A fehérjeszerkezet-vizsgálat korszerű módszerei

III. Előadás

Kísérleti és elméleti módszerek csoportosítása,

Biokémiai és molekuláris biológiai módszerek bemutatása
 Szerkezetvizsgáló módszerek csoportosítása
- 1. a megismerni kívánt szerkezeti tulajdonság szerint
 másodlagos, harmadlagos, negyedleges szerkezet

 direkt vagy indirekt úton

 termodinamikai sajátságok (pl. kalorimetria)

 lokalizáció (pl. mikroszkópos módszerek)

 fehérje-fehérje kölcsönhatások (pl. fluoreszcens technikák)

 térbeli morfológia (pl. gélelektroforézis, hidrodinamikai módszerek)

 atomcsoportok térbeli orientációja (pl. optikai spektroszkópiai módszerek)

 atomi koordináták (pl. NMR spektroszkópia, röntgendiffrakció)

2. elméleti háttér szerint

 biokémiai, molekuláris biológiai, biofizikai, elméleti kémiai, stb.

 a legtöbb esetben nem élesen elválaszthatóak

3. módszer, megközelítés szerint

 kísérleti módszerek

 elméleti módszerek (kvantumkémiai, molekulamechanikai, bioinformatikai)

 Szerkezetvizsgáló módszerek csoportosítása

4. térbeli felbontás
 milyen részletességgel látjuk

a molekula szerkezetét
 akár 1.0 Å !!

5. időbeli felbontás
 mennyire képes az adott

módszer követni és
detektálni a szerkezet
időbeli változásait
-15
 akár 10 s !!
 Szerkezetvizsgáló módszerek csoportosítása

4. térbeli felbontás
 atomi felbontású módszerek:

röntgenkrisztallográfia, NMR spektroszkópia, neutrondiffrackció, az összes elméleti

módszer
 alacsony felbontású módszerek:

klasszikus biokémiai és molekuláris biológiai módszerek, mikroszkópos módszerek,

hagyományos spektroszkópiai módszerek (UV/Vis, fluoreszcens, IR, Raman, stb.)
optikai spektroszkópiai módszerek (ECD, VCD, ROA)

5. időbeli felbontás
 nagyfelbontású módszerek:

hagyományos spektroszkópiai módszerek (UV/Vis, fluoreszcens, IR, Raman, stb.)

optikai spektroszkópiai módszerek (ECD, VCD, ROA), neutrondiffrackció, az
összes elméleti módszer
 alacsony felbontású módszerek: röntgenkrisztallográfia, NMR spektroszkópia

MÓDSZEREK, ESZKÖZÖK KOMBINÁLÁSA!

 Hagyományos biokémiai, molekuláris biológiai és egyéb
alacsony felbontású kísérleti módszerek

1. Natív gélelektroforézis
 a klasszikus SDS-PAGE technikával

szemben nem alkalmaz denaturáló

körülményeket
 előnyei:

- olcsó, elérhető eszközök

- nem igényel sok mintát (< 1 g)
- nem igényel 100% tiszta mintát

 alapja: a fehérje kovalens módosítása, ill.

konformációváltozása a fehérje mobilitásának
megváltozását eredményezi
 a mobilitás töltéstől való függése alapján a reaktív
aminosav oldalláncok száma becsülhető
 Hagyományos biokémiai, molekuláris biológiai és egyéb
alacsony felbontású kísérleti módszerek

1. Natív gélelektroforézis
 Szimultán jelen lévő, interkonvertáló konformerek detektálásának sikere a
konformációváltozás sebességétől és az elektroforetikus szeparáció
sebességétől egyaránt függ
 Hagyományos biokémiai, molekuláris biológiai és egyéb
alacsony felbontású kísérleti módszerek

2. Transzverzális gradiens gélelektroforézis

 Az elektroforetikus vándorlás
irányára merőleges gradiens
alkalmazása
- denaturáló ágens (karbamid) –
gombolyodás és letekeredés
kinetikája
- akrilamid – mobilitás és akrilamid
koncentráció összefüggés
- pH – titrációs görbe

 gradiens gél öntése: 3 csatornás

perisztaltikus pumpa segítségével
 Hagyományos biokémiai, molekuláris biológiai és egyéb
alacsony felbontású kísérleti módszerek
2. Transzverzális gradiens gélelektroforézis

 Gombolyodás kinetika:
az átalakulás sebességének
hatása az karbamid
gradiens jelenlétében
 Hagyományos biokémiai, molekuláris biológiai és egyéb
alacsony felbontású kísérleti módszerek

3. Immunokémiai konformációs vizsgálatok

 alapja: az antigén konformációja nagyban

befolyásolja az antitest kötődését
 az antitest-antigén kölcsönhatás erősségére és
azon keresztül a fehérje konformációjára
kívánunk következtetni.
 monoklonális antitestek, kiválasztásuk
kulcsfontosságú
- mihez kötődik? (szintetikus fehérjefragmens,
egész fehérje, vagy csak egy domain?)
- milyen konformációs állapottal hat kölcsön?
(natív v. denaturált is?)
 Hagyományos biokémiai, molekuláris biológiai és egyéb
alacsony felbontású kísérleti módszerek

3. Immunokémiai konformációs vizsgálatok

 előnyök:
- kevés mintát igényel
- érzékeny módszer
- kísérleti körülmények optimalizálása után screeningre alkalmas
- funkcionális és fizikai tesztek antitest jelenlétében
 hátrányok:
- bonyolult kísérleti körülmények
- gyakran több antitest alkalmazása esetén nyerhető csak egyértelmű válasz
- immobilizált antigén konformációváltozást szenvedhet, denaturálódhat
 Hagyományos biokémiai, molekuláris biológiai és egyéb
alacsony felbontású kísérleti módszerek
4. Hidrodinamikai vizsgálatok

 egy vizes közegben oldott, vagy szuszpendált

makromolekula mozgását vizsgáló módszerek
 a vizsgált molekula analitikai ultracentrifuga
segítségével meghatározott ülepedési
tulajdonságai
- girációs sugár
 - ülepedési sebesség, együttható

 ülepedési adatok és alak modellek

alkalmazásával következtetett konformáció