UNIVERZITET U TRAVNIKU

FARMACEUTSKO ZRDRAVSTVENI FAKULTET

FARMACIJA

Klinička Farmacija
PRETKLINIČKA ISPITIVANJA
-seminarski rad-

Kandidat: Mentor:
Merima Begić prof. dr. Nedžad Mulabegović

Indeks broj:

Travnik, 2020.
 SAŽETAK

Predklinička ispitivanja potencijalnih lijekova in vitro i in vivo provode se u skladu s načelima

dobre laboratorijske prakse, a za ispitivanja na životinjama potrebno je dobiti suglasnost Etičkog
povjerenstva za rad s pokusnim životinjama.

Ispitivanja koja se vrše:

a) Farmakodinamska,
b) Toksikološka,
c) Kancerogenosti,
d) Podnošljivosti i sigurnosti,
e) Farmakokinetička,
f) Toksikokinetička.

2
 ABSTRACT

Pre-clinical trials of potential drugs in vitro and in vivo are carried out in accordance with the

principles of good laboratory practice, and animal testing requires the consent of the Ethics

Committee for work with experimental animals.

Tests performed:

a) Pharmacodynamic,

b) Toxicological,

c) Carcinogenicity,

d) Tolerability and safety,

e) Pharmacokinetic,

f) Toxicokinetic.

3
Sadržaj;

1. UVOD..........................................................................................................................................4

2. PREDKLINIČKA ISPITIVANJA...........................................................................................5

2.1 Farmakodinamska ispitivanja................................................................................................5

2.2 Toksikološka ispitivanja:.......................................................................................................8

2.2.1 Ispitivanje akutne toksičnosti.........................................................................................8

2.2.2 Ispitivanja genotoksičnosti i mutagenosti.......................................................................9

2.2.3 Ispitivanje reproduktivne toksičnosti..............................................................................9

2.3 Ispitivanja kancerogenosti...................................................................................................10

2.4 Ispitivanje podnošljivosti i sigurnosti.................................................................................10

2.5 Farmakokinetička i toksikokinetička ispitivanja.................................................................10

3. ZAKLJUČAK..........................................................................................................................11

4. LITERATURA.........................................................................................................................12

4
1. UVOD

Razvoj novih lijekova uključuje pretkliničku i kliničku fazu. Tijekom pretkliničke faze odabire
se između molekula koje bi u budućnosti mogle postati lijek. U sklopu pretkliničkih studija
provode se fizikalno-kemijska ispitivanja: in vitro, koja uključuju ispitivanja fizikalno-kemijskih
svojstava ispitivanih molekula, njihove stabilnosti, topljivosti i propusnosti in vivo životinje,
farmakodinamička, farmakokinetička i toksikološka ispitivanja.

Predklinička ispitivanja potencijalnih lijekova in vitro i in vivo provode se u skladu s načelima

dobre laboratorijske prakse, a za ispitivanja na životinjama potrebno je dobiti suglasnost Etičkog
povjerenstva za rad s pokusnim životinjama.

Nakon dobivanja povoljnih rezultata iz predkliničkih studija, provode se ljudske studije, kliničke
studije kojima je cilj otkriti farmakodinamička svojstva testiranog potencijalnog lijeka, njegove
nuspojave i farmakokinetiku kako bi se utvrdila učinkovitost i sigurnost ispitivane tvari na
ljudima. Klinička ispitivanja provode se u skladu s načelima dobre kliničke prakse.

5
2. PREDKLINIČKA ISPITIVANJA

2.1 Farmakodinamska ispitivanja

Uključuju djelovanje lijeka na organizam, mehanizam djelovanja, ciljanu strukturu na koju

potencijalni lijek djeluje (receptori, ionski kanali, enzimi), studije odnosa doze i učinka
lijeka, povezanosti strukture i učinka lijeka.
U odnosu na farmakodinamičke pretkliničke studije, provode se farmakodinamički testovi
kako bi se utvrdio potencijalni lijek na glavnim organskim sistemima laboratorijskih
životinja. Otkrivaju organ ili sistem na koji ispitivana tvar vrši najpovoljniji potencijalni
terapijski učinak. Za farmakodinamičke testove najčešće se koriste glodari, miševi i štakori.

 Farmakodinamički testovi uključuju testove:

 Spontane aktivnosti
 Moguće analitičko djelovanje (centralno i periferno)
 Hipnotička akcija
 Psihomotorna koordinacija
 Potencijalno anksiolitičko djelovanje
 Potencijalno antidepresivno djelovanje
 Utjecaj na krvni pritisak, puls i disanje
 Uticaj na pokretljivost gastrointestinalnog trakta
 Utjecaj na metabolizam (koncentracija glukoze u krvi, koncentracija lipida)

Najčešće korišteni testovi za ispitivanje potencijalnih analgetičkih učinaka su metode vruće

ploče, torzijski test i test zračenja toplinom.

1. Metoda vruće ploče temelji se na mjerenju vremena reakcije od trenutka stavljanja

životinje na ringlu (zagrijanu na temperature od 52 do 53 stepeni) do trenutka lizanja
zadnje šape zbog pojave bola. Nakon izlaganja vrućoj ploči, životinja prvo liže prednju
šapu i integrira se u više sfere mozga, dok su desna dva refleksa tipična za donje sfere i

6
 leđnu moždinu. S obzirom na to, metoda vruće ploče je pouzdana metoda za ispitivanje
analgezije koja se postiže centralnim mehanizmima.
2. Ispitivanje toplotom zračenja temelji se na usmjeravanju zraka svjetlosti na vrh repa
laboratorijske životinje, uzrokujući bol i kičmeni obrambeni refleks pomicanja repa.
Supstance čiji mehanizam djelovanja uključuje spinalnu analgeziju značajno povećavaju
prag pojave bola i produžavaju vrijeme izloženosti repa životinje toplotnoj stimulaciji bez
izazivanja obrambenog refleksa.
3. Ako ispitivana supstanca ima analgetički učinak inhibiranjem sinteze prostaglandina, što
je mehanizam djelovanja neopijatskih analgetika, tj. Od nesteroidnih protuupalnih
lijekova, djelotvorna metoda za ispitivanje analgetičkog učinka je test koji izaziva bolnu
iritaciju intraperitonealnom primjenom otopine octene kiseline, zbog čega se kod trudnih
životinja javljaju karakteristični grčevi. Ako ispitivana tvar ima analitički učinak, broj
grčeva bit će značajno manji u tretiranoj skupini kombinacijom sirćetne kiseline I
ispravne supstance u odnosu na grupu tretiranu samom sirćetnom kiselinom.
4. Poremećaj psihomotorne koordinacije može nastati nakon primjene određenog broja
lijekova. Ovaj poremećaj je posebno karakterističan za lijekove koji se koriste u liječenju
anksioznosti, antidepresive, lijekove koji se koriste za liječenje psihoze, antihistaminike,
a kod životinja se može ispraviti metodom rotirajućeg štapa. neprirodnim nefiziološkim
uslovima. Za ispitivanje potencijalnog anksiolitičkog efekta ispitivane supstance korisni
farmakodinamski testovi su testovi su test lavirinta I test otvorenog polja.
5. Tokom lavirint testa, miševi se postavljaju u standardne ograničene prostore koji se
sastoje od dva otvora, dva zatvorena dela I centralne platform. Otvoreni delovi se nalaze
jedan naspram drugog odvojeni medjusobno centralnom platformom. Nakon aplikovanja
leka miša treba postaviti u centralni deo, I okrenuti ga ka jednom od otvorenih delova.
Test traje 5min. Neophodno je meriti vreme provereno u otvorenim I zatvorenim
delovima, kao broj ulazaka miša u otvorene I zatvorene delove. Ukoliko ispitivana
supstanca ispoljava anksiolitičko delovanje, produžava se vreme boravka miša u
otvorenim delovima I povećava se broj ulazaka životinje u otverene delove.
6. Test otvorenog polja podrazumeva postavljanje miša nakon aplikovanja leka u centar
staklene arene čiji je pod izdeljen u 16 jednakih kvadrata. Tokom 5 min trajanja testa
prati se specifično ponašanje miša.

7
7. Merenje krvnog pritiska I registrovanje EKG promena, najčešće su farmakodinamske
metode za ispitivanje funkcije kardiovaskularnog sistema. Precizni efekti uticaja
kardioaktivnih lekova se mogu videti primenom supstanci pomoću infuzione pumpe u
jugulacnu venu laboratorijske životinje. Istovremeno, životinja je priključena I na EKG
aparat. Na ovaj način se precizno mogu uočiti prve reakcije miokarda na primenu
ispitivane supstance, kontimirana reakcija I toksični efekti, a na osnovu brzine moguće je
izračunati dozu supstance koja je pomenute promene izazvala.

8. Farmakodinamički efekti supstanci koje utječu na funkciju respiratornog centra efikasno

se procjenjuju mjerenjem broja disanja u minuti i određivanjem parcijalnog pritiska
kiseonika i ugljen-dioksida u kapilarnoj krvi. Analiza plina kapilarne krvi
eksperimentalnih životinja pokazuje npr. taj mehanizam koji ovisi o dozi morfija
smanjuje osjetljivost respiratornog centra na parcijalni pritisak ugljen-dioksida, koji je
povišen kod životinja liječenih većim dozama morfija.
9. Promjena peristaltike tankog crijeva uslijed primjene supstance najčešće se ispituje kod
miševa. Princip metode je davanje životinjama per os 10% na suspenzijama ljekovitog
ugljena. Nakon 30 minuta miševi se žrtvuju i nakon pripreme tankog crijeva mjeri se
udaljenost medicinskog ugljena (sadržaj crne boje) od slijepog crijeva životinje. U
kontrolnoj grupi životinja udaljenost je u intervalu od 8-12 cm. Ako supstanca smanjuje
smrtnost crijevnog trakta (antidijarei: loperamid, opijatni analgetici: mortin, antagonisti,
acetilholin na muskarinskim receptorima: atropin), udaljenost medicinskog ugljena od
slijepog crijeva i obrnuto.
10. Da bi se ispitali farmakodinamički učinci supstanci s potencijalnim antidijabetičkim
djelovanjem, neophodno je inducirati dijabetes kod laboratorijskih životinja. Dijabetes je
najčešće naznačen upotrebom aloksana ili streptozotocina. Uzrokujući oksidativni stres,
aloksan uništava beta ćelije endokrine gušterače i tako uzrokuje dijabetes. Danas se često
provode istraživanja kako bi se proučile supstance koje imaju sposobnost sprečavanja
endokrinih beta ćelija gušterače, kao i sposobnost da ih natjeraju da se množe i
povećavaju, što bi povećalo lučenje insulina i poboljšalo regulaciju glikolize.

8
2.2 Toksikološka ispitivanja:

U sklopu toksikoloških ispitivanja ispituju se akutna, subakutna i hronična toksičnost, efekti na

reprodukciju, mutagenost, genotoksičnost i karcinogenost utvrđuju se u okviru toksikoloških

testova. Kandidat za lijek koji je ispunio početne kriterije odabira i čiji je potencijalni

farmakološki profil grubo proučen, ulazi u detaljna pretklinička ispitivanja koja uključuju

utvrđivanje sigurnosti i ispitivanje farmakokinetičkih svojstava.

2.2.1 Ispitivanje akutne toksičnosti

Efekti pojedinačnih doza moraju se izvršiti na najmanje dvije vrste sisara. Tijekom ispitivanja
akutne toksičnosti poželjno je odrediti maksimalnu dozu pri kojoj se toksični učinci još ne
javljaju, minimalnu smrtnu dozu (najmanju dozu koja uzrokuje smrt životinje), prosječnu dozu
lefala (LD50), (dozu koja uzrokuje smrt 50% životinja).
Ispitna supstanca se daje intravenozno i nužno na način za koji se pretpostavlja da se daje
ljudima. Može biti per os, intramuskularno, potkožno, intraperitonealno, inhalaciono i
transdermalno.
Glodavci (miševi i štakori) i ne glodari koriste se u studijama akutne toksičnosti. Istraživanje se
izvodi odvojeno na ženama i muškarcima sa najmanje 3 različite doze. Svaka primijenjena doza
testira se na najmanje 6 muškaraca i žena, tako da minimalni broj glodara uključenih u test
akutne toksičnosti iznosi oko 200-300.
Nakon provođenja testova akutne toksičnosti, preživjele životinje se promatraju najmanje 14
dana, a na kraju promatranog razdoblja životinje se žrtvuju i provode makropatološke i
listatološke analize. S obzirom na danas razvijene testove toksičnosti in vitro, testove akutne
toksičnosti treba izvoditi na što manjem broju životinja. Pretklinička toksikološka ispitivanja, iz
etičkih razloga, provode se u skladu s tzv. Načelo 3R. Zamjena-zamjena životinjskog modela in
vitro testovima, Smanjivanje smanjenja broja životinja uključenih u eksperiment (što se postiže
korištenjem istog sloja laboratorijskih životinja identičnog genetskog porijekla, radi smanjenja
intertindividualnih razlika i smanjenja standardne devijacije ispitivanih parametara, Refinementi-

9
poboljšanje i tehničko unapređenje modela ispitivanja, odnosno primjena tehnički preciznijih
metoda i uređaja koji bi značajno smanjili mjerenja pogrešaka. Tijekom ispitivanja akutne
toksičnosti potrebno je pratiti znakove koji prethode smrti životinje, šuštanje dlake, poremećaj
koordinacije, krvarenje.

2.2.2 Ispitivanja genotoksičnosti i mutagenosti

Testovi genotoksičnosti i mutagenosti određuju da li ispitivana supstanca može prouzrokovati

oštećenje gena i mutaciju klica i somatskih ćelija. Tekstovi o genotoksičnosti mogu odrediti
potencijal ispitivane supstance da izazove maligne bolesti. Ova ispitivanja moraju biti završena
prije početka faze II kliničkih studija, tj. Prije primjene potencijalnog lijeka na pacijente.

2.2.3 Ispitivanje reproduktivne toksičnosti

Testovi reproduktivne toksičnosti obuhvataju ispitivanja

a) fertiliteta (sposobnosti oplodnje) i ranog embrionalnog razvoja (ispitivana

supstanca se primenjuje pre parenja, sve do oplodnje); uticaj na mogućnost
parenja,prati se ponašnje pre parenja I polna želja, kao I sposobnost začeća.
b) embrio-fetalnog razvoja, što ujedno predstavlja I ispitivanje potencijalne
teratogenosti (ispitivana supstanca se primenjuje skotnim ženkama u period
organogeneze (što je kod pacova period od 6 do 15 dana gestacije)
c) prenatalnog i postriatalnog razvoja (kada se ispitivana supstanca primenjuje od 6-
og dana gestacije do 21-og dana laktacije kod pacova); prati se uticaj na tok
trudnoće, porodjaj, broj fetusa, broj živorodjenih I mrtvo rodjenih mladunaca
d) multigeneracijske studije, kada se ispitivana supstanca primenjuje na više
generacija laboratorijskih životinja.

Tokom ispitivanja reproduktivne toksičnosti na mužjacima, odredjuje se uticaj ispitivane

supstance na broj i pokretljivost spermatozoida I vijabilnost (održivost) sperme.

10
2.3 Ispitivanja kancerogenosti

Cilj studije karcinogenosti je pokazati potencijal lijeka da izaziva maligne tumore na životinjama
i utvrditi koliko su rezultati ispitivanja karcinogenosti na životinjama relevantni za ljude.
Ispitivanja kancerogenosti potrebna su za svaku supstancu koja se ispituje na ljudima. Nakon
testa uspoređuje se broj malignih oboljenja kod kontrolnih i pokusnih životinja i analiziraju se
mogući rizici od malignih oboljenja zbog upotrebe ispitivane supstance. Ako se broj malignih
tumora u pregledanih životinja značajno razlikuje u odnosu na kontrolne, supstanca ima
kancerogeni potencijal. Studije karcinogenosti provode se tako da se potencijalni lijek daje
hranom ili vodom za piće doživotno, a pojava tumora utvrđuje se nakon smrti životinje ili prije
smrti, patohistološkom analizom zahvaćenih tkiva. Testovi karcinogenosti provode se tako da se
potencijalni lijek doživotno daje hranom ili vodom za piće, a pojava tumora utvrđuje se nakon
smrti životinje ili prije smrti, patohistološkom analizom zahvaćenih tkiva.

2.4 Ispitivanje podnošljivosti i sigurnosti

Tokom pretkliničkih studija prate se neželjeni efekti na životinjama, koji pružaju informacije o
potencijalno štetnim efektima nove molekule. Postoje nuspojave, koje će se, ako se pojave na
životinjama, najvjerojatnije pojaviti na ljudima: oštećenja centralnog i perifernog živčanog
sustava laboratorijskih životinja su nuspojave koje se ne mogu pouzdano prenijeti na ljude.

2.5 Farmakokinetička i toksikokinetička ispitivanja

Farmakokinetičke studije uključuju proučavanje resorpcije sa mjesta: primjena na sistemsku

cirkulaciju, distribucija u tijelu, biotransformacija i izlučivanje potencijalnog lijeka. Rezultat
biotransformacije i izlučivanja je eliminacija iz organizma. Tokom farmakokinetičkih studija,
posebna pažnja posvećuje se proučavanju utjecaja nove molekule na funkciju mikrosomskih
enzima jetre. Mikrosomski jetreni enzimi presudni su za biotransformaciju ksenobiotika (strane
tvari), a potencijalni lijek može inducirati ili inhibirati njihovo djelovanje i tako stupiti u
značajne interakcije s drugim supstancama s kojima se primjenjuje istodobno.

11
3. ZAKLJUČAK

Pretklinička ispitivanja iznimno su važan proces u razvoju lijeka. Ispitivanja koja se vrše tokom
pretkliničkih studija daju bitne informacije o toksičnosti, farmakodinamičnosti, farmakokinetici,
djelovanju i nuspojavama lijeka. Također omogućavaju sigurnu primjenu konačnog proizvoda na
ljudima. Odnosno otkrivaju sve nepoznanice aktivne supstance.
Ova ispitivanja daju zeleno svjetlo testiranju na ljudima.

12
4. LITERATURA

1. Agencija za lijekove i medicinske proizvode, Postupanje sa signalima u

farmakovigilanciji. Dostupno na: http://www.halmed.hr/Farmakovigilancija/Postupanje-
sa-sigurnosnim-signalima/. Datum pristupa: 7. 6. 2016.
2. Yu LJ, Chen Y, Deninno MP, O’Connell TN, Hop CE. Identification of a novel
glutathione adduct of diclofenac, 4’-hydroxy-2’-glutathion-deschloro-diclofenac, upon
incubation with human liver microsomes. Drug Metab Dispos. 2005; 33: 484–488.
3. U. S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center
for Drug Evaluation and Research (CDER). Drug Interaction Studies – Study Design,
Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations (draft
guidance), 2012. www.fda.gov
4. European Medicines Agency, Committee for Human Medicinal Products (CHMP).
Guideline on the Investigation of Drug Interactions, 2012. www.ema.europa.eu

13