Interna Skripta - Instrumentalne Metode

INSTRUMENTALNE METODE
FARMACEUTSKO ZDRAVSVENI FAKULTET TRAVNIK
prof. dr. Sejit Bobar
Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE
dr. Sejit Bobar
UVOD U SPEKTROSKOPSKE ANALITIKE METODE

Izraz spektroskopija s povijesnog se gledita odnosio na granu znanosti koja se bavila
svjetlou (tj. vidljivim zraenjem) rastavljene u komponente, odreene valne duljine, koje
ine spektar. Spektar je, dakako, imao najvaniju ulogu u razvoju savremene atomske teorije.
Nadalje, spektroskopija se pokazala snanim sredstvom kako u kvalitativnoj, tako i u
kvantitativnoj analitikoj hemiji.
Tokom vremena znaenje spektroskopije se proirilo, uz prouavanje svjetlosti ukljuujui i
druge vrste elektromagnetskog zraenja kao to su X-zrake, zatim ultraljubiasto,
infracrveno, mikrovalno i radiofrekvencijsko zraenje. Dananja primjena pojma
spektroskopskih metoda proirena je i na tehnike koje ne ukljuuju elektromagnetsko
zraenje, primjerice akustika, masena i elektronska spektroskopija.
1. SVOJSTVA ELEKTROMAGNETSKOG ZRAENJA

Elektromagnetsko zraenje je vrsta energije koja ogromnom brzinom prolazi prostorom.
Uobiajeno je mnoga svojstva elektromagnetskog zraenja opisivati pomou klasinoga
valnog modela, osnovni parametri elektromagnetskog zraenja su valna duljina, frekvencija,
brzina i amplituda. Nasuprot nekim drugim valnim pojavama, kao to je primjerice zvuk,
prijenosu zraenja nije potrebno sredstvo za irenje, to znai da se ono prenosi i vakuumom.
Valni model ne moe objasniti pojave povezane s apsorpcijom i emisijom energije zraenja.
Prikladno objanjenje tih pojava moe se pronai u promatranj elektromagnetskog zraenja
kao struje pojedinanih (diskretnih) estica energije nazvanih fotonima. Energija fotona je
pritom razmjerna frekvenciji zraenja. Takvo se dvojno objanjavanje zraenja meusobno
ne iskljuuje. Naprotiv, ono je komplementarno. Dvojnost je primjenljiva na ponaanje snopa
(struje) elektrona i drugih elementarnih estica, a valna mehanika ju je uinila razumljivom.
1.1. Valna svojstva

esto je prikladno elektromagnetsko zraenje prikazati elektrinim poljem koje sinusoidno
oscilira u prostoru. Slika1. dvodimenzionalan je prikaz snopa monohromatinog zraenja
(zraenje jedne valne duljine) polariziranoga u ravnini. Izraz polariziran u ravnini oznauje
pojave elektrinih oscilacija u jednoj jedinoj ravnini. Elektrino je polje prikazano vektorom,
duljina kojega je razmjerna jakosti elektrinog polja. Ta promjena jakosti elektrinog polja
slina je vremenskoj promjeni elektrinog polja koja nastaje pri sinusoidnom izmjeninom
naponu spojenome izmeu dviju elektroda u vakuumu. Apscisa se na tom crteu moe
prikazati ili vremenom potrebnim da zraenje proe vrstom takom u prostoru ili
udaljenou. Pritom je smjer osciliranja (titranja) polja okomit na smjer gibanja zraenja.
dr. Sejit Bobar
Valni parametri
Amplituda (A) sinusoidnog vala (Sl.1) definira se kao duljina elektrinog vektora u
maksimumu vala. Vrijeme potrebno za prolaz uzastopnih maksimuma ili minimuma vrstom
takom u prostoru naziva se periodom (p) zraenja. Frekvencija (v) je broj titraja polja u
sekundi i jednaka je 1/p.
Frekvencija zraenja odreena je izvorom i ostaje nepromijenjena bez obzira na sredstvo
kojime zraenje prolazi. Nasuprot tome, brzina vh kojom fronta vala prolazi sredstvom,
ovisna je kako o sredstvu tako i o frekvenciji; indeks i oznauje tu ovisnost o frekvenciji.
Drugi vaan parametar je valna duljina i, definirana kao linearna udaljenost izmeu dva
uzastopna valna maksimuma. Umnoak frekvencije (v-valovi u sekundi) i valne duljine (cm)
jednak je brzini gibanja vala (cm/s):
vi = vi
( 1)
Slika 1. Prikaz snopa monohromatinog zraenja valne duljine i amplitude A. Strijelice

prikazuju elektrini vektor zraenja.
U vakuumu brzina irenja zraenja postaje neovisna o valnoj duljini i dostie svoj
maksimum. Odreeno je da ta brzina, iji je simbol c, iznosi 2,99792 x 1010 cm/s. Brzina
zraenja u zraku neznatno je manja od c (ona je za priblino 0,03% manja). Dakle, uzevi u
obzir tri znaajne znamenke, jednadba 2. jednako je primjenljiva kako za zrak tako i za
vakuum:
c = v = 3,00 x 1010 cm/s
(2)
(ova jednaina je do tri znaajne znamenke jednako primjenljiva u zraku i u vakumu)
dr. Sejit Bobar
Brzina irenja zraenja manja je od c u sredstvu koje sadri neku tvar. Tada otpoinje
meudjelovanje elektromagnetskog polja zraenja i elektrona u atomima ili u molekulama
sredstva. Posljedica toga je smanjenje brzine zraenja. Budui daje frekvencija zraenja
nepromjenljiva i odreena izvorom, valna se duljina mora smanjivati pri prijelazu iz
vakuuma u sredstvo koje sadri neku tvar (jedn.1). Za snop vidljiva zraenja taj je uinak
prikazan slikom 2. Valna se duljina skrauje za priblino 200 nm, ili vie od 30%, pri prolazu
zraenja iz zraka u staklo; obrnuta se promjena zbiva pri ponovnom ulasku zraenja u zrak.
Valni broj v, definiran kao reciprona vrijednost valne duljine izraene u centimetrima (1/A),
jo je jedna veliina za opisivanje elektromagnetskog zraenja. Uobiajena jedinica za v je
cm-1, to oznauje broj valova odreene frekvencije u 1 cm.
Slika 2. Promjena valne duljine pri prolazu zraenja iz zraka u staklo pa opet u zrak.
Snaga i intenzitet zraenja
Snaga zraenja P je energija snopa koji u sekundi pada na neku povrinu; intenzitet I je snaga
po jedinici prostornoga kuta. Te su veliine povezane s kvadratom amplitude A (Sl.1).
Usprkos razliitosti tih dviju veliina, snaga zraenja i intenzitet esto se upotrebljavaju kao
sinonimi.
1.2. estina svojstva zraenja

Energija elektromagnetskog zraenja
Za razumijevanje mnogih meudjelovanja zraenja i tvari potrebno je pretpostaviti da se
elektromagnetsko zraenje sastoji od estica energije zvanih fotoni (ili kvanti). Energija
fotona ovisi o frekvenciji zraenja, a prikazana je jednadbom
E = hv
(3)
u kojoj je h Planckova konstanta (6,63 x 10-34 Js). Prikazana valnom duljinom i valnim
brojem, energija je jednaka
E=
= hcv
dr. Sejit Bobar
(4)
Dakle, valni broj je, ba kao i frekvencija, razmjeran energiji.
1B. ELEKTROMAGNETSKI SPEKTAR

Elektromagnetski spektar obuhvaa veliko podruje valnih duljina i energija. Primjerice,
foton X-zraka ( = 10-10 m) ima priblino 10 000 puta veu energiju od fotona koji emitira
uarena volframova ica (=10-6 m), a 1011 puta veu energiju od fotona iz
radiofrekvencijskog podruja.
Foton je estica elektromagnetskog zraenja mase nula i energije hv.
Podruje zraenja koje opaa ljudsko oko, dakle vidljivi dio spektra, tek je vrlo mali dio
cijelog spektra. Vidljivo podruje spektra protee se od priblino 380 do 780 nm. Razliita
zraenja, kao gama zraenje ili radiovalovi, razlikuju se od vidljive svjetlosti samo
frekvencijom, te time i energijom.
Slikom 3. prikazana su podruja elektromagnetskog spektra primjenljiva u analitikoj
spektroskopiji, te molekulski ili atomski prijelazi koji su uzrok apsorpcije ili emisije zraenja
u pojedinom podruju.
1C. APSORPCIJA ZRAENJA

U spektroskopskom nazivu apsorpcija je proces u kojemu neka hemijska vrsta prisutna u
propusnoj (prozirnoj, transparentnoj) sredini selektivno priguuje, dakle smanjuje intenzitet
neke frekvencije elektromagnetskog zraenja. Prema kvantnoj teoriji svaka elementarna
estica (atom, ion, molekula) ima jedinstven skup i raspored energijskih stanja, pri emu je
najnie meu njima osnovno stanje. Apsorpcija fotona moe nastati samo ako je energija
fotona jednaka energijskoj razlici izmeu osnovnog i nekoga od viih energijskih stanja
estice. Pritom energija fotona prelazi u atom, ion ili molekulu dovodei je u vie energijsko,
pobueno (ekscitirano) stanje. Pobuivanje vrste M u ekscitiranu vrstu M* moe se opisati
jednadbom.
M + hv --> M*
Pobuivanje je proces u kojemu hemijska vrsta apsorbira toplinsku, elektrinu ili energiju
zraenja, pri emu prelazi u vie energijsko stanje.
Nakon vrlo kratkoga vremenskog razdoblja (10-6 1-9 s) pobuena se vrsta relaksira do
svoga prethodnog ili do osnovnog stanja prenosei pritom suviak energije drugim atomima
dr. Sejit Bobar
ili molekulama u istoj okolini. Taj se proces, koji uzrokuje malo povienje temperature
okolia, opisuje jednadbom
M* -->* M + toplina
Relaksacija moe nastati i fotohemijskim razgraivanjem estice M*, pri emu nastaju nove
vrste, ili pak fluorescencijskom ili fosforescencijskom reemisijom zraenja. Vijek trajanja M*
toliko je kratak daje koncentracija pobuenih estica u bilo kojem trenutku zanemariva.
Nadalje, koliina toplinske energije otputene tokom relaksacije najee je tako mala da se
ne moe ni detektirati. Dakle, prednosti apsorpcijskih mjerenja su u injenici da se njima
najmanje to je mogue remeti energija prouavanog sustava.
Slika 3. Podruja elektromagnetskog spektra

Apsorpcijske znaajke pojedine vrste uglavnom se opisuju apsorpcijskim spektrom. To je
grafiki prikaz neke funkcije slabljenja osnovnog snopa zraenja u ovisnosti o promjeni valne
duljine, frekvencije ili valnog broja. Uzorci za apsorpcijsku analizu u ultraljubiatom i
vidljivu podruju elektromagnetskog zraenja najee su ili plinoviti ili su razrijeene
otopine pripremljene u propusnom (prozirnom, transparentnom) otapalu. Transmitancija (T)
otpine je dio upadnog zraenja proputenoga uzorku.
1C-1. Atomska apsorpcija

Pri prolazu polihromatinog ultraljubiastog ili vidljivog zraenja sredinom koja sadri
gasoviti uzorak, tek nekoliko frekvencija je oslabljeno apsorpcijom. Spektar se zato sastoji od
samo malog broja vrlo uskih (priblino 0,005 nm) apsorpcijskih linija.
dr. Sejit Bobar
1C-2. Apsorpcija infracrvenog zraenja

Infracrveno zraenje openito nema dovoljno energije za poticanje elektronskih prijelaza, ali
moe inducirati prijelaze u vibracijskim i rotacijskim stanjima povezanima s osnovnim
elektronskim stanjem molekule. Da bi se pojavila apsorpcija u molekuli, izvor mora emitirati
zraenje onih frekvencija koje tano odgovaraju energijama oznaenima duinama etiriju
strelica. Najupotrebljiviji dio infra crvenog zraenja za detekciju i odreivanje organskih
spojeva je u podruju valnih duljina od 2,5 do12 m, to odgovara podruju valnih brojeva
od 4000 do 667 cm-1.
1C-3. Pojmovi i imena u apsorpcijskoj spektroskopiji
U tablici 1. navedeni su uobiajeni nazivi i simboli koji se primjenjuju u apsorpcijskoj
spektroskopiji. Ta imena preporuili su Ameriko drutvo za ispitivanje materijala i
Ameriko hemijsko drutvo (American Society for Testing Materials; American Chemical
Society). Trei stupac sadri alternativne simbole upotrebljavane u starijoj literaturi. Zbog
visokih zahtjeva postavljenih na standardno ime, povezanih s izbjegavanjem nejasnoa i
viestrukih znaenja, itatelj mora nauiti primjenu, imena i oznake, te izbjegavati simbole iz
treeg stupca.
Transmitancija
Slika 4. prikazuje snop paralelnog zraenja prije i nakon prolaza kroz sloj otopine debljine b
cm i koncentracije c vrste koja apsorbira. Posljedica meudjelovanja fotona i estica koje
apsorbiraju jest smanjenje snage snopa sa Po na P. Transmitancije T otopine definira se kao
udio upadnog zraenja koji je proao kroz otopinu;
T= P/P0
(5)
Transmitanta se esto izraava u postotcima.
dr. Sejit Bobar
Tabela 1. Nazivlje( imena) i simboli koji se primjenjuju u apsorpcijskim mjerenjima
Slika 4. priguivanje snopa zraenja kao rezultat apsorpcije u otopini
Apsorbancija
Apsorbancija A otopine definira se jednadbom
(6)
Nasuprot transmitanciji, apsorbancija otopine se poveava s priguenjem osnovnog snopa.
Jednadba 6, zahtijeva da apsorbancijska ljestvica bude logaritamska, u spektrofotometrima
ureaj za oitanje kojih je badaren za pokazivanje vrijednosti i transmitancije i apsorbancije.
dr. Sejit Bobar
1C-4. Odnos izmeu apsorbancije i koncentracije:Beerov zakon

Funkcijski odnos izmeu veliine mjerene apsorpcijskom metodom (A) i one koja se
odreuje (koncentracija c) poznat je kao Beerov zakon:
A = log(P0 /P) = abc
(7)
gdje je a konstanta proporcionalnosti, apsorptivnost (apsorpcijski koeficijent), a b duljina

puta zraenja kroz uzorak. Budui daje apsorbancija veliina bez dimenzija, jedinice za
apsorpcijski koeficijent odreuju se uz pretpostavku da je lijeva strana jednadbe
bezdimenzijska.
Kada se koncentracija u jednadbi 7. izraava u molovima po litri, a b u centrimetrima,
konstanta proporcionalnosti naziva se molarnom apsorptivnou (molarnim apsorpcijskim
koeficijentom) s posebnim simbolom . Tada je
A = bc
(8)
gdje se izraava u L cm-1 mol-1.
1C-5. Eksperimentalno odreivanje apsorbancije i transmitancije

Apsorbancija i transmitancija, kako su prikazane jednadbama 5. i 6., ne mogu se mjeriti u
laboratoriju jer uzorak kojemu se apsorbancija odreuje mora
Slika 5. Gubici zbog refleksije irasprenja

biti smjeten u neku posudicu. Meudjelovanje zraenja i stijenki posudice je neizbjeno, te
uzrokuje gubitak refleksijom, ali i apsorpcijom (slika 5). Takvi gubici mogu biti veliki. Moe
se primjerice pokazati da se refleksijom gubi otprilike 8,5% snopa ute svjetlosti pri
vertikalnom prolazu zraenja kroz staklenu au napunjenu vodom. Nadalje, uz refleksijske
dr. Sejit Bobar
gubitke, rasprenjem na velikim molekulama ili nehomogenostima u otapalu moe se smanjiti

snaga snopa pri prolazu kroz otopinu.
Za kompenzaciju tih uinaka najee se usporeuje snaga zraenja snopa proputenoga kroz
mjernu posudicu punjenu otopinom koja apsorbira, sa snagom snopa koji prolazi identinom
posudicom punjenom samo otapalom. Eksperimentalna apsorbancija se tada definira
jednadbom
(9)
Takve eksperimentalne apsorbancije u skladu su s Beerovim zakonom i predstavljaju dobre
aproksimacije istinskih apsorbancija. Nadalje e naziv apsorbancija oznaavati omjer
definiran jednadbom 13. Pritom je P0 snaga zraenja nakon prolaza kroz posudicu s
otapalom, a P nakon prolaza kroz identinu posudicu s otopinom analita.
1C-6. Primjena Beerova zakona na smjese

Beerov zakon moe se primijeniti i na otopine koje sadre vie razliitih supstancija koje
apsorbiraju. Uz uvjet da ne postoji meudjelovanje razliitih vrsta, ukupna apsorbancija
viekomponentnog sustava iznosi
Aukupno = A1 + A2 + .... + An = 1bc1 + 2bc2 + ... + nbcn
(10)
gdje indeks n oznauje komponente l,2,...n koje apsorbiraju.
1C-7. Ogranienja primjenjljivosti Beerova zakona

Nije poznat nijedan izuzetak od linearnog odnosa apsorbancije i duljine puta pri jednoj,
odreenoj koncentraciji supstancije koja apsorbira. Meutim, esto su uoena odstupanja od
izravne proporcionalnosti apsorbancije i koncentracije pri konstantnoj duljini puta. Neka od
tih odstupanja su osnovna i predstavljaju istinska ogranienja zakona. Druga su posljedica ili
naina mjerenja apsorbancije (instrumentna odstupanja) ili hemijskih promjena povezanih s
koncentracijskim promjenama (hemijska odstupanja).
Istinska ogranienja
Beerov zakon uspjeno opisuje apsorpcijsko ponaanje samo razrijeenih otopina, te je u tom
smislu granini zakon. Pri visokim koncentracijama (najee > 0,01 M) smanjuju se
prosjene udaljenosti meu esticama vrste koja apsorbira, do stupnja pri kojemu svaka
estica utjee na raspodjelu naboja susjedne etice. Takvo meudjelovanje moe mijenjati
njihovu sposobnost apsorpcije pri odreenoj valnoj duljini. Budui da doseg meudjelovanja
ovisi o koncentraciji, ta je pojava uzrokom odstupanja od linearnog odnosa apsorbancije o
koncentraciji. Slian se uinak katkad pojavljuje u razrijeenim otopinama supstancije koja
apsorbira ako se u otopini nalaze visoke koncentracije nekih drugih vrsta, a osobito
10
dr. Sejit Bobar
elektrolita. Blizina stranih iona i supstancije koja apsorbira mijenja molarnu apsorptivnost
ove druge elektrostatikim meudjelovanjem, a to uzrokuje odstupanje od Beerova zakona.
Iako uinak molekulskog meudjelovanja najee nije znatan pri koncentracijama manjima
od 0,01 M, izuzetci postoje meu nekim velikim organskim ionima ili molekulama.
Primjerice, objavljeno je da se molama apsorptivnost pri 436 nm kationa metilenskog plavila
poveava za 80% kada se koncentracija poveava od 10-5 do 10-2 M; ak niti ispod 10-6 M
nema strogog slaganja s Beerovim zakonom.
Odstupanja od Beerova zakona pojavljuju se i zbog ovisnosti apsorptivnosti o indeksu loma
otopine. Tako, ako su promjene u koncentraciji uzrok znatnih promjena u indeksu loma
otopine, pojavljuje se odstupanje od Beerova zakona. Openito je taj uinak malen i rijetlo
izraen pri koncentracijama manjima od 0,01 M.
Hemijska odstupanja
Oita odstupanja od Beerova zakona esto su posljedica asocijacije, disocijacije ili reagiranja
vrste koja apsorbira s otapalom, pri emu nastaju produkti apsorpcijskih znaajki razliitih od
znaajki analita. Primjer pokazuje da se takva odstupanja od Beerova zakona mogu lako
predvidjeti iz podataka o konstantama ravnotee reakcija i molarnih apsorptivnosti ispitivane
vrste.
2D EMISIJA ELEKTROMAGNETSKOG ZRAENJA

Atomi, ioni ili molekule mogu se pobuditi ujedno ili u nekoliko viih energijskih stanja na
razliite naine. Procesi koji to uzrokuju ukljuuju bombardiranje elektronima ili drugim
elementarnim esticama, izlaganje visokonaponskoj izmjeninoj iskri, podvrgavanje utjecaju
topline u plamenu ili u elektrinom luku, ili pak izlaganje izvoru elektromagnetskog zraenja.
Vrijeme ivota pobuene vrste openito je vrlo krtko (10-6 10-9 s), a relaksacija u nie ili u
osnovno stanje zbiva se uz otputanje suvika energije u obliku elektromagnetskog zraenja,
topline ili ak oboje.
2D-1. Emisijski spektri

Zraenje izvora uglavnom se opisuje pomou emisijskog spektra, koji je prikaz relativne
snage emitiranog zraenja kao funkcije bilo valne duljine ili frekvencije. Imamo tri vrste
spektra: linijski, vrpasti i kontinuirani. Linijski spektar tvori niz otrih, dobro definiranih
maksimuma koji nastaju pobuivanjem pojedinanih atoma. Vrpasti se spektar sastoji od
nekoliko skupina linija smjetenih meusobno tako blizu da ih se ne moe potpuno razdvojiti.
Izvor takvih vrpca su male molekule ili radikali. Konano, kontinuirani je spektar odgovoran
za pojaanje pozadinskog zraenja pri valnim duljinama veima od priblino 350 nm.
Linijski i vrpasti spektri superponirani su kontinuiranome.
11
dr. Sejit Bobar
Linijski spektri
Pojedinani atomi meusobno dobro odvojeni, kao u plinu, emitiraju linijske spektre.
Pojedinane se estice u plinovitu stanju ponaaju meusobno neovisno, te se spektar sastoji
od niza otrih linija irine priblino 10-4 oA.
Dijagram energijskih razina na slici 6a. prikazuje nain nastajanja linija u tipinomu
emisijskom spektru nekog elementa. Vodoravna crta E0 odgovara najniem, osnovnom
energijskom stanju atoma. Vodoravne crte E1 i E2 prikazuju dva via energijska elektronska
stanja. Primjer, jedini vanjski elektron natrijevog atoma u osnovnom se E0 stanju nalazi u
orbitali 3s. Energijska razina E1 tada predstavlja energiju atoma koja odgovara prijelazu tog
elektrona u stanje 3p, apsorpcijom toplinske, elektrine ili energije zraenja. Taj je prijelaz
prikazan manjom, lijevom, valovitom strijelom na slici 6a. Nakon priblino 10-8 sekundi,
atom se vraa u osnovno stanje emitiranjem fotona frekvencije i valne duljine prikazane
jednadbama 11. i 12:
(11) i (12)
Emisijski je proces prikazan kraom, desnom, ravnom strelicom na slici 6a.
Slika 6. Dijagram energijski razina atoma natrijuma i jednostavne molekule. Prikazan je

nastanak (a) linijskog spektra i (b) vrpastog spektra.
Na primjeru atoma natrija E2 odgovara energijom bogatijem stanju 4p; kao rezultat toga,
zraenje E2 se pojavljuje pri manjim valnim duljinama. Prijelazom 3 p --> 3 s nastaje linija
12
dr. Sejit Bobar
pri otprilike 590 nm. Vano je naglasiti da su zbog prijelaza izmeu ista dva stanja, emitirane
valne duljine identine valnim duljinama apsorpcijskih maksimuma natrija.
Vrpasti spektri
Spektralni izvori zbog prisutnosti plinovitih radikala ili malih molekula esto sadre vrpaste
spektre.
Slika 6b. djelomian je dijagram energijskih razina molekule, a prikazuje osnovno stanje E0 i
dva od nekoliko pobuenih elektronskih stanja E1 i E2. Prikazano je i nekoliko od mnogih
vibracijskih razina povezanih s osnovnim stanjem. Vibracijske razine koje pripadaju
pobuenim stanjima izostavljene su jer je vrijeme ivota pobuenog vibracijskoga stanja
neznatno u usporedbi s elektronskim (10-15 s prema 10-8 s). Posljedica takve ogromne razlike
u vremenima ivota oituje se u injenici da se elektron pobuen u jedno od viih vibracijskih
razina nekoga elektronskog stanja relaksira u najnie vibracijsko stanje, bre nego to se
dogodi prijelaz u osnovno elektronsko stanje. Zbog toga zraenje koje je rezultat elektrinog
ili toplinskog pobuivanja vieatomne vrste gotovo uvijek ukljuuje prijelaze s najnie
vibracijske razine pobuenoga elektronskog stanja na neku od nekoliko vibracijskih razina
osnovnog stanja.
Mehanizam kojime se vibracijski pobuene vrste relaksiraju u najblie elektronsko stanje
ukljuuje prijenos suvika energije na druge atome sustava nizom sudara. Taj proces tee
ogromnom brzinom. Relaksacija iz jednog elektronskog stanja u drugo moe se takoer
dogoditi prijenosom energije sudarima, ali je brzina tog procesa dovoljno malena da prednost
ima relaksacija otputanjem fotona.
Dijagram energijskih razina na slici 6b. prikazuje mehanizam emitiranja dviju vrpca zraenja
koje se sastoje od pet blisko smjetenih linija, koje emitira molekula pobuena ili toplinskom
ili elektrinom energijom. U stvarnosti je broj pojedinanih linija mnogo vei jer osnovno
stanje sadri daleko vie vibracijskih razina nego to je prikazano. Uz to, svakoj vibracijskoj
razini superponirano je vie rotacijskih stanja. Razlike u energijama izmeu rotacijskih razina
za priblino su jedan red veliine manje od onih koje odgovaraju vibracijskim stanjima. Stoga
je stvarna molekulama vrpca sastavljena od mnogo vie linija nego to je prikazano slikom, i
one su smjetene meusobno mnogo blie.
Kontinuirani spektri
Pravo kontinuirano zraenje nastaje zagrijavanjem vrsti tjela do usijanja (slika 7). Zraenje
takve vrste, koje se naziva zraenjem crnog tijela, vie je ovisno o temperaturi povrine koja
zrai nego o materijalu te povrine. Zraenje crnog tijela nastaje zbog bezbrojnih atomskih i
molekulskih oscilacija pobuenih toplinskom energijom u kondenziranoj krutini. Treba u
slici 7., uoiti pomak energijskih maksimuma prema manjim valnim duljinama pri povienju
13
dr. Sejit Bobar
temperature. Jasno je da su potrebne vrlo visoke temperature da bi toplinski pobuen izvor

emitirao znatan dio svoje energije u obliku ultraljubiastog zraenja.
Kako je ranije spomenuto, dio kontinuiranoga pozadinskog zraenja u spektru plamena
vjerojatno predstavlja toplinsku emisiju uarenih estica u plamenu. Takvo se pozadinsko
zraenje naglo smanjuje s pribliavanjem ultraljubiastom podruju spektra.
Zagrijana vrsta tijela vaan su izvor infracrvenoga, vidljiva i ultraljubiastog zraenja
veih valnih duljina u analitikim instrumentima.
Slika 7. Krivulje zraenja crnog tijela.

Utjecaj koncentracije na linijske i vrpaste spektre. Snaga zraenja P linije ili vrpce
izravno ovisi o broju pobuenih atoma ili molekula, a koji je razmjeran ukupnoj koncentraciji
c vrsta prisutnih u izvoru. Prema tome moe se pisati
P = kc
(13)
gdje je k konstanta proporcionalnosti. Taj je odnos temelje kvantitativne emisijske

spektroskopije.
2D-2. Emisija fluorescencijom i fosforescencijom

Fluorescencija i fosforescencija analitiki su vani emisijski procesi pri kojima se atomi ili
molekule pobuuju apsorpcijom snopa elektromagnetskog zraenja. Pobuene se vrste
relaksiraju u osnovno stanje otputanjem suvika energije u obliku fotona. Fluorescencija se
zbiva daleko bre od fosforescencije, te je openito potpuna za priblino 10-5 sekundi ili
manje nakon pobuivanja. Fosforscencijska emisija moe trajati minutama ili ak satima
nakon zavretka ozraivanja. Fluorescencija je analitiki mnogo vanija od fosforescencije, te
e biti potanje objanjena.
14
dr. Sejit Bobar
Atomska fluorescencija
Plinoviti atomi fluoresciraju kada su izloeni zraenju valne duljine koja tono odgovara
valnoj duljini apsorpcijske ili emisijske linije ispitivanog elementa. Primjerice, plinoviti
atomi natrija prelaze u pobueno energijsko stanje E1 (slika 6b) apsorpcijom zraenja pri 590
nm. Tada zapoinje relaksacija ili fluorescencijom ili emisijom iste valne duljine.
Fluorescencija u koje su valne duljine pobuivanja i emisije iste naziva se rezonancijskom
fluorescencijom. Atomi natrija mogu rezonantno fluorescirati i kad su izloeni valnoj duljini
pri 330 nm. Nadalje, element moe proizvesti nerezonancisjku fluorescenciju relaksacijom
prvotno na energijsku razinu E1) nizom sudara s ostalim prisutnim vrstama. Relaksacija u
osnovno stanje moe se nastaviti emisijom fotona pri 590 nm ili daljnjom kolizijskom
deaktivacijom. Rezonancijska fluorescencija najee je povezana s atomima, a rjee s
molekulskim vrstama.
Molekulska fluorescencija
Broj molekula koje fluoresciraju relativno je malen. Fluorescencija zahtijeva strukturna
svojstva koja usporavaju brzinu relaksacijskih procesa bez otputanja zraenja, a poveavaju
brzinu fluorescencijske relaksacije. Veina molekula ne posjeduje takve strukture, ime je
iskljuena mogunost fluorescencije.
Molekulskom fluorescencijom nastaju vrpce zraenja. Slino molekulskim aposorpcijskim
vrpcama, molekulske fluorescencijske vrpce sastavljene su od niza teko razluivih, blizu
smjetenih linija. Linije 1 i 2) kojima zavravaju fluorescencijske vrpce pri kratkim valnim
duljinama, odnosno pri visokim energijama, rezonancijske su linije. To znai, da se
molekulske fluorescencijske vrpce sastoje od linija veih valnih duljina od vrpce
apsorbiranog zraenja, koje je uzrok njihova pobuivanja. Taj se pomak u valnim duljinama
ponekad naziva Stokesovim pomakom.
3. INSTRUMENTI U OPTIKOJ SPEKTROSKOPIJI

Osnovni dijelovi analitikih instrumenata za emisijsku, apsorpcijsku i fluorescencijsku
spektroskopiju meusobno su vrlo slini kako u funkciji tako i u izvedbi bez obzira na to jesu
li predvieni za rad u ultraljubiastom, vidljivu ili infracrvenom dijelu spektra. Upavo zbog te
slinosti ti se ureaji esto nazivaju optikim instrumentima, ak i kad su namijenjeni
primjeni u podruju zraenja koje ne opaa ljudsko oko. U ovom e poglavlju najprije biti
opisane znaajke dijelova koji su zajedniki svim optikim instrumentima, te istaknuta
svojstva koja ne ovise o primijenjenoj valnoj duljini kao i svojstva koja ovise. Zatim e se
razmotriti ope znaajke tipinih instrumenata, a posebice onih koji se primjenjuju u
apsorpcijskoj spektroskopiji.
3A. DIJELOVI INSTRUMENATA
Veina je spektroskopskih ureaja sastavljena od pet osnovnih dijelova: (1) stabilnog
izvora energije zraenja, (2) selektora valnih duljina koji omoguuje izdvajanje
15
dr. Sejit Bobar
odreenoga valnoga podruja, (3) jednoga ili vie spremnika za uzorke,(4) detektora
zraenja ili pretvomika energije zraenja u mjerljiv signal (najee elektrini) te (5)
procesora signala i ureaja za njegovo oitanje. Slikom 8. prikazan je nain sastavljanja
pojedinih djelova u instrumentima za emisijsku, apsorpcijsku i fluorescencijsku
spektroskopiju. Oito je daje meusoban poloaj etvrte i pete sastavnice istovjetan u svim
tipovima ureaja.
Emisijski se insturmenti od ostala dva tipa razlikuju utoliko to su u njih prvi i trei navedeni
dio zajedno. To znai da su elektrini luk, iskra, zagrijana povrina ili plamen ujedno i
spremnici uzorka i uzronici emisije karakteristinog zraenja. Nasuprot tome, apsorpcijska i
fluorescencijska spektroskopija zahtijevaju odvojenost izvora enrgije zraenja i spremnika
uzoraka. U apsorpcijskim mjerenjima snop koji dolazi iz izvora prolazi uzorkom tek nakon
izlaza iz selektora valnih duljina. Neki instrumenti, meutim, imaju obrnute poloaje
spremnika i selektora. U fluorescenciji izvor inducira emisiju karakteristinog zraenja
uzorka,
Slika 8. Sastavni dijelovi razliitih tipova instrumenata za optiku spektroskopiju: (a)

emisijska spektroskopija; (b) apsorpcijska spektroskopija; (c) fluorescencijska i
spektrtoskopija rasprivanja koja se najee mjeri pod kutom od 90 stupnjeva u odnosu
prema snopu iz izvora.
16
dr. Sejit Bobar
3A-1. Prozirnost materijala za izradu optikih dijelova ureaja

Slika 9. prikazuje podruja spektralne prozirnosti razliitih materijala koji se primijenjuju za
izradu prozora, lea, kiveta i prizama u spektroskopskim instrumentima. Obino silikatno
staklo uglavnom se rabi u ureajima za primjenu samo u vidljivu dijelu spektra. Taljeni
silicijev dioksid i kvarc proiruju podruje spektroskopskih instrumenata do 180 i 200 nm u
ultraljubiastom dijelu spektra. Infracrvena spektroskopija zahtijeva primjenu prozora
nainjenih od tvari kao to je polirani natrijev, kalijev ili srebrov klorid. Sve tvari prozirne u
infracrvenom dijelu spektra jako apsorbiraju vlagu, te ih je potrebno redovito istiti do
ponovne potpune prozirnosti.
3A-2. Spektroskopski izvori zraenja

Apsorpcijska i fluorescencijska spektroskopija zahtijevaju vanjski izvor konstantnog i
dovoljno snanog zraenja koje omoguuje jednostavnu detekciju i mjerenje. Najee se
snaga zraenja izvora eksponencijalno mijenja s naponom izvora elektrine energije. Zbog
toga se esto uz spektroskopske izvore upotrebljavaju regulatori napona.
Slika 9. transmitacisko podruije razliitih materijala za izradu dijelova optikih

instrumenata
Pitanje stabilnosti izvora ponekad se zaobilazi cijepanjem izlaznog snopa izvora u dva snopa,
referentni koji prolazi otapalom i drugi koji prolazi otopinom analita. Tada je detektor
ozraen naizmjenice s dva snopa ili se pak snopovi promatraju meusobno prilagoenim
detektorima. Omjer intenziteta dva snopa tad pribavlja analitiki parametar koji je uglavnom
neovisan o fluktuacijama izvora.
U tablici 2. popisani su uobiajeni izvori, koji se upotrebljavaju u razliitim tipovima
spektroskopija. Treba uoiti da se primjenjuju kako kontinuirani tako i linijski izvori
zraenja.
17
dr. Sejit Bobar
Vodikova i deuterijeva arulja

Uistinu kontinuiran spektar u ultraljubiatom podruju nastaje elektrinim pobuivanjem
deuterija ili vodika pri nisku pritisku. Mehanizam kojime nastaje kontinuum ukljuuje
stvaranje pobuene molekule (D2* ili H2*) apsorpcijom elektrine energije. Te vrste tada
disociraju, pri emu nastaju dva vodikova ili deuterijeva atoma i ultraljubiasti foton. Za
vodik se reakcije mogu napisati kao
gdje je Ee elektrina energija koju je molekula apsorbirala. Energija ukupnog procesa tada je
Tabela 2.
pri emu je EH2* fiksna kvantizirana energija H2, a EH' i EH'' su kinetike energije dvaju
vodikovih atoma. Zbroj tih dviju energija moe kolebati od nule do vrijednosti EH2* . Prema
tome, energija i frekvencija fotona takoer mogu kolebati u granicama tog podruja enegija.
To znai, ako su dvije kinetike energije male, umnoak hv je velik, i obrnuto, ako su dvije
18
dr. Sejit Bobar
energije velike, hv je mali. Posljedica toga je doista kontinuiran spektar koji se protee od
160 nm do poetka vidljiva podruja.
Veina suvremenih arulja za proizvodnju ultraljubiastog zraenja su nisko-naponske i
sadre deuterij. U njima luk nastaje izmeu zagrijane niti arulje premazane oksidom i
metalne elektrode. Ugrijana nit daje elektrone za odravanje istosmjerne struje pri naponu od
priblino 40 V. Za postizanje stalnih intenziteta potreban je izvor energije koji se moe
regulirati.
Kako deuterijska tako i vodikova arulja proizvode upotrebljiv kontinuirani spektar u
podruju od 160 do 375 nm . Intenzitet deuterijske arulje vei je od intenziteta vodikove,
to je razlog njezinoj eoj primjeni. Pri veim valnim duljinama (> 360 nm) u tim izvorima
nastaju emisijske linije koje su superponirane kontinuumu. Te linije pokatkad u primjeni
izazivaju smetnje. Meutim, one su upotrebljive za badarenje valnih duljina apsorpcijskih
instrumenata.
arulja s volframovom niti
Najei izvor vidljiva zraenja i zraenja u bliskom infracrvenom podruju je arulja s
volframovom niti (Sl.10). Raspodjela energije tog izvora slina je onoj crnog tijela, te je
stoga ovisna o temperaturi. U veine apsorpcijskih instrumenata radna temperatura joj je
priblino 2 900 K. Glavnina energije se pri toj temperaturi emitira u infracrvenom dijelu
spektra. arulja s volframovom niti primjenjiva je u podruju valnih duljina izmeu 320 i 2
500 nm. Donja je granica nametnuta apsorpcijom staklenog omotaa oko niti.
Slika 10. Volframova arulja

Energija izlaznog zraenja volframove arulje u vidljivu se podruju mijenja priblino s
etvrtom potencijom radnog napona, te je nuan strogi nadzor napona. Stoga se primjenjuje
ili pretvara stalnog napona ili elektroniki regulator napona. Postoji mogunost napajanja
arulje akumulatorom od 6 V, kojime se postie vrlo stabilan napon ako se odrava u dobru
stnaju.
arulja volfram/halogen sadri male koliine joda u kvarcnom omotau. Kvarc omoguuje
rad pri temperaturi od priblino 3 500 K, ime se postiu vei intenziteti i proiruje podruje
arulje duboko u ultraljubiasti dio spektra. ivotni vijek arulje volfram/halogen vie je
nego dvostruk od obine volframove arulje vijek koje je ogranien sublimacijom volframa iz
19
dr. Sejit Bobar
ice. U prisutnosti joda sublimirani volfram reagira, pri emu nastaju plinovite molekule WI2
koje se vraaju prema vruoj niti gdje se molekule razgrauju i ponovno taloe atomi
volframa. arulje volfram/halogen sve se ee rabe u suvremenim apsorpcijskim
instrumentima zbog njihova irokoga valnog podruja, veeg intenziteta i duljeg vijeka.
Izvori infracrvenog zraenja

Kontinuirano infracrveno zraenje dobiva se pomou vruih inertnih krutina. Globarov je
tapi silicijeva karbida dimenzija 5 X 50 mm. Prolazom elektriciteta Globarov se izvor
zagrijava na priblino 1 500 C i pritom emitira zraenje u podruju od 1 do 40 /m.
Nernstov tapi je valjak sastavljen od cirkonijeva i itrijeva oksida, dimenzija 2 X 20 mm; on
emitira infracrveno zraenje pri zagrijavanju do visokih temperatura pomou elektrine
struje. Elektino grijane uzvojnice od ice ni-hroma takoer slui kao izvori infracrvenog
zraenja.
3A-3. Selektori valnih duljina

Spektroskopski instrumenti uglavnom sadre ureaj koji suzuje mjereno zraenje do uske
vrpce koju uzorak apsorbira ili emitira. Takva sredstva esto bitno utjeu na selektivnost i
osjetljivost instrumenta. Nadalje, u apsorpcijskim mjerenjima uske vrpce poveavaju
vjerojatnost slaganja s Beerovim zakonom.Nema selektora koji bi mogao izdvojiti zraenje
samo jedne valne duljine. Umjesto toga, izdvaja se skupina susjednih valnih duljina, koja se
naziva vrpcom. Te su valne duljine rasporeene vie ili manje simetrino oko sredinje,
nominalne (nazivne) valne duljine. Efektivna irina vrpce ili irina vrpce selektora (Sl. 6)
definira se kao ona irina vrpce, izraena u jedinicama valne duljine, koja odgovara irini
maksimuma u polovici njegove visine.
Slika 11. Izlazni signal tipinog selektora valnih duljina
20
dr. Sejit Bobar
Ordinata tog crtea predstavlja postotak upadnog zraenja koji je proputen za svaku
odreenu valnu duljinu. Razliiti selektori valnih duljina daju bitno razliite irine vrpca.
Primjerice, monohromatori visoke kakvoe za vidljivo podruje mogu imati efektivnu irinu
vrpce od nekoliko desetinka nanometra ili ak manje, a neki apsorpcijski filtar istog podruja
moe posjedovati irinu vrpce od 200 nm ili vie.
Postoje dva osnovna tipa selektora valnih duljina za proizvodnju uskih vrpca zraenja (tablica
3). To su monohromatori i filtri. Prednost monokromatora je u injenici da se izlazne valne
duljine mogu kontinuirano mijenjati u relativno irokom spektralnom podruju.
Tabela 3 Selektori valnih duljina u spektroskopiji

Filtri
Filtri rade na naelu apsorpcije svih valnih duljina kontinuiranog izvora, osim jedne
ograniene vrpce. Openito, oni su odreeni svojom nazivnom (nominalnom) valnom
duljinom, postotkom transmitancije u maksimumu i efektivnom irinom vrpce (slika 11).
Interferencijski filtri. Interferencijski filtri primjenjivi su kako za ultraljubiasto i vidljivo
zraenje tako i za zraenje do priblino 14 m u infracrvenom podruju. Kao to sam naziv
kazuje, interferencijski se filtri temelje na optikoj interferenciji, ime proizvode relativno
uske vrpce zraenja.
Interferencijski se filtar sastoji od vrlo tanka sloja propusnog materijala (esto kalcijev ili
magnezijev fluorid) prevuenoga sa obje strane slojem metala dovoljno tankim da priblino
polovicu zraenja koje na njega pada proputa, a drugu polovicu reflektira. Sve je to
smjeteno izmeu dviju staklenih ploa koje su zatita od atmosfere. Od zraenja koje pada
na takav filtar pod kutom od 90 stupnjeva, prvi metalni sloj priblino polovicu proputa, a
polovicu reflektira. Proputeno zraenje se slino raspodjeljuje na drugomu metalnom sloju.
Kada je dio koji se reflektira na drugom sloju prikladne valne duljine, on se djelomice reflektira i na unutranjoj strani prvog sloja, a u fazi sa zraenjem iste valne duljine koja je i dalje
proputena prvim slojem. Rezultat tog procesa je konstruktivna interferencija zraenja te
valne duljine i uklanjanje veine drugih valnih duljina. Lako je pokazati da se nominalna
valna duljina interferencijskog filtra Amaks moe prikazati jednadbom1
max = 2tn/ n
(13)
gdje je t debljina sredinjega fluoridnog sloja, n indeks loma tog materijala, a n cijeli broj
nazvan redom interferencije. Stakleni slojevi filtra esto su odabrani tako da apsorbiraju sve
21
dr. Sejit Bobar
osim one valne duljine koju proputa sredinji sloj, ime je propusnost filtra ograniena na
samo jedan red.
Slikom 12. prikazane su radne znaajke tipinoga interferencijskog filtra. Veina filtara tog
tipa ima irinu vrpce bolju od 1,5% nazivne valne duljine, iako se taj broj u nekih filtara s
uskim vrpcama moe smanjiti i do vrijednosti od 0,15%. Meutim, takvi filtri imaju
maksimum transmitancije priblino 10%.
Apsorpcijski filtri. Apsorpcijski filtri, koji su opentio jeftiniji i loiji od interferencijskih, u
primjeni su ogranieni samo na vidljivo podruje spektra. Taj tip filtra najee je napravljen
od obojene staklene ploe koja apsorpcijom uklanja dijelove upadnog zraenja. Podruje
efektivnih irina vrpca apsorpcijskih filtara priblino je 30 - 250 nm. Filtri koji proizvode
najue vrpce istodobno apsorbiraju veliki dio zraenja, te mogu imati transmitancije ak i
manje od 1 % u maksimumuTrite je opskrbljeno staklenim filtrima maksimumi kojih
pokrivaju itavo vidljivo podruje spektra. Njihove su radne znaajke bitno slabije od onih
interferencijskih filtara, meutim cijena im je mnogo nia, a za neke rutinske poslove sasvim su prikladni.
Slika 12. ema vrpce za dva tipa filtera

Monohromatori
Monohromatori za ultraljubiasto, vidljivo i infracrveno zraenje sline su grae. Svi se oni
sastoje od pukotina, lea, zrcala, prozora i disperznog sredstava. Meutim, tvari od kojih su ti
dijelovi nainjeni ovise o valnom podruju njihove primjene (Sl. 9).
Dijelovi monohromatora. Slikom 13. shematski su prikazani optiki elementi svih
monohromatora: (1) ulazna pukotina, (2) kolimacijske lee ili zrcalo koje proizvodi paralelan
snop, (3) prizma ili reetka koja raspruje zraenje u pojedinane komponente - valne duljine
te (4) dio za fokusiranje koji projicira niz pravokutnih slika izlazne pukotine na ravnu
povrinu nazvanu arinom ravninom. Nadalje, veina monokromatora ima izlazne i ulazne
prozore koji tite unutranje dijelove od praine i korozivnih laboratorijskih para.Dva
22
dr. Sejit Bobar
najea tipa disperznih sredstava u monokromatorima su refleksijska reetka i prizma (Sl.

13). U svrhu jednostavnijeg prikazivanja pretpostavlja se daje snop zraenja sastavljen od
samo dviju valnih duljina 1 i 2 (1 > 2). Snop ulazi u monohromator kroz uzak pravokutan
otvor (pukotina), kolimira se, a tada pada na povrinu disperznog elementa pod nekim kutom.
Slika 13. Dva tipa monohromotara (a) monohromator sa reetkom prema Czerny-Turneru;
(b) monohromator sa prizmom prema Bunsenu
U monohromatorima s reetkom, kutna disperzija snopa u pojedinane valne duljine nastaje
zbog difrakcije na refleksnoj povrini. Disperzija u instrumentima s prizmom rezultat je loma
zraenja na dvjema povrinama. I u jednima i u drugima raspreno se zraenje fokusira u
arinoj ravnini AB, gdje se pojavljuju dvije slike ulazne pukotine, po jedna za svaku valnu
duljinu. Zakretanjem disperznog elementa te se slike mogu fokusirati na izlaznu pukotinu.
Kad je detektor smjeten na izlaznu pukotinu monokromatora (Sl. 13a), a reetka se okree
tako da jedna od linija (primjerice 1) prolazi pukotinom od vrijednosti 1 - do vrijednosti
1 + pri emu je mala razlika u valnim duljinama, tada izlazni signal detektora poprima
oblik Gaussove krivulje. Efektivna irina vrpce monohromatora definiranoga priloenom
slikom ovisi o veliini i kakvoi disperznog elementa, o irinama pukotina i arinoj
udaljenosti monohromatora. Monohromator visoke kakvoe ima u ultraljubiastom i vidljivu
podruju efektivnu irinu vrpce nekoliko desetinka nanometra ili manje. Efektivna irina
23
dr. Sejit Bobar
vrpce monohromatora koji openito zadovoljava pri kvantitativnoj primjeni nalazi se u

podruju od 1 do 20 nm.
Refleksijske reetke slue kao disperzni elementi u suvremenim spektroskopskim
ureajima. Stoga e se daljnje izlaganje ograniiti iskljuivo na monohromatore s reetkama.
Refleksijske reetke. Veina je refleksijskih reetaka vjerna kopija (replike) originalne
reetke (matrica), koja se sastoji od velikog broja paralelnih blizu smjetenih ureza u tvrdoj
ulatenoj povrini, nainjenih pomou prikladnoga dijamantnog pribora. Pogled na uveani
presjek nekoliko tipinih ureza prikazan je slikom Reetka za ultraljubiato i vidljivo
zraenje sadri od 300 do 2 000 ureza/mm, pri emu je 1 200 - 1 400 najei broj ureza.
Za infracrveno podruje zraenja uobiajen broj je 10 - 200 ureza/mm.
Slika 14. Mehanizam difrakcije na eeletnoj reetki

Replike reetaka pripremaju se na sljedei nain. Tanak sloj aluminija nanese se uparavanjem
na matricu prethodno prevuenu slojem materijala koji doputa jednostavno odvajanje
aluminija od matrice. Tada se staklena ploa slijepi uz aluminij, a urezani se sloj skine s
originalnoga kalupa. Time je zavren postupak pripremanja reetke. U novije se vrijeme u
monohromatorima pojavljuju holografske reetke. Ta se vrsta reetaka izrauje finim
litografskim tehnikama uz primjenu para laserskih zraka. Radne znaajke tih reetaka daleko
nadmauju znaajke replika - reetaka.
Disperzija pomou refleksijske reetke. Reetka prikazana slikom 14. eeletna je reetka, a
urezi su napravljeni na takav nain da osiguravaju relativno iroke povrine na kojima dolazi
do refleksije, te uske neupotrijebljene povrine. Takav geometrijski raspored osigurava vrlo
djelotvornu difrakciju. Svaka se iroka povrina moe promatrati kao tokasti izvor zraenja
u kojemu nastaju zrake 1, 2 i 3, koje meusobno interferiraju. Konstruktivna se interferencija
24
dr. Sejit Bobar
postie kada se duljine puta zraka razlikuju za cjelobrojni viekratnik n valne duljine
upadnog snopa.
Paralelne zrake 1 i 2 monohromatinog zraenja (slika 14) padaju na reetku pod upadnim
kutom i u odnosu prema okomici reetke. U ovom primjeru najvea konstruktivna
interferencija nastaje pri kutu refleksije r. Oito je da zraka 2 prelazi vei put od zrake 1, a da
je ta razlika jednaka CD AB. Ta razlika mora iznositi im da bi se zadovoljio uvjet
nastajanja konstruktivne interferencije:
Pritom se n, mali cijeli broj, naziva redom difrakcije. Kut CAD jednak je kutu i, a kut BDA
kutu r. Stoga vrijedi trigonometrijski odnos
u kojemu je d razmak izmeu povrina koje reflektiraju. Takoer je oito daje
Negativan predznak dogovorno pokazuje da kut refleksije r lei sa suprotne strane okomice
reetke od upadnoga kuta i (Sl. 14). Kut r je pozitivan kada je s iste strane kao i. Uvrtenjem
dvaju zadnjih izraza u prvi dobije se uvjet konstruktivne interferencije:
n = d(sin i + sin r)
(14)
Jednadba 14. pokazuje da za zadani kut difrakcije r postoji nekoliko valnih duljina . Dakle,
ako se pod kutom r nalazi linija prvog red (n =1) pri 900 nm, pod tim istim kutom pojavit e
se i linija drugog reda (450 nm), kao i ona treeg reda (300 nm). Najee je linija prvog reda
najintenzivnija. Dapae, mogue je napraviti reetku koja u tom redu koncentrira ak 90%
upadnog intenziteta. Linije viih redova mogue je openito ukloniti pomou filtara.
Primjerice staklo, koje apsorbira zraenje ispod 350 nm, uklanja spektre viih redova
povezane sa zraenjem prvog reda u veem dijelu vidljiva podruja. Sljedei primjer ocrtava
te tvrdnje.
Slinim raunom dobivaju se sljedei podatci:
25
dr. Sejit Bobar
Nasuprot prizmi, reetka dispergira zraenje linearno du arine ravnine monokromatora, to

pojednostavnjuje njegovu izradbu. Druga prednost je u tome to su reetke izraene kao
replike mnogo jeftinije od prizama.
Monohromatorske pukotine. Pukotine monohromatora vrlo su vane za kakvou
instrumenta. Pukotina se radi od dva komada kovine, vrlo paljivo da njezini rubovi budu
vrlo otri. Treba paziti da ti rubovi budu meusobno paralelni i da lee u istoj ravnini.
Efektivna irina vrpce monohromatora ovisi kako o disperziji prizme ili reetke tako i o
ulaznoj i izlaznoj pukotini. Veina je monohromatora opskrbljena pukotinama promjenjive
irine, ime se moe mijenjati efektivna irina vrpce. Uske pukotine a time i male irine
vrpca, uzrok su boljeg razluivanja instrumenta, a to je poeljno jer se time otkriva vie
spektralnih pojedinosti uzorka. Budui da se snaga snopa koji izlazi iz monohromatora
znatno smanjuje sa suen- jem pukotine, razluivanje monohromatora je openito odreeno
osjetljivou detektora zraenja.
3A-4. Detektori zraenja i pretvornici

Detektor je naprava koja pokazuje postojanje neke fizike pojave. Poznati primjeri detektora
ukljuuju fotografski film za odreivanje prisutnosti elektromagnetskog ili radioaktivnog
zraenja, kazaljku vage za mjerenje razlika masa, te stupac ive u termometru za pokazivanje
temperaturnih promjena. Ljudsko oko
takoer je detektor. Ono pretvara vidljivo zraenje u elektrini signal koji dolazi do mozga
preko lanca neurona u optikom ivcu.
Pretvornik je posebna vrsta detektora koji pretvara signale kao to su svjetlosni intenzitet,
pH, masa, temperatura, u elektrine signale koji se nakon toga mogu pojaavati, prilagoavati
i konano pretvoriti u broj koji oznauje veliinu poetnog signala.
Svojstva pretvornika
Idealan pretvornik elektromagnetskog zraenja ima brz odgovor za niske razine energije
zraenja u
iroku podruju valnih duljina.
Nadalje,
on proizvodi elektrini
signal koji se lako pojaava te ima relativno
nizak um. Konano,
osnovni
je uvjet da signal koji stvara pretvornik bude razmjeran snazi snopa P.
G = KP + K'
15
gdje je G elektrini odgovor detektora u jedninicama struje, otpora ili potencijala. Konstanta
proporcionalnosti K mjeri osjetljivost detektora kao elektrini odgovor po jedinici snage
zraenja. Mnogi detektori pokazuju mali stalan odgovor, poznat kao tamna struja K\ ak i
kad nikakvo zraenje ne dopire do njihove povrine. Instrumenti iji detektori pokazuju vei
odgovor tamne struje uglavnom su opskrbljeni dodatnim kompenzacijskim krugom koji
omoguuje oduzimanje signala razmjernoga tamnoj struji da bi se K' smanjila na nulu. Dakle,
pod uobiajenim okolnostima moe se pisati
G = KP
16
26
dr. Sejit Bobar
Vrste pretvornika
Kao to je prikazano tablicom 4., postoje dvije osnovne vrste pretvornika, oni koji daju
odgovor na fotone i drugi koji reagiraju na promjenu topline.
Svi fotonski detektori temelje se na meudjelovanju zraenja s reaktivnom povrinom, pri

emu ili nastaju elektroni (fotoemisija) ili oni prelaze u energijska stanja u kojima mogu
voditi elektricitet (fotovodljivost). Samo ultraljubiasto, vidljivo i blisko infracrveno zraenje
imaju dovoljnu energiju za poticanje tih procesa.
Openito, infracrveno se zraenje detektira mjerenjem povienja temperature zacmjenog
materijala smjetenoga na putu snopa zraenja. Budui da su temperaturne promjene koje su
rezultat apsorpcije infracrvene energije vrlo male, potreban je strogi nadzor okolne
temperature ako se ele izbjei velike pogreke. De- tektorski sustav je uglavnom onaj koji
ograniuje osjetljivost i preciznost instrumenata za infracrveno podruje.
Fotonski detektori
U daljem tekstu opisane su etiri najee primjenjivane vrste fotonskih detektora: (1)
fotocijev, (2) fotomultiplikator, (3) silicijska fotodioda i (4) fotonaponski lanak.
Fotocijev. Fotocijev se sastoji od polucilindrine katode i od anode u obliku ice, zataljenih u
evakuiranom propusnom omotau (Sl. 15). Konkavna povrina katode premazana je slojem
fotoosjetljiva materijala kao to su alkalijski metali ili metalni oksidi koji ozraivanjem
emitiraju elektrone. Kada je potencijal primjenjen na elektrode, emitirani fotoelektroni
prelaze na anodu stvarajui struju koja se odmah pojaava te prikazuje ili snima.
Broj elektrona izbaen iz fotoemisivne katode razmjeran je snazi zraenja snopa koji pada na
povrinu. S primijenjenim potencijalom od priblino 90 V svi ti elektroni dolaze na anodu,
pri emu nataje struja razmjerna snazi zraenja. Fotocijevi esto proizvode malu tamnu struju
u odsutnosti zraenja (jedn. 15) koja je rezultat toplinski inducirane emisije elektrona.
27
dr. Sejit Bobar
Slika 15. Strujni krug fotocijevi. Fotostruja iducirana zraenjem uzrokuje pad napona na
otporniku to se pojaava i registrira.
Fotomultiplikatori. Fotomultiplikator (Sl. 16) je po konstrukciji slian upravo opisanoj
fotocijevi, ali je mnogo osjetljiviji. Povrina katode slina je po sastavu onoj iz fotocijevi, pri
emu se elektroni emitiraju kad je izloena zraenju. Emitirani se elektroni ubrzavaju prema
dinodi (oznaka 1 na slici 16b) potencijal koje je za 90 V pozitivniji od onoga katode. Udarom
na povrinu dinode svaki ubrzani fotoelektron proizvodi nekoliko dodatnih elektrona koji se
akceleriraju prema drugoj dinodi, a koja je za 90 V pozitivnija od prve. Tu se opet elektroni
umnoavaju. Nakon zavrenog procesa koji se ponavlja na svakoj od preostalih dinoda, svaki
je foton proizveo 106 - 107 elektrona, koji se konano skupljaju na anodi. Nastala se struja
dalje elektronski pojaava i mjeri.
Silicijske fotodiode. Kristalian silicij je poluvodi, to znai tvar elektrina vodljivost koje
je manja od vodljivosti metala, ali vea od one elektrinih izolatora. Silicij je element etvrte
skupine, te prema tome ima etiri valentna elektrona. U kristalu silicija je svaki od tih
elektrona u sprezi s elektronima etiriju drugih silicij evih atoma, ime nastaju etiri
kovalentne veze. Pri sobnoj temperaturi stvara se dovoljno toplinsko pobuivanje u toj
strukturi da se iz vezanog stanja oslobodi neki od elektrona koji tada ima mogunost kretanja
kroz kristal. Toplinska eksci-tacija elektrona za sobom ostavlja pozitivno nabijeno podruje
nazvano rupom,
28
dr. Sejit Bobar
Slika 16. Fotomultiplikator: (a) presjek; (b) elektrini krug

21A-5. Spremnici za uzorke
Spremnici za uzorke, esto nazivani elijama ili kivetama, moraju imati prozore nainjene od
materijala prozirnoga u odreenom spektralnom podruju. Tako se (slika 9) kvarc
upotrebljava za rad u ultraljubiastom podruju (ispod 350 nm), a moe se primijeniti preko
vidljivoga sve do 3 000 nm u infracrvenom podruju. Silikatno staklo se zbog niih cijena
uglavnom primjenjuje u podruju izmeu 375 i 2 000 nm. Plastine posudice se takoer
mogu primijeniti u vidljivu dijelu spektra. Najei materijal za prozore u infracrvenom
dijelu spektra jest kristalini natrijev klorid.
Najbolje su kivete prozori kojih su okomiti na smjer snopa, ime se smanjuju gubitci zbog
refleksije. Najea debljina kiveta za rad u ultraljubiastom i vidljivu podruju iznosi 1 cm.
Kalibrirane i meusobno sparene kivete te veliine mogu se nabaviti iz vie komercijalnih
izvora. Na tritu postoje kivete i drugih debljina sloja, od 0,1 do 10 cm. Postoje i propusne
razmaknice za skraivanje debljine sloja posudice od 1 na 0,1 cm. Slika 17. prikazuje
nekoliko tipinih kiveta.
29
dr. Sejit Bobar
Slika 17. Tipino trino dostupne kivete

Cilindrine se kivete katkad primjenjuju zbog ekonomskih razloga. Pritom treba posebice
paziti da se takve posudice uvijek stavljaju u isti poloaj u odnosu prema snopu. U suprotnom
bi se mogle pojaviti velike pogreke zbog promjene debljine sloja i refleksijskih gubitaka na
zakrivljenim povrinama.
Kakvoa spektroskopskih podataka vrlo je ovisna o nainu upotrebe i odravanja sparenih
kiveta. Otisci prstiju, masnoa i druge vrste taloga bitno mijenjaju transmisijske znaajke
kiveta. Nuno je ienje kiveta prije i poslije upotrebe, a treba izbjegavati i dodirivanje
prozora nakon zavrenog ienja. Sparene se kivete nikad ne smiju suiti zagrijavanjem u
pei ili iznad plamena, jer takav postupak moe biti uzrok ili fizikog oteenja ili promjene u
debljini sloja. Sparene se kivete redovito moraju meusobno usporeivti (badariti) pomou
neke otopine koja apsorbira.
3B. SPEKTROSKOPSKI INSTRUMENTI

Sastavni dijelovi prikazani u prethodnim odjeljcima mogu biti sklopljeni na razliite naine,
te time nastaje niz razliito konstruiranih instrumenata za spektroskopska mjerenja. Te se
konstrukcije mogu razlikovati od vrlo jednostavnih do vrlo profinjenih. I cijene su im vrlo
razliite; neki se mogu nabaviti za par stotina dolara, dok drugi kotaju desetke tisua dolara.
Nijedan od instrumenata nije sam po sebi najbolji za sve svrhe. Izbor instrumenata odreenje
vrstom posla i ekono- minou primjene.
3B-1. Tipovi spektroskopskih instrumenata

Spektroskop je ureaj za identifikaciju elemenata u uzorku koji je ekscitiran u plamenu ili
nekoj drugoj vruoj sredini. Sadri modificirani monokromator (slika 13b) u kojemu je
arina ravnina s izlaznom pukotinom zamijenjena pokretnom leom koja omoguuje
vizualnu detekciju emisijskih linija. Valna duljina linije odreuje se pomou kuta izmeu
upadnog snopa i puta linije do lee.
Definicija kolorimetra kae daje to instrument za apsorpcijska mjerenja koji koristi ljudsko
oko kao detektor. Za svaku upotrebu instrumenta potrebni su standardi za usporeivanje.
30
dr. Sejit Bobar
Fotometar je jednostavan instrument koji se moe primijeniti za apsorpcijska, emisijska ili

fluorescencijska mjerenja s ultraljubiastim, vidljivim ili infracrve- nim zraenjem. Fotometri
se razlikuju prema ugraenim apsorpcijskim ili interferencijskim filtrima za izabiranje valnih
duljina te fotoelektrinoj napravi za mjerenje snage zraenja. Instrumenti koji se primjenjuju
za apsorpcijska mjerenja s vidljivim zraenjem pokatkad se nazivaju fotoelektirnim
kolorimetrima ili samo kolorimetrima. Primjena ovoga posljednjega naziva moe prouzroiti
nesporazum. Fotometar koji se primjenjuje iskljuivo za fluorescencijska mjerenja esto se
naziva fluorimetrom.
Spektrograf snima spektre na fotografsku plou ili na film smjeten uzdu a- rine ravnine
monokromatora. Tako se monohromator prikazan na slici 21-8. moe pretvoriti u spektrograf
zamjenom arine ravnine AB ploom ili draem filma. Spektri se tada pojavljuju kao niz
crnih slika ulazne pukotine. Spektrografi se ponajprije primjenjuju za kvalitativnu analizu
elemenata.
Spektrometar je monohromator s pukotinom uvrenom u arinoj ravnini. Dva
monohromatora na slici 13. primjeri su spektrometara. Spektrometar s fotopretvornikom zove
se spektrofotometar. Ti se instrumenti mogu primjenjivati za apsorpcijska, emisijska i
esto
se
nazivaju
fluorescencijska
mjerenja.
Fluorescencijski
spektrometri
spektrofluorimetrima.
3B-2. Graa instrumenta
U ovom e se odjeljku opisati etiri osnovne vrste spektroskopskih instrumenata: (1)
jednosnopni, (2) dvosnopni - prostorno odijeljenih snopova, (3) dvosnopni - vremenski
odijeljenih snopova i (4) viekanalni instrumenti.
Jednosnopni instrumenti
Slika 18a, shematski je prikaz instrumenta s jednim snopom zraenja primjenjivim za
apsorpcijska mjerenja. Sastoji se od jednoga od izvora zraenja navedenih u tablici 2., zatim
od filtra ili monokromatora za odabir valnih duljina (tabl. 3), sparenih kiveta koje se
naizmjence mogu umetnuti u snop, jednoga od detektora navedenih u tablici 4., te pojaala i
ureaja za oitavanje.
31
dr. Sejit Bobar
Slika 18. Mjerenje transmitancije instrumentom s jednom zrakom svjetlosti zahtijeva

tri osnovna koraka:
(1) namjetanje (ugaanje) 0% T.
(2) namjetanje (ugaanje)100% T i
(3) odreivanje % T uzorka.
Ugaanje 0% T izvodi se pomou zaslona postavljenoga izmeu izvora i fotodetektora.
Mjerilo se ugaa mehaniki ili elektriki dok se ne postigne vrijednost 0. Drugi se korak
izvodi umetanjem otapala na put svjetlosti, otvaranjem zaslona i mijenjanjem intenziteta
zraenja, ili pojaanjem elektrinog signala s detektora do postizanja vrijednosti 100 (100
%T).
Intenzitet snopa moe se mijenjati na nekoliko naina, ukljuujui namjetanje elektrine
snage na izvoru. Osim toga, snop se moe priguiti pomou dijafragme, optikoga klina ili
optikog elja koji fiziki zaustavlja dio zraenja (uklonjena koliina se moe mijenjati). U
treem se koraku posudica s otapalom zamjenjuje onom koja sadri uzorak, a postotna
transmitancija se oita s ljestvice.
32
dr. Sejit Bobar
Budui da je pretvoreni signal s fotodetektora linearan u odnosu prema snazi zraenja koje na
njega pada, oitanje na ljestvici za uzorak u putu svjetlosti zapravo je postotna transmitancija
(tj. postotak pune ljestvice).
Jednosnopan instrument zahtijeva stabilno napajanje naponom da bi se izbjegle pogreke
nastale promjenama intenziteta snopa za vrijeme ugaanja 100% T i mjerenja % T uzorka.
Velike su razlike meu jednosnopnim ureajima u sloenosti i radnim znaajkama.
Najjednostavniji i najjeftiniji sastoji se od volframove arulje prikljuene na bateriju, niza
staklenih filtara za odabir valnih duljina, epruveta kao mjernih posudica, fotoelije kao
detektora i malog mikroampermetra kao ureaja za oitavanje. S druge strane, postoje
sloeni, kompjutorski upravljani instrumenti koji pokrivaju podruje od 200 do 1000 nm, ili
ak ire. Ti instrumenti imaju meusobno izmjenljive volframove i deuterijeve lampe kao
izvore, primjenjuju pravokutne silikatne kivete, a opremljeni su reetkom s visokim
razluivanjem i varijabilnom pukotinom. Kao detektori slue fotomultiplikatori, a izlazni
podatak esto je digitaliziran i pohranjen te se moe ispisati u nekoliko oblika.
Dvosnopni instrumenti
Mnogi suvremeni fotometri i spektrofotometri temelje se na radu s dva snopa zraenja. Slika
18b. prikazuje instrument u kojemu dva snopa nastaju u prostoru pomou zrcala u obliku
slova V, koje se naziva djeliteljem snopa. Jedan snop prolazi kroz referentnu otopinu prema
fotodetektora, a dragi istodobno prolazi kroz uzorak prema dragom, sparenom fotodetektora.
Dva se izlazna signala pojaavaju, a njihov omjer, ili logaritam njihovih omjera, odreuje se
elektroniki i pokazuje na ureaju za oitavanje. Kod runih instrumenata mjerenje zahtijeva
dva koraka, najprije namjetanje nule pomou zaslona izmeu selektora i djelitelja snopa, a
zatim se uz otvoreni zaslon izravno s mjerila oita transmitancija ili apsorbancija uzorka.
Druga vrsta instrumenta s dvije zrake svjetlosti prikazana je slikom 18c. Tu su snopovi
odijeljeni u vremenu pomou rotirajuega sektorskog zrcala koji usmjeruje cijeli snop
najprije od monokromatora kroz referentnu otopinu, a zatim kroz uzorak. Takvi pulsevi
zraenja kombiniraju se s drugim sektorskim zrcalom koje proputa jedan, a reflektira drugi
impuls zraenja prema detektoru. Kao to je prikazano dijelom oznaenime "pogled sprijeda"
na slici 18c., sektorsko zrcalo koje pokree motor nainjeno je od segmenata u obliku krike
torte, od kojih je polovica zrcalna, a polovica prozirna. Zrcalni dijelovi povezani su zacrnjenim metalnim okvirima koji periodiki prekidaju snop, ime sprjeavaju njegov dolazak
na detektor. Detektorski je krug programiran da za to vrijeme izvede ugaanje tamne struje.
Instrument prikazan slikom 18c. jest instrument "nul-tipa", u kojemu se snop koji prolazi kroz
otapalo priguuje dok se njegov intenzitet tono ne poklopi s intenzitetom snopa koji prolazi
uzorkom. Priguenje se ovdje postie pomou optikoga klina propusnost kojega se linearno
smanjuje s njegovom duljinom.
Dakle, nul-toka se postie pomicanjem klina u snop dok dva elektrina impulsa ne postanu
identina, to se pokazuje nulom na detektoru. Transmitancija ili apsorbancija se tada
izravno oita pomou kazaljke spojene s klinom.
33
dr. Sejit Bobar
Dvosnopni instrumenti pokazuju prednost utoliko to oni kompenziraju sve osim

kratkotrajnih fluktuacija ulaznog zraenja i klizanja u detektoru i pojaalu. Nadalje,
postojanje dvostrukog snopa omoguuje neprekidno snimanje transmi- tancijskih ili
apsorbancijskih spektara. Kao posljedica toga veina suvremenih instrumenata za snimanje u
ultraljubiastom i vidljivom dijelu spektra su s dvostrukim snopom, najee odijeljenim u
vremenu. Na tom se naelu temelji i veina spektrofotometara za infracrveno podruje
spektra.
Viekanalni instrumenti
U posljednjih desetak godina proizvodi se mnogo viekanalnih spektrofotometara. Slika 19.
pojednostavnjen je shematski prikaz optikog nacrta za vrstu viekanalnog spektrometra koji
se naziva spektrometrom s diodnim nizom. Zraenje volframove ili deuterijske lampe
fokusirano je kroz posudicu koja sadri uzorak ili otapalo, nakon ega prolazi
monokromatorom s fiksnom reetkom. Disper- girano zraenje pada na detektor s diodnim
nizom koji se, kao to je prije spomenuto, sastoji od nekoliko stotina linearno poredanih
fotodioda po duljini silicij- skog ipa. Cipovi su uglavnom duljine 1-6 cm, a irina
pojedinanih dioda je 15 - 50 pm. Svaki ip takoer sadri kondenzator i elektini prekida za
svaku diodu. Kompjutorski se sekvencijalno zatvara svaki prekida, stoje uzrok daje svaki
kondenzator nabijen do -5 V. Zraenje koje pada na povrinu bilo koje diode uzrokuje
djelomino izbijanje pripadnoga kondenzatora. Taj se izgubljeni napon nadomjeta tijekom
sljedeeg ciklusa ukljuivanja. Rezultantne struje, koje su razmjerne snazi zraenja,
pojaavaju se, digitaliziraju i spremaju u kompjutorsku memoriju. Cijeli je ciklus zavren za
nekoliko milisekunda.
irina pukotine monokromatora instrumenta s diodnim nizom najee je jednaka irini jedne
od silicij skih dioda. Dakle, izlazni signal svake od dioda odgovara zraenju razliite valne
duljine, a spektar se dobiva sekvencijalnim snimanjem tih izlaznih signala. Budui daje
elektroniki proces snimanja izvanredno brz, podatci cijelog spektra sakupe se za jednu
sekundu ili ak manje.
Slika 19. Prikaz viekanalnog spektrofotometra koji se temelji na primjeni reetke i

fotodiodnog detektora
34
dr. Sejit Bobar
4 MOLEKULSKA APSORPCIJSKA SPEKTROSKOPIJA

Molekulska spektroskopija temeljena na ultraljubiastom, vidljivom i infracrvenom zraenju,
iroko se primjenjuje za identifikaciju i odreivanje bezbrojnih anorganskih i organskih vrsta.
Primjerice, infracrvena apsorpcijska spektroskopija jedna je od najsnanijih raspoloivih
tehnika u hemiji za odreivanje strukture anorganskih i organskih spojeva. Nadalje, sada se
predvia njezina vana uloga u kvantitativnoj analizi, posebice za odreivanje zagaivaa
(polutanata) u okoliu.
Molekulska ultraljubiasta i vidljiva apsorpcijska spektroskopija primjenjuje se ponajprije za
kvantitativnu analizu. To je vjerojatno ee primjenjivana metoda u hemijskim i klinikim
laboratorijima svijeta od bilo kojeg drugog pojedinanog postupka.
Molekulske fluorescencijske metode, iako manje primjenjive od apsorpcijskih metoda,
prilino su vane zbog visoke selektivnosti i izuzetne osjetljivosti. Te su se metode pokazale
osobito upotrebljivima u kvantitativnoj analizi bioloki i biohemijski zanimljivih molekula.
4A. ULTRALJUBIASTA I VIDLJIVA APSORPCIJSKA SPEKTROSKOPIJA
U ovom e se dijelu razmatrati molekulske vrste koje apsorbiraju ultraljubiasto ili vidljivo
zraenje, te se stoga mogu odreivati apsorpcijskom spektroskopijom.
2A-1. Vrste koje apsorbiraju

Kao to je spomenuto, apsorpcija ultraljubiastog i vidljiva zraenja openito se pokazuje u
obliku jedne elektronske apsorpcijske vrpce ili vie, od kojih je svaka graena od velikog
broja blizu smjetenih, ali odvojenih linija. Svaka linija rezultat je prijelaza elektrona iz
osnovnog u jedno od mnogih vibracijskih i rotacijskih energijskih stanja povezanih sa svakim
pobuenim elektronskim energijskim stanjem. Zbog mnogo postojeih vibracijskih i
rotacijskih energijskih stanja te neznatnih meusobnih razlika njihovih energija, broj linija
koje obuhvaa tipina vrpca vrlo je velik, a njihov meusoban razmak minimalan.
Slika 20-a., koja je dio vidljiva apsorpcijskog spektra 1,2,4,5-tetrazinskih para, prikazuje finu
strukturu koja je rezultat mnogih rotacijskih i vibracijskih razina povezanih s pobuenim
elektronskim stanjem ove aromatske molekule. U plinovitu su stanju pojedinane tetrazinske
molekule dovoljno meusobno odvojene, te mogu slobodno vibrirati i rotirati. Oevidno je
postojanje mnogih pojedinanih apsorpcijskih linija koje su rezultat mnotva vibracijskorotacijskih energijskih stanja. Meutim, u kondenziranom stanju ili u otopini bitno se smanjuje sloboda rotiranja, te nestaju linije nastale zbog razlike rotacijskih energijskih razina.
Nadalje, u prisutnosti molekula otapala nepravilno se mijenjaju energije razliitih vibracijskih
razina. Dakle, energija danog stanja poprima u molekulskom okruenju Gaussovu raspodjelu,
to uzrokuje irenje linija. Taj je uinak jae naglaen u polarnim otapalima, kao to je voda,
nego u nepolarnoj, primjerice ugljikovodinoj sredini. Utjecaj otapala prikazan je slikama
20b. i 20c.
35
dr. Sejit Bobar
Apsorpcija organskih spojeva

Za apsorpciju ultraljubiastog i vidljiva zraenja u organskim molekulama odgovorne su
dvije vrste elektrona: (1) zajedniki (podijeljeni) elektroni koji izravno sudjeluju u stvaranju
veze, te su stoga podijeljeni vie nego jednom atomu, i (2) nepodijeljeni vanjski elektroni koji
su uglavnom smjeteni oko atoma kao to su kisik, halogeni elementi, sumpor i duik.
Slika 20. Tipini ultraljubiasti apsorpciski spektri. Spoj je 1,2,4,5- tetrazin. Iz S. F.

Mason, J. Chem. Soc. 1959., 1265. S doputenjem
Valne duljine pri kojima organska molekula apsorbira ovise o jakosti kojom su vezani njezini
razliiti elektroni. Primjerice, podijeljeni elektroni u jednostrukim vezama kao to su ugljikugljik ili ugljik-vodik tako su vrsto vezani da njihovo pobuivanje zahtijeva energije koje
odgovaraju valnim duljinama u vakuumskom ultraljubiastom podruju (ispod 180 nm).
Spektri jednostrukih veza nisu iroko iskoriteni u analitike svrhe zbog eksperimentalnih
potekoa pri radu u tom podruju. Potekoe se pripisuju injenici da i kvare i sastavni
dijelovi atmosfere apsorbiraju zraenje ispod 180 nm. Ta okolnost zahtijeva primjenu evakuiranih spektrofotometara s optikom nainjenom od litijeva fluorida.
Organski spojevi s dvostrukim ili trostrukim vezama openito imaju upotrebljive apsorpcijske
maksimume u lako dostupnom ultraljubiastom podruju jer su elektroni u nezasienim
vezama relativno slabo vezani, te se lako pobuuju. Nezasiene organske funkcionalne
skupine koje apsorbiraju u ultraljubiastom i vidljivu podruju nazivaju se hromoforima. U
tablici 5. popisani su uobiajni hromofori i priblini poloaji njihovih apsorpcijskih
maksimuma. Nekoliko primjera spektara prikazano je na margini stranice.
36
dr. Sejit Bobar
Tablica 5.
APSORPCIJSKE ZNAAJKE NEKIH UOBIAJENIH ORGANSKIH KROMOFORA
Organski spojevi koji sadre sumpor, brom i jod takoer apsorbiraju u ultraljubiastom
podruju jer ti elementi imaju slabo vezane nepodijeljene elektrone koji se lake pobuuju od
podijeljenih elektrona u zasienim vezama.
Apsorpcija anorganskih vrsta
Apsorpcijski spektri veine anorganskih kompleksnih iona i molekula nalik su onima
organskih spojeva (Sl. 20b. i 20c, te spektri prikazani na margini stranice), sa irokim
apsorpcijskim maksimumima i vrlo malo fine strukture. Pritom su iznimka spektri iona iz
niza lantanida i aktinida. Elektroni odgovorni za apsorpciju tih elemanata (4f, odnosno 5f)
zasjenjeni su vanjskim utjecajima elektrona koji se nalaze u orbitalama s veim glavnim
kvantnim brojevima. Posljedica tog su uske apsorpcijske vrpce na koje ne utjee priroda vrsta
vezanih pomou vanjskih elektrona.
Ioni i kompleksi 18 elemenata prvih dvaju prijelaznih nizova obojeni su, uz neke iznimke,
barem u jednom, ako ne u svim oksidacijskim stanjima. Apsorpcija vidljiva zraenja tih vrsta
ukljuuje prijelaze elektrona izmeu popunjenih i nepopunjenih f-orbitala koje se razlikuju u
energiji zbog vezivanja liganda na ion metala. Razlike energija izmeu d-orbitala, a time i
poloaj odgovarajuega apsorpcijskog maksimuma, ovise o oksidacijskom stanju elementa,
njegovu poloaju u periodnom sustavu te vrsti liganda vezanog na ion metala.
37
dr. Sejit Bobar
Apsorpcija prijenosa naboja

Apsorpcija prijenosa naboja osobito je vana za kvantitativne svrhe zbog neobino visokih
vrijednosti molarnih apsorptivnosti (emaks > 10 000), to dovodi do velike osjetljivosti
odreivanja. Mnogi anorganski i organski kompleksni spojevi podlijeu takvoj vrsti
apsorpcije, te se stoga nazivaju kompleksima s prijenosom naboja.
Kompleksi s prijenosom naboja sadre skupinu donora elektrona vezanu na akceptor
elektrona. Kada takav produkt apsorbira zraenje, elektron se s donorske skupine premjeta u
orbitalu uglavnom povezanu uz akceptorsku skupinu. Pobueno je stanje tada rezultat neke
vrste unutarnjega oksidacijsko-redukcijskog procesa. To se ponaanje razlikuje od onoga
organskih kromofora u kojima se pobueni elektron nalazi u molekulskoj orbitali podijeljenoj
izmeu dva ili vie atoma.
Najpoznatiji primjeri kompleksa s premjetanjem naboja su fenolni kompleks eljeza(III),
kompleks eljeza(II) sa 1,10-fenentrolinom, kompleks molekulskog joda s jodidnim ionom te
fero-fericijanidni kompleks koji tvori boju Pruskog plavila. Crvena boja kompleksa koji tvori
eljezo(III) s tiocijanatnim ionom daljnji je primjer apsorpcije prijelaza s prijenosom naboja.
Apsorpcijom fotona elektroni prelaze iz tiocijanatnog iona u orbitalu koja je poglavito
povezana s ionom eljeza(III). Produkt je pobuena estica koja sadri uglavnom eljezo(II) i
tiocijanatni radikal SCN. Kao i u drugim vrstama elektronskih pobuivanja, elektron se u
takvu kompleksu najee vraa u svoje poetno stanje nakon vrlo kratka vremena. Pokatkad,
dodue, pobueni kompleks moe disocirati i pritom nastaju fotokemijski oksidacijskoredukcijski produkti.
Kod veine kompleksa s prijenosom naboja koji u sebi imaju ion metala, metal slui kao
akceptor elektrona. Iznimke su kompleksni spoj 1,10-fenantrolina sa eljezom(III) te
bakrom(I), u kojima je ligand akceptor, a metalni ion donor elektrona. Poznato je jo
nekoliko primjera takvih kompleksa.
2A-2. Instrumenti za ultraljubiastu i vidljivu apsorpcijsku spektroskopiju

Fotometri
Prednosti fotometara u apsorpcijskim mjerenjima su niska cijena, jednostavnost, robusnost,
mogunost prenoenja te lakoa odravanja. Nadalje, u analizama u kojima nije vana visoka
spektralna istoa, a to je esto, tanost i preciznost mjerenja fotometrom sline su onima
dobivenima spektrofotometrom. Loe strane fotometara su skuena viestranost,
nemogunost dobivanja cijelog spektra te vee efektivne irine vrpca.
Slika 21. prikazuje jednostavan jednosnopni fotometar, primjenjiv za kvantitativna
odreivanja u vidljivu podruju. Uz takve fotometre najee postoji nekoliko filtara, od
kojih svaki proputa razliito podruje vidljiva spektra. Openito, prikladan filtar je onaj
kojega je boja komplementarna boji otopine uzorka. Tu komplementarnu boju uzorak
apsorbira. Primjerice, otopina je obojena crveno jer proputa crveno podruje spektra, a
apsorbira zeleno. Intenzitet zelenog zraenja mijenja se s koncentracijom uzorka, te se mora
38
dr. Sejit Bobar
primijeniti zeleni filtar. Ako postoji nekoliko filtara iste osnovne boje, potrebno je upotrijebiti
onaj koji za otopinu analita daje najveu apsorbanciju, odnosno najmanju transmitanciju.
Fotometri za ultraljubiasto podruje postali su vani detektori u visokodjelot- vornoj
tekuinskoj kromatografiji. U tu svrhu kao izvor slui arulja sa ivinim parama, a emisijska
linija pri 254 ili pri 280 nm izolira se pomou interferencijskog filtra.
Slika 21. Jednosnopni fotometar za apsorpcijska mjerenja u vidljivu podruju

Spektrofotometri
Razliiti proizvoai instrumenata nude na tritu nekoliko desetaka razliitih modela
spektrofotometara za ultraljubiasto i vidljivo podruje zraenja.
Instrumenti za vidljivo podruje zraenja. Spektrofotometri za vidljivo podruje zraenja
openito su instrumenti s jednim snopom zraenja i reetkom, relativno su niskih cijena,
robustni i lako prenosivi. Postoje instrumenti na baterijski pogon, koji su tako maleni da se
mogu drati u ruci. Oni se najee primjenjuju za kvantitativnu analizu pri jednoj valnoj
duljini, iako se s nekima od njih mogu poluiti iznenaujue dobri apsorpcijski spektri, a to
omoguuje njihovu primjenjivost i u kvalitativnoj analizi.
Instrument shematski prikazan slikom 22. jednostavan je spektrofotometar Spectronic 20. Taj
se model prvi put pojavio na tritu sredinom pedesetih godina, a njegova se izmijenjena
verzija jo proizvodi i dobro prodaje. Bez ikakve sumnje, vie je tih instrumenata trenutno u
upotrebi u svijetu od bilo kojeg drugog pojedinanog modela spektrofotometra.
39
dr. Sejit Bobar
Slika 22. Spektrofotometar Spectronic 20.

Spectronic 20 se koristi izvorom svjetlosti s volframovom niti uz stabilizirano napajanje
elektrinom energijom, ime nastaje zraenje stalnog intenziteta. Nakon difrakcije na
jednostavnoj refleksijskoj reetki zraenje prolazi kroz kivetu s uzorkom ili onu s
referentnom otopinom, te pada na fotocijev. Pojaan elektrini signal iz detektora pokree
mjerilo, ljestvica kojega je veliine 15 cm badarena linearno za transmitanciju, a
logaritamski za apsorbanciju.
Spectronic 20 opremljen je zatvaraem koji izgleda kao vjetrenica, a automatski zatvara
prostor izmeu snopa i detektora im se kiveta ukloni iz njezina draa. Ureaj za nadzor
svjetlosti, smjeten izmeu reetke i zatvaraa, je otvor u obliku slova V koji se pomie u
snop ili iz njega, ime se nadzire intenzitet snopa koji pada na fotocijev.
U Spectronic 20 badarenje 0% Tnapravi se uz prazan odjeljak za uzorke, pri emu zatvara
sprjeava pristup zraenja detektoru. Ugaanje 100% T ukljuuje stavljanje kivete sa slijepim
uzorkom u odjeljak za uzorke i namjetanje ureaja za nadzor svjetlosti. Konano, u odjeljak
za uzorke stavi se uzorak, a postotna transmitancija, ili pak apsorbancija, izravno se oita s
ljestvice mjerila.
Spektralno podruje instrumenta Spectronic 20 protee se od 340 do 625 nm; dodatna
fotocijev moe proiriti mjerno podruje do 950 nm. Ostale znaajke instrumenta su irina
vrpce od 20 nm i tonost valne duljine od 2,5 nm.
40
dr. Sejit Bobar
Jednosnopni instrumenti, kao to je Spectronic 20, dobro su prilagoeni za kvantitativna

apsorpcijska mjerenja pri jednoj valnoj duljini. Jednostavnost instrumentacije, niska cijena i
lakoa odravanja pruaju znatne prednosti.
Nekoliko proizvoaa instrumenata nudi jednosnopne instrumente za rad u ultraljubiastom i
u vidljivu podruju spektra. Najnie valne duljine su tada izmeu 190 i 210 nm, a najvie
podruje je od 800 do 1 000 nm. Svi su opremljeni volframovom aruljom i deuterijskom (ili
vodikovom) lampom. Veina ima fotomulti- plikatore kao detektore, a reetke za disperziju
zraenja. Mnogi su opremljeni digitalnim ureajem za oitanje, a neki velikim mjerilima.
Spektrofotometri za ultraljubiasto i vidljivo podruje s pisaem. Slika 23., prikazuje
optiki sustav tipinog spektrofotometra s dva snopa zraenja podijeljena u vremenu, koji je
predvien za rad od priblino 190 nm do 750 nm. Instrument se sastoji od deuterijskog i
volframovog izvora zraenja, koje je mogue odabirati prema potrebi, zatim od refleksijske
reetke kao monokromatora te fotomultipli- katora kao detektora. Sjeckalo snopa je
cirkulama ploica ("chopper") pokretana motorom, koja je podijeljena u tri dijela, od kojih je
jedan proziran drugi reflek- sijski, a trei nepropustan. Svakim obrtajem ploice detektor
dobiva tri signala, od kojih prvi odgovara P0, drugi, P, a trei tamnoj struji. Konaan
elektrini signal tada se podvrgava elektronikom procesu, da bi se na ureaju za oitavanje
dobio podatak o transmitanciji ili o apsorbanciji.
Takva vrsta instrumenta najee je opskrbljena reetkom koju pokree motor usklaen s
radom pokretaa papira u pisau, ime je omogueno automatsko snimanje cijelog spektra.
Slika 23. Dvosnopni spekrofotometar s pisaem za ultraljubiasto i vidljivo podruje;

serije Perkin Elmer.
41
dr. Sejit Bobar
4A-3. Primjena ultraljubiaste spektrofotometrije u kvalitativnoj analizi

Spektrofotometrijska mjerenja s ultraljubiastim zraenjem primjenjiva su za otkrivanje
kromofornih skupina (tabl. 5). Veliki dio ak vrlo sloenih organskih molekula proziran je za
zraenje valnih duljina veih od 180 nm, te je pojavljivanje jednoga ili vie maksimuma
izmeu 200 i 400 nm jasni pokazatelj prisutnosti nezasienih skupina, ili pak atoma kao to
su sumpor ili halogen. Priblina slika identiteta skupine koja apsorbira moe se esto dobiti
usporedbom spektra uzorka s onime jednostavnih molekula koje sadre razliite kromoforne
skupine.
Tabela 6. Otapala za ultraljubiasto i vidljivo podruje

Meutim, ultraljubiasti spektri najee ne sadre dovoljno finu strukturu za nedvojbeno
dokazivanje analita. Stoga se kvalitativni podaci iz ultraljubiastih spektara moraju
primjenjivati u sprezi s drugim fizikim i kemijskim dokazima kao to su infracrveni spektri,
podaci nuklearne magnetne rezonancije i spektara masa kao i podaci o topljivosti, talitu i
vrelitu.
Otapala
Za kvalitativnu se analizu najee upotrebljavaju ultraljubiasti spektri razrijeenih otopina
uzorka. Meutim, za hlapljive se spojeve dobivaju mnogo upotrebljiviji spektri ako se uzorak
ispituje u gasovitom stanju (primjerice, usporedite slike 8a. i 8b). Takvi se spektri gasovite
faze esto mogu dobiti postizanjem ravnotee nekoliko kapi istog spoja s atmosferom u
zaepljenoj kiveti.
Otapalo za ultraljubiastu i vidljivu spektroskopiju mora biti prozirno u cijelom tom podruju
te mora otapati dovoljnu koliinu uzorka da bi se dobili dobro definirani maksimumi.
Nadalje, treba razmotriti mogua meudjelovanja s vrstama koje apsorbiraju. Primjerice,
polama otapala kao to su voda, alkoholi, esteri i ketoni mogu promijeniti vibracijske spektre,
te ih je potrebno izbjegavati kada se ele analizirati spektralne pojedinosti. Nepolama otapala,
kao cikloheksan, esto daju spektre sline onima gasovitet faze (usporedite tri spektra na slici
8). Osim toga, polarnost otapala esto utjee na poloaj apsorpcijskog maksimuma. Stoga se
za usporedbu spektara u svhu identifikacije moraju upotrebljavati ista otapala.
U Tabici 6., popisano je nekoliko uobiajenih otapala za prouavanja u ultraljubiastom i
vidljivu podruju, a navedene su i pribline vrijednosti graninih najniih primjenjivih valnih
duljina. Te su granine vrijednosti pod velikim utjecajem istoe otapala. Primjerice, etanol i
ugljikovodina otapala esto su oneiena benzenom koji apsorbira ispod 280 nm4.
42
dr. Sejit Bobar
Utjecaj rasprenog zraenja na krajnje valne duljine spektrofotometra

Prethodno je pokazano da raspreno zraenje moe prouzroiti instrumentna odstupanja od
Beerova zakona. Drugi neeljeni uinak te vrste zraenja povremena je pojava lanih
maksimuma pri krajnjim valnim duljinama spektrofotometra. Krivulja B istinski je spektar
otopine cerija(IV) dobiven pomou spektrofotometra istraivake kakvoe, koji ima
mogunost snimanja kvalitetnih spektara do 200 nm ili ak nie. Krivulja A dobivena je za
istu otopinu pomou instrumenta nie cijene, opskrbljenoga volframovim izvorom prikladnim
za rad samo u vidljivu podruju zraenja. Lani maksimum pri 360 nm izravno se pripisuje
rasprenom zraenju koje nije apsorbirano jer je sastavljeno od valnih duljina veih od 400
nm. Najee takvo raspreno zraenje ima zanemariv uinak jer je njegova snaga samo
malen dio ukupne snage snopa koji izlazi iz monokromatora. Meutim, pri valnim duljinama
manjima od 380 nm zraenje iz monokromatora vrlo je prigueno zbog apsorpcije u
staklenim optikim komponentama i kivetama. Nadalje, i izlazni signal izvora i osjetljivost
fotolanka znatno se smanjuju ispod 380 nm. Kombinacija svih tih imbenika uzrok je
pripadanja bitnog udjela mjerene apsorbancije rasprenom zraenju, u podruju valnih duljina
u kojemu je otopina cerija(IV) prozirna. Time nastaje lani maksimum.
Isti se uinak pokatkad pojavljuje kada se pomou instrumenata za ultraljubiasto i vidljivo
podruje pokuavaju mjeriti apsorbancije pri valnim duljinama manjima od priblino 190 nm.
4A-4. Kvantitativna analitika

fotometrije i spektrofotometije
primjena
ultraljubiaste
vidljive
Apsorpcijska spektroskopija koja se temelji na ultraljubiastom i vidljivu zraenju jedna je od

najupotrebljivijih metoda u kvantitativnoj analitikoj kemiji5.
Vane znaajke fotometrijskih i spektrofotometrijskih metoda su:
1. iroka primjenjivost. Ogroman broj anorganskih, organskih i biokemijskih vrsta apsorbira
ili ultraljubiasto ili vidljivo zraenje, te su time prikladne za izravno kvantitativno
odreivanje. Mnoge vrste koje ne apsorbiraju, takoer se mogu odreivati nakon kemijske
reakcije kojom se prevode u derivate koji apsorbiraju. Procijenjeno je da se vie od 90%
analiza koje se izvode u klinikim laboratorijima temelje na apsorpcijskoj spektroskopiji
ultraljubiastog i vidljiva zraenja.
4B. INFRACRVENA APSORPCIJSKA SPEKTROSKOPIJA
Infracrvena spektrofotometrija jedna je od najsnanijih metoda koje hemiaru stoje na
raspolaganju za identifikaciju istih organskih i anorganskih spojeva, jer osim nekoliko
homonuklearnih molekula kao to su O2, N2 i Cl2, sve molekulske vrste apsorbiraju
infracrveno zraenje. Nadalje, osim kiralnih molekula u kristalinom stanju, svaka
molekulska vrsta ima jedinstven infracrveni apsorpcijski spektar. Stoga se uzorak nedvojbeno
moe identificirati ako se njegov spektar tono slae sa spektrom spoja poznate strukture.
Infracrvena spektroskopija manje je zadovoljavajua za kvantitativnu analizu od
spektroskopije u ultraljubiastom i vidljivu podruju jer uski maksimumi koji su tipini za
infracrvenu apsorpciju obino najee uzrokuju odstupanja od Bee- rova zakona. Nadalje,
43
dr. Sejit Bobar
mjerenja apsorbancije u infracrvenom spektru mnogo su manje precizna. Unato tome, onda
kada je dovoljna umjerena preciznost, jedinstvena priroda infracrvenih spektara pridonosi
stupnju selektivnosti u kvantitativnim odreivanjima, ime se smanjuje uinak neeljenih
znaajki.16
4B-1. Infracrveni apsorpcijski spektri

U infracrvenom se podruju pojavljuju vibracijske apsorpcije jer je u tom podruju energija
zraenja nedostatna za pobuivanje elektronskih prijelaza. Infracrveni spektri pojavljuju se
kao uski, blizu smjeteni apsorpcijski maksimumi (Sl. 25) kao rezultat prijelaza meu
razliitim vibracijskim kvantnim stupnjevima. Razlike u rotacijskim stupnjevima mogu
takoer biti uzrok nizu maksimuma za svako vibracijsko stanje. Meutim, u krutim i tekuim
uzorcima rotacije su esto ili ometane ili sprijeene, te se uinci takvih malih energijskih
razlika ne mogu opaziti. Stoga se tipian infracrveni spektar tekuine (Sl. 25) sastoji od niza
vibracijskih maksimuma.
Broj naina na koje molekula moe vibrirati povezan je s brojem atoma, a time i s brojem
veza koje ona sadri. ak je i u jednostavnim molekulama broj moguih vibracija velik.
Primjerice, n-butanal (CH3CH2CH2CHO) ima 33 vibracijska naina, od kojih se veina
meusobno razlikuje u energiji. Sve te vibracije ne uzrokuju infracrvene maksimume. Unato
tome, spektrar n-butanala relativno je sloen (Sl. 25).
Slika 25.
Apsorpcija infracrvenog zraenja ne zbiva se samo u organskim molekulama, nego i u
kovalentno vezanim metalnim kompleksima koji su openito aktivni u infracrvenom podruju
duih valnih duljina. Stoga su infracrvena spektrofotometrijska prouavanja dala mnogo
korisnih podataka o kompleksima metalnih iona.
4B-2. Instrumenti za infracrvenu spektroskopiju

U suvremenim laboratorijima postoje tri osnovna tipa instrumenata za infracrvenu
spektroskopiju: disperzni spektrometri (ili spektrofotometri), spektrofotometri s Fourierovom
transformacijom (FTIR) te fotometri s filtrima. Prve se dvije vrste upotrebljavaju za
44
dr. Sejit Bobar
dobivanje potpunih spektara za kvalitativnu identifikaciju, a fotometri s filtrima namijenjeni

su kvantitativnom radu. Instrumenti s Fourierovom transformacijom i oni s filtrima su
nedisperzni u smislu nepostojanja prizme ili reetke koja bi dispergirala zraenje u
pojedinane valne duljine.
Disperzni instrumenti
Disperzni instrumenti za infracrveno podruje zraenja openito su, uz jednu razliku, slini
dvosnopnim instrumentima, snopovi zraenja kojih su podijeljeni u vremenu. Spomenuta je
razlika u smjetaju odjeljka za uzorke u odnosu prema monohromatoru. U instrumentima za
ultraljubiasto i vidljivo podruje uzorci su uvijek smjeteni izmeu monohromatora i
detektora da bi se izbjeglo fotohemijsko razgraivanje koje se moe pojaviti pri izlaganju
punoj snazi ultraljubiasta ili vidljiva izvora zraenja. Nasuprot tome, infracrveno zraenje
nema energiju dovoljnu za fotorazgradnju. Stoga se uzorak smjeta izmeu izvora i
monokromatora. Takav raspored ima prednost jer se sve raspreno zraenje koje nastaje u
odjeljku za uzorke ukloni monokromatorom.
Komponente ureaja za infracrveno podruje, u pojedinostima se bitno razlikuju od onih za
ultraljubiasto i vidljivo podruje. Izvori za infracrveno zraenje su zagrijane krutine, a ne
deuterijska ili volframova arulja. Reetke su mnogo grublje izradbe od onih za
ultraljubiasto i vidljivo zraenje. Detektori odgovaraju na toplinu, a ne na fotone.
Nadalje,optike komponente insturmenata za infracrveno podruje nainjene su od izgAenih krutina, kao stoje natrijev klorid ili kalijev bromid.
Spektrofotometri s Fourierovom transformacijom
Prednosti spektrofotometara s Fourierovom transformacijom za infracrveno podruje oituju
se u neobino velikoj osjetljivosti, razluivanju te brzini skupljanja podataka (podaci cijelog
spektra mogu se dobiti za 1 sekundu ili manje). Nasuprot tim prednostima su sloenost
instrumenta i njegova visoka cijena, koja je takva djelomice zbog potrebe postojanja vrlo
sofisticiranog raunala za raspoznavanje izlaznih podataka.
Instrumenti s Fourierovom transformacijom ne sadre disperzni element, te se sve valne
duljine detektiraju i mjere simultano. U svrhu odvajanja valnih duljina, potrebno je signal
izvora modulirati tako da gaje mogue odgonetnuti Fourierovom transformacijom matematikom operacijom koja zahtijeva raunalo velike brzine. Teorija mjerenja prema
Fourierovoj transformaicji izvan je programa ove knjige17.
Fotometri s filtrima
U novije se vrijeme upotrebljavaju infracrveni fotometri predvieni za praenje koncentracije
zagaivaa zraka, primjerice ugljikova monoksida, nitrobenzena, vinilnoga klorida,
cijanovodika i piridina, a u svrhu potovanja pravila koja je donijela zdravstvena organizacija
Occupational Safety and Health Administration (OSHA) (U.S.A.). Mogue je nabaviti
interferencijske filtre predviene za odreivanje svakoga pojedinog zagaivaa. Oni
proputaju uske vrpce zraenja u podruju od 3 do 14 m.
45
dr. Sejit Bobar
4B-3. Kvalitativna analiza primjenom infracrvene spektrofotometrije

Infracrveni apsorpcijski spektar, ak i onaj relativno jednostavna spoja, esto sadri
zbunjujuu koliinu otrih maksimuma i minimuma. Maksimumi kojima se prepoznaju
funkcionalne skupine nalaze se u podruju manjih valnih duljina infracrvenog podruja
(priblino od 2,5 do 8,5 ftm). U tom podruju na poloaje maksimuma ostatak molekule
utjee samo neznatno. U tablici 7. prikazani su poloaji tipinih maksimuma nekih
uobiajenih funkcionalnih skupina18.
Prepoznavanje funkcionalnih skupina u molekuli malokad je dostatno za sigurnu
identifikaciju spoja, te se cijeli spektar od 2,5 do 15 jum mora usporediti s onime poznatog
spoja. Za tu namjenu postoje zbirke spektara.
Tabela 7. Neki tipini infracrveni apsorpcijski maksimumi
4B-4. Kvantitativna
spektrofotometrije
analiza
primjenom
infracrvene
fotometrije
Kvantitativne infracrvene apsorpcijske metode poneto se razlikuju od onih u ultraljubiastom i vidljivu podruju, ponajvie zbog vee sloenosti spektara, uskih
apsorpcijskih vrpca te instrumentnih ogranienja infracrvenih fotometara i spektrofotometara20.
Mjerenja apsorbancije
Primjena sparenih kiveta za otapalo i uzorak malokad je prihvatljiva za infracrvena mjerenja
zbog potekoa u dobivanju kiveta istih transmisijskih znaajki. Dio potekoa potjee od
smanjenja prozirnosti prozora kiveta za infracrveno podruje (najee izglaeni natrijev
klorid) tijekom primjene, zbog prisutnosti tragova vlage u atmosferi i u uzorcima. Nadalje,
teko je dobiti identinu debljinu sloja jer su kivete za infracrveno podruje esto ue od 1
mm. Takve su debljine kiveta potrebne radi proputanja mjerljivih intenziteta infracrvenog
zraenja kroz isti uzorak ili kroz vrlo koncentirane otopine uzorka. Mjerenja razrijeenih
otopina uzoraka, kao u ultraljubiastoj ili vidljivoj spektroskopiji, esto su iskljuena zbog
nedostatka dobrih otapala koja bi bila prozirna u znatnom dijelu infracrvenog spektra. Zbog
46
dr. Sejit Bobar
upravo spomenutih razloga, referentni se uzorak gotovo i ne upotrebljava - kvalitativnoj

infracrvenoj analizi, a intenzitet zraenja koje prolazi kroz uzorak jednostavno se usporeuje
s onime snopa koji nije niime zaprijeen. Alternativ- o. ploica soli moe se staviti i u
referentni snop. U bilo kojemu od spomenutih primjera, transmitancija je uglavnom manja od
100%, ak i u podrujima u kojima je uzorak potpuno proziran.
U kvantitativnom se radu primjenjuju dvije metode za korekciju rasprenja i apsorpcije u
otapalu i stijenkama kiveta. U postupku vaenja kiveta primjenjuje se po jedna kiveta za
uzastopno snimanje spektara otapala i uzorka u odnosu prema neometanomu referentnom
snopu. Transmitancija svake od otopina prema referentnom snopu tada se odreuje kao
apsorpcijski maksimum uzorka. Te se iransmitancije mogu prikazati izrazima:
To = Po/Pr,
Ts = P/Pt,
gdje je PT snaga referentnog snopa, a T0 i Ts transmitancije otapala, odnosno uzorka prema
referentnom snopu. Uz uvjet daje Pr konstantna za vrijeme dvaju mjerenja, transmitancija
uzorka se u odnosu prema otapalu moe dobiti dijeljenjem jedne jednadbe drugom:
T = Ts/T0 = P/P0 .
Alternativan nain dobivanja Po, i Tjest metoda bazne Unije, koja pretpostavlja daje
transmitancija otapala konstantna ili barem da se linearno mijenja izmeu ramena
apsorpcijskih maksimuma. Taje tehnika prikazana slikom 26.
Slika 26. Metoda bazne linije za odreivanje apsorbancije
Odstupanja od Beerova zakona

U infracrvenoj spektroskopiji uobiajena su instrumentna odstupanja od Beerova zakona
zbog vrlo malog intenziteta izvora i osjetljivosti detektora, te su potrebne relativno iroke
pukotine za dobivanje izlaznog signala koji je mogue tano mjeriti. Kao posljedica tih
ogranienja, irina vrpce iz monohromatora esto je istog reda veliine kao irina tipinoga
infracrvenoga apsorpcijskog maksimuma. Takav splet oklnosti najee je uzrok nelinearnog
47
dr. Sejit Bobar
odnosa izmeu apsorbancije i koncentracije. Stoga su u kvantitativnoj infracrvenoj

spektroskopiji uobiajene badarne krivulje sa znatnim zakrivljenjem.
Primjena kvantitativne infracrvene spektroskopije

Infracrvena spektrofotometrija prua mogunost odreivanja izuzetno velikog broja tvari, jer
skoro sve molekulske vrste apsorbiraju u infracrvenom podruju. Nadalje, jedinstvenost
infracrvenog spektra prua stupanj specifinosti kojemu odgovara, ili ga nadilazi, relativno
mali broj drugih analitikih metoda. Ta specifinost pronalazi osobitu primjenu u analizi
smjesa srodnih organskih spojeva.
Nedavno donesena pravila koja reguliraju atmosferska zagaivala zahtijevala su razvitak
osjetljivih, brzih i visoko specifinih metoda za odreivanje razliitih kemijskih spojeva.
Oito je da postupci temeljeni na apsorpciji infracrvenog zraenja odgovaraju tim zahtjevima
bolje od bilo koje druge analitike metode same za sebe.
U tablici 8. prikazanje niz razliitih atmosferskih zagaivala koje je mogue odrediti pomou
jednostavnoga, prenosivoga filtarskog fotometra uz primjenu posebnih interferencijskih
filtara za svaku vrstu uzorka. Izmeu vie od 400 kemikalija za koje je OSHA postavila
maksimalnu granicu tolerancije, vie od polovice imaju apsorpcijske znaajke koje ih ine
prikladnima za odreivanje infracrvenom fotometrijom ili spektrofotometrijom. Oito je zbog
tolikog broja spojeva koji apsorbiraju potrebno oekivati preklapanje maksimuma. Usprkos
tome, ta metoda osigurava umjereno visok stupanj selektivnosti.
Tablica 8.
PRIMJERI INFRACRVENE ANALIZE PARA ZA ZADOVOLJAVANJE PRAVILA
OSHA
48
dr. Sejit Bobar
5.A. ATOMSKA SPEKTROSKOPIJA TEMELJENA NA ULTRALJUBIASTOM I

VIDLJIVU ZRAENJU
Atomska se spektroskopija primjenjuje za kvalitativno i kvantitativno odreivanje priblino
70 elemenata. Osjetljivosti se atomskih metoda nalaze u podruju "dijelova na milijun"
(ppm), odnosno "dijelova na bilijun" (ppb). Dodatne prednosti tih metoda su brzina,
prikladnost, uglavnom visoka selektivnost te umjerene cijene instrumenata.
Spektroskopska se prouavanja atoma (ili elementnih iona), primjerice Fe+, Mg+ ili Al+,
mogu pomou ultraljubiastog i vidljiva zraenja obavljati samo u plinovitoj sredini, u kojoj
su pojedinani ioni dobro meusobno odvojeni. Prema tome, prvi korak svih atomskih
spektroskopskih postupaka je atomizacija, proces kojime se uzorak isparava i razgrauje uz
nastajanje atomske pare. Uinkovitou i reproducibilnou koraka atomizacije bitno je
odreena osjetljivost, preciznost i tonost metode. To znai da je atomizacija najkritiniji
korak u atomskoj spektroskopiji.
Kao to je prikazano tablicom 10., atomske spektroskopske metode prikladno su
kategorizirane prema nainu atomiziranja uzoraka. Pritom se atomizacijska temperatura bitno
mijenja izmeu nekoliko metoda. Atomske se metode temelje na pojavama apsorpcije,
fluorescencije i emisije.
U ovom e se poglavlju razmatrati spektroskopske metode temeljene na etiri najea naina
atomizacije: (1) atomizacija u plamenu, (2) elektrotermika atomizacija, (3) atomizacija u
induktivno spregnutoj plazmi i (4) atomizacija u plazmi istosmjerne struje.
Tabela 10. klasifikacija atomskih spektralnih metoda
49
5.A-1
USPOREDBA
METODA
ATOMSKIH
MOLEKULSKIH
dr. Sejit Bobar
SPEKTROSKOPSKIH
Atomska se spektroskopija temelji na pojavama apsorpcije, fluorescencije i emisije, a za

molekulsku spektroskopiju openito su primjenjive samo apsorpcija i fluorescencija.
Metode toplinske emisije malo su primijenjene u odreivanju molekulskih vrsta jer se veina
molekula razgrauje pri temperaturama potrebnim za pobuivanje emisije.
Postoje neke koncepcijske razlike izmeu atomske i molekulske spektroskopije. Primarna je
razlika u tipu prouavanih hemijskih vrsta. Atomska spektroskopija bavi se identitetom i
koncentracijom atoma u uzorku, bez obzira na nain njihove povezanosti. Nasuprot tome,
molekulska spektroskopija upuuje na kvalitativne i kvantitativne podatke o molekulama u
uzorku.
Atomska spektroskopija ograniena je na frekvencije ultraljubiastog, vidljiva i Xzraenja, jer su samo te frekvencije energijski prikladne za pobuivanje elektronskih
prijelaza. Nasuprot tome, osim elektronskih razina, molekule imaju i vibracijska i rotacijska
energijska stanja. Kao posljedica toga, molekulska se spektroskopija temelji na zraenju
ultraljubiastog, vidljiva, infracrvenog, mikrovalnog i radiofrekvencijskog podruja.
Instrumenti za atomsku i molekulsku spektroskopiju imaju niz zajednikih znaajaka.
Primjerice, i kod jednih i kod drugih primjenjuju se monohromatori ili filtri za odabiranje
valnih duljina te fotonski detektori za odreivanje intenziteta zraenja. Instrumenti za
atomska i molekulska apsorpcijska istraivanja imaju spremnik uzoraka. U ureajima za
molekulsku apsorpcijsku spektroskopiju su spremnici elije, ili kivete, koje sadre tekuu ili
plinsku otopinu uzorka. Spremnik u atomskoj spektroskopiji je plamen, plazma, luk ili iskra,
koji sadre plinski atomski uzorak. Spremnik atoma slui u dvije svrhe: on je ujedno i
sredstvo za atomizaciju i spremnik atomskih para.
Ureajima za atomsku apsorpciju i onima za fluorescenciju zajednika je znaajka takoer
izvor zraenja. Poslije e se uoiti da su upravo svojstva izvora uzrok najveih razlika
izmeu atomske i molekulske spektroskopije.
50
dr. Sejit Bobar
5 B. ATOMSKASPEKTROSKOPIJA TEMELJENA NA PLAMENOJ ATOMIZACIJI

Tri su tipa atomskih metoda temeljena na plamenoj atomizaciji:
(1) atomska apsorpcijska spektroskopija (AAS),
(2) atomska emisijska spektroskopija (AES) i
(3) atomska fluorescencijska spektroskopija (AFS).
U plamenoj se atomizaciji vodena otopina uzorka raspruje u oblik fine vodene praine i
mijea s plinovitim gorivom i oksidansom koji ga unose u plamen. Otapalo ispari u osnovnom
podruju plamena, smjetenome odmah iznad plamenika. Fino raspodijeljene vrste estice
koje tim postupkom nastaju noene su u podruje u sredini plamena, nazvano unutranjim
stocem. To je najtopliji dio plamena u kojemu iz vrstih estica nastaju plinoviti atomi i
elementni ioni. U tom se podruju takoer pobuuju atomski emisijski spektri. Konano,
atomi i ioni su noeni u vanjski rub, vanjski stoac plamena, gdje moe doi do oksidacije
prije rasprivanja atomizacijskih produkata u atmosferu. Zbog velike brzine prolaza smjese
gorivo-oksidans kroz plamen, samo dio uzorka podlijee opisanim procesima. Zbog toga
plamen nije izrazito djelotvoran atomizator.
5B-1. Plameni atomizatori

Dva se tipa plamenika primjenjuju u plamenoj spektroskopiji:
plamenik turbulentnog protoka i

plamenik laminamog protoka.
Slika 27-2a. prikaz je plamenika turbulentnog protoka ili plamenika s potpunim izgaranjem
kakav je mogue kupiti na tritu. U njemu su raspriva (nebulizator) i plamenik ugraeni u
jednu cjelinu. Uzorak se uvlai kapilarom i raspruje Venturijevim djelovanjem, uzrok kojega
je protok plinova oko kapilarnog vrka. Tipine brzine protoka uzoraka su 1 -3 ml/min.
Prednost plamenika turbulentnih protoka je u unoenju relativno velike i reprezentativne
koliine uzorka u plamen. Nedostaci, meutim, ukljuuju relativno kratku duljinu puta kroz
plamen i tekoe sa zaepljenjem vrka kapilare. Nadalje, ti su plamenici buni kako s
elektronike tako i sa ujne take gledita. Kod dananjih apsorpcijskih instrumenata malo
kad se koriste plamenici turbulentnog protoka, iako se katkad upotrebljavaju u emisijskim i
fluorescencijskim ureajima.
51
dr. Sejit Bobar
Slika. 27-2.
Slika 27-2b. prikaz je tipinoga komercijalnog plamenika laminamog protoka, ili plamenika s
prethodnim mijeanjem. Uzorak se raspruje protokom oksidansa pokraj kapilarnog vrka.
Aerosol koji time nastaje mijea se s gorivom i protjee pokraj niza zapreka koje uklanjaju
sve osim najfinijih kapljica. Rezultat toga je velika koliina uzorka, koji se skuplja na dnu
komore za mijeanje odakle se cijevima odvodi u spremnik otpada. Aerosol, oksidans i
gorivo ulaze u plamenik s prorezom, a iji je plamen najee dugaak 5-10 centimetara.
Plamenici laminarnih protoka proizvode relativno tih plamen mnogo vee duljine puta. Ta
svojstva pridonose poveanju osjetljivosti i reproducibilnosti. Nadalje, malokad se pojavljuje
problem zaepljenja. Loe strane takvih plamenika ukljuuju manju brzinu unoenja uzorka
(to moe ponititi prednost vee duljine puta) kao i mogunost selektivnog isparavanja
mijeanih otapala u komori, to moe prouzroiti analitike pogreke. Osim toga, komora za
mijeanje sadri potencijalno eksplozivne smjese, koje se mogu zapaliti uskakanjem plamena
("flashback"). Plamenik prikazan slikom 27-2b. u tu je svrhu opskrbljen sigurnosnim
ventilima za regulaciju tlaka. Zato je glava plamenika katkad uvrena cijevima od
nehrajueg elika.
52
dr. Sejit Bobar
5B-2. Emisijski i apsorpcijski spektri u plamenu

Emisijski i apsorpcijski spektri atoma i iona dobivaju se iz plamena. Atomski emisijski
spektri nastaju kada je atom ili ion pobuen apsorpcijom energije vrueg izvora, te se
relaksira do svoga osnovnog stanja otputanjem fotona zraenja. Nasuprot tome, atomska
apsorpcija nastaje kada plinoviti atom ili ion apsorbira foton zraenja iz vanjskog izvora i
time se pobuuje. Vano je naglasiti daje za isti elektronski prijelaz, energija emitiranog
fotona jednaka onoj apsorbiranog fotona. Dakle, valna duljina emitiranog zraenja jednaka je
valnoj duljini apsorbiranog zraenja.
U plamenu se svi elementi ioniziraju do nekog stupnja, to uvjetuje postojanje smjese atoma,
iona i elektrona u vruem mediju. Primjerice, kada se uzorak koji sadri barij atomizira,
ravnotea
Ba Ba+ + euspostavlja se u unutranjem stocu plamena. Poloaj ravnotee ovisi o temperaturi plamena i
ukupnoj koncentraciji barija kao i o koncentraciji elektrona koji nastaju ionizacijom svih
elemenata prisutnih u uzorku. Pri temperaturama najtoplijih plamena (>3 000 K) priblino
polovica barija moe biti prisutna u ionskom obliku. Meutim, spektri Ba i Ba+ potpuno su
meusobno razliiti. Prema tome, u visokotemperaturnim plamenima pobuuju se dva
spektra za barij, jedan atomski : jedan ionski. Zbog toga, a i zbog drugih razloga, u plamenoj
je spektroskopiji vrlo vaan nadzor temperature plamena.
5B-3. Metode dobivanja spektara pomou plamena

U plamenoj emisijskoj spektroskopiji pobueni ioni uzorka slue kao izvori zraenja. To
znai, za razliku od svih drugih do sada opisanih tipova spektroskopije, u plamenoj
emisijskoj spektroskopiji ne primjenjuje se nikakav vanjski izvor. Spektri se snimaju
smjetanjem unutranjeg stoca plamena ispred ulazne pukotine monohromatora (Sl. 13).
Izlazni signal izlazne pukotine promatra se kao spektar, koji se snima rotiranjem reetke ili
prizme. Tako dobiven emisijski spektar prikazan je slikom 17.
U atomskoj se apsorpcijskoj spektroskopiji zraenje posebne vrste vanjskog izvora proputa
kroz unutranji stoac plamena, monohromator (katkad interfereneijski filtar), do povrine
detektora zraenja. Nasuprot molekulskim apsorpcijskim metodama, atomske apsorpcijske
metode ne primjenjuju kontinuirani izvor zraenja, nego izvore koji emitiraju linije zraenja
istih valnih duljina kao to su one apsorpcijskog maksimuma uzorka. Kao posljedica
primjene linijskih izvora, malo kad se u literaturi koja se bavi atomskom apsorpcijskom
spektroskopijom moe nai potpun spektar.
U atomskoj fluorescencijskoj spektroskopiji fluorescencija se pobuuje pomou snopa
zraenja koji ulazi u plamen pod pravim kutom u odnosu na put prema ulaznoj pukotini
selektora valnih duljina.
53
dr. Sejit Bobar
5B-4. Tipovi plamena

U plamenoj se spektroskopiji primjenjuje nekoliko kombinacija goriva i oksidansa.
Niskotemperaturni plameni (od 1750 do 1850 C), koji se postiu pomou propana ili
prirodnog plina kao goriva i zraka kao oksidansa, imaju dovoljnu energiju za poluivanje
zadovoljavajuih spektara alkalijskih metala, a dovoljno su hladni za onemoguavanje
znatnije ionizacije, te time i gubitka osjetljivosti. Osim toga, vrlo je malo drugih elemenata
koji se mogu pobuditi tom vrstom plamena, te su spektri jednostavni, a linije uzorka se lako
mogu izolirati ak i pomou jeftinih staklenih filtara.
Plameni nastali pomou smjese zrak-acetilen, ije se temperature kreu u podruju 2 200 - 2
400 C, prikladni su za mnoge atomske apsorpcijske metode. Ta smjesa nije zadovoljavajua
za elemente kao to su aluminij, silicij, zemnoalkalijski elementi i vanadij, koji tvore otporne
okside, koji se nepotpuno atomiziraju pri tim temperaturama.
Za dobivanje emisijskih spektara veine elemenata, acetilen se primjenjuje kao gorivo, a
kisik ili azotov(I) oksid kao oksidans. Takve smjese stvaraju plamen temperature od 2 950 do
3 050 C.
Plameni koji primjenjuju smjese zrak-vodik (2100 C) ili kisik-vodik (2700 C) prikladni su
za promatranje linija u ultraljubiastom podruju kratkih valnih duljina jer su oni, za razliku
od acetilenskih i drugih ugljikovodinih plamena, u tom podruju prozirni.
24B-5. Utjecaji temperature plamena

Promjene temperature plamena utjeu na vrlo sloen nain kako na emisijske tako i na
apsorpcijske spektre. Uinak zajedniki za obje metode oituje se u poveanju uinkovitosti
atomizacije, a time i ukupne atomske napuenosti plamena, s povienjem temperature.
Posljedica toga je poveana osjetljivost. Meutim, kao to je prije spomenuto, to poveanje u
atomskoj napuenosti moe se kod nekih elemenata ponititi brojem atoma izgubljenih zbog
ionizacije.
Drugi uinak povienja temperature je proirenje linija, popraeno sa smanjenjem visine
maksimuma.
Temperatura plamena odreuje i relativan broj pobuenih i nepobuenih atoma u plamenu.
Primjerice, u plamenu zrak-acetilen omjer pobuenih i nepobuenih magnezijevih atoma
prema raunu iznosi priblino 10-8, a u plamenu kisik-acetilen, koji je za otprilike 700 C
topliji, taj je omjer vei priblino za faktor 70. Dakle, nadzor temperature je od primarne
vanosti u plamenim emisijskim metodama. Primjerice, u plamenu temperature 2 500 C,
povienje temperature od 10 C uzrok je poveanja broja natrijevih atoma u pobuenu stanju
3p za priblino 3 %. Nasuprot tome, odgovarajue smanjenje u mnogo veem broju atoma
osnovnog stanja iznosi samo otprilike 0,002 %. Stoga emisijske metode temeljene na
napuenosti pobuenim atomima zahtijevaju toniji nadzor temperature plamena od
apsorpcijskih postupaka, analitiki signal kojih ovisi o broju nepobuenih atoma.
54
dr. Sejit Bobar
Tablica 11. Usporedba detekciskih granica razliitih elemenata u plamenim

apsorpcijskim i plamenim emisijskim metodama
Broj nepobuenih atoma u tipinom plamenu prelazi broj pobuenih za faktor 103 - 1010 ili
vie. Iz toga proizlazi da bi apsorpcijske metode mogle biti mnogo osjetljivije od emisijskih
apsorpcijskih metoda. Meutim, postoji i nekoliko drugih varijabla koje utjeu na osjetljivost,
pa se te dvije metode meusobno u tom smislu nadopunjuju.
24B-6. Plamena atomska apsorpcijska spektroskopija

Plamena atomska apsorpcijska spektroskopija je trenutno zbog svoje jednostavnosti,
uinkovitosti i relativno niskih cijena, najee primjenjivana od svih atomskih metoda
popisanih u tablici 9.
Atomski apsorpcijski spektri
Uglavnom se apsorpcija zraenja vanjskog izvora nekom atomskom vrstom u plamenu
oituje u nizu uskih maksimuma (linija), koje su rezultat prijelaza elektrona iz osnovnog u
jedno od nekoliko viih energijskih stanja. Vano je naglasiti daje valna duljina apsorbirane
linije jednaka valnoj duljini emitiranoj pri povratku elektrona iz pobuenoga stanja u
osnovno stanje. To znai da atomska apsorpcija primjenjuje rezonantne linije.
irine atomskih apsorpcijskih linija
Prirodna irina atomske apsorpcijske ili atomske emisijske linije je reda veliine 10-5 nm.
Postoje, meutim, dva razloga koji mogu promatrane linije proiriti za faktor 100, ili vie.
Poslije e biti objanjeno zato se mora voditi rauna pri konstrukciji ureaja za atomsku
apsorpciju o proirenju linija.
Dopplerovo proirenje. Dopplerovo proirenje rezultat je brzog pomicanja atoma pri
emitiranju ili apsorpciji zraenja. Atomi koji se pomiu prema detektoru emitiraju valne
duljine neto krae od onih koje emitiraju atomi to se pomiu pod pravim kutom u odnosu
prema detektoru (Sl. 28). Ta je razlika odraz dobro poznatoga Dopplerova pomaka. Utjecaj je
obrnut za atome koji se pomiu u suprotnom smjeru od detektora. isti uinak te pojave je
poveanje irine emisijske linije. Dopplerov uinak je, zbog posve istih razloga, uzrok
proirenja apsorpcijskih linija. Taj tip proirenja postaje jae izraen pri povienju
temperature plamena, zbog poveane brzine kretanja atoma.
Tlano proirenje. Tlano proirenje nastaje zbog sudara meu atomima, ime nastaju male
promjene energija njihovih osnovnih stanja, a time i male promjene u razlikama energija
izmeu osnovnog i pobuenih stanja. Kao i Dopplerovo, tlano se proirenje takoer
55
dr. Sejit Bobar
pojaava s povienjem temperature. Stoga se pri povienim temperaturama uvijek pojavljuju

iri apsorpcijski i emisijski maksimumi.
Utjecaj uskoe linija na mjerenja apsorbancije
Zbog jedinstvenosti energija prijelaza atomskih apsorpcijkih linija svakoga pojedinog
elementa, analitike metode temeljene na atomskoj apsorpciji imaju mogunost visoke
specifinosti. Nasuprot tome, uske linije stvaraju u kvantitativnoj analizi problem, koji ne
postoji u molekulskoj apsorpciji. Nijedan obian monohromator nema sposobnost izdvajanja
vrpce zraenja tako uske kao to je atomska apsorpcijska linija (0,002 - 0,005 nm). Stoga je
primjena zraenja izoliranoga monohromatorom iz kontinuiranog izvora nuno uzrok
instrumentnih odstupanja od Beerova zakona. Nadalje, budui da je frakcija apsorbiranog
zraenja takva snopa mala, detektor dobiva signal koji je samo neznatno oslabljen (tj. P
P0), te je osjetljivost mjerenja vrlo mala.
Slika 28.
Tekoe nastale zbog uskih apsorpcijskih linija prevladane su primjenom zraenja izvora koji
emitira ne samo liniju iste valne duljine, nego i uu od apsorpcijske linije. Primjerice, arulja
sa ivinim parama primjenjuje se kao vanjski izvor zraenja za odreivanje ive. Plinoviti
ivini atomi pobueni u takvoj arulji elektrinim putem, vraaju se u osnovno stanje uz
emitiranje zraenja valnih duljina jednakih onima koje apsorbiraju atomi uzorka ive u
plamenu. Budui da arulja radi pri temperaturi nioj od one plamena, Dopplerovo i tlano
proirenje ivinih emisijskih linija arulje manje je od odgovarajueg proirenja apsorpcijskih
maksimuma uzorka u vruem plamenu. Kao posljedica toga, efektivne irine linija koje
emitira arulja mnogo su manje od irina vrpca apsorpcijskih maksimuma uzorka u plamenu.
Slika 29. prikazuje openiti pristup mjerenju apsorbancija atomskim apsorpcijskim
metodama. Slikom 29a. prikazane su etiri uske emisijske linije tipinoga atomskog izvora.
Jedna od tih linija izolirana je filtrom ili monohromatorom.
56
dr. Sejit Bobar
Slika 29. Atomska apsorpcija rezonantnih linija

Slika 29b. prikazuje apsorpcijski spektar uzorka u plamenu u podruju valnih duljina od 1 do
2. Pritom je irina apsorpcijskog maksimuma u plamenu mnogo vea od irine emisijske
linije arulje. Intenzitet upadnog snopa P0 smanjuje se prolazom kroz uzorak do vrijednosti P
(Sl. 29c). Budui daje irina vrpce emisijske linije arulje mnogo manja od irine vrpce
apsorpcijskog maksimuma u plamenu, vjerojatno je log P0/P u linearnom odnosu s
koncentracijom.
Linijski izvori za atomsku apsorpcijsku spektroskopiju
U ureajima za atomsku apsorpciju primjenjuju se dvije vrste lampi: lampe sa upljom
katodom i bezelektrodne lampe uz izbijanje.
Lampe sa upljom katodom. Najee primjenjivan izvor zraenja u atomskoj apsorpcijskoj
spektroskopiji je lampa sa upljom katodom, shematski prikazana slikom 30. Sastoji se od
volframove anode i cilindrine katode, zataljenih u staklenoj cijevi punjenoj inertnim plinom,
primjerice argonom, pod tlakom od priblino 100 - 600 Pa. Katoda je napravljena od metala
koji se analizira, ili slui kao podloga za sloj tog metala.
Primjena potencijala od priblino 300 V na elektrodama uzrok je ionizacije argona i
nastajanja struje od 5 do 10 mA, jer kationi argona putuju prema katodi, a elektroni prema
anodi. Kada je potencijal dovoljno velik, kationi argona udaraju na katodu energijom
57
dr. Sejit Bobar
dovoljnom za izbijanje nekolicine atoma metala, ime nastaje atomski oblak. Taj se proces
naziva prtanjem. Jedan dio izbijenih atoma metala nalazi se u pobuenu stanju, te emitiraju
tipine valne duljine pri povratku u osnovno stanje. Treba se prisjetiti da se atomi koji daju
emisijske linije nalaze u lampi pri mnogo nioj temperaturi od atoma uzorka u plamenu.
Stoga se emisijske linije lampe manje proiruju od apsorpcijskih maksimuma u plamenu.
Izbijeni atomi metala u lampi mogu prijei natrag na povrinu katode ili pak na stijenke
lampe, te se tamo istaloiti.
Na tritu postoje lampe sa upljom katodom za analizu etrdesetak elemenata. Neke su
opskrbljene katodom koja sadri vie od jednog elementa. Takve lampe daju spektralne linije
za odreivanje nekoliko razliitih hemijskih vrsta. Otkrie lampa sa upljom katodom
openito se smatra najvanijim za razvoj atomske apsorpcijske spektroskopije.
Slika 30. Lampa sa upljom katodom

Bezelektrodne lampe uz izbijanje. Bezelektrodne lampe uz izbijanje prikladni su izvori
atomskih linijskih spektara, a intenziteti zraenja su im za jedan do dva reda veliine jai od
onih u lampama sa upljom katodom. Tipina lampa sastoji se od zataljene kvarcne cijevi
koja sadri inertan plin kao to je argon, pri tlaku od nekoliko stotina Pa, te malu koliinu
metala koji se analizira, ili njegove soli. Lampa ne sadri elektrode, no umjesto toga koristi
energiju jakog polja radiofrekvencijskog ili mikrovalnog zraenja. Argon se u tom polju
ionizira, ioni se ubrzavaju visokofrekvencijskom komponentom polja dok ne postignu
dovoljnu energiju za pobuivanje atoma metala (kolizijom) spektar kojega je potreban.
Bezelektrodne lampe uz izbijanje mogue je na tritu nabaviti za nekoliko elemenata.
Njihove radne znaajke nisu tako pouzdane kao one lampa sa upljom katodom.
Modulacija izvora
U atomskim apsorpcijskim mjerenjima potrebno je razlikovati zraenje lampe sa upljom
katodom ili bezelektrodne lampe uz izbijanje od zraenja plamena. Veliki dio toga
posljednjega uklanja se monohromatorom, koji je uvijek postavljen izmeu plamena i
detektora. Dodue, toplinsko pobuivanje dijela atoma uzorka u plamenu proizvodi zraenje
valne duljine na koju je monohromator namjeten. Budui da se takvo zraenje ne uklanja,
ono postaje mogui izvor interferencije.
58
dr. Sejit Bobar
Uinak emisije uzorka prevladava se modulacijom izlaznog signala lampe sa upljom

katodom, tako da njezin intenzitet fluktuira pri stalnoj frekvenciji. Stoga detektor prima
izmjenini signal lampe i neprekidan, istosmjerni signal plamena, te ih pretvara u
odgovarajue tipove elektrine struje. Relativno jednostavan elektroniki sustav uklanja
nemodulirane istosmjerne signale nastale plamenom, a do pojaala i sredstava za oitanje
proputa izmjenini signal izvora.
Modulacija se najee provodi umetanjem okruglog sjeckala, pokretanoga motorom, izmeu
izvora i plamena (Sl. 31). Dijelovi metalnog sjeckala su uklonjeni, te se zraenje polovicu
vremena proputa kroz sredstvo, a drugu polovicu vremena reflektira. Rotacija sjeckala
stalnom brzinom uzrok je kolebanju snopa koji pada na plamen od nule do nekog
maksimuma pa opet do nule. Kao alternativa, energija izvora moe se namjestiti na rad s
izmjeninim intenzitetom.
Slika 31. Optiki putevi u dvosnopnom apsorpcijskom spektrofotometru.
Instrumenti
Instrumenti za atomsku apsorpciju sadre iste osnovne komponente kao i oni predvieni za
mjerenja molekulske apsorpcije: izvor, spremnik uzorka (ovdje plamen), selektor valnih
duljina i sistem za detektiranje i oitanje. Mnogi proizvoai nude instrumente s jednim
snopom i s dva snopa zraenja. Postoji razlika u kakvoi i cijeni.
Fotometri. Kao najmanji zahtjev, instrument za atomsku apsorpcijsku spektroskopiju mora
imati mogunost pribavljanja dovoljno uske vrpce za izoliranje izabrane mjerne linije od
drugih manjih linija, koje mogu interferirati ili smanjiti osjetljivost metode. Fotometar sa
upljom katodom kao izvorom i sa staklenim filtrima sasvim zadovoljavajue mjeri
koncentracije alkalijskih metala, koji u vidljivu podruju imaju tek nekoliko iroko
razmaknutih rezonantnih linija. Na tritu postoji i zahtjevniji fotometar s interferencijskim
filtrima i lampama koje se mogu lako mijenjati. Za svaki je element potrebna kombinacija
filtra i lampe. Postignuti su dobri rezultati za analizu 22 razliita metala.
59
dr. Sejit Bobar
Spektrofotometri. Atomska apsorpcijska mjerenja najee se izvode pomou instrumenata

koji kao monohromator posjeduju reetku za ultraljubiasto i vidljivo podruje. Slika 31.
tipian je shematski prikaz instrumenta s dva snopa zraenja. Zraenje lampe sa upljom
katodom rastavlja se sjeckalom i mehaniki u dva snopa, od kojih jedan prolazi kroz, a drugi
oko plamena. Poluposrebreno zrcalo skuplja oba snopa u jedan put, kojime oni naizmjence
prolaze monokromatorom do detektora. Procesor signala tada odvaja izmjenini signal nastao
u odvojenu snopu od istosmjernog signala nastaloga u plamenu. Logaritam omjera referentne
komponente i komponente uzorka izmjeninog signala izrauna se i alje ureaju za oitanje
kao vrijednost apsorbancije.
Interferencije
U atomskim apsorpcijskim metodama pojavljuju se dva tipa interferencija. Spektralne
interferencije se pojavljuju kada neka tvar pri atomizaciji raspruje upadno zraenje izvora,
ili pak kada apsorpcija ili emisija tvari koja interferira prekriva liniju uzorka ili joj je toliko
blizu da razluivanje monohromatorom postaje nemogue. Hemijske interferencije rezultat su
razliitih hemijskih procesa koji se dogaaju za vrijeme atomizacije, a koji mijenjaju
apsorpcijske znaajke uzorka.
Spektralne interferencije. Zbog vrlo uskih emisijskih linija izvora sa upljom katodom, vrlo
su rijetke interferencije prekrivanja linija. Usprkos tome, takve se interferencije mogu
pojaviti kada su dvije linije odvojene za red veliine 0,001 nm. Primjerice, vanadijeva linija
pri 308,211 nm smeta u analizi temeljenoj na aluminijevoj apsorpciji pri 308,215 nm.
Meutim, interferenciju je lako sprijeiti izborom neke druge aluminijeve linije (primjerice
309,27nm).
Spektralne interferencije takoer su rezultat prisutnosti ili molekulskih produkata izgaranja
koji daju iroke apsorpcijske vrpce ili estinih produkata koji raspruju zraenje. U oba se
primjera smanjuje snaga proputenog snopa, to uzrokuje pozitivne analitike pogreke. Kada
je uzrok tih produkata samo smjesa goriva i oksidansa, korekcija se dobiva jednostavno iz
oitanja apsorbancije slijepe probe rasprene u plamenu.
Vee tekoe nastaju kada apsorpcija ili rasprenje potjee od matrice uzorka. U takvu je tipu
interferencije snaga proputenog snopa P priguena komponentama matrice, a snaga upadnog
snopa P0 nije. Nastaje pozitivna pogreka u apsorbanciji, a time i u koncentraciji. Primjerice,
potencijalna apsorpcijska interferencija matrice mogua je pri odreivanju barija u smjesi
zemnoalkalijskih metala. Valna duljina barijeve linije koja se primjenjuje u atomskoj
apsorpciji pojavljuje se u sreditu iroke apsorpcijske vrpce molekulskoga CaOH; rezultat je
interferencija kalcija pri analizi barija. Taj se uinak uklanja zamjenom zraka kao oksidansa
duikovim(I) oksidom; visoke temperature razgrauju CaOH i uklanjaju apsorpcijsku vrpcu.
Spektralne interferencije koje nastaju zbog rasprenja na produktima atomizacije esto se
pojavljuju pri utrcavanju u plamen otopina koje sadre elemente kao to su titan, cirkonij i
volfram, koji tvore stabilne okside. ini se da tada nastaju estice metalnih oksida iji su
promjeri vei od valne duljine svjetlosti, te se upadni snop na njima raspruje.
Sreom, spektralne interferencije produktima matrice nisu tako este pri plamenoj
atomizaciji, te se uglavnom mogu izbjei promjenama analitikih parametara kao to su
60
dr. Sejit Bobar
temperatura plamena ili omjer goriva i oksidansa. Osim toga, kada je izvor interferencije
poznat, moe se kako u uzorak tako i u standarde dodati suviak supstancije koja interferira.
Uz uvjet daje taj suviak velik u odnosu prema koncentraciji u matrici uzorka, utjecaj ovoga
je zanemariv. Dodana supstancija se katkad naziva radijacijskim puferom.
Problem interferencije matrice znatno se poveava pri elektrotoplinskoj atomizaciji, te
postaje jedan od glavnih uzroka loije tonosti bez plamenih metoda2.
Hemijske interferencije. Hemijske se interferencije esto mogu smanjiti prikladnim
odabirom radnih uvjeta. Moda je najuobiajeniji tip hemijske interferencije onaj to nastaje
zbog aniona koji s analitom tvore spojeve slabe hlapljivosti, te time smanjuju brzinu
atomiziranja. Posljedica su niski rezultati. Primjer toga jest smanjenje apsorbancije pri analizi
kalcija koje nastaje s poveanjem koncentracije sulfatnih ili fosfatnih iona koji s kalcijevim
ionom tvore nehlapljive spojeve.
Interferencije koje nastaju zbog stvaranja hemijskih vrsta male hlapljivosti esto se mogu
ukloniti primjenom viih temperatura. Osim toga, u sustav se mogu unijeti otputajui
reagensi. To su kationi koji imaju veu sklonost reakciji s interferencijom, ime sprjeavaju
njezinu reakciju s uzorkom. Primjerice, dodatak suvika stroncijevih ili lantanovih iona
smanjuje interferenciju fosfata u odreivanju kalcija. Pritom stroncij ili lantan zamjenjuje
uzorak u nehlapljivu spoju to nastaje s vrstom koja interferira.
Zatitni reagensi spreavaju interferencije tvorbom stabilnih, hlapljivih vrsta s uzorkom. Tri
reagensa koji se najee primjenjuju u tu svrhu su EDTA, 8hidroksikinolin i APDC
(amonijeva sol 1-pirolidin-karaboditionske kiseline). Pokazano je, primjerice, da prisutnost
EDTA uklanja interferencije silicija, fosfata i sulfata u analizi kalcija.
Ionizacija atoma i molekula uglavnom je neznatna u gorivim smjesama sa zrakom kao
oksidansom. Meutim, u visokotemperatumim plamenovima u kojima su oksidansi kisik ili
duikov oksid, oksidacija je znatna, te kao posljedica ravnotee
M M+ + eu sustavu postoji vea koncentracija slobodnih elektrona. U prikazanoj ravnotei M prikazuje
neutralne atome ili molekule, a M+ njihove pripadne ione. Najee je spektar M+ prilino
razliit od spektra M, te ionizacija iona uzorka pridonosi smanjenju vrijednosti rezultata. Ako
se ionizacija smatra ravnotenim procesom, u kojemu su slobodni elektroni jedan od
produkata, vano je uoiti da na stupanj ionizacije atoma uzorka znatno utjee prisutnost
drugih metala koje se lako ioniziraju u plamenu. Meutim, ako sustav ne sadri samo vrste M
nego i vrste B, te ako B ionizira prema jednadbi
B B+ + e-,
stupanj ionizacije M se smanjuje zbog uinka djelovanja masa elektrona nastalih od B.
Pogreke koje nastaju zbog ionizacije uzorka esto se mogu ukloniti dodatkom potiskivaa
ionizacije, kojime se dobivaju relativno velike koncentracije elektrona u plamenu. Time se
potie potiskivanje, smanjenje ionizacije uzorka. Soli kalija se, zbog male ionizacijske
energije kalija, esto upotrebljavaju kao po- tiskivai ionizacije.
61
dr. Sejit Bobar
Primjena atomske apsorpcijske spektroskopije

Atomska apsorpcijska spektroskopija osjetljivo je sredstvo za odreivanje vie od 60
elemenata. Metoda je prikladna i za rutinska mjerenja, koja mogu obavljati relativno nevjeti
izvoai.
Badarenje
Kvantitativne atomske apsorpcijske metode uglavnom se temelje na badamim krivuljama,
koje su redovito linearne. Pokatkad se moe odstupiti od linearnosti, te se analiza nikad ne
smije temeljiti na mjerenju samo jednoga jedinog standarda, a uz pretpostavku slaganja s
Beerovim zakonom. Nadalje, nastajanjem atomskih para nastaje i niz varijabla koje je
nemogue nadzirati, a koje mogu utjecati na apsorbanciju barem jednoga od mjerenih
standarda. Stoga se odstupanja standarda od originalne badame vrijednosti mogu primijeniti
za korekciju analitikih rezultata.
Metoda dodatka standarda
Metoda dodatka standarda iroko se primjenjuje u atomskoj apsorpcijskoj spektroskopiji. U
primjeni tog postupka dva ili vie alikvota uzorka premjeste se u volumetrijske tikvice. Jedna
od njih se izravno razrijedi. U druge se doda poznata koliina standarda prije razrjeenja na
isti volumen. Mjeri se apsorbancija svake, a ako metoda nije otprije poznata, preporuuje se
priprema nekoliko razliitih dodataka standarda. Ako postoji linearan odnos izmeu
apsorbancije i koncentracije, a to je potrebno eksperimentalno provjeriti, primjenjuju se
sljedei odnosi:
Vx i cx su volumen i koncentracija otopine uzorka, Vs i cs su volumen i koncentracija

standarda, VT je ukupni volumen, k konstanta proporcionalnosti, a Ax i AT apsorbancije samog
uzorka, odnosno uzorka uz dodatak standarda. Kombinacijom prethodnih dviju jednadbi
dobiva se:
Kada je pripremljeno nekoliko otopina sa standardnim dodacima, At iz jednadbe moe se

crtati u ovisnosti o c, (Sl. 32). Dobiveni se pravac tada moe ek- strapolirati na vrijednost At
=0. Uvrtavanjem tog odnosa u predhodnu jednadbu te preureivanjem dobiva se izraz
62
dr. Sejit Bobar
gdje je (Vs)o ekstrapolirani volumen standarda. Primjenom metode standardnog dodatka

mogu se kompenzirati promjene kojima su uzrok spektralne i kemijske interferencije u
otopini analita.
Osjetljivost i tanost. Kolone 2 i 3 u tablici 12. prikazuju podatke o detekcijskim granicama
niza uobiajenih elemenata za analizu plamenom atomskom apsorpcijom i elektrotoplinskim
metodama. Granice analize pomou nekih drugih atomskih postupaka takoer su ukljuene
radi usporedbe. Male razlike izmeu navedenih vrijednosti nisu bitne. Razlike reda veliine
vjerojatno imaju neku vanost, ali faktor 2 ili 3 sasvim sigurno ne.
Tabela 12
Pod uobiajenim uvjetima, relativna pogreka povezana s plamenom apsorpcijskom analizom
iznosi 1 do 2%. Uz posebne mjere opreza taj se broj moe smanjiti na nekoliko desetinka
postotka. Pogreke povezane s besplamenom atomizaci- jom uglavnom su vee od onih za
plamenu atomizaciju za faktor 5 - 10.
5B-7. Plamena emisijska spektroskopija

Atomska emisijska spektroskopija u kojoj se koristi plamen (esto nazivana plamenom
emisijskom spektroskopijom ili plamenom fotometrijom) iroko se rabi u elementnoj analizi.
Najvanija je primjena u odreivanju natrija, kalija, litija i kalcija, osobito u biolokim
tekuinama i tkivima. Zbog svoje prikladnosti, brzine i relativno malo interferencija, plamena
emisijska spektroskopija postala je metodom odabira za te elemente, koje je drugaije teko
odrediti. Metoda se primjenjuje, dodue s promjenljivim uspjehom, za odreivanje gotovo
polovice elemenata periodnog sustava.
Plamena emisijska spektroskopija je, uz kvantitativnu analizu, vrlo korisna i u kvalitativnoj
analizi. Lako se mogu snimiti cijeli spektri. Tada se identifikacija prisutnih elemenata temelji
63
dr. Sejit Bobar
na valnim duljinama maksimuma, koje su jedinstvene za svaki element. U tom smislu

plamena je emisija u velikoj prednosti pred plamenom apsorpcijom, kojom se ne mogu
dobiti cijeli spektri zbog diskontinuirane prirode primijenjenih izvora zraenja.
Instrumentacija
Plameni su emisijski instrumenti po grai slini plamenim apsorpcijskim instrumentima, uz
iznimku izvora zraenja, koji je u prvom primjeru plamen. Stoga su nepotrebni arulja sa
upljom katodom i sjeckalo. Neki instrumenti imaju mogunost mjerenja ili emisije ili
apsorpcije. Poetni radovi u atomskoj emisijskoj analizi izvedeni su uz primjenu plamenika s
turbulentnim protokom. Meutim, u novije je vrijeme sve ira primjena plamenika s
laminamim protokom.
Fotometri i spektrofotometri. Za nerutinske analize poeljan je spektrofotometar za
ultraljubiasto i vidljivo podruje uz mogunost snimanja, a razluivanje kojega iznosi
priblino 0,05 nm. Takvim se instrumentom mogu priskrbiti cijeli emisijski spektri, potrebni
za identifikaciju elemenata prisutnih u uzorku. Slikom 33. prikazano je kako se ine ispravci
s obzirom na pozadinu u snimljenim spektrima.
Jednostavni fotometri s filtrima esto su dovoljni za rutinska odreivanja alkalijskih i
zemnoalkalijskih metala. Niskotemperaturni plamen primjenjuje se da bi se sprijeilo
pobuivanje veine drugih metala. Kao posljedica toga, spektri su jednostavni, a
interferencijski filtri mogu se primijeniti za izolaciju eljene emisijske linije.
Slika 33.
Nekoliko proizvoaa instrumenata proizvodi plamene fotometre prilagoene posebice za
analizu natrija, kalija i litija u krvnom serumu i drugim biolokim uzorcima. U tim je
instrumentima zraenje izvora razbijeno u tri snopa priblino jednake snage. Svaki od njih
tada prolazi posebnim fotometrijskim sustavom koji se sastoji od interferencijskog filtra (koji
proputa emisijsku liniju jednoga od elemenata, a apsorbira one preostalih dvaju), fotocijevi i
64
dr. Sejit Bobar
pojaala. Ako se eli, izlazni se signali mogu mjeriti i odvojeno. Meutim, litij uglavnom
slui kao unutranji standard za analizu. U tu se svrhu u svaki uzorak i u svaki standard unosi
stalna koliina litija. Omjeri izlaznih signala izmeu natrijskih i litij skih, te kalijskih i litij
skih signala slue kao analitiki parametri. Takav sustav pridonosi poboljanju tonosti, jer
veina analitikih varijabla, kao to su temperatura plamena, brzina protoka goriva i
pozadinsko zraenje, utjee na isti nain na intenzitete triju linija. Pritom, oito, litij ne smije
biti prisutan u uzorku.
Automatizirani plameni fotometri
U tim se instrumentima uzorci sekvencijalno uzimaju s okrugloga pominog stolia,
dijaliziraju radi uklanjanja bjelanevina i estica, razrjeuju litijskim unutranjim standardom
te raspruju u plamen. Badarenje se izvodi automatski nakon svakih devet uzoraka.
Interferencije
Interferencije se u plamenoj emisijskoj spektroskopiji pojavljuju zbog istih razloga zbog
kojih i u atomskim apsorpcijskim metodama; potekoe kojima su one uzrok mijenjaju se
ovisno o svakom pojedinanom primje Analitike tehnike
Analitike tehnike u plamenoj emisijskoj spektroskopiji sline su onima opisanima u
atomskoj apsorpcijskoj spektroskopiji. Primjenjuju se i badame krivulje i metoda dodatka
standarda. Usto se moe upotrijebiti unutranji standard za kompenzaciju varijabla plamena.
6A. ATOMSKE APSORPCIJSKE METODE S ELEKTRO PLINSKIM ATOMIZATORIMA
Dva su razloga zbog kojih atomizacija u plamenu nije osobito uinkovita.
Prvo, veliki dio uzorka ili odlazi u otpad (laminarni plamenici) ili nije potpuno
atomiziran (turbulentni plamenici).
Drugo, vrijeme prebivanja pojedinanih atoma u optikom putu plamena vrlo je
kratko (~10-4 s).
Elektrotoplinski atomizatori, koji su se pojavili na tritu ranih sedamdesetih godina,

openito osiguravaju poveanu osjetljivost jer se itav uzorak atomizira u kratku vremenu, a
prosjeno vrijeme prebivanja atoma u optikom putu je 1 sekunda ili ak vie.
Osim atomizatora, oprema potrebna za elektrotoplinsku analizu jednaka je onoj u plamenim
apsorpcijskim metodama. Veina suvremenih instrumenata napravljena je tako daje zamjena
jednog tipa atomizatora drugime vrlo jednostavna.
U elektrotoplinskom atomizatora nekoliko se mikrolitara uzorka najprije upari pri niim
temperaturama, a tada spali pri neto vioj temperaturi u elektriki grijanoj cijevi ili aici
(najee nainjenoj od ugljika). Nakon spaljivanja, struja naglo jaa do nekoliko stotina
ampera, to uzrokuje povienje temperature do priblino 2 000 ili 3 000 C; atomizacija
uzorka dogodi se u vremenu od nekoliko milisekundi do nekoliko sekundi. Apsorbancija
atomiziranih estica odreuje se u podruju neposredno iznad zagrijana vodia.
65
dr. Sejit Bobar
Slika 34a. presjek je elektrotoplinskog atomizatora koji se smjeta ispred ulazne pukotine
monohromatora. Atomizacija se razvija u cilindrinoj grafitnoj cijevi otvorenoj na oba kraja,
te ima sredinju upljinu za unoenje uzorka mikro- pipetom. Grafitna cijev je duljine
otprilike 5 cm, a unutranji promjer joj je neto manji od 1 centimetra. Izmjenljiva grafitna
cijev dobro prilijee u par cilindrinih grafitnih elektrinih kontakata smjetenih na svakom
kraju cijevi. Ti se kontakti nalaze u metalnom kuitu hlaenome vodom. Postoje dvije struje
inertnog plina. Vanjska struja sprjeava ulazak zraka, a time i spaljivanje cijevi. Unutranja
struja ulazi kroz dva kraja cijevi, a izlazi kroz sredinji otvor za uzorak. Ta struja takoer
iskljuuje zrak, ali slui i za odnoenje para koje proizvodi matrica uzorka pri prva dva
stupnja zagrijavanja.
Slika 34b. prikazuje takozvani L'vovljev podloak, koji se esto upotrebljava u grafitnim
peima prikazanima slikom 34a. Podloak je takoer grafitni, a smjeten je ispod otvora za
unoenje uzorka. Uzorak se na podloku upari ispali na uobiajeni nain. Meutim, pri naglu
povienju temperature cijevi atomizacija je u zakanjenju jer uzorak vie nije smjeten uza
stijenku pei. Posljedica toga je da se atomizacija pojavljuje u okruju u kojemu nema naglih
promjena temperature. Rezultat toga je reproducibilnost maksimuma.
Uz monohromator postavljen na valnu duljinu pri kojoj nastaje apsorpcija, izlazni signal
detektora za vrijeme elektrotoplinske atomizacije dostie svoj maksimum nakon nekoliko
sekundi spaljivanja, a tada se naglo smanjuje jer produkti atomizacije bjee u okoli.
Promjena je vrlo brza (esto < 1 s) i zahtijeva primjenu pisaa velikih brzina ili pak
kompjutorsku obradu podataka. Kvantitativna se analiza temelji na visini maksimuma, iako je
u tu svrhu primjenjiva i povrina maksimuma.
Slika 34. a) Presjek grafitne pei, b) L-vovljev podloak i njegov poloaj u grafitnoj pei
66
dr. Sejit Bobar
7A. SPEKTRI NA BAZI PLAZME

U poslijednje vrijeme se kao izvor pobude sve ee koristi induktivno spregnuta plazma ili
skraeno ICP (Inductively Coupled Plasma). Plazma-atomizatori pokazuju neke prednosti u
odnosu na plamene atomizatore. Atomizacija u plazmi primjenjiva je za toplinsku emisiju i
fluorescentsku spektroskopiju. Plazma je vodljiva gasna smjesa koja sadri znatnu koliinu
katjona i elektrona. To je bezelektrodna argonska (rjee nitrogenska) plazma koja radi na
atmosferskom pritisku, a odrava se induktivnim sprezanjem sa radiofrekventnim
elektromagnetnim poljem. Plazmenik ICP se satoji od tri koncentrine cijevi
Kroz untranju cijev se uvodi uzorak, najee u obliku rastvora koji se prevodi u fini
aerosol pomou struje argona
Argon za formiranje plazme uvodi se kroz srednju cijev dok se termika izolacija
(neophodna da bi se izbjeglo topljenje kvarcne cijevi) postie tangencijonalnim
uvoenjem struje argona kroz spoljanju cijev gorionika
Ova struja hladi zidove kvarcne cijevi ali takoe i stabilizuje i centrira plazmu
Oko spoljanje kvarcne cijevi je radiofrekfentna indukciona navojnica vezana za

radiofekventni generator najee frekvencije 27 MHz i snage 1-3 Kw. Argon na poetku
nema jona i jonizacija protoka argona zapoinje iskrom iz Tesline navojnice i nastali joni i
elektroni dolaze u interakciju sa promjenjivim magnetnim poljem. Ta interakcija uzrokuje
prstenasto kretanje jona i elektrona u navojnici pri emu se kao posljedica otpora tom
kretanju javlja omski otpor zagrijavanje. Tempratura plazme varira od 6000 do 10000 K i
opada sa visinom iznad indukcione navojnice tako da se za svako odreivanje moe odabrati
pogodna visina na kojoj e se izvoditi odreivanje.
Plazmenik-Gorionik :1- navoji, 2-Ar sa uzorkom, 3-Ar za obrazovanje plazme, 4- Ar

hlaenje
67
dr. Sejit Bobar
Zbog visokih temperatura u ICP izvorima dobijaju se dosta sloeni spektri

Razlikujemo nekoliko zona:
zona prethodnog zagrijavanja,

poetna zona pranjenja sa intenzivnom atomskom emisijom,
normalna analitika zona koja se nalazi 15-20 mm iznad indukcionog kalema a
eksitaciona temperatura u njoj je oko 6500 K
U ovoj zoni je jako smanjen intenzitet kontinualnog zraenja tako da plazma nije vie
transparentna i u njoj nastaje glavna jonska emisija. Iznad ove zone temperatura u plazmenoj
baklji opada i javlja se atomska i molekulska emisija.
Plazma izvori imaju nekoliko prednosti:
Atomizacija nastaje u hemijski inertnoj sredini to produava vrijeme ivota uzorka
Nasuprot plamenim izvorima, temperaturski presjek plazme je relativno jednolian
Kalibracione krive su uglavnom linearne za nekoliko redova opsega koncentracija
Argonska plazma jednosmjernom strujom
Sapnica plazma-izvor sastoji se iz tri elektrode smjetene u obliku obrnute Ykonstrukcije
Grafitna anoda je smjetena u svakom kraku Y, a volframova katoda u obrnutoj bazi
Argon protie kroz dva anodna bloka prema katodi
Plazma sapnica se formira kada se katoda dovede u trenutni dodir sa anodom.
68
dr. Sejit Bobar
Dolazi do jonizacije argona i razvijena struja (oko 14 A) generie dodatne jone, ime
se beskonano podrava
Temperatura iznosi priblino 10 000 K, a oko 5 000 K u vidljivom podruju
Uzorak se raspruje u podruje izmeu dva kraka Y, gdje se pobuuje i gdje se

posmatra njegov spektar
Spektri koji nastaju plazma-sapnicom imaju manje linija od onih koje nastaju ICP, a
linije potiu uglavnom od atoma, a ne od jona
Osjetljivosti dobijene palzma-sapnicom proteu se od vrijednosti koje su znatno nie

od ICP pa do vrijednosti priblino istog reda kao i kod ICP
Za plazmu sa jednosmjernom strujom potrebno je mnogo manje argona, a spoljanji

ureaji za napajenje su jednostavniji i jeftiniji
Reproducibilnost je priblina ICP, ali se grafitne elektrode moraju mjenjati svakih

nekoliko sati, dok ICP ne zahtjeva nikakvo odravanje
8A. TURBIDIMETRIJA I NEFELOMETRIJA

Turbidimetrija i nefelometrija su metode kojima se odreuje koncentracija estica u
suspenzijama. Zasniva se na elastinom rasprivanju elektromagnetnog zraenja na
suspendiranim esticama u rastvorima. Mjeri se smanjenje jaine (intenziteta) prolaznog
zraenja ili jaine rasprenog zraenja kao posljedicu interakcije sa esticama. Rasprivanje
elektromagnetnog zraenja na suspendiranim esticama esto se naziva i Tyndallov efekat
Ako je dimenzija estica reda veliine valne duine upadnog zraenja ili manja,
zraenje e se rasprivati, a ako je vea doi e do refleksije
Optimalna veliina estica za rasprenje je od 100 do 1000 nm, dakle veliina

koloidnih estica
69
dr. Sejit Bobar
U sudaru sa molekulom, svjetlost indukuje dipolni momenat
Dipol osciluje istom frekvencijom kao i upadna svjetlost
Dipol postaje sekundarni izvor i reemituje upadnu svjetlost u svim pravcima
Upadna i rasuta svjetlost imaju istu talasnu duinu
Kod turbidimetrijskih mjerenja pravolinijski usmjereno zraenje prolazi iz izvora kroz

rastvor uzorka do detektora, a mjeri se smanjenje intenziteta prolaznog zraenja.
Turbidimetrijski se odreuje mutnoa rastvora ili koncentracija u sistemima u kojima
je prisutan talog koji se teko filtrira zbog malih estica ili elatinozne prirode.
Turbidimetrija esto zamjenjuje dugotrajno gravimetrijsko odreivanje. U
turbidimetriji se mjeri prenos (transmitancija) primarne zrake
T = I/I0
gdje je: I0 - jaina (intenzitet) ulaznog zraenja nakon prolaska kroz slijepu probu
I - jaina zraenja nakon prolaska kroz uzorak
Proputeno zraenje je proporcionalno koncentraciji suspendirane tvari prema izrazu koji je

analogan Beerovom zakonu:
S = log I / I0 = kbc
gdje je: S - zamuenje
k - konstanta proporcionalnosti nazvana koeficijentom zamuenja
b - duina puta kroz uzorak
c koncentracija rastvora
Mjerni instrumenti koji se koriste u turbidimetriji su vrlo slini spektrometrima za

ultravioletno podruje, a mogu se koristiti i obini kolorimetri. Kroz obojene suspenzije
70
dr. Sejit Bobar
proputa se zraenje iste boje (monohromatsko svjetlo), zbog smanjenja apsorpcije. Izvori
zraenja su ivina ili volframova lampa s filterima za izbor samo jedne valne duine
Monohromatsko svijetlo je nuno kod turbidimetrijskih odreivanja da se smanji efekat
apsorpcije elektromagnetnog zraenja na esticama, te da je smanjenje jaine posljedica
uglavnom rasprenja (prividna apsorpcija). Detektori u turbidimetriji su, kao i u
spektrofotometriji. Kivete za tekue uzorke u turbidimetriji su iste kao i za
spektrofotometrijska odreivanja.
U nefelometriji se mjeri jaina (intenzitet) rasprenog zraenja na koloidnim esticama pod

uglom, uglavnom od 90, na smjer poetnog (inicijalnog) zraka svjetlosti
Intenzitet rasprenog zraenja proporcionalan je zamuenju rastvora
Instrumenti za nefelometrijska mjerenja su posebni instrumenti s vrlo stabilnim

izvorima zraenja sa okruglim kivetama
Nefelometrijska mjerenja su pogodna za analizu rastvora slabog zamuenja
Sistemi se, ukoliko se odreuje zamuenje, kalibriu sa suspenzijama formazina

(polimerni spoj, primarni standard za kalibraciju) ili sa sekundarnim standardima
koji mogu biti stakleni tapovi razliitog stepena neprozirnosti i na taj nain
simuliraju zamuene sisteme
Suspenzije formazina su po boji sline mlijeku, meutim, za formazin postoji

vjerovatnoa da je kancerogen
Jedinice u kojima se izraava zamuenje su NTU (engl. Nephelometric Turbidity Units),

FTU (engl. Formazine Turbidity Units) ukoliko se mjeri nefelometrijski, a FAU (engl.
Formazine Attenuation Units) ako se mjeri smanjenje intenziteta u prolaznom zraenju
turbidimetrijski. Svi propisi i standardi za vodene ekosisteme trae nefelometrijska
71
dr. Sejit Bobar
odreivanja i rezultate daje u NTU jedinicama. U literaturi postoje podaci da1 NTU odgovara
ekvivalentu od 1 g/l suspendiranog silicijevog dioksida SiO2 u istoj vodi
5NTU
9A.
50 NTU
500 NTU
HROMATOGRAFIJA
Hromatografija ( od grkog chroma-boja i graphein-pisati ) je naziv za skup laboratorijskih

tehnika za razdvajanje smjesa. Ona ukljuuje kretanje ispitivane smjese rastvorene u
mobilnoj fazi , kroz stacionarnu fazu , ime se dijelovi smjese razdvajaju i izoluju, te
ih je mogue analizirati i kvantitativno odrediti.
Hromatografija moe biti analitika i preparativna. Preparativna hromatografija se bavi
razdvajanjem komponenti iz smjese radi dalje obrade, te se moe smatrati metodom
preiavanja. U analitikoj hromatografiji se obino radi sa malim uzorcima te se pokuava
izmijeniti relativni omjer komponenti u smjesi. Hromatografija je jedna od vodeih
analitikih metoda i omoguava razdvajanje i kvantitativno odreivanje supstanci veoma
sline strukture i hemijskih osobina. Pod hromatografijom se podrazumjevaju metode
razdvajanja koje se zasnivaju na razliitoj raspodjeli komponenata uzorka izmeu dvije faze,
od kojih je jedna nepokretna ( stacionarna ), a druga pokretna ( mobilna ) u odnosu na prvu.
Prvu hromatografsku tehniku je pronaao ruski botaniar Mihail Semjonovi Cvet
1900.godine tokom svog istraivanja hlorofila. Koristio je staklenu kolonu koja je sadravala
kalcijum karbonat da bi razdvojio biljne pigmente. Ovu metodu je opisao 30.decembra
1901.godine na 11.Kongresu naturalista i doktora u Sankt Petersburgu. Zanimljivo je da je
njegovo prezime Isvet na ruskom jeziku znai boja, tako da je mogue da je hromatografiju
nazvao prema svome prezimenu. Godine 1951. britanski naunici Arer Don Porter Martin i
72
dr. Sejit Bobar
Riard Lorens Milington Sing su dobili Nobelovu nagradu za hemiju za svoje otkrie
particione hromatografije. Od tada, razvoj hromatografije je bri. Naunici su otkrili da se
principi Cvetove hromatografije mogu primjeniti na razne naine i varijante.
U isto vrijeme, poboljane su i unaprijeene tehnike performanse hromatografije,
omoguavajui razdvajanje veoma slinih molekula.
PODJELA HROMATOGRAFSKIH METODA

Supstance koje se nalaze u prirodi,kao produkti sinteza, najee se javljaju u kompleksnim
smjesama. Klasine metode odjeljivanja ( kristalizacija, sublimacija, ekstrakcija, destilacija i
dr. ) samo donekle mogu rijeiti problem odjeljivanja individualnih komponenti iz smjese.
Veina smjesa organskih spojeva je sloena zbog velikog broja spojeva koji esto imaju
sline fizikalno hemijske osobine. Mnogi od njih imaju sline ili ak iste molekulske formule,
pa mogu biti konstituivni izomeri ili stereoizomeri. Zbog svega navedenog odjeljivanje
komponenti iz smjese moe predstavljati ozbiljan problem. razdvajanje antibiotika, vitamina,
hormona, polipeptida, alkaloida i drugih srodnih spojeva rijeeno je upotrebom
hromatografije.
Hromatografija je metoda odjeljivanja kojom se komponente razdjeljuju izmeu dvije faze ;
jedna je stacionarna s velikom povrinom, a druga je mobilna. Stacionarna faza moe biti
vrsta supstanca ili kapljevina, a mobilna kapljevina ili gas. Mobilna faza putuje preko ili
uzdu stacionarne faze uticajem kapilarnih sila, sile tee, razlike pritiska ...
Hromatografski proces se temelji na uspostavljanju dinamike ravnotee nekog spoja izmeu
stacionarne i mobilne faze. U stacionarnoj fazi nalazi se dio supstance koji je u ravnotei s
dijelom u mobilnoj fazi . Zbog gibanja mobilne faze naruava se ravnotea i molekule putuju
u smjeru gibanja mobilne faze. Zbog specifine interakcije razliitih spojeva sa stacionarnom
i mobilnom fazom, razliiti spojevi putuju razliitim brzinama i tako se odjeljuju. Sam proces
odjeljivanja zasniva se na sljedeim naelima: adsorpciji, razdjeljenju, difuziji, ionskoj
izmjeni, kiralnosti i dr. Velika mo razluivanja hromatografskih metoda zasniva se na
pojavi uzastopnog pojavljivanja primarnog postupka razdjeljivanja neke tvari izmeu
mobilne i stacionarne faze.
S obzirom da se uspostavljanje ravnotee neprestano ponavlja, male razlike u razdjeljivanju
izmeu stacionarne i mobilne faze dovode do dobrog odjeljivanja supstanci. Na uspjenost
73
dr. Sejit Bobar
hromatografije ( osim prirode supstanci, mobilne i stacionarne faze ) utiu : brzina mobilne
faze , temperatura sistema, omjer mase supstance koja se odjeljuje i stacionarne faze, veliina
i oblik estica sorbensa ( stacionarna faza ) i.t.d.
Hromatografske metode je mogue podijeliti prema razliitim kriterijima: prema fizikom
stanju faza, prema mehanizmu razdvajanja i.t.d.
Podjela prema fizikom stanju faza
TENA HROMATOGRAFIJA :
Adsorpciona ( teno / vrsto ), npr. TLC, HPLC
Ionska
Ekskluziona
Particiona ( teno /teno )
GASNA HROMATOGRAFIJA :
Gas/teno
Gas/vrsto
SUPERKRITINA FLUIDNA HROMATOGRAFIJA
Podjela prema obliku sistema
KOLONSKA HROMATOGRAFIJA
PLANARNA HROMATOGRAFIJA, NPR. TLC
Podjela prema mehanizmu razdvajanja
IONOIZMJENJIVAKA ( IONSKA ) HROMATOGRAFIJA
EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA
TEHNIKE
GASNA HROMATOGRAFIJA
TENA HROMATOGRAFIJA
IONOIZMJENJIVAKA HROMATOGRAFIJA
TANKOSLOJNA HROMATOGRAFIJA
EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA
SUPERKRITINA FLUIDNA HROMATOGRAFIJA
74
dr. Sejit Bobar
9.A-1. GASNA HROMATOGRAFIJA

Pod gasnom hromatografijom podrazumjevamo sve hromatografske metode u kojima je
mobilna faza gas.
Zavisno od stacionarne faze, razlikujemo:
- Gasno-tenu hromatografiju/Gas-liquid chromatography (GLC) ;
- Gasno-vrstu hromatografiju/Gas-solid chromatography (GSC).
Gasna hromatografija se primjenjuje za analizu gasovitih jedinjenja ili jedinjenja koja mogu
lako isprati na radnoj temperaturi kolone (do 300o ili neto vie), a da pri tome ne doe do
njihove razgradnje. Broj takvih jedinjenja je vrlo velik ( mnoge masne kiseline, alkoholi,
aldehidi, amini, estri, etri, ketoni, ugljovodonici, halogenirani ugljovodonici, fenoli,
sumporna jedinjenja, metalni kompleksi, interni gasovi itd...), pa je gasna hromatografija
vjerovatno najvie primjenjivani oblik hromatografije prilikom analize niza prirodnih i
umjetnih spojeva. Kod nekih analiza samo visokoefikasna tena hromatografija (HPLC)
konkurie gasnoj hromatografiji, mada je ispravnije rei da ove dvije metode dopunjuju jedan
drugu.Neke od prednosti gasne hromatografije proizilaze iz koritenja gasa kao mobilne faze.
Gasovi, naime, u poreenju s tenostima imaju malu viskoznost, to omoguuje koritenje
drugih hromatografskih kolona, kao i postizanje velike brzine mobilne faze uz umjerene
pritiske. Pored toga, koeficijent difuzije u gasovima su znatno vei nego u tenostima, pa je
optimalna brzina gasovite mobilne faze ( u smislu irenja hromatografskih pikova) dosta
visoka, tako da se razdvajanje i analiza mogu izvesti vrlo brzo ( za nekoliko minuta, a nekad i
sekundi).
U osnovnoj raspodjeli kod gas-vrste hromatografije jeste adsorpcija gasovith supstanci na
povrini vrste stacionarne faze. Stacionarna faza je adsorbens velike specifine povrine,
kao to su silikagel, aktivni ugalj i sl., ali se najvie primjenjuju tzv. molekularna sita i neki
porozni polimeri. Adsorpciona (gas-vrsta) hromatografija se naroito koristi pri razdvajanju
komponenti koje se ne zadravaju u kolonama s tenom stacionarnom fazom, a takvi su npr.
mnogi neorganski gasovi.
9A-2. OSNOVNI PRINCIPI GASNO-TENE HROMATOGRAFIJE

Gasno tena hromatografija je tehnika sa najveom primjenom za odjeljivanje i kvantitativno
odreivanje veine sloenih smjesa. Stacionarna faza je u gasno tekuinskoj hromatografiji je
tekuina nanesena na povrinu vrstog nosaa adsorpcijom ili hemijskim vezanjem. Brzinu
prolaza analita kroz kolonu odreuje njegov omjer raspodjele izmeu pokretne gasovite faze i
imobilizirane tene faze. Kod gas-tene hromatografije iz rezervoara pod pritiskom prolazi
kroz kolonu i kroz cijeli sistem konstantnom brzinom. Uzorak koji se analizira unosi se u
specijalnu komoru ispred kolone ili u kolonu direktno. Temperatura komore ili kolone u koju
75
dr. Sejit Bobar
se uzorak unosi mora biti konstantna i dovoljno visoka da teni uzorak potpuno ispari i da
njegove komponente itavo vrijeme analize ostanu u parnom stanju. Gas nosa nosi isparene
komponente uzorka kroz kolonu, gdje se zbog razliite rastvorljivosti u tenoj stacionarnoj
fazi komponente razliito raspodjeljuju izmeu dvije faze i kroz kolonu kreu razliitom
brzinom, a njihov izlazak iz kolone se automatski registruje odgovarajuim detektorom.
Svaki dio gasnog hromatograma utie na efikasnost sistema ali posebno mjesto zauzimaju
kolone i detektori.
Detektor registruje prisustvo supstanci, a automatski ureaj biljei rezultate u obliku gasnog
hromatograma koji predstavlja odziv detektora u funkciji vremena ili volumena dodane
mobilne faze. Kada su u gasnoj fazi, komponente uzorka se kreu prema izlazu iz kolone ali
ih stacionarna faza relativno usporava. Otuda komponente smjese prolaze kroz kolonu
razliitim brzinama i iz kolone izlaze u razliito vrijeme. Vrijeme prolaska kroz kolonu jako
adsorbovanih ili rastvorenih komponenti moe se skratiti povienjem temperature kolone.
Povienjem temperature kolone pojaava se desorpcija odnosno isparavanje odgovaajuih
komponenti tako da se na taj nain smanjuje vrijeme eluiranja.
Vrijeme zadravanja ili retenciono vrijeme, tR predstavlja karakteristinu velinu za
svaku izeluiranu komponentu smjese. Vrijeme zadravanja je vremenski period od momenta
injiciranja uzorka do momenta kada je pik ispitivane supstance dostigao maksimum. Ova
velina se koristi za identifikaciju pojedinih komponenti uzorka, ali na nju utiu mrtvi
volumen u koloni i gasni volumeni u hromatografskoj koloni, pa je mnogo bolje koristiti tzv.
reducirano vrijeme zadravanja, t'R, koje predstavlja vrijeme koje eluirana supstanca
provede u stacionarnoj fazi. Reducirano vrijeme zadravanja se dobije kada se od vremena
zadravanja, tR, odreene supstance oduzme vrijeme zadravanja tzv.nezadrivog uzorka tM.
Vrijeme koje je potrebno da supstanca koja se ne zadrava na koloni proe kroz kolonu
ponekad se zove mrtvo vrijeme. Osim vremena zadravanja i reduciranog vremena
zadravanja kao mjerilo za identifikaciju supstanci u gasnoj hromatografiji se koriste i
volumen zadravnja, VR, odnosno reducirani volumen zadravnja, VR. Ove veliine su
ponekad bolje za identifikaciju supstanci, jer uzimaju u obzir efekte pritiska i temperature u
gasnoj hromatografiji. Volumen zadravanja predstavlja produkt vremena zadravanja i
brzine protoka gasa nosaa.
Na slici 35. su prikazani karakteristini podaci jednog hromatograma koji sadri pik inertne
supstance koja se nije zadrala na koloni (A) i pik supstanci koja se zadtala na koloni (B). Sa
W je oznaena irina pika na baznoj liniji, a sa Wh je oznaena irina pika na polovini visine
pika.
76
dr. Sejit Bobar
Slik 35. Gasni hromatogram sa oznakom tR vrijeme zadravanja, t*R reducirano

vrijeme zadravanja, tM vrijeme zadravanja uzorka koji se ne zadrava ,Wb irina pika
na baznoj liniji, Wh irina pika na polovini visine
Najvaniji dio gasno hromatografskog sistema predstavlja hromatografska kolona na kojoj
se odvija proces razdvajanja supstanci.
Efikasnost razdvajanja za pojedinu vrste kolone zavisi od vie faktora a to su:
1.Broj teoretskih tavana (N) koji je definisan izrazom:
= 5,54 (
N=16
)2
2.Visina ekvivalentna teoretskom tavanu (H) predstavlja suinu koja odgovara jednom
teoretskom tavanu i moe se izraunati iz duine kolone (L) i broja teoretskih tavana (N):
H= L/N
3.Koeficijent selektivnosti ili koeficijent separacije () neke hromatografske kolone za dva
analita A i B definie se :
(
=KB/KA=kB/kA= (
=(
)!/(
)#
gdje je KB omjer raspodjele za snanije zadrani analit, a KA omjer raspodjele za slabije

zadrani analit, odnosno bre eluirani analit. k'A i k'B su faktori kapaciteta za analit A i B.
Prema toj definiciji uvijek vei od jedinice. Koeficijent selektivnosti se moe izraunati iz
hromatograma.
4.Razdvajanje kolone ili faktora rezolucije (R) je kvantitativna mjera kojom se izraava
sposbnost razdvajnja dva analita na toj koloni, odnosno razdvajanje predstavlja vrijednost
koja pokazuje koliko su dva susjedna pika razdvojena. Vanost tog izraza prikazuje slika 36.
sa dva hromatograma za sastojke A i B na tri kolone razlite moi razdvajanja. Razdvajanje
svake kolone definisano je izrazom:
R=
$&
'
$[(
'
) ]
77
dr. Sejit Bobar
U hromatografiji postoji mnogo razliitih veliina, izraza i odnosa koji ponekad mogu
stvarati zabune. Pregled najvanijih definicija i jednaina koje se koriste u hromatografiji dat
je u Tabeli 1. i Tabeli 2.
Tabela 1. Vane eksperimentalne hromatografske veliine i odnosi
78
dr. Sejit Bobar
Tabela 2. Vane izraunate veliine i odnosi
9A-3 UREAJI ZA GASNO-TENU HROMATOGRAFIJU

Na slici su prikazane osnovne komponente gasnog hromatograma sa sistemom za detekciju
zasnovanom na mjerenju promjene osobine gasa nosaa u prisustvu molekula analita zbog
ega se koristi razvodnik gasa nosaa prije ulaska u kolonu.
79
dr. Sejit Bobar
Slika 36. Shematski prikaz gasnog hromatografa
9A-4. Gas nosa

Gas nosa nosi uzorak kroz kolonu do detektorskog sistema. Gas nosa ne smije uticati
detektorski sistem, mora biti vrlo velikog stepena istoe jer i najmanje neistoe mogu
dovesti u pitanje tanost analize. Izbor gasa nosaa zavisi od izbora detektorskog sistema.
Najee se kao gasovi nosai koristi hidrogen, nitrogen, helijum, argon, ili smjese argonmetan i drugi.
Kada se upotrebljava detektor toplotne provodljivosti, kao gas nosa se koristi helijum ili
hidrogen jer ovi gasovi imaju najbolju toplotnu provodljivost.
Kod plamenjonizacionog detektora mogu se kao gasovi nosai sa podjenakom efikasnou
upotrijebiti nitrogen, helijum ili argon.
Za elektron apsorbirajui detektor najpodesniji gas nosa je nitrogen, pod uslovom da ne
sadri tragove oksigena.
Pri izboru gasa nosaa vodi se posebno raun o njegovom stepenu istoe, kao i drugim
osobinama od kojih zavisi brzina i efikasnost razdvajanja. Brzina analize i vrijeme
zadravanja supstance u koloni zavise od brzine protoka gasa nosaa kroz kolonu, kao i
difuziju uzoraka u gasu nosau.
9A-5.Sistem unoenje uzoraka

Gasnom hromatografijom mogu se razdvajati uzorci u sva tri agregatna stanja. Gasoviti
uzorci unose se u hromatografsku kolonu pomou specijalnih gasnih kiveta odreene
zapremine.
Teni uzorci i rastvori unose se pomou injekcionih prica raznog volumena, i to najee od
1, 10 ili 100 l. Prikaz injekcione price imamo na slici 37.
80
dr. Sejit Bobar
Slika 37. Prikaz injekcione price

Za rastvaranje vrstih uzoraka koriste se lahko isparljivi rastvarai kao etar, hloroform,
benzen, alkohol, nekad i voda. vrsti uzorci se mogu direktno unositi u sistem injiciranja uz
upotrebu tehnike kapsule. vrsta supstanca se unese u metalnu kapsulu, kapsula se zatvori i
ubaci u dio za unoenje uzoraka pomou posebnog dodatnog sistema. Zatim se probui tako
da gas nosa istjera supstancu iz kapsule i unese u kolonu. Ovaj dio se posebno zagrijava da
supstanca pree u gasovito stanje. Kolina uzorka koji se aplicira zavisi od dimenzije kolone,
osjetljivosti detektora i koncentracije supstance u uzorak. S obzirom na to da su detektori vrlo
osjetljivi dovoljna je kolina supstance od 10-10 do 10-15g u volumenu od 1-5l.
Bolja reproduktivnost veliine uzorka i za tene i za gasovite uzorke se pri kvantitativnom
odreivanju postie ako se uzorak u kolonu unosi pomou rotirajuih ventila odreenog
volumena. Sa ovim ureajem greke nastale zbog veliine uzorka mogu biti smanjene od
0,5% do 2% relativno.
Slika 38. Sistem za direktno unoenje uzorka u punjene kolone
81
dr. Sejit Bobar
Izbor kolone
U gasnoj hromatografiji obino se upotrebljavaju dva tipa kolona i to:
- punjene kolone,
- kapilarne kolone
Najee se upotrebljava punjene kolone. Pri formiranju hromatografske kolone mora se
pravilno izabrati vrsta vrstog nosaa, zatim vrsta i kolina tene nepokretne faze, dimenzije
kolone i materijal od koga je napravljena kolona.
Kolone mogu biti napravljene od raznog materijala, kao to su: aluminijum, nehrajui elik,
bakar i staklo. Staklo i nehrajui elik se najee upotrebljavaju. Staklene kolone su
podesne za razdvajanje nestabilnih supstanci kao to su stereoidni hormoni, koji se mogu u
procesu hromatografiranja razlagati u kontaktu sa metalima. U navedenoj Tabeli 3 data su
svojstva i osobine tipine gasno hromatografske kolone.
Vrsta hromatografske kolone
FSTO*
WCOT**
SCOT***
Punjene
Duina m
10-100
10-100
10-100
1-6
Unutranji
prenik mm
0,1-0,3
0,25-0,75
0,5
2-4
Dejstvo,tavan/m
2000-4000
1000-4000
600-1200
500-1000
Kolina
uzorka,ng
10-75
10-1000
10-1000
10-106
Relativni
pritisak
nizak
nizak
nizak
visok
Relativna
brzina
brzo
brzo
brzo
sporo
Hemijska
inertnost
najvea
Fleksibilnost
da
najmanja
ne
ne
ne
Tabela 3. Svojstva i osobine tipicne gasno hromatografske kolone

Punjene kolone koje se koriste u analitike svrhe obino su dimenzije od 1-3 m, a
unutranjeg promjera 3 ili 6 mm izgraene su od staklenih , metalnih ili teflonskih cijevi. U
njih se stavlja jednolino, sitnozrnasto punilo ili vrsti nosa na koji je nanesen tanki sloj
stacionarne tene faze. vrsti nosa u punjenoj koloni nosi tenu stacionarnu fazu.
Stacionarna faza se nanosi tako da to je mogue vea povrina te faze bude u dodiru sa
mobilnom fazom.
82
dr. Sejit Bobar
Kapilarne kolone su duine 10-50m, unutranjeg promjera oko 0,25mm. Postoje dvije vrste
kapilarnih kolona. Jedna vrsta su cijevi kod kojih je unutranja stijenka prevuena tankim
slojem stacionarne faze koje nazivamo kapilarnim kolonama. Drugu vrstu ine mikro punjene
kolone koje su takoer kapilarnih dimenzija ali je unutranja stijenka prevuena punilom
poput dijatomejske zemlje na kojoj je nanesena stacionarna faza.Ovaj tip kapilarne kolone
sadri nekoliko puta veu koliinu stacionarne faze od predhodnih kolona pa zato imaju vei
kapacitet za uzorak. Na Slici 39 dati su hromatogrami dobijeni primjenom kapilarne kolone.
Slika 39.Tipicni hromatogrami dobijeni primjenom kapilarne kolone sa: a)

polidimetoksiloksanom, b) 5 % fenil polidimetoksiloksanom, c) polietilen glikolom, f)
50% cijanopropilpolidimetioksanom
Punilo za kolone
U gasnoj hromatografiji gdje se vri raspodjela, punilo kolone je neisparljiva tenost (tena
faza), nanesena na vrsti nosa. Kao nosa najee se koristi specijalno prireena
dijatomejska zemlja, teflon, staklene kuglice, aluminijum-oksid, aktivni ugalj i silikagel.
Aluminijum-oksid i aktivni ugalj najee se koriste kod gasno-vrste hromatografije. Gore
nabrojani materijali posebno obraeni i odreenih dimenzija estica dolaze u promet pod
razlitim imenima kao: Chromosorb G, Chromosord W, Celit i drugi. Kao nosai koriste se i
razni polimeri etilvinilbenzen, stiren, divinilbenzen, sa komercijalnim oznakama kao Poropak
Q ili Poropak R, S, T. Prije nanoenja nepokretne tene faze, vrsti nosa se moe pripremiti
obradom sa kiselinom, bazama ili reagensima za siliniziranje.
83
dr. Sejit Bobar
vrsti nosa ne smije utjecati na preraspodjelu. Nosa mora biti inertan, dovoljno kompaktan
da se ne raspada prilikom obrade i punjenja kolone, sa to veom aktivnom povrinom da na
sebe moe vezati veu kolinu tene faze i mora imati uniformnu velinu estica.
Dimenzije zrna nosaa- kao to prikazuje Slika 40 dejstvo gasno - hromatografske kolone
naglo se poveava sa smanjenjem prenika zrna punjenja. Razlika u pritisku koja odrava
zadati protok poveava se sa kvadratom prenika zrna. Zbog te razlike postoji donja razlika
prenika zrna. Razlika u pritisku vea od 3,5 x 105 Pa pa nije pogodan za rad u gasnohromatografskoj koloni. Optimalni prenici zrna punjenja su prema tome 170 do 250m.
H=B/u + Csu + Cmu (1)
Jednaina 1 za izraunavanje visine tavana moe se primjeniti za gasnu i za tenu
hromatografiju. Longitudinalna difuzija iz te jednaine ima vei uticaj kad je mobilna faza
gas, jer su brzine difuzije u gasovima 104 puta vee od onih u tenostima. Zbog toga je
minimum u dijagramu na kojem se prikazuje visina tavana u odnosu prema brzini protoka
mnogo iri u gasnoj hromatografiji nego u tenoj. To se takoe odnosi i na krive sa Slike 6 na
kojoj je pokazano kako smanjenje obima zrna punjenja poveava visinu tavana.
Slika 40. Uticaj veliine zrna na visinu tavana. Brojevi sa desne strane oznaavaju
precnik zrna
Nepokretna tena faza

Postoji irok izbor supstanci koje se koriste kao nepokretna tena faza. Ove supstance moraju
biti neisparljive na temperaturi na kojoj se vri hromatografiranje, hemijski stabilne, da ne
podlijee procesu oksidacije, dobro rastvorljive i da stvaraju fini omota oko
nosaa.Nepokretne faze se mogu podijeliti na nepolarne i polarne. Za hromatografiranje
nepolarnih supstanci izabere se i nepolarna tena faza, a za polarne supstance polarna
nepokretna faza. Formirana hromatografska kolona se smjesti u termostat koji se vrl brzo
moe podesiti na eljenu temperaturu u dosta irokom podruju od -70oC do 400oC.Kolona je
jednim krajem prikljuena na injekcioni sistem a drugim na dektorski sistem. Prije
hromatografiranja kolona se grije na odreenoj temperaturi 12 - 24 sata,uz protok samo gasa
nosaa. Ova operacija se zove kondicioniranje kolone ija je svrha da se iz kolone prije
hromatografiranja uklone razne neistoe. Hromatografija se moe provesti na odreenoj
84
dr. Sejit Bobar
ustaljenoj temperaturi ili se temperatura moe poveavati u odreenim vremenskim

razmacima.
U Tabeli 4 dat je primjer nekoliko uobiajnih stacionarnih faza za gasno tenu
hromatografiju.
Stacionarna faza
Uobiajno
trgovako ime
Maksimalna
temperatura C
Uobiajne
primjene
polidimetilsiloksan
OV-1
350
Neplarna
faza
opte namjene:
ugljovodonici,
polinuklearni
aromati, droge,
stereodi, PCB-i
350
Metalni
estri
masnih kiselina,
alkaloidi, droge,
halogena
jedinjenja
SE-30
5% fenilpolidimetilsiloksan
OV-3
SE-52
50% fenilpolidimetilsiloksan
OV-17
250
Droge, stereodi,
pesticidi, glikoli
50%
OV-210
200
Hlorirani
arommati,
nitroaromati,
alkilsupstituirani
benzeni
Carbowax
250
Slobodne
kiseline,
esencijlna
glikoli
trifluoropropilpolidimetilsiloksan
polietilenglikol
200M
50%
cijanopropilpolidimetilsiloksan
OV-275
240
etri,
ulja,
Nezasiene
masne kiseline,
kisele
smole,
slobodne
kiseline, alkoholi
Tabela 4. Nekoliko uobiajnih stacionarnih faza za gasno-tenu hromatografiju
Termostatiranje kolona
Za precizan rad potrebno je temperaturu kolone odravati u granicama nekoliko desetina
stepeni. Kolona je najee smjetena u termostatikom prostoru. Optimalna temperatura
85
dr. Sejit Bobar
kolone zavisi od vrenja uzorka i stepena traenog odvajanja. Pri temperaturi

jednakoj prosjenom vrenju uzorka ili neto vioj postie se prihvatljivo vrijeme eluacije
(od 2 do 30 minuta). Uzorke irokog raspona vrenja poeljno je analizirati uz
programiran porast temperature, tako da se temperatura kolone poveava
neprekidno ili promenljivo tokom o d v a j a n j a .
Slika 41c prikazuje dejstvo programiranog termostatiranja u pogled
poboljanja odvajanja. Uopteno optimalno odvajanje povezano je sa minimalnom
temperaturom. Meutim pri nioj temperaturi trajanje eluacije je due, a time i vrijeme
potrebno za analizu. Slike 41a i 41b pokazuju taj princip.
Slika 41.Uticaj temperature na gasne hromatograme a) izotermno na 45oC, b)

izotermno na 145oC,c) programirano na 30 180oC
9A-6. Detektori
U gasnoj hromatografiji se koristi oko 40 raznih detektora. U principu postoje dvije vrste
detektora i to:
86
dr. Sejit Bobar
a) detektori koji registruju razlike u fizikim karakteristikama izmeu samog gasa nosaa i
gasa nosaa kome je prisutan uzorak, kao to je sluaj kod detektora sa toplinskom
provodljivou,
b) detektori koji mjere samo svojstva uzoraka kao to je grupa detektora sa jonizirajuim
karakteristikama.
Detektor toplinske provodljivosti/Thermal Conductivity Detektor (TCD)
Detektor toplinske provodljivosti registruje prisustvo supstance u gasu naosau iz razlike u
toplinskoj provdljivosti u termalnoj niti, pri prolazu gasa nosaa i supstance i provodljivosti u
referentnoj ugrijanoj niti preko koje prolazi samo gas nosa. Temperatura i otpor uarene niti
zavisi o toplotnoj provodljivosti okolnog gasa. iani otpornici u mjernoj i referentnoj eliji
spojeni su sa otpornicima u Wheatstonov most, pa svaka razlika u provodljivosti gasova,
odnosno u otporu niti pokazuje otklon na registrirajuem instrumentu ili pisau. Velina
razlike u provodljivosti zavisi od prirode supstance u odnosu na gas nosa. Hidrogen
posjeduje toplotnu provodljivost bolju od svih gasova, ali ga je nekada nepodesno upotrijebiti
usljed njegove zapaljenosti. Kao gasovi nosai za detektor toplinske provodljivosti pogodan
je jer ne dolazi do razgradnje uzorka koji se na kraju kolone moe sakupiti. Detektor se
sastoji od metalne nitiuvijene u spiralu smjetenu u metalni cilindar preko koje prolazi gas.
Kada se supstanca nalazi u gasu nosau, temperatura gasa se mijenja i mijenja se
provodljivost niti. Na Slici 42 dat je prikaz detektora toplinske provodljivosti.
Slika 42. Detektor toplinske provodljivosti
Plamenojonizacioni detektor/Flame Ionistation Detektor (FID)

Kod plamenojonizacioni detektora supstanca koja izlazi iz kolone sa gasom nosaem mijea
se sa hidrogenom i vazduhom i sagorijeva u plamenu. Prilkom sagorijevanja supstance dolazi
do stvaranja jona i naglog protoka struje, to se registruje kao hromatografski signal u onom
momemtu kada je supstanca napustila kolonu. Kada iz kolone izlazi samo gas nosa, postoji
vrlo mali protok struje.
H2 + O2 + organska supstanca CO2 + H2O + e- + jon+ +jon e- +jon- struja
87
dr. Sejit Bobar
Plamenojonizacioni detektor je vrlo osjetljiv na sve organske supstance, a neosjetljiv na

neorganske gasove i vodu. Osjetljivost plamenojonizacioni detektora data formulom br. 2
S=
(2)
H - visina signala
Wh - irina signala na polovini visine
M - teina injiciranog uzorka koja odgovara dotinom signalu
Slika 43. Plamenojonizacioni detektor
Elektron-privlaei detektor /Elektron Capture detektor (ECD)

Elektron-privlaei detektor je posebna vrsta detektora koji se upotrebljava za supstance koje
sadre atome ili atomske grupe sa velikim afinitetom za elektrone, kao to su spojevi sa
halogenim elementima.
Elektron-privlaei detektor moe se predstaviti kao jedna komora kroz koju prolazi, kao gas
nosa, nitroge ili argon koji se podvrgava jonizaciji. Jonizacija se provodi sa nekim
radioizotopm kao Ni63 od 15 mCi ili H3. Pri prolazu gas nosaa, uspostavi se standardni
protok struje kroz detektor. Pri prolazu gasa nosaa sa uzorkom smanjuje se protok struje, i to
smanjenje se registruje kao signal.
88
dr. Sejit Bobar
Slika 44. Elektron- privlaei detektor
Sumpor heliuminiscentni detektor/Sulfur Chemiluminescence Detektor (SCD)

Sumpor-heliuminjscentni detektor se temelji na mjerenju inteziteta luminiscencije nastale kao
rezulatat reakcije nekih spojeva koji sadre sumpor i jakog oksidirajueg sredstva kao to je
fluor ili ozon. Intezitet luminiscencije je proporcionalan koncentraciji sumpora. Ovaj detektor
se naroito koristi za odreivanje polutanata kao to su merkaptani. Eulent iz kolone se
mijea sa vodonikom i vazduhom i sagorijeva kao kod plamenojonizacionog detektora.
Nastali gasovi se mijeaju sa ozonom i intezitet nastale emisije se mjeri.
Plamenofotometrijski detektor/Flame Photometric Detektor (FPD)
Plamenofotometrijski detektor se koristi kod gasne hromatografije organskih spojeva koji
sadre sumpor i fosfor. Pri hromatografiranju na izlazu iz kolone dolazi do sagorijevanja
supstance u plamenu i zavisno od prisustva fosfora ili sumpora, do emisije karkatristinog
zraenje. Ovo zraenje se selektira pomou odgovarajuih filtera i njegov intezitet registruje
fotoelija.
Slika 45. Plamenofotometrijski detektor
89
dr. Sejit Bobar
Atomski emisioni detektor/Atomic Emission Detektor (AED)

Ovaj detektor je mnogo skuplji od drugih komercijalno raspoloivih detektora, ali ima mnogo
iru primjenjivost, jer se temelji na detekciji zraenja koje emitiju atomi mnogih elemenata ua
analitima euliranim iz kolone. Kod ovog detektora (Slika 46) eulent se iz kolone uvodi u
helijevu plazmu nastalu pod djelovanjem jakog mikrovalnog zraenja. Djelovanjem energije
plazme dolazi do atomizacije svih elementa u uzorku i do pobuivanja njihovog
karakteristinog sprktra. Ovaj spektar se zatim posmatra spektrometrom koji koristi pokretni,
ravni diodni niz sposoban da detektuje emitirano zraenje od oko 170 d0 780 nm.
Slika46. Atomski emisioni detektor

Fotojonizujui detektor/Photoionization Detektor (PID)
Fotojonizujui detektor se sastoji od elije detektora kroz koju protie efluent, i UV lampe
koja usmjerava UV svjetlost unutar elije. Kod ovog ureaja se koristi UV svjetlo kao
sredstvo za jonizaciju analita koji izlazi iz kolone. Emitovana svjetlost se usmjerava na
struju noseeg gasa koji protie kroz kolonu. Stalno elektronsko polje se
odrava izmeu emitujue i kolektorske elektrode eliji fotojonizujueg detektora. Kada su
jednom jonizovani pod dejstvom UV svjetlosti molekuli u detektoru se kreu u elektronskom
polju stvarajui naelektrisanje koje je proporcionalno koncentraciji jonizovanih molekula u
eliji detektora.
Elektrometar konvertuje trenutnu vrijednost naelektrisanja u voltau, koja se
dalje konvertuje u digitalni signal koji amplificira mikroprocesor. Pravac
kretanja elektrona kroz eliju detektora moe se videti na slici 47.
90
dr. Sejit Bobar
Slika 47. Fotojonizirajui detektor
Azot fosfor detektor/The Nitrogen Phosphorus Detektor (NPD)

Azot-fosforni detektor ili termojonski detektor / Thermoionic Detektor (TID) je selektivan za
organske supstance koje sadre fosfor i/ili azot. Njegov odziv na atom fosfora je priblino
deset puta vei nego na atom azota, a 104-106 puta vei nego na atom ugljika. U poreenju sa
plamenojonizacionim detektorom ovaj detektor ima priblino 500 puta bolju osjetljivost na
supstance koje sadre fosfor i 50 puta bolju osjetljivost na supstance koje sadre azot. Ove
osobine ine termojonski detektor naroito pogodnim za detekciju i kvantitativno odreivanje
mnogih pesticida koji sadre fosfor.
Termojonski detektor ima slinu konstrukciju kao plamenojonizacioni detektor prikazan na
slici 43. Kod ovog detektora osjetljivi element je kuglica izraena od rubidijeva ili cezijea
silikata koja se zagrijava elektrinim putem. Eluent iz kolone se mijea sa vodonikom, prolazi
kroz mlaznicu i zapali se. Nastali topli gas struji oko zagrijane rubidijeve kuglice ijii se
potencijal odrava na oko 180V s obzirom na kolektorsku elektrodu. Zagrijana kuglica stvara
plazmu koja ima temperaturu od 600-800oC. Nije poznao ta se stvarno deava u plazmi da se
stvara neuobiajeno veliki broj jona iz molekula koje sadre fosfor i azot, ali posljedica toga
su velike jonske struje koje se koriste za odreivanje spojeva koji sadre ova dva elementa.
91
dr. Sejit Bobar
Registracija signala-gasni hromatogram

Registrovani signali koji dolaze sa detektora na sistem za registraciju- pisa, predstavljaju
gasni hromatogram. Registrovani signali na gasnom hromatogramu pruaju kvalitativne i
kvantitativne podtke o ispitivanom uzorku. Prilikom hromatografiranja potrebo je ustaliti
neke uslove i navesti tane podatke za temperaturu, brzinu protoka gasa nosaa, brzinu
protoka drugih gasova potrebnih za rad detektora, vrstu punila kolone, kocentraciju tene
faze, vrstu i veliinuzrna vrstog nosaa, dimenziju kolone, vrste detektora, osjetljivosti
sistema za detekciju i drugo. Na snimljeni hromatogram obavezno se unose svi gore navedeni
podaci kako bi se dobiveni rezultati mogli reproducirati.
9A-6. PRIMJENA GASNE HROMATOGRAFIJE

Da bi se procjenila vanost gasne hromatografije, valja razlikovati dvije uloge te metode.
Jedna uloga hromatografije jest odjeljivanje, i u toj je ulozi ona neizbjean dio cjelokupne
analize sloenih organskih organometalnih i biohemijskih smjesa. Njezina druga, bitno
razlita uloga jest sama analiza. Vremena zadravanja pritome slue za kvalitativnu
identifikaciju.
Gasna hromatografija ima mnogo vea ogranienja kvalitativne analize od veine
spektroskopskih metoda. Da bi se uklonila ta nepogodnost, ulau se veliki napori za
kombinaciju izvanrednih sposobnosti odjeljivanja koje posjeduje tehnika gasne
hromatografije s izvanrednim sposobnostima odreivanja masene, IR ili NMR
spektroskopije.
Kvalitativna analiza
Identifikacija komponenata koje se razdvoje u toku hromatografske analize obino se vri na
taj nain da se poredi vrijeme zadravanja ispitivanja supstance sa vremenom zadravanja
test supstance. Vrijeme zadravanja tR je vremenski period od momenta iniciranja uzroka do
momenta kada je pik ispitivane supstance dostigao maksimum. Osim vremena zadravanja
moe se kao mjerilo upotrijebiti volumen zadravanja (VR), koji predstavlja produkt vremena
zadravanja i brzine poticanja gasa nosaa. Za identifikaciju se upotrebljava reducirano
vrijeme zadravanja t,R ili reducirani volumen zadravanja V'R odnosno relativno vrijeme
zadravanja. Reducirano vrijeme (volumen) zadravanja je razlika izmeu vremena
(volumena) zadravanja uzorka i tzv.nezadrane, inertne komponente, obino vazduha.
Relativno vrijeme zadravanja predstavlja odnos reduciranog vremena (volumena)
zadravanja nepoznate supstance i reduciranog vremena (volumena) zadravanja standardne
supstance. Osim vremena zadravanja koristi se i indeks zadravanja.
Kvantitativan analiza
Kvantitativan i semikvantitativna analiza temelje se na odzivu detektora smjetenog na izlazu
iz hromatografske kolone. Pri briljivo nadziranim uvjetima gasno hromatografske analize
moe se postii tanost od 1 do 3%. Vaan udio pri odreivanju mogue tanosti ima priroda
uzorka.
92
dr. Sejit Bobar
Openito rasprave o kvantitativnoj hromatografskoj analizi odnose se na gasnu

hromatografiju, pa prema tome nije nuno daljnje razmatranje navadene teme.
10A GASNA HROMATOGRAFIJA- SPEKTROMETRIJA MASA

Povezivanjem gasnog hromatografa sa spektrom masa dobijen je idealan analitiki sistem
kojim se u toku analize provede razdvajanje supstanci u gasnom hromatografu i detekcija u
spektrometru masa kao specifinom detektoru. Ovakav sistem povezan sa raunarima i sa
bogatom bibliotekom (bankom) podataka, omoguava sakupljanje svih podataka iz gasnog
hromatografa i spektrometra masa u toku analize, detaljnu viestruku analizu, obradu i
komparaciju dobivenih nalaza sa podacima u biblioteci raunara.Gasni hromatograf koji se
vezuje na spektrometar masa moe biti sa punjenim ili kapilarnim kolonama. Najee se
upotrebljavaju kapilarne kolone velike selektivnosti duine 10-50 metara. Primjenom
kapilarnih kolona postie se efikasnije razdvajanje a pogodne su kod vezivanje za
spektrometar masa jer se unosi mali volumen uzorka, odnosno rastvaraa i tako ne dolazi do
veih promjena pritiska u jonizacionoj komori. Hromatografiranje se izvodi uz helijum kao
gas nosa i najee uz temperaturni program. Izlazni dio kolone direktno ulazi u jonizacionu
komoru tako da poslije eluiranja supstance dolazi do jonizacije i stvaranja molekulskog i
fragmentnih jona.
Hromatograf moe biti sa razliitim spektrometrima masa, odnosno razliitim masenim
detektorima. Veza se moe ostvariti sa jednostruko fokusirajuim sektorskim ili
kvadrupolnim instrumentima, sa dvostruko fokusirajuim sektorskim instrumentima visoke
moi razluivanja te sa viestruko fokusirajuim instrumentima razlite izvedbe. Posljednih
godina upotrebljavaju se ureaji poznati pod nazivom jon trap detektor i jon selektivni
detektor.
Vezani sistem gasna hromatografija-spektrometrija masa naroito dolazi do izraaja kada se
ispituje struktura supstance u uzrocima koji sadre vie komponenata sline strukture i kada
je za analizu dostupna mala kolina supstance. Zato je primjena ove metode neophodna
prilikom ispitivanja lijekova pri stavljanje u promet, pri parenju farmakokinetike supstanci,
ispitivanju strukture metabolita, resorpcije, distribucije i izluivanja lijekova. U kontroli
gotovih preparata koristi se pri ispitivanjima oneienja, razgradnih produkata i drugih
istraivanja u tehnologiji pripreme raznih farmaceutskih oblika. Ispitivanje malih kolina
supstance masenom spektrometrijom provodi se tehnikom praenja pojedinanih jona SIR
(Signal Ion Recording). Tehnika se sastoji u tome da se promjenom napona akceleracije,
odnosno RF napona kod kvadrupolnih instrumenata u fokus jonskog kolektora dovode samo
predhodno odabrani joni, i pri tome se ne snima cjelokupni spektrogram masa, ve se izaberu
samo mase karakteristinih fragmenata, koje se u kratkim vremenskim intervalima
naizmjenino registruju i tako se dobije fragmentogram odabranih jona.
Prilikom izbora jona koji e se pratiti treba voditi rauna da oni budu to veeg relativnog
inteziteta, jer se na taj nain postie vea osjetljivost kao i da budu to vee mase, tj. da im
m/z bude to vea poto se na taj nain postie visoka selektivnost i zbjegava registrovanje
mnotva signala koji su prisutni ukoliko se prate manje mase. Fragmentogrami dobiveni na
ovaj nain su isti prisutni su samo signali koji potiu od ispitivane supstance a osjetljivost je
vea i za dva reda veline u odnosu na snimanje klasinih spektrograma masa. Praenje toka
93
dr. Sejit Bobar
analize u vezanom sistemu gasnu hromatografija spektrometrija masa razlikuje se od praenja

u gasnoj hromatografiji i spektrometriji masa.Na osnovu svih snimljenih spektrograma masa
primjenom raunara konstruie se tzv. hromatogram totalne jonske struje, na kojem pojava
hromatografskog signala oznaava da je neka supstanca dospjela u jonizacionu komoru.
Hromatogram totalne jonske struje je, po analogiji, najsliniji hromatogramu koji se dobije na
plamenojonizacionom detektoru gasnog hromatografa, s tom razlikom to kod
plamenojonizacionog detektora supstanca, dospjevi u detektor, sagori dajui elektrone koji
se registruju kao signal a ovdje se supstanca fragmentira i daje jone, odnosno spektrogram
masa. Svi signali znaajnijeg inteziteta koji se dobiju na hromatogramu totalne jonske struje
kasnije se podvrgne evaluaciji i detaljnom ispitivanju njihovih spektrograma masa.
Gasna hromatografija (GC) je tehnika koja se, vjerovatno, najee koristi u kombinaciji sa
masenom spektrometrijom (MS). Kompleksne smjese se mogu veoma lahko razdvojiti
gasnom hromatografijom, a MS se koristi za identifikaciju individualnih komponenata, jer
maseni spektar daje informacije o njihovoj strukturi. Pojedinane komponente smjese se
pojavljuju na gasnom hromatogramu u vidu zasebnih pikova. Retenciono vrijeme moe
posluiti kao veliina za kvalitativno definisanje, ali ovo nije pouzdan nain, pa se nikako ne
smije koristiti za odreivanje sastava nepoznatih i ranije neidentifikovanih jedinjenja.
Ono to je veoma bitno za GC MS je da obje tehnike koriste priblino istu koliinu uzorka
u gasovitom stanju (manje od 1 ng). Nedostatak se ogleda u ogranienju po pitanju upotrebe.
GC MS mogu se analizirati samo komponente iji je napon pare vei od 10-10 mbar, a
maseni spektri izomernih komponenti se ne razlikuju. Drugi nedostatak se esto prevazilazi
hromatografskim razdvajanjem izomera.
GC se moe direktno vezati za MS, to predstavlja kontinualni postupak vezivanja. Postoji
vie modela interfejsa koji povezuju ova dva instrumenta. U diskontinualnom postupku
komponente se prvo razdvajaju pomou GC, zatim se kondenzacijom u kapilarnoj cijevi na
izlazu izdvajaju, a potom se svaki uzorak unosi zasebno u MS. Kada se MS direktno vezuje
za GC, postoji problem u razlici pritisaka. Na izlazu iz GC pritisak iznosi oko 1 bar, a MS
radi pri visokom vakuumu, pritiska od 10-4 do 10-6 mbar. Danas je pojava vika gasa nosaa
prevaziena, jer se koriste kapilarne kolone kod kojih je protok gasa nosaa relativno mali.U
sistemu GC MS koriste se razliiti sistemi za injektovanje, kolone, gasovi nosai, jonski
izvori i maseni analizatori.
Tokom analize dobija se veliki broj podataka, koji se ne mogu obraditi runo, pa je
neophodno povezivanje instrumenata sa raunarskim sistemom.
Opta ema aparature, bez obzira na navedene razlike, moe se prikazati na nain pokazan na
slici , pri emu su brojevima oznaeni sljedei dijelovi:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
boca sa gasom nosaem,

injektor,
kapilarna kolona,
veza izmeu GC i MS,
jonski izvor,
maseni analizator,
detektor,
vakuum sistem,
94
dr. Sejit Bobar
9. raunar,
Slika 48. Shema aparature za GC-MS
11A TENA HROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI

(HPLC)
Na poetku razvitka tekue hromatografije primjeeno je da se najvea djelotvornost
hromatografske kolone postie smanjenjem dimenzija zrna punila, kako to moemo da
vidimo na sljedeoj Slici 49.
Slika 49. Diagram raspodjele prema dimenziji zrna punila
95
dr. Sejit Bobar
Valja uoiti da niti u jednom od tih diagrama nije postignut minimum jer se on u ovoj vrsti
hromatografije pojavljuje uz nedoputeno male brzine protoka. Tehnologija proizvodnje i
primjene punila promjera 10 m razvila se tek kasnih 60 ih godina. Za primjenu te
tehnologije bili su nuni mnogo sloeniji ureaji od jednostavnih staklenih kolona, koje su se
primjenjivale u klasinoj tekuoj hromatografiji. Nazivom Tekua hromatografija visoke
djelotvornosti (eng. Hight Performance Liquid Cromatography, HPLC) eli se naglasiti
razlika izmeu tih novijih postupaka i klasinih metoda, koje se jo primjenjuju u
preparativne svrhe.
11A-1. UREAJI ZA TEKUU KROMATOGRAFIJU VISOKE DJELOTVORNOSTI
Za postizanje dovoljnih brzina protoka u kolonama punjenima savremenim punilima za
tekuu hromatografiju s promjerom zrna od 10 m ili manje, nuni su pritisci od nekoliko
miliona Pa. Tako visoki pritisci zahtijevaju mnogo sloeniju i skuplju opremu od one koja se
susree kod drugih vrsta hromatografije. Slika 2. prikazuje vane dijelove tipinoga tekuega
hromatografa velike djelotvornosti.
Spremnik mobilne faze i sistem za obradu otapala
Savremeni ureaj za tekuu hromatografiju velike djelotvornosti, kako pokazuje slika 2.,
sastoji se od jednog staklenog ili elinog spremnika, ili vie od 500 mL ili vie, u kojima se
nalazi otapalo. esto se u sklopu sistema nalazi oprema za uklanjanje plinova i vrstih
estica, iz tekuina. Plinovi zbog stvaranja mjehuria, mogu prouzroiti irenje zona eluiranih
sastojaka, a mjehurii i estice mogu ometati rad detektora. Odstranjivai plina mogu se
sastojiti od sistema vakuum pumpi, destilacijskog ureaja, grijaa i mijealice ili, kako
pokazuje slika 2, sistema za otplinjavanje u kojemu se otopljeni plinovi odstranjuju iz otopine
noeni mjehuriima inertnog plina netopljivoga u mobilnoj fazi.
Najjednostavniji nain odjeljivanja tenom hromatografijom jest izokratika eluacija, pri
kojoj analit kroz kolonu nosi jedno otapalo. Meutim, esto se bolji hromatogram dobije
gradijentnom eluacijom uz upotrebu dva (pokatkad i vie) sistema otapala polarnosti kojih se
meusobno znatno razlikuju. Odnos zapremine dva otapala mijenja se na unaprijed utvren
nain, i to ponekad neprekidno, a ponekad u nizu koraka. Gradijentna eluacija esto
poboljava djelotvornost odjeljivanja poput programiranog povienja temperature u plinskoj
hromatografiji. Savremeni tekuinski kromatografi esto su opremljeni ventilima za unoenje
tekuina iz dva ili vie spremnika, brzinama koje se mogu neprestano mijenjati (slika 50).
96
dr. Sejit Bobar
Slika 50. Shematski prikaz ureaja za visokodjelotvornu tekuu hromatografiju

Pumpe
Zahtjevi koji moraju odgovarati za pumpe u tekuinskom hromalografu vrlo su strogi:
pritisci do 40 milijuna Pa,

izlaz bez pulsiranja pritiska,
brzine protoka od 0,1 do 10 mL/min.,
reproducibilnost protoka od 99,5% ili bolja i
otpornost na koroziju izazvanu razliitim otapalima.
Za primjenu u tekuinskoj hromatografiji pogodne su dvije vrste mehanikih pumpi: pumpa s

vijanim pogonom i reciprona pumpa (slika 51). Protok tekuine koji stvara pumpa s
vijanim pogonom ravnomjeran je i moe se jednostavno' nadzirati. Nedostatak tih pumpi je
mali kapacitet (- 250 mL) i nepogodnost za promjenu otapala. Reciprone pumpe
upotrebljavaju se ee. Sastoje se od male komore u obliku cilindra koja se puni i prazni
pomicanjem klipa naprijed-nazad. Pomicanje klipa stvara pulsirajui protok koji treba
priguiti. Prednosti tih pumpi su mali unutarnji volumen, visok vanjski pritisak (do 70 MPa),
mogunost primjene za gradijentnu eluaciju, stalni protoci koji ne ovise ni o povratnom
pritisku u koloni ni o viskoznosti otapala.
U neke ureaje ugraene su pneumatike pumpe, koje se u najjednostavnijoj izvedbi sastoje
od spremnika za otapalo smjetenoga u posudu koja se moe stlaiti komprimiranim zrakom.
Pumpe te vrste su jednostavne, jeftine i rade bez pulsiranja. Njihov nedostatak je u
ogranienom kapacitetu i pritisku na izlazu te u brzinama pumpanju koje ovise o viskoznosti
otapala. Osim toga one se ne mogu upotrebljavati uz gradijentnu eluaciju.
Poeljno je naglasiti da visoki pritisci, koje stvaraju pumpe u tekuinskim hromatografima,
ne predstavljaju opasnost od eksplozije jer se tekuine ne mogu konstatno zbijati. No zbog
visokih pritisaka, tekuine mogu procuriti, to bi ipak moglo prouzroiti poar.
97
dr. Sejit Bobar
Slika 51.ematskiprikazrecipronepumpeza HPLC

Sistem za unoenje uzorka
Unoenje uzorka kroz elastinu membranu, tzv. septum, esto se primjenjuje u tekuinskoj
hromatografiji zbog jednostavnosti. Taj nain nije osobito reproduciblian pa je ogranien na
pritiske nie od 10 miliona Pa. Pri unoenju uzorka uz zaustavljanje protoka sklone se matica
na poetku kolone, a uzorak se injekcijskom pricom unese na poetak punila. U tekuinskoj
kromatografiji uzorak se u kolonu najee unosi putem plinskog ventila, poput onoga
prikazanoga na slici 4. Plinski je ventil esto sastavni dio opreme savremenoga tekuinskog
kromatografa. Uz njega se nalazi vie izmjenjivih petlji kojima se u kolonu mogu unositi
koliine uzorka od 5 do 500 L. Preciznost unoenja uzorka preko uobiajene petlje za
uzorak u granicama je nekoliko desetinki postotka.
98
dr. Sejit Bobar
Kolone za visokodjelotvornu tekuinsku hromatografiju

Kolone koje se upotrebljavaju u visokodjelotvomoj tekuinskoj hromatografiji najee su
izraene od elinih cijevi, iako se ponekad, uz niske pritiske (<4 MPa), upotrebljavaju i
staklene cijevi debljih stijenki. Kolone su najee duge 10-30 cm, unutranjeg promjera 4-10
milimetara. Promjer zrna punila najee iznosi od 5 do 10m. Takve kolone najee imaju
40 000 do 60 000 tavana/m. Odnedavno su na tritu dostupne visoko djelotvorne
mikrokolone, unutranjeg promjera 1-4,6 mm i duljine 3-7,5 centimetara. Te kolone, punjene
zrncima promjera 3 - 5 m sadre i do 100 000 tavana/m i imaju prednost u brzini i potronji
otapala.
Punilo, koje se najee upotrebljava u tekuinskoj hromatografiji, je silikagel. Ta se zrna
sintetiziraju iz estica submikrometarskih dimenzija pri uvjetima koji pogoduju nastajanju
veih agregata vrlo jednolikih promjera. Nastali se proizvod zatim prevue tankim organskim
slojem, koji se hemijski ili fizikalno vee na povrinu punila. Upotrebljavaju se i punila koja
sadre glinicu, porozne polimere i ionske izmjenjivae.
Detektori
U tekuinskoj hromatografiji ne postoji univerzalni sistem detektora poput onoga u plinskoj
hromatografiji. Naime, detektorski sistem ovisi o prirodi uzorka. Tabela 1. prikazuje neke
uobiajene detektore i njihova svojstva.
Tablica 28-1.
ZNAAJKE DETEKTORA U TEKUINSKOJ KROMATOGRAFUl
Detektor
Dostupan na
Granica dokazivanja
tritu
(komercijalni detektori)*
absorbancija
fluorescencija
elektrokemijski
indeks loma
vodljivost
spektrometrija masa
FT-IR
rasprivanje
c
svjetlosti
optiki
aktivitet
selektivni elementi
fotokmizacija
dac
dac
dac
da
da
dad
dad
da
ne
ne
ne
100 pg -1 ng
l-10pg
10 pg - 1 ng
100 ng- g
500 pg- 1 ng
100 pg- 1 ng
L g
10 g
-
Granica dokazivanja
(sadanje stanje)b
1 pg
10 fg
100 fg
10 ng
500 ng
1 pg
100 ng
500 ng
1 ng
10 ng
1 pg - 1 ng
Detektori koji se u tekuinskoj kromatografiji najee upotrebljavaju temelje se na

apsorpciji ultraljubiastog ili vidljiva zraenja. Na tritu su dostupni fotometri i
spektrofotometri posebne izvedbe za primjenu uz hromatografske kolone. U fotometrima se
esto upotrebljavaju linije 254 i 280 - nm iz ivine sijalice, jer organske funkcionalne skupine
esto apsorbiraju u tom podruju. Deuterijski i volframovi izvori s interferencijskim filtrima
jednostavno su sredstvo za detekciju sastojaka koji apsorbiraju u tom podruju. U neke
savremene ureaje ugraen je toak s filtrima. Okretanjem toga toka izabire se eljeni filtar.
Spektrofotometrijski detektori su svestraniji od fotometara pa se takoer esto upotrebljavaju
u ureajima za visokodjelotvomu tekuinsku kromatografiju.
Druga vrsta detektora, koja se esto upotrebljava u ovoj tehnici mjeri promjene u indeksu
loma otapala prouzroene prisutnou molekula analita. Nasuprot drugim detektorima
navedenima u tabeli 1., detektor na osnovi indeksa loma je opi, a ne selektivan, tj. pokazuje
odziv na sve sastojke iz uzorka. Nedostatak tog detektora je njegova neto manja osjetljivost.
99
dr. Sejit Bobar
11A-2. VISOKODJELOTVORNA RAZDJELNA HROMATOGRAFIJA

Razdjelna hromatografija, koja se od svih postupaka tekuinske hromatografije najvie
primjenjuje, uobiajeno se dijeli na kromatografiju u sustavu tekuina-teina i na
hromatografiju u sustavu vezane faze. Te dvije vrste hromatografija razlikuju se po nainu na
koji je stacionarna faza vezana na punilu. Zadravanje sastojaka na punilima u sustavu
tekuina-tekuina, temelji se na fizikalnoj adsorpciji, a kod punila u sustavu vezane faze
nastaju kovalentne veze. Kad se poela primjenjivati, razdjelna se hromatografija temeljila
iskljuivo na sustavu tekuina-tekuina. Danas prevladavaju metode vezane faze, a
hromatografija u sustavu tekuina-tekuina primjenjuje se samo iznimno.
Punila s vezanom fazom
Najvie punila s vezanom fazom pripravlja se reakcijom organoklorsilana sa -OH skupinama
nastalima na povrini silikagela hidrolizom u toploj razrijeenoj hlorovodinoj kiselini. Tom
reakcijom nastaje organosiloksan. Reakcija za jednu takvu SiOH skupinu na povrini estice
moe se pisati kao:
pri emu je R esto ravan lanac oktil ili oktildecil skupine (C8H17- ili C18H37-). Na povrinu
sorbensa mogu se vezati i druge organske funkcionalne skupine kao to su alifatski amini,
eteri, nitrili i aromatski ugljikovodici. Moe se primijetiti da se polarnosti stacionarnih faza
meusobno znatno razlikuju.
Punila s vezanom fazom mnogo su stabilnija od punila na kojima se stacionarna faza
zadrava iskljuivo fizikalnim silama. Punila sa stacionarnim fazama, koja su na njih vezana
iskljuivo fizikalnim silama, potrebno je povremeno ponovno provlaiti. Naime, stacionarnu
fazu sa vrstog nosaa postupno ispire mobilna faza. Gradijentna eluacija nije pogodna za rad
s punilima iz sistema tekuina-tekuina, i to zbog gubitaka stacionarne faze koji nastaju zbog
njezine topljivosti u mobilnoj fazi. Glavni nedostatak punila s vezanom fazom jeste njihov
mali kapacitet za uzorak.
Punila s normalnom i reverznom fazom

Ovisno o relativnoj polarnosti mobilne i stacionarne faze, razlikuju se dvije vrste razdjelne
hromatografije. U prvim radovima iz tekuinske kromatografije upotrebljavale su se vrlo
polarne stacionarne faze kao to su trietilenglikol ili voda i relativno nepolame mobilne faze
poput heksana ili i propil etera. Zbog povijesnih razloga, ta se vrsta kromatografije sada
naziva normalnom hromatografijom. U reverznoj kromatografiji stacionarna je faza
nepolama, primjerice ugljikovodik, a mobilna je faza relativno polarno otapalo poput vode,
metanola ili acetonitrila. U normalnoj hromatografiji najmanje polaran sastojak eluira prvi.
Poveanjem polarnosti mobilne faze smanjuje se vrijeme eluacije. Nasuprot tome, u
100
dr. Sejit Bobar
reverznoj hromatografiji najpolarniji sastojak eluira prvi, a poveanjem polarnosti mobilne

faze produuje se vrijeme eluacije.
Procjenjuje se da se tri etvrtine odjeljivanja tehnikom visokodjelotvome tekuinske
hromatografije obavlja reverznom kromatografijom, i to na punilima s vezanim oktil ili
oktildecilsiloksanom. Uz odreeni nain priprave, skupine ugljikovodika s dugakim lancem
poravnavaju se usporedno jedna s drugom i okomito na povrinu zrna, ime nastaje nepolarna
povrina ugljikovodika slina etki. Mobilna faza, koja se upotrebljava uz takva punila
najee je vodena otopina koja sadri razliite koncentracije otapala poput metanola,
acetonitrila i te- trahidrofurana.
Izbor mobilne i stacionarne faze
Da bi razdjelna hromatografija bila uspjena, potrebno je uspostaviti odgovarajuu ravnoteu
meumolekularnih sila izmeu triju sudionika procesa odjeljivanja sastojka, mobilne faze i
stacionarne faze. Te meumolekularne sile kvalitativno opisuju izrazi relativnih polarnosti
reaktanata. Openito, relativne polarnosti organskih funkcionalnih skupina u rastuem nizu
su: alifatski ugljikovodici < olefini < aromatski ugljikovodici < halidi < sulfidi < eteri < nitro
spojevi < esteri < aldehidi ~ ketoni < alkoholi ~ amini < sulfoni < sulfoksidi < amidi <
karboksilne kiseline < voda.
Moe se kazati da i ovdje vrijedi pravilo slinosti. Naime, najbolja hromatografska
odjeljivanja postiu se uz slaganje polarnosti analita i stacionarne faze, a daje pritom
polarnost mobilne faze veoma razliita od polamosti sastojaka. Taj je poredak uspjeniji od
onoga kad se polamosti analita i mobilne faze slau, a istodobno razlikuju od polarnosti
stacionarne faze. Stacionarna faza tada esto ne moe zadovoljiti uvjete za uspjeno
odjeljivanje sastojaka uzorka, a vremena zadravanja postaju prekratka za praktinu
primjenu. Druga je krajnost da su polarnosti analita i stacionarne faze previe sline, pa tada
vremena zadravanja postaju preduga.
11A-3. VISOKODJELOTVORNA ADSORPCIJSKA HROMATOGRAFIJA
Sav pionirski rad na podruju hromatografije temeljio se na adsorpciji u sustavu tekuinavrsta tvar, u kojemu je stacionarna faza bila fino usitnjena polarna vrsta tvar. Na takvu
punilu analit ulazi u pore na povrini punila, a njegovo je zadravanje rezultat adsorpcijskih
sila.
Stacionarne i mobilne faze
Fino usitnjeni silikagel i glinica jedine su stacionarne faze koje su nale primjenu u
adsorpcijskoj hromatograflji. Silikagel se moe upotrijebiti za gotovo sva odjeljivanja
zahvaljujui velikom kapacitetu za uzorak i velikom broju primjenjivih oblika. Adsorpcijska
svojstva tih dviju supstancija meusobno su slina. Kod obje vremena zadravanja postaju
dua s poveanjem polarnosti analita. U adsorpcijskoj kromatograflji jedina varijabla koja
utjee na omjer raspodjele analita jest sastav mobilne faze (nasuprot razdjelnoj kromatografiji
u kojoj je i polarnost stacionarne faze jedna od varijabli). Primjenom sastava eluensa
mjenjaju se faktor kapaciteta i koeficienta selektivnosti, a time i razluivanje, pa se malo kada
dogaa da se nemoe nai pogodna mobilna faza za eljeno odjeljivanje.
101
dr. Sejit Bobar
11A- 4. UOBIAJENE PRIMJENE VISOKODJELOTVORNE

RAZDJELNE HROMATOGRAFIJE
Podruje
Farmacija
Biokemija
ivene namirnice
Industrijski hemijski proizvodi
Tipine smjese
Antibiotici, sedativi, steroidi, analgetici
Aminokiseline, bjelanevine, ugljikovodici, lipidi
Umjetna sladila, antioksidansi, aflatoksin. aditivi
Kondenzirani aromati. premazi, promotori, boje
Zagaivai
Sudska hemija
Klinika medicina
Pesticidi. herbicidi, fenoli, poliklorirani bifenili

Droge, otrovi, alkoholi u krvi, narkotici
une masne kiseline, metaholiti droga, urmski
ekstrakti, estrogeni
Primjena adsorpcijske hromatografije

Danas se visokodjelotvorna adsorpcijska tena hromatografija u sistemu teno-vrsto koristi
za odjeljivanje relativno nepolarnih organskih spojeva netopivih u vodi, molekularne mase
manje od 5000. Jedno od najvanijih osobina adsorpcijske hromatografije je sposobnost
odjeljivanja smjesa izomera kao to su metasupstituisani i parasupstituisani derivati benzena.
Vano je napomenuti da ovu osobinu nemaju ostale vrste hromatografija.
11A- 5. VISOKODJELOTVORNA HROMATOGRAFIJA JONSKE IZMJENE
Jonski izmjenjivai predstavljaju stacionarnu fazu u hromatografiji jonske izmjene.
Hromatografija jonske izmjene je postupak odjeljivanja kojim se joni slinog naboja odjeljuju
eluacijom iz kolone punjene fino usitnjenim zrncima jonskih izmjenjivaa.
Jonski izmjenjivai
Sintetiki jonski izmjenjivai su polimerne tvari velike molekulske mase koji sadre
mnoge funkcionalne grupe po molekuli. Kationski izmjenjivai mogu biti ili jake
kiseline sa sulfonskim kiselim grupama (RSO3- H+) ili slabe kiseline sa karboksilnim
kiselim grupama (RCOOH). Anionski izmjenjivai sadre bazine aminske
funkcionalne grupe vezane na polimernu molekulu. Izmjenjivai sa jakim bazama su
kvarterni amini [RN(CH3)3+OH-]. Jonski izmjenjivai sa slabim bazama sadre
sekundarne ili tercijarne amine.
Vana osobina svih izmjenjivaa je da uglavnom nisu topljivi u vodi. Ubrzo nakon uranjanja
kationskog izmjenjivaa u vodenu otopinu u kojoj se nalaze kationi M+, uspostavlja se
ravnotea izmjene izmeu vrste faze i faze otopine:
xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+

gdje je Mx+ kation, a R je dio molekule izmjenjivaa koji sadri jednu sulfonsku grupu.
Odgovarajui proces jonske izmjene sa anionskim izmjenjivaima moe se pisati kao:
xRN(CH3)3+OH- + Ax- [RN(CH3)3+]xAx- + xOH-
pri emu je Ax- anion.
102
dr. Sejit Bobar
Primjena jonskih izmjenjivaa u hromatografiji

U hromatografiji jonske izmjene joni analita uzorka unose se na poetak kolone napunjene
odgovarajuim jonskim izmjenjivaem. Joni uzorka istiskuju one jone eluensa sa mjesta gdje
se nalaze nabijene skupine na sorbensu. Naprimjer, anioni poput hlorida, tiocijanata, sulftata i
fosfata se mogu odijeliti na anionskim izmjenjivaima u njihovom baznom obliku.
Eluacija se zatim nastavlja razrijeenom otopinom baze pri emu se otputaju anioni. Budui
da se omjeri raspodjele razliitih aniona meusobno razlikuju,tokom eluacije javlja se
frakcionacija.
Jedna od veih prednosti hromatografije jonske izmjene je mogunost mjerenja vodljivosti
eluensa koji izlazi iz kolone, to je pogodna metoda za detekciju i odreivanje koncentracije
eluiranih sastojaka. Danas se primjenjuju dvije vrste hromatografije na punilima sa jonskim
izmjenjivaima:
hromatografija na koloni uz priguenje eluensa
jonska hromatografija na jednoj koloni
Ove dvije tehnike se razlikuju u nainu kojim se sprjeavaju interakcije to uzrokuju
vodljivost eluensa iz kolone pri mjerenju vodljivosti analita.
Hromatografija jonske izmjene sa priguenjem eluensa

Potekoa izazvana velikom vodljivou eluensa rijeena je 1975. godine postavljanjem
kolone za priguenje eluensa odmah iza kolone sa jonskim izmjenjivaem. Kolona za
priguenje eluensa napunjena je jonskim izmjenjivaem koji je razliit od onoga u analitikoj
koloni. Taj jonski izmjenjiva efikasno pretvara jone prisutne u eluensu, koji izlaze iz kolone,
u molekularne vrste ograniene jonizacije koje ne utjeu na vodljivost jona iz analiziranog
uzorka. Naprimjer, pri odjeljivanju i odreivanju kationa, hlorovodonina kiselina je izabrani
eluens, a u koloni za priguenje se nalazi anionski izmjenjiva u hidroksidnom obliku.
Proizvod reakcije izmeu eluensa i priguivaa je voda:
H+(aq) + Cl-(aq) + smola+OH-(s) smola+Cl-(s) + H2O

Anionske grupe ne zadravaju katione analita u toj drugoj koloni.
Za anionska odjeljivanja punilo priguivaa je kiseli oblik kationskog izmjenjivaa uz eluens
NaHCO3 ili Na2CO3. Reakcija u priguivau je sljedea:
Na+(aq) + HCO3-(aq) + smola-H+(s) smola-Na+(s) + H2CO3(aq)

Najveim dijelom nedisocirana karbonska kiselina ne utie znatno na izmjerenu vodljivost.
Nepogodnost vezana za kolone sa priguivaem sastoji se u povremenoj potrebi njihove
regeneracije kako bi se vratili u poetni kiseli ili bazini oblik.
103
dr. Sejit Bobar
Hromatografija jonske izmjene sa jednom kolonom

Mogunost rada bez kolone sa priguivaima postoji zahvaljujui malim razlikama u
vodljivosti izmeu jona iz uzorka i jona koji potiu iz eluensa,a kojih ima mnogo vie. Da bi
se te razlike poveale, koriste se jonski izmjenjivai malog kapaciteta izmjene koji
omoguavaju eluaciju sa razrijeenim otopinama eluensa. Nadalje, biraju se eluensi sa
malom ekvivalentnom provodljivou. Ova hromatografija je pogodna zbog toga to ne
zahtjeva posebnu opremu za priguivanje vodljivosti eluensa. Ipak, ona je neto manje
osjetljiva za odreivanje aniona od metode u kojoj se koristi kolona za priguivanje.
11A-6. VISOKODJELOTVORNA HROMATOGRAFIJA NA GELU

Hromatografija na gelu ili ekskluziona hromatografija kod koje proces odjeljivanja zavisi od
veliine molekula analiziranih sastojaka je posebno pogodna za analizu spojeva velike
molekulske mase.
Punila
Punila za ovu hromatografiju sastoje se od malih zrnaca silikagela ili polimera koji formiraju
mreu pora jednolike veliine. U te pore mogu difundirati molekule uzorka i eluensa.
Prosjeno vrijeme zadravanja molekula uzorka u porama punila zavisi od njihove
veliine.Velike molekule koje su mnogo vee od pora ne mogu ui u njih pa se bez
zadravanja kreu dalje. One se kroz kolonu kreu brzinom mobilne faze. Male molekule,
mnogo manje od pora,ulaze u pore i zadravaju se u njima najdue vrijeme, tj. najmanje
molekule uzorka zadnje izlaze iz kolone. Izmeu velikih i malih molekula nalaze se molekule
srednje veliine ije prosjeno zadravanje u porama zavisi od njihovog prenika.
U hromatografiji na gelu susreemo se sa sistemom kod kojeg proces odjeljivanja zavisi
samo od veliine molekula uzorka i tokom tog procesa nema hemijskih ili fizikih reakcija
izmeu molekula uzorka i stacionarne faze.
Hidrofilna punila se koriste sa vodenim mobilnim fazama,a hidrofobna sa nepolarnim
organskim fazama. Hromatografija u kojoj se koriste hidrofilna punila zove se gel
filtracijska,a ona sa hidrofobnim punilima zove se gel permeacijska. Srednja molekularna
masa sastojaka analiziranog uzorka,pogodna za odreeno punilo moe iznositi nekoliko
stotina do nekoliko miliona. Jedno punilo moe zadovoljiti raspon molekulskih masa od 20
do 25 puta.
Primjena gel hromatografije
Gel hromatografija se koristi za odreivanje eera o vodenim rastvorima,zatim za
odreivanje epoksi smola u kojoj svaka monomerna jedinica ima molekulsku masu 280.
Koristi se za brzo odreivanje molekulske mase ili raspodjele molekulskih masa velikih
polimera ili prirodnih proizvoda.
104
dr. Sejit Bobar
11A-7. USPOREDBA VISOKODJELOTVORNE TENE HROMATOGRAFIJE SA

GASNO TENOM HROMATOGRAFIJOM
Karakteristike obje metode

Djelotvorne,veoma
selektivne,iroka
primjena,male
koliine
uzorka,mogu
biti
nedestruktivne
za
uzorak,lako se koriste za
kvantitativnu analizu.
Prednosti HPLC
Prednosti GLC
Primjeniva za nehlapljive
i toplinski nestabilne
uzorke ,opa primjena za
anorganske jone.
Jednostavna
i
jeftina
oprema,brza,izvanredno
dobro
razluivanje(s
kapilarnim kolonama),lako
se spaja sa spektroskopijom
masa.
12A. HROMATOGRAFIJA SA SUPERKRITINIM TENOSTIMA

Hromatografija
sa
superkritinim
tenostima
(engl.
Supercritical-Fluid
Chromatography,SFC) je hibrid plinske i tene hromatografije. Ona objedinjuje neke
prednosti tih tehnika.
Vane osobine superkritinih tenosti
Superkritine tenosti nastaju uvijek kada se supstanca zagrijava iznad svoje kritine
temperature. Na kritinoj temperaturi supstanca se ne moe kondenzirati u teno stanje.
Naprimjer,CO2 postaje superkritina tenost na temperaturi veoj od 31oC. U tom
stanju,molekule CO2 djeluju nezavisno jedna od druge ba kao i u plinu.
Gustoa, g/cm3
Koeficijent difuzije,
cm2 x s-1
Viskoznost, g x cm-1
x s-1
plin
Superkritina tenost
tenost
(0,6 2) x 10-3
0,2-0,5
0,6 1,6
(1-4) x 10-1
10-3 10-4
(0,2-2) x 10-5
(1-3) x 10-4
(1-3) x 10-4
(0,2-3) x 10-2
Tabela 3: usporedba osobina superkritinih tenosti,tenosti i plinova
105
dr. Sejit Bobar
Vana osobina superkritinih

nih tenosti
te
povezano sa velikim gustoama
ama je njihova sposobnost
otapanja velikih nehlapljivih molekula. Naprimjer,superkritini CO2 dobro otapa n-alkane
n
sa
5-22
22 ugljikova atoma u lancu, dialkilftalate u kojima alkil grupe sadre 4-16
16 ugljikovih atoma
i razliite policikline
ne aromatske ugljikovodike koji u molekuli sadre nekoliko benzenskih
jezgara. Kritine
ne temperature tenosti
tenosti upotrebljavanih u hromatografiji meusobno
me
se znatno
razlikuju i to od 30oC do vie od 200oC.
Ureaji
aji za hromatografiju sa superkritinim
superkriti
tenostima i veliine
ine koje utiu
uti na njihov
rad
Ureaji s kojima se izvodi
zvodi hromatografija sa superkritinom
superkriti
tenou
u slini
sli su ureajima za
visokodjelotvornu tenu
nu hromatografiju, osim naina
ina nadzora i mjerenja pritiska u koloni.
Nekoliko proizvoaa
poelo
elo
elo je proizvoditi takve hromatografe za trite sredinom 1980-tih
1980
godina.
13A. PAPIRNA HROMATOGRAFIJA

Kod papirne hromatografije razdvajanje se vri na listu ili traci specijalne vrste filtar-papira
filtar
izraenog pomno oiene
ene celuloze. Na jedan kraj filtar-papira
filtar papira stavlja se kap analiziranog
rastvora uzorka i njen poloaj zabiljei. Ovaj kraj papira se zatim zaroni u odgovarajui
odgovaraju
rastvara , iji
iji nivo treba da je nii od mjesta nanesene kapi na papiru. Rastvara
Rastvara putuje preko
papira noseii komponente uzorka koje se neprekidno raspodjeljuju izmeu
izme
dvije faze i
zavisno od njihovih koeficijenata raspodjele ,putuju kroz stacionarnu fazu razliitom
razli
brzinom. Ovaj proces se naziva razvijanjem hromatograma , a mobilna faza razvijaem.
Kretanje mobilne faze moe biti pod utjecajem kapilarnih sila prema gore(uzlazno razvijanje)
ili prema dole (silazno razvijanje ) gdje putovanju
putovanju mobilne faze doprinosi i sila Zemljine tee.
Na slici 53. prikazan je ureaj
aj za papirnu hromatografiju.
Slika
ika 53 . Ureaj za papirnu hromatografiju
106
dr. Sejit Bobar
Razvijanje hromatograma se prekida kada mobilna faza doe blizu kraja papira. Papir se
tada izvadi i poloaj pojedinih komponenti (poloaj njihovih hromatografskih mrlja ili
zone) odredi.
Obojene supstaance se mogu na papiru vidjeti direktno, dok se poloaj bezbojnih
supstanci moe detektovati na vie naina. Jedan od njih jeste da se po razvijenom
hromatogramu raspri odgovarajui hemijski reagens , koji s pojedinim komponentama
daje obojene reakcione produkte. Karakterizacija pojedinih komponenti vri se na osnovu
njihovog preenog puta I preenog puta (fronta) rastvaraa I opisuje se retardacionim
faktorom RF
RF =
put koji jeprela komponenta

put koji jepreao rastvara
Da bi se uticaj nekih nekontrolisanih eksperimenata varijabli kompenzovao, kvalitativna

identifikacija pojedinih komponenti se obino vri uporeivanjem njihovog preenog
puta s preenim putem istih komponenti iz standardnog uzorka u istiim uslovima.
Za kvantitativno odreivanje, odvojene mrlje se skupa s filtar-papirom isjecaju,
odgovarajuim rastvaraem ekstrahuju i u dobijenim rastvorima pojedine komponente
odreuju osjetljivim analitikim metodama.
Razvijanje hromatograma se moe vriti i u dvije dimenzije (dvodimenzionalna planarna
hromatografija ,(Sl. 54). Kod ovog razvijanja kap rastvora uzorka se stavi u jedan ugao
etvrtastog lista filtar-papira i hromatogram razvije uzlaznim razvijanjem pogodnim
rastvaraem. Rastvara se tad ukloni isparavanjem, list papira zaokrene za 900 i
hromatogram ponovo razvija, obino nekim drugim rastvaraem npr. Poslije isparavanja i
drugog rastvaraa poloaj pojedinih komponenti se odreuje prskanjem odgovarajuim
reagensom I uporeuje sa poloajem istih komponenti iz standarda raenog istovremeno i
na isti nain.
Razvijanje u dvije dimenzije ima prednost nad jednodimenzionalnim razvijanjem, jer je
potpunije, naroito u sluajevima kada se komponente ne mogu razdvojiti samo jednim
rastvaraem.
107
dr. Sejit Bobar
Slika 54.. ematski prikaz dvodimenzionalnog razvijanja hromatograma

Ovisno o smjeru putovanja pokretne faze,
faze razlikujemo :
- uzlaznu papirnu hromatografiju
- silaznu papirnu hromatografiju
- horizontalnu papirnu hromatografiju
Uzlazna papirna hromatografije

Kod uzlazne papirne hromatografije se traka filter papira ili vei
i komad savijen u obliku
valjka nakon nanoenja probe na start uroni u sloj otapala u komori za hromatografiranje koja
je prethodno zasiena
ena vodenom parom i komora zatvori.
Pokretna faza usljed kapilariteta ulazi u papir i podigne se do visine fronta tj.
t do linije neto
ispod ruba filter papira u kojem momentu se hromatografiranje prekine. Otapalo za sobom
povlai komponente smjese
mjese koje se zaustavljaju na razliitim
razli itim ali kod odreenih
odre
uvjeta
reproducibilnim udaljenostima.
Silazna hromatografija
Kod papirne hromatografije se meutim
me
ee koristi silazna hromatografija jer zbog
djelovanja sile tee otapalo bre putuje prema dole
do pa ona krae
e traje (slika 55).
55 Sada se
startna linija nalazi na gornjem dijelu filter papira, koji se gornjim krajem pomou
pomo staklene
ploee ili motki uroni u posudu s otapalpm smjeten u gornjem dijelu komore. Kako otapalo
putuje prema dole ono povlai za sobom
sobom pojedine komponente iz otopine uzorka koje putuju
razliitim
itim brzinama t.j zaustavljaju se na razliitim
razli itim mjestima i daju mrlje na papiru.
108
dr. Sejit Bobar
Slika 55
Kruna hromatografija na papiru

Kruna hromatografija na papiru sastoji se u tome da se u centar kruno izrezanog filterpapira najprije stavi jedna kap otopine uzorka, a nakon to se ona osui, izree se 4 do 5 mm
iroki jeziac koji ide do ruba filter-papira do sredita mrlje. Izrezani jeziak savije se tako
da se moe uroniti u otapalo.Papir se stavlja u Petrijevu zdjelicu kako bi prostor u zdjelici bio
neprekidno zasien parama otapala. U tom se sluaju na hromatogramu ne dobivaju mrlje,
ve koncentrini krugovi koji ine zonu pojedinog sastojka. (Slika 56 )
Slika 56 Papirna hromatografija

Mehanizam hromatografije na papiru nije potpuno razjanjen. Poto papir sadri znatne
koliine (i do 20%) hemijski i fiziki vezane vode, papirna hromatografija se obino
109
dr. Sejit Bobar
posmatra kao particiona hromatografija tipa teno-teno, gdje je stacionarna faza kompleks
celuloza-voda, a mobilna faza neki rastvara ili smjesa rastvaraa. Pokazalo se da se struktura
kompleksa celuloza-voda ne mijenja i ne zavisi od sadraja vode u mobilnoj fazi, tako da se u
papirnoj hromatografiji mnoga uspjena razdvajanja postiu i eluiranjem rastvaraima koji se
mijeaju s vodom.
Pored toga, vrlo je vjerovatno da se neke supstance na papiru kao stacionarnoj fazi
zadravaju adsorpcijom ili vezivanjem na vlaknima celuloze, ili kombinacijom ovih procesa
istovremeno.
Upotreba papira u hromatografiji moe se proiriti impregnacijom papira nekim
adsorpcionim sredstvima (npr. aluminijum-oksidom, silikagelom), jonoizmjenjivakom
smolom i sl.
Papirna hromatografija spada u podionu hromatografiju, kod koje je stacionarna faza voda
vezana na molekule celuloze. Hromatografski papir je napravljen iz pamune celuloze i
sadri i neorganskih neistoa, ali u kjoliinam akoje ne smetaju procesu razdvajanja.
Prvenstven auloga papira je da slui kao podloga za nepokrenu fazu. Najee se upotrebljava
hromatografski papir firme Whatman sa oznakama 1-4.
Hromatografsko razdvajanje na papiru je posljedica kontinuirane podjele molekula
hromatografiranog spoja izmeu vodene, mirujue faze, (papir za hromatografiranje moe da
vee do 22% vode) i sa vodom nemjeajue pokretne faze, koja se sastoji od organskih
rastvaraa.
Ako su hromatografirane supstance obojene,mjesto gdje se nalazi supsanca je vidljivo.
Poloaj bezbojnih supstanci se mora otkrivati fizikim ili hemijskim metodama. U tu svrhu
hromatogram se izlae ultraljubiastom svjetlu talasne duine 254 i 365 nm i ako supstanca
fluorescira, obiljei se mjesto i boja fluoroscencije. Od hemijskih metoda najee se
upotrebljavaju razni reagensi sa kojima se tretiraju hromatogrami, pri emu dolazi do
razvijanja boje sa hromatografiranim supstancama. Poslije razvijanja boje moe se
hromatogram ponovo ispitivati pod ultraljubiastim svjetlom i uoiti pojava fluoroscencije,
to moe pomoi pri krajnjoj identifikaciji supstance. Pozicija hromatografirane supstance
moe se utvrditi i radioheiskim metodama. Kada se utvrdi poloaj dokle je supstanca
doputovala, pristupa se identifikaciji. Najjednostavnija identifikacija se moe provesti
odreivanjem Rf vrijednosti. Identifikacija se moe provesti i na osnovu karakteristine boje
koja nastaje poslije prskanja sa reagensom ili poslije izlaganja ultraljubiastom svjetlu.
Najee upotrebljavani reagensi za razvijanje hromatograma navedeni su u tabeli 1.
Reagensi
Upotreba
Pare joda
Sa organskim bazama daju

karakteristinu smeu boju
1% KmnO4 aceton/voda
Opti reagens. Daje ute ili bijele

mrlje na ruiastoj pozadini.
O,1% ninhidrin
Specifian za sve aminokiseline
110
dr. Sejit Bobar
1% i 0,5% dinitro
benzojeva kiselina u
NaOH
Srani glikozidi boje se crveno
0,05% bromkrezol zeleno
Sa organskim kiselinama daje obino

ute mrlje na zelenoj podlozi
Dragendorffov reagens
Slui za identifikaciju alkaloida i

amina
NaNO2 0,5% i 0,1% sa N(1-naftil)etilen-diaminom

u M HCl
Sa sulfonamidima stvara crveno

Obojenje
Primjena papirne hromatografije

Hromatografija na papiru se primjenjuje u analitikim laboratorijama u svim granama hemije,
u farmaciji, biohemiji, gdje se koristi za odvajanje i identifikaciju, najee organskih a rijee
i anorganskih tvari. Hromatografija na papiru je posebno interesantna za odvajanje
aminokiselina, hemoproteida, eera, lipida, hormona, enzima, vitamina itd. Glavna
ogranienja PC u odnosu na TLC koja se danas preferira su dua vremena razvijanja,
zone koje nisu jasne definirane, skromna ispravnost kvantitativne analize i ponekad teka
reprodukcija uvjeta razvijanja hromatograma.
14A. TANKOSLOJNA HROMATOGRAFIJA (TCL)

Sadanji sistem hromatografije na tankom sloju postavio je Kircher sa saradnicima 1951
godine, a metoda je postala popularna tek poto je Stahl objavio obimnu knjigu iz ove oblasti
(1962) u kojoj je opisao komercijalni ureaj za nanoenje tankog sloja i odgovarajue
adsorbense.
Prednost ove hromatografske metode nad hromatografijom na papiru jeste da je
hromatografiranje mnogo bre, a u mnogim sluajevima dobije se bolje razdvajanje sa malom
koliinom supstance. Hromatografiranje obino traje oko 30-120 minuta, dok kod papirne
hromatografije moe trajati satima. . Bolje razdvajanje proizilazi iz injenice da se adsorbensi
koji se koriste u hromatografiji na tankom sloju imaju vei kapacitet od papira,
Za rad su potrebne minimalne koliine uzorka (0,5-5g) i mala koliina adsorbensa koji se u
obliku tankog sloja nanosi na tanke ploe. Potpuna standardizacija postupka omoguava laku
reprodukciju rezultata.
111
dr. Sejit Bobar
Hromatografija na tankom sloju je podesna metoda za preliminarno ispitivanje uzorka na

prisustvo aktivnih ili pomoni supstanci, za ispitivanje oneiena, ispitivanje prisustva
raspadni produkata. TLC je posebno pogodna metoda za ispitivanje kod trovanja lijekovima i
ire u toksikolokoj analitici, u anlitici hrane i analitici ivotne sredine.
Hromatogrefske metode su najselektivnije analitike metode razdvajanja. U kombinaciji sa
drugim instrumentalnim metodama (spektroskopija, masena spektroskopija itd.) dospjele su u
sam vrh analitikih metoda i po svojoj osjetljivosti.
Tankoslojna hromatografija ( engl. Thin Layer Chromatography ili TLC ) je hromatografska
metoda koja se koristi za razdvajanje hemijski komponenti. Ukljuuje stacionarnu fazu
sastavljenu iz tankog sloja materijala za adsorpciju, obino silika gel, aluminijum oksida ili
celuloze, koji je privren na ravnu ,inertnu plou.
Pokretna faza se sastoji iz ispitivanog uzorka koji je rastvoren u odgovarajuem rastvarau.
Pokretna faza se kree po stacionarnoj ploi, potiskivana kapilarnim silama, te se tako uzorak
razdvaja u pojedine komponente.
Upotrebljava se u irokm spektru:
1.
2.
3.
4.
Ispitivanje biljnih pigmenata

Detekcija pesticida i insekticida u hrani
Analiza sastava boja i vlakana u forenzikim ispitivanjma
Identifikacija komponenti koji se nalaze u ispitivanom uzorku
Tehnika razdvajanja na tankom sloju

Hromatografija na taknom sloju adsorbenta izvodi se tako to se blizu ivice ploe na koju je
nanesen adsorbent specijalnom kapilarom nanese rastvor uzorka u vidu kapi ili linija koju
ini vie kapi,rastvara otpari na vazduhu,a zatim taj kraj ploe vertikalno uroni svojom
ivicom u mobilnu fazu. Mobilna faza se kapilarnim silama penje uz sloj adsorbensa, na svom
putu nailazi na mrlje uzorka, djeimino iz njih rastvara komponente i nosi ih razliitim
brzinama sa sobom. Kada front mobilne faze dostigne dovoljnu visinu, ploa se vadi i sui, a
potom se zone pojedinih komponenti uporeuju( slika 57)
112
dr. Sejit Bobar
Slika 57. hromatografija na tankom sloju .a) ureaj za nanoenje uzorka, b) kada za
hromatografiranje, c) hromatogram
Kod hromatografije na tankom sloju nije pogodno mjeriti vrijeme izlaska komponente iz
sistema jer se to pri uobiajnim uslovima rada ne dogaa, ve se tokom odreenog trajanja
eksperimenta registruje rekativno zaostajanje komponente za frontom mobilne faze, pri emu
se rastojanja obino mjere linijama nanoenja uzorka do centra koncentracionih zona ( mrlja)
komponente. Karakteristino zaostajanje komponente naziva se Rf-vrijednost kompomente:
Rf= put komponente/put mobilne faze x100
Na taj nain, Rf- vrijednost je veliina, obrnuto proporcionalna vremenu za odravanje
komponente u sistemu.
Kod hromatografije na tankom sloju uslovi pojedinanog eksperimenta teko se mogu
ponoviti, tako da poreenje Rf- vrijednosti nije pouzdano. Stoga se u uzorku unutranji
standard(x), i sve Rf- vrijenosti porede s njim.
RX = put komponente/put standard x100
Ovakav postupak kompenzuje nehomogenost tankog sloja adsorbensa, temperaturne
fluktuacije i mnoge neregularnosti drugih uslova eksperimenta.
Kada je rije o reproduktivnosti Rf i Rx vrijednosti, treba odmah rei da ove karaktristike
nisu dovoljne za sigurnu identifikaciju supstanci zbog mnogih eksperimentalnih faktora koje
ne moemo kontrolisati.
113
dr. Sejit Bobar
Koncentracione zone komponenata u idealno sluaju predstavjaju krunu ili ovalnu mrlju
koja podstepeno uveava dimenzije (difuzno irenje) tokom putovanja sa mobilnom fazom. U
mnogim sluajevima oblik zona je deformisan- javljaju se mrlje s jednim ili dva repa,
preklapanjem mrlja dvije komponente ili jedinstvena supstanca daje dvije ili vie mrlja.
Uzroci ovakvih anomalija nisu upotpunosti poznati, no hromatografski sistem se moze
iskoristiti i u ovakvim sluajevima, ukoliko omoguuje reproduktivnu separaciju
komponenata
Stacionarna faza
Adsorbensi koriteni za stacionarnu fazu odgovaraju materijalima koji se upotrebljavaju kod
hromatografije na koloni, osim to su estice znatno manjih dimenzija. Adsorbensi obino
sadre i vezivo da bi se pojaala adhezija izmeu sloja i ploa, a kod nekih se dodaje i inertni
fluorescentni indikator ( npr. Cink-silikat) koji pomae pri detekciji koncentracioni zona pod
ultraljubiastom svjetlou. Takva posebna obrada adsorbenta posebno se i oznaava pri
emu se oznake gotovo standardizovane. Tanki sloj se moe modifikovati na razliite naine
u cilju zadovoljenja specifini potreba. Npr, za sloj se moe upotrijebiti adsorbent sastavljen
od vie komponenata ili se na istoj ploi mogu obrazovati dva susjedna sloja od razliiti
adsorbenata. Sloj se moe inpregnirati puferima,agensima za precipitaciju, agensima za
kompleksiranje, agensima za helatiziranje, srebro-nitratom, hidrofobnim materijalima itd.
Postoji najmanje 25 inertni materijala koji se koriste kao adsorbensi u TLC, ali nekoliko njih
ima najeu upotrebu:
Silika gel
Silika gel ili silikatne kiseline je bijeli amorfni porozni materijal pripremljen taloenjem iz
rastvora silikata dodatkom kiseline. Veliina pora kod komercijalini ploa je njaee 10-15
mikrometara. Silika gel je polarna supstanca kiselog karaktera. Aktiva mjesta za adsorpciju
su slobodne hidroksilne grupe na kojima dolazi do stvaranja vodikovi veza sa polarnim
supstancama.
Celuloza
U strukturi celuloze postoje OH grupe koje omoguavaju vezanje molekula vode pomou
vodikovi veza, to je ini pogodnim sredstvom za razdvajanje hidrofilni supstanci.
Aluminijum oksid
Aluminij oksid se primprema u 3 pH ranga: kiselo, bazino i neutralno u zavisnoti od toga za
koju vrstu supstance e se koristiti. Najvie se koristi bazina forma (na bazinom se
razdvajaju hidrokarboni, alkaloidi i steroidi).
Priprema sloja adsorbenata
Za nanoenje sloja postoji niz komercijalnih aparata. Aparat se sastoji od plastine podloge,
na koju se redaju staklene ploe (20x20 cm ili 20x10cm), i aplikatora s podesivim razrezom,
koji se puni suspenzijom adsorbenta, postavlja na kraj niza ploa, i prevlai preko njega, pri
emu iza sebe ostavlja tanak, ravnomjeran sloj suspenzije. Razrez se moe podeavati u
intervalima od 0-2000 mikrometara. Rezervoar alpikatora moe se podijeliti na dva dijela i u
njih usuti suspenzije dva razliita adsorbenta za obrazovanje razliita susjedna sloja na
ploama.Suspenzija adsorbenta pravi se u odreenoj koliini vode, u organskog rastvaraa ili
114
dr. Sejit Bobar
smjese vode i organskog rastvaraa, pri emu se treba strogo pridravati uputstva
proizvoaa. Obino se primjenjuje suspendovanje tokom 30-60 sekundi u elektrinom
mikseru. Ako adsorbent sadri vezivo, mora se odmah po suspendovanju nanijeti na ploe da
se ne bi stegao i postao neupotrebljiv. Brzina vezivanja gipsa, esto vezivnog materijala,
moe se smanjiti ako umjeto iste vode za suspenziju upotrijebi smeja vode i metanola.
Prevuene ploe se ostave da se osue na vazduhu, a zatim se aktiviraju prema uputstvu,
odnosno potrebi,najee pri 100-1200C. Slojevi celuloze, jonoimjenivakih smola,
poliamida samo se sue na vazduhu, a gel sephadexa koristi se odmah po nanoenju dok je
jo u nabubrelom stanju.
Ako je potrebno, ploe se impregniraju tako to se prskaju ili potapaju u rastvor
impregnacionog sredstva ili se jednostavno urone donjim krajem u rastvor i pusti da se on
kapilarnim silama upije do vrha ploe, poslije ega se sue i kondicioniraju.
Na tritu ima vie proizvoaa koji isporuuju gotove ploe za tankosloju hromatografiju.
Kako na staklu, tako i na fleksibilnoj aluminiskoj foliji i filmu. Garantovanog su sastava i
unoformnosti, a fleksibilne ploe imaju prednost to se mogu sijei.
Tehnika tankoslojne hromatografije
Nanoenje uzorka
Uzorak se nanosi runo ili automatski. Kod runog nanoenja koristi se mikroprica.
Poluautomatska metoda je nanoenje pomou ureaja koji minimalno oteuje sloj i nanosi
preciznu zapreminu uzorka. Postoje komercijalni ureaji za automatsko, reproduktivno
nanoenje.
Nanosi se 0,1-1% rastvora u koliini od 1-25mikrolitara. Zone uzorka na poetnoj liniji treba
da su prenika od 1-3mm, meusobno udaljene 1.2 cm, na 1,5-2 cm od ivice ploe. Za
analitiki rad, uzorak se nanosi u koliini od 1mikrogram do 1 nanogram.
Kvantitativna analiza
Hromatografija na papiru i tankom sloju moe se koristiti za kvantitativnu analizu. Ova
analiza se moe odvajati na vie naina:
1. mjerenjem intenziteta boje pojedine razdvojene supstance poslije prskanja sa
reagensom i to najee pomou denzitometra,
2. sjeenjem papira na onom mjestu gdje se nalazi supstanca ili skidanjem supstance sa
adsorbensom na tankom sloju hromatograma, eluiranjem boje u odgovarajuem
rastvarau pa mjerenjem u ultraljubiastom, vidljivom ili infracrvenom podruju,
3. istovremenim hromatografiranjem ispitivanog uzorka i nekoliko standarda razne
koncentracije , pa vizuelnim uporeivanjem boje.
Prednosti i nedostatci tankoslojne hromatografije
Glavne prednosti tankoslojne hromatografije su:
Izvanredno velik i jednostavan izbor hromatografskih sistema, pregled nad svim
komponentama uzorka, brzo i efikasno razdvajanje orgasnski spojeva, bolje razdvajanje sa
manjom koliinom supstance u odnosu na papirnu hromatografiju, za svaku komponentu u
115
dr. Sejit Bobar
uzorku je nuno optimizirati razdvajanje, jer je potrebno paziti na potpuno eluirenje uzoreka,
niska cijena rutinskih uzoraka,razvijanje ploa je mogue na razliite naine, bogatsvo
informacija o mogunosti paralelnog razvoja modela i standarda, a u semikvantitativnoj
analizi je oprema znatno jeftinija.
Nedostaci tankoslojne hromatografije su:
Slaba uinkovitost odvajanja, tea upotreba rezervnih faza, via mjera detekcije u odnosu na
HPLC, nedefinisani uslovi razdvajanja, za pravilno odvijanje rutinske TLC je potrebno
relativno veliko iskustvo analitiara, vee nego kod HPLC, komplicirana automatizacija radi
off-line procesa.
116

Interna Skripta - Instrumentalne Metode

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Interna Skripta - Instrumentalne Metode

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

INSTRUMENTALNE METODE

FARMACEUTSKO ZDRAVSVENI FAKULTET TRAVNIK

prof. dr. Sejit Bobar

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

UVOD U SPEKTROSKOPSKE ANALITIKE METODE

1. SVOJSTVA ELEKTROMAGNETSKOG ZRAENJA

1.1. Valna svojstva

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

Slika 1. Prikaz snopa monohromatinog zraenja valne duljine i amplitude A. Strijelice

(ova jednaina je do tri znaajne znamenke jednako primjenljiva u zraku i u vakumu)

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

1.2. estina svojstva zraenja

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

Dakle, valni broj je, ba kao i frekvencija, razmjeran energiji.

1B. ELEKTROMAGNETSKI SPEKTAR

1C. APSORPCIJA ZRAENJA

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

Slika 3. Podruja elektromagnetskog spektra

1C-1. Atomska apsorpcija

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

1C-2. Apsorpcija infracrvenog zraenja

Transmitanta se esto izraava u postotcima.

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

Tabela 1. Nazivlje( imena) i simboli koji se primjenjuju u apsorpcijskim mjerenjima

Slika 4. priguivanje snopa zraenja kao rezultat apsorpcije u otopini

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

1C-4. Odnos izmeu apsorbancije i koncentracije:Beerov zakon

gdje je a konstanta proporcionalnosti, apsorptivnost (apsorpcijski koeficijent), a b duljina

gdje se izraava u L cm-1 mol-1.

1C-5. Eksperimentalno odreivanje apsorbancije i transmitancije

Slika 5. Gubici zbog refleksije irasprenja

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

gubitke, rasprenjem na velikim molekulama ili nehomogenostima u otapalu moe se smanjiti

1C-6. Primjena Beerova zakona na smjese

gdje indeks n oznauje komponente l,2,...n koje apsorbiraju.

1C-7. Ogranienja primjenjljivosti Beerova zakona

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

2D EMISIJA ELEKTROMAGNETSKOG ZRAENJA

2D-1. Emisijski spektri

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

Slika 6. Dijagram energijski razina atoma natrijuma i jednostavne molekule. Prikazan je

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

temperature. Jasno je da su potrebne vrlo visoke temperature da bi toplinski pobuen izvor

Slika 7. Krivulje zraenja crnog tijela.

gdje je k konstanta proporcionalnosti. Taj je odnos temelje kvantitativne emisijske

2D-2. Emisija fluorescencijom i fosforescencijom

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE

dr. Sejit Bobar

3. INSTRUMENTI U OPTIKOJ SPEKTROSKOPIJI

Interna skripta - INSTRUMENTALNE METODE