Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Kamis, 26 April 2018

Manajemen Laboratorium PJ Praktikum : Dwi Yuni Hastati, STP, DEA.

PROSEDUR KALIBRASI HPLC

Kelompok 7/AP1

Ratu Yuliani H J3E116104

Santi Prihartini J3E116116

PROGRAM KEAHLIAN SUPERVISOR JAMINAN MUTU PANGAN

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018
 PT. ANUGERAH SEJAHTERA

Laboratorium Kalibrasi

Jl. Ahmad Kalibrasi

Prosedur Yani, No. 40, Bogor
Alat HPLCTengah, Kota Bogor, Jawa Barat.140555
No DokumenPS-HPLC-
01Revisi0Tanggal Terbit26 April
2018Halaman1/6

DAFTAR ISI

Tujuan

Ruang Lingkup

Definisi

Penanggung Jawab

Prosedur

Dokumentasi

Peraturan Lain yang Terkait

Sumber

Disusun Oleh : Diperiksa Oleh : Disahkan Oleh :

 PT. ANUGERAH SEJAHTERA

Laboratorium Kalibrasi

Jl. Ahmad Kalibrasi

Prosedur Yani, No. 40, Bogor
Alat HPLCTengah, Kota Bogor, Jawa Barat.140555
No DokumenPS-HPLC-
01Revisi0Tanggal Terbit26 April
2018Halaman2/6

Tujuan

Prosedur kalibrasi alat HPLC bertujuan untuk menjamin bahwa kalibrasi dilakukan sesuai
dengan prosedur sehingga hasil kalibrasi yang diperoleh dapat dipertanggungjawabkan
ketepatan dan kebenarannya.

Ruang Lingkup

Prosedur ini berlaku untuk kalibrasi HPLC AGILENT 1100 di Laboratorium Kalibrasi

Definisi

Kalibrasi dalah proses pengecekan dan pengaturan akurasi dari alat ukur dengan
cara membandingkannya dengan standar/tolak ukur

Penanggung Jawab

Manager Teknis

Menjamin bahwa prosedur cara kalibrasi HPLC AGLIENT 1100 ini harus dibuat

Analis

Melakukan cara kalibrasi HPLC AGILENT 1100

Prosedur

Quaternary Pump

Tes kebocoran pada 350 bar dengan solvent methanol

Lepaskan tubing pada outlet pump

Tutup outlet pump dengan “ Column end plug “

Max Pressure limit sebesar 350 bar

Set flow rate 0.2 ml /menit , jalankan pump

pump akan berhenti secara otomatis bila tekanna telah mencapai 350 bar.

Amati tekanan pada 1 menit setelah pump berhenti.

Tekanan tidak bleh turun <310 bar.

Buka reference valve untuk menghilangkan tekanan.

bila pump gagal, amati apakah ada kebocoran pada setiap sambungan, seal pluger dan
Tes Akurasi Flow Rate dengan Solvent Methanol

Ganti “ Column end plug “ pada outlet pump dengan SS Tubing.

Arahkan tubing ke dalam labu ukur 25 ml set flow rate pada pump A sebanyak 5 ml /
menit,

dengan menggunakan stop watch catat waktu yang perlu

PT. ANUGERAH diperlukan untuk menampung
SEJAHTERA
25 ml, lalu set flow rate 0 ml/menit.
Laboratorium Kalibrasi
Arahkan tubing ke dalam labu ukur 10 ml, set flow rate pump A sebanyak 0,5 ml/menit
Jl. Ahmad Kalibrasi
Prosedur Yani, No. 40, Bogor
Alat Tengah, Kota
HPLC Bogor, Jawa Barat.140555
No DokumenPS-HPLC-
dengan menggunakan stop watch , catat waktu yang perlu untuk menampung 25 ml, lalu
01Revisi0Tanggal Terbit26 April
set flow rate 0 ml/menit.
2018Halaman3/6

Hitung akurasi flow rate dengan rumus = 1/3{(A/300)+(B/600)+(C/1200)} x 100%,

dimana :

A = penyimpangan waktu ( dalam detik ) dari waktu 5 menit

B = penyimpangan waktu ( dalam detik ) dari waktu 10 menit

C = penyimpangan waktu ( dalam detik ) dari waktu 20 menit

Akurasi flow rate harus <3%.

Lakukan hal yang sama untuk pump B, C, dan D.

Tes Akurasi Komposisi Gradient

Siapkan Erlenmeyer 500 ml dan isis dengan methanol yang telah disring dengan filter
0.4, masukan selang pump A ke dalam Erlenmeyer tersebut.

Siapkan Erlenmeyer 500 ml dan isi dengan larutan propyl paraben dalam methanol
dengan konsentrasi 10 mg/ml, masukkan selang pump B ke dalam Erlenmeyer tersebut.

Lakukan priming untuk kedua solvent tersebut

Sambungkan tubing outlet injector ke detector ( tanpa column dan pre column ).

Atur set up pump sebagai berikut :

Tabel 1 Akurasi Komposisi Gradient

NoTimeFlow%A
%BCurva10.002.001000*22.002.0090101134.002.0080201146.002.0070301158.002.006
04011610.002.00505011712.002.00406011814.002.00307011916.002.002080111018.00
2.001090111120.002.000100111222.002.001000111325.002.00100011Klik detector
VWD

klik set up VWD signal

set Wave length = 257 nm

Klik run control

Klik sample info lalu isikan nama sampel dan nama file

Lakukan injeksi methanol, tunggu hingga 25 menit

 PT. ANUGERAH SEJAHTERA

Laboratorium Kalibrasi

Jl. Ahmad Kalibrasi

Prosedur Yani, No. 40, Bogor
Alat HPLCTengah, Kota Bogor, Jawa Barat.140555
No DokumenPS-HPLC-
01Revisi0Tanggal Terbit26 April
2018Halaman4/6

Setelah didapatkan kromatogram , lakukan integrasi dengan parameter sebagai berikut :

Minimum area0Minimum height0Peak widthDi set sehingga satu level diwakilinoleh

satu puncak (ada RT-nya) Peak tresholdDi set sehingga satu level diwakili oleh satu
puncak (ada RT-nya)Pada integration event, lakukan force baseline by time mulai 0.0
menit -25 menitCetak kromatogram dengan menggunakan reporting method yang ada
kolom peak height nya

Masukkan nilai peak height tiap level yang menyatakan komposisi vitamin B.

Bagi peak height tiap peak dengan peak height dari peak yang mewakili 100% B.

Kurangkan hasil pembagian tersebut dari 1/100 nilai %B yang diwakilinya.

Nilai maksimum dari hasil pada step sebelumnya adaah persentase akiurasi komposisi.

nilainya harus <0.5%.

Temperature Acuracy

Ganti “column end plug” pada outlet pump dengan SS tubing.

Set flow rate 2 ml /min. Set suhu 36(

Arahkan tubing ke thermometer dan setelah suhu stabil, catat hasil yang ditunjukkan
thermometer.

Selisih sushu maksimum 2(

Detector VWD

Tes Linearity Absorbens Detector

Siapkan standard caffeine dalam air dalam konsentrasi :

5 mg/L, 25 mg/L, 125 mg/L, 250 mg/L, dan beri label masing –masing larutan #1 sampai
#4.

set panjang gelombang = 272 nm.

Pasang coloumn ODS STR-II 250 L x 4.0 mml. D, mobile phase aquabidest 85%
acetonenitrile 15%, flow rate 0.8 ml/min, suhu column 36(

Injekkan masing-masing standard an print hasil kromatogramnya

Hitung sensitifity dengan cara membagi pembacaan absorbens

 PT. ANUGERAH SEJAHTERA

Laboratorium Kalibrasi

Jl. Ahmad Kalibrasi

Prosedur Yani, No. 40, Bogor
Alat HPLCTengah, Kota Bogor, Jawa Barat.140555
No DokumenPS-HPLC-
01Revisi0Tanggal Terbit26 April
2018Halaman5/6

membagi pembacaan absorbens dengan konsentrasi larutan masing-masing dan catat pada
column sensitivity.

Hitung %RSD dari coloumn sensitivity

Hasilnya haru s <5%

Buat kurva yang menghubungkan konsentrasi dengan area

Hitung nilai korelasinya , nilai min adalah 0.99900

Noise, Pressure, dan Temperature Stability

Pasang column ODS STR-II 250 L x 4.0 mml. D, mobile phase aquabidest 100%, flow
rate 1.0 ml/min , suhu column 36C

Set panjang gelombang = 254 nm. Stop time 10 min.

Run method tanpa menginajk apapun dan print hasil kromatogramnya

Amati nilai Wander dan drift pada kromatogram, nilai Wander (mAU) maksimum 0.2
mAU dan nilai drift maksimum 0.5 mAU/h.

Untuk temperature stability , nlai selisih temperature maksimum adalah 0.5C

Untuk temperature stability, nilai selisih temperature maksimum 0.5C

Sedangkan untuk pressure stability, nilai selisih makimum 5%

OVERAL SYSTEM PERFORMANCE (HPLC dengan DETECOR UV/VIS)

4.4.1. Bahan yang diperlukan

Methanol

Milli-Q Water

Methyl paraben

Prophyl paraben

Column ODS STR-II 250 L x 4.0 mml.D.

Overal method Parameter

Column ODS STR-II 250 L x 4.0 mml.D.Mobile Phase60/40 methanol/airFlow rate1

ml/minWave lenght254 nmSampel 0.05 mg/ml methyl dan prophyl parabenInjection
volume20 QUOTE IPenyiapan Fasa Gerak
 methanol ke dalam 200 ml air, aduk sampai homogen

PT. ANUGERAH SEJAHTERA

Laboratorium Kalibrasi

Jl. Ahmad Kalibrasi

Prosedur Yani, No. 40, Bogor
Alat HPLCTengah, Kota Bogor, Jawa Barat.140555
No DokumenPS-HPLC-
01Revisi0Tanggal Terbit26 April
2018Halaman6/6

Penyiapan Sampel

Buat “ Stock Solution” methyl prophyl parabnen ( dicampur ) , sehingga konsentrasinya

0.5 mg/ml

Untuk membuat konsentrasi 0.05 mg/ml, pipet “stock solution” dan masukkan ke dalam
labu ukjr 10 ml dan tambahkan sampai dengan tanda dengan menggunkan fasa gerak

Melakukan Enam (6) kali Injeksi

Siapkan fase geerak methanol di pump A dan air di pump B.

atur perbaningan fase gerak methanol /air 60/40

Alirkan fase gerak denga flow rate 1.0 ml/min selama satu jam hingga output detector
stabil

Catat area dan teetion time untuk tiap peak dari setiap injeksi

Hitung % RSD retention time dan area atau amount , menggunakan prophyl paraben
untuk perhitungan

Presisiuntuk area atau amount harus <1.0% RSD

Presisi untuk retention time harus <1.0%RSD

Dokumentasi :

Hasil kalibrasi alat ini didokumentasikan atau dicatat pada lembaran Calibration Report

Peraturan Terkait :

CPOB 2012 PASAL 12.17

Sumber

7.1. Operating Instruction from EMPOWER

7.2. Operating Instruction from AGILENT 1100

7.3. IK –HPLC-01