stacey A, Schnieke A, Kerr M, Scott A, McKee C, Cottingham I, et al. 1995. Lactation is disrupted by alpha-
lactalbumin deficiency and can be restored by 60 E.O. Melo et al. human alpha-lactalbumin gene replacement in
mice. Proc Natl Acad Sci USA 92: 28352839.

Stinnakre MG, Vilotte JL, Soulier S, Mercier JC, 1994. Creation and phenotypic analysis of alpha- lactalbumin-
deficient mice. Proc Natl Acad USA 91: 65446548.

Suda O, Smith LA, dUscio LV, Peterson TE, Katusic ZS, 2005. In vivo expression of recombinant vascular
endothelial growth factor in rabbit carotid artery increases production of superoxide anion. Arterioscler Thromb
Vasc Biol 25: 506511.

Sullivan EJ, Kasinathan S, Kasinathan P, Robl JM, Collas P, 2004. Cloned calves from chromatin remodeled in
vitro. Biol Reprod 70: 146153.

Thomas KR, Capecchi MR, 1987. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem
cells. Cell 51: 503512.

Van Berkel PH, Welling MM, Geerts M, van Veen HA, Ravensbergen B, Salaheddine M, et al. 2002. Large scale
production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows. Nat Biotechnol 20: 484487.

Van Doorn MB, Burggraaf J, van Dam T, Eerenberg A, Levi M, Hack CE, et al. 2005. A phase I study of
recombinant human C1 inhibitor in asymptomatic patients with hereditary angioedema. J Allergy Clin Immunol
116: 876883.

Velander WH, Johnson JL, Page RL, Russell CG, Subramanian A, Wilkins TD, et al. 1992. High-level
expression of a heterologous protein in the milk of transgenic swine using the cDNA encoding human protein C.
Proc Natl Acad Sci USA 89: 1200312007.

Wakayama T, Shinkai Y, Tamashiro KL, Niida H, Blanchard DC, Blanchard RJ, et al. 2000. Cloning of mice to
six generations. Nature 407: 318319.
Wall RJ, Kerr DE, Bondioli KR, 1997. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a large scale. J Dairy Sci
80: 22132224.

Wall RJ, Powell AM, Paape MJ, Kerr DE, Bannerman DD, Pursel VG, 2005. Genetically enhanced cows resist
intramammary Staphylococcus aureus infection. Nat Biotechnol 23: 445451.

Waterston RH, Lindblad-Toh K, Birney E, Rogers J, Abril JF, Agarwal P, et al. 2002. Initial sequencing and
comparative analysis of the mouse genome. Nature 420: 520562.

Weissmann C, Enari M, Klohn PC, Rossi D, Flechsing E, 2002. Transmission of prions. Proc Natl Acad Sci USA
99: 1637816383.

Wheeler MB, 2003. Production of transgenic livestock: promise fulfilled. J Anim Sci 81: 3237. Willadsen SM,
1986. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320: 6365.

Williams RS, Johnston SA, Riedy M, DeVit MJ, McElligott SG, Sanford JC, 1991. Introduction of foreign genes
into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc Natl Acad Sci USA 88: 27262730.

Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH, 1997. Viable offspring derived from fetal and adult
mammalian cells. Nature 385: 810813.

Wobus AM, Boheler KR, 2005. Embryonic stem cells: prospects for developmental biology and cell therapy.
Physiol Rev 85: 635678.
 274

Wright G, Carver A, Cottom D, Reeves D, Scot A, Simons P, et al. 1991. High level expression of active human
alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep. Biotechnology (NY) 9: 830834.

Zaidi A, Schmoeckel M, Bhatti F, Waterworth P, Tolan M, Cozzi E, et al. 1998. Life-supporting pig-to-primate
renal xenotransplantation using genetically modified donors. Transplantation 65: 15841590.

Zawada WM, Cibelli JB, Choi PK, Clarkson ED, Golueke PJ, Witta SE, et al. 1998. Somatic cell cloned
transgenic bovine neurons for transplantation in parkinsonian rats. Nat Med 4: 569574.

Zbikowska HM, Soukhareva N, Behnam R, Chang R, Drews R, Lubon H, et al. 2002a. The use of the
uromodulin promoter to target production of recombinant proteins into urine of transgenic animals. Transgenic
Res 11: 425435.

Zbikowska HM, Soukhareva N, Behnam R, Lubon H, Hammond D, Soukharev S, 2002b. Uromodulin promoter
directs high-level expression of biologically active human alpha1- antitrypsin into Mouse urine. Biochem J 365:
711. Animal transgenesis 61