DIO IX.

Laboratorijska dijagnostika hematoloških

bolesti i poremećaja hemostaze

48. Anemije (Ivo Radman, Marijo Vodanović). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49. Tumori krvotvornog limfnog tkiva (Igor Aurer). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50. Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija (Danica Matišić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51. Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija (Dragana Šegulja, Danica Matišić). . . . . . . . . . . . . .
52. Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija
(Sanja Davidović-Mrsić, Ivana Franić Šimić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53. Molekularna dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti (Renata Zadro) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54. Primarne imunodeficijencije (Jadranka Kelečić, Ana Merkler). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55. Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma (Drago Batinić). . . . . . . . . . . . . . . . . .
56. Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze
(Désirée Coen Herak, Marija Miloš) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57. Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja sustava zgrušavanja (Silva Zupančić Šalek). . . . .
58. Laboratorijski aspekti transplantacije krvotvornih matičnih stanica
(Branka Golubić Ćepulić, Ines Bojanić). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

443
444 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
 Poglavl je 48.
Anemije
Ivo Radman, Marijo Vodanović

Anemija je stanje smanjenog broja eritrocita, mase eritrocita ili sadržaja hemoglobina u eritrocitima i ozna-
čava slabokrvnost ili malokrvnost. Pojam anemije obuhvaća izrazito heterogenu skupinu poremećaja koji se
rijetko javljaju kao primarne bolesti krvotvornog sustava, a puno češće kao odraz drugih bolesti. U rutinskom
radu stupanj anemije određujemo koristeći nalaze koncentracije hemoglobina - krvnog pigmenta za prijenos
kisika i hematokrita koji predstavlja volumni udio eritrocita u krvi. Anemija se prema količini mase crvenih
krvnih stanica dijeli na relativnu i apsolutnu. Kod relativne anemije nalazimo urednu masu eritrocita uz
povećan volumen plazme. Apsolutna anemija je stanje smanjene mase crvenih krvnih stanica koju određu-
jemo prema kinetskim, morfološkim i patofiziološkim kriterijima. Zadatak kliničara jest prepoznati anemiju
i diferencijalno dijagnostički znati razlikovati sva stanja koja mogu dovesti do određenog tipa anemije.
Prevalenciju anemija je teško odrediti jer ovisi o učestalosti uzroka koji dovode do njenog nastanka i o
drugim čimbenicima (populacija bolesnika, geografska lokacija, referentne vrijednosti nalaza, razvijenost
medicinsko-zdravstvenog sustava koji može odrediti točan uzrok i mehanizam anemije). Epidemiološke
studije u razvijenim zemljama navode prevalenciju anemija do 15 % dok se u nerazvijenom svijetu pojavnost
anemija kreće i do 50 %.

Podjela anemija
Dva su osnovna pristupa podjeli anemija: 1.) kinetički koji nastoji utvrditi mehanizam koji dovodi do anemije
i 2.) morfološki koji dijeli anemije prema veličini srednjeg volumena eritrocita (MCV).
Kinetički pristup dijeli anemije prema jednom od tri mehanizma nastanka anemije: smanjeno stvaranje,
ubrzano propadanje i gubitak eritrocita.
1. Smanjeno stvaranje eritrocita. Tijekom 24 sata propada 1 % eritrocita i zamjenjuje se novostvorenima
u koštanoj srži. Smanjeno stvaranje eritrocita (hipoproliferacijska anemija) javlja se zbog primarne bolesti

445
 koštane srži, infiltracije koštane srži tumorskim
stanicama, snižene razina trofičkih hormona
(eritropoetin, hormoni štitnjače i androgeni) i
nedostatka vitamina B12, folne kiseline ili želje-
za.
2. Povećano propadanje eritrocita javlja se ako
je životni vijek eritrocita kraći od 100 dana (eri-
trociti prosječno žive oko 120 dana). Do anemije
dolazi ukoliko koštana srž ne može dnevno na-
domjestiti 5 % eritrocitne mase. Ovakav tip ane-
mije je karakterističan za hemolitičku anemiju.
3. Gubitak eritrocita je najčešći uzrok anemije.
Najčešće se događa se zbog traume, krvarenja
iz probavnog sustava ili ginekološkog krvarenja.
Krvarenje može i biti okultno npr. kod polipa
ili raka debelog crijeva ili jatrogeno zbog kod
učestalih venepunkcija, hemodijalize i darivanja
krvi.
Morfološki pristup dijeli anemije u tri skupine; mi-
krocitnu gdje je MCV<80 fL, normocitnu (MCV 80-
100 fL) te makrocitnu (> 100 fL) (Tablica 48.1.).
Klinička slika
Kliničke tegobe ovise o brzini nastanka anemije.
Anemije koje se brzo razvijaju pokazuju više tego-
ba od kroničnih, sporoprogredirajućih anemija jer je
manje vremena za prilagodbu organizma. Tek kada
je hemoglobin <90 g/L javljaju se tipični simptomi
anemične hipoksije: nedostatak zraka, bol u prsima,
umor i slabost, gubitak mišićne snage, pospanost,
lupanje srca, glavobolja, gubitak koncentracije. Srce
povećava minutni volumen na račun porasta srčane
frekvencije i manjeg udarnog volumena. Kisik se ot-
pušta brže i lakše iz hemoglobina radi porasta kon-
centracije 2,3 bifosfoglicerata (BPG). Anamnestički
je potrebno obratiti pažnju je li anemija nastala akut-
no (masivno krvarenje ili hemoliza), ili postepeno
(obilnije i/ili dugotrajne menstruacije, prisustvo krvi
u stolici). U statusu se mogu uočiti bljedilo kože i
sluznica, ubrzana srčana akcija, sistolički šum, niže
vrijednosti krvnog tlaka, žutilo sklera i hepatosple-
nomegalija.
Laboratorijski nalazi
Nakon detaljne anamneze i statusa pravi uvid u te-
žinu i uzrok anemije određuje se racionalnom dija-
gnostičkom i laboratorijskom obradom što uključuje:
određivanje broja eritrocita, koncentracije hemoglo-
bina i hematokrita te broja retikulocita, izračunavanje
eritrocitnih indeksa kao i citološki pregled razmaza
periferne krvi. Mnogi uređaji automatski određuju
RDW kao mjeru anizocitoze tj. varijacije u veličini
stanica.
Eritrocitni indeksi opisuju veličinu eritrocita
(MCV), srednji sadržaj hemoglobina u eritrocitu
(MCH) te prosječnu koncentraciju Hb u volumnoj je-
dinici eritrocita (MCHC). MCV određuje morfološku
podjelu anemija. Smanjene vrijednosti MCH i MCHC
opisuju se kod mikrocitnih anemija, a povećane vri-
jednosti se nalaze kod sferocitoze, teže dehidracije
ili megaloblastične anemije.

Tablica 48.1. Podjela anemija

Mikrocitna anemija
MCV < 80 Fl
• Sideropenična anemija
• Talasemija
• Anemija kronične bolesti
• Sideroblastična anemija
Normocitna anemija
MCV (80-100 fL)
• Akutni gubitak krvi
• Anemija kronične bolesti
• Mijeloftizična anemija
• Izolirana aplazija crvene loze
• Aplastična anemija
• Kronično bubrežno zatajenje
• Endokrinološki poremećaji
Makrocitna anemija
MCV > 100 fL
• Intoksikacija etanolom
• Deficit folne kiseline i/ili vitamina B12
• Sindrom mijelodisplazije
• AML
• Anemija uzrokovana lijekovima
• Bolesti jetre
UZ POVEĆANE RETIKULOCITE:
• Hemolitička anemija
• Odgovor na gubitak krvi
• Odgovor na liječenje (Fe, B12, folati)

446 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

Broj retikulocita (Rtc) izražava se kao postotak od
ukupne eritrocitne mase ili kao apsolutni broj. Re-
ferentne vrijednosti broja retikulocita kreću se od
5- 20‰. Anemija s normalnim i smanjenim brojem
retikulocita upućuje na smanjeno stvaranje eritrocita
u koštanoj srži. Najčešće je riječ o hipoproliferativnoj
anemiji ili anemiji zbog poremećaja u sazrijevanju.
Preciznije je određivanje apsolutnog broja retikulo-
cita (normalne vrijednosti su 25000-75000/µL). Reti-
kulocit nastaje iz eozinofilnog eritroblasta, obilježja
zadržava četiri dana, od toga tri dana provodi u ko-
štanoj srži, a jedan dan u perifernoj krvi, tako da se
može dogoditi pomak retikulocita (do dva i pol dana
može provesti u krvi) kao kompenzatorni odgovor
na anemiju i potrebu ubrzanog sazrijevanja eritrocita.
Razmaz periferne krvi pruža vrijedne informaci-
je o morfološkim promjenama eritrocita i leukocita.
Za megaloblastičnu anemiju karakteristične su, pri-
mjerice, hipersegmentacija neutrofilnih granulocita
i pojava ovalocita. Eritroblasti se nađu u hemoglo-
binopatija, anemije srpastih stanica, nakon splenek-
tomije radi hemolitičke anemije, kod mijelofibroze i
mijeloftizične anemije. Fragmentirani eritrociti (shi-
stociti) nalaze se kod mikroangiopatskih hemolitič-
kih anemija i hereditarne sferocitoze. Eliptocite na-
lazimo kod nasljedne eliptocitoze, a mikrosferocite
kod nasljedne sferocitoze. Brzi pad broja eritrocita
uz nedostatak retikulocita upućuje na aplaziju košta-
ne srži, dok brzi pad eritrocita uz povećane retikulo-
cite upućuje na hemolitičku anemiju ili gubitak krvi.
Prisutnost nezrelih stanica u razmazu periferne krvi
iziskuje analizu koštane srži (citologija, imunofeno-
tipizacija, imunohistokemija, citogenetika).
Ostale pretrage: U svrhu isključivanja ili dokaziva-
nja sekundarnih uzroka anemije važno je učiniti na-
laze bubrežne i jetrene funkcije te odrediti hormone
štitnjače i nadbubrežne žlijezde. Elektroforeza pro-
teina uz imunofiksaciju te kvalitativno i kvantitativno
određivanje lakih lanaca mogu otkriti monoklonsku
gamapatiju ili multipli mijelom. Određivanje razi-
ne vitamina B12 i folata indicirano je kod sumnje na
megaloblastičnu anemiju, a vrijednost feritina uz
Fe, UIBC, TIBC važne su za dijagnozu sideropenič-
ne anemije. U hemolitičkih anemija bitno je učiniti
imunoeritrocitno ispitivanje (Coombsov test), elek-
troforezu hemoglobina, test osmotske rezistencije
eritrocita i odrediti aktivnost enzima u eritrocitu. Kod
anemije kronične bolesti (AKB) važan je nalaz kon-
centracije feritina i eritropoetina. Uz pojedine tipove
anemija biti će i detaljnije objašnjeni pojedini testovi.
ANEMIJE ZBOG POREMEĆAJA
METABOLIZMA ŽELJEZA
Poremećaj metabolizma željeza. Željezo se u or-
ganizmu nalazi u funkcionalnom, transportnom i pri-
čuvnom obliku. Ljudski organizam sadrži  3-4 grama
željeza. Od toga su 2,5 grama smještena u eritrociti-
ma, 500 mg je uskladišteno u feritinu i hemosiderinu,
300 mg se nalazi u mioglobinu i enzimima, a samo 4
mg željeza cirkulira i u svakom je trenutku dostupno
za korištenje. Minimalna dnevna potreba za željezom
iznosi 1-2 mg jer se upravo toliko svakodnevno gubi
eksfolijacijom probavnog epitela. Uobičajena dnev-
na prehrana sadrži 10-20 mg elementarnog željeza
od čega se iskoristi oko 10 %. Fiziološkog načina ek-
skrecije željeza iz tijela nema i ono se može gubiti
samo krvarenjem.
Hepcidin – ključni regulator održavanja
homeostate željeza u organizmu
Nedavno je identificiran glavni regulator održavanja
homeostaze željeza u organizmu. To je bjelančevina
akutne faze hepcidin, koji se sastoji od 25 aminoki-
selina. Hepcidin se sintetizira u jetri kao odgovor na
(IL-6. Povećana koncentracija IL-6 i hepatocelular-
nog željeza potiču sintezu hepcidina dok je hipoksija
koči. Drugi upalni citokini kao što su IL-1 i TNF-α
ne utječu na ekspresiju hepcidina. Ovaj zaključak
je pojačan opažanjem da u eksprimentalnih miševa
s nedostatkom IL-6 upalni enzimi ne izazivaju po-
rast hepcidina. Pokusi na zdravim dobrovoljcima su
definitivno dokazali da infuzija IL-6 brzo dovodi do
porasta hepcidina i razvoje sideropenije. Pretjerana
ekspresija hepcidina u miševa neovisno o podrijetlu
izaziva tešku anemiju. Suprotno, upala u miševa ko-
jima nedostaje hepcidin neće izazvati hipoferemiju
Anemije | 447
što je dokaz o ključnoj ulozi hepcidina u prometu Tablica 48.2. Najčešći uzroci sidropenične anemije
željeza u organizmu. Hepcidin smanjuje duodenal-
Prehrana siromašna željezom
nu apsorpciju željeza i blokira oslobađanje željeza • Pridonosi težini anemije, ali je rijetko samostalno uzrokuje
iz makrofaga što ima za posljedicu razvoj anemije
Poremećaj apsorpcije iz probavnog trakta
kronične bolesti. Čini se da nedavno otkriveni gen • gastrektomija
hemojuvelin pomaže hepcidinu u navedenim pro- • kolektomija
mjenama. Shodno tomu, poremećaj u prometu že- • resekcija tankog crijeva
• celijakija
ljeza i smanjena količina raspoloživog željeza oteža- • upalne bolesti crijeva
vaju biosintezu hema, a time i proliferaciju stanica
Kronično krvarenje
eritrocitopoeze. • ginekološko (menometroragije)
Svaki dan otprilike 20 mg željeza ulazi u plazmu i • probavni sustav
• varikoziteti jednjaka
veže se za transferin. Više od 2/3 tog željeza se oslo- • hijatalna hernija
bađa iz raspalih eritrocita, a svega 20 % se oslobađa • ulkusna bolest želuca i dvanaesnika
iz pričuva u jetri. Za vrijeme upale oslobađanje želje- • erozivni gastritis
• nesteroidni protuupalni lijekovi
za iz oba izvora je snažno inhibirano. Interleukin-6
• tumori probavnog sustava
koji se pojačano izlučuje u upali stimulira produkci- • divertikuloza
ju hepcidina s posljedičnim smanjenjem oslobađanja • parazitarne bolesti
uskladištenog željeza što brzo dovodi do hipofere- • angiodisplazije
• Rendu-Osler-Weberova bolest
mije.
Povećane potrebe za željezom
Hepcidin inhibira oslobađanje željeza iz makrofa- • ubrzani rast
ga vezivanjem na feroportin i dovodi do njegove • trudnoća
internalizacije i propadanja.U normalnim uvjetima • dojenje
feroportin na staničnoj membrani predstavlja izlazni Ostalo
kanal za željezo. Mehanizmom hepcidin-feroportin • intravaskularna hemoliza
• gubitak željeza urinom
zakočena je i intestinalna apsorpcija željeza u AKB. • idiopatska plućna hemosideroza
Konačno to može dovesti i do smanjenja zaliha želje- • dugotrajno liječenje eritropoetinom (bubrežno zatajenje).
za u organizmu što je vrlo rijedak slučaj u AKB osim
kod izrazito jake stimulacije IL-6. To je slučaj u djece
i adolescenata koji boluju od juvenilnog reumatoid- mije. Odrastao muškarac fiziološki praktički ne gubi
nog artritisa. željezo. U dobi od 15. do 44. godine učestalost ane-
mije je kod žena 10 do 20 puta češća nego kod muš-
karaca, a nakon 45. godine učestalost se izjednačava.
SIDEROPENIČNA ANEMIJA Manjak željeza se prvo nadoknađuje popunjavanjem
željeza iz rezervi i dolazi do razvoja latentne sidero-
Najčešći oblik anemije koji nastaje zbog manjka že-
penije (Fe je uredno, TIBC povišen, feritin snižen).
ljeza u organizmu.
Daljnjom progresijom dolazi do manifestne sidero-
Sideropenična anemija nastaje zbog smanjenog penije (Fe sniženo, TIBC povišen, feritin snižen), a
unosa, poremećene apsorpcije u probavnom traktu, zatim i anemije.
gubitka krvi ili zbog povećane potrebe za željezom
(Tablica 48.2.). Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Najčešći uzrok sideropenične anemije jest kronično Simptomi poput umora, slabosti, teškoće koncentra-
krvarenje, primjerice, fiziološko krvarenje u žena s cije vezane su uz težinu anemije, može biti prisutan i
mjesečnicama. Gubitak željeza ne mora biti velik, ali Plummer-Vinsonov sindrom (trijas disfagija s ezofa-
s vremenom dolazi do sideropenije, a zatim i ane- gitisom, glositis, hipokromna anemija). Usto se često

448 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

nađe i angularni stomatitis, koilonihija (krhki nokti),
atrofični gastritis. Brojne promjene vjerojatno su po-
vezane sa smanjenom aktivnošću enzima koje sadrže
željezo važno u sintezi stanica epitela.
Anemija je mikrocitna i hipokromna s nalazom anu-
locita u perifernoj krvi uz snižene eritrocitne indekse
MCV i MCH. Bojanje koštane srži na željezo pokazuje
potpuni nedostatak granula željeza u eritroblastima.
Serumsko željezo je sniženo (Fe), uz povišen transfe-
rin (TIBC) i nezasićen dio (UIBC), a zasićenost tran-
sferina (Fe/TIBC) < 10 %. Feritin je izrazito snižen i
najosjetljiviji pokazatelj količine željeza u rezervama.
Manjak željeza može se odrediti i mjerenjem tran-
sferinskih receptora (TfR) u serumu. TfR potječu od
eritroidnih prekursorskih stanica, dobar su kvantita-
tivni pokazatelj eritrocitopoeze i obrnuto su propor-
cionalni količini serumskog željeza.
Liječenje
Prvo treba liječiti uzrok anemije, nakon toga kori-
girati anemiju i popuniti zalihe željezom. Željezo se
primjenjuje u obliku Fe-glukonata, sukcinata, sulfata,
laktata i fumarata. Više je preparata na tržištu, a naj-
češće se rabe tablete za žvakanje koje sadrže 100 mg
željeza u obliku kompleksa željezovog (III) hidrok-
sida s polimaltozom (dekstriferon) i kapsule koje sa-
drže 350 mg željezo (II) fumarata što odgovara ekvi-
valentu od 115 mg željeza. Željezo za parenteralnu
primjenu je željezo (III) hidroksid saharat. Pripravci
za sporo otpuštanje željeza nisu prikladni jer se želje-
zo ne može apsorbirati u donjim dijelovima crijeva.
Terapija se primjenjuje 4-6 mjeseci tj. do popune re-
zervi i normalizacije feritina. Postoje različite formule
za izračunavanje manjka željeza npr.
Deficit (Fe) = (150 – Hb g/L) x tjelesna masa
(kg) x 0.22+600 mg (ž) ili 1000 mg (m)
ili
deficit (Fe) = (15,0 – Hb g/dL) x tjelesna
masa (kg) x 3
Za nekoliko dana nastaje poboljšanje (nestaje umor,
rastu retikulociti i hemoglobin), nestaju drugi zna-
kovi sideropenije (glositis, krhki nokti). Terapija pa-
renteralnim željezom je opravdana kod bolesnika s
teškom anemijom (Hb < 60 g/L), koji imaju malap-
sorpcijski sindrom (upalne bolesti crijeva, celijakija,
operativni zahvati probavne cijevi) ili koji ne podno-
se peroralno željezo. Parenteralno željezo ima nus-
pojave poput lokalne preosjetljivosti na mjestu ubo-
da, opisana je čak i anafilaksija. U slučaju neuspjeha
terapije treba razmotriti druge uzroke: manjak folne
kiseline i/ili vitamina B12, AKB, otrovanje olovom,
nedostatak bakra, talasemije, lijekove koji smanjuju
apsorpciju (čajevi, antacidi, tetraciklini). Potrebno
je liječiti uzrok koji je doveo do anemije npr. krva-
reći peptički ulkus, kolorektalni karcinom ili polip.
Najviše željeza od živežnih namirnica sadrži jetrica
(svinjska 19 mg Fe/100 g), teleća jetra (5,4 mg/100
g), kvasac 18,0 mg/100 g, dok je važno znati da tvari
u povrću poput fitata i fosfata smanjuju apsorpciju
željeza.
SIDEROBLASTIČNA ANEMIJA
Sideroblastična anemija nastaje zbog stečenog pore-
mećaja ili smanjene sinteze hema u prekursorskim
eritroidnim stanicama. Posljedično manjkavoj sinte-
zi hemoglobina razvijaju se mikrocitni i hipokromni
eritrociti. Bojanjem berlinskim modrilom te elektron-
skom mikroskopijom dokazuju se depoziti željeza
unutar mitohondrija. Uzroci mogu biti nasljedni i ste-
čeni. U nasljedne ubrajamo X-vezano nasljeđivanje,
X-vezano nasljeđivanje uz ataksiju, anemiju s pore-
mećajem mitohondrija i megaloblastičnu anemiju
osjetljivu na tiamin. Stečene su čista sideroblastična
anemija ili RARS, te reverzibilna anemija izazvana al-
koholom, izoniazidom, kloramfenikolom, manjkom
bakra i hipotermijom.
ANEMIJA KRONIČNE BOLESTI
Anemija kronične bolesti (AKB) je često korišten
termin za hematološki sindrom koji prati kronične
nehematološke bolesti. Pojavljuje se u kroničnim
upalnim bolestima (endokarditis, kronične plućne i
Anemije | 449
urinarne infekcije, osteomijelitis), sistemskim bole-
stima vezivnog tkiva, u bolesnika sa zloćudnim tu-
morima i nakon velikih trauma tkiva. Ova se anemija
naziva još i anemija posredovana citokinima.
Temeljni mehanizam razvoja anemije kronične bo-
lesti je poremećaj ravnoteže sadržaja željeza u or-
ganizmu koji se sastoji od povećanog ulaska i za-
državanja željeza u stanicama retikuloendotelnog
sustava.(RES). Time se željezo uklanja iz funkcio-
nalnog odjeljka u pričuvni odjeljak odakle se teško
mobilizira te nastaje manjak raspoloživog željeza za
potrebe eritrocitopoeze. U eksperimentalnih životi-
nja injekcija proupalnih citokina IL-1 i TNF-α rezul-
tira razvojem hipoferemije i anemije što je povezano
sa sintezom feritina, glavnim proteinom koji pohra-
njuje željezo u hepatocite i makrofage. U kroničnoj
upali aktivira se u makrofazima mehanizam eritro-
fagocitoze i transmembranskog unosa fero iona po-
moću proteina nosača dvovalentnih metalnih iona
(DMT1).
Interferon-γ, lipopolisaharidi i TNF-α pojačavaju ek-
spresiju DMT1 s povećanim unosom željeza u ak-

Autoimuna bolest
A
CD3+ monocit
T limfocit bubreg

B
IL-6 EPO
IFN-γ
jetra TNF-α
E
IL-1
hepcidin EPO

koštana
srž
DMT-1 Fe2+ F
fagocitoza
eritrocitoza
hepcidin hepcidin

C feroportin
D
feroportin
makrofag feritin
hepcidin transferinski
Fe2+ transferinsko receptor
željezo eritrociti
Fe2+
duodenum IFN-γ
hepcidin

Slika 48.1. Patofiziološki mehanizmi nastanka anemije kronične bolesti. A. Imunološki mehanizam potiče monocite i T limfocite na
pojačano izlučivanje citokina IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ. B. Interleukin-6 stimulira proizvodnju hepcidina u jetri. C. Hepcidin se veže za fero-
portin na membrani enterocita i koči apsorpciju željeza. D. Hepcidin se i na površini makrofaga veže uz feroportin izazivajući njegovu
internalizaciju i degradaciju. Funkciju feroportina koči i INF-γ. Tako se željezo pojačano nakuplja u makrofagu čemu doprinosi i pojačana
fagocitoza eritrocita te pojačana ekspresija DMT-1. Upalni citokini pojačavaju ekspresiju transferinskih receptora na membrani makrofaga
što ide u prilog nakupljanju željezovih iona u feritinu unutar makrofaga. E. TNF-α i INF-γ koče produkciju eritropoetina u bubrezima. F.
IL-1, TNF-α, IFN-γ izravno inhibiraju diferencijaciju i proliferaciju prethodnih stanica crvene loze. Dodatni negativan učinak je izazvan
ograničenom raspoloživošću željeza te smanjenom aktivnošću eritropoetina što u konačnici dovodi do nastanka anemije

450 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

tivirane makrofage. Isti citokini zadržavaju željezo
u makrofazima smanjenjem aktivnosti feroportina
koj je transmembranski izbacivač željeza iz stanice.
U normalnim uvjetima feroportin obavlja prijenos
apsorbiranog željeza iz stanica duodenalnog epitela
u cirkulaciju. Zanimljivo je da i protuupalni citokini
primjerice IL-10 mogu izazvati anemiju poticanjem
transferina i feritina na zadržavanje željeza u RES-
u. U većine bolesnika s AKB nalazi se povećana
koncentracija bakra u krvi što je posljedica porasta
plazmatskog ceruloplazmina. Ceruloplazmin je en-
zim koji je potreban za izbacivanje željeza iz stanice.
Zadržavanje željeza u makrofagima moglo bi značiti
da je u AKB feroksidazna aktivnost ceruloplazmina
inhibirana, no to nije slučaj jer se stanični transport
željeza ne popravlja dodatkom egzogenog cerulo-
plazmina.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Anemija kronične bolesti je normokromna, normo-
citna anemija blažeg (Hb 95 g/L) do srednje teškog
stupnja (Hb 80 g/L) Bolesnici imaju snižen broj re-
tikulocita što govori za smanjenu proizvodnju eri-
trocita. Definitivna dijagnoza može biti otežana u
stanjima kroničnih krvarenja s posljedičnom sidero-
penijom ili u prisustvu drugih vrsta anemija. Stoga
obrada treba uključiti i određivanje statusa željeza u
organizmu da se isključi anemija zbog manjka želje-
za koja je obično hipokromna i mikrocitna. Razlika
između AKBi i sideropenične anemije je u tome da je
posljednja izazvana isključivo manjkom željeza dok
je nastanak AKB višeuzročan. U obje vrste anemije
koncentracija serumskog željeza i saturacija transfe-
rina su smanjene. U prvom slučaju je to posljedica
apsolutnog manjka željeza, a u drugom manjak je
relativan jer je velika količina željeza zarobljena u
stanicama RES-a.
U sideropeničnoj anemiji saturacija transferina je
niža nego a AKB zbog toga što je koncentracija tran-
sferina u AKB normalna ili snižena dok je u sidero-
peničnoj anemiji izrazito povećana. Treba tragati i za
drugim uzrocima manjka željeza kao što su meno-
metroragije, kronična krvarenja iz probavnog susta-
va, crijevne upalne bolesti, angiodisplazije, adenomi
debelog crijeva, rak probavnih organa ili parazitarne
infekcije.
Feritin se koristi kao pokazatelj rezervi željeza u or-
ganizmu i koncentracija od 15 ng/ml se uzima kao
granica koja pokazuje nedostatak željeza. Međutim
koncentracija od 30 ng/ml puno sigurnije određuje
anemiju zbog manjka željeza (vjerojatnost dijagnoze
92-98 %). U AKB feritin je normalan ili povišen poka-
zujući povećane rezerve željeza i zadržavanje željeza
unutar stanica RES-a, ali može biti povišen i zbog
imune aktivacije kao reaktant akutne faze.
Topljivi transferinski receptor je dio membranskog
receptora koji je povećan u nedostatku željeza. U
anemiji kronične bolesti nivo topljivog transferin-
skog receptora je približno normalan jer upalni cito-
kini negativno utječu na njegovu ekspresiju. Odre-
đivanje nivoa topljivog transferinskog receptora
odličan je test razdvajanja AKB od AKB udruženog
s manjom željeza. U prvom slučaju je koncentracija
feritina normalna ili povišena uz nisku vrijednost so-
lubilnog transferinskog receptora dok je u drugom
obrnuto, niski feritin uz visoki transferinski receptor.
Omjer koncenetracije topljivog transferinskog recep-
tora i logaritma koncentracije feritina također može
biti od pomoći. Omjer manji od 1 sugerira anemiju
kronične bolesti, dok vrijednost veća od 2 snažno su-
gerira apsolutni manjak željeza zajedno s anemijom
kronične bolesti. Određivanje postotka hipokromnih
eritrocita ili sadržaja hemoglobina u retikulocitima
također mogu pomoći u otkrivanju manjka željeza
u bolesnika s anemijom kronične bolesti. U tablici
48.3. prikazane su razlike između anemije kronične
bolesti i sideropenične anemije te njihove kombina-
cije.
Liječenje
Anemija se korigira liječenjem osnovne bolesti,
stoga je terapija željezom kontraindicirana. Tran-
sfuzija eritrocita neophodna je samo u bolesnika s
teškim stupnjem anemije i naglašenim simptomima
uz oprez kod srčanih bolesnika. Eritropoetin može
biti koristan u bolesnika sa sniženom proizvodnjom
EPO-a.
Anemije | 451
 Tablica 48.3. Laboratorijske razlike između AKB i sideropenične anemije
Laboratorijski nalaz Anemija kronične bolesti
MCV Normalan
Željezo Sniženo
Transferin Snižen/normalan
Zasićenost transferina Snižena
Topljivi transferinski receptor Normalan
Feritin Normalan/povišen
Omjer transferinskog receptora Nizak (>1)
i log feritina
ANEMIJA U KRONIČNOJ BUBREŽNOJ
INSUFICIJENCIJI
U kroničnoj bubrežnoj insuficijenciji (KBI) redovito
se pojavljuje hipoproliferacijska, normocitna, normo-
kromna anemija uzrokovana poremećajem ekskre-
torne i endokrine funkciji bubrega. Težina anemije
obično odgovara težini bubrežne insuficijencije tako
da je kod vrijednosti klirensa kreatinina manjeg 20
mL/min hematokrit niži od 30 %.
Najvažniji mehanizam nastanka anemije u KBI je
smanjenje ili prestanak proizvodnje eritropoetina
zbog bolesti bubrega, inhibicija koštane srži tok-
sičnim metabolitima koji se ne izlučuju iz organiz-
ma zbog poremećene ekskretorne funkcije bubre-
ga te sekundarni hiperparatireoidizam. Uremijski
toksini nepovoljno djeluju na sintezu hema, te in-
hibiraju diferencijaciju eritroidnih matičnih stani-
ca. Hemodijaliza može dijelom popraviti, ali ne u
potpunosti korigirati anemiju, jer nedostaje eritro-
poetin. U KBI postoji blaga hemoliza zbog meta-
boličkih promjena u eritrocitima i veće osjetljivosti
na mehaničko oštećenje. Kao odgovor na anemiju
i hiperfosfatemiju povećana je koncentracija 2,3-
BPG (2,3 bifosfoglicerat), sa smanjenim afinitetom
Hb za kisik. Ostali činitelji koji pogoduju nastan-
ku anemije su nedostatak željeza zbog gubitaka
krvi iz probavnog i genitalnog sustava te gubitak
željeza i folne kiseline tijekom dijalize. Jedan od
činitelja je i mehanizam koji uzrokuje tzv. anemiju
kronične bolesti. Hemoliza može biti izrazita kod
452 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Sideropenična anemija Kombinirana anemija
Snižen Normalan
Sniženo Sniženo
Povišen Snižen
Smanjena Snižena
Povišen Normalan/povišenn
Snižen Snižen/normalan
Visok (>2) Visok (>2)
bolesnika s mikroangiopatskom hemolitičkom
anemijom (hemolitičko-uremički sindrom, mali-
gna hipertenzija). Konačno, lažno niže vrijednosti
hematokrita mogu biti uzrokovane i stanjem hi-
perhidracije.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Anemija je normocitna i normokromna, ali mogu
postojati blaža makrocitoza ili značajke siderope-
nične anemije. U razmazu krvi se mogu naći razli-
čite morfološke promjene te fragmentirani eritrociti.
Broj retikulocita je normalan ili blago snižen, a oči-
tih znakova hemolize nema. Vrijednosti serumskog
željeza variraju. Osnovna bolest uz pridružene in-
fekcije doprinosi nastanku anemije kronične bolesti.
Brojne transfuzije dovode do opterećenja željezom.
Najvjerodostojniji nalaz za procjenu rezervi željeza
je određivanje serumskog feritina. Funkcija trombo-
cita je poremećena proporcionalno stupnju uremije.
Citološki pregled koštane srži pokazuje “normalan�
nalaz, što je kod izražene anemije, kada se očekuje
eritroidna hiperplazija, odraz relativne insuficijencije
eritroidne loze.
Liječenje
Nadomjesna terapija eritropoetinom (EPO) u najve-
ćoj će mjeri korigirati anemiju te poboljšati kvalitetu
života bolesnika, a izbjegavaju se i moguće kompli-
kacije liječenja transfuzijama krvi. Uz terapiju eritro-
poetinom uvijek kod sideropenije treba dodati želje-
zo (najbolje intravenozno) te folnu kiselinu.
ANEMIJA U ENDOKRINIM BOLESTIMA
Uz eritropoetin i drugi hormoni sudjeluju u regula-
ciji eritrocitopoeze; posredno utječu na produkciju
eritropoetina, kontrolirajući potrošnju kisika u tkivi-
ma. Hormoni koji najočitije utječu na eritrocitopoe-
zu su hormoni hipofize, štitnjače, kore nadbubrežne
žlijezde i gonada. U pravilu ove anemije su blage i
korigiraju se supstitucijskom terapijom osnovne bo-
lesti. Utjecaj androgena na hematopoezu očituje se
već razlikom u koncentraciji hemoglobina između
muškaraca i žena. Androgeni djeluju na eritrocito-
poezu djelujući izravno, zajedno s eritropoetinom
na koštanu srž, a također povećavajući razinu eri-
tropoetina. Bolesnici s hipopituitarizmom razvijaju
najčešće srednje tešku (Hb oko 100 g/L) normocitnu,
normokromnu anemiju s umjerenom hipoplazijom
i relativnom insuficijencijom koštane srži. Za ovo
su odgovorni hormoni hipofize kao što su tireotro-
pni hormon (TSH) i gonadotropini (LH i FSH) koji
kontroliraju produkciju androgena. Supstitucijska
terapija hormonima štitnjače, androgenima, uz ste-
roide korigira anemiju. U hipotireozi eritrocitopoeza
je inhibirana zbog smanjenog metabolizma i stoga
smanjene potrebe tkiva za kisikom. Anemija je umje-
rena, normocitna i normokromna, no može biti kom-
plicirana deficitom željeza i folata, a ponekad može
biti pridružena i periniciozna anemija. Relativno je
česta mikrocitna, hipokromna anemija zbog gubitka
željeza metroragijama što je česta pojava u žena s
miksedemom. Željezo može uzmanjkati i u slučaju
oslabljene apsorpcije zbog aklorhidrije ili intesti-
nalne malapsorpcije. Insuficijenacija kore nadbu-
brežna žlijezde, tj. prije svega nedostatak glukokor-
tikoida uzrokuje blagu normocitnu, normokromnu
anemiju uz pridružen smanjeni volumen plazme, što
može lažno prikrivati anemiju. Nakon adrenalekto-
mije anemija (najčešće blaga) dobro odgovara na
glukokortikoide i EPO. Nakon orhidektomije kon-
centracija hemoglobina je prosječno smanjena za 12
g/L. Androgeni se koriste i u liječenju refraktornih
anemija i aplastične anemije. U hipogonadizmu se
pojavljuje blaga normocitna, normokromna anemija
koja se korigira primjenom testosterona.
MEGALOBLASTIČNE ANEMIJE
U megaloblastične anemije ubrajaju se anemije s ka-
rakterističnim poremećajem eritroidne loze i očituju
se pojavom megaloblasta u koštanoj srži i makrocita
(megalocita) u perifernoj krvi.
Megaloblastična anemija je najčešće posljedica manj-
ka vitamina B12 ili folne kiseline, no može se pojaviti
i zbog poremećaja metabolizma tih dvaju vitamina,
manjka transkobalamina-bjelančevine koja prenosi
vitamin B12 u serumu, te primjene dušikova oksida
i lijekova antifolata. Temeljni mehanizam anemije
je poremećaj u sintezi DNA, anemija prati i konge-
nitalni manjak enzima važnog u sintezi DNA, npr.
kod orotičke acidurije (manjak enzima koji katalizira
pretvorbu orotičke kiseline u orotidin-monofosfat i
potom u uridin-monofosfat). Opaža se u stečenim
stanjima kod dugotrajnog konzumiranja alkohola,
primjene hidroksiureje i citarabina. Tablica 48.4. pri-
kazuje najčešće uzroke nastanka megaloblastične
anemije.
U koštanoj srži vide se brojni megaloblasti s izrazi-
to velikom nezrelom jezgrom. To su stanice veće
od normoblasta istog razvojnog stupnja i obično su
ovalnog oblika. Količina RNA u tim je stanicama ap-
solutno povećana dok je stvaranje DNA usporen. Ci-
toplazma je u nezrelijim stanicama vrlo modra zbog
povećanog sadržaja RNA. U polikromatofilnom me-
galoblastu jezgra je nezrela dok citoplazma odgovo-
ra stadiju zrelosti polikromatofilnog eritroblasta i to
stanje se naziva nukleo-citoplazmatska disocijacija.
Krajnja stanica megalocit je veća od eritrocita, oval-
nog je oblika i promjera do 14 µm. Eritrocitne kon-
Tablica 48.4. Uzroci megaloblastične anemije
• Manjak Vitamina B12
• Manjak folata
• Poremećaj metabolizma vitamina B12 ili folata
– Manjak transkobalamina II,
– Dušikov oksid
– Antifolatni lijekovi
• Ostali poremećaji sinteze DNA
– Kongenitalni manjak enzima npr. orotička acidurija
– Stečeni poremećaj enzima zbog alkohola, liječenje
hidroksiurejom ili citarabinom
Anemije | 453
stante MCV i MCH povećane su pa anemija poka-
zuje značajke makrocitne i hiperkromne anemije.
Zbog nukleo-citoplazmatske disocijacije pojavljuje
se nedjelotvorna (inefektivna) eritrocitopoeza. Zna-
čajka je te promjene izrazita hiperplazija megalo-
blasta u koštanoj srži, pri čemu samo mali broj stva-
ra zrele eritrocite. Na to upozorava broj retikulocita,
koji je obično normalan ili snižen. Željezo se uspo-
reno ugrađuje pa je njegova koncentracija u seru-
mu povećana, a UIBC je normalan ili snižen. Veliki
broj megaloblasta propada u koštanoj srži. Zbog
intramedularne destrukcije ili „hemolize� nezrelih
prethodnih eritroidnih stanica (megaloblasta) raste
LDH i bilirubin. Poremećaj sinteze DNA uzrokuje
morfološke promjene i drugih loza. Granulocitna
loza je zastupljena tzv. gigantskim metamijelociti-
ma s izduženom jezgrom. Segmentirani granuloci-
ti pokazuju hipersegmentaciju jezgre sa šest i više
segmenata. Megakariociti su također veliki i hi-
persegmentirani, a broj im je povećan. Stvaranje
trombocita je smanjeno pa se u teškim slučajevima
stvara samo 10 % od količine koja bi odgovarala
povećanom broju megakariocita. Hipercelularna i
displastična koštana srži ponekad može upućivati
lažno na akutnu leukemiju. Promjene jezgre opaže-
ne su i na epitelnim stanicama probavnog sustava
i spolnih žlijezda.
Jedna od najčešćih megaloblastičnih anemija zbog
manjka vitamina B12 je perniciozna anemija (PA). To
je autoimuna megaloblastična anemija koju karakte-
rizira atrofija sluznice želuca. Smanjena je ili izostaje
sekrecija unutarnjeg faktora, a nedostaje i slobod-
ne solne kiseline u želučanom soku (aklorhidrija).
Bolest se pojavljuje u starijoj životnoj dobi (oko 60.
godine), češće u žena i pokazuje pridruženost dru-
gim autoimunim bolestima (miksedem, Hashimotov
tireoiditis, Addisonova bolest, vitiligo, hipoparatire-
oidizam i hipogamaglobulinemija). Bolest pokazuje
obiteljsku učestalost, najčešća je u osoba krvne gru-
pe A, s plavim očima, koje brže sijede. Prevalencija
karcinoma želuca u bolesnika s pernicioznom ane-
mijom (PA) je 1-3 %, a 2 % bolesnika s karcinomom
ima PA. Zahvaća sve dobne skupine, ali je vršak po-
javnosti između 70 i 80 godina.
454 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
U većine megaloblastičnih anemija simptomi umora i
slabosti se postupno razvijaju, anemija može biti vrlo
teškog stupnja (čak Hb<50 g/L), a da bolesnik bez
drugih komorbiditeta nema većih tegoba. Bolesnik
je blijedožućkaste boje poput slame. Jezik je jarko
crven, uz angularni stomatitis. Mogu biti prisutni
umjereni znakovi malapsorpcije, a ako je prisutna
trombocitopenija može se pojaviti purpura. Pri per-
nicioznoj anemiji često je zahvaćen i živčani sustav
jer je vitamin B12 potreban za proces mijelinizacije.
Najpoznatiji oblik tih neuroloških promjena je funi-
kularna mijeloza, 70-90 % bolesnika pokazuje neu-
rološke promjene sa smetnjama dubokog senzibili-
teta, parestezijama, ataksijom, u težih oblika javljaju
se smetnje mokrenja i defekacije.
Manjak folata ne uzrokuje neuropatiju, iako se na-
kon primjene metotreksata može razviti teška ence-
falopatija Glositis se opaža u oko 65 % bolesnika,
naziva se Hunterovim glositisom.
Anemija je makrocitna (MCV > 100 fL, a često i >120
fL). Makrociti (megalociti) su ovalnog oblika, broj
retikulocita je snižen, a broj leukocita i trombocita
može biti umjereno snižen. Neki od segmentiranih
granulocita pokazuju hipersegmentaciju jezgre (sa
šest i više segmenata). Koštana srž pokazuje tipične
znakove megaloblastične hematopoeze. U serumu
je povećan nekonjugirani bilirubin i LDH, a željezo
i feritin su na gornjoj granici normale ili su povišeni.
Manjak vitamina B12 ili folne kiseline može se utvrditi
određivanjem njihove koncentracije u serumu (Ta-
blica 48.5.).
Ako manjka vitamina B12, serumski su folati normalni
do povišeni, a ako manjka folne kiseline, serumski
je vitamin B12 umjereno snižen. Deoksiuridinski test
supresije koristi se u dijagnostici manjka folne kiseli-
ne i vitamina B12. Tim se testom in vitro objektivizira
stupanj supresije ugradnje radioaktivnog timidina
u stanice koštane srži, dodatkom deoksiuridina. Za
manjak vitamina B12, posebice pernicioznu anemiju
provodi se Schillingov test, koji je zadnjih nekoli-
ko godina zamijenjen novijim testovima. Testom se
određuje izlučivanje radioaktivnog vitamina B12 u
 Tablica 48.5. Koncentracija vitamina B12 i folne kiseline u bolesnika s megaloblastičnom anemijom
Test Manjak vitamina B12
Vit. B12 u serumu Snižen
Folati u serumu Normalan/povećan
Folati u eritrocitu Normalan/snižen
mokraći. Na usta se primjeni 0,5-2,0 µg radioaktiv-
nog vitamina B12 uz parenteralnu primjenu oko 1000
µg vitamina B12 kako bi se popunile rezerve tog vi-
tamina. Zdrave će osobe u 24-satnom urinu izlučiti
5-40 % primijenjene peroralne doze. Bolesnici po-
kazuju smanjeno izlučivanje ako je zbog bilo kojeg
razloga poremećena apsorpcija vitamina B12. Izlučuju
od 0-3 % radioaktivnog vitamina B12. Test se izvodi u
tri akta kako bi se razlikovala perniciozna anemija od
bolesti ileuma i sindroma slijepe vijuge. Dodatkom
unutarnjeg faktora test se normalizira kod pernicio-
zne anemije. U sindromu slijepe vijuge prethodnim
liječenjem antibioticima uništavaju se bakterije koje
prekomjerno troše vitamin B12 što uvjetuje normali-
zaciju Schillingova testa (tablica 48.6.)
Kod određivanja koncentracije vitamina B12 javljaju
se lažno pozitivne i negativne vrijednosti zbog činje-
nice da se samo 20 % ukupnog vitamina B12 nalazi
vezan za transkobalamin, a ostatak za haptokorin.
Noviji testovi poput holotranskobalamina temelje se
na mjerenju saturacije transkobalamina vitaminom
B12. Mjerenje koncentracije MMA i/ili homocisteina
se sve više koristi u postavljanju dijagnoze nedostat-
ka vitamina B12. U preko 98 % bolesnika nalaze se
značajno povišene vrijednosti MMA i homocisteina,
uključujući i one bolesnike sa samo neurološkim ma-
nifestacijama. Povišena MMA>1000 nmol/L isključi-
Tablica 48.6. Schillingov test
Uzrok manjka vitamina B12 Schillingov test Bez IF
Vegeterijanci normalan
Perniciozna anemija ili gastrektomija snižen
Bolest ileuma snižen
Sindrom slijepe vijuge snižen
Manjak folne kiseline
Normalan/graničan
Snižen
Snižen
vo je povezana uz nedostatak vitamina B12, dok se
umjeren porast (300-700 nmol/L) vidi u bubrežnom
zatajivanju. Određivanje homocisteina je manje
specifično, a povišen je i kod nedostatka folata. Za
određivanje uzroka nedostatka vitamina B12 koriste
se drugi testovi poput određivanja protutijela na IF-
intrinzični faktor (osjetljivost 50 %, specifičnost 100
%), antiparijetalna protutijela (osjetljivost viša od 80
% uz manju specifičnost), određivanje razine gastri-
na, serumskog pepsinogena tip I.
Makrocitna anemija se može pojaviti zbog kroničnog
alkoholizma, bolesti jetre, miksedema, primjene ci-
tostatika, tijekom trudnoće, u teških oblika aplastič-
ne anemije, te u mijelodisplazija i multiplog mijelo-
ma. Makrocitoza je umjerena a MCV gotovo nikad
nije > 120 fL.
Liječenje
Liječenje megaloblastične anemije jednostavno je
kao i liječenje sideropenične anemije. Ako uzrok
nije jasan bolje je primijeniti oba vitamina, jer sama
folna kiselina ne liječi neurološke promjene, nego
ih pogoršava. Pripravak vitamina B12 hidroksikoba-
lamin ili cijanokobalamin (češći u SAD) primjenju-
je se intramuskularno u dozi od 1000 µg nekoliko
puta tjedno kroz 2 tjedna (moguće i jednom kroz
sedam dana) odnosno do jasnog hematološkog
Schillingov test s IF Schillingov test nakon
antimikrobne terapije
normalan normalan
normalan snižen
snižen snižen
snižen normalan
Anemije | 455
oporavka nakon čega se prelazi na injekcije jednom HEMOLITIČKE ANEMIJE
mjesečno. Vitamin B12 treba profilaktički doživotno
primjenjivati nakon gastrektomije, poremećene ap- Koštana srž proizvede svaki dan oko 200 milijardi
sorpcije ili resekcije ileuma. Folna kiselina u obli- eritrocita koji prosječno žive 120 dana. Svako stanje
ku tableta primjenjuje se peroralnu u dozi od 5 mg koje je praćeno skraćenim životnim vijekom eritro-
tijekom 4 mjeseca. Dužina liječenja ovisi o uzroku cita naziva se hemolitička anemija.
manjka folne kiseline. Tijekom trudnoće, te u teških Eritrociti se u fiziološkom procesu starenja mije-
hemolitičkih anemija i bolesnika na hemodijalizi njaju, dolazi do smanjene fleksibilnosti, povećane
preporučuje se profilaktička primjena folne kiseli- propustljivosti membrane, gubitka bjelančevina i
ne. Ako je terapija ispravna bolesnik se subjektivno enzima i smanjene sposobnosti stvaranja energije
bolje osjeća već 24-48 sati od početka liječenja, za - ATP. Odstranjuju ih stanice mononuklearno-ma-
početak hematološkog oporavka potrebno je ne- krofagnog sustava u koštanoj srži te jetri i slezeni.
koliko dana, a prvi objektivni pokazatelj jest izra- Hemoglobin se razgrađuje na hem i globin. Hem
ziti porast retikulocita koji se opaža 6-7 dana od se katabolizira put mikrosomalnog oksidacijskog
početka liječenja, a nakon dva tjedna hemoglobin sustava jetre, dok se porfirinski prsten pretvara u
poraste za 20-30 g/L. Periferna neuropatija samo se žučni pigment – bilirubin koji se izlučuje jetrom.
dijelom poboljša nakon tjedan dana. Za neurološ- Prerano raspadanje eritrocita tj. hemoliza nastaje u
ki kompletan oporavak potrebno je 6-18 tjedana. cirkulaciji odnosno razaranjem stanica mononukle-
Kod bolesnika s teškom simptomatskom anemijom arno-makrofagnom sustavu. Intravaskularna hemo-
i kardijalnim simptomima primjenjuje se trasfuzija liza nastaje vezanjem komplementa za membranu
eritrocita. eritrocita ili djelovanjem vanjskog toksina. Ekstra-
vaskularna hemoliza posljedica
je aktivacije makrofaga specifič-
nim vezivanjem imunoglobulina
Tablica 48.7. Najčešći uzroci hemolitičkih anemija
vezanih za površinu eritrocita.
Nasljedne Stečene
Organizam nastoji kompenzira-
MEMBRANOPATIJE IMUNOSNE ti ubrzano propadanje eritroci-
• sferocitoza • Autoimune
ta. Koštana srž ima sposobnost
• eliptocitoza – AIHA s toplim protutijelima
• stomatocitoza AIHA s hladnim protutijelima povećati stvaranje eritrocita do
• akantocitoza • Aloimune 6 puta iznad normale. To znači
ENZIMOPATIJE – hemolitičko-transfuzijske reakcije da je organizam sposoban kom-
• deficit G6PD – hemolitička bolest novorođenčeta
• deficit PK – alogena transplantacija koštane srži penzirani anemiju sve dok se
HEMOGLOBINOPATIJE – anemija uzrokovana lijekovima životni vijek eritrocita ne skrati
• hemoglobin S SINDROM FRAGMENTACIJE ERITROCITA ispod 20 dana. Najčešći uzroci
• hemoglobin C • arterijski presadak
• nestabilni hemoglobin • umjetni zalisci hemolitičkih anemija prikazani
MIKROANGIOPATSKE HEMOLITIČKE ANEMIJE su u tablici 48.7.
• trombotičko trombocitopenična purpura
• hemolitičko uremijski sindrom
• meningokokna sepsa
Laboratorijska dijagnostika
• preeklamspija Na hemolitičku anemiju upu-
• diseminirana intravaskularna koagulacija ćuju povišeni nalazi testova de-
• Marš hemoglobinurija
MIKROORGANIZMI (klostridij, plazmodij) strukcije eritrocita, povišenog
PAROKSIZMALNA NOĆNA HEMOGLOBINURIJA stvaranja eritrocita te testovi koji
KEMIJSKE I FIZIKALNE TVARI upućuju na manje vrijedne eri-
SEKUNDARNE HEMOLITIČKE ANEMIJE
• bolesti bubrega i jetre
trocite. Kao prvi test potrebno je

456 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

odrediti relativni i apsolutni broj retikulocita. Uglav-
nom je relativni broj retikulocita >20‰ ili apsolutni
broj>100x109/L. Povišena je vrijednost nekonjugi-
ranog bilirubina i urobilinogena u mokraći. Intra-
vaskularna hemoliza karakterizirana je hemoglobi-
nemijom, hemoglobinurijom te hemosiderinurijom
i methemalbuminemijom uz snižen haptoglobin te
povišen LDH. Nužno je učiniti citološki razmaz peri-
ferne krvi jer različite promjene u morfologiji eritro-
cita upućuju na ovaj tip anemije (shistociti, sferociti,
dakriociti, ehinociti i akantociti).
Nasljedne hemolitičke anemije
1. Anemije zbog poremećaja membrane eritrocita
• Hereditarna sferocitoza
• Hereditarna eliptocitoza
• Hereditarna stomatocitoza
• Akantocitoza
2. Anemije zbog poremećaja metabolizma eritrocita
• Deficit enzima G6PD
• Deficit enzima PK
3. Hemoglobinopatije
• Talasemije alfa
• Talasemija beta (minor, intermedija i major)
•  stale hemoglobinoptije (anemija srpastih
O usta, smanjena je količina stomatina, vezne bjelanče-
stanica, hemoglobinopatija D)
Anemije zbog poremećaja membrane eritrocita
Hereditarna sferocitoza jest najčešća nasljed-
na hemolitička anemija. Zbog poremećaja sinteze
membranskih bjelančevina metodom elektroforeze
na poliakrimidnom gelu prepoznaju se 4 podtipa
nasljedne sferocitoze: izolirani poremećaj spektrina,
kombinirani poremećaj spektrina i ankirina, manjak
vežućeg proteina 3, manjak proteina 4.2. Za pojedi-
ne podtipove zahvaćeni su geni na pojedinim kro-
mosomima: kromosom 1 (alfa-spektrin), kromosom
8 (ankirin), kromosom 14 (beta spektrin), kromosom
15 (protein 4.2) kromosom 17 (vežući protein 3). Za
sve je poremećaje karakteristična slabost vertikalne
veze između lipidnog dvosloja od ostalog skeleta
membrane, zbog čega se područja lipidnog dvosloja
oslobađaju u obliku mikrovezikula.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Bolest se očituje slikom kronične hemolitičke ane-
mije i splenomegalijom. S vremenom se kod 50 %
bolesnika stvaraju žučni kamenci. Hemolitičke krize
su povezane s infekcijama. Aplastična kriza je po-
vezana s infekcijom parvovirusom B19. Dijagnoza.
Dijagnoza se postavlja na temelju kliničke slike i na-
laza sferocita u razmazu periferne krvi. Osmotska
rezistencija eritrocita je patološka, osjetljivost sfero-
cita na osmotske promjene je povećana. Molekularni
poremećaj se može otkriti na poliakrilamidu dok se
u zadnje vrijeme razvijaju i genetski testovi koji se
temelje na PCR metodi. Splenektomija je terapija iz-
bora, a preporuča se još liječenje rekombinantnim
eritropoetinom.
Nasljedna eliptocitoza nastaje radi poremećaja
skeletnih bjelančevina alfa i beta – spektrina, bje-
lančevine 4.1, glikoforina C i vezne bjelančevine 3.
Karakterizira je nalaz eliptocita i ovalocita uz karak-
teristične znakove hemolize. Homozigoti i dvostru-
ki heterozigoti očituju se hemolitičkom anemijom s
mikrosferocitima, poikilocitima, splenomegalijom.
Nasljedna stomatocitoza. Eritrociti imaju oblik
vine 7.2, znatno je povećana količina natrija i vode.
Bolest se očituje hemolizom i nalazom stomatocita
oko 10-30 %.
Akantocitoza ili bizarni eritrociti s produljcima po-
javljuje se kod teških jetrenih bolesti (ciroza jetre),
gdje se slobodni kolesterol nakuplja na površini
membrane. Akantociti su laboratorijsko obilježje
abetalipoproteinemije, gdje nedostaje beta-lipopro-
tein. Poremećaj je u sekreciji apoproteina u jetrernim
stanicama. Eritrociti normalnog izgleda dolaze u pa-
tološku plazmu gdje poprimaju izgled akantocita i
ubrzano propadaju, dolazi do anemije i splenomega-
lije. Karakteristični su testovi na hemolizu., Transfu-
zije nemaju koristi jer se transfundirani eritrociti brzo
pretvaraju u akantocite. Splenektomija može ublažiti
simptome, ali je zbog postojanja jetrene bolesti vrlo
rizičan zahvat.
Anemije | 457
Anemije zbog poremećaja metabolizma eritrocita HEMOGLOBINOPATIJE
Anemija je kroničnog tipa, dok se akutna intermi-
Do sada je opisano više od 1200 mutacija globina.
tentna hemoliza viđa kod bolesnika s poremećajem
Većina tih mutacija je klinički nijema. U više od 350
enzima koji sintetiziraju metabolizam glutationa.
mutacija globinskih gena dolazi do alfa i beta tala-
Deficit enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaza
semije. Ove mutacije mijenjaju ili zaustavljaju tran-
(G6PD) najčešći je metabolički nasljedni poremećaj
skripciju odgovarajućih globinskih gena, odnosno
metabolizma eritrocita. G6PD je ključni enzim hek-
translaciju mRNA. S druge strane globinske mutacije
soza monofosfat shunta, stoga G6PD reducira NADP
mogu uzrokovati nastanak hemoglobina s velikim
u NADPH i započinje reakciju stvaranja pentoza
afinitetom za kisik, što uzrokuje nastanak policite-
šećera. Aktivnost G6PD smanjuje se kako eritrocit
mije, nastanak hemolitičke bolesti te mutacije koje
stari, a retikulociti pokazuju pet puta veću aktivnost
pospješuju oksidaciju hemoglobina, zbog čega na-
enzima od najstarije populacije eritrocita. Nasljeđuje
staju methemoglobin i cijanoza. Najviša je učestalost
se spolno X-vezano, gen ima 20 kb s 13 eksona, naj-
hemoglobinopatija u tropskom i subtropskom po-
češća su 2 tipa A afrički i B divlji tip te je dosad opi-
dručju kao jedan od zaštitnih odgovora na malariju.
sano više od 300 inačica deficita enzima. Na temelju
Talasemije su heterogena skupina nasljednih
kliničke slike i tipa hemolize deficit enzima dijeli se
bolesti uzrokovanih smanjenim stvaranjem α i
na 3 skupine: akutna intermitentna hemoliza koja se
β-globinskih lanaca. Bolest se očituje od fetalnog
pojavljuje endemski (mediteranski tip, afričko-ame-
hidropsa, β-talasemija major, talasemija intermedija
rički tip, jugoistočno azijski tip). Druga skupina je
i talasemija minor.
praćena kroničnom hemolitičkom anemijom. Treća
skupina nije česta bez znakova hemolitičke anemije. Alfa talasemije nastaju zbog delecije α-gena. Postoje
dva gena na kromosomu 15 i potrebna je delecija
Klinički se bolest očituje hemolitičkom krizom na-
sva 4 alela za potpunu supresiju α-lanaca. Manjak ili
kon akutnih infekcija, uzimanja boba i lijekova koji
delecija obaju gena dovodi do nastanka hemoglobin
djeluju kao antioksidansi (antimalarici, sulfonamidi,
Bart (γ4) i takav poremećaj dovodi do intrauterine
sulfoni, nitrofurantoin, kloramfenikol, analgetici po-
smrti fetusa. Delecija tri α-gena dovodi do kliničke
put aspirina u višim dozama, antihelmintici poput
slike mikrocitne hipokromne anemije i splenome-
nitrodazola, antraciklini – doksorubicin, analozi vi-
galije (bolest hemoglobina H). Poremećaj jednog ili
tamina K). Dolazi do denaturacije hemoglobina koji
dvaju α-gena nema kliničkih posljedica, ali MCV i
se precipitira u obliku Heinzovih tjelešaca koje fago-
MCH mogu biti niži. Opisana je mutacija koja zahva-
citira slezena. Liječenje je simptomatsko, a splenek-
ća krajnju fazu translacije, pri čemu nastaje produže-
tomija ima kratkotrajan učinak.
ni α-lanac npr. „hemoglobin constant spring�.
Deficit piruvat kinaze PK je važan enzim u anae-
Beta talasemije obuhvaćaju sljedeće bolesti talasemi-
robnom ciklusu glikolize u eritrocitu. Deficit tog en-
ja major, intermedija i minor.
zima uzrokuje kroničnu hemolitičku anemiju. Deficit
se nasljeđuje autosomno recesivno. Bolest je prisut- β-talasemija minor pojavljuje se u potomaka u
na kod homozigota dok kod heterozigota nema bo- kojih su oba roditelja prenositelji talasemije (hete-
lesti. PK pretvara fosfoenolpiruvat u laktat, pri čemu rozigotna talasemija minor). Bolest se naziva me-
nastaje energijom bogati ATP. Klinički težina varira diteranskom anemijom. Temeljno je obilježje pot-
od blage do teške hemolitičke anemije (žutica, žučni puni manjak β-lanaca (β0) ili se stvara vrlo mala
kamenci, aplastična bolesti, manjak folata). Splenek- količina β-lanaca (β+). Veći višak α-lanaca uzrokuje
tomijom se može postići dobar učinak na hemolizu težu anemiju. Stvaranjem γ-lanaca nastoji se suzbiti
jer smanjuje potrebu za transfuzijama. Splenektomiju bolest. Povoljan je učinak hidroksiureje jer dovodi
treba napraviti nakon 3. godine života. do pomaka sinteze adultnog hemoglobina prema
fetalnom. Poznato je preko 200 različitih genetskih

458 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

poremećaja koji se fenotipski očituju ovom slikom.
Glavna genetska promjena je točkasta mutacija unu-
tar genetskog kompleksa ili u začetniku gena ili u
području genskog pojačivača. Mutacija dovodi do
delecije nukleotida, zbog čega se zaustavlja proces
translacije ili dolazi do preranog završetka sinteze
globinskog lanca. Mutacija može uzrokovati i na-
stanak vrlo nestabilne m-RNA. Talasemija major
je često posljedica nasljeđivanja dvaju mutacija od
kojih svaka zahvaća β-lanac. Stvaranje δ/β fuzijskog
gena zbog prebacivanja gena s jednog člana kromo-
soma na drugi te nastaje talasemija nazvan Lepore
sindrom. Klinički bolest se očituje slikom teške ane-
mije 3-6 mjeseci nakon rođenja kada nastaje pomak
od fetalnog HbF u adultni hemoglobin (HbA) kada
se pojačava sinteza β-globinskog lanca. Prisutna je
izrazita destrukcija i ekstramedularna hematopoeza
te hepatosplenomegalija i hemosideroza. Intenziv-
na hiperplazija koštane srži dovodi do ekspanzije i
hipertrofije koštanog tkiva s formiranjem facies tha-
lassemica (izbočene kosti kranija, posebice čeonih
i tjemenih kostiju). Zbog brojnih transfuzija razvija
se sekundarna hemosideroza s oštećenjem niza or-
gana (hipofiza-hipopituitarizam, zaustavljanje rasta,
zakašnjeli pubertet, hipotireoidizam, šećerna bolest,
hipoparatireoidziam, oštećenje jetre i gonada) te srca
s nastajanjem infiltrativne hipertrofične kardiomio-
patije. Bolesnici imaju sivkast izgled, osjetljivi su na
infekcije posebice nakon splenektomije (pneumo-
kok, meningokok). Prisutna je teška hipokromna,
mikrocitna anemija uz retikulocitozu, a u perifernom
razmazu nađe se povećan broj eritroblasta, stanice
poput cilja, bazofilne punktacije eritrocita. Elektrofo-
rezom se nađe HbF, nedostaje HbA. Važno je učiniti
ispitivanje svih organskih sustava kod hemosideroze.
Liječenje talasemija provodi se transfuzijama kon-
centrata eritrocita uz primjenu folne kiseline (5mg/
dan). Terapija hemosideroze provodi se kelatorima
željeza. Parenteralni pripravak deferoksamin potreb-
no je davati u produljenoj kontinuiranoj infuziji što
povećava njegov učinak i eliminaciju željeza iz orga-
nizma. Postoji i peroralni pripravak deferasiroks ko-
jeg je potrebno dati dovoljno rano i prevenirati ošte-
ćenja organa. Splenektomija može smanjiti potrebu
za transfuzijama. Prije splenektomije potrebno je dati
pneumokokno cjepivo. Transplantacija alogenih kr-
votvornih matičnih stanica od HLA-podudarnog da-
rivatelja omogućuje povoljan terapijski učinak kod
80 % bolesnika. Talasemija intermedija: Anemija
pokazuje srednje težak stupanj (Hb 70-100 g/L) bez
sustavne potrebe za liječenjem transfuzijama. Tako
se može prezentriati i homozigotna beta talasemija s
povećanim stvaranjem HbF. Kliničku sliku uzrokuje
i delecija triju gena α–lanca i HbH se razlikuje od
beta talasemije. U ovog tipa nema povećane koli-
čine željeza u organizmu, kao niti ekstramedularne
hematopoeze.
Heterozigotna talasemija (minor) čest je oblik ta-
lasemije koji se očituje hipokromnim, mikrocitnim
eritrocitima s naznačenom anemijom ili normalnim
nalazom crvene krvne slike. Nalaz elektroforeze po-
kazuje povećan udio HbA2 (>3,5 %).
Ostale hemoglobinopatije
Anemija srpastih stanica (drepanocitoza – hemo-
globinopatija S) Deoksihemoglobin S polimerizira se
pa je hemoglobin izduženog oblika, a eritrocit popri-
ma izgled srpastog izgleda (beta kodon 6 GAG>GTG
ili zamjena valina glutaminskom kiselinom). Taj pro-
ces se odigrava u mirocirkulaciji pa uzrokuje zače-
pljenje malih krvnih žila i razvoja mikroinfarkta. U
zapadnoj Africi je česta hemoglobinopatija C gdje je
lizin zamijenjen glutaminskom kiselinom u beta-glo-
binskom lancu na istome mjestu gdje je valin zamje-
njen glutaminskom kiselinom.
Hemoglobinopatija D (zamjena glutamina u položaju
121 β-globinskog lanca s glicinom) u homozigotnom
se stanju očituje kliničkom slikom koja podsjeća na
anemiju sprastih stanica.
STEČENE HEMOLITIČKE ANEMIJE
Splenomegalija
Slezena je organ u kojem se razara najveći dio eri-
trocita, posebice se razaraju eritrociti s bilo kojim
defektom. Kod bolesnika sa splenomegalijom do-
lazi do razaranja eritrocita u crvenoj pulpi. Uzroci
Anemije | 459
splenomegalije su brojni poput hematoloških bolesti
(KML, KLL, leukemija vlasastih stanica, mijelofibroza,
akutne leukemije, limfomi, talasemija major), bole-
sti nakupljanja (Gaucherova bolest, Nieman-Pickova
bolest, galaktozemija), sustavne upalne autoimune
bolesti (SLE, RA), infekcije poput bruceloze, malarije,
tuberkuloze, mononukleoze, lišmenije (kala-azar).
Splenomegalija se javlja i u bolestima s portalnom
hipertenzijom (ciroza jetre, tromboza hepatalnih
vena –Budd-Chiariev sindrom, tromboza vene porte,
spleničnih vena).
Imunohemolitičke anemije
Imunohemnolitička anemija u odraslih može biti
uzrokovana trima vrstama protutijela:
a) Stečenim aloantitijelima nakon transfuzije ili
trudnoće, usmjerenim protiv transfundiranih
eritrocita
b) Protutijelima koja se aktiviraju na tjelesnoj tem-
peraturi, a usmjerena su protiv bolesnikovih vla-
stitih eritrocita i
c) Protutijela koja se aktiviraju na hladnoći, a
usmjerena su protiv bolesnikovih protutijela
Autoimune hemolitičke anemije (AIHA) bolesti
su koje nastaju kao posljedica gubitka tolerancije
prema vlastitim antigenima. Dijele se prema toplin-
skim osobinama autoantitijela na hemolitičke ane-
mije uzrokovane „toplim� i „hladnim� protutijelima,
a ovisno o uzroku na primarnu (nepoznat uzrok) ili
idiopatsku te sekundarnu AIHA (u podlozi druga
bolest). Glavni laboratorijski test za dokaz imuno-
hemolitičke anemije jest Coombsov antiglobulinski
test. Test se zasniva na vezivanju životinjskih protu-
tijela usmjerenih na serumske proteine koji su vezani
na membrani eritrocita. Riječ je o IgG i dijelovima
komplementa C3. Sposobnost seruma da se veže za
eritrocitnu membranu i izazove aglutinaciju naziva
se Coombsovim direktnim antiglobulinskim testom
(DAT). Indirektni Coombsov test (IAT) otkriva pri-
sutnost proteina u serumu bolesnika. U testu se inku-
biraju normalni eritrociti s bolesnikovom plazmom i
nakon toga se primjenjuje DAT.
460 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Autoimuna hemolitička anemija uzrokovana
toplim protutijelima
Autoimuna hemolitička anemija je uzrokovana pro-
tutijelima koja pokazuju najveću reaktivnost s eritro-
citnim antigenima pri tjelesnoj temperaturi od 37°C.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Kod primarne AIHA s toplim protutijela postoji spe-
cifičan imuni odgovor na membranski antigen. Kod
sekundarne AIHA autoantitijela nastanu kao pore-
mećaj imunološke regulacije, eritrociti su obloženi s
IgG, kompleksom IgG+komplement ili komplemen-
tom. Iznimno su rijetka IgM i IgA protutijela. Eritro-
citi koji nemaju ciljni antigen uredno preživljavaju.
Razgrađuju se u makrofazima ukoliko su obložena s
IgG, a ukoliko su obložena komplemetom razgrad-
nja nije izravna, već se takvi eritrociti predočavaju
antigen prezentirajućim stanicama. Eritrocite mogu
razoriti i limfociti direktnom citotoksičnom aktivno-
šću. Prevalencija raste sa starenjem, anemija uglav-
nom nastane kao komplikacija poremećaja imuno-
loškog sustava poput zloćudnih tumora limfocita,
kolagenoza, solidnih tumoria te kongenitalne imu-
nodeficijencije. Stvaranje protutijela mogu poticati i
lijekovi.
Anemija varira od blage do teške, pa čak i one s
dramatičnim tijekom. Obično se razvija postupno
no moguć je i nagli nastanak. Anemiju karakterizira
retikulocitoza, povišen indirektni bilirubin i LDH te
snižen haptoglobin. Serološki se nađe pozitivan Co-
ombsov test, najčešće DAT, a ukoliko su protutijela
prisutna u velikoj količini pozitivan je i IAT. Osim
anemije može se razviti i imuna tromocitopenija pa
je tada riječ o Evansovom sindromu.
Liječenje
Blaga anemija ne zahtjeva nikakvu terapiju, dok lije-
čenje sekundarnih oblika mora biti usmjereno pre-
ma osnovnoj bolesti. U bolesnika s težim oblikom
lijek izbora su kortikosteroidi (prednizolon 1-2 mg/
kg/dan) i terapija se koristi do normalizacije vrijed-
nosti Hb, te se doza nakon toga postupno smanjuje
i nakon nekoliko mjeseci prekida. Na kortikostero-
ide najbolji odgovor imaju primarna AIHA i sekun- mononukleoza), infekcije mikoplazmom pneumoni-
darna AIHA uz SLE. U oko 50 % bolesnika nakon je i u sklopu limfoproliferativnih bolesti.
postignute remisije moguća je ponovna pojava bo- Primarna se bolest hladnih aglutinina razvija nakon
lesti. Druga linija kod neadekvatnog odgovora na 50. godine života. U nekih bolesnika se razvije B-
kortikosteroide jest splenektomija. Ako se tada ne stanična limfoproliferativna bolest (Waldenströmova
uspije kontrolirati bolest primjenjuju se drugi imu- makroglobulinemija).
nosupresivni lijekovi (azatioprin, ciklofosfamid).
Sekundarna bolest hladnih aglutinina pojava je kod
Plazmafereze nisu učinkovite jer je više od polovice
sifilisa, infekcije mikoplazmom pneumonije, Epstein-
IgG protutijela ekstravaskularno. Imunoglobulini u
Barrovim virusom i kod drugih virusnih infekcija jer
visokim dozama ne pokazuju povoljan učinak kao
nastaje prolazna hiperprodukcija hladnih aglutinina.
kod trombocitopenija. Transfuzija se primjenjuje
Aglutinini su prisutni nekoliko dana nakon oporavka
u iznimnim situacijama s anemičnom hipoksijom,
od infekcije. Sekundarna bolest može nastati u bo-
tako da krv davatelja ne smije sadržavati specifič-
lesnika s preegzistirajućim limfoproliferativnim bo-
ne antigene. Rituksimab (anti-CD20) monoklonsko
lestima, a hladni algutinini se mogu naći i u sklopu
protutijelo također pokazuje povoljan odgovor u
drugih malignih bolesti.
oko 50-60 % bolesnika. Primarne (idiopatske) AIHA
Vaskularni poremećaji nastaju pri hlađenju krvi u
imaju nepredvidljiv tijek karakteriziran remisijama i
perifernoj cirkulaciji kad se hladni aglutinini vežu
relapsima. Desetogodišnje preživljenje je oko 70 %.
za eritrocite. Nastaje intravaskularna hemoliza koja
Prognoza sekundarne AIHA ovisi o osnovnoj bo-
se očituje cijanotičnim ekstremitetima, ušima i nosu
lesti.
(akrocijanoza). Anemija je blaga do umjerena, češće
u hladnim razdobljima.
Autoimuna hemolitička anemija uzrokovana
hladnim protutijelima
Liječenje
Ako protutijela pokazuju najjaču reaktivnost na tem-
Najbolji način liječenja bolesnika s akrocijanozom
peraturi <37°C (obično nižoj od 31°C) i uzrokuju
jest utopljavanje i zaštita od hladnoće. Splenek-
anemiju tada govorimo o AIHA uzrokovanoj hlad-
tomija nema učinka dok je učinak kortikosteroida
nim protutijelima.
znatno manji nego kod anemije s toplim protutije-
lima i ostvaruje se u oko 1/6 slučajeva. Klorambu-
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
cil i ciklofosfamid rabe se kod izraženije bolesti s
Osnovni uzrok nije do kraja objašnjen, posredovana
naglašenim anemijskim simptomima. Plazmafereze
je hladnim aglutininima, a važna je i uloga komple-
mogu biti korisne obzirom na prisutna intravasku-
menta u destrukciji. Hladni aglutinini su IgM protuti-
larna protutijela u akutnom napadaju i kod kritičnih
jela koja aglutiniraju eritrocite na temperaturi između
bolesnika. Opisuje se odgovor na liječenje interfero-
0 i 5°C, vežu se na „I� antigen eritrocitne membrane
nom alfa, dok primjena rituksimaba dovodi u 50-60
ili na njegov fetalni ekvivalent „i� antigen. Stupanj
% slučajeva do parcijalne remisije. Prognoza bolesti
hemolize ovisi o titru protutijela u serumu, njihovom
je dobra, osim kod onih u kojih je bolest nastala u
afinitetu za eritrocit, afinitetu za vezanje komple-
sklopu neke od limfoproliferativnih bolesti.
menta, te temperaturi pri kojoj protutijela uzrokuju
Paroksizmalna hemoglobinurija na hladnoću je ri-
aglutinaciju. Oštećenje eritrocita nastaje izravnom li-
jetka, ranije se opisivala u područjima endemskog
zom posredovanom komplementom ili fagocitozom
tercijarnog sifilisa, javlja se kod djece (zaušnjaci, os-
makrofaga. Dijeli se na primarnu (idiopatsku) kro-
pice), a postoji i primarni oblik. Bolest počinje stva-
ničnu bolest hladnih aglutinina, te sekundarnu koja
ranjem snažnih hemolizina (Donath-Landsteinerova
nastaje kao komplikacija virusnih bolesti (infektivna
protutijela) IgG klase usmjerene na „P� kompleks.

Anemije | 461
Bolest nastaje nakon izlaganja hladnoći. Potrebno je
bolesnike utopljavati te liječiti akutnu infekciju kod
djece uz zabrana izlaganja hladnoći.
Imunohemolitička anemija uzrokovana lijekovima
Postoje tri tipa AIHA uzrokovane lijekovima:
Penicilinski (haptenski) tip AIHA. Bolest nasta-
je 7-14 dana od početka antibiotske terapije, nakon
prekida penicilina dolazi do oporavka. Penicilin
obloži eritrocite koji vežu protutijela IgG, a ne vežu
komplement te se razgrađuju u slezeni. Sličan tip
mogu uzrokovati cefalosporini i tetraciklini.
AIHA uzrokovana primjenom alfa-metildope.
Mnogi lijekovi uzrokuju stvaranje autoantitijela na
eritrocite. Primjer je antihipertenziv alfa-metildopa.
Test je pozitivan u oko 10-35 % bolesnika koji uzima-
ju alfa-metildopu, a kod 1 % dolazi do hemolitičke
anemije. Hemoliza prestaje nakon prekida uzimanja
lijeka. Kod bolesnika koji se liječe analozima purina
(fludarabin) razvije se AIHA.
AIHA zbog odlaganja kompleksom lijek-protein
plazme (antigen-protutijelo-komplement). Molekule
lijeka ili metabolita (kinidin, probenicid, rifampicin,
cefalosporini, diklofenak, amfotericin B) ulaze u in-
terakciju s makromolekulom plazme nakon čega do-
lazi do indukcije stvaranja IgG, IgM i formiranja kom-
pleksa koji se veže na eritrocite i posljedično aktivira
komplement. Potrebno je prekinuti uzimanje lijeka.
Anemija uzrokovana fizikalnim čimbenicima
Mehanička trauma u krvnom otpoku može uzroko-
vati hemolizu na tri načina:
1. Oštećenjem eritrocita prilikom prolaska kroz
vrlo uske krvne žile na površini tijela ispod kojih
je tvrda podloga-kost; što se događa kod trkača,
sportaša, vojnika koji obavljaju marševe.
2. Oštećenjem eritrocita prolaskom kroz umjetne
valvule, arterijske presatke, umjetne graftove,
valvule s velikim gradijentom tlakom (stenoza
aortne valvule). U oko 10 % bolesnika s umjet-
nim zaliscima događa se hemolitička anemija.
Hemoliza se očituje smanjenjem vrijednosti
hemoglobina i haptoglobina, porastom LDH
462 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
i retikulocita, hemoglobinurijom te hemoglo-
binemijom uz fragmentirane eritrocite u cito-
loškom razmazu periferne krvi. U težim slu-
čajevima potrebno je učiniti ponovni kirurški
zahvat, a može se razmotriti liječenje eritropo-
etinom.
3. Intravaskularna koagulopatija s taloženjem fibri-
na unutar stijenki krvnih žila oštećuje eritrocite
što se vidi kod arterijske hipertenzije, eklampsi-
je, odbacivanja transplantiranog bubrega, meta-
staskog karcinoma i hemangioma. Ovaj tip ane-
mije je prisutan kod TTP i HUS-a te bolesnika s
DIK-om. Terapija je usmjerena prema liječenju
osnovne bolesti.
Hemolitička anemija uzrokovana biološkim
činiteljima
Brojne infekcije mogu uzrokovati intravaskularnu
hemolizu na nekoliko načina: 1. Izravna invazija in-
fektivnog mikroorganizma (malarija, bartoneloza); 2.
Otpuštanje hemolitičkih toksina (Clostridium perfrin-
gens); lecitinaza razara lecitin membrane eritrocita i
uzrokuje akutno bubrežno i jetreno zatajenje; 3. Na-
stanak autoantitijela protiv antigena eritrocita (miko-
plazma pneumonije). Virusi također mogu biti pove-
zani s nastankom autoimune hemolize kao i brojne
bakterijske infekcije (Shigella, Campylobacter, As-
pergillus) te ubodi ose, stršljena, škorpiona i pauka.
Hemolitička anemija uzrokovana kemijskim
činiteljima
Otrovanja olovom, arsenom, solima bakra (Wilsono-
va bolest, hemodijaliza) mogu uzrokovati hemolitič-
ku anemiju.
APLASTIČNA ANEMIJA
Aplastična anemija (AA) određena je pancitopenijom
i hipocelularnom koštanom srži koja nastaje zbog
smanjenog broja ili nedostatka krvotvornih matičnih
stanica.
Aplastične anemije mogu biti nasljedne i stečene
(idiopatska i sekundarna). Među nasljedne ubraja-
mo Fanconijevu anemiju, kongenitalnu diskeratozu
i Schwachman–Diamondov sindrom. Sekundarne
mogu biti uzrokovane citostaticima, zračenjem,
benzenom i drugim organskim otapalima te nekim
lijekovima (kloramfenikol, soli zlata, nesteroidni an-
tireumatici, antiepileptici, sulfonamidi, arsen). Na-
dalje virusne infekcije (parvovirus B19, HIV, EBV,
virusi hepatitisa) kao i autoimune sistemske bole-
sti (eozinofilni fascitis, SLE, GvHD), paroksizmalna
noćna hemoglobinurija, tumori timusa mogu biti
uzrok aplastične anemije. U više od polovice sluča-
jeva uzrok je nepoznat pa govorimo o idiopatskoj
aplastičnoj anemiji. Smanjen je broj matičnih stani-
ca s ekspresijom CD34 biljega dok stroma koštane
srži nije poremećena. Smatra se da matične stanice
bolesnika inkubirane zdravim stromalnim stanica-
ma ne oporavljaju svoju proliferativnu sposobnost,
dok s druge strane toksične tvari (lijekovi, virusi i
antigeni) aktiviraju imunološki sustav limfocita T i
izazivaju ubrzanu apoptozu matičnih stanica. Lu-
čenje IFN-γ dovodi do ekspresije Fas receptora na
matičnim stanicama i apoptoze. Opisan je i manjak
NK T-limfocita koji se vidi i kod drugih autoimunih
poremećaja.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Klinički znakovi odraz su smanjenog broja krvnih
stanica pa se zbog trombocitopenije javljaju znako-
vi hemoragijske dijateze poput petehija, ekhimoza
i manjih ili većih krvarenja, a zbog nedostatka eri-
trocita izraženi su simptomi i znakovi anemijskog
sindroma.
U krvnoj slici se nalazi normocitna, normokromna
anemija ili makrocitoza uz manjak ili nedostatak re-
tikulocita. Granulociti su sniženi uz urednu morfo-
logiju i povišenu leukocitnu alkalnu fosfatazu (APL)
dok je broj limfocita najčešće uredan.
Histološki nalaz koštane srži pokazuje izrazitu hipo-
plaziju sa zamjenom hematopoetskog tkiva masnim
tkivom. Glavne su stanice limfociti i plazma stanice,
a megakariociti su izrazito smanjeni ili ih se ne nala-
zi. Dijagnostičke kriteriji teške i izrazito teške apla-
stične anemije prikazuje tablica 48.8.
Tablica 48.8. Kriteriji za dijagnozu teške i izrazito teške
aplastične anemije
Teška aplastična anemija
• <25 % stanica krvotvornog sustava u biopsiji koštane srži
• <50 % stanica krvotvornog tkiva u koštanoj srži
• s <30 % hematopoetskih stanica) te prisutnost najmanje
od navedenih kriterija:
• apsolutni broj retikulocita <40 x 109/L
• apsolutni broj granulocita <0,5 x 109/L
• apsolutni broj tromboita <20 x 109/L
Izrazito teška aplastična anemija
• kriteriji za tešku aplastičnu anemiju
• apsolutni broj granulocita < 0,2 x 109/L
Liječenje
Cilj liječenja je restitucija funkcije koštane srži imuno-
supresivnom terapijom ili alogenom transplantacijom
koštane srži. Ako je uzrok anemije poznat treba ga
ukloniti i provoditi potporno liječenje transfuzijama
eritrocita i trombocita uz liječenje infekcija. Strategija
liječenja idiopatske AA ovisi o dobi i stupnju anemi-
je. U osoba mlađih od 30 godina s TAA prva linija
terapije je transplantacija alogene koštane srži ko-
jom se postiže izlječenje u više od 60 % bolesnika. U
ostalih liječenje se provodi kombinacijom kortikoste-
roida i ciklosporina, a u slučaju neadekvatnog odgo-
vora primjenjuje se antitimocitni globulin. Povoljan
terapijski učinak se očekuje kod 50-70 % bolesnika,
uz rizik od relapsa bolesti 30-40 % unutar 5 godina.
Komplikacije liječenja su razvoj drugih klonalnih po-
remećaja poput mijelodisplazije, AML ili PNH.
PAROKSIZMALNA NOĆNA
HEMOGLOBINURIJA (PNH)
PNH je klonalna bolest matičnih hematopoetskih sta-
nica zbog stečenog poremećaja membrane i poveća-
ne osjetljivosti eritrocita na hemolizu posredovanu
komplementom.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Poremećaj se očituje na svim krvnim stanicama i
može se očitovati hemolizom, sklonošću tromboza-
ma i aplastičnom anemijom.
Anemije | 463
Poremećaj nastaje zbog somatske mutacije gena pig-
A važnog za sintezu GPI koji je smješten na X kromo-
somu. Zbog nedostatka GPI na PNH stanicama nasta-
je manjak enzima acetilkolinesteraze, 5-nukleotidaze,
alkalne fosfataze i adhezijskih molekula CD48 i LFA
3 ili CD58, CD66 i CD67. Nedostaju regulatori kom-
plementa CD 55 ili DAF, CD59 ili MIRL. Nedostatak
CD 55 dovodi do nakupljanja i odlaganja aktiviranog
komplementa (C3b) i hemolize. Nedostatak CD59
molekule prati sklonost izrazitoj hemolizi zbog nedo-
statka inhibitora stvaranja C9 (kompleks komplemen-
ta). Manje vrijedan PNH klon ima prednost u rastu
u usporedbi s normalnim hematopoetskim klonom.
Temeljna značajka klasične PNH jest kronična intra-
vaskularna hemoliza s epizodama akutnih egzacerba-
cija i hemoglobinurijom kojoj prethodi napadaj boli u
trbuhu (privremene okluzije vena probavnog trakta).
U postavljanju dijagnoze važno je osim rutinske krv-
ne slike učiniti testove intravaskularne hemolize:
broj retikulocita, LDH, haptoglobin, hemoglobin i
hemosiderin u mokraći, methemalbumin u serumu.
Obično se nađe pancitopenija uz aplaziju koštane
srži, manjak željeza, folne kiseline te snižena kon-
centracija APL. Današnja dijagnostika temelji se na
određivanju stanica s manjkom GPI protočnom cito-
metrijom pomoću anti-DAF protutijela (CD55), anti-
MIRL protutijela (CD59).
Liječenje
Osim potpornog liječenja transfuzijama eritrocita
i trombocita daju se glukokortikoidi koji pokazuju
povoljan učinak na hemolitičku anemiju, a mogu
se primjeniti i androgeni. Najnovije u liječenju jest
primjena monoklonskog protutijela ekulizumab (So-
liris) koji je usmjeren na CD5 komponentu komple-
menta i tako inhibira završnu aktivaciju komplemen-
ta. Jedini način izlječenja je transplantacija alogenih
krvotvornih matičnih stanica. Također se primjenjuje
imunosupresivna terapija (ciklospirin i antitimocitni
globulin).
Izolirana aplazija crvene loze
Rijetki poremećaj s izrazitom anemijom bez prekur-
sora crvene krvne loze i retikulocita, dok su ostale
464 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
loze uredne. U citološkom nalazu koštane srži ne
nalaze se proeritroblasti, prve nezrele morfološki
prepoznatljive stanice.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Uzroci su najčešće infekcije (parvovirus B19, HIV, vi-
rusni hepatitis), imunološki poremećaji (autoimuna
hemolitička anemija, SLE, RA, alogena transplantaci-
ja AB0 nepodudarnog darivatelja), mijeloidni tumori
(KML, mijelofibroza, mijelodisplazija), limfoidni tu-
mori (KLL, LGL leukemija, Hodgkinov limfomNHL,
multipli mijelom), lijekovi (sulfametoksazol/trime-
toprim, zidovudin, fenitoin, rekombinantni humani
eritropoetin, mikofenolat mofetil).
Dijagnoza se postavlja na temelju nalaza anemije,
smanjenog broja retikulocita uz urednu mijelopoezu
i limfocitopoezu. U aplaziji crvene loze uzrokovane
parvo B19 virusom prisutni su divovski proeritroblasti.
Liječenje
Terapijski pristup se temelji na prekidu primjene lije-
ka koji je doveo do aplazije i liječenju transfuzijama
eritrocita. Infuzije imunoglobulina daju se bolesni-
cima kod sumnje na aplaziju uzrokovanu virusom
parvo B19 i najčešće je dostatna jedna infuzija 0,4 g/
kg tjelesne mase. Ako je u podlozi mogući imunološ-
ki uzrok primjenjuju se kortikosteroidi, ciklosporin
i ciklofosfamid. U zadnje vrijeme sve je više radova
koji daju pozitivne rezultate na primjenu anti-CD20
monoklonskim protutijelom (rituksimab).
Anemija zbog infiltracije koštane srži stranim
tkivom
Anemija zbog infiltracije koštane srži stranim tkivom
ili mijeloftizična anemija nastaje zbog infiltracije ko-
štane srži malignim stanicama, rjeđe granulomato-
znim tkivom, fibrozom ili produktima metaboličkih
poremećaja koji se odlažu u koštanoj srži.
Metastatski karcinomi su najčešći uzrok infiltracije i
oštećenja mikrookoliša koštane srži jer je koštana srž
nakon pluća i jetre najčešće sijelo metastaza. Zloćud-
ne hematopoetske bolesti rijetko izazivaju mijeloftizič-
nu anemiju. Sekundarna mijelofibroza može se vidjeti
kod kroničnih infekcija i otrovanja. Granulomatozne
upale, neke gljivične i bakterijske infekcije te naku-
pljanje metabolita u Gaucherovoj bolesti, Nieman-Pic-
kovoj bolesti i drugim tezaurizmozama uzrokuju sliku
mijeloftizične anemije. Dolazi do mehaničkog poti-
skivanja zdravog hematopoetskog tkiva uz inhibiciju
rasta normalnih stanica humoralnim mehanizmima te
mlađi oblici krvnih stanica ulaze u krvotok.
Klinička slika i laboratorijska dijagnostika
Anemija je normocitna, normokromna uz morfološke
promjene eritrocita (poikilocitoza, anizocitoza, prisut-
nost dakriocita, fragmentocita, leukoeritroblastoza) i
prisutnost eritroblasta i nezrelih granulocita. Katkad se
nalazi pancitopenija, smanjen broj trombocita, ili čak
povećan broj neutrofila. Klinička slika ovisi o težini
anemije te uzroku koji dovodi do ovog tipa anemije.
LITERATURA
Agarwal AM, Prchal JT. Anemia associated with marrow infil-
tration. Williams Hematology pp 613-616, McGraw-Hill, New
York, 8 Edition 2010.
Baker KR, Moake J. Hemolytic anemia resulting from physi-
cal injury to red cells. Williams Hematology pp 755-760,
McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.
Banka S. et al. Identification and Characterisation of an Inborn
Error of metabolism caused by Dihidrofolate Reductase Defi-
ciecy. Am J Hum Genet. 2011;88:216-225.
Beutler E. Disorders of Iron metabolism. Williams Hemato-
logy pp 565-606, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.
Brodsky RA. How I treat paroxysmal nocturnal hemoglobinu-
ria. Blood 2009;113:6522-6527.
Carmel R. How I treat cobalamin (vitamin B12) defiiency. Blo-
od 2008;112(6):2214-2221.
Cattan D. Pernicious anemia: What are the actual diagnostic
criteria? World J Gastroenterol 2011;17(4)543-544.
Clarke V, Weston-Smith S. Severe folate-deficiency pancyto-
penia. BMJ Case Rep. 2010;doi:10.1136.
Coelho D et al. Gene Identification for the cblD Defect of Vi-
tamin B12 Metabolism. N Engl J Med 2008;358(14):1454-1464.
Drüeke TB. Anemia Treament in Patients with Chronic Kid-
ney Disease. N Engl J Med 2013;368:387-389.
Francetić I i sur. Farmakoterapijski priručnik. Medicinska na-
klada, Zagreb, 6. Izdanje 2010.
Infiltracija koštane srži stranim tkivom dokazujemo
biopsijom koštane srži jer je citološki nalaz nedosta-
tan. Scintigrafija i radiološke metode otkrivaju mjesta
patološke pregradnje kostiju. Biopsijom je nužno ra-
zlikovati idiopatsku mijelofibrozu od ovog entiteta.
Leukoeritroblastoza se viđa i kod težih infekcija te u
hemolitičkim krizama. Za razliku od KML-e APL je
povišena i nema Ph kromosoma.
Liječenje
Potrebno je liječiti osnovnu bolest, npr tuberkuloza
tuberkulostaticima, Gaucherovu ili Fabryjevu bolest
enzimskom terapijom. Transfuzija se daje kod teške
anemije sa znakovima hipoksije. Terapija eritropoe-
tinom može biti korisna, dok se splenektomija radi
kod bolesnika sa hipersplenizmom.
Gallagher PG. The red blood cell membrane and its disorders:
Hereditary spherocytosis, eliptocytosis and related diseases.
Williams Hematology pp 617-646, McGraw-Hill, New York,
8 Edition 2010.
Green R. Folate, Cobalamin and megaloblastic anemias.
Williams Hematology pp 533-563. McGraw-Hill, New York,
8th edition 2010.
Gregg XT, Prchal JT. Anemia of endocrine disorders. Williams
Hematology pp 509-5013, McGraw-Hill, New York, 8 Edition
2010.
Gonzalez-Casas R, Jones EA, Moreno-Otero R. Spectrum of
anemia associated with chronic liver disease. World J Gastro-
enterol. 2009;15(37):4653-4658.
Inrig JK, Barnhart HX, Reddan D, et al. Effect of hemoglobin
target on progression of kidney disease: a secondary analysis
of the CHOIR (Correction of Hemoglobin and Outcomes in
Renal Insufficiency) trial. Am J Kidney Dis 2012;60:390.
KDIGO clinical practice guidelines for anemia in chronic kid-
ney disease. Kidney Int Suppl 2012;2:288.
Labar B, Hauptman E. i sur. Anemije. Hematologija, 11: 102-
157 Školska knjiga Zagreb, 4. izdanje 2007.
Lechner K, Jäger U. How I treat autoimmune hemolytic ane-
mias in adults. Blood 2010;116:1831-1838.
Lim CH et al. Anaemia after gastrectomy for early gastric can-
cer: Long-term follow-up observational study. World J Gastro-
enterol 2012;18(42):6114-6119.
Anemije | 465
Macdougall IC et al. Peginesatide for Anemia in Patients with Prchal JT. The Erythrocyte. Williams Hematology pp 409-455,
Chronic Kidney Disease not receiving Dialysis. N Engl J Med McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.
2013;368(4):320-332.
Scheinberg P, Young NS. How I treat acquired aplastic ane-
Namour F et al. Luminal expression of cubilin is impaired in mia. Blood 2012;120:1185-1196.
Imerslund-Gräsbeck syndrome with compound AMN mutati-
Segel GN, Lichtman MA. Aplastic anemia: Aquired and inhe-
ons in intron 3 and exon 7. Haematologica 2011;96(11):1715-
rited. Williams Hematology pp 463-480, McGraw-Hill, New
1719.
York, 8 Edition 2010.
Packman CH. Hemolytic anemia resulting from immune
Sertić J i sur. Katalog dijagnostičkih laboratorijskih pretraga
injury. Williams Hematology pp777-793, McGraw-Hill, New
s primjerima iz kliničke prakse, Medicinska naklada, Zagreb
York, 8 Edition 2010.
2011
Palmer SC, Navaneethan SD, Craig JC, et al. Meta-analysis:
Stabler SP. Vitamin B12 Deficiency. N Engl J Med
erythropoiesis-stimulating agents in patients with chronic kid-
2013;368(2):149-159.
ney disease. Ann Intern Med 2010;153:23.
Weatherall DJ. The Thalassemias: Disorders of globin synthe-
Pfeffer MA, Burdmann EA, Chen CY, et al. A trial of darbe-
sis. Williams Hematology pp 675-703, McGraw-Hill, New
poetin alfa in type 2 diabetes and chronic kidney disease. N
York, 8 Edition 2010.
Engl J Med 2009;361:2019.

Pitanja i odgovori

1. Koji je najbolji test za procjenu rezervi željeza u organizmu?

Koncentracija feritina u serumu.

2. Što je glavni regulator metabolizma željeza u organizmu?

Hepcidin.

3. Na kojem je kromosomu smještena mutacija gena odgovorna za nastanak PNH?

Na X kromosomu.

4. Koja je najčešća nasljedna hemolitička anemija?

Hereditarna sferocitoza.

5. Koliki je udio HbA2 u heterozigotnoj talasemiji?

Veći od 3,5 %.

466 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 49.
Tumori krvotvornog i limfnog tkiva
Igor Aurer

Tumori krvnog i limfnog tkiva čine veliku skupinu zloćudnih bolesti porijeklom iz krvotvorne matične stanice
i njenih potomaka. Potpuna klasifikacija je složena (tablica 49.1.) i podložna čestim promjenama. Trenutno
se koristi klasifikacija Svjetske zdravstvene organizacije iz 2008. godine. Ovako velik broj različitih vrsta
raka je vjerojatno posljedica činjenice da normalne hematopoetske i limfne stanice imaju neke od značajki
zloćudnih pa maligna transformacija može nastati u stanicama različitog stupnja sazrijevanja, a ne samo u
matičnim stanicama kao u većini ostalih tkiva. Tako skoro sve krvne stanice imaju sposobnosti širenja po
organizmu (tj. metastaziranja), dok velik broj zrelih limfocita živi dugo i može se, uz odgovarajući podražaj,
početi dijeliti i stvoriti klon potomaka.
U ovom poglavlju ćemo se osvrnuti na najčešće mijeloproliferativne bolesti (MPB, akutne mijeloične i lim-
foblastične leukemije (AML i ALL), tumore zrelih B odnosno T i NK stanica, koji se zajedno ubrajaju u non-
Hodgkin limfome (NHL), Hodgkinov limfom (HL) i multipli mijelom (MM).

MIJELOPROLIFERATIVNE BOLESTI
Mijeloproliferacije su tumori koji nastaju iz matične krvotvorne stanice, a karakterizirani su prekomjernim stva-
ranjem zrelih granulocita, eritrocita, trombocita ili srodnih mijeloičnih stanica. To su bolesti starije životne dobi.
Klinička slika je obično blaga, bolesti se nerijetko nađu slučajno ili se bolesnik javlja liječniku zbog smetnji uzro-
kovanih povećanom slezenom (bolovi i nelagoda pod lijevim rebrenim lukom), začepljenja krvnih žila (venska
tromboza, moždani ili srčani udar) ili znakova hipermetabolizma (subfebrilitet, noćno znojenje, svrbež kože).
Najčešća MPB je policitemija rubra vera (PRV), bolest kod koje dominira prekomjerno stvaranje eritrocita.
Učestalost bolesti je oko 2 na 100000 stanovnika. Zbog povećane mase eritrocita u krvi, krv je gušća pa

467
 Tablica 49.1. Osnovna podjela tumora krvotvornog i
limfnog sustava
Mijeloproliferativne neoplazme
Mijeloične i limfoidne neoplazme s eozinofilijom i pore-
mećajima PDGFRA, PDGFRB ili FGFR1
Mijelodisplastično-mijeloproliferativne neoplazme
Mijelodisplastični sindromi
Akutne mijeloične leukemije i srodne prekursorske neo-
plazme
Akutne leukemije dvojbenog porijekla
Prekursorske limfoidne neoplazme
Neoplazme zrelih B limfocita
Neoplazme zrelih T i NK stanica
Hodgkinov limfom
Limfoproliferativni poremećaji povezani s imunodefici-
jencijom
Neoplazme histiocita i dendritičkih stanica
je povećana sklonost venskim trombozama i mož-
danom udaru, a bolesnici nerijetko imaju i povišen
krvni tlak. Sumnja na dijagnozu se postavlja na teme-
lju povećane koncentracije hemoglobina ili hemato-
krita. Broj eritrocita nije toliko značajan jer njihova
veličina može jako varirati pa bolesnik s povećanim
brojem malih eritrocita (mikrocitoza) može biti ane-
mičan, a onaj sa smanjenim brojem velikih (makroci-
toza) policitemičan. Dijagnostička obrada bolesnika
sa sumnjom na PRV je danas znatno jednostavnija
nego ranije. Za postavljanje dijagnoze je nekada
bilo nužno dokazati da je povećanje koncentracije
hemoglobina uistinu posljedica povećanja ukupnog
volumena mase eritrocita, a ne smanjene količine
plazme u tijelu. To se može učiniti scintigrafskom
pretragom: volumen mase eritrocita i plazme. Nakon
toga je bilo potrebno isključiti bolesti koje dovode
do prekomjernog lučenja eritropoetina, najčešće su
to bolesti pluća. Prije desetak godina je otkriveno da
preko 90 % bolesnika s PRV ima mutiran i stoga traj-
no aktivan JAK2 gen čiji se protein fiziološki aktivira
nakon vezivanje eritropoetina na receptor i stimuli-
ra stvaranje eritrocita. Mutacije ovog gena mogu se
dokazati u kliničkim molekulskim laboratorijima, a
468 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
određivanje koncentracije eritropoetina je postala ru-
tinska laboratorijska pretraga tako da se danas s ove
dvije pretrage može dijagnosticirati ili isključiti PRV u
velike većine bolesnika s eritrocitozom. Cilj liječenja
je smanjiti rizik od tromboembolizama. To se može
postići smanjenjem mase eritrocita u cirkulaciji i da-
vanjem lijekova koji ometaju agregaciju trombocita.
Citoredukcija se najčešće provodi venepunkcijama
(puštanjem krvi) ili citostatikom hidroksiureom, a od
antiagregacijskih lijekova se obično koristi acetilsali-
cilna kiselina. Prognoza bolesti je razmjerno dobra,
očekivano preživljavanje je preko 10 godina, smrt-
nost je oko 30 % veća nego u općoj populaciji.
Druga češća MPB je esencijalna trombocitemija (ET).
Učestalost joj je slična ili nešto manja nego PRV. Iako
se i u 50 % ovih bolesnika nađe mutirani JAK2 gen,
u druge polovice je potrebno isključiti sekundarne
uzroke trombocitoze. To su između ostaloga kro-
nična upala (npr. autoimune bolesti), rak i manjak
željeza. Bolesnici s ET imaju blago povećan rizik pre-
težno arterijskih tromboembolizama, prvenstveno
infarkta miokarda i mozga. Bolesnici s vrlo visokim
brojem trombocita (preko 100-150 x 109/L) mogu
imati paradoksalnu sklonost krvarenju. Cilj liječena
je spriječiti tromboembolije (što se postiže acetilsa-
licilnom kiselinom i eventualno smanjenjem broja
trombocita) i krvarenje (za što je nužno smanjiti broj
trombocita). Od citoreduktivnih lijekova najčešće se
koriste hidroksiurea i interferon alfa. Prognoza bo-
lesti je dobra, očekivani životni vijek je sličan općoj
populaciji.
Kronična mijeloična leukemija (KML) je prva bolest
kod koje je dokazano da rak nastaje zbog pojave
određene genetske promjene u osjetljivim stanicama,
u ovom slučaju BCR-ABL gena, posljedice translo-
kacije t(9;22) u matičnoj krvotvornoj stanici. Godiš-
nje se dijagnosticira oko 1 novi bolesnik na 100000
stanovnika. Bolest se obično prezentira povećanim
brojem leukocita na račun zrelih i nezrelih oblika
granulocitne loze bez prekida u sazrijevanju (tj. bez
hiatus leukemicusa). Tako se u krvi nalaze segmen-
tirani i nesegmentirani neutrofilni granulociti, eozi-
nofili i bazofili, metamijelociti, mijelociti, promijelo-
citi i blasti. Bolesnici nerijetko imaju trombocitozu.
Dijagnoza se postavlja tako da se dokaže postajanje
t(9;22) ondosno hibridnog BCR-ABL gena, citogenet-
skim ili molekulskim metodama. Obzirom da KML
nekada može imitirati ET pa čak i PRV, potrebno je
kod svih MPB isključiti postojanje BCR-ABL gena. S
druge strane, svaka MPB u kojoj postoji BCR-ABL
je po današnjoj definiciji KML i treba je liječiti na taj
način. Razlog za to leži u izrazito visokoj sklonosti
transformaciji KML u akutnu leukemiju. I u PRV, a u
manjoj mjeri u ET se u manjeg broja bolesnika nakon
dosta godina može javiti akutna leukemija, no u ne-
odgovarajuće liječenoj KML se to događa u praktički
svih. Cilj liječenja KML je supresija malignog klona
što se danas postiže lijekovima koji inhibiraju ABL ki-
nazu: imatinibom, nilotinibom i dasatinibom. Uspjeh
liječenja se prati molekulski, kvantitativnim PCR-om
na BCR-ABL. U većine bolesnika se ovakvom tera-
pijom uspijeva postići trajno ili dugogodišnje povla-
čenje bolesti. U većine se, nakon prekida terapija,
bolest vraća. U slučaju neuspjeha inhibitora tirozin
kinaza, može se KML pokušati izliječiti transplantaci-
jom alogeničnih matičnih krvotvornih stanica (što je
malo složeniji i točniji naziv od transplantacije aloge-
nične koštane srži), no uz rizik smrti od komplikacija
liječenja od 20 do 30 %.
AKUTNE LEUKEMIJE (AL)
Akutne leukemije su vrlo zloćudni tumori krvotvor-
nog sustava karakterizirani zastojem sazrijevanja
krvnih stanica na razini nezrelih stanica: blasta i po-
sljedičnim izostankom stvaranja zrelih krvnih stanica.
Bolesti se javljaju u svim dobnim skupinama, a uče-
stalost im raste s dobi. ALL su najčešće zloćudne bo-
lesti djece. Čimbenici rizika za nastanak AL su izlaga-
nje genotoksinima, npr. citostaticima, ionizirajućem
zračenju, organskim otapalima itd. Visoka je učesta-
lost AL u bolesnika s prirođenim poremećajima po-
pravka DNA (teleangiektatična ataksija, Fanconijeva
anemija itd) i u osoba s Downovim sindromom.
Većina bolesnika se javlja liječniku zbog komplika-
cija supresije normalne hematopoeze, tj. infekcije
uslijed manjka granulocita, krvarenja uslijed manjka
trombocita ili slabosti uslijed anemije. Prvi korak u
dijagnostici je krvna slika. Redovito se nalaze anemi-
ja i trombocitopenija, broj leukocita može biti visok,
normalan ili čak snižen. Ako je normalan ili visok,
obično se u diferencijalnoj krvnoj slici nalaze samo
zreli oblici granulocitne loze i blasti, dok se prijelazni
oblici ne nalaze. To se zove hiatus leukaemicus. Za
dijagnozu AL je nužna punkcija i citološka analiza
koštane srži kojom se nađe povećan udio blasta (>20
% stanica s jezgrom). Iako se suvremena klasifikacija
AL temelji na citogenetskim i molekulskim značajka-
ma zloćudnih stanica (za sada je poznato preko 20
različitih vrsta), u kliničkoj dijagnostičkoj obradi su
od velike važnosti i citokemija i imunotipizacija le-
ukemija na protočnom citometru, metode kojima se
brzo može odrediti radi li se o AML, B-ALL ili T-ALL
što je važno za izbor terapije. Liječenje se provodi
kombinacijom citostatika, u AML najčešće citarabi-
nom i nekim od antraciklina (daunorubicin, idaru-
bicin) ili mitoksantronom, a u ALL vinkristinom i
glukokortikoidima uz dodatak antraciklina, ciklofos-
famida, metotreksata, merkaptopurina, asparaginaze
itd. AL s RARα-PML i BCR-ABL se liječi kombinaci-
jom citostatika i lijekova koji inhibiraju odgovarajuće
proteine: transretinoičnom kiselinom i inhibitorima
ABL kinaze, istim koji se koriste za KML. Terapija AL
je dugotrajna i naporna, bolesnici prolaze kroz duga
razdoblja pancitopenije s teškim infektivnim kompli-
kacijama. Većini odraslih treba i alotransplantacija.
Naposljetku se izliječi oko 1/3 bolesnika, dok 2/3
umru od svoje bolesti ili komplikacija liječenja. Pro-
gnostički faktori su genetske promjene, dob (mlađi
imaju bolju prognozu) i broj leukocita (oni s vrlo ve-
likim brojem leukocita imaju lošiju prognozu).
LIMFOMI
Najjednostavnija definicija limfoma u skladu s klasifi-
kacijom SZO bila bi da su to tumori koji nastaju iz tzv.
zrelih limfatičkih stanica. Pri tom je nebitno prezenti-
raju li se oni kao solidne nakupine tumorskog tkiva
(što je klasična definicija limfoma) ili su tumorske
stanice smještene u koštanoj srži i cirkuliraju krvlju
(što je klasična definicija leukemije). Tumori nezre-
Tumori krvotvornog i limfnog tkiva | 469
lih limfatičkih stanica su ALL, odnosno limfoblastični
limfomi za koje danas smatramo da su samo druga
manifestacija ALL i liječimo ih na isti način kao i nji-
hove leukemijske inačice. Podjela limfoma je vjero-
jatno najkompliciraniji dio hematopatologije. Temelji
se na morfologiji (mikroskopskom izgledu tumora),
imunološkim i genetskim značajkama tumorskih sta-
nica te kliničkoj slici. Za pravilnu dijagnozu je ve-
ćinom nužna biopsija zahvaćenog čvora ili organa
osim u nekih leukemijskih oblika bolesti za koje je
dovoljna citologija, imunofenotipizacija i citogene-
tika. Danas postoji preko 50 općepriznatih tipova
limfoma i još dvadesetak podtipova, u budućnosti
ih možemo očekivati i više (tablica 49.2.). Limfomi
većinom nastaju uslijed genetskih grešaka koje se
događaju tijekom prestrojavanja imunoglobulinskih,
odnosno gena za T stanični receptor, procesa pro-
mjene građe DNA svojstvene isključivo limfocitima

Tablica 49.2. Osnovna podjela limfoma

Tumori zrelih B stanica
• Kronična limfocitna leukemija / limfom malih limfocita
• B prolimfocitna leukemija
• Splenički limfom marginalne zone
• Leukemija vlasastih stanica
• Neklasificirani splenički B stanični limfom/leukemija
• Limfoplazmocitoidni limfom
• Ekstranodalni limfom marginalne zone limfnog tkiva vezanog uz sluznice (MALTom)
Nodalni limfom marginalne zone
• Folikularni limfom (1.-3. stupnja)
• Primarni kožni limfom centra folikla
• Limfom plaštenih stanica
• Difuzni B velikostanični limfom (DLBCL)
• Burkittov limfom
B stanični limfom, neklasificiran, sa značajkama između DLBCL i Burkittovog limfoma
B stanični limfom, neklasificiran, sa značajkama između DLBCL i klasičnog Hodgkinovog limfoma
Tumori zrelih T/NK stanica
• T prolimfocitna leukemija
• T stanična leukemija velikih granuliranih limfocita
• Kronična NK stanična limfoproliferativna bolest
• Agresivna NK stanična leukemija
• Sustavna EBV pozitivna dječja T stanična limfoproliferativna bolest
• T stanična leukemija/limfom odraslih
Limfom sličan Hydroi vacciniforme
• Mycosis fungoides
• Sezaryjev sindrom
• Primarna kožna CD30 pozitivna T stanična limfoproliferativna bolest
• Primarni kožni gama-delta T stanični limfom
Ekstranodalni NK/T stanični limfom nosnog tipa
• Enteropatski T stanični limfom
• Hepatosplenički T stanični limfom
• T stanični limfom sličan subkutanom panikulitisu
• Nespecificirani periferni T stanični limfom
• Angioimunoblastični T stanični limfom
• Anaplastični velikostanični limfom
Hodgkinov limfom
• Nodularna limfocitna predominacija
• Klasični Hodgkinov limfom

470 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

koji omogućuju stvaranje velikog broja različitih mo-
lekula potrebnih za uspješnu borbu protiv velikog
broja uzročnika infekcija. Zbog toga većina kromo-
somskih translokacija koje se javljaju u B limfomima
uključuju imunoglobulinske gene.
Godišnje se dijagnosticira oko 9 novih bolesnika s
B limfomima, 1 s T limfomom (tj. 10 s NHL) i 2,5
s Hodgkinovim limfomom na 100000 stanovnika.
Čimbenici rizika su slični kao za AL. Učestalost lim-
foma je nešto veća u osoba višeg socijalnog statusa
i jedinaca, dok je značajno veća u bolesnika inficira-
nih HIVom i onih na dugotrajnoj imunosupresivnoj
terapiji, npr. nakon transplantacije organa.
Klinički se NHL mogu podijeliti na indolentne i agre-
sivne. Indolentni limfomi mogu rasti godinama ne
stvarajući bolesniku smetnje. Iako dobro odgovara-
ju na liječenje, redovito se ponovno vraćaju (ulaze
u relaps). Liječenje se bez štete po bolesnika može
odgoditi do pojave smetnji. Agresivne NHL treba
dijagnostički obraditi i započeti s liječenjem u roku
od nekoliko tjedana, dok kod Burkittovog limfoma,
zbog vrlo kratkog vremena podvostručenja tumorske
mase, to razdoblje valja što više skratiti.
Za uspješno liječenje je osim točne dijagnoze potreb-
no odrediti proširenost bolesti, prognostičke značaj-
ke te procijeniti podobnost bolesnika za eventualno
agresivno liječenje. Proširenost bolesti procjenjuje se
kliničkim pregledom, CT-om prsnog koša, trbuha i
zdjelice te biopsijom koštane srži iz stražnje gornje
ilijačne spine. Danas se CT često nadopunjuje i po-
zitronskom emisijskom tomografijom, scintigrafskom
metodom kojom se procjenjuje intenzitet metaboliz-
ma u limfnim čvorovima i drugim organima. Poja-
čano nakupljanje radionuklida fluorodeoksiglukoze
može ukazivati na prisustvo limfomskih stanica. LDH
je jedan od najvažnijih prognostičkih biljega u NHL,
bolesnici s povišenom razinom ovog enzima imaju
lošiju prognozu.
Najindolentniji limfomi su ekstranodalni limfomi
marginalne zone (eMZL). To su tumori koji se javljaju
u organima izloženim dugotrajnoj antigenoj stimula-
ciji, obično u sklopu kronične infekcije. U nas su to
najčešće želudac uslijed infekcije Helicobacter pylori
i očna adneksa uslijed infekcije klamidijom. Većina
ovih limfoma regredira na odgovarajuću antibiotsku
terapiju, rijetko koji bolesnik umre od svoj bolesti.
Folikularni limfom je najčešći indolentni nodal-
ni limfom. Vrlo je rijedak u djece. Karakterizira ga
translokacija t(14;18) kojom se inhibitor apoptoze
bcl2 dovodi pod kontrolu promotora za teški lanac
imunoglobulina. Kod nas na folikularni limfom ot-
pada oko 20 % svih NHL, nešto je rjeđi nego u SAD
i zapadnoj Europi, a češći nego u istočnoj Europi i
Dalekom istoku. Bolest je u pravilu neizlječiva, ali in-
dolentnog tijeka. Liječenje se provodi kombinacijom
citostatika, glukokortikoida i monoklonskog protuti-
jela rituksimaba koji se veže na CD20 antigen, prisu-
tan na stanicama većine B limfoma. Mlađim bolesnici
se u drugoj ili trećoj liniji mogu liječiti i transplan-
tacijom vlastitih (autolognih) matičnih krvotvornih
stanica. Prosječno preživljavanje je 11 godina, 15 %
bolesnika nikada ne treba terapiju.
B-velikostanični limfom je najčešća vrsta limfoma di-
ljem svijeta. Javlja se u svih dobnih skupina. Na njega
otpada oko 1/3 svih NHL. Biološki i genetski je hete-
rogen, nema tipičnih genetskih promjena, a obično
se nalazi poremećen izražaj bcl2 ili bcl6 gena. Liječi
se kombinacijom rituksimaba i citostatika, povreme-
no i zračenjem. Najčešće se koristi CHOP kombina-
cija (ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, predni-
zon). Izliječi se oko 60 % bolesnika. Mlađi bolesnici,
koji ne odgovore na prvu liniju, se liječe intenzivnom
kemoterapijom i autotransplantacijom.
T limfomi su većinom agresivni i imaju lošu progno-
zu. Liječe se CHOPom ili još agresivnije, nerijetko i
autotransplantacijom. Usprkos tome su rezultati loši,
petogodišnje preživljavanje je oko 30 %. NK-stanični
limfomi sadrže PGP, pumpu koja iz stanice izbacuje
velik broj toksina, između ostalih i citostatike koje
sadrži CHOP. Zbog toga je prognoza ovih bolesti do
sada bilo loša. Zadnjih godina su se pojavili radovi,
većinom iz istočne Azije gdje su ovi limfomi češći,
koji ukazuju da su NK-stanični limfomi osjetljivi na
asparaginazu, enzimski citostatik koji cijepa amino-
kiselinu asparagin, a nije supstrat za PGP. Moguće
je da će ovakvo liječenje poboljšati prognozu ovih
bolesti.
Tumori krvotvornog i limfnog tkiva | 471
Burkittov limfom je rijetka, ali vrlo agresivna vrsta
limfoma koja se obično javlja u djece i mlađih odra-
slih. Karakteriziran je translokacijom t(8;14) kojom
se myc gen dovodi pod kontrolu promotora za teški
lanac imunoglobulina. Uslijed toga su praktički sve
stanice limfoma u staničnom ciklusu pa je vrijeme
podvostručenja tumorske mase vrlo kratko. Ako se
dijagnoza postavi na vrijeme, kombinacijom inten-
zivne kemoterapije temeljene na visokim dozama
metotreksata i rituksimabom može se izliječiti oko 80
% bolesnika. Na početku terapije se nerijetko javlja
sindrom lize tumora. Ovaj poremećaj nastaje uslijed
jako povećane razgradnje tumorskih stanica. U krvi
raste koncentracija završnih produkata razgradnje
DNA i intracelularnih iona: mokraćne kiseline, kalija
i fosfora u krvi. Sindrom lize tumora može dovesti do
akutnog zatajenja bubrega i drugih teških metabolič-
kih komplikacija. Prevenira se davanjem alopurino-
la, lijeka koji inhibira ksantin oksidazu, zadnji enzim
u procesu sinteze mokraćne kiseline iz nukleinskih
baza, stimuliranjem stvaranja mokraće lijekovima i
obilnim infuzijama te davanjem natrijevog bikarbo-
nata koji zalužuje urin što olakšavaju izlučivanje ka-
lija i urata mokraćom.
Kronična limfocitna leukemija (KLL) je najčešća le-
ukemija osoba bijele rase i najčešći uzrok kronične
limfocitoze (broj limfocita > 5x109/L) u nas. Limfom-
ski oblik bolesti se zove i limfom malih limfocita.
Tumorske stanice izražavaju imunološke biljege B
loze i CD5. Citogenetskim tehnikama se nalaze pro-
mjene 11, 12. 13. ili 17. kromosoma s mutacijama
ATM, Rb i p53 gena. Godišnje se dijagnosticiraju oko
4 nova bolesnika na 100000 stanovnika, uglavnom
u starijim dobnim skupinama. Bolest je indolentnog
tijeka, oko 1/3 bolesnika treba liječiti odmah pri po-
stavljanju dijagnoze, 1/3 nakon nekog vremena, dok
1/3 bolesnika nikada ne zatreba liječenje leukemi-
je. KLL može dovesti do povećanja limfnih čvorova
i slezene, smanjenja broja granulocita, eritrocita ili
trombocita, sklonosti infekcijama zbog hipogama-
globulinemije i autoimunih poremećaja. Povećan
broj limfocita je klinički beznačajan, limfociti ni kada
ih ima vrlo mnogo ne ometaju normalan protok krvi
kroz kapilare. KLL se liječi kombinacijom citostatika
472 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
i rituksimaba. U mlađih je najučinkovitija kombina-
cija fludarabina i ciklofosfamida dok se stariji liječe
klorambucilom. Autoimuni poremećaji se liječe glu-
kokortikoidima, a česte infekcije u hipogamaglobu-
linemičnih se mogu prevenirati infuzijama intraven-
skih imunoglobulina. Od prognostičkog značenja su
citogenetika, proširenost bolesti, supresija normalne
hematopoeze, neke imunološke značajke i razina
beta 2 mikroglobulina u krvi. Prosječno preživljava-
nje je 7-9 godina.
Hodgkinov limfom je agresivni limfom koji nastaje
iz B-limfocita. Javlja se u svim dobnim skupinama,
a najveća mu je učestalost u mlađih odraslih. Postoji
nekoliko histoloških podtipova od kojih je nodular-
na limfocitna predominacija, zbog razlika u biologiji
i odgovoru na liječenje, izdvojena, dok su ostale vr-
ste grupirane u tzv. klasični Hodgkinov limfom. Bo-
lest je ime dobila po engleskom liječniku Thomasu
Hodgkinu koji je u prvoj polovici 19. stoljeća opisao
veći broj bolesnika s, kako se smatralo, ovom bo-
lešću. Nedavno se, pažljivim pretraživanjem arhive
patologije bolnice u kojoj je radio, ustanovilo da je
samo nekoliko zaista imalo HL, dok su ostali imali
NHL ili tuberkulozni limfadenitis. Bolest je karakte-
rizirana tumorskim stanicama tipičnog izgleda, tzv.
Reed-Sternbergovim stanicama s dvije velike jezgre
i izraženim nukleolusom, tako da izgledaju kao so-
vino oko. Slične mononuklearne stanice zovu se
Hodgkinove stanice. Tumorske stanice izražavaju
CD30, dok su biljezi B loze uglavnom negativni.
Zato je porijeklo tumorskih stanica dokazano mo-
lekulskim metodama tek nakon desetljeća istraživa-
nja. Liječenje se provodi kombinacijom citostatika i
zračenjem. Najčešće se koriste ABVD (doksorubi-
cin, vinblastin, bleomicin, dakarbazin) ili BEACOPP
(bleomicin, etopozid, doksorubicin, ciklofosfamid,
vinkristin, prokarbazin, prednizon). Bolesnici koji
ne odgovore na prvu liniju se liječe intenzivnom ke-
moterapijom i autotransplantacijom. Dob, spol (biti
muškarac je nepovoljno) i proširenost bolesti utječu
na prognozu. Od laboratorijskih nalaza mogu biti
važni brzina sedimentacije eritrocita (SE), krvna slika
(leukocitoza, limfopenija i anemija su nepovoljni) i
razina albumina u krvi. SE, razina bakra i haptoglo-
bina u krvi se mogu koristiti kao tumorski biljezi jer
im razina u krvi prati aktivnost bolesti. Izlječenje se
postiže u oko 80 % bolesnika.
MULTIPLI MIJELOM
Multipli mijelom (MM) je najčešći zloćudni tumor
plazma stanica. Bolest je češća u muškaraca, crnaca
i starijih, ne javlja se u djece. Tumor je građen od
atipičnih plazma stanica koje najčešće luče komple-
tan imunoglobulin (paraprotein), rjeđe samo lake
lance, dok su nesekretorni mijelomi rijetki. Tumor-
ske stanice se obično nalaze difuzno u koštanoj srži,
rjeđe u fokalnim nakupinama. Naziv plazmocitom
se u anglosaksonskoj literaturi koristi isključivo za
tumorski oblik bolesti, dok se u srednjeeuropskoj
upotrebljava kao sinonim za MM. Zbog velike količi-
ne tzv. paraproteina smanjena je sinteza ostalih imu-
noglobulina. Laki lanci prolaze kroz glomerularni fil-
tar u primarni urin, odakle ih reapsorbiraju bubrežni
tubuli. Kada im koncentracija dovoljno naraste, talo-
že se u tubulima i dovode do bubrežnog zatajenja.
Plazma stanice luče i različite faktore od kojih neki
aktiviraju osteoklaste, a drugi suprimiraju stvaranje
eritrocita. Zato je multipli mijelom karakteriziran po-
javom monoklonskog imunoglobulina ili slobodnih
lakih lanaca u serumu ili urinu, osteolizama i poslje-
dičnim frakturama patološki promijenjenih kostiju,
povećanom sklonošću infekcijama, anemijom kro-
nične upalne bolesti i bubrežnim zatajenjem. Za po-
stavljanje dijagnozu je potrebno dokazati postojanje
dva od tri uvjeta:
1. tumor građen od plazma stanica ili infiltracija
srži plazma stanicama
2. M komponenta: monoklonski imunoglobulin ili
povećana koncentracija slobodnog lakog lanca
u krvi ili urinu
3. osteolize.
Bolest kod koje postoji M komponenta, ali ne i ostali
faktori zove se monoklonska gamapatija. Otprilike 5
% bolesnika s monoklonskom gamapatijom godišnje
razvije MM.
Monoklonski imunoglobulin se dokazuje imunofik-
sacijom. Prema vrsti imunoglobulina koji luče, dijele
se MM na κ ili λ te IgG, IgA ili lakih lanaca. IgD i IgE
su rijetki. Ova podjela nije od kliničkog značenja. M
komponenta se u IgG MM obično nalazi u frakciji
gama globulina, a kod IgA u frakciji beta globulina.
Laki lanci se ne vide u elektoforezi serumskih pro-
teina, zbog smanjene sinteze normalnih Ig nalazi se
hipogamaglobulinemija. Slobodni laki lanci se mogu
kvantificirati u serumu ili 24 h urinu ili se njihovo
postojanje može dokazati u slučajnom uzorku urina.
Potonja pretraga je nekada bila poznata kao određi-
vanje Bence-Jones proteina.
MM se liječi ako postoji oštećenje ciljnih organa: ko-
stiju (osteolize ili hiperkalcemija), bubrega ili nor-
malne hematopoeze (najčešće anemija). U terapiji
se koriste deksametazon i drugi glukokortikoidi, ci-
tostatici melfalan, ciklofosfamid, vinkristin i doksoru-
bicin, inhibitor proteasoma (stanične strukture koja
izlučuje razgrađene proteine iz stanice) bortezomib
te imunomodulatori talidomid i lenalidomid. Mlađe
bolesnike je nakon postizanja remisije korisno au-
totransplantirati. Bolesnicima se, osim ovih lijekova
koji djeluju protutumorski, daju i lijekovi koji inhibi-
raju funkciju osteoklasta i tako sprečavaju razgradnju
kosti, tzv. bifosfonati. Najčešće se koriste pamidro-
nat, zoledronat i ibandronat.
Bolest je praktički neizlječiva, karakterizirana re-
misijama i relapsima. Najvažniji prognostički faktor
je razina beta 2 mikroglobulina u krvi. Bolesnici s
vrlo visokom koncentracijom imaju lošu prognozu.
Osim toga na prognozu utječu koncentracija albumi-
na, citogenetske i molekulske promjene. Prosječno
preživljavanje transplantiranih bolesnika je oko 8, a
netransplantiranih oko 6 godina.
Tumori krvotvornog i limfnog tkiva | 473
LITERATURA
Aurer I, Gašparov S, Kralik M, Balenović A, Huić D, Šantek
F, Duletić-Načinović A, Pejša V, Ostojić-Kolonić S, Grah JJ.
Dijagnostika i liječenje limfoma – drugi hrvatski konsenzus.
Liječ Vjesn 135:63-76, 2013.
Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE, ur. Essential haematology,
5. izd. Wiley-Blackwell, Malden, 2008.
Labar B, Hauptmann E, ur. Hematologija, Školska knjiga, Za-
greb 2007.
Swedlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein
H, Thiele J, Vardiman JW, ur. WHO classification of tumours
of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, Lyon 2008.
Tefferi A, Rajkumar SV, Kantarjian HM, Adjei AA, ur. Neopla-
stic hematology and medical oncology. Mayo Foundation for
Medical Education and Research, Rochester, 2008.
Vrhovac B, Jakšić B, Reiner Ž, Vucelić B, ur. Interna medicina,
Naklada Ljevak, Zagreb, 2008.

Pitanja i odgovori

1. Porast kojih parametara crvene krvne je tipičan za policitemiju rubru veru?

Koncentracije hemoglobina i hematokrita.

2. Što je to hiatus leukemicus i za koju skupinu bolesti je karakterističan?

Nalaz diferencijalne krvne slike u kojoj se nalaze blasti i zreli granulociti bez prijelaznih oblika. Karakterističan
je za akutne leukemije.

3. Koji biokemijski parametar je jedan od najvažnijih prognostičkih faktora u NHL-u?

LDH.

4. Koncentracija kojih tvari raste u krvi u sindromu lize tumora?

Urata (ili mokraćne kiseline), kalija i fosfora.

5. Kada se u bolesnika s multiplim mijelomom neće naći monoklonski šiljak u elektroforezi serumskih proteina?
Ako mijelomske stanice luče samo lake lance ili se radi o nesekretornom mijelomu.

474 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 50.
Laboratorijska dijagnostika
monoklonskih gamapatija
Danica Matišić

Monoklonske gamapatije (MG) spadaju u veliku skupinu imunoproliferativnih bolesti koje karakterizira
prisutnost monoklonskog proteina (M-proteina) u serumu i/ili urinu koje stvara klon B-stanica podvrgnut
genetičkoj transformaciji. Takvo stanje može biti posljedica benigne ili maligne bolesti koja se onda manife-
stira kliničkim simptomima od asimptomatskog neprogresivnog stadija do malignog agresivnog multiplog
mijeloma ili limfoma. Najčešći M-protein (M-P) je IgG, rjeđe IgA i IgM, a vrlo rijetko IgD i IgE.
Benigna monoklonska gamapatija podrazumijeva koncentraciju M-proteina manju od 10 g/L, normalnu
sintezu neuključenih imunoglobulina, negativan nalaz monoklonskih slobodnih lakih lanaca kapa (SLL κ)
ili lambda (SLL λ) tipa u serumu i/ili urinu i odsutnost porasta koncentracije M-proteina nakon nekoliko na-
rednih godina. Monoklonski sintetizirane SLL-e imunoglobulina prije 150 godina prvi puta je opisao doktor
Bence Jones pa su po njemu i dobili eponim Bence Jonesovi proteini – BJP.
Malignu monoklonsku gamapatiju (multipli mijelom) prati koncentracija M-proteina veća od 10 g/L, odsut-
nost sinteze ostalih neuključenih imunoglobulina, te pozitivan nalaz monoklonskih SLL κ ili λ tipa u serumu
i/ili urinu kod 80-96 % bolesnika s multiplim mijelomom sa intaktnim M-Ig.
Najvažniji kriterij je svakako kliničko napredovanje bolesti i M-proteina, jer kod većine bolesnika s multiplim
mijelomom postoji eksponencijalni porast koncentracije M-proteina u serumu. Stoga je od iznimne važnosti
praćenje koncentracije M-proteina u serumu kao i redovito preispitivanje prisutnosti monoklonskih SLL κ
ili λ tipa.
Poseban problem su monoklonski teški lanci gama, alfa i mi (bolest teških lanaca), koji se ne mogu uočiti
elektroforezom proteina u serumu. Njihova imunološka identifikacija provodi se s pomoću posebne imuno-
kemijske metode, imunoselekcije.
Treba uzeti u obzir i teškoće pri otkrivanju M-IgD i M-IgE koji se u serumu nalaze u vrlo malim koncentra-
cijama. Osim toga M-IgD se razgrađuje in vivo i in vitro pa na elferogramu nalazimo samo difuznu vrpcu

475
proteina, dok M-IgM stvara komplekse ili polimere
koji su netopljivi i ostaju na startu.
Dijagnoza monoklonskih gamapatija osniva se na
nalazu klasičnog triasa:
• nalazu monoklonskog proteina u serumu i/ili
urinu
• infiltraciji koštane srži plazma stanicama (>10
%) te
• nalazu osteolitičkih žarišta.
Laboratorijska dijagnostika MG obuhvaća nalaz M-
proteina. Da bi klinička i laboratorijska evaluacija
bolesnika s monoklonskim gamapatijama bila ujed-
načena u svim centrima koji se bave tom dijagnosti-
kom, Američko društvo patologa kao i Međunarodna
radna grupa za multipli mijelom još su 2000. godine
dali detaljne smjernice:
• dogovoren je termin monoklonskog proteina.
Naime, u literaturi i svakodnevnoj upotrebi po-
stoji mnogo termina koje treba izbaciti poput
paraprotein, mijelom protein, monoklonska
komponenta. Predložen je termin M-protein, jer
takav termin ne implicira ništa što se odnosi na
strukturu molekule a niti nameće postojanje po-
sebnih patoloških simptoma kod bolesnika. M-
pik koristimo kod denzitometrijskog očitavanja
ili opisa elferograma
• zatim su dane upute koje bolesnike treba testirati
• određen je slijed testiranja te
• preporučene metode koje treba koristiti pri de-
finiranju M-proteina.
Smjernice za kliničku i laboratorijsku evaluaciju bo-
lesnika s monoklonskim gamapatijama mogu se sa-
žeti u osam točaka:
1. Potrebno je učiniti elektroforezu proteina u se-
rumu i/ili urinu za svakog bolesnika kod kojeg
postoji sumnja na poremećaj plazma stanica.
2. Za definiranje abnormalnog razreda i tipa pro-
teina indicirana je imunofiksacija (IF). Iako je
nalaz elektroforeze negativan kod suspektnih
bolesnika treba napraviti imunofiksaciju. Imu-
476 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
nofiksacija nije indicirana ako se ustvrdi poli-
klonska hipergamaglobulinemija.
3. M-protein je potrebno pratiti denzitometrijski.
Budući se radi o molekuli koja je monoklonski
sintetizirana, te se zbog tog razlikuje od normal-
nog proteina, nefelometrijski ili turbidimetrijski
nećemo moći odrediti ukupnu vrijednost M-
proteina. To posebno vrijedi kod vrlo visokih
vrijednosti M-proteina posebno kod M-IgM i M-
IgA. Imunofiksaciju nije potrebno ponavljati ako
se nisu dogodile promjene u migraciji M-prote-
ina te ako se nije pojavila nova monoklonska
vrpca.
4. Za sve bolesnike s poremećajem plazma stanica
potrebno je nefelometrijsko ili turbidimetrijsko
određivanje imunoglobulina da bi se ustvrdila
koncentracija i ostalih neuključenih imunoglo-
bulina.
5. Svim bolesnicima s MM-om, Waldenström ma-
kroglobulinemijom, amiloidozom i srodnim bo-
lestima potrebno je odrediti prisutnost i dnevno
izlučivanje BJP.
6. Kod bolesnika s MM-om, Waldenström ma-
kroglobulinemijom te amiloidozom potrebno
je pratiti promjene u koncentraciji M-proteina
svakih 1-2 mjeseca, dok se takvo praćenje kod
MGUS preporučuje jednom na godinu.
7. Hiperviskozni sindrom traži zamjenu plazme s
indikacijama utemeljenima na kliničkim značaj-
kama (viskozitet i elektroforezu seruma treba
napraviti prije nego se plazma zamijeni radi us-
poredbe koncentracija M-proteina).
8. Krioglobuline treba napraviti u svih bolesnika s
M-proteinom koji pokazuju osjetljivost na hlad-
noću, posebno kod onih sa M-IgM (vidi poglav-
lje 51).
Isti autori dali su preporuke i za metode koje treba
koristiti u evaluaciji M-proteina:
1. Za elektroforetsko razdvajanje proteina u se-
rumu preporučuje se koristiti elektroforetske
tehnike visoke djelotvornosti na agarozi ili ka-
 pilarnu zonsku elektrofore- elektroforeza proteina u serumu
zu što omogućuje vrlo rano
otkrivanje M-proteina.
2. Imunoglobuline treba kvan- vizualni pregled
titativno odrediti nefelome-
trijski kad god je to moguće.
Određivanje imunoglobuli-
na turbidimetrijski je također klinička sumnja ili
bez promjena
dovoljno osjetljivo za rutin- prisutnost monoklonske vrpce
ske potrebe.
3. Razred i tip M-proteina
odrediti imunofiksacijom BJP ? imunofiksacija MP

odnosno imunoselekcijom.
Metoda imunosubtrakcije je
moguća samo uz kapilarnu elektroforeza proteina u urinu definicija M-P
(100x ukonc. urin) (određ. razreda i tipa)
zonsku elektroforezu.
4. Kvantifikaciju M-proteina
izvoditi denzitometrijski.
negativan prisutan denzitometrijska
5. Kontrola kvalitete evalu- nalaz BJP kvantifikacija M-P
acije M-proteina: ključna
komponenta interne kon-
trole je izravan kontakt la- imunofiksacija 100x
boratorijskog stručnjaka s ukoncentriranog urina
kliničarem o slučaju koji je
neuobičajene prirode ili ako
postoji bilo kakav nesklad u opisni nalaz + klinička
informacija daju
nalazu.
tumačenje nalaza
Zbog potrebe da se svim bole-
snicima s MM-om, Waldenström Slika 50.1. Laboratorijski dijagnostički postupnik za definiranje M-proteina: nakon vizu-
makroglobulinemijom, amiloido- alnog pregleda elferograma te nalaza monoklonske vrpce ili ako postoji klinička sumnja
na postojanje MG-e, potrebno je učiniti imunofiksaciju te definirati razred i tip monoklon-
zom i srodnim bolestima odredi skog proteina. Kod prve obrade pacijenta potrebno je također provjeriti postojanje sin-
prisutnost i dnevno izlučivanje teze monoklonskih SLL imunoglobulina.
monoklonskih SLL, cijeli postu-
pak laboratorijskog evaluiranja
bolesnika s MG je bio znatno atinin i kalcij. Isto tako od hematoloških pokazatelja
produžen (slika 50.1.). Naime, potvrdi li IF nalaz M- potrebno je odrediti sedimentaciju eritrocita, hemo-
proteina potrebno je provjeriti da li njegovu sintezu globin i diferencijalnu krvnu sliku.
prati i sinteza monoklonskih SLL imunoglobulina. U Opisani dijagnostički postupnik za definiranje M-
tu svrhu potrebno je učiniti elektroforezu i IF 24-sat- proteina doživio je promjene posljednih godina ra-
nog uzorka urina koji mora biti ukoncentriran naj- zvojem reagensa koji omogućuje rutinsko kvantita-
manje 100 x. tivno određivanje SLL κ i λ tipa te njihovog omjera
Osim navedene elektroforeze i IF od ostalih testova u serumu kao i u nativnom uzorku 24 satnog urina
u serumu još se određuju beta-2-mikroglobulin, kre- (slika 50.2.).

Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija | 477

 elektroforeza proteina u serumu
vizualni pregled
bez promjena
prisutnost monoklonske vrpce
BJP ?
kvantitativno određivanje
SLL κ i λ u serumu/urinu
te njihovog omjera κ/λ
opisni nalaz + klinička
informacija daju
tumačenje nalaza
Slika 50.2. Preporučeni laboratorijski dijagnostički postupnik za definiranje M-proteina
koji je danas u upotrebi: nakon definiranja razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina
imunofiksacijom izmjere se kvantitativno SLL te odredi κ/λ omjer
Monoklonski SLL su važan tumorski biljeg za identi-
fikaciju i praćenje bolesnika s multiplim mijelomom
lakih lanaca i amiloidoze lakih lanaca. Međutim,
treba naglasiti da istovremeni porast koncentra-
cije SLL κ i λ tipa u normalnom omjeru, ne znači
monoklonsku sintezu lakih lanaca iako su njhove
pojedinačne vrijednosti patološke odnosno izvan
referentnog intervala. Poliklonski porast lakih lana-
ca može biti znak nekog drugog upalnog procesa.
Kod raznih nemalignih bolesti, kao što su reuma-
toidni artritis, SLE i kronično bubrežno zatajenje,
mogu se naći pozitivni SLL u povišenim vrijedno-
stima. Visoke doze penicilina ili aspirina prije sku-
pljanja 24 satnog urina mogu dati lažno pozitivan
rezultat.
Biljeg monoklonske sinteze la-
kih lanaca je poremećen omjer
SLL κ/λ tipa i to povišen kod
monoklonske sinteze SLL κ tipa
odnosno snižen kod monoklon-
ske sinteze SLL λ tipa.
Uvođenje određivanja κ/λ omje-
klinička sumnja ili ra SLL u rutinu povećalo je klinič-
ku važnost BJP-a i znatno skratilo
cijeli postupak laboratorijske di-
jagnostike monoklonskih gama-
imunofiksacija MP patija.
Referentne vrijednosti i referen-
tni intervali za κ/λ omjer u seru-
definicija M-P mu i 24 satnom urinu određeni
(određ. razreda i tipa)
su na velikom broju ispitanika s
različitim imunoproliferativnim
bolestima. Istraživanje je provela
denzitometrijska grupa kliničkih kemičara na čelu
kvantifikacija M-P
s profesorom Robertom Kyle iz
klinike Mayo. Test je tako uve-
den u rutinu prije 10-tak godina.
Prvi komercijalni test priredili su
profesor Bradwell i njegov tim
stručnjaka. Test je od Free Light
Chain dobio skraćeno ime FLC
koje ćemo često naći u literaturi.
Serumska koncentracija mo-
noklonskih SLL tj. BJP korelira
samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov
nalaz može biti neovisan biljeg MG. Jedan posebno
važan aspekt BJP je njihov kratak poluživot: 2-3 sata
za kapu i 5-6 sati za lambdu, što je 150 puta kraće
vrijeme od 21 dana koliko je, primjerice, poluživot
IgG. Tako koncentracija BJP omogućuje vrlo brzu
procjenu učinka kemoterapije: 92-128 dana brže
nego koncentracija M-Ig ali isto tako i raniju procje-
nu relapsa bolesti.
Koncentracija BJP ovisi o sintezi plazma-stanica, ali
isto tako i o bubrežnom klirensu. Uz poliklonsku
sintezu imunoglobulina i/ili bubrežnog oštećenja,
naći ćemo 10-20 puta povećanu koncentraciju BJP u
serumu. Bubrežno izlučivanje BJP raste s koncentra-

478 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

cijom u serumu, ali značajno opada kada je visoka
koncentracija kombinirana s bubrežnim oštećenjem.
Odlaganje BJP je izravno odgovorno za patološke
procese tubulointersticijskog oštećenja. Nakon fil-
tracije, BJP se vežu na heteromerične receptore koji
se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju
reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endoci-
toze i hidrolize BJP se vraćaju kao aminokiseline
u cirkulaciju. BJP su otrovni zbog potencijalnih in-
terakcija sa svim dijelovima nefrona. Nefrotoksični
potencijal BJP ovisan je o njihovom fizikalno-ke-
mijskom sastavu kao i utjecaju okoliša u kojem se
nalaze.
Sakupljanje 24-satnog urina nije standardizirani po-
stupak, mukotrpno je za bolesnike i uglavnom ne-
točno. Laboratorijski postupak evaluacije monoklon-
skog proteina znatno se produljuje zbog obrade
urina. Stoga mnogi kliničari predlažu da se obrada
24-satnog urina ukloni iz primarnog postupnika za
definiranje M-proteina.
Katzmann J. A. i Hill P. G. pokazali su na velikom
broju bolesnika, u dvije odvojene studije, da zbog
oštećenja bubrega u približno 25 % bolesnika s MG
možemo naći lažno pozitivne nalaze BJP u serumu,
odnosno lažno negativne u urinu.
Može se zaključiti da primjenjujući program odre-
đivanja ukupnih proteina u serumu, elektroforeze
proteina u serumu, kvantitativnog određivanja SLL
κ i λ tipa u serumu kao i njihovog omjera eliminira-
mo potrebu sakupljanja 24-satnog urina, što znatno
skraćuje proces definiranja M-proteina. Mokraća će
se obrađivati diskontinuirano, tj. kod raznih dispro-
teinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je M-
protein već identificiran.
Kao što je već navedeno, prvi korak za definiranje
M-proteina je elektroforeza proteina u serumu. Da-
nas najraširenija elektroforetska tehnika je kapilar-
na zonska elektroforeza (CZE), elektroforeza viso-
ke djelotvornosti, koja je razvijena u ranim ‘90.-im
godinama. Odvajanje analita bazirano je na veliči-
ni i naboju samog analita u unutrašnjosti kapilara
koje su napravljene iz posebnih silaniziranih vrsta
stakla negativno nabijenih, promjera 15 – 20 µm.
Kapilare su napunjene puferom u kojem proteini

Elektroforeza proteina u serumu

Frakcija Rez % Ref. int. % Rez. g/L Ref. int. g/L

Albumin 39,7 55,8 - 66,1 36,9 40,2 - 47,6
Alpha 1 2,8 2,9 - 4,9 2,6 2,1 - 3,5
Alpha 2 7,7 7,1 - 11,8 7,2 5,1 - 8,5
Beta 6,5 8,4 - 13,1 6,0 6,0 - 9,4
Gamma 43,3 11,1 - 18,8 40,3 8,0 - 13,5

Ukupni proteini: 93 (60 - 78)

A/G: 0,66 (0,80 - 2,00)

Komentar:

Voditelj laboratorija:

Slika 50.3. Elektroforeza proteina u serumu - nađen monoklonski protein

Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija | 479

 Elektroforeza proteina u serumu

Frakcija Rez % Ref. int. % Rez. g/L Ref. int. g/L

Albumin 43,6 55,8 - 66,1 39,2 40,2 - 47,6
Alpha 1 4,1 2,9 - 4,9 3,7 2,1 - 3,5
Alpha 2 10,4 7,1 - 11,8 9,4 5,1 - 8,5
Beta 10,8 8,4 - 13,1 9,7 6,0 - 9,4
Gamma 31,1 11,1 - 18,8 28,0 8,0 - 13,5

Ukupni proteini: 90 (60 - 78)

A/G: 0,77 (0,80 - 2,00)

Komentar:

Voditelj laboratorija:

Slika 50.4. Elektroforeza proteina u serumu – hipergamaglobulinemija, (Klinička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).

putuju od katode prema anodi pomoću elektro-
foretskog toka. Međutim, zbog posebno visokog
negativnog naboja na stijenkama kapilara javlja se
elektroendoosmotski tok kao otpor pozitivnom
naboju pufera, koji je znatno veći od elektroforet-
skog toka, i razdvaja proteine u smjeru od anode
prema katodi. Proteini se razdvajaju pri naponu
od 7600 V.
Primjeri elektroforeza proteina u serumu dobiveni
KZE-om nalaze se na slikama 50.3. i 50.4.
Metoda izbora za određivanje razreda i tipa M-pro-
teina je imunofiksacija koja se može učiniti unutar
jednog sata. Uzorak seruma nanosi se razrijeđen na
katodni kraj prema preporučenim razrjeđenjima za
svaki imunoglobulin. U slučaju izrazito povećane
koncentracije imunoglobulina unatoč razrjeđenju
može doći do učinka suviška antigena. Optimalna
precipitacija s komercijalnim antiserumima događa
se kod koncentracije imunoglobulina oko 10 g/L.
Zato se preporuča napraviti kontrolnu elektroforezu
prije izvođenja same imunofiksacije kako bi se uoči-
lo kolika je vrpca samog M-proteina.
Imunofiksacija je dvostupanjski postupak koji se sa-
stoji od elektroforeze na agarozi i imunoprecipitaci-
je. Proteini se razdvoje elektroforetski na oštre vrpce
u gelu. Na svaku vrpcu doda se specifični antiserum
za molekulu pojedinačnih razreda i tipa imunoglo-
bulina. Ako je prisuan monoklonski sintetizirani ra-
zred teškog lanca imunoglobulina, nastat će netopivi
kompleks s antiserumom koji se tada može obojiti i
detektirati (slika 50.5.).
Određivanje razreda i tipa M-proteina moguće je ta-
kođer odrediti na sustavu za KZE, tj. metodom imu-
nosubtrakcije. Metoda se osniva također na principu
imunoprecipitacije antigena: IgG, IgA ili IgM kao i
vezanih κ i λ lakih lanaca sa specifičnim antiseru-
mom.
Katzman J. A. i ostali stručnjaci iz Mayo klinike, koji
su intenzivno pratili i ispitivali mogućnosti testa za
kvantitativno određivanje SLL u serumu i/ili urinu
kod MG od samih početaka, smatraju da je vrijeme
za promijene laboratorijske evaluacije bolesnika
s MG. Pa tako naglašavaju da dosadašnji opsežan
postupnik u laboratorijskoj dijagnostici MG treba

480 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 HYDRAGEL IF 2/4 sebia seruma i/ili urina u kombinaciji s IF i elektrofore-
ELP G A M K L ELP G A M K L
3 4
zom urina.
10056/00371

Međutim dosadašnji rezultati korištenja testa za

1 2
ELP G A M K L ELP G A M K L u prvom koraku dijagnostičkog postupnika, prikaza-
Slika 50.5. Imunofiksacija četiri različita uzorka seruma u kojima su
nađeni monoklonski proteini: uzorak br. 1.: nađen monoklonski IgA κ
tipa; uzorak br. 2.: nađen monoklonski IgG λ tipa; uzorak br. 3.: nađen
slabo izražen monoklonski IgM λ tipa; uzorak br. 4.: nađen monoklon-
ski IgG λ tipa (Klinička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).
selektivno koristiti. U većini slučajeva kao početni
postupnik još uvijek se koristi elektroforeza prote-
ina u serumu, IF seruma, određivanje κ/λ omjera
kvantitativno određivanje SLL u serumu i/ili urinu
pokazuju da bi se inicijalni probir laboratorijske di-
jagnostike MG trebao sastojati od elektroforeze pro-
teina u serumu i κ/λ omjera slobodnih lakih lanaca
imunoglobulina u serumu (slika 50.6.). IF seruma i
obradu urina treba uključivati u dijagnostički postu-
pnik mnogo selektivnije.
Primjeri mogućih nalaza, koje možemo definirati već
ni su na slikama 50.7., 50.8., 50.9. i slici 50.10.
Ako ne postoji klinička sumnja na MG, nalaz na slici
50.10. pokazuje da ne postoji potreba za IF ni seru-
ma ni urina. Može se zaključiti da nalaz elektroforeze
proteina u serumu uz kvantitativno određivanje SLL
omogućuje jednostavni i učinkoviti inicijalni dijagno-
stički probir za MG poput multiplog mijeloma i Wal-
denström makroglobulinemije. Stoga se kod takvih
bolesnika elektroeforeza i IF urina kao i IF seruma
preporuča koristiti selektivno.

elektroforeza kvantitativno određivanje

proteina u serumu
+ SLL: κ i λ i κ/λ omjer

1. SLL: κ/λ omjer 2. SLL: κ/λ omjer 3. SLL: κ/λ omjer 4. SLL: κ/λ omjer
izvan ref. intervala izvan ref. intervala unutar ref. intervala unutar ref. intervala
SPE: nalaz uredan SPE: nalaz M-Ig SPE: nalaz M-Ig SPE: nalaz uredan

prisutan prisutan intaktni prisutan M-Ig i BJP

BJP M-Ig i BJP intaktni M-Ig nisu prisutni

Slika 50.6. Primarni postupnik laboratorijske dijagnostike monoklonskih gamapatija prema kojem možemo već u prvom koraku procije-
niti barem četiri slučaja: ako u prvom koraku uz uredan nalaz elektroforeze proteina u serumu imamo povišen ili snižen κ/λ omjer, nalaz
ukazuje na sintezu BJP; ako elektroforezom proteina u serumu nađemo monoklonsku vrpcu M-proteina i povišen ili snižen κ/λ omjer,
nalazi ukazuju na sintezu i monoklonskog intaktnog Ig i sintezu BJP; ako elektroforezom proteina u serumu nađemo monoklonsku vrpcu
M-proteina a κ/λ omjer unutar referentnog intervala može se zaključiti da postoji sinteza monoklonskog intaktnog imunoglobulina
bez popratne sinteze BJP; uredan nalaz elektroforeze proteina u serumu i κ/λ omjer unutar referentnog intervala ukazuje da ne postoji
sinteza ni M-Ig ni BJP

Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija | 481

 Referentni
Rezultat Jedinica interval Opaska
Proteini 65 g/L 66 - 81
IgG 5,87 g/L 7,0 - 16
IgA 0,60 g/L 0,7 - 4
Slika 50.7. Uredan nalaz IgM 0,62 g/L 0,4 - 2,3
elektroforeze proteina u se- Slobodni laki lanci Ig KAPA 3500,00 mg/L 3,30 - 19,40 SLL: κ/λ omjer
tipa – serum izvan ref. intervala
rumu uz povišen κ/λ omjer: Slobodni laki lanci Ig 10,90 mg/L 5,71 - 26,30 SPE: nalaz uredan
pregledom elferograma LAMBDA tipa – serum
moglo bi se zaključiti da Sl. laki lanci Ig KAPA / Ig 319,00 0,26 - 1,65
LAMBDA – omjer (serum)
osim hipogamaglobuline-
mije nema nekih dodatnih
Imunofiksacija (serum) vidi pod LAKI LANCI Ig (BJP) IMUNOFIKSACIJA
osobitosti. Međutim, para- Laki lanci Ig (BJP) NAĐENI MONOKLONSKI SLOBODNI LAGANI LANCI IMUNOGLOBULINA KAPA TIPA
lelno određeni κ/λ omjer – imunofiksacija seruma
Laki lanci NAĐENI MONOKLONSKI SLOBODNI LAGANI LANCI IMUNOGLOBULINA KAPA TIPA
pokazao je da postoji sin- Ig (BJP) – imunofiksacija urina
teza BJP κ tipa što je očito
i uzrok izostanka sinteze ELEKTROFOREZA PROTEINA U SERUMU
Referentni
ostalih neuključenih imu- Rezultat Jedinica interval
noglobulina. Prema primar- Albumin % 47,4 % 55,8 - 66,1
Albumin 30,8 g/L 40,2 - 47,6
nom nalazu napravljena Alfa 1 globulini % 9,5 % 2,9 - 4,9
je naknadno i IF seruma Alfa 1 globulini 6,2 g/L 2,1 - 3,5
i urina na BJP koja je do- Alfa 2 globulini % 17,9 % 7,1 - 11,8
Alfa 2 globulini 11,6 g/L 5,1 - 8,5
datno potvrdila postojanje Beta globulini % 16,9 % 8,4 - 13,1
monoklonske sinteze BJP Beta globulini 11,0 g/L 6 - 9,4
κ tipa, (Klinička jedinica za Gama globulini % 8,3 % 11,1 - 18,8
Gama globulini 5,4 g/L 8 - 13,5
specijalnu biokemiju, KBC
Omjer A/G 0,90 0,8 - 2
Zagreb).

SLL: κ/λ omjer izvan

ref. intervala
SPE nalaz M proteina
Referentni
Rezultat Jedinica interval Opaska
Slika 50.8. Nalaz mo- (S) Proteini 68 g/L 66 - 81
(S) IgG 25,82 g/L 7,0 - 16
noklonske vrpce na elfero- (S) IgA 0,11 g/L 0,7 - 4
gramu kao i izrazito povi- (S) IgM 0,09 g/L 0,4 - 2,3
šen κ/λ omjer: primjer na (S) Slobodni laki lanci Ig 5420,00 mg/L 3,30 - 19,40
KAPA tipa
slici br. 50. 8. je vrlo jasan. (S) Slobodni laki lanci Ig 2,18 mg/L 5,71 - 26,30
Već samim pregledom elfe- LAMBDA tipa
(S) Sl. laki lanci Ig KAPA / 2480,00 0,26 - 1,65
rograma uočena je vrlo oš- Ig LAMBDA – omjer
tro odvojena monoklonska Vrijeme validacije nalaza: 09.01.2012 12:13
vrpca, odnosno monoklon- Imunofiksacija (serum)
ski – pik (M-pik) a izrazito Laki lanci Ig (BJP)
povišen κ/λ omjer pokazuje – imunofiksacija seruma
Laki lanci
da sintezu intaktnog M-IgG Ig (BJP) – imunofiksacija urina
prati i sinteza monoklonskih
ELEKTROFOREZA PROTEINA U SERUMU
SLL κ tipa. Iz kvantitativno Referentni
određenih imunoglobuli- Rezultat Jedinica interval
(S) Albumin 37,1 % 55,8 - 66,1
na može se zaključiti da je (S) Albumin 25,2 g/L 40,2 - 47,6
došlo do supresije sinteze (S) Alfa 1 globulini 7,2 % 2,9 - 4,9
ostalih neuključenih imu- (S) Alfa 1 globulini 4,9 g/L 2,1 - 3,5
(S) Alfa 2 globulini 15,6 % 7,1 - 11,8
noglobulina kao i potpuno
(S) Alfa 2 globulini 10,6 g/L 5,1 - 8,5
izgubljene kontrole sinteze (S) Beta globulini 8,5 % 8,4 - 13,1
slobodnih lakih lanaca imu- (S) Beta globulini 5,8 g/L 6 - 9,4
noglobulina, (Klinička jedi- (S) Gama globulini 31,6 % 11,1 - 22,1
(S) Gama globulini 21,5 g/L 8,0 - 15,9
nica za specijalnu biokemiju, (S) Omjer A/G 0,59 0,8 - 2
KBC Zagreb). (S) Imunofiksacija NAĐEN MONOKLONSKI IMUNOGLOBULIN G KAPA TIPA

482 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Referentni
Rezultat Jedinica interval Opaska
Proteini 94 g/L 66 - 81
IgG 44,06 g/L 7,0 - 16
Beta-e-mikroglobulin 11,04 mg/L 0,6 - 2,0
Slobodni laki lanci Ig KAPA 8,92 mg/L 3,30 - 19,40
tipa – serum SLL: κ/λ omjer unutar
Slobodni laki lanci Ig 34,90 mg/L 5,71 - 26,30 ref. intervala
LAMBDA tipa – serum SPE: nalaz M-proteina
Sl. laki lanci Ig KAPA / Ig 0,26 0,26 - 1,65
LAMBDA – omjer (serum)

Slika 50.9. Nalaz oštro

izdvojene monoklonske
Imunofiksacija (serum) NAĐEN MONOKLONSKI IMUNOGLOBULIN G LAMBDA TIPA
vrpce i κ/λ omjer unutar
referentnog intervala: kvan-
ELEKTROFOREZA PROTEINA U SERUMU titativno određeni imuno-
Referentni
Rezultat Jedinica interval globulini pokazuju da pik
Albumin % 37,1 % 55,8 - 66,1
Albumin 34,9 g/L 40,2 - 47,6
monoklonskog imunoglo-
Alfa 1 globulini % 4,3 % 2,9 - 4,9 bulina, koji se jasno uočava
Alfa 1 globulini 4,0 g/L 2,1 - 3,5 na elferogramu, pripada
Alfa 2 globulini % 9,6 % 7,1 - 11,8 M-IgG. Međutim κ/λ omjer
Alfa 2 globulini 9,0 g/L 5,1 - 8,5
Beta globulini % 6,9 % 8,4 - 13,1 je unutar referentnog inter-
Beta globulini 6,5 g/L 6 - 9,4 vala što znači da još uvijek
Gama globulini % 42,1 % 11,1 - 18,8 postoji kontrola sinteze SLL,
Gama globulini 39,6 g/L 8 - 13,5
Omjer A/G 0,59 0,8 - 2
(Klinička jedinica za specijal-
nu biokemiju, KBC Zagreb).

Referentni
Rezultat Jedinica interval Opaska
(S) Proteini 74 g/L ležei bolesnici 66 - 78
ambulantni bol. 66 - 81
(S) IgG 8,54 g/L 7,00 - 16,00
(S) IgA 2,83 g/L 0,70 - 4,00
(S) IgM 0,49 g/L 0,40 - 2,30 FLC normalan
SPE normalna
(S) Slobodni laki lanci Ig KAPA tipa 13,40 mg/L 3,30 - 19,40
(S) Slobodni laki lanci Ig LAMBDA 21,90 mg/L 5,71 - 26,30
tipa (S)
(S) Sl. laki lanci Ig KAPA / Ig LAMBDA 0,61 0,26 - 1,65
– omjer
SLL: κ/λ omjer je
unutar ref. intervala
SPE: nalaz uredan

ELEKTROFOREZA PROTEINA U SERUMU

Referentni
Rezultat Jedinica interval
(S) Albumin 63,0 % 55,8 - 66,1
(S) Albumin 46,6 g/L 40,2 - 47,6
(S) Alfa 1 globulini 3,2 % 2,9 - 4,9
(S) Alfa 1 globulini 2,4 g/L 2,1 - 3,5
(S) Alfa 2 globulini 10,4 % 7,1 - 11,8
(S) Alfa 2 globulini 7,7 g/L 5,1 - 8,5
Slika 50.10. Uredan nalaz
(S) Beta globulini 10,7 % 8,4 - 13,1 elektroforeze proteina u
(S) Beta globulini 7,9 g/L 6,0 - 9,4 serumu kao i κ/λ omjera:
(S) Gama globulini 12,7 % 11,1 - 18,8
nalazi ukazuju da ne postoji
(S) Gama globulini 9,4 g/L 8,0 - 15,9
(S) Omjer A/G 1,70 0,8 - 2,0 sinteza ni M-Ig ni BJP, (Kli-
(S) OMJER 2 1,00 nička jedinica za specijalnu
(S) Imunofiksacija NORMALNA biokemiju, KBC Zagreb).

Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija | 483

LITERATURA
Bradwell A. R. Serum Free Light Chain Analysis (plus Hevyli-
te). The Binding Site Group Ltd. Birmingham 2013.
Cockwell P, Hutchison CA. European trial of free light chain
removal by extended haemodiylysis in cast nephropathy. He-
matology Meeting Reports 2008;2:17-18.
Goeken JA, Keren DF. Introduction to the report of the con-
sensuc conference on monoclonal gammopathies. Arch Pat-
hol Lab Med 1999;123:104-105
Holding S, Spradbery D, Hoole R et al. Use of serum free
light chain analysis and urine protein electrophoresis for de-
tection of monoclonal gammopathies. Clin Chem Lab Med
2011;49:83-88.
Hutchison CA, Basnayake K, Cockwell P. Serum free light
chain assessment in monoclonal gammopathy and kidney
disease. Nature Reviews 2009;5:621-627.
Kallemuchikkal U, Gorevic PD. Evaluation of Crioglobulins.
Arch Pathol Lab Med 1999;123:119-125
Katzmann JA. Screening Panels for Monoclonal Gammopathi-
es: Time to Change. Clin Biochem Rev 2009;30:105-111.
Keren DF, Alexanian R, Goeken JA, Gorevic PD, Kyle R, To-
mar RH. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of
patiens with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab
Med 1999;123:106-107
Lakshminarayanan R, Li Y, Jantpour K, Beckett L, Jialal I. De-
tection by Immunofixation of M Proteins in Hypogammaglo-
bulinemic Patients With Normal Serum Protein Electrophore-
sis Results. Am J Clin Pathol 2007;127:746-751.
Matišić D. Nova strategija u dijagnostici monoklonskih gama-
patija. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S22-S23.
Tatsas AD, Jagasia MH, Chen H, McCurley TL. High-Re-
solution Serum/Urine Electrophoresis or Marrow Biop-
sy With Immunohistochemical Analysis? Am J Clin Pathol
2010;134:139-145.

Pitanja i odgovori

1. Koji su osnovni kriteriji dijagnostike monoklonskih gamapatija?

Nalaz monoklonskog proteina u serumu i/ili urinu, infiltracija koštane srži plazma stanicama (>10 %), te nalaz
osteolitičkih žarišta.

2. Koji je prvi korak u dijagnostici MG?

Elektroforeza proteina u serumu.

3. Po čemu razlikujemo benigne od malignih MG?

Benigna MG podrazumijeva koncentraciju M-proteina manju od 10 g/L, normalnu sintezu neuključenih imuno-
globulina, negativan nalaz BJP u serumu i/ili urinu i odsutnost porasta koncentracije M-proteina nakon neko-
liko narednih godina. Malignu MG-u prati koncentracija M-proteina veća od 10 g/L, odsutnost sinteze ostalih
neuključenih imunoglobulina, te pozitivan nalaz BJP u serumu i/ili urinu kod 80-96 % bolesnika s multiplim
mijelomom s intaktnim M-Ig.

4. Kojom metodom se može napraviti tipiziranje BJP?

Za određivanje tipa BJP potrebno je napraviti imunofiksaciju najmanje 100x ukoncentriranog uzorka 24 satnog
urina.

5. Što pokazuju rezultati desetgodišnjeg korištenja određivanja κ/λ omjera u serumu?

Pokazuju da bi se inicijalni probir laboratorijske dijagnostike MG trebao sastojati od elektroforeze proteina u
serumu i κ/λ omjera u serumu.

484 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 51.
Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija
Dragana Šegulja, Danica Matišić

Krioglobulini su imunoglobulini ili imunoglobulinski kompleksi koji precipitiraju na temperaturi 4-37oC i ne

nalaze se u serumu zdravih osoba. Nužno ih je razlikovati od ostalih fenomena u hladnom kao npr. hladnih
aglutinina i kriofibrinogena.
Krioglobulini se nalaze u brojnim infektivnim, bubrežnim, jetrenim, autoimunim, hematološkim i neoplastič-
nim bolestima i tada govorimo o sekundarnoj krioglobulinemiji. Međutim, moguće ih je naći i u odsutnosti
navedenih bolesti. Kada ne postoje dokazi o prisutnosti bolesti s kojima se krioglobulinemija najčešće pove-
zuje, prisutnost krioglobulina u krvi definira se kao esencijalna miješana krioglobulinemija (EMK). Proteini
koji spontano reverzibilno precipitiraju pri temperaturi nižoj od 37oC spominju se još 1933. godine kad su
Wintrobe i Buell opisali neobičan slučaj precipitacije proteina na niskoj temperaturi u serumu bolesnice s
multiplim mijelomom. 1947. godine su Lerner i Watson pokazali da hladno precipitirajući proteini po svojoj
elektroforetskoj pokretljivosti spadaju u gamaglobuline i nazvali ih krioglobulinima, a njihovu prisutnost u
krvi krioglobulinemijom. Kako simptomi (purpura, atralgija, slabost) nisu bili tipični za određenu bolest uve-
den je terminEMK. Naziv miješana krioglobulinemija obuhvaća nalaz više od jednog razreda imunoglobulina
sa krioprecipitacijskim svojstvom.
Prisutnost krioglobulina u serumu uzrokuje sistemsku upalu koja se najčešće manifestira kao bubrežna bolest
i kožne lezije. Kliničke manifestacije miješane krioglobulinemije (Tablica 51.1.) posljedica su nakupljanja
imunokompleksa na stijenci krvnih žila pri niskoj temperaturi (sistemski vaskulitis, glomerulonefritis) te
aktivacije komplementa koja dovodi do lokalnog oštećenja tkiva odnosno kožnih lezija.
Iako patofiziologija krioglobulinemija nije još potpuno jasna, uz intravaskularne depozite krioglobulina u
bolesnika se često nalazi sniženi hemolitički komplement (CH50) i komponente komplementa (C3, C4) kao
kemotaktičnih čimbenika upale. Cirkulirajući visokomolekularni kompleksi krioglobulina mogu izazvati i
hiperviskozni sindrom.

485
 Tablica 51.1. Kliničke manifestacije miješane krioglobu-
linemije
Purpura
Raynaudov sindrom
Atralgija
Periferni neuritis
Glomerulonefritis
Sistemski vaskulitis
Hiperviskoznost
KRIOPRECIPITACIJA
Svojstvo krioglobulina da se talože u hladnom koristi
se u laboratorijskom radu za njihovu detekciju. Pre-
cipitaciju krioglobulina na temperaturi od +4oC u in
vitro uvjetima nazivamo krioprecipitacija. Količina i
brzina stvaranja precipitata ovisi o tipu krioglobuli-
nemije, njihovoj koncentraciji te temperaturi na kojoj
dolazi do precipitacije. Iako točan mehanizam krio-
precipitacije nije poznat, dokazane su konformacijske
promijene u Fab području nekih krioglobulina pri ni-
skim temperaturama. Pretpostavlja se da do stvaranja
krioprecipitata dolazi u dva koraka. U prvom, neovi-
snom o temperaturi, nastaju imunokompleksi između
imunoglobulina M koji posjeduje reumatoidnu aktiv-
nost (IgM-RF, IgM-antiglobin) i imunoglobulina G, a
u drugom, ovisnom o temperaturi, dolazi do među-
sobnog nekovalentnog povezivanja imunoglobulina
M i time do agregacije imunokompleksa.
Kompleksi heparina i fibronektina te fibrina i fibrino-
gena (kriofibrinogenemija) kod bolesnika na antiko-
agulantnoj terapiji mogu precipitirati na hladnom te
stoga biti čest uzrok lažno pozitivnih rezultata.
PODJELA KRIOGLOBULINEMIJA
Krioglobulini (Mr oko 200 kDa) mogu biti posljedica
monoklonske ili poliklonske sinteze imunoglobulina.
Najčešće su IgG i IgM razreda koji posjeduje reuma-
toidnu aktivnost te se veže na C-terminalni kraj Fc do-
mene IgG kao antigena. Prema sastavu krioprecipita-
ta krioglobulinemije dijelimo po Brouetu na tri tipa:
• Tip I - karakterizira prisutnost monoklonski
sintetiziranog krioglobulina, rjeđe monoklonski
486 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
sintetiziranih lakih lanaca imunoglobulina. Kon-
centracija krioglobulina u serumu često prelazi
5g/L. Ovaj tip krioglobulinemije čini 10-15 %
svih krioglobulinemija, a nalazi se kod multi-
plog mijeloma, Waldenström makroglobuline-
mije i drugih limfoproliferativnih poremećaja.
• Tip II – čini 50-60 % svih krioglobulinemija, a
predstavlja miješanu krioglobulinemiju karakteri-
ziranu prisutnošću imunokompleksa koji uz mo-
noklonsku sadrže i poliklonsku komponentu. Naj-
češće se nalazi monoklonski IgM-RF u kompleksu
sa poliklonskim IgG. Koncentracija krioglobulina
u serumu je uglavnom između 1 i 5 g/L.
• Tip III – predstavlja miješanu krioglobulinemi-
ju s koncentracijom krioglobulina manjom od
1 g/L. Ovaj tip krioglobulinemija karakterizira
prisutnost isključivo poliklonski sintetiziranih
krioglobulina. Udio krioglobulinemija tipa III
u ukupnom broju krioglobulinemija je 25-30 %.
Sekundarne miješane krioglobulinemije se javljaju u
infektivnim bolestima (HCV, HBV, HIV, CMV), au-
toimunim bolestima (SLE, RA, SS), kroničnoj bolesti
jetre. Većina miješanih krioglobulinemija (tip II i III)
povezuje se s HCV infekcijom. Povezanost između
kronične HCV infekcije i miješane krioglobulinemije
bolje je uočena uvođenjem molekularne dijagnostike
u laboratorijsku dijagnostiku hepatitisa C. Pozitivan
nalaz HCV-RNA nađen je u 80 % bolesnika s miješa-
MIJEŠANA KRIOGLOBULINEMIJA
1 2 3 4 5
EMK I AIP MK MK
? HCV HBV, HIV,
CMV i dr.
Slika 51.1. Shematski prikaz kliničke i etiološke podijele miješane
krioglobulinemije: (1) EMK – esencijalna miješana krioglobuline-
mija; (2) i (3) EMK i MK pridružena hepatitisu C kod bolesnika sa
autoimunim poremećajem (AIP); (4) miješana krioglobulinemija
pridružena hepatitisu C; (5) miješana krioglobulinemija povezana
sa drugim virusima
nom krioglobulinemijom, a HCV-RNA se nalazi i u
sastavu krioprecipitata.
Prevalencija miješane krioglobulinemije u općoj je
populaciji 1:100000. Češće se nalazi na području juž-
ne Europe nego sjeverne Europe i Amerike i to tri
puta češće kod žena nego kod muškaraca. Pozitivni
nalaz krioglobulina nalazi se kod 15-20 % HIV-pozi-
tivnih te kod 15-25 % bolesnika sa vaskulitisom (slika
51.1.).
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
KRIOGLOBULINEMIJA
Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija sastoji
se od dva dijela:
• kvalitativnog - prepoznavanja prisutnosti krio-
precipitata
• kvantitativnog - određivanja koncentracije i sa-
stava krioprecipitata
Budući proteini koje analiziramo imaju tendenciju
precipitacije na niskoj temperaturi, postupak uzor-
kovanja i pripreme seruma nužno je provesti na tem-
peraturi od 37oC. Krv se vadi u unaprijed zagrijane
epruvete, koje se slijedeća dva sata zadržavaju u ter-
mostatu na temperaturi od 37oC i tek tada centrifu-
giraju. Proces zgrušavanja krvi mora se provoditi na
temperaturi od 37oC kako ne bi došlo do taloženja
krioglobulina i njihovog „zarobljavanja� u ugrušku.
Najčešći uzrok lažno negativnih rezultata je neod-
govarajuća separacija seruma od ostalih krvnih ele-
menata.
Da bi detektirali i najmanje krioprecipitate (koncen-
tracije krioglobulina < 1g/L) potrebno je imati do-
voljnu količinu seruma za nastanak okom vidljivog
krioprecipitata. Stoga je preporuka vaditi najmanje
10-20mL krvi za pretraživanje krioglobulina.
Kvalitativna analiza precipitata sastoji se od in vitro
izazvane krioprecipitacije. Uzorci seruma se pohra-
njuju na +4oC tijekom 7 dana. Dnevnom vizualnom
provjerom uzoraka već nakon 72 sata u uzorku s
prisutnim krioglobulinima može se naći krioprecipi-
tat. Krioprecipitat je bijele boje, a po strukturi može
biti želatinozan, u obliku kristala ili pahuljičast (slika
51.2.).
Za očitavanje prisutnosti krioprecipitata, pogotovo
kod malih koncentracija krioglobulina, neophod-
no je iskusno i educirano tehničko osoblje. U lite-
raturi se preporuča alikvot uzorka čuvati na 37oC
radi usporedbe sa uzorkom pohranjenim na +4oC i
lakše detekcije precipitata, ali u praksi to najčešće
nije moguće provesti. Zbog nemogućnosti procjene
prisutnosti precipitata u lipemičnim uzorcima, takvi
se uzorci smatraju neprihvatljivima za pretraživanje
krioglobulina.
Veličinu krioprecipitata moguće je izraziti kao krio-
krit, tj. postotni volumni udio precipitata u odnosu
na ukupni volumen seruma. No, budući se kriokrit
očitava prije ispiranja nespecifično adheriranih pro-
teina i nije standardiziran prema volumenu, veličini
epruvete, uvjetima centrifugiranja nije dobra mjera
aktivnosti bolesti prilikom uspoređivanja rezultata.
Svi pozitivni uzorci idu u daljnju obradu tijekom koje
se određuje količina i sastav krioprecipitata. Detaljan
opis krioglobulina zahtjeva rigorozan postupak ispi-
ranja precipitata, testiranje na reverzibilnost kriopre-
cipitata zagrijavanjem, kvantifikaciju krioglobulina,
evaluaciju monoklonskog krioglobulina metodom
imunofiksacije. Precipitat se odjeljuje, a nespecifično
Slika 51.2. Serum nakon krioprecipitacije na +4 °C.
Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija | 487
 Alb α1 α2 β γ glogulini Alb α1 α2 β γ glogulini Alb γ glogulini

A B C

Slika 51.3. Usporedbom nalaza elektroforeze proteina seruma zagrijanog na 37 °C i nakon krioprecipitacije moguće je procjeniti uspješ-
nost odvajanja krioprecipitata. Slika A prikazuje elferogram proteina seruma s pozitivnim krioglobulinima otopljenim zagrijavanjem
na 37 °C. Krioglobulini u električnom polju putuju najčešće u području beta i gama globulina. Slika B prikazuje elferogram proteina u
supernatantu nakon krioprecipitacije na +4 °C. Uočava se nestanak frakcije u području gama globulina tj. krioglobulina. Slika C prikazuje
elferogram otopljenog i zagrijanog krioprecipitata koji sadrži krioglobuline i primjese albumina, (Klinička jedinica za specijalnu biokemiju,
KBC Zagreb).

adherirani proteini se ispiru s hladnom fiziološkom mg/L. Za tipizaciju krioglobulina prema Brouetu po-
otopinom. Kako bi bili sigurni da u odjeljenom pre- trebno je utvrditi radi li se o monoklonskoj ili o poli-
cipitatu doista postoje krioglobulini (gamaglobulini) klonskoj sintezi krioglobulina. Imunofiksacija je me-
moguće je provesti elektroforezu zagrijanog i ispra- toda izbora za ispitivanje klonalnosti imunoglobulina
nog precipitata (slika 51.3.). Odijeljeni precipitat se i tipiziranje krioglobulina. Oštra vrpca na agaroznom
potom otapa s PBS-om na 37oC, i nanosi na ploče za gelu nakon imunofiksacije ukazuje na monoklonsku
radioimunodifuziju (RID) (slika 51.4.). Na RID plo- sintezu krioglobulina (slika 51.5.).
čama određuje se koncentracija imunoglobulina A,
G i M u precipitatu, a zbrajanjem koncentracija po-
jedinih imunoglobulina dolazi do količine ukupnog
krioprecipitata.
Iako je do nedavno bilo opće prihvaćeno da do kon-
centracije krioglobulina od 60 mg/L nije potrebno
određivati tip krioglobulinemije, danas se preporuča
tipizirati krioprecipitat već kod koncentracije od 20

Slika 51.5. Imunofiksacija uzorka s pozitivnim krioglobulinima: re-

Slika 51.4. Ploča za kvantitativno određivanje krioglobulina radi-
oimunodifuzijom
akcija s antiserumima na gama(γ) i alfa(α) teški lanac te lambda(λ)
laki lanac ukazuje na poliklonsku sintezu krioglobulina G i A ra-
zreda. U reakciji s antiserumima na mi(μ) teški lanac i kapa(κ)
laki lanac u istom položaju se uočava oštra vrpca što ukazuje
na monoklonsku sintezu krioglobulina IgM kapa tipa. Prisutan
monoklonski krioglobulin IgM kapa tipa i poliklonski sintetiziran
krioglobulin IgG upućuje na krioglobulinemiju tipa II, (Klinička je-
dinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).

488 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

Testiranje na prisutnost krioglobulina treba se provo-
diti samo onda kada postoje jasni klinički simptomi,
manifestacije bolesti uzrokovane hladnoćom te prisut-
nost bolesti koju prati krioglobulinemija. Prema smjer-
nicama za kliničku i laboratorijsku evaluaciju bolesni-
ka s monoklonskim gamapatijama Američkog društva
kliničkih kemičara pretraživanje na krioglobuline treba
napraviti kod svih bolesnika sa monoklonskim prote-
inom koji pokazuju osjetljivost na hladnoću, posebice
kod onih sa monoklonskim proteinom IgM razreda.
Na krioglobulinemiju treba posumnjati i kada koncen-
tracija RF ne odgovara kliničkoj slici (lažno niski RF)
jer ako je većina IgM antiglobina osjetljiva na tempera-
turu gubi se u ugrušku tijekom obrade uzorka.

LITERATURA
Attaelmannan M, Levison SS. Understanding and iden-
tifying monoclonal gammopathies, Clinical Chemistry
2000;46(8):1230-1238
Ferri C. Mixed cryoglobulinemia, Orphanet Journal of rare
diseases 2008;3:25
Franco Dammacco: HCV Infection and Cryoglobulinemia,
Springer-Verlag, Italia, 2012.
Kallemuchikkal U, Gorevic PD. Evaluation of cryoglobulins,
Arch Pathol Lab Med 1999;123:119-125
Keren DF, Alexanian R, Goeken J, Gorevic P, Kyle RA, Tomar
RH. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of pati-
ents with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med
1999;123:106-7
Lothar Thomas: Clinical Laboratory Diagnostic, Th-Books
Verlagsgesellshaft mbH, Frankfurt/Main, Germany, 1998
Morie A Gertz, Philip R. Greipp. Hematologic Malignancies:
Multiple Myeloma and related plasma cell disorders (Ange-
la Dispenzieri: Cryoglobulinemia 228-252), Springer-Verlag
Germany 2004
Ramos-Casals M, Stone JH, Cicl MC, Bosch X. The cryoglobu-
linaemias. Lancet 2012;379(9813):348-60
Stjepan Gamulin, Matko Marušić i sur: Patofiziologija, Medi-
cinska naklada, Zagreb, 1998.

Pitanja i odgovori

1. Što su krioglobulini?
Imunoglobulini ili imunoglobulinski kompleksi koji precipitiraju na temperaturi 4-37 °C.

2. Koje su najčešće kliničke manifestacije miješane krioglobulinemije?

Purpura, Raynaudov sindrom, periferni neuritis, glomerulonefritis i sistemski vaskulitis.

3. Koji je najčešći uzrok lažno negativnih rezultata u laboratorijskoj dijagnostici krioglobulinemija?

Neadekvatan predanalitički postupak. Naime, proteini koje analiziramo imaju tendenciju precipitacije na niskoj
temperaturi te je nužno postupak uzorkovanja i pripreme seruma provesti na temperaturi od 37 °C.

4. Što obuhvaća kvalitativnu analizu krioglobulina?

Prepoznavanje prisutnosti krioprecipitata nakon pohrane uzorka seruma na +4 °C tijekom najmanje 72 sata, a
po potrebi i do 7 dana.

5. Koja je metoda izbora za tipizaciju krioglobulina prema Brouetu?

Imunofiksacija.

Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija | 489

Poglavl je 52.
Citogenetske metode u dijagnostici akutnih
leukemija
Sanja Davidović-Mrsić, Ivana Franić Šimić

Citogenetika je znanost koja u sebi sjedinjuje znanost o stanici (citologija) i znanost o nasljeđivanju (geneti-
ka). Ona proučava morfologiju i dinamiku kromosoma tijekom mitoze i mejoze te nastoji povezati kromo-
somske nalaze s principima opće genetike.
Znatniji napredak u otkrivanju hematoloških bolesti povezuje se s otkrićem Philadelphia kromosoma godine
1960. u KML-i).
Stečene klonalne kromosomske promjene nalaze se u zloćudnim stanicama bolesnika s leukemijom, limfo-
mom, ali i drugim hematološkim neoplazmama. Broj specifičnih kromosomskih promjena svakim se danom
povećava, a njihovo dokazivanje i razumijevanje molekularne osnove postaje bitno i nezaobilazno u dija-
gnostici, klasifikaciji, terapiji, praćenju i prognozi bolesti.

METODE U CITOGENETICI
Kromosomske promjene (promjene genoma) u leukemijskim stanicama mogu se objektivizirati primjenom
različitih citogenetskih metoda. Od metoda koje se danas primjenjuju u objektivizaciji (istraživanju i dijagno-
stici) promjena genoma zloćudnih stanica su metode konvencionalne ili klasične citogenetike (metode pruga-
nja) i sve više metode molekularne biologije kao što je FISH, ali i druge danas dostupne molekularne metode.
Uspjeh citogenetske analize ovisi o kvaliteti uzorka, ali i o primijenjenoj metodi.
U dijagnostici hematoloških bolesti citogenetske metode se međusobno kombiniraju i dopunjuju kako bi
informacija o genomu bila što potpunija.
Ovisno o metodi koja se primjenjuje u citogenetskoj analizi promjene genoma mogu se objektivizirati izravno
iz dobivenog materijala, iz stanične kulture ili iz arhiviranih uzoraka.

490
Dobivene informacije o promjenama genoma opisu-
ju se kvantitativno i kvalitativno prema definiranoj
međunarodnoj nomenklaturi, ISCN. Analizu prepa-
rata omogućuju svjetlosno-fluorescentni mikroskopi
i specifični programi za obradu slike i signala.
Konvencionalne citogenetske metode – klasična
citogenetika
Uzorci koji se koriste za konvencionalnu citogenet-
sku analizu u bolesnika s malignim hematološkim
bolestima mogu biti: koštana srž, periferna krv, uzo-
rak tkiva tj. bioptat limfnoga čvora kada se radi o lim-
fomu. Rjeđe se za analizu mogu upotrijebiti likvor,
pleuralni izljev, ascites ili aspirat (kada se sumnja
na proširenost bolesti ili ima podatak o prisutnosti
malignih stanica). Svi uzorci koji se iskorištavaju za
dokazivanje promjena genoma nekom od konvenci-
onalnih citogenetskih metoda moraju zadovoljavati
zadane kriterije kao što su: broj i viabilnost stanica,
sterilno uzimanje uzorka, adekvatni transport te čitav
niz drugih parametara koji su zadani protokolima i
standardima koji se koriste u radu. Najčešći uzorak
koji se koristi u dijagnostici hemoblastoza, akutnih
leukemija je uzorak koštane srži (KS), a dobije se
punkcijom sternuma i/ili kriste ilijake posterijor.
Preporučene kulture stanica koštane srži (KS) bez
stanične su stimulacije i kratkotrajne su, tj. direktne,
1 2
6 7
13
19
Slika 52.1. Metafaza i kariotip opisan metodom GTG-pruganja.
24-satne ili nešto duže 48–72-satne kulture stanica. De-
finiranim uzgojem stanica KS što ovisi o tipu leukemije
(AML ili (ALL) dolazi se do metafaza i/ili interfaza koje
se iskorištavaju različitim citogenetskim metodama. U
kliničkoj dijagnostici hematoloških bolesti najčešće se
primjenjuje konvencionalna metoda pruganja, metoda
u kojoj se koristi boja Gimza i enzim tripsin (GTG). Pri-
mjenom ove metode pruganja moguće je istražiti klo-
nalne kromosomske promjene kako strukturne tako i
numeričke. Metode konvencionalne – klasične cito-
genetike iskorištavaju isključivo metafaze. Za metodu
GTG- pruganja potrebne su metafaze zadovoljavajuće
kvalitete i mitotskog indeksa, tj. broja metafaza. Pruga-
njem kromosoma dobije se uvid u kompleksnost pro-
mjena genoma, drugim riječima, konvencionalno pru-
ganje kromosoma je morfološko-deskriptivna metoda
i početak je svake citogenetske analize (slika 52.1.).
Molekularne citogenetske metode –
Fluorescentna in situ hibridizacija
Za razliku od konvencionalnalnih citogenetskih me-
toda, molelularna metoda kao što je fluorescentna
hibridizacija in situ osim metafaza može iskorištavati
i interfezne stanice/ jezgre. Jedan od osnovni predu-
vjeta za primjenu molekularne metode je sačuvani
genom. Kada je genom sačuvan metode fluorescen-
tne in situ hibridizacije mogu se primijeniti na arhi-
3 4 5
8 9 10 11 12
14 15 16 17 18
20 21 22 X Y
Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija | 491

Slika 52.2. Metoda I-FISH, amplifikacija N-MYC, parafinski rez
virane uzorke npr. parafinske rezove (slika 52.2.) ili
citološke razmaze (slika 52.3.). Metodom FISH iden-
tificiraju se strukturne, numeričke ali i kompleksne
promjene genoma u bolesnika s AL-om.
Molekularne metode imaju veliku specifičnost i ve-
liku osjetljivost i zato nam omogućuju identifikaciju
gena, tj. dijelova gena koji su involvirani u onkoge-
nezu. Osjetljivost FISH metode određena je uzorkom
koji iskorištavamo ali i probom (sondom) koju ko-
ristimo. Upravo radi toga raspon osjetljivosti se kre-
će od 10-1 (metafazni, M- FISH) do 10-4 (interfazni,
Slika 52.3. Metoda I-FISH na citološkom razmazu, CEP proba za
kromosom 12, (Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku
hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).
492 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
I- FISH), a broj pogledanih stanica i/ili interfaznih
jezgara može biti velik (200-300 i.j. ili veći).
Zahvaljujući upravo molekularnim metodama kao
što je I-FISH mogu se pretraživati i dokazivati po-
znate, specifične promjene genoma koje se nalaze
u određenog morfološkog tipa/podtipa akutne le-
ukemije.
AKUTNA LEUKEMIJA
Leukemije su neoplazme koje nastaju iz hematopoe-
znih stanica i u početku proliferiraju u koštanoj srži,
a zatim diseminiraju u perifernu krv, slezenu, jetru,
limfne čvorove i na kraju u druga tkiva. Akutna leu-
kemija (AL) sindrom je klonalnih zloćudnih bolesti
matičnih hematopoeznih stanica. Promjene genoma
koje se otkriju pri dijagnozi AL-a prate se u različitim
fazama liječenja (remisija, relaps bolesti).
Za praćenje malignoga klona primjenjuju se prije
svega metode koje imaju veliku osjetljivost i specifič-
nost, a to su upravo metode molekularne biologije.
Kriterij za postavljanje dijagnoze akutne leukemije
jest nalaz leukemijskih stanica u koštanoj srži, u pe-
rifernoj krvi (PK) i u ekstramedularnim tkivima. Ko-
štana srž obično je hipercelularna uz infiltraciju leu-
kemijskih blasta i redukciju normalne hematopoeze.
Tradicionalno, podjela leukemija je polazila od mor-
foloških značajki leukemijskih stanica, tj. koja je sta-
nična loza zahvaćena, mijeloične ili limfocitne (Ta-
blica 52.1.).
Najnovija podjela AL-a uključuje sve one kliničke,
biološke i laboratorijske pokazatelje koji određuju i
prognozu akutne leukemije (t – translokacija).
Akutna mijeloična leukemija – AML
Prema SZO-i iz 2001. i 2008. godine podjela AML uz
fenotipska obilježja (morfologija, citokemija, imuno-
fenotipizacija, citogenetika i molekularna) uključuje
i prognozu akutne leukemije. To je prva podjela le-
ukemija koja govori o važnosti promjena u genomu
stanice pri postavljanju dijagnoze.
Temelj modernog pristupa podjeli AML je upravo
obavezno pretraživanje genoma na poznate nam
 Tablica 52.1. Podjela AL prema morfološkim značajkama Tablica 52.2. Podjela akutnih mijeloičnih leukemija –
leukemijskih stanica (t = translokacija) SZO

Leukemija Promjene Odrasli % Djeca % AML s ponavljajućim citogenetskim promjenama

• AML s t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO;RUNX1-RUNX1T1)
ALL t (9;22) 25–40 4–6 • Akutna promijelocitna leukemija AML s t(15;17)
t (1;9) 2–3 5–6 (q22;q11-12) i varijantama, (PML/RAR-alfa)
t (4;11) 5 2 • AML s eozinofilijom u koštanoj srži inv(16)(p13;q22) ili
t (5;14) <1 <1 t(16;16)(p13;q11), (CBF-beta/MYH11)
t (11;19) <1 <1 • AML s 11q23 (MLL) promjenom, t(9;11)
t (9;11) <1 <1 (p22;q23);MLLT3-MLL
t (17;19) <1 <1 • AML s t(6;9)(p23;q34);DEK-NUP214
t (8;14) 4–5 1–2 • AML s inv(3)(q21;q26) ili t(3;3)(q21;q26); RPN1-EVI1
• AML s mutacijom NPM1, AML s mutacijom CEBPA
ALL – (T-loza) - 10–30 20–30 AML s znacima mijelodisplazije
t (11;14) 5–10 5–10 • AML iz prethodne mijelodisplazije
t (1;14) 1–3 1–3 • AML bez prethodne mijelodisplazije
t (10;14) 1–3 1–3 AML – sekundarne nakon terapije
• Nakon alkilirajućih tvari
AML t (8;21) 5–10 5–10 • Nakon epipodofilotoksina (neke ALL)
t (15;17) 5–10 5–10 • Ostale AML
inv (16) 5–10 5–10 AML koje nisu drugdje uvrštene
t (9;11) 1–5 5–10 • AML minimalno diferencirana (FAB – M0)
t (9;22) 1–3 <1 • AML bez sazrijevanja (FAB – M1)
t (6;9) <1 <1 • AML sa sazrijevanjem (FAB – M2)
• Akutna mijelomonocitna leukemija (FAB – M4)
• Akutna monocitna leukemija (FAB – M5a i M5b)
• Akutna eritroidna leukemija (FAB – M6a i M6b)
specifične promjene koje imaju dijagnostičku, tera- • Akutna megakariocitna leukemija (FAB – M7)
pijsku ali i prognostičku vrijednost. • Akutna bazofilna leukemija
• Akutna panmijeloza s mijelofibrozom
Prema SZO, AML su podijeljene na 6 skupine (Tabli-
Mijeloični sarkom
ca 52.2.), a određene su veličinom tumorske mase Mijeloidne proliferacije u Downovom sindromu
(>20 % blasta u koštanoj srži, perifernoj krvi). Blastična plazmocitoidna neoplazma dendritičkih
stanica
U prvoj skupini su AML-a s ponavljajućim (specifič-
nim) citogenetskim promjenama, kao što su AML s
translokacijom t(8;21)(q22;q22), AML1(CBF-alfa)/
idne proliferacije vezane uz Downov sindrom. Udio
ETO, akutna promijelocitna leukemija s t(15;17)
blasta u koštanoj srži ili perifernoj krvi potreban za
(q22;q11-12) i varijantama, PML/RAR-alfa, AML s
postavljanje dijagnoze AML iznosi 20 % ili više mije-
eozinofilijom u koštanoj srži inv(16)(p13;q22) ili
loblasta i/ili monoblasta/promonocita i/ili megakari-
t(16;16)(p13;q11), CBF-beta/MYH11. Akutne mijelo-
oblasta. U slučajevima kada je nađena specifična pro-
ične leukemije s tim promjenama ubrajaju se u sku-
mjena u kariotipu bolesnika s AML udio blasta može
pinu AML povoljne prognoze za razliku od AML-e s
biti i manji od 20 %.
promjenama lokusa 11q23 / MLL, promjene lokusa
3q26, te kompleksne promjene koje se ubrajaju u Podjela SZO-e na neki način je moderna nadopuna na
prognostički nepovoljnu skupinu AML-a. U drugoj staru francusko-američko-britansku podjelu (FAB).
podskupini su AML-e sa promjenama pridruženim Za rutinsku klasifikaciju AML još uvijek se uz novu
mijelodisplaziji i njihova prognoza je loša. Sekundar- podjelu SZO primjenjuje i FAB - citomorfološka kla-
ne AML, treća podskupina leukemija, obično su po- sifikacija. Zajednička francusko-američko-britanska
sljedica kemoterapije. Taj tip AML-a ima nepovoljnu skupina podijelila je AML u podtipove ovisno o stup-
prognozu. Četvrta skupina su AML ne klasificirane nju diferencijacije i sazrijevanja. Osnovni morfološki
drugačije, zatim skupina mijeloidni sarkom te mijelo- pokazatelj akutnih leukemija jest stanica tipa blasta

Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija | 493

koja predstavlja nediferenciranu ili slabo diferencira-
nu stanicu krvotvornog tkiva.
Ono što je važno naglasiti, a to je da se u rutinskoj
dijagnostici dokazuje i/ili isključuje postojanje spe-
cifičnih promjena genoma u određenog tipa / pod-
tipa AML. Upravo time napravljena je „privremena�
poveznica između stare FAB podjele i nove podjele
SZO.
Kao klonalni biljezi mogu se iskoristiti specifične
citogenetske promjene koje nalazimo u određenih
tipova/podtipova akutnih leukemija (Tablica 52.3.).
Ova podjela također potvrđuje vrijednost citogenet-
skih promjena u dijagnostici, klasifikaciji, terapiji, ali
i u prognozi bolesti.
Specifične kromosomske promjene imaju veliko
kliničko značenje kao neovisni prognostički poka-
zatelj. Upravo radi toga citogenetske se promjene
dijele u povoljne, nepovoljne i u inermedijarne (Ta-
blica 52.4.). Tako bolesnici s AML i citogenetskim
promjenama kao što su: t (8;21) u AML-M2, t (15;17)
u AML-M3 i inv (16), t(16;16) u AML-M4 imaju dobru
prognozu bolesti, što znači bolje preživljenje. Bole-
snici s nepovoljnim citogenetskim promjenama prije
ulaze u relaps bolesti (Slika 52.4.).
Citogenetske se promjene opisuju u oko 80 % bo-
lesnika s AML-om. Kariotipske promjene mogu za-
hvaćati samo jedan (u oko 55 % slučajeva) ili više
kromosoma (oko 45 % slučajeva).
Primarne citogenetske promjene koje nalazimo u bo-
lesnika s AML-om prikazuje tablica 52.5.
U većine bolesnika s AML-om kariotipska promjena
zahvaća 8. kromosom. Translokacija t (8;21) ima do-
bru prognozu u mlađih bolesnika s AML-M2 (slika
52.5. i 52.6.).
U oko 98 % bolesnika s AML-M3 nalazi se transloka-
cija t (15;17).
Inverzija, odnosno delecija 16, del (16) nalazi se u
oko 30 % bolesnika s AML-M4 (Slika 52.7.).

Tablica 52.3. Specifične kromosomske promjene u AML

Promjena Učestalost Leukemija Komentar
t (8;21)(q22;q22) 5-12 % M2 Dobra prognoza
t (15;17)(q22;q21) 97 % M3, M3v Dobra prognoza
inv (16)(p13q22) 10 – 20 % M4 s eozinofilijom Dobra prognoza
t (9;11)(p22;q23) M5 Loša prognoza
t (6;9)(p23;q32) 50 % M2, M4 Loša prognoza
inv (3)(q21q26) 3-5 % M5 s fagocitozom Loša prognoza
t (3;3) M1, M4, M6 Loša prognoza
numeričke promjene +8,-5,-7 40 % AML-svi podtipovi Loša prognoza
delecije krom. M4, M1 do M7 Loša prognoza
5q-,-5,-7 40 % AML-svi podtipovi Nepoznata
kompleksne 7-10 % Loša prognoza
<10 % Loša prognoza

Tablica 52.4. Prognostičke skupine za AML

Povoljna Nepovoljna Intermedijarna
t (8 ;21) promjena kr. 5 uredan nalaz ili druge neklasificirane
t (15;17) promjena kr. 7 promjene kariotipa
inv (16) promjena 11q23
t(16;16) promjene 3q21-26
+8
kompleksni kariotip
Dob < 50 Dob > 60
L < 30,000/µL L > 30,000/µL

494 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 100
90 nepovoljna 82 %
80
intermedijarna 68 %
70

vjerojatnost (%)
60
50 povoljna 56 %
40
30
20
10
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108
mjeseci

Slika 52.4. Vjerojatnost relapsa ispitanika s AML prema prognostičkim skupinama

1 2 3 4 5 mar

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X Y

Slika 52.5. Translokacija t (8;21) u AML-M2, metoda GTG pruganja

Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija | 495

 Tablica 52.5. Primarne citogenetske promjene u bolesnika s AML-om
Kromosom Tip promjene Tip leukemije
1p36 t(1;13)(p36;q21) dismegakariopoeza
1p11 t(1;7)(p11;p11) sek. AML, AML-4
2p21 t(2;11)(p21;q23) isto kao kromosom 1
3q21 t(1;3)(p21;q23) isto kao kromosom 1
3q21-25 t(3;5)(q21-25;q31-35) abnormalni megakariociti i trombociti
3q21 i 3q26 ins(3;3)(q26;q21)
inv(3)(q21q26)
5 -5 sek.AML
5q del(5q) sek.AML
5q31-35 t(3;5)(q21-25;q31-35)
6p23 t(6;9)(p23;q34) AML-2, AML-4 s bazofilijom
6q27 (6;11)( AML-5, AML-5a
7 -7 sek.AML
7p11 t(1;7)(p11;p11) isto kao kromosom 1
7q del(7q) sek.AML
8 +8
8p11 t(8;16)(p11;p13) AML-5a s fagocitozom
8q22 t(8;21)(q22;q22) AML-2 s eozinofilijom
9p21-22 t(9;11)(p21-22;q32) AML-5, AML-5a
9q del(9q) AML-1, AML-2
9q34 t(6;9)(p23;34)
t(9;22)(q34q11)
11q13-14 del/t(11)(q13-14) AML-4, AML-5
11q23 t(10;11)(p14;q13) AML-4, AML-5, AML-5a
del/t(11)(q23)
t(2;11)(q27;q23)
t(6;11)(q27;q23)
t(9;11)(p21;q23)
t(11;17)(q23;q25)
t(11;19)(q23-q13)
12p11-13 del/t(12p) sek.AML
AML-4, AML-2 s bazofilijom
15q22 t(15;17)(q22;q11-12) AML-3
16p13 t(8;16)(p11;p13)
16p13 inv(16)(p13q22) AML-4 s eozinofilijom
16q22 t(16;16)(q22)
del(16)(q22)
17p11-q11 i(17q)
17q11-12 t(15;17)(q22;q11-q12)
17q25 t(11;17)(q23;q25)
19p13 t(11;19)(q23;p13)
20q del(20q) AML-6
21 +21
21q22 t(8;21)(q22;q22)
22q1 t(9;22)(q34;q11)

496 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 1 2 3 4 5 mar

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X Y

Slika 52.7. Metoda GTG-pruganja, kariotip u bolesnika s AML-M4,

47, xx, inv(16), +21

Slika 52.6. Metoda I-FISH, t (8;21), AML1/ETO, (Klinička jedinica za

citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC
Zagreb).

Bolesnici u kojih se promjene nalaze na kromoso-

mu 5 ili 7 imaju lošiju prognozu nego ostali bolesni-
ci (Slika 52.8.) (Klinička jedinica za citogenetiku i
FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC
Zagreb).
LSI 5q31

Akutna limfocitna leukemija – ALL

Podjela akutne limfocitne leukemije prema SZO pri-
kazuje tablica 52.6.
Numeričke kromosomske promjene sa strukturnim
promjenama ili bez njih utvrđene su u oko 50 % bo-
lesnika s ALL-om. Tablica 52.7. prikazuje učestalost Slika 52.8. Metoda FISH, lokus specifična proba, pozitivan nalaz
numeričkih kromosomskih promjena u bolesnika s del(5q31)

ALL-om.
U odraslih bolesnika najčešće se nalazi hiperdiplo-
idija s 47–50 kromosoma, dok je u djece učestalija Tablica 52.6. Podjela akutnih limfocitnih leukemija –
SZO*
hiperdiploidija s više od 50 kromosoma. Prema re-
zultatima dosadašnjih istraživanja, hiperdiploidija je Prekursorske B – stanične ALL
(citogenetske podskupine)
povoljan prognostički činitelj za postizanje remisije
• t (9;22)(q34;q11); BCR/ABL
te preživljenje bolesnika, osim ako uz hiperdiploidiju • t (v;11q23); preustroj MLL
ne postoji i Philadelphija kromosom. U tom slučaju • t (1;19)(q23;p13); E2A/PBX1
bolesnici imaju izrazito lošu prognozu (Slika 52.9.), • t (12;21)(p12;q22); ETV/CBF-alpha
Prekursorske T-stanične ALL
(Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku Akutna leukemija Burkittovih stanica
hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).
SZO* Svjetska zdravstvena organizacija

Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija | 497

 Slika 52.10. Translokacija t(9;22), BCR/ABL, dokazana metodom
GTG-pruganja i FISH

genetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bo-

Slika 52.9. Hiperdiploidija dokazana metodom GTG-pruganja
(metafaza) i I-FISH
Hiperdiploidija se nalazi u 2–8 % odraslih bolesnika.
Bolesnici s gotovo haploidnim brojem kromosoma
imaju samo numeričke promjene, dok bolesnici s
modalnim brojem kromosoma između 30 i 44 imaju
učestale strukturne promjene, mahom translokaci-
je. U 50 % slučajeva riječ je o translokaciji t (9;22)
(q34;q11) (Slika 52.10.), (Klinička jedinica za cito-
lesti, KBC Zagreb).
Prema dosadašnjim istraživanjima bolesnici s hipo-
diploidijom imaju lošu prognozu. Pseudodiploidija
se nalazi u oko 50 % odraslih bolesnika s ALL-om.
Philadelphija kromosom nađe se u oko 40 % bole-
snika s pseudodiploidijom, (Klinička jedinica za
citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških
bolesti, KBC Zagreb).
Strukturne se promjene nalaze u oko 78 % bolesnika
u kojih su utvrđene numeričke kromosomske pro-
mjene (Tablica 52.8.).

Tablica 52.7. Učestalost numeričkih kromosomskih promjena u bolesnika s ALL-om

Numeričke promjene Učestalost odrasli % Učestalost djeca %
uredan kariotip 26–34 8–56
hipodiploidija (<46 kromosoma) 2–8 5–6
Pseudodiploidija 7–59 3–42
hiperdiploidija (47–50 kromosoma) 7–17 8–16
hiperdiploidija (>50 kromosoma) 4–9 14–27
blizu triploidija 3 <1
blizu tetraploidija 2 1

498 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Tablica 52.8. Učestalost strukturnih promjena u bolesni- U oko 30–40 % bolesnika utvrđeno je postoja-
ka s ALL-om nje translokacije t (9;22)(q34;q11). U bolesnika s
Kromosomska Učestalost Fenotip FAB translokacijom t (4;11) i Ph kromosomom pri dija-
promjena gnozi nalazi se velik broj leukocita i blasta. Bolesnici
del(6q) <5 % B ili T L1, L2 s translokacijom t (8;14) i t (4;11), kao i bolesnici s
i(6p) <5 % - - promjenama 14q+ imaju veći rizik od zahvaćenosti
i(7q) <5 % - - središnjega živčanog sustava nego drugi bolesnici.
7q32-35 <5 % T L1 > L2 Ph kromosom nalazi se u 1–2 % bolesnika s AML-om
t(1;7)(p32;q35) i u 5 % djece s ALL-om i u 15–35 % odraslih s ALL-
t(7;9)(q34;q32)
t(7;10)(q35;q24)
om. Gotovo svi slučajevi Ph pozitivnog ALL-a imaju
t(7;11)(q35;p13) pre-B-imunofenotip, dok su drugi imunofenotipovi
8q24 <3–5 % B L3 rijetki. U 40–65 % bolesnika s Ph+ ALL uz limfoid-
t(2;8)(p12;q24) ne markere biljega prisutni su i mijeloidni markeri
t(8;22)(q24;q11) na površini stanica. Prema sadašnjim istraživanjima
i (9q) <5 % Pre B L2 bolesnici s ALL-om u kojih je prisutan Ph kromosom
t(9;22)(q34;q11) 20–30 % Pre B L1, L2 imaju izrazito lošu prognozu.
del(9q)(p21-22) 7–15 % B ili T L1, L2 Promjene 11q23 česte su citogenetske promjene u
11q23 3–10 % bolesnika sa zloćudnim hematološkim bolestima.
t(1;11)(p32;q23) Rana pre-B L1 U bolesnika s ALL-om promjene 11q23 nalaze se u
t(4;11)(q21;q23) Bifenotipska L1, L2 oko 10 % bolesnika. Najčešće je riječ o translokaciji
t(10;11)(p12-14) L1, L2 t (4;11)(q21;q23) i t (11;19)(q23;p13). Prema dosa-
12q 3–4 % Pre-B L1, L2 dašnjim rezultatima preživljenje bolesnika izrazito
t(9;12)(q34;p13) je loše zbog brzog relapsa bolesti nakon postizanja
t(12;21)(p11;q22)
kompletne remisije (Slika 52.11.).
14q11 T L1 > L2
t(1;14)(p32;q11) <1 % Promjene 19p13 su rijetke (<5 % odraslih bolesnika),
t(8;14)(q24;q11) 3–7 % ali su udružene s pre-B ALL, (Klinička jedinica za
t(10;14)(q24;q11) 5–7 % citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških
t(11;14)(p13;q11) <1 %
Inv(14)(q11;q23) bolesti, KBC Zagreb).
Translokacija t (10;14)(q23;q11) dovodi do preured-
be gena za T-stanični receptor. Ova se translokacija
nalazi u 4–7 % bolesnika s T-ALL-om.
Translokacija t (8;14)(q24;q32) često je prisutna u bo-
lesnika sa zrelim B-staničnim zloćudnim bolestima.
Takva se translokacija nalazi u većine bolesnika s
B-ALL-om i L3-morfologijom. Oko 85 % ima translo-
kaciju t (8;14)(q24;q32), a ostatak translokaciju t (2;8)
(p12;q24) i t (8;22)(q24;q11).
Izokromosom se nalazi u 7–9 % bolesnika s ALL-om.
Najčešće je riječ o i (7q), i (9q), i (17q) i i (12q). Izo-
kromosom i (7q) nalazi se pridružen drugim primar-
nim citogenetskim promjenama kao što su t (4;11) ili
der (19). Izokromosom i (9q) nalazi se u bolesnika s
Slika 52.11. Metoda I-FISH, amplifikacija 11q23/MLL ALL-L2, pre-B-fenotipa.

Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija | 499

Prema dosadašnjim podatcima, u djece se mogu de- pina. Prema dosadašnjim rezultatima, smatra se da,
finirani skupine bolesnika s citogenetskim promje- zbog vrlo loše prognoze, bolesnike s Ph+ ALL-om
nama koje mogu imati dobru ili lošiju prognozu. Za treba intenzivno liječiti.
odrasle bolesnike nema tako dobro definiranih sku-

LITERATURA
Ankathi R, Geetha N, Remani P. et al. Clinical implications of Slovak ML, Kopecky KJ, Wolman SR, Henslee-Downey JP,
cytogenetic classification in adult acute lymphoblastic leuke- Appelbaum FR, Forman SJ, Blume KG. Cytogenetics corre-
mia patients. J Cancer Res Clin Biol 1996;122:370-379. lation with disease status and treatment out come in advan-
ced stage leukemia post bone marrow transplantation: a
Heim S, Mitelman F. Cancer Cytogenetic. New York, NY, Liss,
Southwest Oncology Groupstudy (SWOG-8612) Leuk Res
1987.
1995;19(6):381-8.
Martineau M, Clark R, Farrell DM. et al. Isocromosomes in
Sullivan MP, Pullen Dj, Crist Wm. et. al. Clinical and biological
acute lymphoblastic leukaemia: i(21q) is a significant finding.
heterogenity of childhood B cell acute lymphoblastic leuke-
Genes Cromosomes cancer 1996;17:21-27.
mia: Implications for clinical trials. Leukemia 1990;4:6-12.
Rabbits TH. Chromosomal translocations in human cancer.
Zhao L, Chang KS, Estey EH, Hayes K, Deisseroth AB, Li-
Nature 1994;372:143.
ang JC. Detection of residual leukemic cells in patients with
Schouten HC, van Putten WL, Hagemeier A. et al. The pro- acute promyelocytic leukemia by the fluorescence in situ
gnostic significance of chromosomal findings in patients with hybridisation method: potential for predicting relapse. Blood
acute myeloid leukaemia in a study comparing the efficacy 1995;85:495.
of autologous and allogeneic bone marrow transplantation.
Bone Marrow 1991; 8:377.

Pitanja i odgovori

1. Koje se citogenetske metode koriste u dijagnostici akutnih leukemija?

GTG-pruganje, -konvencionalne metode i FISH.

2. Koja je specifična promjena za akutnu promijelocitnu leukeniju?

t(15;17).

3. Koje promjene su povoljne u akuntnim mijeloičnim leukemijama?

t(8;21), t(15;17), inv(16).

4. Promjena t(9;22) češća je u AML ili ALL?

U ALL.

5. Translokacija t(8;14) karakteristična je za koji tip ALL?

Burkittov limfom.

500 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 53.
Molekularna dijagnostika zloćudnih
hematoloških bolesti
Renata Zadro

Leukemije i limfomi klonalni su poremećaji hematopoezne stanice karakterizirani stečenim somatskim mu-
tacijama. Otkriće molekularnih promjena promijenilo je razumijevanje genetičkih mehanizama uključenih u
patogenezu zloćudnih hematoloških bolesti. U leukemijama je otkriveno više od 300 kromosomskih pore-
mećaja, a više od 100 tih poremećaja do sada je klonirano i karakterizirano.
Molekularni poremećaji udruženi sa zloćudnim hematološkim bolestima uključuju:
• abnormalna genska premještanja uzrokovana kromosomskim translokacijama, inverzijama i duplikaci-
jama s posljedicom aktivacije onkogena; rezultat preuredbe jest fuzijski protein ili poremećeni izražaj
gena.
• mutacije i delecije tumorsupresorskih gena (npr. p53).
Dodatno, normalna genska premještanja kao u genima za lake i teške lance imunoglobulina i receptore na
limfocitima T služe za dokazivanje klonalnosti koja korelira sa zloćudnošću.
Prva karakterizirana i klonirana kromosomska abnormalnost u leukemijama jest translokacija t(9;22), od-
nosno fuzijski gen bcr/abl. Spajanje dijelova gena BCR i ABL uzrokuje aktivaciju gena ABL koja je potrebna
i dovoljna za nastanak kronične mijeloične leukemije (KML). Translokacija t(9;22) nalazi se u više od 95
% slučajeva KML-a, ali taj poremećaj nije patognomoničan za KML jer je prisutan u 15–30 % odraslih i 5 %
pedijatrijskih ALL-a te u 2 % AML-a. Translokacija t(9;22) recipročna je translokacija u kojoj se veliki dio
protoonkogena Abelson (ABL) na položaju 9q34 postavlja unutar gena BCR na položaju 22q11, što rezul-
tira nastankom fuzijskoga gena bcr/abl. Konačni je produkt fuzijski protein s povišenom tirozinkinaznom
aktivnošću koji utječe na signalne putove unutar stanice uključene u kontrolu stanične smrti, proliferacije i
međustanične adhezije. Molekularna masa nastaloga fuzijskog proteina iznosi od 190 do 230 kDa ovisno o
mjestu loma u genu BCR. U KML-i lom se većinom zbiva u području m-bcr gena BCR, što ima kao posljedicu
nastanak fuzijskoga prijepisa veličine 8,5 kb koji sadržava ekson b2 ili b3 gena BCR i ekson 2 gena ABL. Ova-

501
kva mRNA kodira protein p210 (molekularne mase
210 kD). U 5 % slučajeva mogu se detektirati obje
vrste prijepisa kao rezultat alternativnog cijepanja. U
rijetkim slučajevima Philadelphia-pozitivne KML lom
u genu BCR uključuje područje m-bcr, što ima kao
posljedicu sintezu fuzijskoga proteina p190 ili pod-
ručje m-bcr s posljedičnim proteinom p230 s većom
molekularnom masom.
KLASIFIKACIJA LEUKEMIJA I LIMFOMA
Poznate genske promjene uključene su u podjelu
akutnih leukemija i limfoidnih neoplazmi prema
SZO. Karakterizacija poremećaja na molekularnoj
razini važan je dio dijagnostičkog postupka u svrhu
definicije rizika za recidiv bolesti te svrstavanje bo-
lesnika u različite terapijske protokole.
Podjela prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji
prepoznaje u AML osam podskupina (Tablica 53.1.).
Temeljem smjernica radne skupine za AML Europ-
ske leukemijske mreže (ELN) definirano je nekoliko
važnih nezavisnih prognostičkih pokazatelja: broj
leukocita, razvoj AML iz mijelodisplazije ili AML sa
znacima mijelodisplazije, prethodna terapija citosta-
ticima drugog zloćudnog tumora i citogenetičke i
molekularne promjene u leukemijskim stanicama. O
navedenim prognostičkim pokazateljima ovisi inten-
zitet odnosno agresivnost liječenja. Prognostičku vri-
jednost genetičkih promjena prikazuje Tablica 53.2.
Revidirana podjela limfoidnih neoplazmi prema
Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji uključuje podjelu
na prekursorske limfoidne neoplazme, B-limfobla-
stične leukemije/limfom (neklasificirane), B-lim-
foblastične leukemije/limfom s povratnim citogene-
tičkim poremećajima i T-limfoblastičnu leukemiju/
limfom (Tablica 53.3.).
Većina B-staničnih limfoma te u manjem broju T-sta-
ničnih limfoma karakterizirana je povratnim kromo-
somskim translokacijama (Tablica 53.4.) koje uključuju
gene za teške i lake lance imunoglobulina i T-stanič-
ne receptore s različitim kromosomskim partnerima.
Rezultat ovakvog poremećaja jest abnormalni izražaj
protoonkogena. Jedan manji dio preuredbi rezultira
502 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Tablica 53.1. Podjela akutnih mijeloičnih leukemija
(AML) prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji
Akutna mijeloičnaleukemija s povratnim genetič-
kim poremećajima
• AML s t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1
• AML s inv(16)(p13.1;q22) ili t(16;16)(p13.1;q22);
CBFB-MYH11
• APL s t(15;17)(q22;q21); PML-RARA
• AML s t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL
• AML s t(6;9)(p23:q34); DEK-NUP214
• AML s inv(3)(q21;q26.2) ili t(3;3)(q21;q25.2);
RPN1-EVI1
• AML (megakariocitna) s t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1
• Podtip: AML s mutiranim NPM1
• Podtip: AML s mutiranom CEBPA
Akutna mijeloična leukemija sa znacima
mijelodisplazij­e
Mijeloidni zloćudni tumor nakon liječenja
Akutna mijeloična leukemija, koja nije drugdje
uvrštena
• AML s minimalnom diferencijacijom
• AML bez sazrijevanja
• AML sa sazrijevanjem
• Akutna mijelomonocitna leukemija
• Akutna monoblastna/monocitna leukemija
• Akutna eritroidna leukemija
• Čista eritroidna leukemija
• Eritroleukemija, eritroidna/mijeloidna
• Akutna megakarioblastna leukemija
• Akutna bazofilna leukemija
• Akutna panmijeloza s mijelofibrozom
(akutna mijelofibroza; akutna mijeloskleroza)
Mijeloični sarkom (ekstramedularni mijeloični
tumor; granulocitni sarkom, klorom)
Mijeloidna proliferacija zbog Down-ovog sindroma
• Prolazni poremećaj mijelopoeze
(prolazna mijeloproliferativna bolest)
• Mijeloidna leukemija pridružena Down-ovom sindromu
Blastični plasmacitoidni zloćudni tumor dendritič-
nih stanica
Akutne leukemije neodređene krvotvorne loze
• Akutna nediferencirana leukemija
• Akutna leukemija miješanog fenotipa s t(9;22)
(q34;q11.2); BCR-ABL1
• Akutna leukemija miješanog fenotipa s t(v;11q23);
preustro­j MLL
• Akutna leukemija miješanog fenotipa, B/mijeloidna,
koja nije drugdje uvrštena
• Akutna leukemija miješanog fenotipa, T/mijeloidna,
koja nije drugdje uvrštena
• Podtip: Limfoblastična leukemija/ limfom stanica
prirodni­h ubojica (engl. Natural killer)
Tablica 53.2. Prognostička vrijednost genetičkih poremećaja
Genetička skupina
Povoljna
Intermedijarna I
Intermedijarna II
Nepovoljna
Podskupina
t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1
inv(16)(p13.1q22) ili t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11
mutirani NPM1 bez FLT3-ITD (normalni kariotip)
mutirana CEBPA (normalni kariotip)
mutirani NPM1 i FLT3-ITD (normalni kariotip)
NPM1 divlji-tip i FLT3-ITD (normalni kariotip)
NPM1 divlji-tip bez FLT3-ITD (normalni kariotip)
t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL
Citogenetičke promjene koje nisu povoljne ili nepovoljne
inv(3)(q21q26.2) ili t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1
t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214
t(v;11)(v;q23); preuredba MLL
-5 or del(5q); -7; promjena(17p); kompleksni kariotip

Tablica 53.3. Podjela akutnih limfoidnih leukemija prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji
Prekursorske limfoidne neoplazme
B-limfoblastična leukemija/limfom, koja nije drugdje uvrštena
B-limfoblastična leukemija/limfom s povratnim citogenetičkim poremećajima
• t(9;22) BCR/ABL1, 25 % odraslih, <5 % dječje B-ALL
• t(v;11q23), preuredba 11q23, djeca <1 godine, povećana učestalost u odraslih
• t(12;21) ETV6/RUNX1, 25 % dječeje B-ALL
• hiperdiploidija, 25 % dječje B-ALL
• hipodiploidija
• t(5;14) IL3/IGH
• t(1;19) E2A/PBX1
T-limfoblastična leukemija/limfom

Tablica 53.4. Kromosomski poremećaji u NHL

Histološki tip Translokacija Uključeni geni Molekularna analiza
MCL t(11;14)(q13;q32) BCL1 IgH FISH, PCR
FL>DLCL t(14;18)(q32;q21) BCL2 IgH PCR, FISH
KLL/SLL t(14;19)(q32;q13) BCL3 IgH FISH
DLCL>FL t(3;14)(q27;q32) BCL6 IgH FISH
ALCL t(2;5)(p23;q35) NPM ALK RT-PCR
LPL t(9;14)(p13;q32) PAX5 IgH FISH
MALT t(11;18)(q21;q21) API2 MALT1 PCR
MCL – limfom stanica zone plašta; FL – folikularni limfom; DLCL – difuzni limfom velikih stanica; KLL/SLL – kronična limfoidna leuke-
mia/limfom malih limfocita; ALCL – anaplastični limfom velikih stanica; LPL – limfoplazmocitoidni limfom; FISH – fluorescentna in situ
hibridizacija; (RT) - PCR – (reverzna transkripcija) – lančana reakcija polimerazom

Molekularna dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti | 503

stvaranjem novoga fuzijskog proteina. Aneuploidija i
delecija specifičnih kromosomskih područja sekun-
darni su događaji koji nisu specifični za pojedinu vrstu
limfoma, ali su vrijedna prognostička informacija.
METODOLOŠKI PRISTUPI U
OTKRIVANJU MOLEKULARNIH
POREMEĆAJA UDRUŽENIH S
LEUKEMIJAMA I LIMFOMIMA
Zloćudne se hematološke bolesti dijagnosticiraju na
osnovi stanične morfologije i površinskih biljega,
imunohistokemije i citogenetičkih abnormalnosti.
U tablici 53.5. navedene su tehnike koje se rabe u
molekularnoj dijagnostici hemoblastoza, a u tablici
53.6. prikazana je usporedba osjetljivosti različitih
metoda detekcije.
Reverzna transkripcija/lančana reakcija polimerazom
(RT-PCR) tehnika je otkrivanja vrlo malih količina
specifičnih fuzijskih prijepisa, rabi se u rutinskoj mo-
lekularnoj dijagnostici te za procjenu odgovora na
terapiju. Kvantitativni RT-PCR određuje broj kopija
DNA te je osobito koristan za utvrđivanje minimalne
ostatne bolesti.
Tablica 53.5. Tehnike u molekularnoj dijagnostici zlo-
ćudnih hematoloških poremećaja
Tehnike probiranja kromosomskih poremećaja u genomu
• “multikolor� fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)
• komparativna genomska hibridizacija
Analize ciljanih kromosomskih poremećaja
• lančana reakcija polimerazom analize DNA (PCR)
• reverzna transkripcija-lančana reakcija polimerazom
analize RNA (RT-PCR)
• PCR u stvarnom vremenu (engl. real-time PCR)
• PCR-SSP (genotipizacija polimorfizma jednog nukleotida)
• FISH
Analize praćenja minimalne ostatne bolesti
• nested PCR (dvostruko umnožavanje)
• kvantitativni PCR (Q-PCR ili Q-RT-PCR)
Analize profila izražaja gena
• globalni
• specifični
• umnožene RNA s rezova tkiva
504 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Minimalna ostatna bolest
Iako mnogi bolesnici postižu potpunu hematološku
remisiju te remisiju prema morfološkim i imunološ-
kim kriterijima, u određenog broja bolesnika doći će
do recidiva bolesti. Populacija zloćudnih stanica pri-
sutna u malom broju ispod granice osjetljivosti stan-
dardnih tehnika razlog je recidiva bolesti i naziva se
minimalnom ostatnom bolesti. Mnoga su istraživanja
pokazala da je otkrivanje i kvantifikacija ostatnih tu-
morskih stanica u značajnoj sprezi s kliničkim isho-
dom bolesti. Kvantitativno mjerenje smanjenja broja
leukemijskih stanica tijekom početne faze liječenja
ima visoku prognostičku vrijednost.
Metode otkrivanja minimalne ostatne bolesti uključu-
ju tehnologije za otkrivanje ostatnih zloćudnih stanica
ispod praga osjetljivosti konvencionalnih metoda (Ta-
blica 53.6.). Tehnike za otkrivanje minimalne ostatne
bolesti trebaju imati osjetljivost u rasponu 105–106.
Metode koje se osnivaju na lančanoj reakciji polime-
razom najprihvatljivije su za utvrđivanje minimalne
ostatne bolesti, a kvantifikacija ostatne bolesti pojed-
nostavnjena je uvođenjem automatizirane tehnologije
PCR-a u stvarnom vremenu (engl. real-time PCR).
Genski čipovi
Posljednjih su 10-ak godina istraživanja uporabom
genskih čipova pridonijela detaljnijoj molekularnoj
podjeli zloćudnih hematoloških bolesti. Navedenom
se tehnologijom dobiva na brz i reproducibilan na-
čin kvantitativni podatak o izražaju tisuća gena. U ta-
kvim se pokusima sonde DNA nanose na staklenu ili
silikonsku podlogu ili najlonsku membranu, a ciljne
Tablica 53.6. Osjetljivost različitih metoda detekcije
Metoda Osjetljivost (1 stanica/n stanica)
Citogenetika 1/25
Interfazni FISH 1/500
Imunofenotipizacija 1/102 – 104
Nested PCR 1/103 – 106
Real time PCR 1/103 – 105
Mikrosateliti PCR 1/102 – 104
se probe cDNA ili cRNA označene fluorescentnom
bojom ili biotinom hibridiziraju te mjeri intenzitet
fluorescencije svake sonde.
S pomoću mikropostroja moguće je utvrditi profil
izražaja gena karakterističan za pojedinu podskupi-
nu AML i ALL. Pokazano je da su tipični profili izra-
žaja gena povezani s pojedinim kariotipom u AML;
izražaj gena u ALL s preuredbom gena MLL razlikuje
se od ALL i AML bez preuredbe gena MLL. U ALL,
prema profilu izražaja gena razlikuju se T-ALL, hi-
perploidna, te akutne limfoidne leukemije s preured-
bom MLL, BCR/ABL1, TEL/ANL-1, E2A/PBX1 i nova
podskupina ALL.
Difuzni limfom velikih stanica zloćudna je hemato-
loška bolest u kojoj nije bilo moguće odrediti pod-
LITERATURA
Bahloul M, Asnafi V, Macintyre E. Clinical impact of molecu-
lar diagnostics in low-grade lymphoma. Best Pract Res Clin
Haematol 2005;18:97-111.
Bench AJ. The role of molecular genetic analysis within the
diagnostic haemato-oncology laboratory. Intl J Lab Hematol
2011;34:21-34.
Campo E, Swerdlow SH, Harris NL, Pileri S, Stein H, Jaffe
ES. The 2008 WHO classification of lymphoid neoplasms and
beyond: evolving concepts and practical applications. Blood
2011;117:5019-32.
Dietel M, Sers C. Personalized medicine and development
of targeted therapies: the upcoming challenge for diagnostic
molecular pathology. A review. Virchows Arch 2006;448:744-
55.
skupine na osnovi morfologije stanica. Uporabom
mikropostroja DNA otkrivena su dva molekularno
različita oblika DLBCL-a s profilom izražaja gena ka-
rakterističnim za različite stadije diferencijacije lim-
focita B: profil izražaja gena karakterističan za stani-
ce limfocita B germinativnog centra (GC-DLBCL) te
geni koji se normalno induciraju tijekom aktivacije
in vitro limfocita B periferne krvi (PB-DLBCL). Po-
kazano je da povoljniji ishod bolesti imaju oni bo-
lesnici u kojih je profilom izražaja gena utvrđen tip
GC-DLBCL.
Profil izražaja gena pomaže u području klasifikacije
zloćudnih hematoloških bolesti i u predviđanju is-
hoda, što omogućuje prilagodbu i raniju primjenu
terapije u korist svakoga pojedinog bolesnika.
Döhner H, Estey EH, Amadori S, Appelbaum FR, Büchner T,
Burnett AK, et al. Diagnosis and management of acute myelo-
id leukemia in adults: recommendations from an international
expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood
2010;115:453-74.
Hubank M. Gene expression profiling and its application
in studies of haematological malignancy. Brit J Haematol
2004;124:577-94.
Rumpold H, Webersinke G. Molecular pathogenesis of Phi-
ladelphia positive chronic myeloid leukemia – is it all BCR-
ABL? Curr Cancer Drug Targets 2011;11:3-19.
Molekularna dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti | 505
 Pitanja i odgovori

1. Na čemu se osniva laboratorijska dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti?

Stanična morfologija, površinski biljezi na stanicama, imunohistokemijska analiza i citogenetičke i molekularne
abnormalnosti.

2. Koliko različitih fuzijskih proteina može nastati kao posljedica translokacije t(9;22) u kroničnoj mijeloičnoj
leukemiji?
p210, p230 i p190.

3. Koje su prognostički povoljne genetičke promjene u akutnim mijeloičnim leukemijama?

t(8;21), inv(16), mutirani NPM1 i CEBPA bez mutiranog FLT3.

4. Koja je laboratorijska metoda najosjetljivija u otkrivanju fuzijskih prijepisa u leukemijama i limfomima?

Nested PCR ili kvantitativni PCR.

5. Koje su prednosti uporabe mikropostroja u hemato-onkologiji?

Kvantitativni podatak o izražaju velikog broja gena, detaljna molekularna podjela, predviđanje ishoda bolesti,
prilagodba terapije.

506 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 54.
Primarne imunodeficijencije
Jadranka Kelečić, Ana Merkler

Primarne imunodeficijencije nasljedni su poremećaji razvoja i/ili funkcije imunosnog sustava. Danas je
poznato oko 200 različitih oblika primarnih imunodeficijencija, a definirano je više od 150 mutacija gena.
Incidencija je oko 10 na 100000 živorođenih. Znatno je veća incidencija u populacijama s visokom stopom
konsangviniteta, kao i u genetski izoliranih populacija. Primarne imunodeficijencije klasificirane su u osam
skupina, ovisno o dijelu imunosnog sustava koji ima poremećenu funkciju (tablica 54.1.). U kliničkoj slici
prevladavaju rekurentne, teške infekcije i infekcije oportunističkim uzročnicima. Ovisno o dijelu imuno-
snog sustava koji je zahvaćen poremećajem postoji sklonost infekcijama određenim uzročnicima (tablica
54.4.). Neke primarne imunodeficijencije obilježene su poremećajem imune regulacije, a u nekim sindro-
mima poremećaj imunosti samo je jedan dio kliničke slike. Prema podacima Europskog registra primarnih
imunodeficijencija (ESID) najčešće su primarne imunodeficijencije s poremećajem produkcije protutijela
koje čine više od 50 % bolesnika. Slijede po učestalosti poremećaji stanične imunosti, poremećaji broja i
funkcije granulocita i drugi dobro definirani sindromi imunodeficijencije. Bolesnici s imunodeficijencijama
češće obolijevaju od autoimunih i malignih bolesti. Broj dijagnosticiranih bolesnika manji je od očekivane
incidencije, posebice u nekim sredinama. Stoga se pokušava edukacijama liječnika, ali i javno zdravstvenim
mjerama poboljšati informiranost o tim bolestima. Rana, odnosno pravovremena dijagnoza ključna je za
svakog bolesnika jer o tome ovisi kvaliteta njihova života i životna prognoza. Posebice je važno prepoznati
bolesnike s najtežim oblicima primarnih imunodeficijencija, npr. s teškom kombiniranom imunodeficijen-
cijom (SCID) obzirom da je ishod liječenja transplantacijom krvotvornih matičnih stanica znatno povoljniji
u djece mlađe od 3 mjeseca, odnosno u djece koja nisu imale ozbiljnih komplikacija, posebice infekcija. Na
poremećaj imunosti treba posumnjati u djeteta, odnosno odrasle osobe koja ima rekuretne, teške infekcije
koje ne reagiraju na uobičajeno antimikrobno liječenje, odnosno infekcije uzrokovane oportunističkim
uzročnicima infekcija.

507
 Tablica 54.1. Podjela imunodeficijencija (Intenational Union of Immunological Societies Expert Committee on Primary
Immunodeficiency, 2009.)
Poremećaji produkcije protutijela: XLA (Spolno vezana agamaglobulinemija), CVID (Obična varijabilna imunodefici-
jencija), prolazna hipogamaglobulinemija ranog djetinjstva, manjak podrazreda IgG
Kombinirane stanično-humoralne imunodeficijencije: SCID (Teška kombinirana imunodeficijencija), Retikularna
disgeneza, CD40 ligand deficijencija, deficijencija klase II MHC
Dobro definirani sindromi imunodeficijencije: Wiskott-Aldrichov sindrom (WAS), teleangiektatična ataksija (AT),
Nijmegen breakage sindrom, Bloom sindrom, Hiper IgE sindrom, Comel-Netherton sindrom
Bolesti uzrokovane imunosnom disregulacijom: Obiteljska hemofagocitna limfohistiocitoza (FHL), Limfoproliferativ-
ni sindromi (XLP, ALPS), Griscelli sindrom, Hermansky-Pudlak sindrom
Prirođeni poremećaji broja ili funkcije fagocita: Teška kongenitalna neutropenija (SCN), Ciklička neutropenija (CN),
Kronična granulomatozna bolest (CGD), Schwachman-Diamond sindrom
Poremećaji urođene imunosti: anhidrotska ektodermalna displazija s imunodeficijencijom, HSE (herpes simpleks viru-
sni encefalitis), kronična mukokutana kandidijaza, IRAK-4
Autoinflamatorni poremećaji. Obiteljska mediteranska groznica, Hiper IgD sindrom, Blau sindrom
Deficijencije komplementa : C1 inhibitor deficijencija, C1q deficijencija, properdin deficijencija

KLINIČKA SLIKA ćaj. Posebnu pozornost treba obratiti na bolesnika

Podjela imunodeficijencija
Osnovna podjela imunodeficijencija temeljena je
na dijelu imunološkog sustava koji je zahvaćen po-
remećajem (tablica 54.1.). Na osnovu kliničke pre-
zentacije, odnosno anamneze, kliničkog nalaza, in-
fekcija i drugih simptoma može se posumnjati na
dio imunološkog sustava u kojem se nalazi poreme-
u kojega se nađu dva ili više znakova koji ukazuju
na mogući poremećaj imunosti (The Jeffrey Modell
Foundation warning signs for PID, Tablica 54.2. i
54.3.). Uz težinu i lokalizaciju infekcija uzročnici in-
fekcija značajan su čimbenik na osnovu kojega se
može posumnjati na određeni poremećaj imunosti
(Tablica 54.4.).

Tablica 54.3. Deset znakova koji ukazuju na primarnu

Tablica 54.2. Deset znakova koji ukazuju na primarnu
imunodeficijenciju u djece
Četiri ili više upala srednjeg uha tijekom godine dana
Dvije ili više ozbiljnih upala sinusa u godinu dana
Liječenje antibioticima tijekom 2 ili više mjeseci bez
povoljno­g učinka
Dvije ili više upala pluća tijekom godine dana
Nenapredovanje na tjelesnoj težini ili usporen rast
Ponavljani apscesi kože ili unutarnjih organa
Uporni mlječac (soor) ili gljivična infekcija kože
Infekcije koje se moraju liječiti parenteralnom primjenom
antimikrobnih lijekova
Dvije ili više teških infekcija (meningitis, celulitis, sepsa)
Primarna imunodeficijencija u obitelji
(Jeffrey Modell Foundation warning signs for PID)
imunodeficijenciju u odraslih
Dvije ili više upala srednjeg uha tijekom godine dana
Dvije ili više upala sinusa tijekom godine dana u
bolesnik­a bez atopije
Jedna upala pluća godišnje tijekom nekoliko godina
Kronični proljev i gubitak tjelesne težine
Ponavljane virusne infekcije (prehlade, herpes, bradavice,
kondilomi)
Opetovana potreba za liječenjem infekcija intravenskim
antibioticima
Opetovani apscesi kože ili unutarnjih organa
Uporni osip ili gljivična infekcija kože
Infekcije inače nepatogenim mikobakterijama
Primarna imunodeficijencija u obitelji
(Jeffrey Modell Foundation warning signs for PID)

508 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

Tablica 54.4. Infekcije povezane s glavnim skupinama primarnih imunodeficijencija
Uzročnik Humoralne ID CIDs Poremećaj fagocita Poremećaj komplementa
Virusi Enterovirusi Svi, posebice Ne Ne
CMV, RSV, EBV,
Parainfluenza tip 3
Bakterije S. pneumoniae, Kao kod humoralnih S. aureus, Kao kod humoralnih ID,
H. influenzae, ID, ali i: P. aeruginosa, posebice N. meningitidis
Moraxella catarr., Salmonella typhi, Nocardia asteroides,
P. aeruginosa, Listeria monocytogenes, Salmonella typhi
S. aureus, crijevne bakterije
N. meningitidis,
M. pneumoniae
Mikobakterije Ne Netuberkulozne, Netuberkulozne, Ne
uključujući BCG uključujući BCG
Gljive Ne Candida species, Candida species, Ne
Aspergillus species, Aspergillus species
Cryptococcus
neoformans,
Histoplasma
Capsulatum,
Pneumocystis
Jiroveci
Protozoe Giardia Toxoplasma gondii, Ne Ne
Lamblia Cryptosporidium parvum
(JACI 2010;125:S182-94)

Anamnestički podaci koji ukazuju na mogući • bronhiektazije nejasnog uzroka i nekontrolora-

poremećaj imunosti: na opstruktivna plućna bolest
• rekurentne bakterijske infekcije • atipična autoimuna bolest i/ili limfoproliferacija
• rekurentne infekcije uzrokovane istim uzročnikom • podatak o imunodeficijenciji, neobjašnjenoj
• dvije ili više teških infekcija (sepsa, meningitis, smrti malog djeteta ili konsangvinitetu u obitelji
pneumonija, peritonitis, osteomijelitis) Klinički nalazi koji ukazuju na mogući poreme-
• infekcije uzrokovane oportunističkim uzročnicima ćaj imunosti:
• atipična klinička slika infekcije • odsutnost limfnog tkiva (tonzile, limfni čvorovi)
• neodgovarajući odgovor na uobičajeno antmi- • limfadenopatija
krobno liječenje • organomegalija
• apscesi unutarnjih organa ili rekurentni apscesi • gingivitis, ulkusi usne šupljine, afte
potkožnog tkiva
• teško cijeljenje rana
• kronični proljev
• telangiektazija, ataksija
• nenapredovanje
• parcijalni albinizam, promijenjena struktura vlasi
• tvrdokorna kandidijaza kože i sluznica (soor)
• kronični ekcem, dermatitis
• zakašnjelo otpadanje pupčanog bataljka (>4
tjedna) • batičanje prstiju
• kasno nicanje mliječnih zubi • vaskulitis
• pojava bradavica otpornih na uobičajeno liječenje • dizmorfija, posebice anomalije lica i mikrocefalija

Primarne imunodeficijencije | 509

PRIMARNE IMUNODEFICIJENCJE
S POREMEĆAJEM PRODUKCIJE
PROTUTIJELA
Primarne imunodeficijencije s poremećajem pro-
dukcije protutijela najčešće su primarne imunode-
ficijencije koje se mogu dijagnosticirati kako u do-
jenačkoj, tako i u kasnoj životnoj dobi. Poremećaji
produkcije protutijela čine 50 do 70 % primarnih
imunodeficijencija. Klinički su obilježene ponav-
ljanim, najčešće bakterijskim infekcijama dišnog i
probavnog sustava, te kože. Uz infekcije, u bole-
snika s humoralnim imunodeficijencijama postoji
sklonost razvoju autoimunih i malignih bolesti. Ma-
ligne bolesti javljaju se s većom učestalošću u bo-
lesnika s CVID-om i XLA-om, a rijetko u bolesnika
sa selektivnim manjkom IgA i deficijencijama IgG
podrazreda.
Kongenitalna agamaglobulinemija najčešće se pre-
zentira ponavljanim infekcijama dišnog sustava obič-
no u razdoblju nakon 3. mjeseca života do 2. godine.
Sklonost bakterijskim infekcijama uzrokovana je gu-
bitkom zaštitnih protutijela dobivenih od majke uz
nemogućnost produkcije vlastitih protutijela. U tih
su bolesnika značajno snižene razine svih razreda
imunoglobulina, a analizom subpopulacija limfocita
periferne krvi ne nalaze se biljezi B-limfocita (CD19/
CD20). Moguća je genomska analiza kojom se u 85
% bolesnika s agamaglobulinemijom nalazi mutacija
u genu za Brutonovu tirozin kinazu koja je uzrok
spolno vezane agamaglobulinemije (XLA).
Prolazna hipogamaglobulinemija ranog djetinjstva
blagog je kliničkog tijeka, iako i ti bolesnici mogu
obolijevati od teških infekcija. U laboratorijskim na-
lazima nalazi se snižena razina imunoglobulina G i
A uz uredan broj B limfocita. Nadomjesno liječenje
imunoglobulinima indicirano je u tih bolesnika ako
je razina IgG < 3,5 g/L.
Obična varijabilna imunodeficijencija (CVID) naj-
češća je simptomatska humoralna imunodeficijencija
s incidencijom od 1:10000 do 1:50000. Do sada je
nađeno nekoliko mutacija koje su odgovorne za po-
remećaj funkcije B limfocita, ICOS, BAFF-R, TACI, te
510 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
manjak MSH5. Broj B limfocita može biti normalan ili
snižen. Razina serumskog IgG snižena je za više od 2
standardne devijacije od očekivane, kao i razina IgA,
a u nekih je bolesnika snižena i razina IgM. Dijagno-
za bolesti obično se postavi u kasnom djetinjstvu ili
mladosti, no simptomi se mogu pojaviti u bilo kojem
životnom razdoblju. Klinička slika obilježena je reku-
rentnim bakterijskim infekcijama dišnog i probavnog
sustava. Bolesnici s običnom varijabilnom imunode-
ficijencijom imaju povećan rizik razvoja malignih bo-
lesti, posebice NHL i karcinoma želuca.
KOMBINIRANE STANIČNO-
HUMORALNE IMUNODEFICIJENCIJE
Teška kombinirana imunodeficijencija (SCID) jedna
je od najtežih primarnih imunodeficijencija. Nekoli-
ko različitih mutacija uzrok je udruženog poremeća-
ja stanične i humoralne imunosti. Bolest je klinički
obilježena teškim, rekurentnim, odnosno perzisten-
tnim bakterijskim, gljivičnim i virusnim infekcijama,
nenapredovanjem, kroničnim proljevom, osipom.
Najvažnije obilježje SCID-a je izrazito snižen broj T
limfocita, udružen sa značajnom hipogamaglobuli-
nemijom ili agamaglobulinemijom. Iako je T-limfo-
penija jedno od najvažnijih obilježja teške kombini-
rane imunodeficijencije u nekih oblika bolesti njihov
broj može biti normalan, ili čak povećan, kao npr.
kod Ommenovog sindroma ili u slučaju značajnog
prolaza majčinih limfocita u tijeku trudnoće koji
mogu biti uzrokom GVHD-a. Na poremećaj stanične
imunosti treba posumnjati djece s apsolutnim bro-
jem limfocita < 2500. Kliničku sliku SCID-a uzrokuje
nekoliko različitih mutacija, a već nalaz limfocitnih
subpopulacija može nas uputiti na mogući genski
poremećaj. Bez liječenja transplantacijom krvotvor-
nim matičnim stanica ili genskog liječenja, koje je
moguće za bolesnike s X-SCID-om, te bolesnike s
nedostatkom adenozin deaminaze (ADA-SCID) ti
bolesnici umiru u ranom djetinjstvu. Za ishod lije-
čenja presudna je rana, odnosno pravovremena di-
jagnoza jer je npr. znatno uspješnije liječenje tran-
splantacijom krvotvornih matičnih stanica u djece s
teškom kombiniranom imunodeficijencijom koja su
liječena u prva 3 mjeseca života (preživljenje 95 %),
nego u kasnijoj dobi, kada komplikacije, najčešće
infekcije znatno smanjuju povoljan ishod liječenja
(preživljenje 60 do 70 %).
DOBRO DEFINIRANI SINDROMI
IMUNODEFICIJENCIJE
Wiskott-Aldrich sindrom (WAS), teleangiektatična
ataksija (AT), Nijmegen breakage sindrom (NBS),
Bloom sindrom, Hiper IgE sindrom, Comel-Nether-
ton sindrom neki su od dobro definiranih sindroma
obilježje kojih je, uz druge poremećaje, poremećaj
imunosti.
Teleangiektatična ataksija (AT) je autosomno rece-
sivna bolest čiji je uzrok mutacija u ATM genu, prote-
in kinazi koja sudjeluje u popravku DNA. Klinički se
manifestira progresivnom cerebelarnom ataksijom,
okulokutanom telangiektazijom i imunodeficijenci-
jom. Ataksija se javlja u ranom djetinjstvu, dok se
karakterističan znak, okulokutana telangiektazija
obično javlja u dobi od 4 do 6 godina. Neki bole-
snici nemaju infekcije, niti poremećaje imunosti. U
bolesnika s tipičnom kliničkom slikom može se naći
poremećaj humoralne imunosti, stanične imunosti,
ili njihova kombinacija. Najčešće se nalazi snižena
razina IgA, IgG2, IgG4, te ponekad limfopenija. U
oko 10 % AT- bolesnika bolest se u ranoj fazi može
manifestirati teškim infekcijama, povišenom ili nor-
malnom razinom IgM uz sniženu razinu IgG i IgA,
odnosno kliničkom slikom hiper-IgM sindroma. AT
je imunodeficijencija s najvećim rizikom razvoja ma-
ligne bolesti od svih imunodeficijencija. Sklonost
razvoju malignih bolesti vezana je uz brojne translo-
kacije i lomove kromosoma.
Nijmegen breakage sindrom (NBS) rijetka je auto-
somno recesivna bolest koja se klinički manifestira
mikrocefalijom, nestabilnošću kromosoma, poveća-
nom osjetljivošću na ionizirajuće zračenje, imunode-
ficijencijom i velikom sklonosti razvoja malignih bo-
lesti limfnoga tkiva. Iako se javlja u cijelome svijetu
češća je u srednjoj i istočnoj Europi.
POREMEĆAJI IMUNOSNE REGULACIJE
U bolesnika s poremećajem imunosne regulacije po-
većana osjetljivost na infekcije nije glavni problem.
Spolno vezani limfoproliferativni sindrom
(XLP) rijetka je imunodeficijencija koja se klinički
najčešće manifestira kao fulminantna infekcija Eb-
stein - Barrovim virusom, disgamaglubulinemijom
i limfomom. Klinička slika fulminantne infekciozne
mononukleoze posljedica je neadekvatnog imuno-
loškog odgovora na EBV infekciju koja je obilježena
nekontroliranim brojem EBV inficiranih B limfocita,
CD8+ T limfocita i makrofaga, te često i znakovima
hemofagocitne limfohistiocitoze. Druga uobičajena
manifestacija XLP je poremećaj humoralne imunosti
praćen limfoproliferacijom B stanica. Ponekad, no
vrlo rijetko bolest se može manifestirati kao auto-
imuni poremećaj, aplastična anemija, plućna limfo-
idna granulomatoza. XLP je uzrokovan mutacijom
SH2DIA. U XLP bolesnika s tom mutacijom znatno
je povećan rizik razvoja Non Hodgkin B staničnog
limfoma ili drugih limfoproliferativnih bolesti. Među-
tim, u nekih bolesnika nema dokaza EBV infekcije,
pa se može pretpostaviti da je sam genski poremećaj
uzrok razvoja limfoma. Izlječenje bolesti moguće je
jedino transplantacijom krvotvornih matičnih stani-
ca. Transplantacijom krvotvornih matičnih stanica
treba liječiti i asimptomatske bolesnike koji imaju
HLA podudarnog srodnog davatelja, kao i bolesni-
ke s HLP čija je bolest kontrolirana kemo i imuno-
terapijom. Prije transplantacije krvotvornih matičnih
stanica bolesnici s XLP mogu se liječiti kombinaci-
jom IVIG-a i rituximaba kako bi se prevenirala EBV
infekcija.
Autoimuni limfoproliferativni sindrom (ALPS)
klinički obilježava nemaligna limfoproliferacija (lim-
fadenopatija i/ili splenomegalija koja je prisutna više
od 6 mjeseci) i autoimune citopenije. ALPS je uzro-
kovan poremećajem apoptoze limfocita. U perifer-
noj krvi nalazi se povećan udio CD4-CD8- dvostruko
negativnih T limfocita. Konačna dijagnoza postavlja
se analizom ekspresije Fas (CD95) i molekularnom
genomskom analizom.
Primarne imunodeficijencije | 511
POREMEĆAJI BROJA ILI FUNKCIJE
GRANULOCITA
Na taj poremećaj upućuju piogene infekcije, reku-
rentne infekcije uha, nosa i ždrijela, infekcije donjih
dišnih puteva, i znatno rjeđe oportunističke gljivične
infekcije, u prvom redu Aspegillusom. Kod sniženog
broja granulocita (apsolutni broj granulocita<1500)
diferencijalno dijagnostički treba razmišljati o auto-
imunoj neutropeniji, dijagnoza koje se može potvr-
diti nalazom antigranulocitnih protutijela, benignoj
neutropeniji dojenačke dobi, cikličkoj neutropeniji
i najtežem obliku, kongenitalnoj neutropeniji. Kada
je broj granulocita uredan treba posumnjati na pore-
mećaj njihove funkcije, što se ovisno o poremećaju
može dokazati analizom respiracijskog praska, testo-
va fagocitoze i konačno molekularnom genomskom
analizom.
Teška kongenitalna neutropenija (SCN) genetski
je heterogena bolest, ali ima zajednička hematološka
i klinička obilježja. Nasljeđuje se autosomno domi-
nantno u oko 60 % bolesnika ili autosomno recesiv-
no u otprilike 30 % bolesnika. Klinički je definirana
zastojem u sazrijevanju mijelopoeze na nivou mijelo-
cita/promijelocita, te brojem neutrofilnih granulocita
u perifernoj krvi manjim od 0,5x109/L. U kliničkoj
slici dominiraju teške bakterijske infekcije od rane
dječje dobi. Autosomno recesivni oblik bolesti prvi
je opisao Rolf Kostmann 1956.godine. Prije nekoli-
ko godina otkriveno je da je uzrok bolesti u autoso-
mno recesivno nasljednoj kongenitalnoj neutropeniji
mutacija u HAX1 genu. Najčešća mutacija, nađena
u oko 50-60 % bolesnika s teškom kongenitalnom
neutropenijom je mutacija gena koji kodira netrofil-
nu elastazu 2 (ELA 2). U određenog broja bolesnika
nije nađena nijedna od poznatih mutacija. Moguć-
nost liječenja bolesnika s SCN-om primjenom čim-
benika stimulacije granulocitopoeze (G-CSF) koja je
moguća od 1987.godine znatno je poboljšan ishod
liječenja i kvaliteta života tih bolesnika. Primjenom
G-CSF-a povoljan terapijski učinak, odnosno porast
apsolutnog broja neutrofilnih granulocita na više od
1,0x109/L postiže se u više od 90 % bolesnika. Većina
bolesnika reagira na doze G-CSF-a koje su manje od
512 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
25 µg/kg/d, a doza kojom se postiže apsolutni broj
neutrofila veći od 1,0x109/L varira od 1 do 120 µg/
kg/d. Za bolesnike kod kojih nema povoljnog tera-
pijskog odgovora na G-CSF liječenje izbora je alo-
gena transplantacija krvotvornih matičnih stanica.
Transplantacija krvotvornih matičnih stanica terapij-
ska je opcija i u bolesnika sa SCN-om kod kojih je
došlo do transformacije u mijelodisplastični sindrom
(MDS/leukemija). Bolesnici sa SCN-om imaju znatan
rizik obolijevanja od leukemije, posebice AML, ali i
ALL, kronične mijelolomonocitne leukemije i bifeno-
tipske leukemije.
POREMEĆAJI UROĐENE IMUNOSTI
Na poremećaj urođene imunosti treba posumnjati
u bolesnika s piogenim infekcijama i rekurentnim
injekcijama uha, nosa, ždrijela i donjih dišnih puteva
u kojih nije nađen poremećaj humoralne imunosti
ili poremećaj granulocita. Anhidrotska ektodermalna
displazija s imunodeficijencijom i IRAK – 4 deficijen-
cija spadaju u tu grupu imunodeficijencija.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
Dijagnostički postupci kod sumnje na primarnu
imunodeficijenciju
• Kompletna krvna slika – određivanje apsolut-
nog broja leukocita, limfocita i neutrofila
• Kvantitativno određivanje razine imunoglobuli-
na IgG, IgA, IgM, IgE u serumu
• Određivanje razine podrazreda IgG
• Određivanje titra specifičnih protutijela na cjepi-
va (tetanus, difterija, hepatitis B) ili titra protuti-
jela na uzročnike preboljelih infekcija
• Odgovor na polisaharidne antigene (određiva-
nje titra protutijela nakon cijepljenja cjepivom
protiv pneumokoka)
• Određivanje titra izohemaglutinina
• Imunofenotipizacija perifernih mononuklearnih
stanica: određivanje apsolutnog broja limfocita
T (CD3+), pomagačkih limfocita T (CD3+CD4+),
 citotoksičnih limfocita T (CD3+CD8+), limfocita
B (CD19+), NK stanica (CD16/CD56)
• Proliferacija limfocita in vitro - mitogenici: PHA,
ConA, PWM i antigeni: PPD, candida, tetanus
toksoid
• Sposobnost oksidativnog metabolizma fagocita
(respiracijski prasak)
• Kožni testovi odgođene preosjetljivosti (PPD,
Candida, tetanus toksoid)
• Komplement: CH50, C3, C4
• Dodatne analize komplementa (npr. C1 inhibitor)
• Određivanje razine enzima: adenozin deamina-
za, purin nukleozid fosforilaza
• Fagocitoza
• NK-aktivnost
• Određivanje izražaja CD40-liganda (CD154)
• Analiza citokina
• Genomska analiza
MOLEKULARNA GENETIKA I
DIJAGNOSTIKA
Tipovi mutacija
Primarne imunodeficijencije obuhvaćaju sve tipove
mutacija, a najčešće su mutacije promjene smisla
(eng. missense) i besmislene mutacije (eng. nonsen-
se). Također se javljaju i delecije, insercije, duplika-
cije i splice site mutacije.
Mutacija promjene smisla je zamjena jedne nukleo-
tidne baze drugom, čime dolazi do substitucije ami-
nokiselina u proteinskom lancu.
Besmislena mutacija je također zamjena nukleotid-
nih baza, ali ovdje se događa da umjesto signala za
neku aminokiselinu dolazi do signala za stop kodon
i time se zaustavlja sinteza proteina. To rezultira
skraćenim proteinom, koji može biti nefunkcionalan.
Insercija je promjena broja nukleotidnih baza u genu
tako da se na određeno mjesto umetne jedna ili više
baza.
Delecija je promjena u broju nukleotidnih baza gu-
bitkom dijela DNA. Malim delecijama se gubi jedna
ili više baza unutar gena, dok se velikim delecijama
gubi cijeli gen ili čak i nekoliko susjednih gena.
Duplikacija je pojava kada je dio DNA abnormalno
kopiran 1 ili više puta.
Splice site mutacija je mutacija koja se događa pri-
likom izrezivanja introna iz primarnog transkripta
RNA. Može doći do pogrešnog izrezivanja tako da se
dio introna unese u zrelu mRNA ili se može dogoditi
da je neki ekson izostavljen.
Genetska heterogenost
Kod primarnih imunodeficijencija javlja se pojava ge-
netske heterogenosti što znači da se ista bolest može
pojaviti zbog više različitih razloga. Postoji alelska
heterogenost gdje se različite mutacije javljaju unu-
tar istog lokusa (gena), i lokusna heterogenost kada
mutacije na različitim lokusima (genima) rezultiraju
istom bolešću.
Načini nasljeđivanja primarnih imunodeficijencija
Najčešće se primarne imunodeficijencije nasljeđuju
po Mendelovom načinu nasljeđivanja, tj. prenoše-
njem mutacije nekog gena sa roditelja na djecu. Ali
ponekad se može pojaviti i de novo mutacija koja
nastaje u spolnim stanicama (jajnoj stanici ili sper-
miju) jednog od roditelja ili u samoj oplođenoj jajnoj
stanici (zigoti).
Kada se bolest nasljeđuje autosomno recesivno, zna-
či da je osoba nasljedila mutacije na oba alela istog
autosomnog gena. Osoba može biti homozigot za
mutaciju, ako je nasljedila 2 identične mutacije na
oba alela istog gena ili složeni heterozigot, ako ima
2 različite mutacije na svakom pojedinom alelu. Kod
recesivnih bolesti, heterozigotni nositelji (koji imaju
jedan normalni alel i jedan s mutacijom) ne pokazuju
simptome bolesti jer je ekspresija alela s mutacijom
potisnuta u prisutnosti normalnog alela.
Kod autosomno dominantnog nasljeđivanja osobi je
potrebna samo jedna kopija promjenjenog gena da
bi se razvila bolest. Roditelj od kojeg je nasljeđena
mutacija može i sam imati simptome, ali može biti i
asimptomatski nositelj. Autosomno dominantna bo-
lest također može biti i posljedica de novo mutacije.
Primarne imunodeficijencije | 513
Mutacije u genima na kromosomu X uzrokuju bole- te mora biti potvrđeno da su majka ili otac nositelji
sti sa specifičnim X-vezanim načinom nasljeđivanja. bolesti. U slučaju X-vezanih bolesti, važno je pret-
Zbog različitog broja kromosoma X kod muškaraca hodno utvrditi spol djeteta, jer samo muška djeca
i žena, te mutacije izazivaju različite posljedice. Kod mogu oboliti. Uzorci iz kojih se radi prenatalna di-
muškaraca bolest se javlja uvijek jer njegova jedi- jagnostika su amnijska tekućina i korionske resice.
na kopija gena sadrži mutaciju. Hemizigotnost kod
muškaraca objašnjava velik broj X-vezanih imunode- Genetsko savjetovanje
ficijencija i velik udio muškaraca sa dijagnosticiranim Vrlo je bitno uputiti bolesnika i njegove roditelje na
nasljednim imunodeficijencijama. Žene imaju dva genetsko savjetovanje prije testiranja na neku od pri-
kromosoma X pa su uglavnom samo asimptomatski marnih imunodeficijencija, da dobiju osnovne infor-
nositelji bolesti. macije o ulozi određenog gena u prijenosu primarne
imunodeficijencije za koju se vrši testiranje, da sa-
Prenatalna dijagnostika znaju kakav oblik testiranja će se provesti (koji će se
Prije odluke o prenatalnom testiranju obavezno je uzorak uzeti, koliko će analiza trajati, kolika je njena
genetsko savjetovanje sa genetskim savjetnikom. točnost, pozitivne i negativne posljedice testiranja
Obiteljska mutacija mora biti prethodno utvrđena, za bolesnika i njegovu obitelj). U slučaju pozitivnog

100 110 120 130

G T T G G C A T T T T T T T A G A T T T T G A C T A A A G G A G A

140 150 160

A G T T C A A G T A T C A G A T A A A G A A A C A C A C A C C C G A

170 180 190

T G G A A C G T A T G T T T A C G T T C A T T G C A T C T A T T G

200 210 220 230

T G A C A A A T G A G T G T G T C A A T C C T G A A A C A A A C A A

Slika 54.1. Elektroferogram dijela sekvence gena SBDS. Heterozigotna delecija četiri nukleotida uzrokuje pomak u okviru čitanja (eng.
frameshift) kod bolesnika sa autosomno recesivnim Shwachman-Diamondovim sindromom (označeno crvenom strelicom). Crveni vrh
– timin; plavi vrh – citozin; zeleni vrh – adenin; crni vrh – gvanin, (Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku KBC Zagreb).

514 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

rezultata testiranja (potvrde kliničke dijagnoze), bit- G G T G T Y C C T G C
no je i genetsko savjetovanje nakon testiranja, da se
detaljno razjasne rezultati provedene analize, da bo-
lesnik shvati medicinske činjenice, dijagnozu, tijek
bolesti, mogućnosti liječenja i da dobije informacije
o raznim udrugama, zdravstvenim i socijalnim služ-
bama koje bi mu mogle koristiti.

Prednosti molekularne dijagnostike u dijagnozi

primarnih imunodeficijencija
Molekularna dijagnostika pomaže liječniku u po-
tvrđivanju kliničke dijagnoze, identificiranju novih i
atipičnih prezentacija bolesti, postavljanju dijagno-
ze kod novorođenčadi gdje konvencionalni dija-
gnostički testovi nisu pouzdani. Ovisno o utvrđenoj
mutaciji moguća je lakša prognoza bolesti i odluka
o tome da li je bolesnik pogodan za gensku tera- Slika 54.2. Heterozigotna mutacija promjene smisla kod bolesni-
ka sa autosomno dominantnim oblikom neutropenije (označena
piju. Moguće je učiniti presimptomatsko testiranje
crvenom strelicom), (Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku
što pomaže u ranom prepoznavanju bolesti prije ra- KBC Zagreb).
zvijanja simptoma. Isto tako molekularne analize se
koriste u istraživanju i identifikaciji novih genetskih
poremećaja. Molekularna dijagnostika primarnih imunodeficijen-
Molekularna dijagnostika primarnih imunodeficijen- cija provodi se metodom sekvenciranja kodirajuće
cija obuhvaća skup testova i metoda koje kao glavni regije gena (eksona). To je metoda kojom se utvr-
analit koriste DNA. DNA se može izolirati iz perifer- đuje redoslijed nukleotida (A, T, G, C) u molekuli
ne krvi kojoj je dodan antikoagulans EDTA, iz amnij- DNA. Najčešće korištena metoda sekvenciranja je
ske tekućine ili iz korionskih resica. Sangerova dideoksi metoda.

G A G C A T G A G A T G A G C A T G A G A T

Slika 54.3. Hemizigotna besmislena mutacija kod bolesnika sa X-vezanom agamaglobulinemijom (slika lijevo, označeno crvenom
strelicom) i ista mutacija kod majke bolesnika u heterozigotnom obliku (slika desno, označeno crvenom strelicom), (Klinička jedinica za
molekularnu dijagnostiku KBC Zagreb).

Primarne imunodeficijencije | 515

Lančana reakcija polimerazom
Prije nego što je DNA spremna za sekvenciranje, po-
trebno ju je umnožiti. U tu svrhu se koristi lančana
reakcija polimerazom (PCR). Za PCR je potrebna izo-
lirana DNA, enzim DNA polimeraza, dvije odgova-
rajuće oligonukleotidne početnice, odgovarajući pu-
fer sa MgCl2 i smjesa 4 deoksiribonukleotida: dATP,
dGTP, dCTP i dTTP.
To je metoda umnožavanja određenog fragmenta
DNA na eksponencijalan način koja se bazira na hi-
bridizaciji specifičnih oligonukleotidnih početnica i
in vitro sintezi kopija željenog fragmenta koji je ogra-
ničen i obilježen tim početnicama.
Reakcija PCR provodi se u oko 30-40 ciklusa, a svaki
ciklus se sastoji od 3 faze (Slika 54.4.):
1. Denaturacija – razdvajaju se lanci dvostruke
uzvojnice kalupne molekule DNA
2. Hibridizacija – prijanjanje oligonukleotidnih po-
četnica na denaturiranu DNA
3. Elongacija – enzim DNA polimeraza produljuje
lanac DNA od početnica u smjeru 5’-3’ sve dok se
ne izgradi nova dvolančana molekula DNA koja
je potpuno identična početnoj molekuli DNA
PRVI CIKLUS
Početnica Novi lanac DNA
2. HIBRIDIZACIJA 3. ELONGACIJA
5’ 3’
3’ 5’
1. DENATURACIJA
Početnica Novi lanac DNA
Slika 54.4. Lančana reakcija polimerazom
516 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Sangerova dideoksi metoda (sekvencijska
reakcija)
U sekvencijskoj reakciji (Slika 54.5.) pročišćeni
PCR produkt potrebno je obilježiti fluorescentnim
bojama kako bi se tijekom procesa kapilarne elek-
troforeze fluorescencijski signali mogli detektirati
i pretvoriti u podatke o slijedu nukleotida u DNA.
Sekvencijska reakcija se provodi po Sangerovoj ili
dideoksi metodi. U reakciju se, osim reagenasa koji
se koriste za reakciju PCR, dodaju i četiri fluores-
centno obilježena dideoksiribonukleotida (ddNTP).
Svaki dideoksiribonukleotid je obilježen drugom
bojom. Prlikom sinteze lanca DNA, ako se u rastu-
ći lanac DNA umjesto deoksiribonukleotida ugradi
dideoksiribonukleotid, sinteza lanca se prekida.
Tako dobijemo produkte (lance) različitih duljina
koji na svojem 3’ kraju sadrže fluorescentno obilje-
ženi ddNTP.
Kapilarna elektroforeza
Kapilarna elektroforeza je analitička metoda razdva-
janja nabijenih čestica na temelju njihove elekrofo-
retske pokretljivosti u električnom polju. Tijekom ka-
DRUGI CIKLUS TREĆI CIKLUS
 DENATURACIJA HIBRIDIZACIJA ELONGACIJA
enzim
dNTP
ddNTP
Slika 54.5. Sekvencijska reakcija
pilarne elektroforeze, produkti sekvencijske reakcije
ulaze u kapilare, napunjene polimerom, kao rezultat
elektrokineičke injekcije. Visoki napon tjera negativ-
no nabijene fragmente DNA kroz kapilare. Fragmenti
se, putujući kroz polimer u kapilarama, razdvajaju na
temelju svoje molekularne težine. Prije nego stignu
do pozitivno nabijene elektrode, odsječci prolaze
kroz dio kapilare koji se nalazi prislonjen uz optički
čitač, a u isto ih vrijeme laserska zraka veliki broj
puta obasjava, pobuđujući fluorescenciju u krajnjim
nukleotidima lanaca. Zabilježeni fluorescentni signa-
li pretvaraju se u elektroferogram, što je digitalni pri-
kaz slijeda nukleotida u obliku vrhova četiri različite
boje, označavajući četiri vrste nukleotida.
LIJEČENJE
Liječenje bolesnika s primarnim imunodeficijencija-
ma ovisi o tipu imunodeficijencije. Liječenje humo-
ralnih ID temeljeno je na redovitom nadomjesnom
liječenju humanim imunoglobulinima, preparatima
za intravensku primjenu (IVIG) ili subkutanu primje-
nu (SCIG). Preporučena doza za IVIG je 400 do 800
mg/kg svaka 3-4 tjedna. Cilj je nadomjesnog liječe-
nja smanjiti učestalost infekcija, a time i kroničnih
komplikacija, u prvom redu razvoj kronične plućne
bolesti (bronhiektazija) i enterovirusnog meningo-
encefalitisa. Poželjna razina imunoglobulina G prije
slijedeće infuzije je više od 5,0g/L, a idealna u nor-
malnom rasponu za odrasle (7-17 g/L). Uobičajena
PRODUKTI
A C
A AC G
ACG C
C
ACGC T
G
ACGCT A
T A C G C TA G
A C G C TA G T
doza IVIG-a je 400-500 mg/kg, dok je veće doze po-
trebno dati bolesnicima s bronhiektazijama i entero-
virusnim meningoencealitisom. SCIG se daje u dozi
od 100 mg/kg/tjedan. Prednost liječenja SCIG-om je
stabilnija razina IgG i manja učestalost nuspojava.
Kontinuirana antibiotska profilaksa nije uobičajena,
ali se o njoj može razmisliti u bolesnika s bronhiek-
tazijama i ponavljanim upalama paranazalnih sinusa.
U djece sa sumnjom na kombiniranu imunodefici-
jenciju potrebno je dati kotrimoksazol radi profilakse
Pneumocystis jiroveci infekcije, profilaksu gljivičnih
infekcija, suspstituciju imunoglobulina, a infekcije
zahtijevaju agresivno liječenje. Često je potrebna
nutritivna potpora, ponekad imunosupresija, kao
npr. kod sindroma Ommen. U bolesnika sa SCID-
om treba dati filtrirane i ozračene krvne derivate
radi visokog rizika razvoja GVHD-a, odnosno CMV
i EBV infekcije. Ne smiju se cijepiti živim cjepivom
kako bi se izbjegla mogućnost vakcinalnih infekci-
ja. Liječenje izbora za djecu oboljelu od SCID-a ili
drugih staničnih imunodeficijencija je transplantacija
krvotvornih matičnih stanica (TKMS). TKMS srodnog
davatelja uspješna je u više od 90 % bolesnika. Po-
stojanje svjetskih registara dobrovoljnih darivatelja
krvotvornih matičnih stanica i banaka umbilikalne
krvi omogućilo je uspješno liječenje alogeničnom
transplantacijom i u bolesnika koji nemaju podudar-
nog srodnog davatelja. Uspjeh transplantacije ovisi
o dobi bolesnika i do tada preboljelim infekcijama,
i znatno je bolji što je niža životna dob i manji broj
Primarne imunodeficijencije | 517
preboljelih infekcija. U nekih bolesnika s primarnim Transplantacija krvotvornih matičnih stanica indi-
imunodeficijencijama moguće je i gensko liječenje. cirana je ako bolesnik ima srodnog podudarnog
To su u prvom redu SCID-X1 i ADA deficijencije, te davatelja, dok o transplantaciji od nesrodnog po-
određeni bolesnici s CGD-i. Kako je 5 bolesnika li- dudarnog davatelja ili umbilikalne krvi treba razmi-
ječenih u dva centra razvilo klonalnu proliferaciju šljati u slučaju nezadovoljavajuće kontrole infekcija
intenzivno se radi na razvoju novih virusnih vektora. i inflamatornih komplikacija. U posljednje vrijeme
Nadomjesno liječenje pegiliranom goveđom adeno- u nekih se bolesnika s CDG primjenjuje gensko li-
zin-deaminazom (pegademazom) tjednim intramu- ječenje.
skularnim injekcijama dostupno je za bolesnike s Regularnom primjenom čimbenika stimulacije gra-
ADA deficijencijom (manjkom adenozin deamina- nulocitopoeze (G-CSF) postiže se u većine bolesnika
ze). Bolesnici s kompletnim Di George sindromom s kongenitalnom neutropenijom zadovoljavajući po-
mogu se liječiti transplantacijom timusa nesrodnog rast broja granulocita (više od 1000). Međutim, oko
davatelja. 10 % bolesnika s kongenitalnom neutropenijom u
Bolesnici s CGD-i zahtijevaju regularnu antibiotsku kojih nema odgovora na visoke doze G-CSF-a liječe-
i antimikotsku profilaksu (kotrimoksazol, itrako- nje izbora je alogenična transplantacija krvotvornih
nazol), te u određenim slučajevima primjenu IFNγ. matičnih stanica.

60 70 80
C C C T G G G G A A G A T G C C A T A T G A G A G A T T T A C

90 100 110 120

T A A C A G T G A G A C T G C T G A A C A C A T T G C C C A A G

130 140 150

C C T A C G T C T C T A C A G G C C T C A T C T G G C T T C A G

160 170 180

A G A A G G T A T A T A C C A T C A T G T A C A G T T G C T G G C

Slika 54.6. Prikaz elektroferograma dijela sekvence gena, (Ana Merkler, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku KBC Zagreb).

518 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

Transplantacija krvotvornih matičnih stanica liječenje
je izbora i u bolesnika s drugim imunodeficijencija-
ma, kao što su WAS, XLP, HLH, IPEX sindrom.
Primarne imunodeficijencije su rijetke bolesti koje
zahtijevaju timski rad niza specijalnosti. Osobito je
važna pravovremena dijagnoza i liječenje kao bi se
spriječio razvoj komplikacija. Ishod liječenja bole-
snika s primarnim imunodeficijencijama ovisi o pra-
vovremenoj dijagnozi, izboru optimalnog liječenja i
tipu imunodeficijencije. Napretkom transplantacijske
LITERATURA
Al-Herz W, Bousfiha A, Casanova JL et al. Primary immu-
nodeficiency diseases: an update on the classification from
the International Union of Immunological Societies Expert
Committee for Primary Immunodeficiency. Front Immunol
2011;2(54):1-26.
Ameratunga R, Woon ST, Neas K, Love DR. The clinical uti-
lity of molecular diagnostic testing for primary immune de-
ficiency disorders: a case based review. Allergy Asthma Clin
Immunol 2010;6(1):12.
Arkwright PD, Gennery A. Ten warning signs of primary
immunodeficiency: a new paradigm is needed for the 21st
century. Ann N Y Acad Sci 2011;1238:7-14.
Ballow M, Notarangelo L, Grimbacher B et al. Immunodefici-
encies. Clin Exp Immunol 2009;158(Suppl 1):14-22.
Berger M. Choices in IgG replacement therapy for primary
immune deficiency diseases: subcutaneous IgG vs. intraveno-
us IgG and selecting an optimal dose. Curr Opin Allergy Clin
Immunol 2011;11(6):532-8.
Berliner N. Lessons from congenital neutropenia: 50 ye-
ars progress in understanding myelopoiesis. Blood
2008;111(12):5427-32.
Bonilla FA, Fried AJ. Pathogenesis, Diagnosis and Manage-
ment of Primary Antibody Deficiencies and Infections. Clin
Microbiol Rev 2009;22(3):396-414.
Booth C, Gaspar HB, Thrasher AJ. Gene therapy for primary
immunodeficiency. Curr Opin Pediatr 2011;23(6):659-66.
Buckley RH. Molecular defect in human severe combined
immunodeficiency and approaches to immune reconstituti-
on. Ann Rev Immunol 2004;22:625-55.
Buckley RH. Primary immunodeficiency or not? Making the
corect diagnosis. J Allergy Clin Immunol 2006;117(4):756-8.
Chinen J, Shearer WT. Advances in basic and clinical immu-
nology in 2011. J Allergy Clin Immunol 2012;129(2):342-8.
imunologije, većom dostupnošću mogućih nesrod-
nih darivatelja krvotvornih matičnih stanica danas
je moguće liječenje mnogih bolesnika s primarnim
imunodeficijencijama alogeničnom transplantacijom
krvotvornih matičnih stanica. Definiranje genskih
poremećaja omogućilo je kod nekih bolesti gensko
liječenje, kao i prenatalnu dijagnostiku. Rana dija-
gnoza često je jedan od najvažnijih čimbenika koji
određuju konačni ishod bolesti u djece s primarnim
imunodeficijencijama.
Dale DC, Bolyard AA, Schwinzer BG et al. The Severe Chro-
nic Neutropenia International Registry: 10-Year Follow-up
Report. Support Cancer Ther 2006;3(4):220-31.
de Vries E, Driessen G. Educational paper: Primary immuno-
deficiencies in children: a diagnostic chalange. Eur J Pediatr
2011;170(2):169-77.
Diaz de Heredia C, Ortega JJ, Diaz MA et al. Unrelated cord
blood transplantation for severe combined immunodeficiency
and other primary immunodeficiencies. Bone Marrow Tran-
splant 2008;41(7):627-33.
Eibel H, Salzer U, Warnatz K. Common variable immunode-
ficiency at the end of a prospering decade: towards novel
gene defects and beyond. Curr Opin Allergy Clin Immunol
2010;10(6):526-33.
Electrophoresis (DOE Joint Genome Institute) 2004
http://jgi.doe.gov/sequencing/education/how/how_10.html
Filipovich AH. Hematopoietic cell transplantation for corecti-
on of primary immunodeficiencies. Bone Marrow Transplant
2008;42(Suppl 1):S49-52.
Genetic Home Reference 2012 http://ghr.nlm.nih.gov/glossary
Hrvatsko društvo za humanu genetiku. Genetičko savjetova-
nje: stajalište hrvatskog društva za humanu genetiku Hrvat-
skog liječničkog zbora 2010 http://www.humana-genetika.
org/wp-content/uploads/2010/06/GENETSKO_SAVJETOVA-
NJE-stajaliste_HDHG.pdf
Kaveri SV, Maddur MS, Hedge P, Lacoix-Desmazes S, Bayry
J. Intravenous immunoglobulins in immunodeficiencies.
More than mere replacement therapy. Clin Exp Immunol
2011;164(Suppl 2):2-5.
Kersseboom R, Brooks A, Weemaes C. Syndromic forms of
primary immunodeficiency. Eur J Pediatr 2011;170(3):295-
308.
Primarne imunodeficijencije | 519
Notarangelo LD. Primary immunodeficiencies. J Allergy Clin
Immunol 2010;125(2 Suppl 2):S182-94.
Puck JM, Nussbaum RL. Genetic Principles and Technologies
in the Study of Immune Disorders. U: Ochs HD, Smith CIE,
Puck JM, ur. Primary Immunodeficiency Diseases: A Molecu-
lar and Genetic Approach. 2 izd. New York: Oxford Univer-
sity Press; 2007, str. 16-26.
Rezaei N, Mahmoudi E, Aghamohammadi A, Das R, Nichols
KE. X-linked lymphoproliferative syndrome. A genetic condi-
tion typified by the tried of infection, immunodeficiency and
lymphoma. Br J Haematol 2011;152(1):13-30.
Richter D, Sertić J. Uloga genomske analize u primarnim imu-
nodeficijencijama. Paediatr Croat 2004;48(Supl 1):131-42.
Rocha V, Locatelli F. Searching for alternative hematopoietic
stem cell donors for pediatric patients. Bone Marrow Tran-
splant 2008;41(2):207-14.
Roifman CM, Somech R, Kavadas F i sur. Defining combined
immundeficiency. J Allergy Clin Immunol 2012;130(1):177-83.
Shehata N, Palda V, Bowen T i sur. The Use of Immunoglo-
bulin Therapy for Patients With Primary Immune Deficiency:
An Evidence-Based Practice Guideline. Transfus Med Rev
2010;24(Suppl 1):S28-50.
Skoda-Smith S, Torgerson TR, Ohs HD. Subcutaneous immu-
noglobulin replacement therapy in the treatment of patients
with primary immunodeficiency disease. Ther Clin Risk Ma-
nag 2010;6:1-10.
Skokowa J, Germeshausen M, Zeidler C, Welte K. Severe con-
genital neutropenia: inheritance and pahophysiology. Curr
Opin Hematol 2007;14(1):22-8.
Teachey DT. New advances in the diagnosis and treatment
of autoimmune lymphoproliferative syndrome. Curr Opin
Pediatr 2012;24(1):1-8.
Wood P. Primary antibody deficiency sydromes. Curr Opin
Hematol 2010;17(4):356-61.
33. Wood P, Stanworth S, Burton J et al. Recognition, clini-
cal diagnosis and management of patients with primary an-
tibody deficiencies:a systematic review. Clin Exp Immunol
2007;149(3):410-23.

Pitanja i odgovori

1. Što su primarne imunodeficijencije?

Nasljedni poremećaji razvoja i/ili funkcije imunosnog sustava.

2. Koji su načini nasljeđivanja primarnih imunodeficijencija?

Autosomno dominantno, autosomno recesivno ili X-vezano.

3. Podjela primarnih imunodeficijencija.

Poremećaji produkcije protutijela, kombinirane stanično-humoralne imunodeficijencije, dobro definirani sindro-
mi imunodeficijencije, bolesti uzrokovane imunosnom disregulacijom, prirođeni poremećaji broja ili funkcije
fagocita, poremećaji urođene imunosti, autoinflamatorni poremećaji i deficijencije komplementa.

4. Kako se umnaža DNA za potrebe sekvenciranja gena?

Lančanom reakcijom polimerazom.

5. Na čemu se temelji liječenje humoralnih imunodeficijencija?

Redovitom nadomjesnom liječenju humanim imunoglobulinima, preparatima za intravensku primjenu (IVIG)
ili subkutanu primjenu (SCIG).

520 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 55.
Laboratorijska dijagnostika
imunodeficijencijskih sindroma
Drago Batinić

U čovjeka se procjena imunosnog sustava, u pravilu, temelji na laboratorijskom ispitivanju in vitro. Valja
pretpostaviti je da će razvoj imunologije i novih tehnologija omogućiti još precizniji uvid u funkcioniranje
imunosnog odgovora, a time i u mehanizme poremećaja imunosnog sustava. No, važno pitanje u tom pro-
cesu jest kako složene laboratorijske testove prenijeti u rutinsku kliničko-laboratorijsku praksu. Drugim
riječima, sve veći broj složenih imunoloških testova nameće potrebu za što racionalnijim odabirom testova
koji će osigurati odgovarajuću informaciju.
Najvažnije indikacije za laboratorijsko ispitivanje imunosnog sustava jesu stanja koje karakterizira poremećaj
u prepoznavanju ili odstranjenju tuđih antigena, a koje nazivamo imunodeficijencijama ili imunodeficijencij-
skim sindromima. U odnosu na uzrok, imunodeficijencijski sindromi dijele se na primarne (urođene) i sekun-
darne (stečene), a oba dovode do sličnih kliničkih stanja koja se očituju rekurentnim ili kroničnim infekcija.
U usporedbi s primarnima, sekundarne su imunodeficijencije znatno učestalije, a nastaju kao posljedica
teške pothranjenosti, zaraze (npr. AIDS, ospice, parazitske bolesti), autoimunih bolesti (npr. SLE) i primje-
ne agresivnih oblika liječenja (kortikosteroidima, imunosupresijskim lijekovima, citostaticima i zračenjem,
presadbom tkiva i organa).
Do danas je opisano oko 200 kliničkih entiteta primarnih imunodeficijencijskih sindroma, a za više od 100 je
poznat genetski uzrok. To su relativno rijetke bolesti čija incidencija iznosi 1:300 do 1:500000 u općoj popu-
laciji. Najčešće se otkriju u novorođenačkoj i dječjoj dobi (60 %), dok se preostale otkriju tek u odrasloj dobi.
Premda su rijetki, primarni imunodeficijencijski sindromi bitni su zbog sljedećih razloga: 1. brza i adekvatna
dijagnoza bolesti može spasiti život ili znatno unaprijediti kvalitetu života oboljelog djeteta; 2. poznavanje
genske prirode poremećaja imunosnog sustava omogućuje prenatalnu dijagnostiku i pridonosi planiranju
obitelji i 3. omogućuju upoznavanje složenih mehanizama imunoregulacije. Važnost ranog otkrivanja pore-
mećaja pokazuje i činjenica de je u nekoliko saveznih država SAD-a nedavno uveden novorođenački probir

521
na SCID s pomoću testa za otkrivanje odsječaka DNA
T-staničnog receptora (TRECs) koji je značajno una-
prijedio rano otkrivanje SCID-a i teške limfopenije
limfocita T.
Imunodeficijencije nastaju zbog poremećaja nespe-
cifične ili specifične imunosti, a u odnosu na izvršni
krak imunosnog odgovora, poremećaj može nastati
na razini stanične imunosti, humoralne imunosti ili
zahvaća oba kraka imunosnog odgovora (mješovite
imunodeficijencije). Na razini nespecifične imuno-
sti oštećenje zahvaća fagocite, NK stanice ili sustav
komplementa, dok na razini specifične imunosti
poremećaj dovodi do smanjenoga broja ili funkcije
limfocita T ili B, odnosno do smanjenog ili potpunog
izostanka izlučivanja protutijela.
S kliničkoga stajališta, imunodeficijencije se očituju
zarazama rekurentnog ili kroničnog tijeka, otporno-
šću na antimikrobnu terapiju, specifičnom vrstom
uzročnika i često atipičnom kliničkom slikom. Oso-
ba pod povećanim rizikom za razvoj zarazne bolesti
naziva se kompromitiranim domaćinom (engl. com-
promised host), a osoba s oštećenim i nedostatnim
imunosnim odgovorom naziva se imunokompromi-
tiranim domaćinom. Imunodeficijencije se, konačno,
povezuju i s nastankom autoimunih bolesti, alergija,
hematoloških poremećaja, malapsorpcijskog sindro-
ma i neoplazmi limfnoga tkiva.
DIJAGNOSTIKA PRIMARNIH
IMUNODEFICIJENCIJSKIH SINDROMA
Dijagnoza primarnih imunodeficijencijskih sindro-
ma posebno je značajna tijekom prve godine života.
Naime, ako se ne dijagnosticiraju i ne liječe na vri-
jeme, primarni imunodeficijencijski sindromi često
završavaju letalno. U svrhu odgovarajuće labora-
torijske dijagnostike, posebnu pažnju treba usmje-
riti na anamnezu i kliničku sliku. Podatci važni za
dijagnozu uključuju dob u kojoj je došlo do pojave
prvih znakova bolesti, rast i razvoj djeteta, ishod ci-
jepljenja živim mikroorganizmima, učestalost, težina
i vrsta infekcija i sl. Obiteljska je anamneza važna
jer može upozoriti na dijagnozu imunodeficijencije
522 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
(npr. podatak o iznenadnoj smrti dojenčadi u obite-
lji, konsagvinitet, i sl.). Liječnik mora poduzeti kli-
ničko-laboratorijska ispitivanja kako bi utvrdio vrstu
i opseg oštećenja i locirao poremećaj na staničnoj
i molekularnoj razini. Osim ispitanika, kliničko-la-
boratorijska obradba treba uključiti i članove obite-
lji. Budući da ne postoji jedinstveni test kojim bi se
utvrdili poremećaji imunosnog sustava, to je obično
potrebno učiniti nekoliko pretraga u svim slučajevi-
ma sumnje na imunodeficijenciju.
Vrsta zaraznog uzročnika i zahvaćeni organi obično
daju korisne smjernice u otkrivanju naravi imunološ-
kog poremećaja (Tablica 55.1.). Primjerice, osobe s
nedostatnim humoralnim odgovorom imaju poveća-
nu sklonost zarazi inkapsuliranim piogenim bakterija-
ma (Staphylococcus sp. i Streptococcus pneumoniae)
i enterovirusima. Nasuprot, osobe s nedostatnom
funkcijom limfocita T ponajčešće pate od virusnih i
gljivičnih infekcija, a česte su i zaraze s Pneumocy-
stis sp. Drugi važni klinički znakovi imunodeficijen-
cija jesu kronični proljev, malapsorpcija, a katkad i
malnutricija, pa se u dijagnostici moraju isključiti au-
toimune i kronične upalne bolesti (npr. gluteinska
enteropatija). Najčešći uzročnici navedenih simptoma
jesu Giardia, Cryptosporidium i rotavirusi. U bole-
snika s primarnom imunodeficijencijom pažnju treba
usmjeriti i na opći status (zastoj u rastu), limfne čvo-
rove (koji nedostaju ili su povećani), organomegaliju,
osip i kožne promjene, usnu šupljinu, kao i na hema-
tološke nalaze (na primjer, trombocitopenija je važan
nalaz u dijagnostici Wiskott-Aldricheva sindroma).
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
U načelu, imunološke pretrage u rutinskoj praksi mo-
žemo podijeliti na testove pretraživanja („screening�),
(Tablica 55.2.) i na specijalne testove (Tablice 55.3.-
55.5), a u odnosu na ispitivano svojstvo na fenotip-
ske, genotipske i funkcijske pretrage. Za velik broj
imunoloških pretraga, posebice funkcijskih testova
limfocita, još uvijek nema „zlatnog standarda�, pa se
stoga izvode u specijaliziranim centrima i laboratori-
jima. Laboratorijsku dijagnostiku imunodeficijencija
 Tablica 55.1. Povezanost između specifičnog imunodeficita i predispozicije za zarazu specifičnim uzročnikom
Oštećenje Uzrok (bolest ili ijatrogeni učinak) Najčešći uzročnici zaraze
neutropenija hemoblastoze, citostatici, aplastična anemija gram-bakterije, Staphyloccocus. aureus, Candida
sp., Aspergillus sp.
kemotaksije granu- Chediak-Higashijev sindrom Streptoccocus pneumoniae, Haemophilus influ-
locita enze
splenektomija trauma, liječenje trombocitopenije H. influenze, S. Pneumoniae, streptokoki
manjak C3-komple- urođen S. pneumoniae, S. Pneumoniae, Pseudomonas
menta SLE sp., Proteus sp.
jetrene bolesti
manjak ili oštećenje aplazija timusa Listeria monocytogenes, Mycobacterium sp.,
funkcije limfocita T Hodgkinova bolest Candida sp., Aspergillus sp., Cryptoccocus neo-
sarkoidoza formans, Herpes simplex, Herpes zoster
lepra (guba)
manjak ili oštećenje AIDS Pneumocystis carinii, Cytomegalovirus, herpes
funkcije limfocita T simplex, Candida sp., Mycobacterium avium
manjak limfocita B Agamaglobulinemija S. pneumoniae, streptokoki, H, influenze, N.
ili protutijela KLL meningitidis, S. aureus, Klebsiella pneumoniae,
MM E. coli, Giardia lamblia

treba započeti testovima pretraživanja (engl. scre-
ening) humoralne i stanične imunosti, uključujući
fagocite. Na osnovi rezultata testova pretraživanja
liječnik indicira specijalističke pretrage za ispitivanje
humoralne i stanične imunosti u svrhu utvrđivanja ra-
zine i opsega oštećenja imunosnog sustava. Konačno,
biokemijske i molekularnogenetičke analize definira-
ju poremećaj na supcelularnoj i molekularnoj razini,
čime se ujedno postavlja i konačna dijagnoza bolesti.
Pretraživanje humoralne imunosti
Glavni efektori humoralne imunosti jesu protutijela
čiju funkciju dopunjuje („komplementira�) sustav
komplementa. Protutijela su proizvod plazma-stani-
ca, krajnje diferenciranih limfocita B.
Pretrage humoralne imunosti nedvojbeno su pouz-
danije i manje podložne interpretaciji negoli pretrage
stanične imunosti, posebice kad je riječ o mjerenju
razine serumskih imunoglobulina kao mjere funkci-
je limfocita B. Pretraživanje humoralne imunosti uk-
ljučuje sljedeće testove: a) elektroforezu serumskih
proteina; b) određivanje razine imunoglobulinskih
razreda (IgA, IgG i IgM) u serumu; c) određivanje
titra izohemaglutinina; d) određivanje titra specifič-
nih protutijela i e) ispitivanje funkcije komplementa
(Tablica 55.2).
Elektroforeza serumskih proteina
Protutijela su sadržana u frakciji g-globulina (imuno-
globulina), a njihova serumska razina ovisi o dobi
te o odnosu između sinteze i potrošnje ili gubitka.
Treba napomenuti da elektroforeza serumskih pro-
teina ne može kvantificirati pojedinačne imunoglo-
bulinske razrede.
Mjerenje razine imunoglobulinskih razreda
Mjerenje koncentracije serumskih imunoglobulin-
skih razreda izvodi se u tekućoj fazi (npr. laserskom
nefelometrijom) ili u polučvrstom mediju (npr. ra-
dijalnom imunodifuzijom). Druge tehnike uključuju
radioimunotest i enzimski imunotest, posebice kada
se mjeri razina IgE i IgD. Neto-koncentracija imuno-
globulina u serumu ovisi o više činitelja, kao što su
dob, stupanj sinteze, tkivne razdiobe, potrošnje i gu-
bitka imunoglobulina. Stoga se pri tumačenju nalaza
moraju uzeti u obzir normalne vrijednosti za lokalno
stanovništvo, ali i različiti metabolički činitelji, od-
nosno bolesti koje mogu biti povezane s gubitkom

Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma | 523

 Tablica 55.2. Testovi za pretraživanje primarnih imunodeficijencijskih sindroma
Pretraga Mjerni parametar Sastavnica
Leukociti i diferencijalna krvna slika • morfologija i apsolutni broj neutrofilnih granulocita – granulociti
• apsolutni broj limfocita – limfociti T i B
• apsolutni broj trombocita – medijatori
Komplement • ukupna hemolitička aktivnost (CH50) – komplement
• razina C3, C4 i C1-inhibitora
Elektroforeza proteina • g-globulini (cjelokupna protutijela) – limfociti B
Imunoglobulini u serumu • IgA
• IgG – limfociti B
• IgM
Razina funkcijskih protutijela • protutijela na krvne grupe – limfociti B
• protutijela na antigene cjepiva
Kožni test • reakcija kasne preosjetljivosti (PPD, candidin) – limfociti T

proteina. Istodobno mjerenje razine drugih proteina
u serumu (npr. albumina) s pomoću elektroforeze
važno je za procjenu cjelokupnog gubitka serumskih
proteina i imunoglobulina.
Mjerenje titra izohemaglutinina
Mjerenje titra izohemaglutinina anti-A i anti-B služi
kao pokazatelj proizvodnje “prirodnih� protutijela ra-
zreda IgM. Ta se protutijela sintetiziraju u svih osoba
(osim u onih krvne grupe AB), a nastaju kao reakcija
na ubikvitarne bakterijske antigene čija građa naliku-
je na polisaharide antigena krvnih grupa (križna re-
akcija). Osoba krvne grupe A razvija protutijela anti-
B, osoba grupe B razvija anti-A, a osoba krvne grupe
0 razvija anti-A i anti-B. Izohemaglutinini se sinteti-
ziraju u prvim godinama života, pa do treće godine
većina (98 %) zdrave djece krvnih grupa A, B i 0
imaju titar izohemaglutinina najmanje 1:16. Manjak
izohemaglutinina pokazatelj je oštećenja humoralne
imunosti, čak i u one djece koja mogu imati uredan
nalaz serumskih imunoglobulina (npr. u djece obo-
ljele od Wiskott-Aldricheva sindroma).
Mjerenje specifičnog imunosnog odgovora nakon
imunizacije
Stvaranje protutijela na specifične antigene najbolji
je pokazatelj cjelokupne B-stanične funkcije. Riječ
je o ispitivanju titra specifičnih protutijela razreda
IgG prije i nakon imunizacije antigenima cjepiva,
pri čemu se istodobno ispituje i aferentni (prepo-
znavanje protutijela) i eferentni krak (proizvodnja
protutijela) humoralnog odgovora. Pri tome se tre-
ba strogo držati pravila da se djetetu sa sumnjom na
imunodeficijenciju nikada ne daju cjepiva od živih
mikroorganizama (BCG, polio, morbili). Od T-ovi-
snih antigenaobično se rabe cjepiva protiv tetanusa,
difterije ili ona koja sadržavaju Haemophilus influ-
enze, dok se za procjenu odgovora na T-neovisne
antigene primjenjuju cjepiva koja sadržavaju polisa-
haride pneumokoka. Normalni humoralni odgovor
očituje se povećanjem titra specifičnog protutijela
nakon dva tjedna od primjene proteinskih cjepiva
(npr. difterija i tetanus), odnosno tri tjedna od pri-
mjene polisaharidnih cjepiva. No, djeca mlađa od 2
godine obično vrlo slabo odgovaraju na polisaha-
ridna cjepiva. U bolesnika s agamaglobulinemijom
ne će se razviti većina (ili sve) vrsta protutijela, oni
s izdvojenim manjkom IgG2 mogu imati teškoća u
sintezi protutijela na polisaharide, dok će bolesnici s
manjkom IgA ili prolaznom hipogamaglobulinemi-
jom imati normalni odgovor na cjepiva.
Analiza komplementa
Razina komplementa u serumu određuje se testom
ukupne hemolitičke aktivnosti seruma, (CH50). Te-
stom se ispituje klasični put aktivacije komplementa,

524 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

pa je stoga koristan za pretraživanje većine nedostat-
nosti sustava komplementa. Vrijednost CH50 = 0 nala-
zi se pri manjku komponenti C1-C8, dok se u manjku
C9 vrijednosti CH50 kreću od 25 do 50 % normalne
vrijednosti. Test CH50 ne će otkriti manjak properdina
ili faktora D (tada je potrebno učiniti specijalni test
– AH50). Manjak faktora I ili H udružen je s pove-
ćanom potrošnjom C3 i stoga sniženom vrijednosti
CH50. Manjak C1-inhibitora udružen je sa sniženom
razinom C4.
Pretraživanje stanične imunosti
Za pretraživanje stanične imunosti rabe se dvije
osnovne pretrage – krvna slika i kožno testiranje in
vivo (tablica 55.2).
Krvna slika
Osnovna pretraga za procjenu stanične imunosti in
vitro jest krvna slika koja mora sadržavati relativni i
apsolutni broj limfocita, neutrofila i trombocita, kao
i morfološke značajke stanica periferne krvi (npr.
broj i veličinu granula u neutrofilima, oblik i veliči-
nu trombocita i sl.). U ocjeni imunodeficijencije tre-
ba se voditi činjenicom da apsolutni broj leukocita,
neutrofila i limfocita također ovisi o dobi ispitanika.
Na primjer, limfopenija je definirana brojem limfocita
<2500/μL krvi u neonatalnoj dobi, <4000/μL u doje-
načkoj (5-12 mjeseci) dobi i <1000/μL krvi odrasloj
dobi. Smanjen broj limfocita može biti izdvojeni na-
laz ili može biti udružen s kvantitativnim poreme-
ćajem drugih leukocita, kao što je npr. limfopenija
s eozinofilijom ili limfopenija s trombocitopenijom.
Kožni test in vivo
Za funkcijsku procjenu stanične imunosti in vivo
primjenjuje se kožno testiranje po tipu odgođene
(kasne) preosjetljivosti. Sastoji se od intradermalne
injekcije antigena, a reakcija se očitava nakon 48 i
72 sata. Pozitivnom reakcijom smatra se nalaz indu-
racije minimalne veličine 5×5 mm na mjestu injekcije
antigena. Tim se testom ispituje funkcija memorijskih
limfocita T, tj. reakcija na antigene zaraznih klica s
kojima je osoba prethodno došla u dodir prirodnim
putem ili cijepljenjem (PPD, antigeni Candidae ili
Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma | 525
mumpsa). Stoga se ti antigeni nazivaju i anamnestič-
kim (engl. recall), a reakcija koju induciraju naziva
se anamnestički odgovor. Negativan nalaz ne znači
uvijek manjak limfocita T, već se može raditi o dis-
funkciji, odnosno anergiji limfocita T koja se viđa u
različitim patološkim stanjima. Za dojenčad i malu
djeca ne preporučuje se kožno testiranje zbog visoke
učestalosti lažno negativnih odgovora, tj. nedovoljne
prethodne izloženosti djece navedenim antigenima.
Preporuka je SZO da se testiranje s pomoću sintet-
skoga spoja DNCB više ne izvodi, jer je taj spoj mu-
tagen i uzrokuje nekrozu tkiva.
Specijalni testovi za dijagnostiku primarnih
imunodeficijencijskih sindroma
Specijalni testovi za dijagnostiku imunodeficijencij-
skih sindroma indicirani su nakon što poznati rezul-
tati testova pretraživanja, a nikako prije njih. Speci-
jalne testove za procjenu broja i funkcije limfocita T
i B prikazuju tablice 55.3. i 55.4.
Relativni i apsolutni broj limfocitnih subpopulacija
Osnovna metoda za određivanje relativnog i apsolut-
nog broja pojedinih razreda i podrazreda limfocita u
perifernoj krvi jest imunološka fenotipizacija limfo-
cita s pomoću monoklonskih protutijela i protočne
citometrije. Imunološka fenotipizacija leukocita te-
melji se na otkrivanju membranskih LDA-a iz sustava
CD s pomoću specifičnih monoklonskih protutijela.
Danas se rabi višestruko bojenje stanica, od 3 do 6
biljega u istom uzorku stanica čime se omogućuje
analiza udjela pojedinih vrsta limfocita, njihov stu-
panj diferencijacije, kao i imunofenotipske aberacije
u vidu neizražaja određenih biljega.
Paleta monoklonskih protutijela koja se rabi u di-
jagnostici ovisi o indikaciji. Osnovnim panelom za
imunološku fenotipizaciju limfocita otkriva se rela-
tivni i apsolutni broj limfocita T i njihovih subpo-
pulacija (pomagačkih i citotoksičnih), limfocita B i
NK-stanica u perifernoj krvi, a katkada se ista analiza
radi i s uzorcima koštane srži.
Pri tumačenju i prikazivanju rezultata limfocitnih
subpopulacija treba se služiti referentnim vrijedno-
stima. Stoga liječnik treba poznavati raspone nor-
 Tablica 55.3. Specijalni testovi limfocita u dijagnostici primarnih imunodeficijencijskih sindorma
Limfociti B
Protočna citometrija - relativni i apsolutni broj limfocita
B (CD19+/CD20+)
(dodatna ispitivanja navedena u tablici 55.3.)
Određivanje serumske razine podrazreda IgG
(IgG1-IgG4)
Stvaranje protutijela na cjepiva
(npr. pneumokokni polisaharid)
In vitro proizvodnja protutijela na podražaj mitogenika
(PWM) i proteina A
Analiza gena (primjeri mutacija):
agamaglobinemija: Btk, CD79a i CD179b
hiper IgM sindrom: TNFSF5, AICDA, UNG
kasne hipogamaglobulinemije: ICOS
a
fitohemaglutinin; b konkavalin A; c korovski mitogen (engl. pokeweed mitogen); d purificirani proteinski derivat iz kulture Mycobacterium
tuberculosis; ekultura pomiješanih limfocita; fadenozin deaminaza; g purin-nukleozid fosforilaza;
malnih vrijednosti vlastita kliničkog laboratorija, a
u znanstvenim istraživanjima treba formirati vlastite
kontrolne skupine. Udio i apsolutni broj limfocitnih
subpopulacija u krvi ovisi o dobi i spolu, pa za djecu
i starije osobe uvijek treba tražiti primjerene referen-
tne raspone, uključujući one iz velikih serija ispita-
nika iz literature. Pri tome treba imati na umu da je
apsolutni broj stanica važniji podatak nego njihov
udio u zajedničkoj lozi. Praćenje limfocitnih subpo-
pulacija pokazalo se vrijednim za dijagnostiku speci-
fičnih imunodefcita (npr. parcijalnog Di Georgeova
sindroma) i praćenje bolesnika s imunodeficitom,
posebice u kontekstu specifične terapije.
Prošireni panel biljega rabi se kako bi se dokaza-
la, odnosno isključila određena imunodeficijencija
526 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Limfociti T i NK
Protočna citometrija - relativni i apsolutni broj:
limfociti T (CD3+)
pomagački limfociti T (CD3+CD4+)
citotoksični limfociti T (CD3+CD8+)
omjer CD4/CD8
NK stanice (CD3-CD16+56+)
(dodatna ispitivanja navedena u tablici 55.3.)
Proliferacija limfocita in vitro inducirana:
mitogenicima (PHAa, ConAb i PWMc)
antilimfocitnim protutijelima (CD3)
antigenima (PPDd, tetanusni toksoid)
alogeničnim stanicama (MLR)e
Testovi citotoksičnosti:
NK aktivnost
testovi citotoksičnosti limfocita T
Određivanje citokina (Th1 vs. Th2):
u limfocitima
u nadtalogu podraženih limfocita
Enzimski test: ADAf i PNPg u lizatu eritrocita
FISH za 22q11 i 10p11 (delecija)
Analiza gena (primjeri mutacija):
SCID: IL-2RG, JAK3, IL7RA, IL2R, RAG1, RAG2
MHC I: TAP1, TAP2
MHC II: MHC2TA
CD3: CD3D, CD3E, CD3G, ZAP-70
Wiskot Aldrichev sindrom: WASP
(Tablica 55.4). Primjerice, razvojni oblici (subpopu-
lacije) limfocita B važni su u dijagnostici humoral-
nih imunodeficijencija, posebice obične varijabilne
imunodeficijencije u kojoj defekt B-loze može nastati
na različitim razvojnim razinama. Stoga se u dijagno-
stici tog poremećaja određuju različiti razvojni oblici
B-stanica, od onih nezrelih (tranzicijskih) do me-
morijskih stanica. Na taj način protočna citometrija
pomaže ne samo u otkrivanju već i u klasifikaciji po-
remećaja. Slično, i specifičan imunofenotip limfocita
T može upozoriti na određeni poremećaj. Primjerice,
nalaz povećanog udjela dvostruko negativnih (CD4-
CD8-) limfocita T s receptorom TCRαβ+ predstavlja
jedan od važnih kriterija za dijagnozu autoimunog
limfoproliferativnog sindroma.
 Tablica 55.4. Specifični limfocitni imunofenotipovi u odabranim primarnim imunodeficijencijama
Imunofenotip Vrst stanica Imunodeficijencija
• IgM+CD24+CD38+ • tranzicijski limfociti B (= ili ↓) Oblici obične varijabilne imunodefici-
CD19+IgM+ CD21slabo+ • CD21slabo+ (= ili ↑) jencije (CVID)
CD27+IgD- memorijski limfociti B (= ili ↓)
TCRαβ+CD4-CD8- ↑dvostruko negativni (CD4-CD8-) limfociti TCRαβa Autoimuni limfoproliferativni sindrom
CD4+CD154- CD154-negativni pomagački limfociti T nakon aktiva- X-vezani hiper IgM sindrom
cije in vitro
CD19+CD40- CD40-negativni limfociti B Autosomno-recesivni hiper IgM sin-
drom
CD3+/HLA-ABC- HLA-ABC-negativni limfociti T Sindrom “golih� limfocita
CD20+HLA-DR- HLA-DR-negativni limfociti B i monociti
CD3+HLA-DR- HLA-DR-negativni limfociti T nakon aktivacije in vitro Sindrom manjka HLA-DR
CD4+CD45RO+ memorijski limfociti majke Omenov sindrom
CD3+CD43- CD43 (sijaloforin)-negativni limfociti T Wiskott-Aldrichev sindrom
a
TCRαβ, T-limfocitni receptor tipa αβ.

Funkcijski testovi limfocita Mitogenici su poliklonski aktivatori limfocita, a najče-

Postoje brojni testovi limfocitne funkcije, no oni
su, u načelu, složeni i nestandardizirani. Stoga se
u svojem radu liječnik treba osloniti na što točni-
ju reprodukciju rezultata vlastitog laboratorija, a
ne težiti “točnom� rezultatu. Usporedbe s vlastitim
laboratorijskim kontrolama, kao i korelacija s tije-
kom i ishodom bolesti posredno približavaju razu-
mijevanju uloge mjerene pojave u funkciji određe-
nih stanica. Funkcijski testovi limfocita T uključuju
mjerenje proliferacije limfocita, analizu citokina i
imunoglobulina podraženih limfocita, i testove ci-
totoksičnosti.
Od funkcijskih ispitivanja limfocita najčešće se izvodi
test proliferacije limfocita in vitro, dok se složenije
analize izvode u specijaliziranim laboratorijima.
Aktivacija i proliferacija limfocita in vitro
Limfociti se mogu aktivirati i potaknuti na poliklon-
sku proliferaciju in vitro primjenom nespecifičnih
aktivatora (mitogenika, superantigena, forbol-estera
i antilimfocitnih protutijela), dok se aktivacija za an-
tigen specifičnih receptora inducira “memorijskim�
antigenima i alogeničnim molekulama HLA (tj. alo-
geničnim stanicama).
šće se rabe lektini fitohemaglutinin (PHA), konkava-
lin A (ConA) i korovski mitogen (PWM). PHA i ConA
služe za procjenu aktivacije limfocita T, a zahtijevaju
prisutnost monocita za stimulaciju limfocita T. Uobiča-
jeni aktivatori limfocita B jesu PWM (učinak ostvaruje
putem limfocita T) i stafilkokni protein A (SPA). Drugi
nespecifični aktivatori limfocita jesu forbol-esteri (npr.
PMA) i superantigeni, kao što je TSST. Forbol-esteri
izravno aktiviraju PKC, čime se zaobilazi početna faza
aktivacije limfocita putem receptora. Superantigeni
aktiviraju limfocite T tako da se izravno vežu za b-la-
nac TSR-a i za molekulu II. razreda HLA na antigen-
predočnim stanicama. Protutijela koja se rabe za nes-
pecifičnu aktivaciju limfocita T uključuju protutijela
na signalnu (CD3) i kostimulacijsku molekulu (CD28),
kao i na različite adhezijske molekule (npr. CD2).
Nasuprot poliklonskim aktivatorima, antigeni podra-
žuju samo one limfocite koji izražavaju specifične re-
ceptore za te antigene. Za mjerljivi odgovor limfocita
T na antigene in vitro rabe se antigeni iz cjepiva,
odnosno antigeni ubikvitarnih uzročnika, čime se is-
pituje memorijski odgovor limfocita. Stoga je testira-
nje antigenima manje učinkovito u dojenačkoj dobi
i u malene djece. Najčešće se rabe tetanusni toksoid

Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma | 527

(TT), ekstrakt Candide albicans, tuberkulin (PPD) i
streptolizin/streptodornaza.
Proliferacija limfocita na alogenične stanice u reakciji
pomiješanih limfocita (MLR) dodatna je metoda za
procjenu funkcije limfocita T. Zbog svoje relativne
složenosti postupak nije u rutinskoj uporabi, nego
se obično izvodi u specijaliziranim centrima za pre-
sadbu krvotvornih matičnih stanica.
U procjeni stupnja aktivacije i proliferacije limfocita in
vitro rabe se različite tehnike, što ovisi o veličini i opre-
mljenosti laboratorija. Tradicionalni postupak mjerenja
proliferacije limfocita jest metoda ugradnje radioaktiv-
no obilježenog timidina ([3H-thyimidine]) u DNA proli-
ferirajućih limfocita. Umjesto ugradnje radioaktivnog ti-
midina, danas su razvijene sljedeće tehnike: a) mjerenje
ugradnje neradioaktivnog spoja brom-deoksiuridina
(BrdU) s pomoću fluorescentnih anti-BrdU protutijela
i protočne citometrije; b) analiza sadržaja DNA protoč-
nom citometrijom (mjeri se udio stanica u proliferaciji) i
c) mjeri se izražaj aktivacijskih biljega CD69 ili CD25 na
limfocitima s pomoću protočne citometrije. Treba na-
pomenuti da se analizom izražaja aktivacijskih biljega
(npr. CD69) na limfocitima podraženima tijekom kra-
ćeg perioda (4–6 sati) ne mjeri proliferacija limfocita,
nego samo početna faza, tj. aktivacija limfocita.
Analiza citokina i imunolgobulina podraženih
limfocita
Za dokaz proizvodnje protutijela od podraženih lim-
focita B in vitro najčešće se rabi analiza nadtaloga
kultura s pomoću enzimskog imunotesta (ELISA).
No, postupak se malokad izvodi u rutinskom radu.
Citokini su glavni posrednici imunoloških stanica ko-
jima se ostvaruje imunološki odgovor. Početni opti-
mizam glede dijagnostičke vrijednosti mjerenja razine
citokina u biološkim materijalima (npr. u krvi i likvoru)
polako je nestao nakon što je pokazano da ta informa-
cija u većini slučajeva nema veliku kliničku vrijednost.
Ipak, u pojedinim oblicima imunodeficijencija i u istra-
živačke svrhe često se rabi mjerenje razine citokina
podraženih limfocita in vitro. Pri tome se obično pri-
mjenjuje ELISA za mjerenje izlučenih citokina u nadta-
logu kultura podraženih limfocita, dok novije metode
uključuju protočnu citometriju za mjerenje intracelular-
528 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
nih citokina i ELISPOT, metodu za imunocitokemijski
dokaz proizvodnje citokina u pojedinom limfocitu.
Tim se postupcima mogu otkriti funkcijski odjeljci po-
draženih limfocita T: limfociti Th1 luče citokine (IFN-γ,
TNF i IL-2) odgovorne za razvoj stanične imunosti, dok
limfociti Th2 luče citokine (IL-4, IL-5, IL-10) odgovorne
za sazrijevanje limfocita B i humoralne imunosti.
Mjerenje izražaja liganda CD40 (CD154) na
limfocitima T
Tijekom aktivacije limfocita T dolazi do izražaja mo-
lekule CD154, liganda za molekulu CD40 na limfocitu
B. Ta je stanična interakcija posebno važna, jer omo-
gućuje imunosni odgovor na antigene ovisne o timu-
su (tj. o limfocitima T). Veza između liganda CD40 na
limfocitu T i CD40 na limfocitu B dovodi do aktivacije
limfocita B, a citokini koje izlučuje aktivirani limfo-
cit T (IL-4, IFN-γ i TGF-β) omogućuje prekopčavanje
imunoglobulinskog razreda u limfocitu B (IgM→IgG/
IgA/IgE). U osoba s manjkom ili nedostatnom funk-
cijom CD40-liganda (CD154) na limfocitima T izosta-
je stanična kooperacija i mogućnost prekopčavanja
imunoglobulinskog razreda ("sindrom hiper IgM").
Danas je poznato da taj sindrom uključuje nekoliko
inačica, ovisno o genskom oštećenju ne samo limfo-
cita T nego i limfocita B (npr. neizražaj CD40). Stoga
i ne začuđuje nalaz CD154 na aktiviranim limfocitima
T u dijela bolesnika sa sindromom hiper IgM.
Testovi citotoksičnosti
U citotoksične testove ubrajaju se test citotoksičnost
limfocita T i NK aktivnost. Oba testa primjenjuju istu
metodologiju, tj. oslobađanje radioaktivnog kroma
([51Cr]) ili drugih pogodnih spojeva (npr. fluorescen-
tne boje) iz prethodno obilježenih ciljnih stanica.
Novije metode rabe protočnu citometriju s pomoću
koje se može mjeriti udio lizirani (mrtvih) stanica ili
pak sniženje udjela vitalno obilježenih (fluorescen-
tih) ciljnih stanica.
Testovi citotoksičnosti limfocita T obično se ne
izvode u rutinskom dijagnostičkim laboratoriju. Naj-
češće se rabi test ubijanja alogeničnih (tuđih) stani-
ca i test ubijanja vlastitih stanica zaraženih virusima
(obično limfocita B zaraženih virusom EBV-a). U oba
slučaja ciljne stanice (alogenične stanice ili virusom za-
ražene vlastite stanice) najprije se obilježe pogodnim
markerom, potom inkubiraju s efektorskim (ispitiva-
nim) limfocitima T, a stupanj otpuštanja markera (radi-
oaktivnoga spoja ili boje) razmjeran je stupnju citolize.
NK aktivnost mjeri spontanu citolitičku aktivnost
prirodnoubilačkih ili NK stanica (prema engl. na-
tural killer). Za razliku od citotoksičnih limfocita T,
kojima za razvoj u stanice-ubojice treba i nekoliko
dana, NK stanice djelotvorne su već nakon nekoliko
sati od inkubacije ciljnim stanicama. Njihova se aktiv-
nost klasično mjeri testom oslobađanja radioaktivno-
ga kroma iz ciljnih stanica, slično testu citotoksičnosti
limfocita T. No, za razliku od citotoksičnih limfocita
T, mjerenje citotoksične aktivnosti NK stanica ne za-
htijeva ciljne stanice podudarne u lokusu HLA. Ciljne
stanice u testu NK aktivnosti jesu stanice ljudskih tu-
morskih staničnih linija, od kojih je najpoznatija linija
K562. Ciljne i izvršne stanice (limfociti periferne krvi)
međusobno se pomiješaju u određenim omjerima i
inkubiraju tijekom 4 sata, nakon čega se izmjeri radi-
oaktivost oslobođena iz ciljnih stanica. Umjesto radi-
oaktivnog testa, danas se sve više rabi fluorescentna
metoda s pomoću protočne citometrije.
Pretrage fagocita
Specijalni testovi fagocita (neutrofila i monocita/
makrofaga) uključuju ispitivanje adhezijskih biljega
i funkcijske testove fagocita (tablica 55.5).
Izražaj adhezijskih molekula fagocita
Imunodeficit zbog manjka adhezijskih molekula fa-
gocita naziva se leukocitnim adhezijskim defektom
tipa 1 (LAD1). Fagociti (posebice neutrofili) pokazu-
ju oslabljenu kemotaksiju, adherenciju i endocitozu,
a klinički se poremećaj očituje povećanim brojem
leukocita, infekcijama kože (bez granuloma), peri-
dontitisom i crijevnim fistulama. Uzrok poremećaja
leži u nedostatku heterodimernih površinskih adhe-
zijskih glikoproteina – leukocitnog funkcijskog anti-
gena LFA-1/CD11a, receptora za komplement iC3b
(CR2/CD11b) i receptora za komplement C3d (CR4/
CD11c). Nedostatak tih molekula nastaje zbog ab-
normalne biosinteze b-lanca (CD18) koji je zajednič-
ki lanac svim navedenim adhezijskim receptorima.
Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma | 529
Funkcijski testovi fagocita
Antimikrobna aktivnost fagocita može se podije-
liti u četiri međusobno povezana mehanizma: a)
migraciju stanica u smjeru kemijsko-biološkog po-
dražaja (kemotaksija); b) adherenciju; c) fagocitozu
i d) unutarstaničnu razgradnju mikroorganizama.
Ispitivanje kemotaksije neutrofila in vitro može
se provesti s pomoću specijalnih Boydenovih ko-
morica (kemotaksija neutrofila kroz filtar u smjeru
podražaja) ili u mekom agaru koji omogućuje kre-
tanje neutrofila u smjeru podražaja. Fagocitoza se
ispituje na različite načine: jednostavnije, metode
služe citomorfološku analizu obojenih neutrofila s
ingestiranim kvasnicama, dok se suvremenije me-
tode temelje na protočnocitometrijskoj analizi flu-
orescentnog signala neutrofila i monocita nakon
fagocitoze obilježenih (fluorescentnih) bakterija.
Sposobnost oksidativnog metabolizma fagocita
(respiracijskoga praska, engl. respiratory burst)
može se, također, ispitati na nekoliko načina. Sta-
rija metoda, poznata pod nazivima redukcija boje
NBT-a ili formazanski test, temelji se na pretvor-
bi tetrazolijske soli NBT-a u netopljive precipitate
formazana u citoplazmi i na membrani neutrofila
nakon podražaja odgovarajućim tvarima (npr. for-
bol-esterom). Danas, međutim, sve više prevlada-
va protočnocitometrijska analiza koja se temelji na
mjerenju fluorescencije stanica nakon konverzije
nefluorescentnog u fluorescentni spoj unutar ne-
utrofila nakon podražaja aktivatorima (npr. jono-
micinom i forbol-esterom). Nesposobnost razvoja
respiracijskog praska karakterističan je nalaz u bo-
lesnika s kroničnom granulomatoznom bolesti. In-
tenzitet fluorescencije granulocita ne otkriva samo
bolesnike (negativni nalaz) nego i prenositelji ove
X vezane bolesti, kao i dvije inačice (genotipa) bo-
lesti – X vezanu i autosomno-recesivnu. Mikrobi-
cidnu aktivnost, tj. unutarstaničnu, razgradnju mi-
kroorganizama omogućuju produkti oksidativnog
metabolizma (tzv. respiracijskog praska) fagocita
– H2O2 i reaktivni radikali (OH- i O2-), kao i mi-
krobicidne tvari – laktoferin, lizozim i defenzini. U
tom se postupku granulociti inkubiraju bakterijama
i ljudskim serumom (izvorom komplementa i op-
sonina), nakon čega se u određenim vremenskim
intervalima određuje broj živih bakterija u nadtalo-
gu inkubacijske smjese. Metoda je prilično složena
i nestandardizirana, pa se relativno rijetko izvodi.
Molekularnobiološke analize
Velik broj primarnih imunodeficijencija nastaje zbog
oštećenja gena koji kodiraju molekule uključene u
imunosni odgovor. Stoga je za konačnu dijagnozu
bolesti potrebno učiniti molekularnu analizu na razi-
ni gena i/ili biokemijsku analizu abnormalnih produ-
kata (tablica 55.3). Razvoj tehnologije sekvenciranja
gena na temelju fluorescencije i kapilarne elektro-
foreze omogućuje još izravniju primjenu analize
mutacija u velikoga broja imunodeficijencija. Ta je
činjenica bitna i za genetsko savjetovanje temelje-
no na prenatalnoj dijagnostici i otkrivanju nositelja
mutacije. Važnost takve tehnologije pokazana je na
sindromu hiper IgM: dok je prije smatran jedinstve-
nim poremećajem, analiza mutacija gena pokazala
je da je riječ o nekoliko tipova oštećenja gena koja
zahvaćaju ne samo limfocite T nego i limfocite B. U
skladu s tim je i raznolika klinička prezentacija tog
sindroma. Iz navedenoga proizlazi da napredak la-
boratorijske tehnologije omogućuje sve bolji uvid u
razumijevanje imunopatogeneze specifičnih imuno-
deficijencija, a ta činjenica postavlja nove zahtjeve
pred klinički laboratorij.
SEKUNDARNE IMUNODEFICIJENCIJE
Sekundarne imunodeficijencije mnogo su češće od
primarnih, a nastaju kao rezultat mnogobrojnih pa-
toloških stanja. Najčešće uzroci stečene imunode-
ficijencije jesu pothranjenost, metaboličke bolesti
(šećerna bolest, Cushingov sindrom), zarazne bole-
sti (AIDS, citomegalovirus), autoimune bolesti (npr.
SLE), opsežne ozljede (posebice toplinske), primjena
imunosupresijskih lijekova i zračenja, kao i presadba
tkiva i organa. Oštećenje može zahvatiti nespecifič-
nu (npr. kožu, sluznice i njihove izlučine, normalnu
mikrobnu floru, granulocite i fagocitozu, NK stanice
i komplement) i specifičnu imunost (limfocite T i B,
odnosno protutijela). No, u većine imunokompromi-
tiranih bolesnika postoji združen poremećaj obrane,
kao što je npr. oštećenje sluznice zračenjem i citosta-
ticima i smanjen broj lekocita u krvi.
Dijagnostika sekundarnih imunodeficijencija
U načelu, laboratorijska dijagnostika sekundarnih
imunodeficijencija ne razlikuje se od dijagnostike
primarnih imunodeficijencija. U oba slučaja labora-
torijska dijagnostika ima za cilj i predviđanje vrste po-
tencijalne zaraze, jer zaraze u takvih bolesnika često
imaju atipični oblik i više uzročnika (npr. pneumonija
uzrokovana citomegalovirusom i Pneumocystis sp. u
bolesnika s presađenom koštanom srži) (tablica 55.1).

Tablica 44.5. Specijalni testovi fagocita u dijagnostici primarnih imunodeficijencijskih sindroma

Oksidativni prasak (NBT-test, protočna citometrija)
Protočna citometrija za analizu izražaja adhezijskih molekula (CD11/CD18)
Kemotaksija
Fagocitoza
Enzimski test MPO-e i G6PD-e
Mikrobicidna aktivnost fagocita
Biopsija koštane srži
Analiza gena (primjeri mutacija):
• X-vezana kronična granulomatozna bolest: CYBB
• autosomno-recesivna kronična granulomatozna bolest: CYBA, NCF1, NCF2
• manjak leukocitnih adhezijskih molekula: ITGB2, FLJ11320
• Chediak-Higashijev sindrom: LYST

530 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

NOVIJE SPECIJALNE PRETRAGE
LIMFOCITA
Riječ je o testovima koji su do prije koju godinu bili
mahom eksperimentalni, a danas su neki od njih
postali sastavnim dijelom novorođenačkog probira
na tešku združenu imunodericijenciju. Među njima
su izdvajaju T-stanična spektratipizacija (engl. T-cell
spectratyping), tehnologija MHC/HLA-tetramera te
analiza TREC-a.
T-stanična spektratipizacija označuje analizu varijabil-
nih regija β-lanaca (Vβ) receptora limfocita T s pomo-
ću metode PCR. U normalnim su prilikama sve obitelji
Vβ-lanaca (n=24) podjednako zastupljene u receptori-
ma limfocita T, što upućuje na poliklonsku narav lim-
focita T u periferiji. U nekim imunodefcijencijama (npr.
u Omenovu sindromu) i nakon presadbe krvotvornih
stanica, nalazi se ograničen broj obitelji Vβ-lanaca re-
ceptora limfocita T u krvi i u tkivima. Taj nalaz govori
u prilog oligoklonskog razvoja limfocita T.
Tehnologija HLA/MHC tetramera važna je za određi-
vanje broja antigen specifičnih limfocita T, posebice
u istraživanjima virusnih zaraza, cijepljenja i auto-
imunosti, pa je za sada ograničena na specijalizirane
istraživačke centre.
LITERATURA
Batnić D. Laboratorijska dijagnostika imuno­deficijencijskih
sindroma. Paediatr Croat 2005;49(1):39-47.
Batinić D, Malenica B. Racionalni pristup laboratorijskoj dija-
gnostici imunoloških poremećaja. Paediatr Croat 2012;56(Supl
1):53-61.
Bonilla FA, Bernstein IL, Khan DA, Ballas ZK, Chinen J, Frank
MM, et al. Practice parameter for the diagnosis and manage-
ment of primary immunodeficiency. Ann Allergy Asthma
Immunol 2005;94(5 Suppl 1):S1-63.
Cant A, Battersby A. When to think of immunodeficiency?
Adv Exp Med Biol 2013;764:167-77.
Kelly BT, Tam JS, Verbsky JW, Routes JM. Screening for seve-
re combined immunodeficiency in neonates. Clin Epidemiol
2013;5:363-9.
Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma | 531
Analiza TREC-a. Pojednostavnjeno, tijekom razvoja
limfocita T, višak genskog materijala koji je odgovo-
ran za receptor limfocita T biva izrezan iz DNA i tvori
kružne strukture unutar stanice (TRECs). Novonastali
(naivni) limfociti T jesu TREC+ stanice, dok limfociti
T nakon podražaja i dioba gube TREC, pa se smanju-
je i ukupni udio TREC+ stanica u periferiji. Metoda se
najčešće rabila u istraživanju T-staničnih imunodefi-
cijencija (npr. Di Georgeova sindroma) i oporavka
limfocita T nakon transplantacije krvnotvornih ma-
tičnih stanica. Danas je, međutim, postala rutinskom
metodom novorođenačkog probira na SCID i teške
limfopenije T u dijela saveznih država SAD-a što go-
vori u prilog što ranijeg otkrivanja poremećaja prije
nego što dođe do infekcija i trajnog oštećenje tkiva.
Mogućnosti ispitivanja imunološkog sustava sve su
veće, posebice kada se to pitanje razmatra u sklopu
suvremenih laboratorijskih tehnika. No, pravi izazov
za laboratorij jest prijenos sve složenijih laboratorij-
skih tehnika u klinike i kliničke laboratorije. Bez
ulaska suvremenih tehnologija i metoda u rutinski
laboratorij ne će biti moguće odgovoriti na sve veće
zahtjeve za brzom i pouzdanom dijagnostikom, a
time i odgovarajućim liječenjem bolesnika s imuno-
deficijencijom.
Marodi L, Notarangelo LD. Immunological and genetic ba-
ses of new primary immunodeficiencies. Nat Rev Immunol
2007;7:851-61.
Notarangelo LD. Primary immunodeficiencies. J Allergy Clin
Immunol 2010;125(2 Suppl 2):S182-94.
Reust CE. Evaluation of primary immunodeficiency disease in
children. Am Fam Physician 2013;87(11):773-8.
Somech R, Amariglio N, Spirer Z, Rechavi G. Genetic pre-
disposition to infectious pathogens: a review of less familiar
variants. Pediatr Infect Dis J 2003;22(5):457-61.
Wehr C, Kivioja T, Schmitt C, Ferry B, Witte T, Eren E, et al.
The EUROclass trial: defining subgroups in common variable
immunodeficiency. Blood 2008;111(1):77-85.
 Pitanja i odgovori

1. Na što ukazuje manjak izohemaglutinina u djeteta krvne grupe AB?

Normalan fiziološki nalaz.

2. Što treba znati pri analizi limfocitnih subpopulacija periferne krvi?

Apsolutni broj je važniji podatak od relativnog broja.

3. U kojih bolesnika je nemogućnost razvoja respiracijskog praska u granulocitima karakterističan nalaz?

U bolesnika s kroničnom granulomatoznom bolešću.

4. Čime treba biti završena moderna dijagnostika primarnih imunodeficijencijskih sindroma?

Dijagnostiku treba završiti molekularnom analizom na razini gena i/ili biokemijskom analizom (produkta).

5. Koji navod nije točan za funkcijske testove imunosnih stanica in vitro:

Moguća je pouzdana usporedba kvantitativnih rezultata između laboratorija; oslanjaju se na reprodukciju re-
zultata vlastitog laboratorija; radi se o složenim testovima; uglavnom su nestandardizirani, korelacija s tijekom
bolesti posredno približava razumijevanje njihove uloge u imunopatogenezi bolesti.

532 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 56.
Hemostaza i laboratorijska dijagnostika
poremećaja hemostaze
Désirée Coen Herak i Marija Miloš

HEMOSTAZA
Hemostaza predstavlja složeni proces međusobno povezanih reakcija koje sudjeluju u zaustavljanju krvare-
nja nakon ozljede krvne žile. Prema preciznijoj kliničkoj definiciji hemostaza je obrambeni mehanizam koji
održavanjem krvi u tekućem stanju i kontroliranim sprječavanjem prekomjernog gubitka krvi iz intravasku-
larnog prostora neprekidno štiti organizam od krvarenja i patoloških trombotičkih događaja kao što su infarkt
miokarda, moždani udar, arterijska ili duboka venska tromboza (DVT).
Fiziološka hemostaza uključuje uravnoteženo međudjelovanje trombocita s brojnim prokoagulacijskim i an-
tikoagulacijskim čimbenicima (faktorima zgrušavanja i njihovim inhibitorima) s endotelom krvnih žila. Svaki
poremećaj ravnoteže između prokoagulacijskih i antikoagulacijskih čimbenika bez obzira na uzrok rezultira
patološkom hemostazom, pa tako pojačano djelovanje antikoagulacijskih čimbenika nakon ozljede krvne
žile uzrokuje različite stupnjeve krvarenja, dok pojačana aktivnost prokoagulacijskih čimbenika rezultira
prekomjernom aktivacijom sustava zgrušavanja i posljedičnom trombozom.
Proces hemostaze uključuje tri osnovne faze: primarnu hemostazu (prva faza) u kojoj nastaje trombocitni
ugrušak, sekundarnu hemostazu tj. proces zgrušavanja krvi (druga faza) koju karakterizira nastajanje fibrin-
skog ugruška na mjestu nastalog trombocitnog ugruška, te fibrinolizu (treća faza) u kojoj se odvija proces
liziranja stvorenog fibrinskog ugruška.

Primarna hemostaza
Primarna hemostaza je proces interakcije (međudjelovanja) trombocita s elementima oštećene stijenke krvne
žile koji rezultira nastajanjem trombocitnog ugruška. Proces primarne hemostaze uključuje slijed međusobno
povezanih reakcija koji se sastoji od adhezije (priljubljivanja) trombocita na komponente subendotela, ak-

533
tiviranja i promjene oblika trombocita, lučenja sadr-
žaja iz trombocitnih granula što u konačnici dovodi
do agregacije trombocita i retrakcije ugruška. Nepo-
sredno nakon ozljede krvne žile započinje proces
primarne hemostaze početnim priljubljivanjem trom-
bocita na izloženi subendotelni vanstanični matriks.
U subendotelnom vanstaničnom matriksu nalazi se
veći broj različitih liganada kao što su kolagen, von
Willebrandov faktor (VWF), laminin, fibronektin i
trombospondin, koji se vežu na različite trombocit-
ne receptore, što omogućuje čvrsto priljubljivanje
(adheziju) i aktiviranja trombocita te lučenje sadr-
žaja iz trombocitnih granula. Trombocitne α- i guste
granule sadrže brojne aktivne spojeve od kojih su
adenozin difosfat (ADP), adenozin trifosfat (ATP) i
serotonin snažni aktivatori trombocita koji svojim
izravnim djelovanjem pojačavaju proces primarne
hemostaze. Trombociti također sintetiziraju farma-
kološki aktivne molekule tromboksan A2 i aktivi-
rajući faktor trombocita koji se vežu na specifične
membranske receptore drugih trombocita, privlače
i aktiviraju nove trombocite i time doprinose naku-
pljanju trombocita. Istodobno kao posljedica akti-
vacije trombocita dolazi do premještanja negativno
nabijenih fosfolipida iz unutarnjeg u vanjski mem-
branski dvosloj i dramatičnog povećanja sadržaja
fosfatidilserina na vanjskoj strani membrane, čime
se stvara kritična katalitička površina za aktiviranje
faktora zgrušavanja.
Normalno odvijanje primarne hemostaze nije mogu-
će bez aktivnog međudjelovanje trombocita s faktori-
ma zgrušavanja: VWF i fibrinogenom, koji predstav-
ljaju dva najvažnija adhezijska proteina u primarnoj
hemostazi. VWF je veliki multimerični glikoprotein
(GP) koji se osim u subendotelnom matriksu nalazi u
plazmi, α- granulama i Weibel-Paladijevim tjelešcima
i čini poveznicu između tkiva i trombocita. Veže se
na izloženi kolagen, te na trombocite preko veznog
mjesta koji se nalazi na GP Iba, glavnom receptoru
za VWF i sastavnom dijelu kompleksa GPIb/IX/V. Si-
metrična struktura molekule fibrinogena omogućuje
međusobno povezivanje trombocita vezanjem na ak-
tivirani trombocitni receptor GPIIb/IIIa što rezultira
agregacijom trombocita i nastankom trombocitnog
534 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
ugruška. Trombocitni ugrušak samo je privremena
mjera za zaustavljanje krvarenja, dok se aktivacijom
sustava zgrušavanja i stvaranjem trombina slijedom
međusobno povezanih i kontroliranih reakcija u
procesu sekundarne hemostaze nastali trombocitni
ugrušak stabilizira i učvršćuje pomoću niti fibrinskih
polimera.
Sekundarna hemostaza
Različiti modeli sustava zgrušavanja krvi mijenjali su
se tijekom vremena ovisno o trenutnim spoznajama
pojedinih komponenata sustava zgrušavanja i njiho-
vim funkcijama. Doprinos u razumijevanju hemostat-
skog procesa omogućilo je otkriće staničnog modela
zgrušavanja krvi. Za razliku od kaskadnog modela
prema kojem nakon ozljede krvne žile fibrinski ugru-
šak nastaje aktivacijom unutarnjeg ili vanjskog puta
zgrušavanja, stanični model pojašnjava i dokazuje
kako unutarnji i vanjski put zgrušavanja nisu dva
odvojena i neovisna mehanizma, već se međusobno
isprepliću i zajedno sudjeluju u procesu zgrušavanja
krvi. Prema staničnom modelu reakcije zgrušava-
nja krvi odvijaju se na TF-stanicama, trombocitima
i endotelnim stanicama, koje s obzirom na njihova
prokoagulacijska ili antikoagulacijska svojstva ima-
ju različite uloge u procesu zgrušavanja. Pri tome
trombociti zauzimaju središnju ulogu u podržavanju
prokoagulacijskih reakcija, dok su endotelne stanice
krvnih žila nužne za održavanje antikoagulacijskih
osobina krvnih žila. U procesu zgrušavanja razlikuju
se 3 faze: početna, amplifikacijska i propagacijska
faza (Slika 56.1.).
Početna faza zgrušavanja započinje nakon ozljede
krvne žile vezanjem plazmatskog FVII, od kojeg se
1-2 % nalazi u aktivnom obliku (FVIIa), s tkivnim
faktorom (TF) vezanim na membrani ekstravasku-
larne stanice koja sintetizira TF (TF-stanica, npr. fi-
broblasta). Aktivni enzimski kompleks staničnog TF
i FVIIa (TF-VIIa) aktivira FVII vezan na površini sta-
nice koja izražava TF u kompleks TF-VIIa koji akti-
vira FIX i FX u aktivne serinske proteaze FIXa i FXa.
FIXa napušta TF-stanicu i veže se na trombocitnu
površinu. FXa može aktivirati plazmatski FV, a FXa
koji ostaje vezan na površini stanice koja nosi TF,
 X
II V
XI VIII/VWF
VIIa TF Xa Va
Trombin
TF-stanica (IIa)
VIIa TF
XIa VIIIa
Va
IX
IXa
Slika 56.1. Prikaz svih procesa koji se odvijaju tijekom procesa zgrušavanja krvi (početne, amplifikacijske i propagacijske faze zgrušavanja)
prema staničnom modelu zgrušavanja
veže se u kompleks s FVa koji iz protrombina stvara
malu količinu trombina. Stvorena količina trombina
predstavlja <5 % ukupne količine trombina koji na-
staje u procesu zgrušavanja, te je dovoljna samo za
aktivaciju nekih faktora zgrušavanja (FV, FVIII i FXI)
i trombocita, ali ne i za pretvorbu fibrinogena u fibrin
i nastajanje hemostatskog ugruška.
Amplifikacijska faza zgrušavanja započinje ak-
tivacijom faktora zgrušavanja V, VIII i XI. U plazmi
se FVIII nalazi u kompleksu s VWF koji služi kao
specifični nosač FVIII i štiti ga od prerane proteoli-
tičke razgradnje. VWF se veže na trombocitni GPIba,
na koji se veže i trombin i to u neposrednoj blizini
kompleksa FVIII-VWF. Trombin aktivira FVIII i otcje-
pljuje FVIIIa iz kompleksa s VWF, pa se relativno ne-
stabilni FVIIIa stvara izravno na trombocitnoj povr-
šini i na istoj veže preko specifičnog veznog mjesta.
Nanomolarna količina trombina nastalog u početnoj
fazi zgrušavanja aktivira FV i FXI koji se vežu na
trombocite adherirane na ekstravaskularnim kom-
ponentama matriksa na mjestu ozljede krvne žile.
Proces vezanja na proteine matriksa, posebice na
kolagen, djelomično aktivira trombocite i lokalizira
ih na mjestu izlaganja TF. Trombin je najsnažniji fizi-
ološki agonist trombocita, a za maksimalni hemostat-
ski učinak trombocita nužno je vezanje trombina na
tri različita vezna proteina: GPIba i dva transmem-
X
Trombocit
II Fibrinogen
Xa TROMBIN
Va
XIa VIIIa (IIa)
Aktivirani
XIa trombocit Fibrin
IX
branska receptora iz superobitelji proteazom aktivi-
ranih receptora (PARs) vezanih na protein G, PAR1
i PAR4. Vezanje trombina na kompleks GPIb/IX/V
značajno olakšava aktivaciju PAR1 te katalizira akti-
vaciju trombocita. Trombin hidrolitičkim cijepanjem
aktivira PAR1 i PAR4, a signal se u stanicu prenosi
preko proteina G, s tim što PAR1 potiče aktivaciju
trombocita kod niskih koncentracija trombina, dok
PAR4 doprinosi aktivaciji trombocita samo kod viso-
kih koncentracija trombina.
Rezultat aktivacije trombocita je izlučivanje hemo-
statski aktivnih tvari iz trombocita među kojima i
četiri faktora zgrušavanja pohranjenih u a-granula-
ma i citoplazmi trombocita (fibrinogena, FV, FXI i
FXIII), koji izravno sudjeluju u nastajanju stabilnog
fibrinskog ugruška. Aktivacija trombocita, FV, FVIII
i FXI omogućava nastajanje prokoagulacijskih kom-
pleksa i velike količine trombina u propagacijskoj
fazi zgrušavanja, s tim što se na površinu aktiviranih
trombocita prvo vežu aktivirani kofaktori Va i VIIIa
te FXIa, pa tek nakon toga faktori zgrušavanja koji
čine prokoagulacijske enzimske komplekse.
Propagacijska faza zgrušavanja započinje veza-
njem FIXa, nastalog aktiviranjem FIX djelovanjem
kompleksa TF-VIIa, na površinu trombocita. Dodat-
na količina FIXa nastaje i drugim mehanizmom, dje-
lovanjem prethodno vezanog FXIa na trombocitnoj
Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze | 535
površini na FIX. Vezani FIXa stvara s vezanim FVIIIa
tenazni enzimski kompleks, što predstavlja osnovu
za nastajanje fiziološki značajnih koncentracija FXa
na aktiviranoj trombocitnoj membrani. Tenazni
kompleks 105-106 puta brže aktivira FX od samog
FIXa te 50-100 puta brže od kompleksa TF-FVIIa.
Enzimskom aktivnošću tenaznog kompleksa FIXa-
FVIIIa nastaje >90 % od ukupno stvorenog FXa. U
protrombinazni kompleks može se vezati jedino FXa
koji je nastao na površini trombocita jer je zaštićen
od djelovanja nekoliko inhibitora zgrušavanja: ini-
bitora puta TF (TFPI), antitrombina (AT) i heparina,
što omogućuje vezanje s FVa u kompleks koji ima
aktivnost protrombinaze. Za razliku od toga FXa koji
nastaje djelovanjem kompleksa TF-VIIa na FX biva
inhibiran prije nego što dođe u blizinu aktiviranih
trombocita. Djelovanjem protrombinaze nastaje do-
statna koncentracija trombina za nastajanje stabilnog
fibrinskog ugruška. Trombin prvo iz fibrinogena
otcjepljuje fibrinopeptide A i B te aktivira FXIII u
aktivnu transglutaminazu što omogućuje polimeri-
zaciju fibrinskih vlakana i učvršćivanje fibrinskog
ugruška.
Različiti proteini koji sudjeluju u procesu zgrušava-
nja krvi (faktori zgrušavanja) nalaze se u cirkulaciji
u različitim koncentracijama, ovisno o njihovim spe-
cifičnim ulogama (Tablica 56.1.). Komponente koje
sudjeluju u ranoj fazi zgrušavanja nalaze se u mnogo
manjim koncentracijama u odnosu na one faktore
koji sudjeluju u kasnijim fazama zgrušavanja. Visoka
koncentracija fibrinogena neophodna je za nastaja-
nje fibrinskog ugruška, dok je niska koncentracija
FVIII dostatna za aktivaciju FX. Od faktora ovisnih
o vitaminu K, FVII se nalazi u najnižoj koncentraciji,
FIX i FX u intermedijarnim, a FII u najvišoj koncen-
traciji. Prirodni inhibitori zgrušavanja su uglavnom
inhibitori serinskih proteaza, osiguravaju lokalizira-
no zgrušavanje samo na mjestu oštećenja krvne žile.
Hemostatski najvažniji prirodni inhibitori zgrušava-
nja s antikoagulacijskim djelovanjem su: AT koji in-
hibira IXa, Xa, XIa i kompleks TF-VIIa, heparinski
kofaktor II, TFPI koji inhibira TF, VIIa i Xa, protein C
koji u aktiviranom obliku inhibira Va i VIIIa i protein
S (Tablica 56.1.).
536 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
Fibrinoliza
Fibrinoliza je proces liziranja stvorenog fibrinskog
ugruška koji na taj način regulira lokalizirano stva-
ranje ugruška, a u najvećoj mjeri ovisi o aktivaci-
ji plazminogena. Plazminogen se može aktivirati
djelovanjem tkivnog ili urokinaznog aktivatora
plazminogena pri čemu nastaje ključni enzim fi-
brinolitičkog sustava plazmin. Iako plazmin može
hidrolizirati nekoliko različitih supstrata, najzna-
čajnije je njegovo djelovanje na fibrinogen i fibrin.
Razgradnja fibrinskog ugruška odvija se stupnjevito
pri čemu nastaju razgradni produkti različite mole-
kularne mase. Završni, odnosno najmanji razgradni
produkt nastao fibrinolitičkim djelovanjem plazmina
na umreženi fibrin je D-dimer približne molekularne
mase od 190 kDa, koji se sastoji od 2 kovalentno
povezane D-domene susjednih g-lanaca fibrinskog
polimera.
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
POREMEĆAJA HEMOSTAZE
Laboratorijska dijagnostika ima ključnu ulogu u dija-
gnostici i praćenju većine hemostatskih poremećaja,
kao i praćenju antikoagulacijske i nadomjesne tera-
pije. Načelno, u dijagnostici hemostatskih poreme-
ćaja preporuča se postupni dijagnostički pristup, pa
se u tu svrhu provode različite pretrage prve (pre-
trage probiranja), druge (određivanje funkcionalnih
aktivnosti pojedinih komponenti, pretrage funkcije
trombocita) i treće razine koje se izvode samo u spe-
cijaliziranim laboratorijima (određivanje prisutnosti
nespecifičnih i specifičnih inhibitora zgrušavanja,
određivanje koncentracije antigenih komponenti
pojedinih komponenti),
Pretrage probiranja u hemostazi
(Osnovne koagulacijske pretrage)
Za laboratorijsko otkrivanje većine klinički važnih
hemostatskih poremećaja u prvom se koraku izvode
pretrage probiranja (globalne pretrage): protrombin-
sko vrijeme (PV), aktivirano parcijalno trombopla-
stinsko vrijeme (APTV), fibrinogen (Fbg) i rjeđe
Tablica 56.1. Karakteristike (značajke) faktora zgrušavanja i prirodnih inhibitora zgrušavanja
Protein (kratica) Kromosom Funkcija In vivo Koncentracija Kliničko stanje
t1/2 (h) u plazmi (nM)
Krvarenje Tromboza
Fibrinogen (FI) 4q23-q32 Supstrat 100-150 7600 + +
Protrombin (FII) 11p11 Neaktivna serinska 50-120 1400 + +
proteaza ovisna o vita-
minu K
Tkivni faktor (FIII) 1p22-p21 Receptor-kofaktor / / / /
Faktor V (FV) 1q21-25 Prokofaktor 12-36 20 + +
Faktor VII (FVII) 13q34 Neaktivna 4-6 10 + +
serinska proteaza ovi-
sna o vitaminu K
Faktor VIII (FVIII) Xq28 Prokofaktor 10-16 0,7 + +
Faktor IX (FIX) Xq27.1-q27.2 Neaktivna 18-24 90 +
serinska proteaza ovi-
sna o vitaminu K
Faktor X (FX) 13q32-qter Neaktivna 36-48 170 +
serinska proteaza ovi-
sna o vitaminu K
Faktor XI (FXI) 4q35 Neaktivna 40-80 30 +
serinska proteaza
Faktor XII (FXII) 5q33-qter Neaktivna serinska pro- 50-70 375 +?
teaza kontaktni faktor
Prekalikrein (PK) 4q34-q35 Neaktivna serinska 35 450
proteaza
Visokomolekularni 3q26qter Kofaktor 150 6000
kininogen (HMWK)
Faktor XIII (FXIII) Neaktivna transgluta- 150-300 90 +
FXIIIA 6p24-25 minaza
FXIIIB 1q31-q32.1
Von Willebrandov 12p13.13 Medijator 24 + +?
faktor (VWF)
Antitrombin (AT) 1q22-25 Inhibitor serinskih 50-70 3400 +
proteaza
Protein C (PC) 2q14-21 Neaktivna serinska 6-8 60 +
proteaza ovisna o vita-
minu K
Protein S (PS) 3q11.2 Kofaktor ovisan o vita- 42 300 +
minu K
Trombomodulin (TM) 20p12-cen Receptor-kofaktor / / +?
Heparinski kofaktor II 22q11 Inhibitor serinskih 1200 +/-
(HC II) proteaza
Inhibitor puta tkivnog 2q31-32.1 Inhibitor tipa Kunitz / 2,5 +?
faktora (TFPI)
Inhibitor fibrinolize 13q14.11 Neaktivna 0,17 75 +?
aktiviran trombinom prokarboksipeptidaza
(TAFI)
t1/2-vrijeme poluživota

Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze | 537

trombinsko vrijeme (TV), kao i broj trombocita, dok
se pretrage funkcije trombocita obično ne izvode u
okviru osnovnog ispitivanja. Rezultati pretrage pro-
biranja unutar referentnih intervala ne isključuju mo-
gućnost postojanja blagog manjka pojedinih faktora
zgrušavanja, te je stoga bitno rezultate interpretirati
zajedno s podacima iz osobne i obiteljske anamneze.
U tablici 56.2. prikazani su najčešći mogući uzroci
dobivenih rezultata pretraga probiranja. Slijede pre-
trage mjerenja aktivnosti pojedinačnih faktora zgru-
šavanja kao i metode miješanja s normalnom plaz-
mom.
Protrombinsko vrijeme (PV)
PV je globalna koagulacijska pretraga kod koje se
mjeri brzina nastanka ugruška (u sekundama) u re-
akcijskom sustavu u kojem se u uzorak citratne plaz-
me dodaje reagens tromboplastin (TF) i kalcij. TF iz
reagensa veže i aktivira FVII što rezultira aktivacijom
vanjskog puta zgrušavanja, nastankom trombina i
ugruška. Dobiveni rezultat ovisi o aktivnostima FII,
FV, FVII, FX i fibrinogena. PV se koristi kao pretra-
ga probira na nasljedne i stečene poremećaje „vanj-
skog� i „zajedničkog� puta zgrušavanja te kao pretra-
ga laboratorijskog praćenja oralne antikoagulacijske

Tablica 56.2. Mogući uzroci i tumačenje rezultata hemostatskih pretraga probiranja

Pretraga
Mogući uzrok (poremećaj)
PV APTV Fbg TV Broj trombocita
N N N N Poremećaj stijenke krvnih žila
N Poremećaj funkcije trombocita
Manjak FXIII ili inhibitora plazmina
von Willebrandova bolest
P N N N N Manjak FVII
Početna faza oralne antikoagulacijske terapije
N P N N N Manjak FVIII, FIX, FXI, FXII, PK ili HMWK
von Willebrandova bolest
Inhibitori na FVIII, FIX, FXI ili FXII
Lupus anticoagulant
N ili P N ili P N N N Niskomolekularni heparin
Direktni inhibitori FX
P P N N N Manjak vitamina K
Oralna antikoagulacijska terapija
Manjak FII, FV ili FX
Inhibitori na FII, FV ili FX
Kombinirani manjak FV i FVIII
N ili P P N P N Visokomolekularni heparin
P P N P N Direktni inhibitori trombina
P P ↓ P N Bolesti jetre
Afibrinogenemija, hipo-ili disfibrinogenemija
Hiperfibrinoliza
N N N N ↓ Trombocitopenija
P P N ili ↓ N ↓ Bolesti jetre
P P N ili ↓ P ↓ Diseminirana intravaskularna koagulacija Masivna transfuzija
Akutna bolest jetre
N-rezultat unutar referentnog intervala; P-rezultat izvan referentnog intervala: PV<0,70, APTV i TV-rezultat iznad gornje granice referen-
tnog intervala

538 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

terapije (Slika 56.2.). Slika 56.3. prikazuje preporu-
čeni algoritam laboratorijskog ispitivanja sniženog
rezultata PV udjela.
Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme
(APTV)
APTV je globalna koagulacijska pretraga kod koje
se uzorak citratne plazme prethodno inkubira s re-
agensom koji se sastoji od fosfolipida i aktivatora
kontaktnog sustava (kaolin, silika, elaginska kiseli-
na), pri čemu dolazi do aktivacije FXII, FXI i FIX.
Nakon dodatka kalcija u reakcijsku smjesu dolazi
do aktivacije FX i kaskade reakcija koje rezultiraju
nastankom trombina i ugruška, što se zabilježi kao
vrijeme nastanka ugruška (u sekundama. Dobiveni
rezultat ovisi o aktivnostima FII, FV, FVIII, FIX, FX,
FXI, FXII i fibrinogena (Slika 56.2.). APTV se koristi
kao pretraga probira na nasljedne i stečene pore-
mećaje „unutarnjeg� puta zgrušavanja, na prisutnost
lupus antikoagulanta te kao metoda laboratorijskog
praćenja heparinske terapije. Slika 56.4. prikazuje
preporučeni algoritam laboratorijskog ispitivanja
produljenog rezultata APTV-a (sekunde).
Fibrinogen (Fbg)
Preporučena metoda za mjerenje aktivnosti Fbg je
Claussova metoda kod koje se mjeri vrijeme zgru-
šavanja razrijeđenog uzorka citratne plazme nakon
dodatka standardizirane koncentracije trombina u
suvišku (Slika 56.2.), a dobiveno vrijeme zgrušava-
nja razmjerno je aktivnosti fibrinogena u uzorku u
g/L. Mjerenje aktivnosti Fbg koristi se za otkrivanje
nasljednog ili stečenog poremećaja sinteze fibrino-
gena (afibrinogenemija, hipofibrinogenemija, disfi-
brinogenemija), povećane potrošnje u diseminiranoj
intravaskularnoj koagulaciji (DIK-u), u primarnoj
fibrinogenolizi, za praćenje trombolitičke terapije i
kao rizičnog faktora arterijske tromboze.

UNUTARNJI PUT

APTV reagens
HMWK VANJSKI PUT
FXII (aktivator + fosfolipidi)
PK
FXI

FXIIa Tromboplastin
FIX FVII
FX
Ca2+
FXIa
TF
Ca2+
FIXa FVIIa
FVIIIa
APTV
FXa

FVIII PV
Ca2+ FVa FV

FII FIIa Trombin

TV

Fibrinogen Fibrin

Slika 56.2. Pojednostavljeni shematski prikaz sustava zgrušavanja krvi prema kaskadnom modelu kojim se objašnjavaju hemostatske
pretrage probiranja: aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTV), protrombinsko vrijeme (PV) i trombinsko vrijeme (TV)

Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze | 539

 snižen PV
Na vrijednosti fibrinogena utječu dob, spol, puše-
nje, stres te ukupna tjelesna masa, a porast kon-
centracija fibrinogena opažen je sa starosnom
dobi, kod pušača i u trudnoći. Snižene vrijedno-
miješanje s normalnom
plazmom sti fibrinogena (g/L) mogu biti rezultat smanjene
sinteze fibrinogena u jetri, (npr. ciroza jetre i kod
otrovanja) ili njegove povećane potrošnje kao npr.
u DIK-u.

snižen PV normalan PV Trombinsko vrijeme (TV)

TV je koagulacijska pretraga kod koje se mjeri brzi-
na nastanka ugruška (u sekundama) u reakcijskom
specifični inhibitori sustavu u kojem se u uzorak citratne plazme dodaje
aktivnost faktora
na faktore zgrušavanja reagens trombin koji prevodi fibrinogen u fibrin (Slika
zgrušavanja VII
(rijetko kupus antikoagulant)
56.2.). Određivanje TV se koristi kao pretraga probi-
ranja na poremećaje nastajanja fibrina, u slučajevima
Slika 56.3. Preporučeni algoritam ispitivanje sniženog PV-a
sumnje na afibrinogenemiju,
hipofibrinogenemiju i disfibri-
nogenemiju, te za razlikovanje
produljen APTV poremećaja stvaranja fibrina
od stanja uslijed prisutstva he-
parina u uzorku.
miješanje s normalnom
plazmom Mjerenje aktivnosti
pojedinačnih faktora
zgrušavanja
Za mjerenje aktivnosti poje-
dinačnih faktora zgrušavanja
normalan APTV produljen APTV
najčešće se koristi koagulacij-
ska metoda u jednom stupnju
koja predstavlja prilagođenu
aktivnost faktora metodu PV za FII, FV, FVII
pretrage na prisutnost
zgrušavanja
VIII, IX, XI i XII
lupus antikoagulanta i FX i prilagođenu metodu
APTV za FVIII, FIX, FXI i FXII.
Metoda se temelji na svojstvu
razrijeđene citratne plazme
bolesnika da skrati tj. korigi-
pozitivne negativne ra PV ili APTV plazme koja
ima aktivnost mjerenog fak-
tora <0,01 kIU/L (deficijentna
lupus specifični inhibitori plazma). S obzirom da su u
antikoagulant na faktore zgrušavanja reakcijskom sustavu u suviš-
ku prisutni svi faktori zgruša-
Slika 56.4. Preporučeni algoritam ispitivanja produljenog APTV-a vanja osim mjerenog faktora,

540 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

vrijeme nastanka ugruška ovisno je samo o aktiv-
nosti ispitivanog faktora u uzorku plazme. Analizu
je potrebno izvoditi u 3 razrjeđenja uzorka citratne
plazme, kako bi se dobila točna aktivnost mjerenog
faktora zgrušavanja i isključila moguća prisutnost in-
hibitora zgrušavanja (npr. lupus antikoagulant).
Metode miješanja s normalnom plazmom
Metodama miješanja s normalnom plazmom ispituje
se uzrok sniženog PV-a ili produljenog APTV-a. Na-
kon miješanja uzorka citratne plazme s normalnom
plazmom u omjeru 1:1 ponavlja se mjerenje PV i/ili
APTV. Potpuna korekcija rezultata upućuje na sniže-
nu aktivnost faktora zgrušavanja dok nepotpuna ko-
rekcija rezultata ukazuje na inhibiciju koagulacijske
reakcije specifičnim inhibitorima usmjerenim na fak-
tore zgrušavanja ili nespecifičnim inhibitorima kao
što je lupus antikoagulant. Metoda je osobito korisna
za ispitivanje produljenog APTV-a, dok je sniženi PV
u većini slučajeva posljedica smanjene aktivnosti fak-
tora zgrušavanja.
D-dimeri
Određivanje koncentracije D-dimera izvodi se enzi-
mimunokemijskom analizom uporabom monoklon-
skih antitijela specifičnih za epitope koji sa nalaze na
fibrinskom fragmentu D-dimer, ali ne i na fibrino-
genskom fragmentu D, drugim razgradnim produk-
tima fibrinogena ili nativnom fibrinogenu, u uzorku
plazme ili pune krvi. Referentni interval i granična
vrijednost za isključivanje tromboze ovisna je o re-
agensu i sustavu koji se primjenjuju za određivanje
koncentracije D-dimera. Koncentracija D-dimera glo-
balni je pokazatelj stvaranja fibrina in vivo i predstav-
lja izrazito osjetljiv, ali nespecifičan parametar, pa se
na temelju povišene koncentracije D-dimera ne može
pouzdano utvrditi dijagnoza. Niske koncentracije D-
dimera normalno su prisutne u plazmi zdravih osoba,
a smatra se da su rezultat fiziološke fibrinolize. U ra-
zličitim patološkim stanjima kao npr. DIK-u i venskoj
tromboemboliji koja uključuje DVT i plućnu emboliju
(PE), prekomjerno stvaranje fibrina može uzrokovati
nastajanje intravaskularnih tromba. Kao rezultat fibri-
nolize dolazi do porasta koncentracija D-dimera, čije
Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze | 541
vrijednosti mogu biti i do 100 puta više od normalnih
vrijednosti. Koncentracija D-dimera može biti povi-
šena i nakon većih operativnih zahvata, traume, u
malignim bolestima, bolestima jetre, bolesti srpastih
stanica, sepsi i preeklampsiji itd. D-dimeri imaju vi-
soku negativnu prediktivnu vrijednost jer vrijednosti
niže od granične vrijednosti isključuju trombozu.
Pretrage funkcije trombocita
Trombociti imaju važnu ulogu u održavanju normalno-
ga hemostatskog odgovora za koju je uz normalan broj
nužna i njihova normalna funkcija. Bolesnici s pore-
mećajima broja (kvantitativnim) i/ili funkcije (kvalita-
tivnim) trombocita uobičajeno imaju krvarenja u kožu
i sluznice različitog stupnja te pojačano krvare nakon
operacije ili traume. Stoga su pretrage funkcije trom-
bocita nužne za utvrđivanje mogućeg uzroka krvare-
nja, za razlikovanje poremećaja funkcije trombocita od
koagulacijskih poremećaja i postavljanje dijagnoze na-
sljednih i stečenih poremećaja krvarenja. Poremećaje
funkcije trombocita mnogo je teže dijagnosticirati od
koagulacijskih poremećaja jer do danas ne postoji niti
jedna pretraga probiranja koja bi bila dovoljno osjetlji-
va na sve poznate poremećaje trombocita.
U prošlosti se ispitivanje funkcije trombocita rabilo
isključivo za mjerenje i praćenje sposobnosti trombo-
cita u adheziji i agregaciji. Adhezivnost trombocita is-
pituje se mjerenjem vremena krvarenja, jedinom pre-
tragom in vivo, koja ukazuje na reakciju trombocita
sa stijenkom krvne žile s ciljem stvaranja trombocit-
nog ugruška i dugi je niz godina bila jedina pretraga
za ispitivanje funkcije trombocita. Ovom pretragom
mjeri se vrijeme potrebno za potpuni prestanak kr-
varenja na mjestu standardizirane veličine i dubine
incizije kože kod tlaka od 40 mmHg koji se održava
za cijelo vrijeme izvođenja pretrage. Pretragom se
najčešće otkrivaju kvalitativni poremećaji trombocita,
a produženo vrijeme krvarenja rezultat je sniženog
broja trombocita ili poremećaja funkcije trombocita.
Najčešća pretraga koja je ujedno i “zlatni standard�
za ispitivanje funkcije trombocita optička je agrega-
cija trombocita. Pretraga omogućuje ispitivanje me-
đudjelovanja između receptora i liganada nužnih za
održavanje hemostaze in vivo mjerenjem učinka ago-
nista na aktivaciju trombocita in vitro i međusobno
povezivanje trombocita. Optičkom agregometrijom
trombocita ispituje se % porasta transmisije svjetlo-
sti u uzorku plazme bogate trombocitima nakon
dodatka agregirajućeg sredstva (agonista) određe-
ne koncentracije što rezultira nastajanjem agregata
trombocita i razbistravanjem plazme. Agonisti koji se
najčešće koriste su ADP, adrenalin, arahidonska ki-
selina, kolagen i ristocetin, od kojih svi agonisti osim
ristocetina mogu potaknuti otpuštanje ADP-a i ATP-a
iz gustih granula, što pojačava agregaciju trombocita
i dovodi do dodatnog porasta transmisije svjetlosti.
Rezultati se izražavaju kao % maksimalne agregaci-
je, odnosno stupanj agregacije u točno određenom
vremenskom periodu. Osim optičke agregometrije
trombocita moguće je i mjerenje stupnja agregacije
trombocita u uzorcima pune krvi pri čemu nastajanje
agregata trombocita rezultira promjenom otpora.
U nekoliko posljednjih godina razvijeno je i nekoliko
novih testnih sustava za ispitivanje funkcije trombo-
cita u punoj krvi kako bi in vitro što bolje imitirali
procese koji se događaju nakon ozljede krvne žile in
vivo, a posebice sa svrhom ispitivanja aktivacije trom-
bocita u fiziološkim uvjetima brzine protoka krvi u
arterijama. Prvi takav sustav koji se pojavio na tržištu
i koji se najčešće koristi je analizator funkcije trom-
bocita (Platelet Function Analyzer) PFA-100. PFA-100
je specifični instrument za ispitivanje funkcije trom-
bocita, kojim mjerimo kapacitet primarne hemostaze
u uzorku pune citratne krvi. Citratna krv se aspirira
kod konstantnog negativnog tlaka na otvor promjera
147 μm na membranu obloženu kolagenom i ADP-
om ili kolagenom i adrenalinom. U prisutnosti ovih
aktivatora trombocita i fiziološke brzine protoka
krvi u arterijama (5000-6000 s-1) pod standardizira-
nim uvjetima dolazi do adhezije, aktivacije i agrega-
cije trombocita te stvaranja trombocitnog ugruška.
Trombocitni ugrušak prekriva otvor na membrani,
a funkcija trombocita mjeri se kao funkcija vremena
potrebnog za stvaranje trombocitnog ugruška. Iako
je zamišljen kao test probiranja na funkciju trombo-
cita pokazalo se kako uporabom ovog sustava nije
moguće otkriti sve poremećaje funkcije trombocita,
te da nekoliko čimbenika utječe na rezultate: broj
542 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
trombocita <50x109/L, vrijednost hematokrita <0,25
L/L, VWF te ishrana (hrana bogata flavonoidima).
Unatoč napretku u mogućnostima analize funkcije
trombocita, do današnjeg dana još uvijek ne postoji
osjetljiva i specifična dijagnostička pretraga funkci-
je trombocita koja omogućuje razlikovanje između
poremećaja funkcije vezane uz adheziju, agregaciju,
aktivaciju i sekreciju. Kako svaka pojedina pretraga
trombocita mjeri različite aspekte funkcije tromboci-
ta, jedini je mogući pristup u dijagnostici poremećaja
funkcije trombocita uporaba kombinacije odgovara-
jućih pretraga za svaki pojedini slučaj.
LABORATORIJSKO PRAĆENJE
ANTIKOAGULACIJSKE TERAPIJE
Lijekovi koji se koriste za prevenciju i liječenje trom-
boembolijskih bolesti godinama su bili ograničeni
na 3 osnovne skupine: antagoniste vitamina K, he-
parine i aspirin, a tijekom zadnjih godina postao je
dostupan veliki broj novih antikoagulacijskih lijeko-
va. Laboratorijsko praćenje antikoagulacijske terapi-
je sastoji se od praćenja rizika i posljedica mogućeg
krvarenja (hemoglobin, hematokrit, broj tromboci-
ta, okultno krvarenja i sl.), koje je zajedničko svim
vrstama lijekova i specifičnog praćenja terapije koje
uključuje procjenu specifičnog antikoagulacijskog
učinka pojedinog lijeka.
Antagonisti vitamina K
Antagonisti vitamina K koriste se za prevenciju i li-
ječenje tromboembolijskih bolesti kao što su DVT,
PE, infarkt miokarda i moždani udar. Derivati su
4-hidroksi kumarina a najvažniji predstavnik skupi-
ne je varfarin. Antikoagulacijski učinak temelji se na
inhibiciji enzima koji sudjeluju u redukciji vitamina K
(vitamin K epoksid reduktaza i vitamin K reduktaza),
nužnog za sintezu faktora zgrušavanja FII, FVII, FIX
i FX i prirodnih inhibitora zgruđavanja proteina C i
S. Vitamin K-H2 sudjeluje kao esencijalni kofaktor u
reakciji posttranslacijske modifikacije γ-glutamilnih
ostataka ovih proteina pri čemu nastaju vezna mjesta
za kalcijeve ione, nužna za vezanje faktora zgruša-
vanja na fosfolipidne površine i njihovu aktivnost.
Tijekom ove reakcije dolazi do oksidacije vitamina
K u oksidirani oblik, vitamin K epoksid, koji se za
ponovnu aktivnost mora reducirati.
Varfarin je racemična smjesa R- i S-enantiomera, od
kojih je S-varfarin 3-5 puta aktivniji i metabolizira se
u jetri djelovanjem enzima CYP2C9, koji je odgovo-
ran za 85 % metabolizma varfarina. Opisani su genski
polimorfizmi CYP2C9, a najučestaliji polimorfni aleli
u bjelačkoj populaciji su CYP2C9*2 i CYP2C9*3, po-
vezani s fenotipom sporijeg metabolizma i potrebom
za nižom dozom lijeka. Dokazani su i polimorfizmi
u genu za podjedinicu 1 enzima vitamin K epoksid
reduktaze (VKORC1), koji su također odgovorni za
interindividualne razlike u osjetljivosti na varfarin.
Terapijski učinak varfarina zahtjeva laboratorijsko
praćenje iz više razloga. Varfarin ima usku terapijsku
širinu s dramatično smanjenim učinkom kod primje-
ne doze koja je manja od optimalne i velikim rizikom
za krvarenja kod primjene više doze. Već spomenu-
te interindividualne razlike u učinku varfarina, kao
i utjecaj prehrane i lijekova koji se istovremeno ko-
riste, dodatan su razlog za laboratorijsko praćenje
terapije antagonistima vitamina K. Terapijski učinak
antagonista vitamina K prati se mjerenjem PV-a, s
obzirom da je PV pretraga osjetljiva na aktivnost vi-
tamin K ovisnih faktora zgrušavanja FII, FVII i FX.
Nedostatak PV-a su značajne razlike u dobivenim re-
zultatima ovisno o analizatoru, vrsti reagensa (trom-
boplastina) i seriji proizvedenog reagensa, što dovo-
di do različitih rezultata između laboratorija, pa čak
i unutar istog laboratorija u različitom vremenskom
periodu. U svrhu standardizacije rezultata PV-a osmi-
šljen je internacionalni normalizirani omjer (INR) koji
predstavlja matematičku pretvorbu rezultata PV izra-
ženog u sekundama (PVsek):
ISI
PV ispitanika (sek)
INR =
PV normalne plazme (sek)
gdje je ISI je internacionalni indeks osjetljivosti. ISI
je mjera osjetljivosti tromboplastina na manjak ko-
Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze | 543
agulacijske aktivnosti faktora zgrušavanja u odno-
su na referentni pripravak tromboplastina Svjetske
zdravstvene organizacije (SZO), a koji se dobije u
složenom postupku kalibracije kojeg preporuča
SZO. Prema definiciji, vrijednost ISI od 1,0 označava
istu osjetljivost ispitivanog tromboplastina i interna-
cionalnog referentnog pripravka SZO prema manj-
ku koagulacijske aktivnosti faktora zgrušavanja. SZO
preporuča uporabu tromboplastina s ISI vrijednosti-
ma blizu 1,0. Protokol kalibracije tromboplastina uk-
ljučuje mjerenje PV-a ispitivanim tromboplastinom i
ispitivanom metodom, te referentnim pripravkom i
referentnom metodom u 20 plazmi zdravih davatelja
i 60 plazmi bolesnika na stabilnoj terapiji varfarinom.
ISI predstavlja nagib pravca koji se dobije ortogonal-
nom regresijom dobivenih rezultata u koordinantom
sustavu log-log gdje su na os X nanešene vrijednosti
dobivene ispitivanom metodom i ispitivanim trom-
boplastinom, a na os Y vrijednosti dobivene referen-
tnom metodom i referentnim pripravkom. U praksi
se ovaj složeni postupak kalibracije ne provodi rutin-
ski, nego se većina laboratorija oslanja na vrijednost
ISI određenu od strane proizvođača za određenu
kombinaciju instrumenta i tromboplastina, iako to
nije uvijek idealno. Zadnjih godina u porastu je zani-
manje za instrument-specifičnom kalibracijom INR-a
uporabom plazmatskih kalibratora s točno definira-
nim vrijednostima INR-a, čime se postupak pojed-
nostavljuje i smanjuje mogućnost pogreške, iako i
ovaj sustav ima svoje nedostatke. Danas na tržištu
postoji više komercijalnih plazmatskih kalibratora za
direktnu kalibraciju INR-a.
Usprkos nekim nedostacima, sustav INR-a doveo je
do smanjenja interlaboratorijskih razlika u mjerenju
PV-a i predstavlja preporučenu metodu za praćenje
terapije varfarinom. Preporučena vrijednost INR-a
kod terapije srednjeg intenziteta iznosi 2,0-3,0, a kod
terapije visokog stupnja (intenziteta) 2,5-3,5 (Tablica
56.3.). Vrijednost INR>4,5 povećava rizik za krvare-
nja 6 puta dok vrijednost INR>7,0 povećava rizik 40
puta.
Valja imati na umu da je antitrombotski učinak var-
farina odgođen i nastupa tek nakon 60-72 h, nakon
smanjenja aktivnost protrombina (FII), koji ima naj-
duži poluživot u cirkulaciji. Početni učinak varfarina
i pad vrijednosti PV-a posljedica je smanjenja aktiv-
nosti FVII koji ima najkraći poluživot u cirkulaciji, ali
nije ključan za antitrombotski učinak (Tablica 56.1.).
Osim toga, u prvim satima varfarinske terapije dolazi
i do smanjenja aktivnosti prirodnih antikoagulanata
proteina C i S, koji se također stvaraju u jetri ovisno
o vitaminu K, što dovodi do potencijalnog protrom-
botičkog učinka varfarina u prvih 24-48 h od početka
terapije. Zbog navedenog se, kao uvod u terapiju
varfarinom, koristi heparin koji se može isključiti
nakon što se postigne stabilna vrijednosti INR>2,0
tijekom dva dana.
Heparin i niskomolekularni heparin
Nefrakcionirani heparin (UFH) je heterogena
smjesa polisaharidnih lanaca molekulske mase od
3000 do 30000 Da. Indirektni antitrombotski učinak
heparina posljedica je vezanja na AT, pri čemu na
AT dolazi do konformacijskih promjena i ubrzavanja
reakcije inhibicije serinskih proteaza, posebice trom-
bina i FXa. Heparin inhibira samo slobodni trombin
i FXa u plazmi.
Osim po molekularnoj masi heparinski lanci hetero-
geni su i po antikoagulacijskom učinku i farmakoki-
netskim svojstvima. Samo jedna trećina heparinskih
lanaca sadrži pentasaharidnu strukturu, jedinstvenu
sekvencu od 5 saharidnih jedinica koja je nužna za
vezanje na AT i za antikoagulacijski učinak. Inhibi-
cija trombina odvija se stvaranjem ternarnog kom-
pleksa između pentasaharidne sekvence heparina,
Tablica 56.3. Preporučene vrijednosti antikoagulacijske terapije izražene preko INR-a
Indikacije za terapiju antagonistima vitamina K
Prevencija i liječenje duboke venske tromboze i plućne embolije
Fibrilacija atrija
Bolesti srčanih zalistaka
Umjetni srčani zalisci životinjskog podrijetla
Umjetni srčani zalisci od sintetskog materijala
Sekundarna prevencija od embolije nakon akutnog infarkta miokarda
Sekundarna prevencija od ponovnog infarkta miokarda
544 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
AT i trombina, za što je potrebna duljina heprinskih
lanaca od najmanje 18 saharidnih jedinica, dok za
inhibiciju FXa nije potrebno nastajanje ternarnog
kompleksa. Stoga molekule heparina s manje od 18
saharidnih jedinica ne mogu inhibirati trombin, ali
imaju svojstvo inhibicije FXa. Heparinski lanci vežu
se na različite proteine plazme, ali i stanične elemen-
te (endotelne stanice, trombocite, makrofage, oste-
oblaste), čime njegov antitrombotski učinak postaje
izrazito nepredvidljiv, kao i mogući neželjeni učinci
(krvarenje, osteoporoza, pojava heparinom inducira-
ne trombocitopenije - HIT-a). Heparin ima bimoda-
lan klirens, pa se duži lanci izlučuju brzim staničnim
mehanizmom, dok se kraći lanci izlučuju sporim,
bubrežnim mehanizmom. Zbog svega navedenog
učinak heparina je nepredvidljiv i individualan, pa
je potrebno laboratorijsko praćenje terapije.
UFH se koristi u terapiji DVT i PE, te kod akutnog
infarkta miokarda i angine pectoris. Primjenjuje se
intravenozno pri čemu se daje bolus doza od 5000
U, a nakon toga kontinuirana infuzija od 32000 U
tijekom 24 sata. Antikoagulacijski učinak je trenutan,
a kao antidot se koristi protamin sulfat.
Niskomolekularni heparin (LMWH) je smjesa
polisaharidnih lanaca duljine 1000 do 10000 Da, a
dobiva se kemijskom ili enzimskom depolimerizaci-
jom UFH. Upravo je razlika u duljini polisaharidnih
lanaca osnova razlika u djelovanju između LMWH i
UFH. Dok UFH ima jednak inhibicijski učinak prema
FXa i trombinu (1:1), LMWH ima jači inhibicijski uči-
nak prema FXa (omjer iznosi od 4:1 do 2:1 ovisno o
Preporučeni INR
2,0 - 3,0
2,0 - 3,0
2,0 - 3,0
2,0 - 3,0
2,5 - 3,5
2,0 - 3,0
3,5 - 4,5
duljini lanaca i vrsti pripravka). LMWH se manje veže
na proteine plazme, makrofage i endotelne stanice,
čime mu učinak postaje značajno predvidljiviji, kao
i duljina poluživota u plazmi. Također, smanjeno ve-
zanje LMWH na trombocite čini ga pouzdanijim i u
smislu razvoja HIT-a. LMWH se koristi u liječenju i
prevenciji venske tromboembolije (veliki ortoped-
ski zahvati, operativni zahvati kod onkoloških paci-
jenata, prevencija kod pacijenata na kemoterapiji) i
kod akutnog koronarnog sindroma, a primjenjuje se
subkutano, 1-2 puta dnevno.
Antikoagulacijski učinak UFH prati se mjerenjem
APTV-a kod uobičajenih terapijskih doza, dok se
kod visokih doza, koje se daju kod perkutanih koro-
narnih intervencija i kardiokirurških zahvata, koristi
aktivirano vrijeme zgrušavanja (ACT). APTV se mjeri
6 sati nakon bolus doze heparina i na temelju dobi-
venog rezultata podešava daljnja intravenska terapija
pomoću nomograma. Preporučeni terapijski raspon
za APTV je 1,5 - 2,5 puta dulji APTV u odnosu na
bazalnu vrijednost (bazalno mjerenje APTV-a prije
početka terapije). S obzirom da raspon nije potpu-
no jednak za svaki pojedini APTV reagens i metodu
koje se koriste u laboratorijima, preporuča se izrada
specifične kalibracije za svaku kombinaciju reagen-
sa i instrumenta te određivanje terapijskog raspona
LITERATURA
Ansell J, Hirsh J, Poller L, Bussey H, Jacobson A, Hylek E. The
pharmacology and management of the vitamin K antagonists:
the Seventh ACCP Conference on Antithrombotic and Throm-
bolytic Therapy. Chest 2004;126 (3 Suppl):204S-233S.
Bates SM, Weitz JI. Coagulation assays. Circulation
2005;112:e53-60.
Batty P. Haemostasis; Surgery 2010;28:530-5.
Dahlbäck B. Blood coagulation and its regulation by anti-
coagulant pathways: genetic pathogenesis of bleeding and
thrombotic diseases. J Intern Med 2005;235:209-23.
Hirsh J, Rashke R. Heparin and low-molecular-weight hepa-
rin: the Seventh ACCP Conference on Antithrombotic and
Thrombolytic Therapy. Chest 2004;126 (3 Suppl):188S-203S.
Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze | 545
APTV-a pomoću specifične anti-Xa metode za mjere-
nje aktivnosti heparina u krvi. Ovom metodom mjeri
se intenzitet inhibicije aktiviranog FXa iz reagensa
djelovanjem heparina iz uzorka, i to nakon kalibracije
specifičnim heparinskim kalibratorima. Ciljna terapij-
ska vrijednost za anti-Xa aktivnost s UFH-om je 0,3 do
0,7 anti-Xa kU/L. Stanja u kojima je potrebno izmjeriti
aktivnost heparina anti-Xa metodom su kombinira-
na terapija anatagonistima vitamina K i heparinom,
kombinirana fibrinolitička i heparinska terapija, rezi-
stencija na heparin, visoke koncentracije Fbg i FVIII
u uzorku, prisutnost lupus antikoagulanta u uzorku,
bolesti jetre i kontaminacija uzorka heparinom.
Praćenje terapije LMWH-om u pravilu nije potrebno,
iako postoje situacije u kojima se preporuča mjere-
nje aktivnosti anti-Xa metodom, koja se izvodi na isti
način kao kod UFH, ali nakon kalibracije specifičnim
LMWH-kalibratorima. To su sljedeća stanja: kod bo-
lesnika s bubreženim bolestima, kod novorođenčadi
i trudnica, te kod bolesnika kod kojih tjelesna masa
značajno odstupa od idealne, kod dugotrajne pri-
mjene i kod velikog rizika za krvarenje ili trombozu.
Ciljna vrijednost za terapiju LMWH-om je 0,5 do 1,0
anti-Xa kU/L. Terapija LMWH-om ne može se pratiti
mjerenjem APTV-a, jer LMWH ne produljuje APTV ili
ga tek neznatno produljuje, ovisno o reagensu.
Hoffman M, Monroe III DM. A cell-based model of hemosta-
sis. Thromb Haemost 2001;5:958-65.
Lasne D, Jude B, Susen S. From normal to pathological hemo-
stasis. Can J Anesth 2006;53:S2-11.
Lippi G, Favaloro EJ. Laboratory hemostasis: milestones in
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Clin Chem Lab
Med 2013;51:91-7.
Kitchen S, Makris M. Laboratory tests of hemostasis. U: Prac-
tical Hemostasis and Thrombosis. 2. izd. West Sussex: Wiley-
Blackwell. 2009; 7-16.
Kitchen S, Preston FE, Olson JD. Internal quality control in the
hemostasis laboratory. U: Quality in Laboratory Hemostasis
and Thrombosis. 1. izd. West Sussex: Wiley-Blackwell. 2009;
43-50.
Mann KG. Biochemistry and phisiology of blood coagulation.
Thromb Haemost 1999;82:165-74.
Roberts HR, Monroe DM, Escobar MA. Current concepts
of hemostasis: implications for therapy. Anesthesiology
2004;100:722-30.
Wheeler AP, Rice TW. Coagulopathy in critically ill patients:
part 2-soluble clotting factors and hemostatic testing. Chest
2010;137:185-94.
Wolberg AS. Thrombin generation and fibrin clot structure.
Blood Reviews 2007;21:131-42.

Pitanja i odgovori

1. Koje su osnovne tri faze zgrušavanja prema staničnom modelu hemostaze?

U procesu zgrušavanja razlikuju se 3 faze: početna, amplifikacijska i propagacijska faza.

2. O kojim faktorima ovise rezultati pretrage APTV?

Dobiveni rezultat ovisi o aktivnostima FII, FV, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII i fibrinogena.

3. O čemu ovise referentni interval D-dimera i granična vrijednost za isključivanje tromboze?

Referentni interval i granična vrijednost za isključivanje tromboze ovisna je o reagensu i sustavu koji se primje-
njuju za određivanje koncentracije D-dimera.

4. Što omogućuju pretrage funkcije trombocita?

Pretrage funkcije trombocita omogućuju utvrđivanje mogućeg uzroka krvarenja, za razlikovanje poremećaja
funkcije trombocita od koagulacijskih poremećaja i postavljanje dijagnoze nasljednih i stečenih poremećaja
krvarenja.

5. Kojim laboratorijskim pretragama se prati djelotvornost antikoagulacijske terapije?

Antikoagulacijska terapija antagonista vitamina K se prati određivanjem PV-a i izražavanjem preko INR-a, viso-
komolekularnog heparina APTV-om, a niskomolekularnog heparina mjerenjem anti-Xa aktivnosti.

546 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 57.
Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja
sustava zgrušavanja
Silva Zupančić Šalek

Nasljedni poremećaji sustava zgrušavanja čine skupinu rijetkih bolesti. Najčešći poremećaji su von Wille-
brandova bolest, zatim slijede hemofilija A i B. Hemofilije su nasljedni, recesivni poremećaji koji nastaju
uslijed mutacija gena F8 odnosno F9. Hemofilija A je manjak ili kompletan nedostatak aktivnosti faktora
VIII, a hemofilija B faktora IX. Sve rasne skupine su podjednako zahvaćene hemofilijom i nema geografske
predispozicije. Učestalost hemofilije A je 1 u 5000 živorođene muške djece i 1 u 30000 u hemofiliji B. Preva-
lencija hemofilije A je 11.2 slučaja na 100000 muških osoba. Hemofilija A čini 85 % svih hemofilija i najčešća
je teška nasljedna koagulopatija. Prevalencija von Willebrandove bolesti je gotovo 1 % opće populacije.
Kvantitativni i/ili kvalitativni defekt von Willebrandova faktora uzrokuje bolest, a nastaju uslijed točkastih
mutacija ili velikih delecija gena za VWF.
Od hemofilija obolijevaju samo muškarci, dok su žene nositeljice bolesti. Radi se o spolno vezanoj bolesti.
Nositeljice bolesti imaju šansu 25 % da im sin boluje od hemofilije, odnosno istu šansu da će kćer biti obli-
gatna nositeljica bolesti. Kad postoji više članova obitelji zahvaćeno hemofilijom tada se radi o „obiteljskoj�
hemofiliji, dok je „sporadična hemofilija� rezultat de novo mutacije u otprilike 30 % oboljelih. Neke nosite-
ljice bolesti imaju sniženu razinu aktivnosti faktora VIII/IX. Ponekad je sniženje toliko da zahtijeva primjenu
lijeka, koncentrata faktora VIII/IX. Djeca zdrave žene i muškarca s hemofilijom imat će sve zdrave sinove, a
sve kćeri su nositeljice bolesti. Von Willebrandova bolest nasljeđuje se uglavnom autosomno dominantno
s varijabilnom ekspresijom.

Sličnosti i razlike između hemofilija A i B

Hemofilije A i B se ne mogu klinički razlikovati Postoji niz sličnosti između bolesti i to produženo aktivi-
rano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTV), tip krvarenja što uključuje krvarenja u velike zglobove,
razvoj inhibitora, nasljeđivanje vezano uz X kromosom, razvoj artropatije. Također postoji i niz različitosti

547
i to farmakokinetika faktora zgrušavanja, učestalost
pojave bolesti, udio bolesnika prema težini bolesti,
mutacije koje uzrokuju bolest (više točkastih mutaci-
ja u hemofiliji B nego hemofiliji A), razvoj inhibitora
(češće u hemofiliji A), rizici povezani s inhibitorima
u hemofiliji B kao pojava anafilaktičke reakcije.
KLINIČKA SLIKA
Težina simptoma krvarenja u bolesnika s hemofili-
jom A i B ovisi o razini koncentracije nedostatnog
faktora. Koncentracija faktora zgrušavanja izražava
se u internacionalnim jedinicama (IU); 1 IU definira
se kao koncentracija faktora zgrušavanja u 1 mL nor-
malne plazme. Zdrava osoba ima koncentraciju fak-
tora VIII ili IX 0.50 do 1.50 IU/mL. Koncentracija fak-
tora VIII ili IX može se izraziti i u postocima prema
normalnoj plazmi definirano kao 100 %. Bolesnici s
hemofilijom klasificiraju se u tri skupine prema težini
bolesti: teški oblik, umjereni i blagi. Bolesnici s teš-
kim oblikom bolesti nemaju mjerljive koncentracije
faktora VIII/IX. Oni krvare spontano bez prethodne
traume. U bolesnika s umjerenim ili blagim oblikom
bolesti plazmatska koncentracija FVIII/IX iznosi 2-5
% ili 6-40 %. Prekomjerno krvarenje javlja se obično
nakon malih trauma, stomatoloških zahvata ili ope-
racije.
Dijagnoza hemofilije postavlja se odmah po rođenju
ako je majka dokazani ili poznati nositelj bolesti. Kad
to nije slučaj, dijagnoza bolesti se postavlja tek kad
dođe do krvarenja i to spontano ili nakon traume.
Karakteristična krvarenja su intrakranijalna u novo-
rođenčeta koje se rodi na vrijeme, bolna oteklina
velikih zglobova uslijed krvarenja u zglobove, neo-
bjašnjive, duboke modrice kad dijete počinje puzati i
hodati. Isto tako javljaju se postoperativna krvarenja,
supkutana nakon venepunkcija i krvarenja u mišić
što može biti spontano ili uslijed traume.
Bolesnici s hemofilijom A i B imaju produženo ak-
tivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme i nor-
malan nalaz protrombinskog vremena. Iako uredan
nalaz, APTV ne znači da je hemofilija isključena i
to u slučaju blage hemofilije. Potrebno ja razlikovati
548 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
hemofiliju A od von Willebrandove bolesti. Ove se
bolesti razliku po načinu nasljeđivanja i kliničkim
simptomima krvarenja. Većina slučajeva von Wille-
brandove bolesti je blaga pa tako nema kliničke slike
krvarenja kao u hemofiliji A već se radi o menoragi-
jama, epistaksama i modricama. Jedino teški oblik
von Willebrandove bolesti, tip 3 ima tešku kliničku
sliku sa svim oblicima krvarenja. Ima više podvrsta
von Willebrandove bolesti, no prije postavljanja dija-
gnoze hemofilije A potrebno je isključiti defekt veza-
nja FVIII i vWF što može uzrokovati sniženje faktora
VIII, a radi se o von Willebrandovoj bolesti tipa 2N ili
Normandy. Taj oblik bolesti može se pojaviti u žena
jer se radi o von Willebrandovoj bolesti i nasljeđuje
se autosomno.
Određivanjem koncentracije faktora IX potvrđuje se
dijagnoza bolesti. Koncentracija faktora IX se ne mi-
jenja tijekom života, osim u onih osoba koji su imali
mutaciju u promotorskoj sekvenci gena faktora IX
(faktor IX Leiden). U tih bolesnika raste koncentra-
cija faktora IX s pubertetom, pa teški oblik bolesti
postaje blagi, a blagi se sasvim normalizira s normal-
nom koncentracijom faktora IX.
Blaga hemofilija nije povezana sa spontanim krvare-
njima. Krvarenja se javljaju samo nakon većih trauma
ili operacija. Značajan broj bolesnika dijagnosticira
se neposredno pred operaciju u pred operacijskoj
koagulacijskoj obradi.
Umjerena hemofilija rijetko povezana sa spontanim
krvarenjima, već su krvarenja precipitirana traumom
ili operacijom. Prvi se simptomi javljaju u kasnijoj
životnoj dobi s većim životnim aktivnostima.
Teški oblik hemofilije ima prosječno od 15 do 35
spontanih krvarenja u zglobove ili mišiće po godi-
ni. Glavna manifestacija bolesti je krvarenje u veliki
zglob i mišić. Oko 90 % krvarenja se događa u velike
zglobove. Najčešće zahvaćeni zglob je koljeno, pa
zatim lakat, gležanj, rameni ručni zglob. Koljena i
laktovi su osobito vulnerabilni jer moraju podnije-
ti rotatorni i kutni stres u relativno slaboj zglobnoj
vezi. Tipična promjena za hemofiliju je hemofilična
artropatija koja nastaje uslijed opetovanih krvarenja,
upala, sinovijalne hipertrofije, destrukcije hrskavice
i kosti. Nakon akutnog krvarenja u zglob dolazi do
autolize eritrocita s odlaganjem hemosiderina u si-
novijanom tkivu. To izaziva upalni proces u sinoviji
s povišenim proinflamatornim citokinima (IL-6, II,
I beta, TNF). Opetovana krvarenja dovode do kro-
ničnog trajnog upalnog procesa što je „hemofilična
artropatij�. Opetovana krvarenja dovode do razvoja
tzv. ciljnog zgloba. Kad dođe do kompletne erozije
hrskavice i kosti dolazi do kronične hemofilične ar-
tropatije s trajnim oštećenjem zgloba. Ta je faza ka-
rakterizirana ograničenjem pokreta, razvojem kon-
traktura i progresivnog ukočenja zgloba.
Mišićna se krvarenja javljaju u otprilike 30 % bole-
snika s hemofilijom i to su uglavnom spontana kr-
varenja. Krvarenja prati bol, oteklina blago povišena
temperatura s pojavom ekimoza po tijelu. Krvarenja
u veliki mišić mogu biti velika no isto tako se mogu
resorbirati u potpunosti, za razliku od malih krvare-
nja koja mogu biti opasna u zatvorenom prostoru i
izazvati fascijski kompartment sindrom. Posebno su
teška retroperitonealna krvarenja u mišić m. psoas
major. Oni uzrokuju ograničenje pokreta, nestabil-
nost koljena zgloba i drugo.
Najozbiljnije krvarenje je u centralni nervni sustav je
može biti fatalno. Incidencija intrakranijalnog krvare-
nja je 3.5-4 % u neonatalnom periodu i u zemljama s
dobro organiziranom medicinskom skrbi za bolesni-
ke s hemofilijom. U bolesnika koji se liječe samo po
potrebi učestalost intrakranijalnog krvarenja je 3-10
%. Otprilike 20 % završi letalno s intrakranijalnim
krvarenjem, a više od jedne trećine razvije teške po-
sljedice krvarenja. Krvarenja mogu biti subduralna,
subarahnoidalna, intraspinalna ili intracerebralna.
U 10-15 % bolesnika razvije se gastrointestinalno kr-
varenje Taj postotak raste s portalnom hipertenzijom
zbog kroničnog hepatitisa ili ciroze jetre.
Klinička slika von Willebrandove bolesti znatno va-
rira. Tipično se javlja krvarenje iz sluznica (epistak-
se, menoragije), pojačano krvarenje nakon ozljeda
ili reznih rana kao i postoperativna krvarenja. Kako
postoji više tipova bolesti, tako je i s kliničkom ma-
nifestacijom bolesti. Krvarenja u zglobove i mišiće su
rijetkost osim u tipu 3 ili teškom obliku von Wille-
brandove bolesti. Definitivna dijagnoza se postavlja
temeljem niz koagulacijskih testova.
Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja sustava zgrušavanja | 549
LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA
Laboratorijsko testiranje je integralni dio kliničke
procjene poremećaja sustava zgrušavanja. Važno je
točno i brzo dijagnosticirati poremećaj, klasificirati
temeljem određenih laboratorijskih rezultata, a oni
nam usmjeravaju i prate učinak liječenja. Molekula
FVIII je jedna od najnestabilnijih u skupini faktora
zgrušavanja. FVIII se lako adsorbira na strane površi-
ne, brzo se degradira kad je izložen temperaturi oko-
line i u slučaju kad pH vrijednost pada izvan uskog
raspona normale. Rezultati s različitim reagencijama i
različitim instrumenti daju različite rezultate. Sumnja
na hemofiliju postavlja se već testovima probiranja
kad nalazimo izolirano produženo APTV u dječaka
ili muškarca s prisutnim prekomjernim krvarenjem i
pozitivnu anamnezu. Određivanje aktivnosti FVIII/
FIX je neophodno jer nad donosi dijagnozu. Faktor
VIII je reaktant akutne faze, povišen je u trudnoći i
tijekom vježbanja. Pri testiranju na moguću hemo-
filiju A ili von Willebrandovu bolest potrebno je te-
stiranje ponoviti jer temeljem jednog rezultata se ne
smije niti postaviti niti isključiti dijagnoza hemofilije.
Najčešći test za mjerenje aktivnosti FVIII/FIX je koa-
gulacijska metoda u jednom stupnju. Teško je izvesti
ovaj test ako se radi o niskim aktivnosti FVIII manjoj
od 3 % (0.03 IU/mL). Modificirani kromogeni test
po Yatau omogućava preciznije i točnije određiva-
nje aktivnosti u omjeru od 0.1-2 %. Blaga hemofilija
A se ne isključuje rezultatima normalne aktivnosti
FVIII u jednom stupnju. Poznato je da podskupina
bolesnika s blagom hemofilijom A iskazuje različite
rezultate aktivnosti FVIII upotrebom različitih meto-
da određivanja FVIII. To se odnosi na otprilike 20 %
bolesnika s hemofilijom A. Stoga je važno upamtiti
da u bolesnika s pozitivnom anamnezom na hemo-
filiju a normalnim rezultatima aktivnosti FVIII u testu
jednog stupnja, potrebno je učiniti aktivnost FVIII
testu dva stupnja ili kromogenim. Manji je broj blažih
bolesnika s hemofilijom koji u jednom stupnju testa
imaju snižene vrijednosti FVIII, a normalne rezultate
u dva stupnja. Praćenje primjene koncentrata faktora
zgrušavanja treba pratiti istim testom. Iznimke su pri
primjeni rekombinantnog FVIII. Rezultati testiranja
aktivnosti rekombinantnog FVIII normalne dužine
rezultati komogenim testom bit će 40-50 % viši nego
kad se određuje testom u jednom stupnju. Zatim u
rekombinantnom FVIII bez B domene rezultati u jed-
nom stupnju su bili 30 % viši od kromogenog testa.
Stoga je preporuka koristiti test u jednom stupnju, ali
kalibrirati sa standardom bez B domene.
Postavljanje dijagnoze von Willebrandove bolesti
temelji se na pozitivnoj anamnezi i kliničkim nala-
zima i fenotipskim hemostatskim testiranjem. Od
testova probiranja određivanje APTV je značajno jer
je osjetljivo na sniženje FVIII. Normalan nalaz FVI-
II ne isključuje von Willebrandovu bolest i određi-
vanjem PFA-100. Bitno je odrediti broj trombocita,
aktivnost FVIII:C, VWF:Ag i jedan funkcionalni test
VWF. Samtra se da VWF:CB ima prednost u odnosu
na VWF:RCo. Određivanje multimera von Willeban-
dova faktora je indicirano u osoba u kojih je već do-
kazna patološki nalaz u ostalim fenotipskim testovi-
ma. Ovom se metodom dijagnosticiraju kvalitativni
defekt VWF i svrstavaju u određene podskupine.
MOLEKULARNA GENETIKA I
DIJAGNOSTIKA
Gen za faktor IX kloniran je 1982. godine, a fakto-
ra VIII 1984. Postoji baza podataka svih otkrivenih
mutacija gena, a u teškog oblika bolesti oko 45 %
ima inverziju introna 22, dok su ostatak točkaste mu-
tacije, dok je samo 5 % malih i velikih delecija. Po-
stoji međunarodna internacionalna baza podataka o
mutacijama u hemofiliji B gdje većinu čine točkaste
mutacije, oko 7 % su kratke adicije ili delecije i oko
3 % velike delecije.
Faktor VIII je veliki plazmatski glikoprotein, jedan
od najvećih i najmanje stabilnih. U plazmi cirkulira
nekovalentnom kompleksu s von Willebrandovim
faktorom. Poluvijek života faktora VIII je 12 sati u
odraslih, a kraće je u djece. Von Willebrandov faktor
štiti FVIII od prerane proteolitičke razgradnje. Faktor
IX se sintetizira u jetri i najveći je protein ovisan o
vitaminu K. Plazmatska koncentracija faktora IX je 50
puta manja od FVIII, a poluvijk života je oko 24 sata.
550 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
LIJEČENJE
Liječenje bolesnika s hemofilijom bazira se na pri-
mjeni nedostatnog faktora. Doza i trajanje infuzije
ovisi o težini bolesti, tj o kliničkoj slici, mjestu i te-
žini krvarenja. Faktor zgrušavanja treba primijeniti
bez oklijevanja, odmah i bez odgađanja u situaciji
akutnog krvarenja, a ne čekati na određene dijagno-
stičke pretrage (npr. radiološke pretrage i drugo). Za
krvarenja u velike zglobove dovoljno je dati jednu
do dvije doze lijeka. Lijek se primjenjuje intravenski
ili u kontinuiranoj infuziji, a to uglavnom periope-
racijski. U bolesnika s blagom hemofilijom mogu-
će je krvarenje rješavati primjenom dezmopresina,
sintetskog analoga vazopresina koji povisuje plaz-
matsku koncentraciju FVIII i vWF dva do šest puta
oslobađanjem endogenih rezervi. Primjenjuje se u
dozi od 0.3 µg/kg, intravenski i supkutano. Moguća
je intranazalna primjena u dozi od 150 µg/kg. Tim
načinom liječenja izbjegla se mogućnost prijenosa vi-
rusnih infekcija koje se prenose krvlju. Ne postižu svi
bolesnici adekvatnu razinu faktora zgrušavanja na-
kon primjene dezmopresina pa je potrebno pažljivo
pratiti razinu faktora VIII nakon primjene dezmopre-
sina. Antifibrinolitici su lijekovi koji koče fibrinolizu
i to na mjestima najveće aktivnosti, usna šupljina i
maternica. Istovremena primjena koncentrata faktora
VIII i antifibrinolitika povećava rezistenciju ugruška
na fibrinolizu. Fibrinska ljepila se koriste tijekom
operacijskih zahvata, a u svrhu smanjenja potrebe
za nadomjesnom terapijom.
Dva su modaliteta primjene koncentrata faktora VIII/
IX. Primjena lijeka samo u slučaju potrebe, akutnog
krvarenja tzv. epizodno liječenje ili liječenje po po-
trebi. Drugi oblik liječenja je profilaktička primjena
lijeka kako bi se prevenirala krvarenja. Studije su
jasno pokazale prednost i značajnu učinkovitost u
bolesnika liječenih profilaktički u odnosu na one
koji su primali lijek po potrebi. Ideja profilaktičkog
liječenja rođena je tijekom 1950.-tih godina prošlog
stoljeća u Švedskoj. Ideja je prevesti teški oblik bole-
sti u umjereni oblik bolesti koji ne dovodi do teških
oštećenja zgloba uslijed čestih krvarenja. Bolesnik
koji se liječi profilaktičkom terapijom održava nor-
malan mišićnokoštani sustav. Više je shema profilak-
se no najzastupljenija je primjena faktora VIII tri puta
tjedno ili svaki drugi dan u dozi od 25-40IU/kg TM.
U hemofiliji B profilaksa se provodi dva puta tjedno.
S profilaksom se započinje u dobi od jedne do dvije
godine, a do tada svi teški oblici bolesti pokažu jasne
simptome prekomjernog krvarenja. Epizodno liječe-
nje provodi se u više od 80 % bolesnika s hemofili-
jom A/B, osobito u nerazvijenim zemljama svijeta.
Danas se liječenje bolesnika s hemofilijom provodi
primjenom plazmatskih ili rekombinantnih koncen-
trata faktora zgrušavanja. Rekombinantni koncentrati
faktora VIII su danas lijek izbora u liječenju bole-
snika s hemofilijom. Postoje već tri generacije lijeka.
Ovi su lijekovi sigurni i nema rizika od prijenosa vi-
rusa koji se prenose krvlju.
Genska terapija je u tijeku kliničkih ispitivanja, a he-
mofilija je idealna bolest za takav vid liječenja. Gen-
skom terapijom hemofilije A i B direktno se korigi-
ra molekularni defekt u mutiranom genu. Danas se
genska terapija zasniva na ideji dodavanja gena za
faktor VIII/IX. Genska terapija je jedini oblik liječenja
koja nudi kompletno izlječenje.
Komplikacije u bolesnika s hemofilijom dijelimo na
one vezane uz osnovnu bolest i to su primarno ošte-
ćenje lokomotornog sustava i smrt uslijed iskrvarenja.
Komplikacije uslijed liječenja bolesnika s hemofili-
jom su prijenos infekcija virusima krvlju i razvoj inhi-
bitora na FVIII. Tijekom 1980-tih godina svi koncen-
trati faktora VIII i IX bili su porijekla ljudske plazme
što je omogućilo prijenos infekcije HCV, HBV i HIV-a
u bolesnika s hemofilijom. Danas su još uvijek u pri-
mjeni koncentrati porijekla ljudske plazme no oni su
sada sigurniji i podvrgnuti različitim metodama viru-
sne inaktivacije, testirani darivatelji plazme i drugo.
Rekombinantni koncentrati faktora VIII stvoreni su
rekombinantnom tehnologijom i sigurni su. Danas
su na raspolaganju rekombinantni koncentrati fak-
Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja sustava zgrušavanja | 551
tora VIII, IX, VII i XIII. Prva generacija koncentrata
faktora VIII sadržavala je albumin kao stabilizator.
u tu svrhu su korišteni životinjski proteini tijekom
procesa proizvodnje. Druga generacija ne sadrži al-
bumin kao stabilizator ali ga koristi u staničnoj kul-
turi. Treća generacija koncentrata faktora ne sadrži
ni ljudske niti životinjske proteine.
Razvoj inhibitora, aloantitijela razvija se u 30 % djece
s teškim oblikom hemofilije A. Inhibitori se mogu
javiti i u osoba s umjerenom ili blagom hemofilijom,
no to je rijetkost. U hemofiliji B se javljaju vrlo rijetko
i to manje od 3 % bolesnika a tada primjena koncen-
trata FIX dovodi do anafilaktičke reakcije. Osobe s
inhibitorima dijele se na one visokog titra i to s više
od 5 Bethesda j/mL i onih niskog titra s manje od
5 jedinica. Oni s visokim titrom inhibitora reagira-
ju promptno na primjenu koncentrata faktora VIII i
liječe se koncentratima koji zaobilaze aktivnost fak-
tora VIII. To su: aktivirani protrombinski kompleks
(FEIBA) i aktivirani rekombinantni faktor VII (Novo-
Seven). Studija je pokazala jednaku učinkovitost, no
neki bolesnici bolje reagiraju na jedan lijek ili drugi.
Inhibitori se mogu eliminirati jedino postupkom in-
dukcije imunološke tolerancije (ITI). Ima više proto-
kola koji se rabe u tom postupku. Najpoznatiji su: ni-
sko dozni, visoko dozni i Malmo protokol. U Malmo
protokolu kombinira se ciklofosfamid, intravenski
imunoglobulini, imunoadsorpcija ili plazmafereza i
koncentrati FVIII. Kompletna remisija se postiže u
otprilike 30-80 %. Kad se jednom odstrane inhibitori,
rizik ponovne pojave je oko 15 %. Hemofilija B liječi
se plazmatskim koncentratima faktora IX i trenutno
postoji samo jedan rekombinantni faktor IX. Von
Willebrandova bolest liječi se ovisno u tipu bolesti s
plazmatskim koncentratom FVIII+vWF, dezmopre-
sinom, antifibrinolitikom. Liječenje koje nam stoji
na raspolaganju danas omogućava dobru kvalitetu
života.
LITERATURA
Astermark J, Donfield DM, DiMichele DM et al. A randomised
comparison of bypassing agents in hemophilia complicated
by an inhibitor: the FEIBA NovoSeven comparative (FENOC)
study. Blood 2007;109:546-57.
Berntorp E, Shapiro A. Modern haemophilia care. Lancet
2012;379:1447-56.
Bude U, Pienconka A, Will K, Schneppenheim R. Laboratory
testing for von Willebrand disease: contribution of multimer
analysis to diagnosis and classification. Semin Thromb He-
most 2006;32:S14-S21.
Fijnvandraat K, Cnossen MH, Leebeck FWG, Peters
MP. Diagnosis and management of haemophilia. BMJ
2012;344:e2707
Husbard AR, Bevan SA, Weller LJ. Coagulation and chromoge-
nic assays of FVIII activity: general aspects standardisation and
recommendations. Semin Thromb Haematol 2002;28:247-256.
Kouides PA, Phatak PD, Burkart P, Braggins C, Cox C, Bern-
stein Z et al. Gynaecological and obstetrical morbidity in wo-
men with type 1 von Willebrand disease: results of a patient
survey. Haemophilia 2000;6:643-8.
Schramm W, Royal S, Kroner B, Berntorp E, Giangrande P et
al. Clinical outcomes and resorce utilization associated with
haemophilia care in Europe. Haemophilia 2002;3:181-187.
8.Stonebraker JS, Bolton-Maggs PH, Soucie JM, Walker I, Bro-
oker M. A study of variations in the reported haemophilia
A prevalence around the world. Haemophilia 2010;16:20-32.

Pitanja i odgovori

1. Koji faktor zgrušavanja nedostaje u hemofiliji B?

U hemofiliji B nedostaje faktor IX.

2. Kolika je koncentracija faktora zgrušavanja u bolesnika s teškim oblikom hemofilije A/B?

Teški oblik bolesti hemofilije A/B ima nemjerljivu koncentraciju faktora VIII/IX navodi se ispod 1 %.

3. Koja su najčešća mjesta krvarenja u bolesnika s teškim oblikom hemofilije A/B?

Najčešća mjesta krvarenja u bolesnika s teškim oblikom hemofilije A/B jesu u velike zglobove i mišiće.

4. Koji se koncentrat faktora zgrušavanja primjenjuje u liječenu hemofilije A?

U liječenju hemofilije A primjenjuje se koncentrat faktora VIII.

5. Što su inhibitori u bolesnika s hemofilijom A?

U bolesnika s hemofilijom A razviju se aloantitijela na faktor VIII i to u 30 %.

552 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

 Poglavl je 58.
Laboratorijski aspekti transplantacije
krvotvornih matičnih stanica
Branka Golubić Ćepulić, Ines Bojanić

Funkcionalno sposobne i zrele krvne stanica nastaju od zajedničke krvotvorne matične stanice (KMS). U
koštanoj srži se aktivacijom određenih gena te djelovanjem krvotvornih činitelja rasta, citokina i mikrooko-
liša u KMS pokreću procesi: a) proliferacije (staničnog rasta, tj. diobe) što omogućuje samoobnavljanje, b)
diferencijacije (usmjeravanja) u pojedinu staničnu liniju, tj. lozu i c) maturacije (sazrijevanja) duž određene
stanične linije, od nezrelih do funkcionalno aktivnih, zrelih stanica. Iz KMS-a mogu nastati stanice mijeloid-
nog (eritrociti, granulociti, monociti/makrofagi, trombociti) i limfoidnog sustava (T i B limfociti i stanice pri-
rodne ubojice). Sve je više istraživanja koja pokazuju da se KMS mogu diferencirati i u stanice jetre, bubrega,
pluća, kože, probavnog sustava i u mišićne stanice. Zbog sposobnosti proliferacije i diferencijacije KMS se
mogu koristiti u liječenju bolesnika s oštećenom funkcijom koštane srži kao što su bolesnici s aplastičnom
anemijom ili bolesnici s jatrogenim oštećenjem koštane srži zbog primjene visokih doza hematotoksičnih
lijekova i/ili radioterapije. Klinička primjena KMS-a u obnavljanju funkcije ostalih organa još je uvijek u ranoj
fazi ispitivanja.

IZVORI KMS
Za liječenje bolesnika KMS se sakupljaju iz koštane srži, periferne krvi i krvi iz pupkovine. One se mogu
uzeti od bolesnika (autologne) ili od druge osobe (alogenične: srodne i nesrodne). Ako se radi o alogeničnoj
transplantaciji, osobe moraju biti podudarne u antigenima tkivne snošljivosti (HLA).
Samo mali broj bolesnika kojima je potrebno liječenje transplantacijom KMS ima srodnog HLA identičnog
darivatelja. Kako bi se što veći broj bolesnika mogao liječiti transplantacijom, u 80-im godinama osnovani
su registri dobrovoljnih darivatelja koštane srži. U 2006. godini se 67 neovisnih registara povezalo u među-
narodno udruženje (WMDA) u čijoj se bazi podataka nalazi oko 11 milijuna potencijalnih darivatelja KMS-a.

553
Iako je broj registriranih darivatelja velik, samo za 30
% bolesnika moguće je pronaći imunološki identič-
nog darivatelja.
OBRADA PRIPRAVAKA KMS
rutinskih postupaka je standardna oprema koja se
koristi u proizvodnji i preradi krvnih pripravaka.
Specijalni postupci koriste se radi postizanja veće
čistoće i učinkovitosti pripravaka KMS. Za ove po-
stupke potrebna je posebna oprema i reagensi koji
se koriste u staničnom inženjerstvu (tablica 58.1.).

Pripravak KMS nakon transplantacije mora dugotraj-

no obnoviti funkciju koštane srži.
Postupci obrade pripravaka KMS dijele se na rutin-
ske i specijalizirane. Rutinski postupci se koriste za
koncentriranje KMS ili uklanjanje nepotrebnih sta-
nica i/ili plazme. Temelje se na jednostavnim fizi-
kalnim metodama odvajanja stanica prema veličini
i gustoći nakon centrifugiranja primjenom staničnih
separatora ili staničnih procesora, odvajanjem sta-
nica pomoću različitih otopina (npr. koloidna oto-
pina HES-a za sedimentaciju eritrocita) i istiskivača
plazme (ručnih i automatskih). Oprema za izvođenje
KONTROLA KVALITETE PRIPRAVKA KMS
Kontrola kvalitete pripravaka KMS-a mora obuhvatiti
testove kojima se može: 1. procijeniti učinkovitost
i sigurnost staničnog pripravka 2. nadzirati kvalite-
tu postupaka sakupljanja, obrade i pohrane stanica.
Opseg kontrole pripravka ovisi o kliničkoj namjeni
stanica i složenosti postupka proizvodnje.
Ishod transplantacije KMS ovisi o broju transplantira-
nih stanica i njihovoj klonogenoj sposobnosti. Stoga
su ključni element za procjenu kvalitete pripravka

Tablica 58.1. Postupci obrade krvotvornih matičnih stanica

Postupak
Rutinski postupci
Koncentriranje KMS
Uklanjanje plazme
Uklanjanje eritrocita
Otapanje
Pranje
Filtracija
Specijalizirani postupci
Centrifugalna elutricija
Stanična selekcija
Ekspanzija stanica in vitro
Ostalo
Primjena
• smanjenje volumena prije zamrzavanja KMS
• prvi korak u složenoj obradi KMS uklanjanje eritrocita i plazme prije daljnje obrade
• uklanjanje ABO nepodudarne plazme - kod male ABO nepodudarnosti
• sprječavanje preopterećenja krvotoka u primatelja (djeca, bolesnici male tjelesne mase,
srčani i bubrežni bolesnici)
• smanjenje volumena prije zamrzavanja
• sprječavanje hemolize u slučajevima velike ABO nepodudarnosti ili u bolesnika s kli-
nički značajnim antieritrocitnim protutijelima ostalih specifičnosti
• ograničavanje količine slobodnog hemoglobina nakon odmrzavanja
• otapanje zamrznutog pripravka KMS prije transplantacije
• uklanjanje DMSO-a i hemoliziranih eritrocita radi smanjenja toksičnosti
• uklanjanje agregata stanica prije transplantacije
• odvajanje staničnih subpopulacija (koncentriranje mononukleara, uklanjanje T-limfocita)
• pozitivna i negativna selekcija stanica temeljena na izražaju staničnih biljega (npr. imu-
nomagnetska)
• povećanje broja KMS i progenitorskih stanica radi bržeg oporavka i boljeg ishoda tran-
splantacije
• uklanjanje malignih stanica i čišćenje transplantata s monoklonskim protutijelima
• farmakološko čišćenje pripravka KMS

554 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

KMS-a broj stanica, udio pojedinih vrsta stanica, udio
stanica sa specifičnim biološkim biljezima od koji je
najvažniji CD34, vijabilnost stanica, klonogena spo-
sobnost stanica u staničnim kulturama in vitro i mi-
krobiološko testiranje.
U razmazu koštane srži KMS se morfološki ne mogu
razlikovati od malog limfocita. Točnije se mogu
odrediti imunofenotipizacijom i funkcionalnim te-
stovima uzgoja stanica in vitro. Najvažniji identifi-
kacijski biljeg KMS je CD34 antigen koji se određuje
metodom protočne citometrije. Kako se ovaj biljeg
nalazi i na progenitorskim stanicama u ranoj fazi di-
ferencijacije, sve CD34 pozitivne stanice nisu i KMS.
KMS na površini nema diferencijacijske antigene
staničnih linija (Lin-), niti antigene HLA-DR i CD38.
S obzirom da još uvijek ne znamo točan izgled niti
imunološki fenotip KMS, za procjenu njihovog broja
u transplantatu u rutini se koriste surogatni testovi
kao što su: brojenje stanica s jezgrom (NC), brojenje
monouklearnih stanica (MNC), identifikacija CD34
pozitivnih stanica i kratkotrajna kultura granulocit-
no-monocitnih kolonija (CFU-GM). Neizostavni dio
kontrole kvalitete pripravka KMS je praćenje brzine
oporavka krvnih stanica nakon transplantacije za
svakog pojedinog bolesnika.
Broj i vrsta stanica
Brojenje stanica u pripravcima KMS je osnovni test
kojim se procjenjuje kvaliteta pripravka kao i učin-
kovitost postupaka za uzimanje i obradu KMS. Me-
đutim, broj NC ili MNC od male je koristi za procje-
nu broja KMS-a u pripravku jer je korelacija između
broja zrelih krvnih stanica u koštanoj srži i perifernoj
krvi i broja KMS među njima veoma slaba. Ipak u
nedostatku boljeg pokazatelja broj NC koristi se još i
danas u procjeni kvalitete pripravka KMS porijeklom
iz koštane srži. Za uspješnu autolognu transplanta-
ciju pripravak KMS iz koštane srži treba imati 2x108
NC/kg tjelesne težine, a za alogeničnu 3x108 NC/kg
tjelesne težine. Minimalni broj NC za transplantaci-
je krvotvornih matičnih stanica iz krvi iz pupkovine
mora biti oko 3x107 NC/kg. U slučajevima kada po-
stoji veći rizik neprihvaćanja transplantata kao što je
to slučaj u bolesnika s aplastičnom anemijom ili kod
Laboratorijski aspekti transplantacije krvotvornih matičnih stanica | 555
HLA haploidentičnih transplantacija, za uspjeh tran-
splantacije je potrebna i dvostruka količina stanica
nego u standardnom transplantatu.
Tijekom brojanja stanica u uzorcima KMS pomoću
automatskih brojača stanica mogu se učiniti neke
tipične greške: u uzorcima koštane srži automatski
brojači mogu nakupine masti veličine NC brojati kao
stanice; u uzorcima krvi iz pupkovine u ukupan broj
NC mogu se ubrojiti i eritrocitoblasti koji ne bi tre-
bali biti uključeni u broj stanica kada se procjenjuje
kvaliteta transplantata; u uzorcima KMS dobivenih
aferezom iz periferne krvi broj stanica može biti vrlo
visok pa do greške može doći zbog ograničenja bro-
jača ili nepreciznosti pri razrjeđivanju uzoraka.
Imunofenotipizacija KMS
Određivanje broja CD34 pozitivnih stanica protoč-
nom citometrijom postalo je rutinska metoda za pro-
cjenu količine KMS u krvi bolesnika i transplantatu.
Ova metoda dobro korelira s količinom KMS i brzi-
nom oporavka krvnih stanica nakon transplantacije.
Osim toga priprema uzorka i mjerenje traje oko jed-
nog sata tako da rezultati dobivaju brzo. To omo-
gućuje pravovremenu i klinički relevantnu procjenu
kvalitete pripravka KMS u okolnostima kada treba
donijeti odluku o početku ili nastavku sakupljanja
KMS.
Do pogreške u mjerenju broja CD34 pozitivnih sta-
nica može doći zbog loše uzetog uzorka, kalibracije
protočnog citometra, izbora protutijela, tehnike lize
uzorka i postavljanja ograda pri analizi uzorka. Bo-
lja standardizacija mjerenja je postignuta uvođenjem
dobro definiranih protokola od kojih svaki ima neke
prednosti i nedostatke.
Analiza vijabilnosti i apoptoze stanica
Ostvarenje biološkog ili terapijskog učinka stanične
terapije ovisi o vijabilnim stanicama u staničnim pri-
pravcima. Stoga je određivanje udjela živih / vijabil-
nih i mrtvih stanica prvi korak u određivanju funk-
cionalne sposobnosti pripravka KMS. Mrtve stanice
gube integritet stanične membrane, gube metabo-
ličku aktivnost i otpuštaju citoplazmatski sadržaj u
okolni medij. Analiza vijabilnosti stanica je važna
kako kod procjene kvalitete svakog pojedinačnog
pripravka KMS tako i kod inicijalne validacije kod
uvođenja novih tehnika obrade KMS.
Vijabilnost stanica može se procijeniti bojanjem uzor-
ka KMS s triptanskim modrilom i brojenjem obojenih
stanica svjetlosnim mikroskopom. S obzirom da se
stanična membrana mijenja nakon smrti stanice, ali i
tijekom čuvanja, laboratorijske obrade i zamrzavanja,
mijenja se količina boje koja ulazi u stanicu. Obojene
stanice su mrtve i nemaju više sposobnost diobe. S
obzirom da je broj stanica koji se analizira mali, a
broj analiziranih KMS još manji, ovaj test ima ogra-
ničenu korist u procjeni kvalitete pripravka KMS. (te
ne govori ništa o funkcionalnoj vijabilnosti analizi-
ranih stanica).
Dodavanje monoklonskih protutijela koja obilježa-
vaju stanice koje su nevijabilne ili apoptotične kod
određivanja broja CD34+ stanica protočnom citome-
trijom je preciznije jer je analiza usmjerena na po-
pulaciju stanica čija brojnost korelira s oporavkom
hematopoeze i ishodom transplantacije. 7-amino-ak-
tinomicin-D (7-AAD) se koristi za identifikaciju nevi-
jabilnih (nekrotičnih) stanica. Annexin V je protein
ovisan o kalciju (Ca2+) s visokim afinitetom za fosfati-
dilserin, a test koji mjeri translokaciju fosfatidilserina
s unutarnje na vanjsku stranu membrane identificira
stanice u različitim stadijima apoptoze. Ovi biljezi
apoptoze su točniji za identifikaciju funkcionalnih
stanica prisutnih u pripravcima KMS.
Kratkotrajna kultura KMS
Za ispitivanje klonogene sposobnosti pripravka KMS
koristi se kratkotrajna kultura stanica s dodatkom
različitih činitelja rasta. U staničnoj kulturi mogu
se prepoznati granulocitne (CFU-GM), eritroidne
(BFU-E) i miješane linije krvotvornih stanica. Klono-
gena sposobnost KMS-a se procjenjuje prema bro-
ju naraslih kolonija pojedine krvne loze u odnosu
na ukupan broj zasađenih stanica. Za rast kolonija
potrebno je nekoliko tjedana inkubacije stanica na
hranjivim podlogama, u sterilnim uvjetima i u sta-
ničnom inkubator što zahtjeva specifičnu opremu i
izvježbano osoblje. S obzirom da se rezultat kultura
treba čekati dva tjedna, ovaj test se ne može koristiti
556 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
u brzoj procjeni kvalitete pripravka KMS-a. Test je
teško standardizirati zbog velikog broja činitelja koji
utječu na rast stanica. To često uzrokuje nereprodu-
cibilnost rezultata osobito između laboratorija. Zbog
toga nema opće prihvaćenog minimalnog broja ko-
lonija naraslih in vitro koji bi s velikom vjerojatno-
šću osigurao hematološki oporavak bolesnika nakon
transplantacije KMS-a iako neki istraživači preporu-
čuju da broj CFU-GM-a bude >6x105 po kilogramu
tjelesne težine primatelja. Tehnička složenost i ne-
dostatak pouzdane kliničke korelacije s rezultatima
funkcionalnih testova razlog su da se kultura stanica
u mnogim centrima više ne koriste u rutinskoj kon-
troli kvalitete pripravaka KMS-a.
Mikrobiološko testiranje
Mikrobiološko testiranje obuhvaća: 1. ispitivanje da-
rivatelja KMS-a na uzročnike zaraznih bolesti koje se
prenose krvlju radi sprječavanja prijenosa infekcije s
davatelja na bolesnika tijekom infuzije ili iz jednog
pripravka u drugi tijekom pohrane u tekućem duši-
ku, 2. ispitivanje pripravka KMS na moguće bakterij-
sko zagađenje tijekom uzimanja, obrade ili pohrane
KMS. Rizik prijenosa zaraznih bolesti transplantatom
KMS-a ovisi o: 1. izvoru krvotvotvornih matičnih
stanica (autologni ili alogenični), 2. načinu uzima-
nja stanica; 3. postupcima laboratorijske obrade; 4.
načinu pohrane.
Darivatelji KMS moraju biti testirani na biljege za-
raznih bolesti prema međunarodnim standardima i
prema lokalnoj epidemiološkoj situaciji.
Uzorci za mikrobiološku kontrolu uzimaju se iz pri-
pravaka KMS na kraju laboratorijske obrade, a prije
zamrzavanja pripravka. Učestalost zagađenja bakte-
rijama ovisi o izvoru matičnih stanica. Odmah na-
kon dobivanja informacije o bakterijskom zagađenju
pripravka KMS, laboratorij mora o tome obavijestiti
bolesnikovog liječnika kako bi se donijela odluka
o daljnjim postupcima. Pripravci KMS-a iz koštane
srži imaju visok rizik bakterijskog zagađenja tijekom
uzimanja KMS zbog višekratnog punktiranja kože i
vrećice za sakupljanje KMS. Gotovo isključivo se radi
o bakterijama koje pripadaju normalnoj flori kože.
Ovo zagađenje rijetko uzrokuje kliničku infekciju
nakon reinfuzije KMS. Rizik bakterijskog zagađenja
je nizak za pripravke KMS dobivenih aferezom iz
periferne krvi jer je vrećica za uzimanje sastavni dio
jednokratnog zatvorenog seta za stanični separator.
Bakterijska zagađenja nastala u tijeku obrade pri-
pravka KMS-a imaju znatno težu kliničku sliku jer
se uglavnom radi o patogenim bakterijama a ne sa-
profitima kože.
Budući da je u nekim slučajevima pripravak KMS
jedinstven i nezamjenjiv, pozitivan nalaz mikrobio-
loškog testiranja ne znači uvijek da se pripravak ne
smije primijeniti. Pripravci zagađeni gram negativnim
bakterijama se nažalost uvijek moraju uništiti. Osta-
li slučajevi bakterijskog zagađenja pripravaka KMS
trebaju se razmotriti s transplantacijskim centrom i u
slučaju potrebe primijeniti uz prethodnu profilaksu
infekcije infuzijom antibiotika (prema antibiogramu)
neposredno prije transplantacije.
ZAMRZAVANJE
Zamrzavanje stanica postalo je moguće otkrićem kri-
oprotektivnog svojstva glicerola i dimetilsulfoksida
(DMSO) koji sprječavaju dehidraciju stanica tijekom
zamrzavanja. Zamrzavanje je omogućilo dugotrajnu
pohranu KMS-a bez većeg gubitka njihove vijabil-
nosti i nakon višegodišnjeg čuvanja na niskim tem-
peraturama. Ta činjenica koristi se u liječenju auto-
lognom transplantacijom KMS i za pohranu krvi iz
pupkovine za srodnu i nesrodnu transplantaciju.
Do oštećenja stanica tijekom zamrzavanja dolazi
zbog intra- i ekstracelularnog stvaranja kristala leda i
dehidracije stanica. Oštećenja ovise o brzini zamrza-
vanja. Ako je zamrzavanje brzo, kristali leda nastaju
u stanici, što uzrokuje mehaničko oštećenje stanice i
njezinu smrt. Ako je proces zamrzavanja sporiji, kri-
stali leda nastaju pretežno u izvanstraničnim prosto-
rima. Slobodne molekule vode vežu se u kristale leda
što uzrokuje koncentriranje soli u izvanstraničnom
prostoru koje više ne ulaze slobodno u stanicu, hi-
perosmolarnost i oštećenja stanice zbog dehidracije.
KMS se najčešće zamrzavaju u aparatima za kontro-
lirano zamrzavanje uz dodatak krioprotektivne oto-
Laboratorijski aspekti transplantacije krvotvornih matičnih stanica | 557
pine DMSO-a i proteina plazme s ili bez makromule-
kularne otopine hidroksietil škroba (HES).
DUGOTRAJNA POHRANA
Većina laboratorija KMS čuva na temperaturama ni-
žim od -1200C u električnim zamrzivačima ili u plino-
vitoj ili tekućoj fazi dušika. Na višim temperaturama
postoji mogućnost rasta kristala leda zbog tzv. pro-
cesa rekristalizacije u kojem voda migrira iz manjih
kristala u veće.
Zbog zadržavanja što niže temperature u spremnici-
ma, kao i zbog sprječavanja oscilacija temperature,
mnogi laboratoriji KMS pohranjuju u tekućem du-
šiku. Pri ovakvom načinu čuvanja postoji moguć-
nost da se putem tekućeg dušika prenesu uzročni-
ci zaraznih bolesti s jednog transplantata na drugi.
Opisan je slučaj zaraze tri bolesnika s hepatitisom
B nakon transplantacije zbog križne kontaminacije
transplantata čuvanih u istom spremniku. Zbog toga
transplantati čuvani u tekućem dušiku moraju biti
dodatno zaštićeni u dodatnim vrećicama.
Čuvanje transplantata u plinovitoj fazi dušika sma-
njuje rizik križne kontaminacije. Međutim, u ovim
spremnicima postoji razlika u temperaturi ovisno o
položaju. Tako npr. temperatura odmah ispod po-
klopca može biti samo -1000C. Pri otvaranju spre-
mnika i pri stavljanju pripravaka KMS u nosače,
temperatura se može dodatno povisiti. Do ovakvog
zagrijavanja može doći i više puta tijekom pohrane
KMS što može uzrokovati oštećenje stanica. Kako bi
se djelomično spriječila ova oscilacija temperature,
nosači u spremnicima moraju biti izrađeni od metala
koji dobro provode toplinu.
Neke krioprotektivne otopine dozvoljavaju pohranu
KMS-a na višim temperaturama, npr. -800C. S obzi-
rom da je -800C radna temperatura električnih zamr-
zivača koji se često koriste u laboratorijima, jedan
dio transplantacijskih centara koristi ove zamrzivače
za pohranu KMS-a. Međutim u ovim zamrzivačima
KMS mogu sigurno biti pohranjene tek nekoliko mje-
seci od sakupljanja.
Danas se smatra da KMS propisno zamrznute i ču-
vane na niskim temperaturama bez oscilacija tem-
perature, mogu desetljećima očuvati proliferativnu
sposobnost nakon otapanja.
IZDAVANJE KMS
Prije izdavanja KMS u transplantacijski centar provje-
rava se zadovoljava li pripravak sve zahtjeve kvalite-
te. Pregledava se izgled pripravka (cjelovitost pakira-
nja, oznaka, promjena boje), a rezultati proizvodnog
postupka se još jednom provjere. S obzirom da je
pripravak KMS namijenjen isključivo za liječenje
određenog bolesnika, mora biti izgrađen sustav
identifikacije koji nedvojbeno povezuje pripravak i
bolesnika. Ukoliko se otkriju odstupanja, obavješta-
va se bolesnikov liječnik i transplantacijski tim koji
donose odluku o daljnjem liječenju bolesnika.
Neposredno prije izdavanja staničnog pripravka iz
banke ili neposredno prije primjene uz krevet bole-
snika potrebno je učiniti dodatne postupke koji su
dio proizvodnog procesa (otapanje, pranje, even-
tualno uzimanje uzoraka). Prostor u kojem se ove
manipulacije rade mora zadovoljiti mikrobiološku
sigurnost.
PRAĆENJE USPJEHA TRANSPLANTACIJE
Ustanova koja je proizvela i izdala pripravak KMS-a
mora pratiti uspjeh liječenja i nepoželjne događaje
vezane uz primjenu pripravka. Praćenje bolesnika
mora obuhvatiti pokazatelje kojima se dokazuje si-
558 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze
gurnost i učinkovitost pripravka. Sigurnost priprav-
ka mjeri se učestalošću i vrstom neželjenih reakcija
povezanih s infuzijom pripravka. Učinkovitost pri-
pravka mjeri se brzinom hematološkog oporavka
pa se stoga prati broj dana od transplantacije do
porasta broja granulocita u perifernoj krvi >1 x 109/L
i broj dana od transplantacije do rasta broja trom-
bocita u perifernoj krvi >20x109/L. Neizostavno se
mora pratiti broj bolesnika u kojih nakon transplan-
tacije nije došlo do prihvaćanja transplantata. Ako
rezultati transplantacije nisu očekivani, potrebno
je razmotriti ima li u postupku uzimanja, obrade,
pohrane i transporta propusta koji su uzrokova-
li neočekivano loš klinički odgovor te eventualne
propuste otkloniti.
OSIGURANJE KVALITETE, DOBRA
PRIREĐIVAČKA PRAKSA I
AKREDITACIJA
Svi postupci modifikacije staničnog pripravka, od
početka proizvodnje do primjene, dio su proizvod-
nog procesa. Oni moraju biti trajno nadzirani i do-
kumentirani. Ustanove koje se bave proizvodnjom
staničnih pripravaka trebaju raditi prema zahtjevima
dobre priređivačke prakse i postojećim zakonskim
propisima koji reguliraju rad tkivnih i staničnih bana-
ka. Za međunarodnu razmjenu transplantata nužna
je međunarodna akreditacija prema stručnim stan-
dardima koje su izdali Foundation for the Accredita-
ton of Cellular Therapy (FACT) i Joint Accreditation
Committee ISCT and EBMT (JACIE).
LITERATURA
Benn H, Rowley SD. Bone marrow and peripheral blood stem Greco N, O’Donnell. Assessment of viability and apoptosis in
cell transplantation. U: Hillyer CD, Silberstein LE, Ness PM, cellular therapy products. U: Areman EM, Loper K, ur. Cellu-
Anderson KC, Roback JD, ur: Blood banking and transfusion lar therapy: Principles, Methods, and Regulations Bethesda,
medicine. 2. izdanje. Philadelphia: Churchill Livingston Else- MD: AABB, 2009: 563-572.
vier, 2007:787-822
Klein MA, Kadidlo D, McCullough J, et al. Microbial contami-
Benn H, Rowley SD. Collection and processing of peripheral nation of hematopoietic stem cell products: Incidence and cli-
blood stem cell and bone marrow. U: Hillyer CD, Silberstein nical sequelae. Biol Blood Marrow transplant 2006;12:1142-9.
LE, Ness PM, Anderson KC, Roback JD, ur: Blood banking
McKenna DH, Clay ME. Haematopoetic stem cell processing
and transfusion medicine. 2. izdanje. Philadelphia: Churchill
and storage. U: Murphy MF, Pamphilon DH, ur: Practical tran-
Livingston Elsevier, 2007:833-852.
sfusion medicine. 2. izdanje. Blackwell Publishing, 2005:375-
Bojanić I, Golubić Ćepulić B, Nemet D, Raić Lj. Batinić D, 368.
Labar B. Osobitosti autolognih krvotvornih matičnih stani-
Pravilnik o radu i nadzoru nad zdravstvenim ustanovama
ca iz periferne krvi u pedijatrijskih bolesnika. Lijec Vjesn.
ili dijelovima zdravstvenih ustanova s bankama tkiva (NN
2006;128(1-2):43-8.
1/2006)
Bojanić I, Golubić Ćepulić B. Umbilikalna krv kao izvor ma-
Snyder EL, Haley NR. ur. Cellular therapy: A physician’s
tičnih stanica. Acta Med Croatica. 2006;60(3):215-25.
handbook. AABB Press, Bethesda 2004
Broxmeyer HE. Umbilical cord blood stem cells: collection,
Standards for hematopoietic progenitor cell collection, proce-
processing and transplantation. U: Hillyer CD, Silberstein LE,
ssing and transplantation. 3. izdanje Joint accreditation com-
Ness PM, Anderson KC, Roback JD, ur: Blood banking and
mittee of ISCT-Europe and EBMT. 2007.
transfusion medicine. 2. izdanje. Philadelphia: Churchill Li-
vingston Elsevier, 2007:823-832 Standards for hematopoietic progenitor cell and cellular pro-
duct service. AABB Press, Bethesda 2007.
Council of Europe: Guide to safety and quality assurance for
organs, tissues and cells, 3. izdanje. Council of Europe Publis-
hig, Strasbourg, 2007.

Pitanja i odgovori

1. O čemu ovisi ishod transplantacije krvotvornih matičnih stanica?

Ishod transplantacije ovisi o broju transplantiranih stanica i njihovoj klonogenoj sposobnosti.

2. Koji je najvažniji identifikacijski biljeg krvotvornih matičnih stanica?

Najvažniji identifikacijski biljeg krvotvronih matičnih stanica je CD34.

3. Koji se biljezi apoptoze određuju u transplantatima krvotvornih matičnih stanica?

Određuju se 7-amino-aktinomicin-D (7-AAD) i aneksin V.

4. Što sve obuhvaća mikrobiološko testiranje transplantata?

Mikrobiološko ispitivanja uključuje ispitivanje darivatelja na uzročnike krvlju prenosivih bolesti i bakterijsko
ispitivanje transplantata.

5. Koja je najčešće korištena krioprotektivna otopina koja se koristi za zamrzavanje krvotvornih matičnih stanica?
Najčešće se koristi dimetilsulfoksid (DMSO).

Laboratorijski aspekti transplantacije krvotvornih matičnih stanica | 559

560 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze