DEBRECENI EGYETEM — Oktatási segédlet 2010 126 oldal {frissítve 2012.12.

03}
Összeállította : Szentirmai Attila Emeritus egyetemi tanár

BIOTERMÉK TECHNOLÓGIA
Szerkesztési elvek: taxonomiai fajnevek dőlt betüvel; Publikáció (folyóirat.Évszám.kötetszám:oldalszám tól-ig);
Enzimnév néha dőlt betüvel;
TARTALOMJEGYZÉK:
BEVEZETÉS — EXPOZÍCIÓ? 1
AZ ELJÁRÁSOKHOZ SZÜKSÉGES SZERVEZETEK KIVÁLASZTÁSA 3
SZTEROIDOK DEHIDROGÉNEZÉSE 14
ALKOHOLOK OXIDÁCIÓJA KETONNÁ VAGY ALDEHIDDÉ 18
SZÉN-SZÉN KETTŐSKÖTÉS TELÍTÉSE 21
A KETTŐS KÖTÉS IZOMERIZÁCIÓJA 22
SZTEROIDOK HIDROXILEZÉSE 24
KORTIKOIDOK ELŐÁLLÍTÁSÁT SZOLGÁLÓ EREDMÉNYEK 28
A SZTEROID VÁZ OXIDATÍV LEBOMLÁSA 35
19-NORSZTEROID TOTÁLSZINTÉZIS 41
ENANTIOMER ÖSZTRON INTERMEDIER ELŐÁLLÍTÁSA 48
6-AMINOPENICILLINSAV (6-APS) ELŐÁLLÍTÁSA 49
KONVERZIÓRA ALKALMAS SEJTTÖMEG FELHASZNÁLÁSA 63
7-AMINO KEFÉMSAV (7-ACA) és szármaszékainak ELŐÁLLÍTÁSA 64
L-AMINOSAK RLŐÁLLÍTÁSA 66
AZ AROMÁS AMINOSAVBIOSZINTÉZIS SZABÁLYOZOTTSÁGA 73
ELJÁRÁSOK TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSÁRA 85
L-ASCORBINSAV ELŐÁLLÍTÁSÁHOZ KAPCSOLÓDÓ TEVÉKENYSÉG 92
GLÜKÓZ-FRUKTÓZ CUKORSZÖRP NAGYIPARI ELŐÁLLÍTÁSA 95
BIOETANOL 100
A CIKLODEXTRIN BIOLÓGIÁJA 105
KÖRNYEZETET SZENNYEZŐ ANYAGOK BIOLÓGIAI HASZNOSÍTÁSA 111
Szakmai dolgozat kérdéseire adható válasz 119

BEVEZETÉS — EXPOZÍCIÓ?
Az idesorolható biotechnológiai folyamatokat a szakirodalom eredetileg biotranszformációnak
nevezve tárgyalta. Ugyanakkor transzformációnak nevezték a mikrobiális genetika művelői a
mikroorganizmus genetikai állományában idegen DNS bevitelével előidézett öröklődő változást.
Ezért célszerűnek látszik a megkülönböztető biokonverzió elnevezés használata. Ezekben az
eljárásokban különféle szerves vagy szervetlen kiindulási vegyületekből egy vagy több enzim
specifikus katalitikus aktivitását hasznosítva jutunk el a célvegyületnek tekintett (piacképes)
hasznos termékhez. Az eljárással szemben támasztott követelmény, hogy a szubsztrátum jó
hatásfokkal, minimális anyagvesztés mellett, nagy koncentrációban, (kis térfogatban) kerüljön
átalakításra.
A kiválasztott mikroszervezeteket a fenti cél elérése érdekében olyan fermentációs
körülmények között dolgoztatják, hogy a túlélés egyetlen lehetősége számukra a kívánt
reakciósor hatásos működtetése legyen. Az átalakítandó kiindulási vegyület többnyire
valamilyen preparatív kémiai tevékenység köztes terméke (kulcs intermedierje), amely általában
a primer anyagcsere enzimei által katalizált biokonverziós reakcióban szubsztrát-analogként vesz
részt.

1
A gazdaságosságra törekedve
biokonverziós eljárást alkalmaznak a
kémiailag körülményesen kivitelezhető
feladat megoldására. (Az alkohol
dehidrogenáz királis vegyületek
előállítására kerülhet alkalmazásra. A
galaktóz oxidáz katalizálja a királis, vagy
prokirális alifás alkoholok
sztereospecifikus oxidációját. A peroxidáz
az arómás vegyületek hidroxilezésére, a
szulfatáz a fenolizomerek
szétválasztására.használható. A karbonsav
eszterázok a rezolválást egyszerüsítik.) Az
eljárások egy részénél az élő sejt jelenléte
szükséges, míg más részük akár rögzített
enzimekkel is lefolytatható. A mikrobiológus az utóbbi esetben az enzimtermelésre használható
mikroorganizmus tömegtenyésztését végzi, kidolgozva a technológiát, amely a kiválasztott, vagy
genetikai munkával előállított mikroszervezet gazdaságos alkalmazását lehetővé teszi. A
mikrobiális enzimek specificitását hasznosítva környezetszennyezés nélkül vállalkozhatunk
különféle vegyipari alapanyagok előállítására is Az optimális eljárásban kémiai lépések és
biológiai reakciók váltakozva is részt vehetnek, amint az példaként a CETUS által propénből
propilénoxid előállítására kifejlesztett eljárásban tanulmányozható
*
Az első lépésben az eljárás H2O2 (hidrogénperoxid) igényét kielégítendő az
Oudemansiella mucido piranoz oxidáza glükózból szorbozont állít elő, amit a ciklust teljesítve
platina katalizátor mellett redukálnak vissza glükózzá.
*
A Clamidiomyces fumago klórperoxidáza állítja elő propénből a klórpropánt,
*
amiből H2O2 jelenlétében egy Flavobacterium törzs klórhidrin epoxidáza alakítja ki a
propilénoxidot.

2
AZ ELJÁRÁSOKHOZ SZÜKSÉGES SZERVEZETEK KIVÁLASZTÁSA
Első feladat a természetes élőhelyükön előforduló populációból kiválasztani az
igényeinknek megfelelő tulajdonságú, a reprodukálhatóság szempontjából genetikailag stabil
(törzs) klón kiválasztása. A feltétel teljesítése szempontjából előnyös a gyüjteményekben
elhelyezett törzsek átvizsgálása, amelyeknél a szabadalmi szempontból kívánatos rendszertani
vizsgálatokat már elvégezték. A gyüjtemények katalógusainak tanulmányozásán kívül sokat
segít a szakirodalom ismerete és néhány kézikönyv. Ilyen például Cherney és Herzog “Microbial
transformations of Steroiods” /Academic. P. New York 1967/, vagy Klaus Kieslich “Microbial
transformation of Non-steroid Cyclic Compounds” /Georg Thieme Verlag Stuttgart 1976/
Ezekben az átalakítandó vegyületek, illetve a a termékek szempontjából kapunk használható
adatot az átalakítást végző mikroorganizmus megjelölésével. Az irodalom tájékoztat arról, hogy
bizonyos reakciók elősegítésére milyen rendszertani csoportok részletesebb vizsgálata vezethet
eredményre. Az utóbbi időben hasonló összefoglaló munkák nem jelentek meg, mert a
különböző számítógéppel elérhető adatbázisok feleslegessé teszik.

A kiválasztás kísérleti munkáját indokolja a leírtaknál előnyösebb.törzs izolálásának

lehetősége, továbbá a genetikai munkával fejlesztett variánsok alkalmazhatóságának reménye. A
kiválasztás rutinszerű.munka. Folyékony táptalajon növesztett tenyészethez adagolják az
átalakítandó szubsztrátumot. Meghatározott ideig végzett átalakítási periódus után általában a
céltermék kinyerése szempontjából előnyös szerves oldószeres extrakcióval különíthető el a
termék. Más esetben a vizes fázisból vett minta összetétele kromatográfiával elválasztva
vizsgálható. Könnyebb a törzs kiválasztása, ha az elvégzendő átalakítás a mikróba számára
„javítja” az életkörülményeket. A szterin oldallánc lebontására alkalmas mikroszervezet táptalaja
egyedüli szénforrásként koleszterint tartalmazott.
Hasonló meggondolás szerint paraffint hasznosító mikroszervezet izolálása érdekében a
tenyésztésre használt táptalaj egyedüli szénforrásként normál paraffint tartalmazott. A kinőtt
tenyészetet többször átoltva hasonló összetételű táptalajra; a paraffint hasznosító tenyészet
oltóanyaga reprodukálhatóan fenntartható. A következő lépésben a tenyészetet addig hígítjuk,
amíg egyetlen élősejtből növekedő tenyészethez jutunk. A klón elkülönítése, néha nehéz
bonyolult feladat, mert lehetséges, hogy a törzs növekedése egy konzorcium hatásos
együttműködését jelenti. A törzs ez esetben tiszta formában nem tartható fenn.

3
 SZTEROIDOK MIKROBIÁLIS ÁTALAKÍTÁSA

A szteroidok mikrobiológiai átalakítását célzó kutatások kezdettől fogva szorosan kapcsolódtak a

gyógyszeripar igényeihez. A szteroid hormonok és hormonanalógok előállítására kidolgozott
eljárásokban a meglehetősen drága és sok esetben kémiailag érzékeny vegyületekre tekintettel a
biológiai lépések – az enzimreakciók sztereospecifitása, valamint a biológiai eljárások enyhe
reakciókörülményei miatt - kezdettől fogva fontos szerepet nyertek. A világszerte alkalmazott
mikrobiológiai eljárásokban oxigenázok, oxidoreduktázok, izomerázok, dehidrogenázok,
dehidratázok és acilázok működését hasznosítják. A szteroidok átalakítását célzó kutatómunka
irányát szakmai mélységét minden esetben a gyakorlati előnyök, az ipar által támasztott igények
szabták és szabják meg ma is. A gazdaságosság és nem kis mértékben a világpiaci ár határozza
meg a bevezetendő eljárással szemben támasztott követelményeket.
A biokonverziós eljárásban felhasználható mikrobiális reakció legyen tehát
- egy termékhez vezető
- teljessé tett
- viszonylag kis térfogatban végezhető
- rövid idő alatt végbemenő folyamat
- olcsó segédanyagokat igénylő
- egyszerü berendezésekben lefolytatható
- a teremék kinyerésére viszonylag egyszerű, hatásos módszer szolgáljon
A gazdaságosság a kémiai reakciók és az enzimreakció legelőnyösebb kombinálását, optimális
illesztését teszi szűkségessé. A fermentációs eljárás költséges volta miatt sokszor célszerűbb több
egymást követő enzimreakciót a köztes termék kinyerése és tisztítása nélkül végrahajtani. Ezen
kívánalmaknak megfelelően a mikrobiológus feladata egyrészt az elvárást teljesítő törzs
kiválasztása, illetve genetikai módszerekkel történő előállítása; másrészt a kiválasztott törzs
élettani tulajdonságainak felderítése után a megismert, genetikailag meghatározott biokémiai
adottságainak gazdaságos hasznosítása üzemi körülmények között. Végül is biztonságosan
megvalósítható eljárás kidolgozása és beillesztése a szintézisút kémiai lépései közé.
Az ipari gyakorlat általában olyan vegyület átalakítására kívánja a kiválasztott
mikroorganizmus enzimkészletét használni, amely a normál anyagcserében nem fordul elő, sőt
sok esetben a környezetben elő nem forduló szintetikus termékek előállítása a cél. Ezek
átalakítására az ad lehetőséget, hogy az enzim felépítésétől függően a természetes
szubsztrátumhoz hasonló szerkezetű vegyület is kapcsolódhat az aktív centrumhoz és a reakció
sikeres befejeztével onnan el is távozhat.
Egy-egy új vegyület mikrobiológiai átalakítására szolgáló eljárás kidolgozása a
különböző forrásból származó, különböző fajba sorolható mikroszervezetek aktivitásának
összehasonlításával kezdődik. Ezt a munkát jobbára minden új vegyület átalakításakor a törzsek
biológiai aktivitásának változatossága miatt célszerű elvégezni, annak ellenére, hogy a szerves
vegyületek átalakításáról könnyen kezelhető kézikönyvek, áttekinthatő összefoglalók állnak
rendelkezésünkre. Ez azért javasolható, mert az irodalmi adatok, különösen a nemzetkozi
gyüjteményekből megszerezhető törzsek szabadalmakban közölt eredményei sok esetben csak a
bejelentők reményeit tartalmazzák. A szteroidok mikrobiológiai átalakítására szolgáló enzimek
jelenléte illetve hiánya nem köthető taxonomiai bélyegekhez. Ebből következően azonos fajba
sorolt törzsek az átalakítóképesség, és a gyakorlati alkalmazhatóság szempontjából igen eltérőek
lehetnek. Célszerű a kiválasztott törzs szubsztrátspecifitását alkalmas modellvegyületek
adagolásával feltérképezni.
A szubsztrátumtól függő technológia kidolgozása érdekében szubsztrátspecifitásra
vonatkozó adatokat előnyösen sejtmentes enzimkivonat alkalmazásával gyüjthetünk, jóllehet az
ipari gyakorlatban élő, vagy elölt mikroorganizmusok konverziós aktivitását hasznosítjuk.

4
Jelen lehet a mikroszervezet csupán az enzim hordozójaként (például a 3,17-dihidroxi-4-
pregnen-3,20-dion előállítása Streptomyces griseocarneus elölt miceliumtömegével), sok esetben
azonban az enzim működéséhez szükséges kofaktorok folytonos regenerálásához az élő sejt
jelenléte nélkülözhetetlen. (hidrokortizon előállítása Absidia orchidis tenyészetével, vagy
koleszterin oldallánc lebontása Mycobacterium tenyészettel).

A mikrobiológiai átalakítást végző enzim működését befolyásoló tényezők:

- szubsztrátum koncentráció hatása
- a termék koncentráció hatása
- az enzim szubsztrátspecificitása
- pH hatása a reakciósebességre
- pH hatása a reakció irányára
- hőmérséklet hatása a reakciósebességre
- kofaktor (ellátás) aktuális koncentráció hatása a reakciósebességre
- az enzim működését befolyásoló egyéb tényezők (gátló ill. serkentők) jelenléte

A kofaktorellátottságot befolyásoló tényezők:

- kofaktort regeneráló rendszer aktivitása
- anaerob illetve aerob reakciókörülmények hatása
- a regeneráló rendszer szubsztrátum-ellátottságának hatása
- a kofaktor másirányú felhasználási lehetősége az anyagcserében

Szubsztrátum ellátottságot befolyásoló tényezők:

- a sejtburok áteresztőképességének alakulása
- a szubsztrátum, illetve a termék aktuális koncentrációja, vizoldékonyságuk

Az átalakítást katalizáló enzim képződését befolyásoló tényezők:

- indukálhatóság esetén az optimális (szelektív) induktor alkalmazása
- represszálhatóság vizsgálata, derepresszió alkalmazása
- konstitutívan derepresszált mutáns előállítása
- zavaró mellékreakciók hatásának csökkentése.

Az átalakítási reakció szempontjából ideális mikroorganizmus kiválasztása:

Csak a kívánt reakciót katalizálja.
A mellékreakciókat katalizáló enzimek képződése visszaszorítható legyen,
Rosszabb esetben a melléktermék képződése szelektíven gátolható legyen.
Reverzibilis reakció esetén az egyensúly a kívánt irányba mozdítható legyen
Ha lehet a kívánt reakciót katalizáló enzim konstitutívan derepresszált legyen,
rosszabb esetben képződése indukálható legyen
A kofaktor szint a tenyésztési körülmények változtatásával optimalizálható legyen.
*
A kutató-fejlesztő munka művelőinek a feladata a fenti szempontok figyelembevételével a
kidolgozandó, illetve már kidolgozott eljárások versenyképességét, piaci helyzetét szüntelen
javítani. Az ipari tevékenység céljára kiválasztott szervezetek természetes, vagy célzottan
előállított öröklött genetikai állományát a bonyolult élettani összefüggések ismeretében
kialakított eljárásban lehet hasznosítani. A példaként felsorolt eljárások kidolgozásakor minden
esetben — nem a mikroorganizmus növekedése, hanem — a céltermék képződése
szempontjából optimális fizikai és kémiai körülmény meghatározása a feladat. Ezt a kérdést a
folytonosan növekedő tenyészetben lehet érdemében vizsgálni, mivel az úgynevezett batsh
eljárás változó körülményei között nehéz felismerni a folyamatot meghatározó tényezőt.

5
Szakaszos eljárás estén a
reakcióközeg összetétele
állandóan változik;
A szubsztrátum fogy, a
termék mennyisége
növekedőben van,
közben felszaporodnak
bizonyos nemkívánt
melléktermékek,
amelyek zavarhatják a
kiválasztott törzs normál
anyagcseréjét.

Ebből következően, a fejlesztés gazdasági eredményét szolgáló optimális feltételek adatait csak
folytonosan növekedő tenyészetben folytatott vizsgálatok segítségével — a fizikai és kémiai
körülmények változtatásával nyert részeredmények ismeretében — határozhatjuk meg.

6
 SZTERINEK. SZTEROLOK KÉMIÁJA
Az alapváz ciklopentano-perhidro-fenantrén.
A humán szervezetben előforduló zooszterin,
a koleszterin C27H46O (vízben nemoldódó,
szintelen, optikailag aktív, vizes alkoholból
*H2O-val lemezesen kristályosodó vegyület)

Az A gyürű hidroxil csoportjának helyzete 90%-.ban ß-térállású. — A ∆5 telítés esetén az epi

szerkezet irányába tolódik az egyensúly. — A 10, 13, 17 helyzetű szubsztitució cisz helyzetű.
Nyolc asszimetria centrum alapján levezethető 256 sztereoizomer közül biolgiailag csupán
egyetlen változat aktív. Átalakításuknál ezért a biológiai módszerek gazdasági előnyt élveznek.
Ipari eljárással a koleszterinből ivarhormonok,
kéreghormonok, D-3 vitamin készíthető

A gombák membránjában ergoszterol fordul elő

Az emlős szervezetben a máj feladata a genetikailag meg-

határozott koleszterin szint biztosítása, amelyből egyrészt
az epesavak(cholsav származékok) képződnek, másrészt
különböző életfontosságú szteroid-hormonokat állítanak
elő a belsőelválasztású mirigyek.

Ipari szempontból alapanyagként szerepeltek a

vizes oldatban habzó növényi steroidsaponinok
(hexózhoz kapcsolt sapogenin), amelynek aglükon
frakciójából oxidatív módszerrel pregnán vegyület
(3β,17α,21-trihidroxi-5-pregnen-20-on.21-acetát)
nyerhertő. Példaként említhető a Dioscorea kaktusz
gyökeréből nyert saponinból hidrolizált termék a
diosgenin (C27H48O3)

Olcsó gyógyszeripari alapanyag előállítás

szempontjából a növényi szterinek közül a
szójabab olajból nyert γ-szitoszterin említendő
/A gyapotmagolajból nyert β-szitoszterinben
a C24-re β-helyzetben kapcsolódik az etil!/

γ-szitoszterin

7
IZOPRÉN-OLIGOMEREK BIOSZINTÉZISE (a fontosabb köztestermékek szerkezete)

2 acetil-CoA
acetoacetil-CoA-szintetáz -------->CoA-SH

acetoacetil-CoA
<--------acetil-CoA
hidroximetil-glutaril-CoA-szintetáz --------->CoA-SH COOH
H-C-H
β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA HO-C-CH3
<---------2 NADPH H-C-H
hidroximetil-glutaril-CoA-reduktáz ------>CoA-SH O=C-S-CoA
--------->2 NADP+
H H OH H
3 R-mevalonát HO-C--C--C---C--COOH
mevalonát-kináz <-------------ATP H H CH3H
------------>ADP
H H OH H
5-foszfo-mevalonát H2O3-P-O-C--C--C---C--COOH
<-------ATP H H CH3H
mevalonátfoszfát-kináz ------>ADP
H H OH H
5-pirofoszfo-mevalonát PP--O-C--C--C---C--COOH
<----------ATP H H CH3H
5-pirofoszfo-mevalonát dekarboxiláz ------->CO2
--------->ADP H
izomeráz H-C-H H-C-H
dimetilallil-pirofoszfát ⇔ izopentenil-pirofoszfát C-CH3 ||
|| C.CH3
C-H H-C-H
dimetilallil H-C-O--PP H-C-O--PP
transzferáz H H
CH3
geranil-pirofoszfát PP--O-HCH-HC=C-HCH-HCH-HC=C
CH3 CH3
geranil PP
transzferáz
izoprenil PP
transzferáz oligoizoprén szintáz
farnezil-pirofoszfát ---------------------->baktoprenol-foszfát
tetraizoprenil-pirofoszfát
<-----4 NADPH
tetraizoprenil- retinál
-PP reduktáz ------>4 NADP+

fitanil-pirofoszfát karotinok
szkvalén
szintáz <--------NADPH
-------->NADP+

szkvalén

8
ERGOSZTEROL KÉPZŐDÉS VÁZLATA

9
 Az antibiotikus hatású anyagok tulajdonságaival
foglalkozó mikrobiológusok évtizedek óta
keresnek hatásos fungisztatikus anyagokat. A
Streptomycesek által termelt anyagok nistatin
felfedezése mellett a gombavilág egymás elleni
küzdelmét szolgáló anyagok felismerése is
reményt keltőnek tünt. Valójában először ez a
vegyületcsoport mint ismeretlen szerkezetű
antifungális anyag került izolálásra.
A XX. század utolsó negyedében Merck Sharp
and Dohme gondozásában került a piacra a
lovastatin hatásos népszerű koleszterin szint
csökkentőként. A koleszterin szintézis
nélkülözhetetlen építőelemének a mevalonsavnak
a képződését gátolva gyakorlatilag a koleszterin
képződést lehet akadályozni. A kutatócsoport (A.
Endo és munkatársai) a hetvenes években
elméleti meggondolásból a fungisztatikus hatású
mikroorganizmusok között célzottan szterin-
szintézist gátló mikrobiális eredetű vegyületet
kerestek. Közel 8000 törzs biológiai aktivitását
vizsgálták patkány máj enzimrendszerén in vitro.
A Penicillium által termelt compactinról -
későbbi néven mevastatinról - 1976-ban jelent
meg az első közlemény. Később a compactin
metilezett származékát az Aspergillus fajok
tenyészlevében is megtalálták. Az első
összefoglaló dolgozat a hetvenes évek végén
jelent meg. (J. Antibiot. 32:852-54 1979) a
Monascus ruber tenyészlevéből kinyerhető
hatásos vegyületekről. A következő évben l980-
ban A.V. Alberts és munkatársai Aspergillus
terreus tenyészlevében találtak hasonló hatású
hexahidro naftalénhez kapcsolódó heptánsavakat. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3957-61).
A pravastatin savként kerül kiszerelésre. A többi "statin" lakton alakja a májban felnyílik és
így létrjön a gátlás szempontjából fontos hidroxisav. Jól tudott, hogy a mevalon-sav a
szterinszintézis korai köztesanyaga. A lovastatin és rokonvegyületei, mint intracelluláris
enzim-gátlók a mevalonsav képződés akadályozásával a magasabb-rendűekben a szterin
képződést, a koleszterin szintézist gátolják. A kompetitív gátló hatás már 1 nM tartományban
jelentkezik. Ez három negyságrenddel alacsonyabb mint a HMG-CoA (3-hidroxi-3-metil-
glutaril-CoA) disszociációs állandója. Ezek a vegyületek az izeltlábúakban akadályozzák a
juvenilis (fejlődési) hormon képződést, a növényekben és gombákban a szterin képződését.

mevalon-sav NADPH-reduktáz

10
A vegyületcsoport a zsírsav szintézishez hasonló módon acetil-CoA elemekből épül fel. A
kabonil csoportok eliminálásához szükséges NADPH intenziv szénhidrát anyagcserét feltételez.
Ebből következik, hogy ez a vegyületcsoport nem az idiofázisban képződik hanem a fejlődési
ciklusban.

11
 MIÉRT ÉRDEKELT A GYÓGYSZERIPAR A SZTEROIDOK
MIKROBIOLÓGIAI ÁTALAKÍTÁSÁRA SZOLGÁLÓ ELJÁRÁSOK FEJLESZTÉSÉBEN?
A hormonhatású vegyületek hatásának befolyásolása analógokkal,
a módosított változattal új hatás kiváltása is lehetséges.
AZ EMLŐS SZERVEZETBEN KOLESZTERINBŐL KÉPZŐDŐ ÉLETTANILAG JELENTŐS VEGYÜLETEK

GESZTAGÉNek képviselője Progeszteron

C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal
KORTIKOIDok képviselője Dezoxikortikoszteron
C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal
C-21 hidroxilezve
GLÜKOKORTIKOID képviselő Hidrokortizon
C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal
és α-helyzetű hidroxil csoport C-11 β-helyzetű hidroxil csoport
képviselő Kortizon
C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal
és α-helyzetű hidroxil csoport C-11 karbonil
MINERALOKORTIKOIDok képviselője Aldosteron
C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal
C-21 hidroxilezve C-11 β-helyzetű hidroxil csoport
ANDROGÉNek képviselője Testosteron
C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez csak β-helyzetű hidroxil csoport kapcsolódik
ÖSZTROGÉNek képviselője Ösztradiol
C-3 helyen fenolos hidroxil az aromás A gyürűn C-17-hez csak β-helyzetű hidroxil csoport kapcsolódik

A máj epetermelésének befolyásolása

12
 ÉLETTANILAG JELENTŐSEBB SZTEROID-VEGYÜLETEK

A KOLESZTERIN az emlős szervezet nélkülözhetetlen szteroid terméke

1-1.5 g az ideális szint;
naponta a májban termelődik.
20 %-a szabad formában, zömében azonban linolénsavval észterezve fordul elő
általában 0.5g kiürül a széklettel
Epesavak 3-5 g vesz részt az emésztésben;
naponta 0.8 g képződik koleszterinből a májban (a többi recirkulál)
Koleszterin-szint szabályzók (sztatinok): Xeter; Crestor; (10 mg)

HORMONHATÁSÚ SZTEROIDOK
A szteroid hormonok zömmel fehérjéhez kötve cirkulálnak a szervezetben
hormonhatása azonban csak a szabad hormonnak van
hatását a receptor fehérjéhez kötődve fejti ki

A mellékvesekéreg hormontermelése genetikailag meghatározott

amit adott esetben szerkezeti analógokkal, céltermékekkel befolyásolni lehet

Kortikoszteroidok 21 C atomot tartalmaznak

- Mineralokortikoidok az elektrolit forgalmat befolyásolják (11 desoxi-kortikoid)
- Glükokortikoidok az intermedier szénhidrátforgalmat befolyásolják (11 oxikortikokoid)
- Az aldoszteron erélyes mineralo és gyenge glükokortikoid hatású
- 9a-fluorokortizolban a fluor sokszorozza a mineralokortikoid hatást
- A prednizolon (∆1) csökkenti a mineralokortikoid hatást, erősíti a gyulladás csökkentő hatást
- A progesteron a szexuálhormon hatás mellett csekély mértékben kéreghormonhatású

Androgének Nemi jellegre ható hormonhatású szteroidok 19 C atomot tartalmaznak

A mellékvese-kéregben és a herében termelődnek
A női szervezetben csak a kéreg termeli

Ösztrogén hatású hormon 18 C atomot tartalmaz, aromás A gyűrű

Az ováriumban termelődik koleszterinből illetve 17-hidroxi-progeszteronból;

A hormonhatású szteroidok zöme a májban inaktiválódik,

A bomlástermék végül szulfát illetve glükuronid formában ürül a vizelettel

13
 SZTEROIDOK DEHIDROGÉNEZÉSE (a ∆1reakció)
A szteroidok 1,2-dehidrogénezését az ötvenes évek első felében Fried, Thoma és Klingsberg
(J. Am. Chem. Soc. 1953.75:5764), valamint Vischer és Wettstein (Experientia 1953.9:371)
fedezte fel. Néhány év mulva, 1959-ben Levy és Talalay Pseudomonas testosteroni-ból
dehidrogénező enzimkeveréket izolálva (J. Biol. Chem. 1953.234:2014) valószínűsítették, hogy
itt direkt dehidrogénezés történik hidroxilezett átmeneti termék képződése nélkül. Az in vitro
dehidrogénező reakció nem igényelt oxigént.
Megállapították, hogy a fenazinmetoszulfát
hatásos oxidáló ágensként alkalmazható az
esetben, ha az enzimkészítménnyel anaerob
körülmények között dolgoztak. Más
dehidrogénezésben használható faktorok
(NAD+, NADP+, FMN, FAD, citokrom-c, ferricianid ion) használhatatlanok voltak. Ezek az
eredmények, Talalay azon
megfigyelésével együtt, hogy az
1α-hidroxi, illetve a 2β-hidroxi
származékok nem alakulnak
dehidrogénezett származékká,
megerősítette a közvetlen dehidrogénezésre vonatkozó elképzeléseket. A dehidrogénezési
mechanizmust erősítették meg Gale és munkatársai, amikor kimutatták Bacillus sphaericus-ban
a prednizolon képződéshez szűkséges chinon szerű faktort, a K2 vitamint. Bacillus sphaericus
sejtmentes kivonatában ugyanis ez az enzim nem működik, de a K2 vitamin, menadion, illetve
hexahidro-koenzim-Q hatására a dehidrogénező aktivitás újra megjelenik (Biochemistry 1962.
1:788). Talalay szerint a chinon szerkezetű vegyületek csak másodlagos szerepet játszanak a
redukciós ciklus folyamatában. Az igazi koenzim valamilyen flavin szerkezetű vegyület. — Iica
és munkatársai olyan sejtmentes enzimkészítményt állítottak elő Bacillus cyclo-oxidans-ból,
amelyik reverzibilisen 1,2-
dehidrogénezést és 1,2-
hidrogénezést katalizált. Az
enzimszint növelhető volt a
tápközegbe adott androszta-
1,4-dién-3,17-dionnal. A
dehidrogénezést menadion
stimulálta, a hidrogénezés
pedig NADH jelenlétét
igényelte. (Steroids Suppl. 1965.1:159) A két enzimaktivitást a hagyományos fehérjetisztítási
módszerekkel eddig elválasztani nem sikerült. — A szteroid 1,2-dehidrogenáz működését
sztereokémiai szempontból Bacillus sphaericus-nál Ringold, Hayano, valamint Stefanovic
tanulmányozták részletesen (J. Biol. Chem. 1963.238:1960). Az enzimkészítményük az 1β és a
2α szubsztituált származékokat dehidrogénezte, viszont az 1α és a 2β szubsztituáltakat nem
alakította át, amiből következtethető, hogy a dehidrogénezésben az 1α és a 2β helyzetű hidrogén
atom vesz részt. — Ezt Ringold azon tapasztalata is megerősítette, hogy a dehidrogénezési
reakció után is megmaradt az 1β deuterium, míg az 1α deuterium eltünt.

14
Az enzim három aktív hellyel egy protondonor, egy protonakceptor és egy hidrid akceptor
tulajdonságú ponttal közeledik a szubsztrátumhoz. A protondonor és a protonakceptor hely
hatására egy enolizációs folyamat indul a 3-ketonon. Ezt követi a hidrid átvitel az 1α helyzetből,
ami végül is az enzim-
szubsztrátum komplex szétesését
vonja maga után. A fermentációs
közegben az enolizációt
izotopkicserélési módszerrel
bizonyították, ami igazolta, hogy
az enolizáció a dehidrogénezési
reakció szűkséges lépcsője. —
Az 1,2-dehidrogénezési reakció (∆1reakció)
kényelmes lehetőséget teremtett a 19-
norszteroidok aromatizálására (J. Am. Chem.
Soc. 1961.83:4627). Ennek ipari jelentősége
nagy mértékben csökkent a hatvanas években a
norszteroid totálszintézis kifejlesztése és ipari
gyakorlatba vétele után.
A Bacillus sphaericus-ból nyert kivonat az 5β-androsztán-3,17-dion dehidrogénezésére
nem alkalmas, viszont az 5α-androsztán-3,17-dion esetében eredményes. Ezt az eredményt a két
vegyület enolizációs képességében rejlő különbség magyarázza. Az 5β származék esetében
ugyanis az enolizáció a 4-es szénatom irányába következik be, az 5α származék esetében viszont
a 2-es szénatom van kitüntetett helyzetben, ami az 1α helyzetű hidrogén eliminációját segíti.
Jerussi és Ringold későbbi vizsgálatai azt mutatták, hogy az enolizációt katalizáló enzim
kapcsolatban van egy flavint, illetve más redox rendszert tartalmazó olyan fehérjével, amelyik
képes az axiális helyzetű hidrid-ion elvonására az 1-es szénatomról. — A telített pregnán
dehidrogénezésekor főtermékként minden esetben 1,4-dien származék képződik. A
melléktermékként jelentkező 4-androsztén-3,17-dion utólagos telítés eredménye lehet.—Fonken
és Murray Streptomyxa affinis-szel dehidrogénezték az 5β-pregnán-3,11,20-trion-20-ketált. Ez az
eredmény lehetőséget adott a dehidrogénezésben
szereplő hidrogén térhelyzetét részletesen
vizsgálni 5α-pregnán, illetve 5β-pregnán
szerkezetű szubsztrátum esetében. Mindkét
pregnán származékban az 1β-hidrogént és a 2α-
hidrogént deuteriumra cserélték. Az 5α-pregnán-
3,11,20-trionból az 1α,2β helyzetű, az 5β-
pregnán-3,11,20-trionból viszont az 1β,2β
helyzetű szubsztituensek távoztak a
dehidrogénezési folyamatban, ami nem meglepő, ha összehasonlítjuk az 5α-pregnán és az 5β-
pregnán enolizált „A” gyürüjének térszerkezetét. A dehidrogénezés utolsó momentumaként
távozó hidrid ugyanis mindkét esetben axiális helyzetből kerül a dehidrogenáznak a hidrid-
akceptor pomtjára. (J. Org. Chem. 1962.27:1102)
Dehidrogénezés a szterán váz különböző (1-, 4-, 5-, 7-, 9-, 14-, 16-) helyein figyelhető
meg. Az első ilyen reakciót Horváth János és Krámli András írta le 1947-ben. Azotobacter
tenyészetben koleszterolból 7-dehidrokoleszterol képződött (Nature 1947.160:633). Több
közlemény nem jelent meg erről a reakcióról, noha a szakirodalom a mikrobiológiai konverzió
mérföldköveként emlékezik meg róla. —

15
Ezen a téren a kutatás a már említett Fried, Thoma és Klingsberg eredményeinek közlésével
indul, amelyben megállapítják, hogy a
Cylindrocarpon radicicola tenyészlevében a
progesteronból, testosteronból és a Reichstein
féle S-vegyületből egyaránt 1,2-
dehidrotestololakton képződik. Streptomyces
lavendulae viszont progesteronból androszta-
1,4-dien-3,17-dion és 1,2-dehidro-testosteron keverékét állítja elő. —
A kortikoidok 1,2-dehidrogénezésére 1954 óta világszerte a Corynebacterium simplex, illetve az
érvényben levő taxonomiai elnevezés szerint Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzset
használják. Genetikailag stabil
clon-ként élesztőkivonatot és
glükózt tartalmazó táptalajon
az aktivitás elvesztése nélkül
fenntartható. — Szabadalmi és
gazdasági meggondolásból
néhány más törzs biokémiai
aktivitását is hasznosítják:
Bacterium cyclooxidans ATCC 12673(1958),— Bacillus lentus ATCC 13805 (1963),— Bacillus
sphericus ATCC 7055 (1955),— Mycobacterium globiforme 193 (1959),— Streptomyxa affinis
ATCC 6737 (1958).— Ezek fontos szerepet kaptak a gyulladást csökkentő szteroid gyógyszerek
előállítását szolgáló eljárásokban. Élesztőkivonatot, kazein-hidrolizátumot, kukoricalekvárt,
glükózt tartalmazó táptalajon változatlanul az aktvitás maximális szintjét teljesítik. A tenyésztése
6.8- 6.9 pH tartományban 28°C-on, aerob kürülmények között 12-15 óra alatt befejeződik. Az
enzim indukcióját a tápközegben szennyezésként nyomokban jelenlevő növényi szteroidok
végzik. Az enzimszint értékét előnyösen befolyásolja a növekedési periodus utolsó szakaszában
adagolt szubsztrátum. Még ma sem vesztett jelentőségéből a mikrobiológiai eljárás, jóllehet az
1,2-dehidrogénezés kémiai úton is végrehajtható. — A ∆1 dehidrogénezést végző mikróbák
általában a szteroid váz lebontására szolgáló enzimekkel (például 9α-hidroxiláz aktivitással)
rendelkezve, nemkívánatos veszteséget okozhatnak. Ez a veszély megfelelő enzimhiányos
mutáns alkalmazásával, vagy specifikus hatású gátlószer alkalmazásával kivédhető, de kellően
magas dehidrogénező szint esetében a biokonverzót végző tenyészet hígitott formában való
használata is eredményre vezethet. A tenyészközegbe adagolt induktor ugyanis olyan 1,2-
dehidrogenáz szintet eredményezhet, ami a biokonverzióra használható tenyészet százszoros
higítását is lehetővé teszi. Ez utóbbi esetben gyakorlatilag csapvízben, tápanyag nélkül folyik a
dehidrogénező folyamat. Sejtnövekedés hiányában a szteroid váz lebontására szolgáló enzimek
képződésére nincs lehetőség. — Nemkívánatos mellékreakcióként bekövetkezhet a pregnán
oldallánc keto csoportjának a redukciója. Ez a NADH kofaktort igénylő enzim ugyancsak
indukálható. Ezért a növekedési periódusban induktorként célszerű pregnán oldalláncot nem
tartalmazó vegyületet (például androszténdiont) használni és az átalakítási szakaszban
klóramfenikol adagolásával akadályozni az induktív enzim képződését. — A dehidrogénezési
folyamathoz nem szükséges élő sejt. Sikerrel használható az indukált tenyészetből előállított
acetonos száraz sejtpor. Ekkor azonban elektronakceptorként fenazin-metoszulfát jelenléte
szűkséges.
Folyamatos tenyésztéssel tartósan fennntartva a növekedési állapotot, magas aktivitású
sejttömeg állítható elő. A nagy aktivitású sejttömeg előnyösen használható hidrokortizon
kristályszuszpenzó prednizolon kristályszuszpenzióvá alakítására. Literenként 400-500 g
hidrokortizon kristályt tartalmazó szuszpenzióból 95%-os hatásfokkal képződik a prednizolon
kristály. — A teljes átalakulást akadályozza a szubsztrátumra kristályosodó prednizolon, mert a
zárványként jelenlevő hidrokortizon már nem vehet részt a biokonverziós folyamatban.

16
 Vischer és Wettstein közléséből megtudhatjuk, hogy a Fusarium solani és a Fusarium
caucasicum feltűnő aktivitással állítja
elő az androsta-1,4-dién-3,17-diont a
dezoxikortikoszteronból, 4-androstén-
3,17-dionból, és progeszteronból.
Tovább oxidálva végül tesztololakton
származékok képződnek. — Wix és
Albrecht vizsgálatai szerint Fusarium
tenyészettel a telített szteroidok,
valamint a 3β-hidroxi-5,6-dehidro-
szteroidok is androsta-1,4-dien-3,17-
dionná alakíthatók. (Acta Microbiol.
Acad.Sci. Hung. 1961. 8:339).— A
telített szteroidok 4-es helyzetben
történő dehidrogénezését először
Vischer és Wettstein írták le. —
Hasonló átalakításról számolnak be a
pregnán sorban Nocardia blackvelli-
vel, Stoudt és munkatársai (Arch.
Biochem. Biophys. 1958.74:280),
valamint Coronelli, Kluepfel és Sensi
Corynebacteriun simplex sejtjeit
használva (Experientia 1962.18:441;
1964.20:208). — {*Laskin és Fried
szerint az eredetileg hidroxilező fajként
leírt Glomerelle fusaroides 9,(11)-
helyzetben képes az ösztront
dehidrogénezni (U.S. Patent 1963.
3,115-444)}. — Az epesavak
dehidrogénezésére Hayakawa és
munkatársai Streptomyces és
Corynebacterium törzseket használtak
(J. Biochem. Tokyo 1957.44:108;
1958.45:4319; 45:633).
A digitoxigenin dehidrogénezése 16-os
helyzetben Trichotecium reseum-mal
végezhető (J. Biol. Chem. 1960.
235:3399). Ez az organizmus 17α-
hidroxilező aktivitásával vált ismertté.
Lehetséges, hogy a digitoxigenin labilis 17α-hidroxi származékából spontán vízkilépéssel
képződik a dehidrogénezett végtermék.
Herzog és munkatársai a Wojnovicia graminis tenyészlevében is megfigyelték a tesztoszteron
dehidrogénezését 14-es helyzetben a 12α-hidroxilezéssel egyidejüleg. Általános azonban az a
vélemény, hogy ez nem enzimes folyamat eredménye, hanem a mikrobiális hidroxilezés közben
a 12α,14α-diolból képződő műtermék, amely a labilis 14α-hidroxicsoport spontán
eliminációjának az eredeménye. Az elimináció mozgató ereje a megjelenő hidroxilcsoportok 1,3-
diaxiális kölcsönhatásából adódik. Ezt a megállapítást, a 14α-hidroxi-tesztoszteron
melléktermékként való megjelenése támogatja (J. Org. Chem. 1960.25:2177).

17
 ALKOHOLOK OXIDÁCIÓJA KETONNÁ vagy ALDEHIDDÉ
A hidroxiszteroidok reverzibilis oxidációs folyamatait Talalay és munkatársai a Pseudomonas
testosteroni indukálható enzimein tanulmányozták részletesen. Elválasztották a 3α-hidroxil
csoportot oxidáló enzimtől a 3β- és 17β-hidroxil csoportokat oxidáló enzimet. Megállapították,
hogy mindkét enzim NAD+ kofaktort igényel működéséhez, viszont szubsztrátspecificitás
szempontjából markáns különbséget tehetünk közöttük. Specifikus az enzim a sztereokémiai
viszonyokra, függetlenül attól, hogy a hidroxil
csoport az adott esetben axiális vagy
ekvatoriális helyzetben van. ( „The Enzymes”
Vol. 7:177 Acad. Press New York 1963) —
Ringold és munkatársai szerint a
Pseudomonas testosteroni esetében a 6-os
helyzetben levő elektronszívó csoportok a
megfordítható reakció egyensúlyát
befolyásolhatják, akár meg is fordíthatják. A
kísérleti eredmények szerint a karbonil

csoporton kialakuló elektronsürüség döntő

szerepet játszik az egyensúly kialakulásában.
Ez nem meglepő, hiszen a folyamat valójában
hidrid-ion átvitelét jelenti a szubsztrátum és a NAD+ között.
Az alkoholok ketonná oxidálása már Bertrand 1896-ban végzett munkáiból ismert. A
szteroloknál először Mamoli és munkatársai alkalmazták, amikor 5-androsztén-3β,17β-diolt
oxidáltak 4-androsztén-3,17-dionná egy fertőzött élesztőtenyészetből izolált baktériummal
(Berichte 1938.71:2701). Ugyanezzel a tenyészettel oxidálták a 3β-hidroxi-5-pregnén-20-on
vegyületet progeszteronná. Az eredményeken felbuzdulva a mikrobiológusok hasonló céllal
különböző baktériumok tiszta tenyészetével végeztek hasonló átalakításokat. Kiderült, hogy a
Micrococcus dehydrogenans, a Corynebacterium mediolanum, a Flavobacterium dehydrogenans
enyhe reakciókörülmények között nem csak a 3β-hidroxi csoport dehidrogénezését, hanem az
acetil csoport hidrolízisét és az 5,6-kettőskötés izomerizálását is elvégzik.
A 3β-hidroxil csoport
dehidrogénezését a levegő
oxigénjével regenerálódó szterin-
oxidázok is sikeresen végrehajtják. A
sugárgombákban aktívan működnek
mint irreverzibilisen dehidrogénező
enzimek. Régiószelektivitásukból adódóan azonban a szteroidok 17β-hidroxil csoportját
természetesen nem dehidrogénezik. Mivel nem igényelnek NAD+ kofaktort, vizzel nem
elegyedő szerves oldószerek, klórozott szénhidrogének jelenlétében is működőképesek.
A különböző helyen hidroxilezett szteroid származékok oxidációját számos esetben
megfigyelték. Így a 3α-hidroxiszteroidokon kívül a 6β-hidroxi, a 7α-hidroxi, a 11β-hidroxi, a
16α- és 16β-hidroxi, a 18-hidroxi és a 20-hidroxi származék mikrobiális oxidációjára van ugyan
irodalmi adat, ezeknek a kémiai oxidációja azonban általában előnyösebb. Sok példát találunk az
irodalomban a karbonil csoportok direkt bevezetésére. Feltételezhető, hogy a primer
hidroxilezést közvetlenül követő oxidáció eredményét regisztrálják.

18
 KARBONIL CSOPORT KÖZVETLEN REDUKCIÓJA ALKOHOLLÁ
Az alkohol oxidációjával foglalkozó
fejezetben már találkoztunk ezzel a sok
esetben megfordíthatónak tekinthető
reakcióval. Ha feltesszük, hogy
sebességmeghatározó faktor a hidrid-ion
átvitele a NADH-ról a karbonil csoportra,
akkor nyilvánvaló, hogy az elektronsürűség
csökkentése a karbonilcsoporton, kedvez a
redukciós folyamatnak. Ringold és
munkatársai kimutatták, hogy a Pseudomonas
testosteroni sejtmentes kivonata a 2α-metil,
illetve a 6β-metil-tesztoszteron 3-as
ketocsoportját nem redukálja (Biochem.
Biophys. Res. Comm. 1963.13:162).
Megváltozik azonban a helyzet elektronszívó
csoportok jelenlétében, a 2α-, 4α-, 6α-, vagy
6β- helyzetben fluorozott, vagy a 4-es
helyzetben klórozott tesztoszteronból 3α- és
3β-hidroxi származékok keveréke képződik.
Robinson, Bruce és Oliveto szerint
Flavobacterium dehydrogenans nem
redukálja a szubsztituálatlan 17-ketoszteroidokat, viszont a 16,16 difluoro-ösztron metilétert
17α-hidroxi származékká alakítja. Az erősen elektronegatív elem jelenléte elősegíti a hidrid-ion
átvitelét a karbonil csoportra (J. Org. Chem. 1963.28:975).
A szteroid vegyületek 3-as és 17-es ketocsoportjainak élesztővel történő redukcióját
Mamoli és Vercellone írta le 1937-ben (Berichte 1937.70:470; 70:2073). A redukciós
folyamatok katalizálására azért használják az élesztőt, mert általában nem okoz más átalakítást.
Az élesztők általában nem redukálják a konjugációban levő ketocsoportokat, bár az 5α-1-
androszten-3,17-diont a Saccharomyces cerevisiae 5α-androsztán-3,17-diollá redukálja.
A mikrobában általában két NAD+ függő hidroxiszteroid dehidrogenáz felelős a
ketocsoportok redukciójáért. A szubsztrátum szerkezetétől függ, hogy melyik végzi el a
redukciót. Az A-B gyürú transz anellációja a
β-enzim működésének kedvez, ezért főleg 3β-
hidroxiszármazék képződik Ezzel szemben az
A-B gyürű cisz anellációja a 3α-hidroxi
származék képződését segíti. Sok esetben a
redukálandó ketocsoporttól távolabb levő
szubsztituens változása megváltoztathatja a
biokonverzió lefolyását. Saccharomyces
cerevisiae jelenlétében az 5α- illetve az 5β-
dihidro-11-keto-progeszteronból egyaránt a
3α-hidroxiszármazék képződik, függetlenül az
A-B gyürű kapcsolódásától. Ugyanakkor 3β,11α-dihidroxi-5α-dihidroprogeszteron képződik
élesztő jelenlétében a 11α-hidroxi-5α-pregnánolonból (Helv.Chim.Acta 1953.36:1945).
A szteroid vegyületekben előforduló ketocsoportok redukciójára is bőven találunk adatot
a szakirodalomban. Az epesavakban előforduló 7-keton redukcióját 7α-hidroxillá Streptomyces
gelasticus-szal és Corynebacterium fajokkal írták le (Proc. Japan Acad./1957/ 33:221).

19
 A 9,10-szeko vegyületekben a 9-ketonok 9α-, illetve 9β-hidroxilezett termékké alakulnak
Nocardia restrictus, illetve Mycobacterium fajok tenyészlevében (Biochemistry 1963.2:1238).
A 16-os helyen megjelenő oxigénfunkció a lehetséges oxidált és redukált formában jelenik meg,
feltehetőleg enzimes és spontán átalakulási folyamatok eredményeként. A 19-karbonil
redukcióját Penicillium thomii aktivitásaként Sih és munkatársai közölték 14β-hidroxi-3,18-
dioxo-4,20/22/-kardenolid szubsztrátumon. Az egyensúly az alkohol irányába tolódik (J. Org.
Chem. 1963.28:854).
A pregnán oldallánc 20-ketocsoportjának redukciójával több kutatócsoport foglalkozott.
Először Fried, Thoma és Klingsberg írta le Streptomyces lavendulae-val végzett biokonverziós
folyamatok nem kívánatos mellékreakciójaként. Hübner és munkatársai Streptomyces
hydrogenans-ból izolálták azt az indukálható 20β-dehidrogenázt (Biochem. Biophys. Acta.
1953.35:270), amely széles szubsztrátspecifitása miatt a kortikoidok előállítását célzó
biokonverziós eljárások nemkívánt melléktermékének képződését katalizálja. Prokariótákban és
fonalas gombákban fordul elő ez az enzim.— Algákban, élesztőkben és az emlős szervezetben a
20α-dehidrogenáz működik, így a Rhodotorula longissima tenyészlevében prednizolonból,
annak 20α-hidroxi származéka képződik (J.Org.Chem. 1953.24:695).
A 22-aldehidek redukcióját először Murray és Peterson írták le Rhizopus fajok esetében,
de a Mycobacterium tenyészlevében is megtalálható az oldallánc-lebontás melléktermékei között
20-oximetilpregnán formájában. Megjelenésükből a mikroszervezet sejten belüli oxidoredukciós
állapotára következtethetünk (J. Am. Chem. Soc. /954.76:5673).

20
 SZÉN-SZÉN KETTŐSKÖTÉS TELÍTÉSE
Telitetlen kötések telítésére szolgáló reakciók két csoportban tárgyalhatók Külön tárgyalandó az
izolált kettős kötés redukciója a konjugált rendszerek telítésétől. —
Nem azonosított féceszből izolált anaerob
baktériumokkal a koleszterint 5β-kolesztánná,
másnéven koprosztánná lehet redukálni (Arch.
Biochem. Biophys. 1957.72:213). — A kolsav
átalakítása 7-dezoxiepesavvá ugyancsak
bendőbaktériumokkal végezhető. Amennyiben a
redukálandó kettőskötés keto-csoporttal van konjugálva, a dehidrogénezésnél megismert
szabályok érvényesek,— azaz a belépő
hidrogénatom mindig axiális és transz az
1α,2β-szénatomon. A reakció egyensúlyra
vezető természetéből következik, hogy a
triamcinolont a Bacillus cyclo-oxidans
részben 1,2-dehidro-triamcinolonná redukálja (J. Biol.Chem. 1960.235:965).
Konjugált kettőskötés redukcióját
Mamoli és Schramm rothasztó baktériumok
tenyészetét használva figyelték meg. A
Bacillus putrificus vagy a Schubert által
használt Clostridium paraputrificum
anaerob körülmények között a 4-androszten-3,17-dionból 3-keto-5β-androsztán, és 3α-hidroxi-
5β-androsztán származékok keverékét állítja elő (Z. Naturforschung 1963.18b:284).
Élesztővel az 1,2-dehidro-3-keto szteroidok redukciója 3β-hidroxi-5α-androsztán
képződéséhez vezet. A 4,5-kettőskötés telítésére külön enzim szolgál, ami lehetőséget ad 3-keto-
1,4-dien szerkezetű vegyületekből 3-keto-1,2-dehidro-5β-androsztán származékok előállítására.
Különleges esetet képvisel a 16-dehidroprogesteron hidroxilezése Rhizopus nigricans,
illetve Aspergillus niger hidroxilező képességeinek felhasználásával. Mindkét esetben ugyanis a
11α-hidroxiprogeszteron 17α-epimerje
képződik, annak ellenére, hogy a pregnán
oldallánc β-helyzete termodinamikailag
stabilabb. — Az egyik észszerű
magyarázat szerint a β-oldalról közelítő
enzimfelületen hidrogénaddicióval
fejeződik be a reakció, ami a 17-es
oldallánc kezdeti planaritását a hidrogénaddicióval „kvázi” axiális szerkezetüvé módosítja.—
Ugyanez az eredmény akkor is, ha a jelenséget egy megfordított Ringold mechanizmusként
értelmezzük, feltételezve egy átmeneti enol forma létezését, ami spontán protonálódik még az
enzimfelület elhagyása előtt. Itt a β-oldalról közelítő enzimfelület nem katalitikus, hanem csak
szterikus szerepet játszik (Berichte 1935.68:1847; 1937.71:96).

21
 A KETTŐS KÖTÉS IZOMERIZÁCIÓJA
Mamoli 1939-ben írt közleményében (Ann. Rev. Biochem 1965.34:352) a Corynebacterium
mediolanum-mal végzett 3β,21-dihidroxi-5-pregnen-20-on.21-acetát dezoxikortikoszteronná
alakítására vezető reakciósorban a dehidrogénező reakciót követő lépésként említi a szteroid
izomeráz megfordítható működését.— Általában a mikroorganizmusok, amelyek az oxidációs
reakciót képesek elvégezni, izomerizálással fejezik be konverziós tevékenységüket. Az irodalom
egyetlen esetet ismer, amikor egy Actinoplanes missuriensis a dehidrogénezést követően nem
izomerizálta a reakcióterméket. — Az enzimkatalizálta izomerizáció mechanizmusát Talalay és
Ringold tanulmányozták részletesen. Pseudomonas testosterini-ből nyert indukálható enzimet
tisztították, kristályos formában előállították. Az aktív centrumban levő hisztidin imidazol
csoportjának fontos szerepét tisztázták( ). A Pseudomonas enzim az 5,10 kettőskötést is
átfordítja kialakítva a 3-keto-4,5-dehidro szerkezetet.
Deuterium-oxiddal végzett kísérleteikben megállapították, hogy nem hidrogénfelvétel, hanem
közvetlen (intramolekuláris) hidrogénátvitel történik a 4-es szénatomról egy átmenetileg létező 8
tagú, illetve 10 tagú gyürűs szerkezetű köztes állapoton keresztül a 6-os szénatomra.

Az imidazol csoport szerepe

Mellékveséből előállított nyers kivonatban a dehidro-epiandroszteron képződés első lépése a

rendszer dekonjugációja, a kettős kötés vándorlása 5-ös helyzetbe és ezt követi a redukciós
folyamat.

22
 ÉSZTERÁZOK REVERZIBILIS MŰKÖDÉSE
A szteroid molekula hidroxil csoportjainak a védelmére széleskörüen alkalmaznak kémiai
eljárásokat, így az acilezést is. A védőcsoportok eltávolítása sok esetben a mikrobiológus
feladata. Az enzimek sztereospecificitása miatt a sztereoszelektív észterhidrolízis sok esetben
racemátok szétválasztására is alkalmazható. — A 3-keto-1,4-dien szerkezet kialakítása közben
általában az észterkötések is hidrolízálódnak. Legkönnyebben a primer alkoholok észterei, amit
sorrendben a szekunder acetoxi csoport hidrolízise követ. Végül a molekulán belüli
acilvándorlást követően a tercier acetoxi csoport hidrolízise is bekövetkezik. — A 21-acetát
hidrolízise volt az egyik legrégebben felfedezett szteroidészter hidrolízis. — Mamoli
Corynebacterium mediolanum aktivitását hasznosította dezoxikortikoid előállításához 21-
acetoxi-pregnenolonból.
Az észterek hidrolízise szteroid
alkoholokká részleteiben nem ismert,
noha legtöbb esetben specifikus
észteráz hatással találkozunk. Az eddig
vizsgált észtert bontó enzimek
hisztidint tartalmaznak, továbbá az
ismert észterázt gátló vegyületekkel a
szteroidésztert bontó enzimek
működése is akadályozható. A
hidrolízis közben az enzimet az észter
savkomponense átmenetileg acilezi,
amit egy újabb vízmolekula távolít el
az enzimfelületről.
Az észterázok reverzibilis
működése miatt a tenyészlébe adagolt
szteroidokat sok esetben acilezi a
mikroszervezet. Az élesztők esetében
gyakran a 17-hidroxi származék
acetátjával találkozunk.
A Streptomyces roseochromogenes —
amelyet sikerrel használnak
hidroxilező szervezetként 16-hidroxi-
kortikoidok előállításához — a 21-
amino-9α−fluoro-11β,17α-dihidroxi-
1,4-pregnadien-3,20-dionból
triamcinolon.21-N-acetátot állít elő.
A triamcinolon acetonidját például a
Trichoderma glauka képes acilezni 21
származékká.

23
 SZTEROIDOK HIDROXILEZÉSE
A mikroorganizmusokban hidroxil csoportok
kiépítésére számos példát ismerünk.
Leggyakrabban telítetlen kötés kialakitását
követő vizfelvétel ad lehetőséget a további
feladat teljesítésére kész köztestermék, a
hidroxilezett származék megjelenésére.
A jól ismert Szent-Györgyi Krebs
ciklus enzimei közt szereplő FAD igényes
szukcinát dehidogenáz[7] hatására képződő
fumársav vízfelvétellel [8] alakul almasavvá,
amely NAD+ kofaktort igénylő reakció [9]
során alakul oxálecetsavvá, a trikarbonsav
ciklus nélkülözhetetlen termékévé..
A zsírsav lebontás (béta-oxidáció)
hidroxilezett köztes termékének képződését
is megelőzi a [6] FAD igényes acil-CoA
dehidrogenáz működése, a telítetlen kötés
kialakítása, amit követ a vízfelvétel [4], és a
NAD+ igényes β-OH-acilCoA dehidrogenáz
[7] működése.
ZSÍRSAV SZINTÉZIS ÉS LEBOMLÁS ÖSSZEHASONLÍTÁSA

1); Malonil transzferáz (működését a jelenlevő zsírsavak alloszterikusan gátolják)

2); β-ketoacil-CoA szintház
3); D-β-ketoacil-CoA reduktáz
4); D-β-hidroxi-acil-CoA dehidratáz
5); acil-CoA reduktáz
6); FAD igényes acil-CoA dehidrogenáz
7); NAD+ igényes β-OH-acil-CoA dehidrogenáz
8); ketoacil-CoA tioláz
* a transeszteráz az igényeknek megfelelően segít felhasználni a képződött zsírsavat

24
Bloom és Shull megállapította, hogy az axiális hidroxilezésre képes mikroorganizmus adott
körülmények között képes a kettőskötésben levő szénatomot támadva epoxid képződést
katalizálni (J. Bacteriol. 1962.84:382).—
Az oxiránok előállítására a kémiai
módszerek ugyan előnyösebbek, mégis a
reakció tanulmányozása a hidroxilezés
biokémiai mechanizmusának jobb
megértését segíti. — Az epoxid-oxigén
konfigurációja a hidroxil csoport
konfigurációjával megegyezik. A
kettőskötés π-elektronjai az axiális CH
kötés elektronjaihoz hasonló orientációt
mutatnak, miközban a szénatomot
támadó, oxigént irányító hidroxilező enzimkomplex nem tud különbséget tenni a két helyzet
között. A Curvularia lunata a 9,11-dehidro-Reichstein-S vegyületbe 9β,11β-epoxidot visz be,
míg a 14,15-dehidro származékból 14α,15α-epoxid képződik. — Más axiális hidroxilezők, így a
11-es helyen hidroxilező Cunninghamella blakesleana, vagy a 14-es helyzetben hidroxilező
Helicostylum piriforme, valamint a Mucor griseocíanus ugyancsak megfelelő oxirán
származékot alakít ki a dehidrogénezett
szubsztrátumból. A Nocardia fajok aktivitása a
9α-hidroxilező képességükből következően a
9,11-dehidroszármazékból 9α,11α-epoxidot hoz
létre (Gazz. Chim. Ital. 1956.86:260).
Epoxidok egyszerű
hidrolízisét Saccharomyces
cerevisiae tenyészetében
először Camerino írta le
példaként a diaxiális-
glikolkénti felnyitásra. A
mechanizmus valójában egy
savkatalizálta epoxid-
felnyitáshoz hasonlít. A
kombinált protonforrásként imidazolt tartalmazó enzim nukleofil támadóként jelenik meg. A víz
nem tekinthető független résztvevőnek, inkább egy hidrogénkötésekkel összetákolt
agglomerátumnak (Berichte 1939.72:1863). — Speciális esetben az epoxid felnyílás egy
Wagner-Meervein
átrendeződést von
maga után, amit a
szteroidszintézisben
érdekelt vegyészek
hasznosíthatnak. A
folyamat teljesen
megegyezik az
enzimtől független, savkatalizálta felnyitáskor bekövetkező folyamattal. Ilyen speciális esetnek
tekinthető a 16,17-oxidoprogeszteron konverziója Saccharomyces cerevisiae sejtjeivel,
miközben a metil csoport a 13-as helyről a 17-es szénatomra vándorol. Az átrendeződés azonban
egyszerű kémiai folyamat, ami spontán követi az oxirán enzimkatalizálta felnyitását.

25
A szteroidok C11 helyzetben bekövetkező mikrobiális axiális hidroxilezése minden esetben a
légköri oxigén beépülését jelenti,
amit kísérletileg Hayano és
Dorfman bizonyítottak. Jelölt vízzel
/H218O, illetve D2O/ normál oxigén
tenzióban végigvitt hidroxilezés
esetén a termék jelöletlen maradt.
Nehéz oxigén-atmoszférában viszont a 18O beépülése bizonyítást nyert. — Megállapították, hogy
a 9/11/-telítetlen szteroidok nem prekurzorai a 11β-hidroxi származékoknak. —Ezek a
megállapítások a 6β-, 11α-, 11β-, 12β-, 15α-, 17α-, és 21-hidroxi csoportoknak a kiépítésére
érvényesek. Hayano, Peterson, Corey, Gregorian, kísérletileg bizonyították, hogy a szénatom
térhelyzete a szubsztitució alatt nem változik. Rhizopus nigricans-szal végzett kísérletekben 11α-
hidroxi csoportot vittek be pregnándionba, amely 11α- és 12α-helyzetben triciálva volt A
hidroxilezés közben a 11α− tricium
elveszett, a 12α−tricium viszont
változatlanul maradt.— Egy másik
kísérletben 11β-Deuterium tartalmú
pregnándiont hidroxileztek. Az
eredmény a megfelelő 11α-hidroxi-
pregán-3,20-dionban a 11β−Deuterium
változatlanul megmaradt. Ezek a
kísérletek egyértelműen bizonyították,
hogy a hidroxil bevitelben nem érintett
hidrogén térhelyzetét változatlanul
megtartja.
Ringold elképzelése
szerint a hidroxilezés a 2β-,
6β-, 10β-, 17α-hidroxilezés
esetében egy enolizáció
eredményeként létrejövő
aktívált állapoton keresztül
történhet. Az enolizáció is
az enzim hatására
következik be, amit az
enzim által aktívált,
nemdisszociált oxigén
támad. Az első lépés egy
hidroperoxid képződés, amit
egy újabb enzimkatalizálta
reakció tesz teljessé. A hidroperoxid NADPH segítségével hidroxillá alakul, egy molekula víz
egyidejű képződésével. A hidroperoxid jelenlétét és az utána 10β- és 17α-helyzetben következő
redukciós folyamatot Barton és munkatársai igazolták.

A szteroid váz szinte minden szénatomja, a 3-as, 4-es és 13-as szénatom kivételével
mikrobiális úton hidroxilezhető. A 3-as szénatomhoz a természetes szteroidokban minden
esetben oxigén kapcsolódik, a 13-as kvaterner szénatomhoz viszont nem kapcsolódhat oxigén.
Azokon a helyeken, ahol enolizációra nincs mód, ott más mechanizmus működését kell
feltételezni. — A mikróbák természetesen nem szűkítik tevékenységüket egyetlen reakció
elvégzésére, hanem a térszerkezeti analógiák szerint a szteroid váz más pontjain is

26
végrehajthatnak hidroxilezést, sőt a mikróba enzimkészletének megfelelően egyéb reakciók
végrehajtására is sor kerülhet.
A SZTERIN VÁZ HIDROXILEZÉSE
1α Penicillium fajjal 1α-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion dehidroepiandroszteronból
Nocardia fajokkal pregnán-származékok 1α-hidroxilezése
1β Rhizoctonia ferrugene Reichstein féle S vegyület 1β- és 2β-hidroxilezése
Absidia orchidis digitoxigenin 1β- és 5β-hidroxilezése
2α Nocardia corallina az ethiszteront 1α és 2α-helyzetben hidroxilezi
Nocardia italica a noretiszteront 2α és 16α-helyzetben hidroxilezi
2β Rhizoctonia ferrugene 1β- és 2β-hidroxilezés
5β Absidia orchidis digitoxigenin 1β- és 5β-hidroxilezése
6β Mucor félék melléktermékként hidroxilez 6β helyzetben
Rhizopus arrhizus a progesteront hidroxilezi 6β- és 11α-helyzetben
Chaetomium a prednizont hidroxilezi 6β-helyzetben
7α Phycomyces blakesleeanus a progesteront hidroxilezi 7α-helyzetben
7β Proactinomyces a koleszterin 7β-hidroxilezése (Horváth-Krámli 1948)
8β Cercospora melonis Reichstein-S vegyület 8β-hidroxilezése
9α Helicostylum piriforme Reichstein féle S vegyület hidroxilezése
Actinomycetales,Eubacteriales 1,2 dehidrogenáz hiány esetén—különben bomlás követi
10β Rhizopus nigricans és egyéb gombák 19-nortesztoszteron 10β- és 11α-hidroxilezése
11α Rhizopus nigricans ATCC 6227 progeszteron 11α-hidroxilezése (14α)
Aspergillus ochraceus NRRL 405 progeszteron 11α-hidroxilezése (14α)
11β Curvularia lunata hidrokortizon előállítása
Cunninghamella blakesleeana hidrokortizon előállítása
12a Wojnowicia graminis testoszteronból 12α- és 14α-hidroxilezett terméket készít
12β Fusarium lini digitoxygenin digoxigeninné alakítása
Streptomyces purpurascens digitoxin digoxinná hidroxilezése
14α Mucor félék Reichstein féle S vegyület 14α-hidroxilezés
15α Colletotrichum antirrhini progesteron 15α származéka
Giberella baccata dezoxicorticosteron 15α-hidroxilezése
15β Phycomyces blacesleeanus progesteron 15β-hidroxilezése
Lenzites abietina desoxicorticosteron 15β-hidroxilezése
Bacillus megaterium Reichstein S vegyület 15β-hidroxilezése
16α Streptomyces roseochromogenus 9α-fluoro hidrokortizon 16α-hidroxilezése
16β Helicostylum piriforme digitoxigenin 16β-hidroxilezett származéka
17α Trichotecium roseum desoxicorticosteron 17α-hidroxilezése
18 Corinespora cassiicola corticosteron aldosteronná alakítása
19 Corticium sasakii a 19-metil hidroxilezése
21 Ophiobolus herpotrichus csak a természetes d-enantiomert hidroxilezi

A gazdaságossági szempontok figyelembe vételével

a technológia kialakításakor kell feloldani ezt a nemkívánatos helyzetet, és
a mikróba kiválasztásával,
a technológiai körülmények megválasztásával,
esetleg a szubsztrátumon végzett kémiai átalakítással lehet biztosítani
a célvegyület főtermékként való képződését.

27
A szteroid C11 helyzetben történő
hidroxilezésének folyamata valójában
több lépésre különíthető:
- az oxigén aktíválása,
- a szubsztrátum aktíválása
- az oxigén átvitel, végül
-a redukált koenzim szerepe
-és a regenerálása.
Az nyilvánvaló, hogy a molekuláris
oxigén reagál az elektrongazdag
centrummal. A hidroxilező fehérje
fajra jellemző szerkezetétől függően
α- vagy β- oldalról közelítve a
szubsztrát molekulát, aktíválva a CH
kötést, kvázi ionos karakterüvé alakítja. A kötés nem szakad fel teljesen, de jelentős mértékben
polarizálódik, ami lehetővé teszi a nemdisszociált, de fellazult kötésű oxigénmolekula
beépülését. A hidroperoxid intermedier tovább alakításához Cooper, Estabrook és Rosenthal
vizsgálatai szerint ekvivalens mennyiségű redukált kofaktor használódik fel. A regenerálás miatt
az intermedier anyagcsere működőképessége nélkülözhetetlen feltétele a hidroxilezési
folyamatnak.

28
 KORTIKOIDOK ELŐÁLLÍTÁSÁT SZOLGÁLÓ EREDMÉNYEK
A kortizon gyulladásgátló hatásának a felismerése a század közepén a gyógyszerkutatással
foglalkozók figyelmét a kortikoidok előállítására irányította. Sarett 1946-ban megjelent
dolgozatában közölte ugyan a kortizon kémiai szintézisét, ennek azonban csak elméleti
jelentősége volt.— A Searle cég anyagi támogatásával Hechter 1949-ben izolált mellékvese

készítménnyel kortexonból (11β-hidroxilezéssel) kortikoszteront állított elő. A pénzt és

fáradtságot nem kímélő tevékenység nyilvánvalóvá tette, hogy ez az út sem vezet piaci
eredményre.— Az irodalmi adatok szerint a szteroid vegyületek 11-helyzetben való
hidroxilezése csak biológiai eljárással oldható meg. Gazdasági sikert remélve néhány
gyógyszergyár (Upjohn, Squibb, Pfizer, Schering) anyagi támogatásával a mikrovilág
biokonvereziós aktivitásának hasznosítása érdekében szisztematikus kutatómunkával
feltérképezték a törzsgyüjteményekben fellelhető szervezetek biokémiai aktivitását. A rázott
lombikban növekedő tenyészethez adott gazdaságosan előállítható kiindulási vegyület
átalakulását papirkromatográfiás módszerrel követték.— Az Upjohn támogatásával dolgozó
Peterson és Murray 1952-ben megjelent
szabadalma szerint a Rhizopus nigricans
tenyészetéhez adott progesteronból 80%-
os elméleti kihozatallal lehet 11α-
hidroxiprogesteront nyerni, amiből a
gyógyszergyár kémiai eljárással üzemi
méretben előállítható, piacképes
gyulladásgátló kortikoidhoz jutott.
A törzsgyüjteményben deponált
0.5% peptont és 5% malátakivonatot
tartalmazó agar táptalajon fenntartott
Rhizopus nigricans /ATTC 6227/
tenyészettel 3% kukoricalekvárt és 5%
glükózt tartalmazó folyékony táptalajt
oltva folyamatosan levegőztetve és
keverve 24 °C-on két nap alatt kifejődött
tenyészethez acetonban oldva kerül az
átalakítandó progeszteron, amely az
oldószer kilevegőztetése után a
gombafonalak felületére csapódik. A
levegőztetést tovább folytatva a
hidroxilezett termék a vizes fázisban
dusul fel, ami a leszűrt vizes fázisból diklóretánnal extrahálható.— A kiszűrt fonalas
gombtenyészet napokig megtartva aktivitását hidroxilezésre ismételten felhasználható. —
Tökéletesítve az eljárást, a hidroxiprogeszteron elkülönítésére adszopciós gyantát alkalmazva, a
hidroxilezett termék a szűrletből folyamatosan eltávolítható és így a reakcióterméktől
megszabadított fermentlé levegő befúvásával visszajuttatható az erre a célra kialakított reaktorba.
—A folyamatos elkülönítés céljából, a sűlyesztett tenyészetben kinőtt mycélium olyan
szűrőlappal ellátott reaktorban kerül felhasználásra, amelyben a hidroxilező aktivitással

29
rendelkező micélium tömegen oxigénnel telített fermentlé áramlik keresztül. Az átszűrt
fermentlé visszajuttatását a reakciótérbe, a felszálló ágban elhelyezett fúvóka segíti. A befúvott
levegő az oxigéntelítés mellett - a felszálló ágban levő frakció fajsúlyát, a légbuborékok
segítségével csökkentve – lehetővé teszi a fermentlé folyamatos visszatáplálását. A reaktorban
elhelyezett micélium tőmeg hidroxilező aktivitása hat-nyolc nap alatt csökken a felére. Ez a
módszer a rögzített enzimhordozó első gyakotlatban negvalósult alkalmazásának is tekinthető.
Sikerrel alkalmazható a progesteron 11α-hidroxilezésére az Aspergillus ochraceus
spóratömege amely ismételten felhasználható hidroxilazésre. A peptont és malátakivonatot
tartalmazó szilárd táptalajon előállított spóratömeg 0.1%-os nátriumlauril szulfát oldatba
szuszpendálva aktivitásveszteség nélkül –20°C-on hónapokig tárolható.
A mikroszkopikus gombák átvizsgálásakor sok olyan törzset találtak, amely 11β-
helyzetben hidroxilezte a szubsztrátumot. Colingswort és munkatársai Streptomyces fradiae
törzset használva a Reichstein-féle S vegyületből hidrokortizont állítottak elő. Ez a felismerés
nem csak azért volt jelentős, mert a termék az egyik legismertebb értékes glükokortikoid volt,
hanem mert belőle Corynebacterium simplex dehidrogénező aktivitását használva igen értékes
termék, a prednizolon nyerhető. Ez a vegyület 1955-ben jelent meg a gyógyszerpiacon mint
hatásos gyulladáscsökkentő, a reumás izületi gyulladás ma is hatásos gyógyszere.
Az egyik kiválasztott
törzs, az Absidia orchidis, gyors
növekedésű, homothallikusan
zigosporát és szőrszerű
légmicéliumot képző Mucor féle.
A 2-4µ átmérőjű spórái kifejezett
apofízissel rendelkező körte alakú
sporangiumokban képződnek. Az
üllepedő mikrokolonia formáját
megtartó tenyészet szuszpenziója
a Reichstein féle S vegyületből
főtermékként hidrokortizont és az
S vegyület 11α-hidroxilezett
származékát állítja elő. A törzs C-
11-es hidroxilező képességét
befolyásolni, a két termék arányát
a körülmények változtatásával,
illetve mutagén ágensek
alkalmazásával nem lehet, ami azt
igazolja, hogy csupán egyetlen
hidroxilező enzim működik, amelynek aktiv centrumához különböző, a hidroxil csoport
orientációját meghatározó helyzetben kötődhet a szubsztrátum.
A kialakított technológia szerint malátakivonatot és peptont tartalmazó tápközegben,
szigorúan meghatározott számú spórával oltva, készül a 24°C-on egy napig növekedő inokulum,
amely a kukoricalekvárt, glükózt, és ammoniumszulfátot tartalmazó főfermentáció oltóanyaga.
40 óra növekedés után a mikrokoloniákból álló tenyészet, csapvizes mosás után, több napon
keresztül változatlan aktivitással használható hidroxilező reagensként szolgál.
A megfelelően higított, kimosott Absidia orchidis tenyészethez kalciumkloridos
metanolban oldva adagolják a szubsztrátumot (Reichstein féle S vegyületet). A reakcióelegyet 38
órán keresztül megfelelő levegőztetés mellett 24°C-on keverik. A hidroxilezett szteroidok elegye
a fermentlé szűrletéből etilacetáttal extrahálható, amelyből töményítés után kristályosodó nyers
termék 55% hidrokortizont, 5% kortizont és 15% 11α-hidroxi származékot tartalmaz. — A

30
kiszűrt micélium metanolos-csapvízzel mosva, változatlan aktivitással újra használható 6-8
napon keresztül.
Gyakorlati szempontból előnyösebb a nyers szűrletet a hidrokortizon kinyerése nélkül
tovább fermentálni a megfelelően higított Corynebacterium simplex tenyészettel, és csak az 1,2-
dehidrogénezés befejeztével, a köztes termék kinyerésével együttjáró anyagveszteséget elkerülve
nyerni ki a prednizolont. Ezzel a kombimált eljárással a kiindulási Reichstein féle S vegyületre
számolva 48%-os hatásfokkal állítható elő a prednizolon.

REICHSTEIN FÉLE S VEGYÜLET ELŐÁLLÍTÁSA

A kombinált fermentációs eljárás szubsztrátumaként szereplő 17α,21-dihidroxi-4-pregnen-3,20-
dion (Reichstein féle S vegyület) előállítására három kémiai lépés helyett biokonverziós eljárást
használnak. A szteroid szapogeninek aglűkonjaiból, a dioszgeninből illetve a szolaszodinból
induló kémiai átalakítási eljárás egyik intermedierje a 3β,17α,21-trihidroxi-5-pregnen-20-on.21-
acetát, amelyből kémiai eljárással egy bromozást követő krómsavas oxidációval, majd cink
jelenlétében végzett dehalogénezést követő alkalikus hidrolízissel nyerherő a 17α,21-dihidroxi-
4-pregnen-3,20-dion, az úgynevezett Reichstein féle S vegyület.
Az antibiotikum termelésre, talajmintából izolált sugárgombák közül sikerült kiválasztani a fent
ismertetett biokonverziós lépések bonyolítására használható mikroorganizmust. A később
Streptomyces griseocarneus néven deponált törzs szójalisztet és glükózt tartalmazó táptalajon
tenyésztve jelentős szteroid dehidrogenáz, és 21-aciláz aktivitással tünt ki. A törzs előnyös
tulajdonsága, hogy a kívánt reakció vízzel nem elegyedő szerves oldószerek (toluol, diklóretán,
butilacetát) jelenlétében is végbemegy. A szerves oldószer jelenléte nemcsak azért előnyös, mert
a vízben alig oldódó szubsztrátumot nagy koncentrációban lehet a prokarióta tenyésztbe juttatni,
hanem azért is hasznos, mert a mikroszervezet szteroidlebontó aktivitását, nem kívánt
melléktermékek képződését a szerves oldószer megakadályozza.
A Stretomyces griseocarneus-ban
működö 3β-hidroxi csoportot
dehidrogénező enzimet a légköri
oxigén regenerálja. Szigorúan
specifikus körülmények között
működik, csak az A/B transz anellált
szerkezetű 3β-hidroxycsoportot képes dehidrogénezni.— Az oxidációt követő izomerizációt
katalizáló enzimet nem sikerült elkülöníteni. Lehetséges, hogy a dehidrogénezést végző enzim
szerkezete elősegíti az oxidációs lépés után a kötésvándorlást.
Az iparilag is alkalmazható eljárásban a szójalisztet és glükózt tartalmazó táptalajon, 28°C-on,
48 óra alatt kinőtt tenyészethez literenként 65 ml diklóretánban oldva 20 g szubsztrátum kerül
adagolásra. A reakcióelegyet ezután 37 °C-on keverve, levegőztetve, és a pH-t lúgadagolással
8,2-8.4 értéken tartva, az oxidáció és a hidrolízis 3-5 nap alatt végbemegy. A terméket a szerves
fázisból 96%-os hatásfokkal kristályos formában lehet kinyerni.

31
 CURVULARIA FAJOK SZEREPE A KORRTIKOID SZINTÉZISBEN
1968-ban nyilvánosságra került irodalmi adatok alapján a prednizolon előállítására új
lehetőség kínálkozott, mely azon a holland felismerésen alapult, hogy megfelelő Reichstein-S
származék a hidroxilezésnél fellépő mellékreakciók lehetőségét csökkenti. A Curvulari lunata
a hidrokortizon 11β-hidroxil csoportján kívül a 7α- és a 14α-helyzetű hidroxil csoportot is
képes kialakítani. Ha azonban szubsztrátumként 17α-acetátot adagolunk a tenyészethez,
akkor csupán egyetlen termék, a hidrokortizon.17α-acetát képződik, mivel az „α” oldalon
elhelyezkedő nagy térfogatú szubsztituens akadályozza az enzim közeledését ebből az
irányból.
17αα-acetoxi származék előállítása
Az új eljáráshoz Reichstein S 17α-acetátra volt szűkség, amiről kiderült, hogy kémiai eljárással
gazdaságosan nem állítható elő. Járható útnak igérkezett az eddigi szubsztrátum triacetátjából
induló fermentációs útvonal kidolgozása. Régóta ismert volt, hogy a primer, szekunder és tercier
hidroxil csoportok észterei enzimatikusan eltérő sebességgel hidrolizálnak. Sajnos ebből a
szempontból a Streptomyces griseocarneus teljesen alkalmatlan volt, mivel a hidroxiszteroid
oxidázok szubsztrátumként nem fogadnak el 17α−szubsztituált szteroidot. A 3β-hidroxiszteroid
oxidázokkal ellentétben nem dehidrogénezik a dioxipregnenolon-17α-acetát származékot.
Nagyszámú átvizsgált baktérium közül a már Arnaudi által 1949-ben izolált Flavobacterium
lucecoloratum és a F. dehidrogenans tünt alkalmasnak, mivel az indukálható szteroidoxidáz
mellett jelenlevő észteráza a tercier észtert 20-szor lassabban hidrolizálja mint a primer és
szekunder alkohol észterét. Gyakorlatilag a szubsztrátumként bevitt triacetátból 6 pH-nál, szinte
veszteség nélkül nyerhető a Reichstein féle S vegyület 17 acetát származéka.
Az élesztőkivonatot tartalmazó táptalajon
kinőtt 18 órás Flavobacterium tenyészethez
20mg/ml-es koncentrációban adagolható a
3β,17α,21-tracetoxi-5-pregnen-20-on, amely
néhány nap alatt teljesen átalakulva
kristályos formában 95%-os elmélei
hatásfokkal kinyerhető, mint Reichstein-S
17.acetát.— A 6.2 pH tartását a semleges
pH-nál bekövetkező acilvándorlás (17-ről
21-re) akadályozása indokolja.
Ez az új eljárás lehetőséget adott egy igen
aktív hidroxilező törzs a Curvularia fallax
alkalmazására, amely a Reichstein S-ből
annak 14α-hidroxi és 14α,7α-dihidroxi
származékát állítja elő. A 17-acetoxi csoport
jelenléte (a hidroxilezés irányát az α-oldalról
a β-oldalra terelve) egyetlen termék a 11β-
hidroxilezett származék képződését teszi
lehetővé. A 3β,17α,21-trihidroxi-5-pregnen-
20-on.triacetátból hidrokortizon.17-acetát
képződik főtermékként. Csekély
mennyiségben melléktermékként a
lánclebontást követő hidroxilezés
eredményeként 14-hidroxi-4-androsztén-
3,17-dion képződhet.

32
A Curvularia lunata esetében a 21-acetoxi csoport akadályozza a hidroxilezési folyamatot, a
gyenge észterhidrolizáló képessége miatt a 17-21 diacetát illetve a triacetát számára
alkalmatlan szubsztrátum. A Curvularia fallax kiemelkedő észterhidrolizáló képessége
viszont néhány óra alatt eltávolítja az acilező csoportot a 21-es szénatomról és eredményesen
hidroxilezi a 17 acetát származékot.

Az átfordítás ténye Brannon elképzelését látszik igazolni. Szerinte a szteroid szubsztrátum a 3-as
és 20-as oxigénfunkció által négy féle orientációban rögzülhet az enzim aktív centrumában. Ha a
szubsztrátumon végrehajtott változtatás azt a helyet, ahova a hidroxilezés eredetileg irányul
térbelileg gátolja, akkor az orientáció változása miatt a hidroxilezés a lehetséges engedély
irányába módosul. — A módosított szubsztrátum használat csak az esetben lehetséges, ha a
nemkívánatos melléktermék az α oldalon axiálisan van hidroxilezve. Így csak a Curvularia
esetében alkalmaztható, ahol a melléktermék 14α- illetve 7α-hidroxi származék. Ebből
következően az Absidia orchidis esetében a módszer nem használható.

Az eljárás ipari szempontból is igéretesnek látszik. Az átalakításhoz mindkét Curvularia törzs

felhasználható, de a Curvularia fallax esetében a pH és a hőmérséklet beállítása nagyobb
technológiai fegyelmet követel. Optimális körülmények között az inokulum táptalaj
mogyorólisztet és glükózt, a
főfermentáció, glükózt, szójalisztet,
kukoricalekvárt és káliumfoszfátot
tartalmaz.

Hidroxilezés közben fontos a 6.2 pH

érték tartása, mert lugosabb
tartományban az észterhidrolízis
megelőzheti a hidroxilezési
folyamatot, ami elősegítheti a
7α,14α-hidroxilezett termékek
megjelenését.

A hidroxilező Curvularia sejttömeg

biokémiai aktivitását megtartja. A
kiszűrt micélium puffer oldatban
szuszpendálva újra felhasználható.
Aktivitása a harmadik alkalmazás
után kezd csökkenni.

A folyamat befejeztével, 8.5 pH-nál,

37 Co-on a hidrokortizon.17-acetátról
az acilvándorlást követően az
ecetsavat a gomba könnyen
eltávolítja.

Az Arthrobacter simplex a
hidrokortizont és a hidrokortizon.17-
acetátot azonos sebességgel
dehidrogénezi. A 17-acetát csoport

33
gátolja a 9α-oxigenáz működését, azaz a szteroid váz lebomlását katalizáló terminális reakciót, a
9α-hidroxilezés folyamatát. Ezért az indukált tenyészet nagyobb koncentrációban, bomlási
folyamat nélkül képes a hidrokortizon.17-acrtát dehidrogénezésével prednizolont előállítani.

A fentiekből következően a Curvularia törzsek aktivitása hármas kombinált fermentációs

rendszerbe építve, a 3β,17α,21-trihidroxi-5-pregnen-20-on.3,17,21-triacetátból közbenső
tisztítási lépések nélkül, kristályos formában prednizolont szolgáltat a kiindulási anyagra
számolva 45%-os kihozatallal.

Az első lépésben a Flavobacterium lucecoloratum sejtszuszpenzió 28 Co-on 4 nap alatt 20mg/ml

koncentrációban adagolt 3β,17α,21-trihidroxi-5-pregnen-20-on.3,17,21-triacetátból lehasítja a
primer és szekunder acetát csoportot, és a szterinoxidáz hatására történik a ∆5-3-ol >> ∆4-3-on
átrendeződés. A mikrokristályos formában kiülepedő végtermék, a 17α,21-dihidroxi-4-pregnen-
3,20-dion, az úgynevezett Reichstein féle S vegyület, ideális szubsztrátum a Curvularia törzsek
által végzendő 11β-hidroxilezéshez, amely reakció 2 mg/ml koncentrációban folyik a már
ismertetett körülmények között (6.2 pH, 28 Co).

A hidrokortizon.17-acetát 1,2-dehidrogénezését a szűrt fermentlébe juttatott — a 18-ik órában

andoszta-1,4-dien-3,17-dion adagolással indukált — Arthrobacter simplex 24 órás tenyészetéből
elkülönített, 20-szorosan higított baktérium tömeg végzi, amelytől az oxidációs folyamat végén
centrifugálással különíthető el a prednizolon.17-acetát. Ennek a hidrolízise kémiailag végezhető.

34
 A SZTEROID VÁZ OXIDATÍV LEBOMLÁSA
A mikroorganizmusok csoportjai képesek a szteroid vegyületeket széndioxiddá és vízzé bontani.
Ez a lebontó aktivitás különösen azokra a fajokra jellemző, amelyek a 3-keto-4-dehidro-
szteroidok 1,2-dehidrogénezésében kiemelkedő aktivitással vesznek részt. Ide sorolhatók a
Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Arthrobacter genus fajai. Ebből
következik, hogy a gyulladásgátló 1,2-dehidro-kortikoidok mikrobiológiai előállítása az
anyagveszteség elkerülése érdekében nagy óvatosságot igényel.

A lebontási utak biokémiai mechanizmusát fáradtságos munkával több kutatócsoport derítette

fel. A megismert bomlási köztestermékekből az következtethető, hogy a lebontási útvonal a
mikrovilágban általában azonos reakcióúton halad. A mellékelt ábra az oxidatív lebontási útba
illeszthető reakciótermékekből összeállított vázlatot mutatja. A vizsgált mikroszervezet
anyagcsere rendszerében uralkodó oxido-redukciós viszonyok határozzák meg a köztestermékek
minőségét. A köztes anyagok mintegy biokémiai puffert képezve redukált formában is jelen
lehetnek, ha valamilyen anyagcserezavar miatt a lebontásban szerepet játszó kofaktor
regenerálása, visszaoxidálása átmenetileg késedelmet szenved.

Dodson és Muir elsőként mutatták ki, hogy a szteroid váz bontása a 9α-hidroxilezést és az 1,2-
dehidrogénezést követő retroaldol reakció eredményeként szekofenol köztes anyag
képződéséhez vezet. A lépések sorredje a mikróba anyagcsere viszonyainak a függvénye. Az
egyik vizsgált Nocardia törzsben a 9α-hidroxi csoport beépítése megelőzte a dehidrogénezést. A
vizsgálatban szereplő Pseudomonas-nál viszont fordítva az 1,2-dehidrogénezés előzte meg a
hidroxilezést. A két kulcsfontosságú enzim aktuális aktivitását a pillanatnyi anyagcsereviszonyok
érzékenyen befolyásolhatják. Sok esetben a fiatal tenyészetben a hidroxilező aktivitás
intenzívebb, az idősebb tenyészetben a stacioner fázis elején pedig éppen fordított a helyzet. A
vizsgálatok igazolták, hogy a retroaldol reakció nem enzimes folyamat, másrészt, hogy az
oxidáció légköri oxigén felhasználásával történik.

Dodson és Muir megállapította, hogy a 19-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion a Pseudomonas

tenyészetben veszteség nélkül ösztronná alakul.

Sih és Rahim Nocardia restrictus-t használva felismerte, hogy ha a 19-es anguláris metil
oxidálva van, akkor a 9,10-szekofenol helyett minden esetben a retroaldol átrendeződés helyett
az „A” gyürű aromatizációja következik be.

A lebontási út következő lépése az A gyürű felnyitása, amit az aromás gyürű C4 helyzetű

hidroxilezése vezet be. A hidroxi származék képződése a gyürűfelnyitási folyamat előfeltétele.

Ugyanez a hidroxilezés vezeti be – Sih vizsgálatai szerint – az ösztron oxidatív lebontásakor az

„A” gyürű felnyitását.

Az ábrán feltüntetett köztes terméket, a ketokarbonsav származékot csak ammoniával reagálva

sikerült izolálni, mert a lebontási folyamat aktivitása a ketosavat maradéktalanul tovább alakítja.
Sih Károly végül is propion-aldehid és piroszőlősav feldúsulását tapasztalta.

35
A szaggatott vonallal körülhatárolt átmeneti termék keletkezése pillanatában irreverzibilis
retroaldol átrendeződés termékeként a szteroidváz szekofenol formájában jelenik meg. Ezért a
szakma termináló oxigenáznak nevezi a szteroid-9α-hidroxilázt. A szteroid vázlebontás
részleteinek feltárása, az elméleti alapokig hatoló vizsgálata gyakorlati értelmet nyer, mivel a
hormonszintézishez szükséges alapanyagok előállítására szolgáló módszerek kialakitásához,
fejlesztéséhez útmutatást ad.

36
A másik részletesen vizsgált terület a szterin oldallánc mikrobiológiai úton végrehajtott szelektív
lebontása. Tatum már 1913-ban leírta, hogy a növényi, illetve állati eredetű szterolokat a
mikroorganizmusok egy csoportja szénforrásként képes hasznosítani. — Turfit 1948-ban
közzétett dolgozatában arról számol be, hogy a Proactinomyces erithropolis a tápközegbe adott
kolesztenont és az epesavat kismértékben etiosavvá alakítja. — A szakmai közvélemény ennek a
közlésnek nem tulajdonított jelentőséget. Annál nagyobb érdeklődést váltott ki 1964-ben
Whitmarsh munkája, amely szerint koleszterinből androszt-4-én-3,17-diont, androszta-1,4-dién-
3,17-diont, 3-keto-bisnorkolénsavat és 3-keto-bisnor-1,4-koladién savat kapott. Ez a közlés nem
jöhetett volna jobbkor a nyersanyaghiánnyal küzdő szteroidipar számára. A közlemény elérhető
olcsó szteroidforrásra, az állati és növényi eredetű szterinekre irányította a kutatócsoportok
figyelmét. Nem volt kétséges, hogy a gyógyszerpiac igényelte hormonhatású szteroidok,
valamint gyógyászati jelentőségű származékaik ipari előállítása csak a teremészetben jelentős
mennyiségben előforduló szterinekből történhet. A Mycobacterium katabolikus aktivitása a
szterin molekula jól elkülöníthető két régióján, egyrészt a szteroid váz AB gyűrűjén érvényesül,
másrészt az előbbitől teljesen függetlenül bontja az oldalláncot.
Sih és Wang az általuk kidolgozott eljárással 3β,19-dihidroxi-5-kolesztén.3-acetátból
72%-os elméleti kinyeréssel jutottak ösztronhoz. — Későbbi vizsgálataikban Sih és
munkatársai koleszterint kívántak lebontani Nocardia, Mycobacterium, Corynebacterium, és
Arthrobacter törzsekkel. Izotóppal jelzett szubsztrátumot használva megállapoították, hogy a
lebontás folyamata az egyes törzseknél azonos, minden esetben kolánsav bisznorkolánsav
közti terméken keresztül történik. A biokonverzió reakcióelegyéből izolált termékekből össze
lehetett rakni az oldallánc-eltávolítás minden egyes lépését képviselő reakciósort, ami
igazolta, hogy a lebomlás a zsírsav béta-lebomlás sémáját követi. Nyilvánvalóvá vált a
retroaldol átrendeződés fontos szerepe. — Kisérleteikben nehézoxigént tartalmazó vizet
alkalmazva kiderült, hogy a végtermékben szereplő 17-es szénatomhoz kötődő oxigén nehéz
vízből származik. — Később megállapították, hogy az oldallánc lebontás baktériumokkal
(Corynebacterium simplex) és gombákkal (Fusarium solani) egyaránt elvégezhető. — 1965-
ben Dr. Wix Györgynek és munkatársainak sikerült a szterin-oldallánc szelektív lebontását elérni a
Mycobacterium phlei tenyészethez adagolt 8-hidroxi-kinolinnal. Így szelektíven gátolva a 9α-
hidroxiláz enzim működését 1,4-androsztadién-3,17-dionhoz jutottak.— Megkísérelték az A-gyűrű
metabolizációját már az első lépésnél megakadályozni. A szterinek 3ß-hidroxil-csoportját kis
térkitöltésű, rövid láncú alkil-éter, illetve karbamoil-védőcsoporttal látva el Ambrus Gábornak sikerült
az A-gyűrű metabolizációját már az első lépésnél megakadályozni. E származékok oldalláncát a
Mycobacterium phlei lebontotta. Ezt követően a védőcsoportot eltávolítva, az androgén
hormonok, anabolikumok és aldoszteron-antagonisták szintézisének a kulcsintermedierjéhez a
dehidroepiandroszteronhoz jutottak.A 6,19- ciklokoleszterinek, a szterin éterek, vagy a
karbamoil szterinek oldallánca ugyanúgy lebontható, mint a szabad 3-oxigén funkcióval
rendelkező szterinek oldallánca. — Végül igazolták, hogy a diosgenin oldallánca, a
spiroketál gyürűje is lebontható. A reakciótermék D gyürüjében az oxigén eredeti helyén
maradva a 16-os szénatomhoz kötődik. —A ketocsoport utólag bekövetkező redukciójára
utal, hogy a reakcióelegy 16α- és 16β-hidroxi származékot is tartalmaz. A kisérleti eredmény
valószinüsíti Kondo és Mitsugi elképzelését, amely egy hidrolitikus folyamatot követő
dehidrogénezést, majd egy Baeyer-Villiger oxidációt követő újabb hidrolízist tételez fel,
végül utolsó lépésként a retroaldol reakciót valószinüsíti. Eddig nem sikerült kimutatni a 20-
hidroxi-pregnán származékot a reakciótermékek között.
A Mycobacterium-nál igazolt β-lebontás is hasonló eredményre vezet. A két lebontási út
egyidejű működése is lehetséges, ami a szterol-oldallánc szelektív lebontásakor Mycobacterium
aureum esetében megmagyarázná a progeszteron megjelenését a reakcióelegyben.
**

37
A szteroid váz lebontása szempontjából döntő jelentőségű a vastartalmú 9α-hidroxiláz és a
FAD kofaktort igénylő szteroid-1,2-dehidrogenáz. A két enzim aktivitásának hatására a
szteroid váz szekofenol képződésen keresztül elbomlik. Az AD (androszténdion) gazdaságos
előállításának feltétele a fent említett két enzim működésképtelensége.
Xxxxxxxxxxx

Az elmúlt évtizedekben különböző prokarióta szervezetekből számos enzimsérült mutánst

lehetett izolálni, amelyeket a lebomlási út egyes közti termékeinek nagyobb mennyiségben való
előállítására lehetett használni.

A szteroid ipar nyersanyag ellátását a XXI században is ezeknek a mutánsoknak az ipari

gyakorlatban való használata szolgálja.

38
 α-oxigenáz hiányos mutáns törzs csak az oldallánc lebontására képes.
A 9α
A szitoszterinből induló 4-androsztén-3,17-dion főtermék (AD) képződésére vezető
biokonverziós eljárás során, az oldallánc lebontásában mindössze tíz enzim vesz részt 16
enzimkatalizálta lépésben. Néhány enzim többször is szerephez jut Az enzimek részben
membránhoz kötve, illetve a membrán közelében levő mikroszómákban működnek.
A membránon keresztül hatoló szterin molekula apoláros oldallámcára az oxigén
funkciót az indukálható omega-oxigenáz katalizálja. A rekcióelegyben oldott oxigén beépítése a
NADPH két elektronjának a felhasználásával történik egy molekula víz képződése mellett. Az
alkohol aldehiddé oxidálását a citoplazmában működő alkohol dehidrogenáz végzi. Az
eltávolított két elektront a NAD+ kofaktor veszi fel. A következő két elektron eltávolítását
ugyancsak NAD kofaktorral működő aldehid dehidrogenáz végzi. A következő működő enzim a
tioforáz, amely acetil-CoA felhasználásával az intermediert acil-S-CoA származékká alakítja. Ez
ideális szubsztrátum a mikroszómába rögzített acil-S-CoA dehidrogenáz számára.
Két hidrogént az enzimhez kötött FAD vesz fel. Ekkor következik be a szitoszterin C-24
etiloldalláncának karboxilezése. Ez az intermedier ideális szubsztrátum a metil-krotonil-CoA
karboxiláz számára, mert az etil oldallánc 1-szénatomja kitüntetetten reakcióképes A
karboxilezést végző, indukálható enzim képződése a biotinil enzimet karboxilezett állapotban
ígényli. A karboxilezés a kialakuló adenilsav szénsav vegyesanhidrid aktuális koncentrációjától
(áttételesen a széndioxid parciális nyomásától) függ. A karboxilezett telítetlen intermedier
vízfelvételét az enoil-hidratáz katalizálja. Ezt követi úgynevezett retroaldol folyamat
eredményeként az első propionil-CoA spontán leválása. A spontán folyamatot a CoA-tiolészter
C2 atom kitüntetett elektronvonzó képessége mozgatja.
A következő lépésben újra a tioforáz lép működésbe, amely.acetil-CoA igénybevételével
katalizálja a tovább bontható származék képződését. Ezt követően a zsírsav ß-lebontásában is
résztvevő ß-keto-tioláz CoA jelenlétében leválasztja a második propionil-CoA-t. Ezt követően az
acil-S-CoA dehidrogenáz által előállított telítetlen intermedier vízfelvételét az enoil-hidratáz
katalizálja. A hidroxilezett származékból a ß-hidroxiacil-S-CoA dehidrogenáz működését
követően a keto-tioliáz hatására szabadul fel az acetil-CoA. Az oldallánc lebontás utolsó
szakasza a bisnorkolenil-CoA dehidrogénezése. A két hidrogént ismét a FAD kofaktorral
működő acil-S-CoA dehidrogenáz távolítja el. Ezt követi a acil-CoA-enoil-hidratáz által
katalizált vízfelvétel, amelynek hatására a spontán bekövetkező retroaldol átrendeződés
eredményeként megjelenik a hamadik propionil-S-CoA és főtermékként AD képződik.
Az utolsó enzimreakciók lefutását erősen befolyásolja a szteroid mag D gyűrüjének
merev szerkezete, csökkenti a reakció teljesítményét (fluxusát). Az utolsó lépések szűk
keresztmetszete miatt feltorlódó köztestermékek az aciltranszferáz hatására a kofaktor
ellátottsággal összefüggő minőségben és mennyiségben megjelennek a biokonverziós elegyben.
Ezek a köztesanyagok (például bisznorkolénsav, tesztoszteron), már nem kerülnek vissza a
lebontási folyamatba, hanem a főterméket szennyező melléktermékként rontják az eljárás
hatásfokát, a kinyerést. A lebontási folyamat lépései ugyan nem igénylik a baktérium sejt
szaporodását, a kofaktorok (NADH illetve FADH2) regenerálása szempontjából azonban a
légző-rendszer működése —, az életben tartás — megkerülhetetlen. Ezért nem jöhet számításba
szerves oldószer alkalmazása.
Az oldallánc lebontás szük keresztmetszete a metilmalonil-CoA szintetáz, más néven a
propionil-CoA karboxiláz nem kielégítő működése, mivel a nagyobb mennyiségben képződő
propionil CoA eliminálására, hasznosítására a mikróba metabolizmusa csupán ezzel az egyetlen
lehetőséggel rendelkezik. A propionil-CoA metilmalonil-CoA szintetáz hatására egy szén
felvételével metilmalonil-CoA-vá, ez pedig egy mutáz hatására szukcinil-CoA-vá alakulva a
Krebs ciklusban hasznosul. Mindkét enzim propionsavval, ill. propanollal indukálható.

39
Az oldallánc szelektív lebontásával egy időben a szteroid mag AB gyűrűjén is enzimek által
katalizált átalakítások mehetnek végbe. A Mycobacterium törzsekben NAD-függő 3ß-
hidroxiszteroid dehidrogenáz alakítja ki a 3-keto-4-en szerkezetet. {β-enzim}

A Nocardia törzsekben és több Actinomyces fajban előforduló szterinoxidáz működését az

átvizsgált Mycobacterium törzsekben nem sikerült kimutatni.

40
 19-NORSZTEROID TOTÁLSZINTÉZIS
A születés szabályozás hormonális úton való megoldása gazdaságos norszteroid előállítási eljárás
kidolgozását igényelte. Az egyik út az előbb bemutatott szelektív oldallánc lebontással nyert
szterin 19 metil-csoportjának az eltávolítása. A Johnson nevéhez fűződő ösztronszintézis, a
norszteroidok totálszintézissel történő előállítása a molekulában előforduló királis szénatomok
miatt gazdaságosan nem oldható meg, bár a létrejövő racém termék szétválasztására az enzimek
sztereospecifitásán alapuló módszerek jól alkalmazhatók. Hátránya, hogy ez az eljárás optimális
esetben sem éri el a racém végtermékre számítva az 50 %-ot. Ebből következően nagy gazdasági
jelentősége van minden olyan eljárásnak, amely egy adott szintézisút optikailag inaktív

termékéből biológiai módszerrel alakítja ki az aktív intermediert. Ebben az esetben ugyanis nincs
elvi akadálya a kvantitatív átalakítás tetszőleges megközelítésének. Döntő fordulatot jelentett
Velluze, valamint a Smith-Torgov féle, eredetileg racém termék előállítását szolgáló
totálszintézis kidolgozása. A 2-metil-2-aralkil-ciklopentán-dion viszonylag olcsó teremék. A C
gyűrű sztereospecifikus zárása biztosíthatja a végtermék optikai tisztaságát. Ezt a feladatot
legegyszerűbben az egyik szterikusan kitüntetett helyzetű ketocsoport reakcióképességének
átmeneti felfüggesztésével lehet megoldani.

41
Kémiai redukcióval a szekodion redukálható keto csoportjai két helyzetben radukálódnak. A
reakcióelegyből azonban a kivánt termék rezoválással való elkülönítése nem tekinthető
gazdaságos megoldásnak.

Izolálható viszont olyam élesztő, amelynek a NADH igényes 3ß,17ß-hidroxiszteroid

dehidrogenáza képes a kívánt királis intermedier előállítására, miközben a kiválasztott
törzsben jelenlevő 3α-hidroxiszteroid-dehidrogenáz csekély aktivitást teljesít. Inhibitor
jelenlétében ez utóbbi aktivitás elnyomható. A két dehidrogenáz aktivitása az egyes
törzsekben eltérő szintet képvisel, ami mutagén hatásra is változhat.

A redukció végbemenetelének feltétele a redukált kofaktor (NADH) állandó jelenléte, ami azt
jelenti, hogy nélkülözhetetlen a dehidrogénezhető vegyület (szénhidrát, esetleg alkohol) és az
oxigén jelenléte. — A prokirális szubsztrátum, a 3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-
ösztratetraén-14,17-dion mikrokristályos formában adagolva gyorsítja a reakció lefolyását.

42
Egy viszonylag gazdaságosan előállítható prokirális 3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-
ösztratetraén-14,17-dion köztestermékből (szekodion), a 17-ketocsoport sztereoszelektiv
redukciójával nyerhető a kulcsintermedier (szekoolon). A szekodion 17 ß-hidroxi származékából
nemkívánt melléktermék képződése nélkül jutunk el az optikailag tiszta természetes
konfigurációjú ösztradiol (19-norszteroid) származékhoz.
A 14-ß-hidroxi származékból előállítható az enantiomer ösztron.

43
 A Pichia carsomii esetében a
3α-hidroxiszteroid oxidoreduktáz
aktivitás a nagyobb, ezért
főtermékként a szekodionból
14α származék képződik.

44
Üzemi körülmények között végzett biokonverziós folyamat adatait bemutató ábrán
jól látható a répacukor adagolás hatása

45
Biológiai hatás szempontjából a 13-etil-19-norszteroidok (18-metil-19-norszteroid) előállítása
céljából az etilszekodion redukcióját is meg kellett oldani. Megfelelő detergens
alkalmazásával a biokonverziós aktivitás fokozható volt
Redukálandó
szubsztrátum

13-metil
szekodion

(18-metil)
13-etil
szekodion

androszténdion

17-keto-
ösztron

(18-etil)
13-propil
szekodion

Az etilszekodionból biokonverzióval nyert 13-etil-szeko-17β−ol-14-on ból előállítható 19-

norszteroid ideális kiindulási termék a hatásos gestodén előállításához

46
Hatásos antikoncipiens

47
 ENANTIOMER ÖSZTRON INTERMEDIER ELŐÁLLÍTÁSA
Alkalmasan megválasztott mikroorganizmusok felhasználásával valamint a
biotranszformációs lépéseket kémiai redukcióval kombinálva, az enantiomer ösztron
előállítására szolgáló kulcsintermedier, a 14ß-hidroxi,17-keto-szekoolon is előállítható. — Az
első lépésben Saccharomyces uvarum-ot levegőztetett tenyészetben használva elkülönítjük a
17ß-szeko-olont, amit borohidrides redukcióval
14ß,17ß- és 14α,17ß-diolok elegyévé
redukálunk. A borohidrides redukció a
14β,17β- diol képződésnek kedvez. {A 17β-
szekoolon ecetsavanhidriddel acetilezett
származékának borohidrides redukciója
előnyösen növeli a 14β,17β-acetil származék
képződését.}
A következő anaerob lépésben a 14α−hidroxi
csoportot a Flavobacterium dehidrogenans
keto csoporttá redukálja. A képződő 17ß-
hidrozi származék recirkulálva újra redukálható
borohidriddel.

A katalitikus redukcióval nyert elegyben levő

14ß,17ß-diol 17ß-hidroxi csoportját anaerob
reakciókörülmények között egy erre a célra
kiválasztott Nocardia törzs dehidrogénezi. Az
így előállított (cisz-helyzetű) 14ß-hidroxi-17-
keto-szekoolonból jó hozammal előállítható az
enantiomer ösztradiol. (Lásd az ábrát a 42.
oldalon) {A prokarióta adott esetben az acetil

csoportot is hidrolizálja.}

48
 6-AMINOPENICILLANSAV (6-APS) ELŐÁLLÍTÁSA

A szakmai körokben igen olvasott Nature című folyóirat 187-es kötetében a 236-237
oldalakon 1960-ban két közlemény jelent meg. Az egyik angol szerzők tollából (Beecham
Research Laboratories Ltd.), a másikat pedig egy amerikai gyógyszergyár (Bristol Co) kutatói
írták. A két közlemény gazdaságos biokonverziós eljárás lehetőségét vázolta fel a penám
alapmolekula, a 6-aminopenicillinsav nagyipari előállítására. Ennek a vegyületnek a jelenlétét
prekurzor nélkül növekedő Penicillium chrysogenum tenyészetében már egy évvel előbb
közölték Batchelor és munkatársai (Nature 1959.183:257). Sőt a kép teljességéhez tartozik,
hogy a japán Kato (J. Antibio. 1953 6:130, 6:184), valamint ugyancsak japán folyóiratban (J.
Agric. Chem. Soc. 1950.23:411) Sakaguchi és Murao benzilpenicillinből való képződését már
tíz évvel előbb közölték penicillin amidáznak nevezett enzim termékeként. Erről azonban,
talán nyelvi nehézség miatt tíz éven keresztül nem vett tudomást az antibiotikum-ipar.
Később ez az enzim penicillin acilázként (EC.3.5.1.11) vonult be a szakirodalomba.
A nagy áttörést Chain és munkatársainak az a felismerése jelentette, hogy a penicillin alapváz
6-aminocsoportja tetszőleges reagenssel acilezve új nagyhatású azetidinon származékok
előállítását teszi lehetővé.— A penám alapmolekula kémiai acilezésének a gondolatát
valószínüleg a penicillin totálszintézisével foglalkozó kémikusok ezidőtájt nyilvánosságra
került eredményei hívták elő. — A penicillin szerkezeti képletének a megismerésekor, a
királis szénatomok száma visszarettentette a kemikusokat a hatásos vegyület szintézisétől. A
szerves szintézis gyors fejlődése, különösen a peptidszintézis módszereinek a fejlesztése az
ötvenes években már királis szénatomot tartalmazó vegyületek gazdaságos előállítását tették
lehetővé. A ftálimid védőcsoport irányító hatása, a tercier butilészter csoport könnyű
eltávolíthatósága, és a diciklohexil-carbodiimid alkalmazása ugrásszerű fejlődést hozott.
Sikerrel vállalkoztak a hatásos anyag totálszintézisére.

Az első reakciólépésben penicillamid-hidrokloriddal nátriumacetáttal pufferolt vizes

etanolban reagál a tercier-butil-ftálimido-malonaldehid. A ftalil csoport eltávolítását hidrazin
komplex képzésen keresztül végezték ecetsavban szuszpendálva. A tecier-butiloxikarbonil-
tiazolidin származék aminocsoportját egyenértéksúlynyi fenoxi-acetilkloriddal acilezték két

49
ekvivalens trietilamin jelenlétében. A tercier-butiloxi csoport eltávolítását metilén kloridban
vízmentes sósavval végezték, amit átkristályosítás követett ekvivalens piridint tartalmazó
vizes acetonból. A gyürűzárást ekvivalens mennyiségű N-diciklohexilkarbodiimiddel
végezték dioxán vizes oldatában. — A szintézis az enantiomerek előállítására is lehetőséget
adott. Ezek azonban alig mutattak biológiai aktivitást (0.7% a teremészetes penicillinre
vonatkoztatva). A tritil védőcsoport megadta a lehetőséget a „penicillin mag” a 6-
aminopenicillinsav totálszintézisére, ami számos új penicillin származék előállítására adott
lehetőséget. Ez esetben a ftalil védőcsoport eltávolítása előtt a karboxilcsoportot észterezték.
A tercier butiloxivédelem eltávolítása után tritilezték az aminocsoportot dietilamin
jelenlétében. Ezt követte a gyürűzárás, amit N,N’-diizopropil-karbodiimiddel hajtottak végre
dioxánban a D-α-4-karbometoxi-5,5-dimetil-α-tritil-amino-2-tiazolidin-ecetsavból. Al-oxidon
végzett kromatografálás után kristályos formában nyerték a 6-tritil-aminopenicillinsav-
metilésztert, amiből az észter hidrolízisével dietilamin sót nyertek, majd híg sósavval a tritil
csoport eltávolítása következett.
Nyilvánvaló, hogy Sheehan és munkatársainak 1955-ben a V-penicillin totálszintéziséről
megjelent munkái katalizálták az antibiotikumokkal foglalkozó mikrobiológusok és
vegyészek fantáziáját. — Hamarosan számos mikrobiológiai eljárás született a 6-APS
származékainak előállítására. A prekurzor nélkül végzett direkt-fermentációs eljáráson kívül
az olcsó penicillint használva kiindulási anyagként sikerrel használtak biokonverziós
módszereket. A prekurzor nemcsak hatásosabb termék képződését eredményezi, de a
prekurzor beépülésével egyidejüleg a α-amino-adipinsav újra használhatóvá válik a
szintézisben, ami a penám váz képződését segíti. Prekurzor jelenlétében több mint egy
nagyságrenddel nagyobb koncentrációban képződik a penám váz, mint prekurzor nélkül. —
Az pedig, hogy a
6-APS előállításhoz G és a V penicillin egyaránt használható kiindulási anyagként a termék
előállítási ára szempontjából nem elhanyagolható. Bizonyos baktériumok például az
Escherichia coli a G penicillin dezacetilezését végzi hatásosan. A Streptomyces törzsek a V-
penicillinről, a fenoxiecetsav eltávolításában jeleskednek. Lugos pH a hidrolízisnek, savas pH
a szintézisnek kedvez. Az enzim erdetileg valamilyen transzacilezési folyamatot katalizált a
membránban. Az eljárás ipari jelentősége miatt az enzimtermeló törzsek fejlesztése fontos
feladat volt. Kezdetben a klasszikus mutagén ágenseket alkalmazva is sikerült nagyobb
enzimszintet termelő törzseket izolálni. Később konstitutívan penicillin acilázt termelő
mutánst izoláltunk.
Az enzimes eljárás kihozatalát a szubsztrátum és
a termék érzékeny volta befolyásolja. Semleges
pH-nál 37°C-on 3 óra alatt a hasznos teremék
50 %-a inaktíválódik. — A képződő 6-APS
képes a vízben oldódó széndioxiddal, a
szénsavval reagálni. A 6-APS karboniloxi
származékából spontán képződő imidazolidon
enolizált formája könnyen dekarboxileződik. —
A másik inaktiválódási lehetőség a
polimerizáció, ami az enzim transzacilkező
aktivitásának a következménye, és a reakció
előrehaladtával a termékkoncentráció
függvényében jelentős veszteséget okoz. — A
két folyamat egymást segítve rontja a kihozatalt.

50
A reakcióelegyben G-penicillinből képződő 6-aminopenicillansav sorsa
6-APS előállítása kémiai eljárással
A félszintézishez használható
alapanyag(6-aminopenicillansav)
nagyvolumenű előállítására,
illetve a fenoxiecetsav
tetszőleges csoporttal való
kicserélésére kémiai megoldás is
ismeretes. Első lépésként a
penicillin karboxil csoportjának a
védelme alkil-szililészter
képzésével oldható meg. A
kapott reakcióterméket -30 oC
alatt iminohalogenidet képző
reagenssel, például (PCl5)
foszforpentakloriddal hozzák
össze. Az átmeneti termékként
képződő N-monoszubsztituált
imino-kloridot alkohollal
(esetünkben n-butanollal)
reagáltatva imino-éterré
alakítják, amelyből az iminoéter
csoport és a védőcsoport
hidrolízisével nyerhető a 6-APS.

Ezek az eljárások gazdaságos lehetőséget jelentettek félszintézissel előállítható új penicillin

származékok nagyipari előállítására. Általában — így az oxacillin előállításakor is —
savkloridokat használnak acilező szerként.

51
Esetenként az enzimes szintézis is szerepet kap, kihasználva a penicillin-(aciláz)-amidáz
reakció reverzibilis voltát.
Különösen előnyös az enzim, ha
ezzel elkerülhető a védőcsoport
használata. Igy gazdaságosan
nyerhető az ampicillin fenilglicin-
tioglikolsav észterből és 6-APS-ből
penicillin-aciláz enzimmel savanyú
közegben végzett reakcióval.
A hatvanas években
Ampicillin előállítása Escherichia coli tenyészetével előállított sok ezer új vegyület
között több száz hatásos termék akadt. Ezek az új származékok a fermentációs úton
előállítható két (G- és V-penicillin) származéknál előnyösebb terápiás hatásúak. A savamid
kötés közelében elhelyezett nagy térkitöltésű szubsztituens (methicillin, penbritin) védelmet
jelentett a penicillináz inaktíváló hatásával szemben. A savállóságot növelte a savamid kötés
közelében elhelyezkedő elektronszívó csoport (oxacillin, cloxacillin, flucloxacillin). A
baktérium spektrum szélesítése céljából előnyös volt az amino csoportot tartalmazó arómás
savvakkal (fenilglicin, p-hidroxi-fenilglicin) történő acilezés (ampicillin, amoxicillin). Szabad
karboxil csoport jelenléte (fenilmalonsav) a Pseudomonas fajok leküzdésére is alkalmassá
teszi az új származékot (carbenicillin). A penámváz karboxil csoportját érintő kémiai
átalakítások (pl.G-penicillin acetoximetilésztere) az alkalmazhatóságot befolyásolhatják
(maripen). A félszintézissel előállított új származékok antibakteriális hatása (MIC érték) is
kedvezően megváltozhatott. Eltérést találtak a felszívódásban, a kiürülésben, a vérszint
alakulásában.
Félszintetikus azetidinon származékok előállítása
A 6-aminopenicillansav acilezésével a penicillináznak ellenálló félszintetikus penicillin
származékok nyerhetők, de a baktérium-spektrum szélesítésére is lehetőség adódott

Oxacillin.
(5-metil-3-fenil-4-izoxazolil-penicillin. nátrium
monohidrát) A 3 fenil és az 5 metil csoport
térbeli gátlása akadályozza a molekula
kapcsolódását a penicillináz aktív központjához. A molekula elektronszerkezete savtűrést
biztosít. Ezért per os adagolva is alkalmas a penicillin rezisztens fertőzések leküzdésére. A
kapszulában forgalmazott (250 mg) hatóanyag a bélből felszívódva erősen kötődik a
plazmafehérjékhez. Egy óra múlva hatásos vérszintet ad. A vesén keresztül változatlan
formában ürül. Adagolása 4-6 óránként 2 kapszula egy órával az étkezés előtt.

Ampicillin (Penbritin, Semicillin) D-α-amino-

benzilpenicillin.trihidrát. Az aminocsoport az antibiotikum
baktérium spektrumát kiterjeszti. Eredményesen alkalmazható
a Gram negatív kórokzók, így az enterococcus okozta
fertőzések esetében is. Különösen hatásos akut hugyuti fertőzések (Escherichia coli, Proteus
mirabilis, etc.) leküzdésére. Az ampicillin amino csoportja savanyú körülmények között
protonálva van, ami bizonyos mértékű savstabilitást biztosít. Kapszulában adagolva általában
két óra alatt érhető el a maximális vérszint. A vesén keresztül változatlan formában ürül. Egy
kapszula 250 mg hatóanyagot tartalmaz, amiből hat óránként kell egyet bevenni. Injekciós
adagoláshoz nátrium sóját használják (porampullában).

52
 Amoxicillin 6-D-α-amino-p-hidroxi-
fenilacetamido-penicillansav, az ampicillin p-
hidroxi analógja. Baktérium spektruma és kémiai
stabilitása hasonló, de jobban szívódik fel a
bélcsatornából, ezért magasabb vérszintet ad. A gyorsabb felszívódás miatt kevésbbé hatásos
disenteria esetében. A vesén keresztül változatlan formában ürül, ezért hat óránként kell egy
egy kapszulát (250 mg hatóanyag) adni. Clavulánsavval együtt adagolva a rezisztens törzsek
ellen is hatásos széles spektrumú gyógyszerkészítményként kerül forgalomba.

Ezek az eredmények félszázaddal ezelőtt

a penicillináznak ellenálló, széles
spektrumú, kevéssé toxikus β-laktám
antibiotikum félszintézisének lehetőségét
teremtették meg. A bakteriális fertőzések
leküzdésében ezek a vegyületek ma is
döntő szerepet töltenek be.
Az eredmények azonban nem
függetleníthetők a gazdaszervezet
védekező mechanizmusának állapotától.
A felhasznált hatóanyagok csak
csökkentik a korokozók életképességét.
A végső eredményt az ellenanyagképző mechanizmus, az immunológiai védelem
teljesítménye határozza meg.

Bacillus cereus esetében, a kezdetben membránhoz kötődő enzim a periplazmikus

térben megjelenő proteáz hatására extracelluláris penicillinázként működik a környezetben.
Limitált proteolízis Proteáz hatás

apoláros szakasz| | **extracelluláris penicillináz*****|

H2N–Met–(Xxx)15–Ser–(Xxx)22–Glu–Ser–Lys–Thr–Glu–(Xxx)258–Lys–COOH
|
O
| foszfatídsavval acilezett szerin-OH
HO–P=O
|
HO–CH–CH–CH2
| | |
H O O
| |
O=C C=O
| |
R R R = páratlan szénatom számú alkil láncok
(A foszfolipid zsírsavkomponense )

A membránhoz kötődő penicillináz extracelluláris enzimmé válása a citoplazmammbrán

külső felületén tevékenykedő proteáz aktivitásának a függvénye.

53
A PENICILLIN FELFEDEZÉSE és a gyógyászatban való alkalmazásának történetét
tanulságos röviden áttekintani. A Londonban működő St. Mary kórház bakteriológusa, a
Hollandiából menekült családból származó Alexander Fleming (1881-1955) doktori
disszertációját a magasabb rendűek által védekező anyagként termelt lizozim tulajdonságait
vizsgálva készítette. Ez az enzim folytonosan termelődve, az élőlényt károsító baktériumok
sejtfalának szénhidrát építőelemei közötti β-glikozidos kötést hidrolizálva elpusztítja a
korokozót. — A szepszist okozó baktériumok tulajdonságait vizsgáló Fleming 1929-ben a
tenyészetét fertőző penész hatására bekövetkező baktérium-pusztulást, valamint a hatásos
anyag hő és pH érzékenységét tapasztalva, valami lizozimhoz hasonló hatóanyagra gondolt.
— A munkába kapcsolódó Dr. C. Thom mikológus rendszertanilag Penicillium notatum-mal,
egy ritkán előforduló fajjal azonosította az antibakteriális hatást mutató anyagot termelő
fonalas gombát. Az antibakteriális tulajdonságú hatásos anyag kinyerése céljából végzett
eredménytelen kísérleti munka után, 1932-ben Clutterbuck, a vegyész munkatárs, csak annyit
közölhetett, hogy a a termelő törzs fajnevéből következően penicillinnek elnevezett hatásos
anyag labilis, pH és hő érzékeny gyenge sav. Az anyag hatásossága és elhanyagolhatóan
csekély toxicitása azonban nem hagyta feledésbe merülni a felfedezést, bár a nehézségeket
látva Fleming sem bízott a sikerben. Az 1930-as évek végén csupán a tenyészet szűrletét
javasolhatta külsődleges alkalmazásra. Az Oxfordban összekovácsolódott munkacsoport
kitartó munkája, Chain és Florey erőfeszítései végül eredményre vezettek. Felületi
tenyészetből elkülönített tenyészléből fagyasztva szárítva sikerült kielégítő stabilitású barna
port nyerni, amellyel Abraham és munkatársai már bizonyíthatták az anyagnak a szeptikus
folyamatok leküzdésében elért fantasztikusnak tűnő gyógyító hatását. (Abraham közben
észlelte a hatóanyagot lebontó rezisztens baktériumok megjelenését)— Tiszta anyaggal nem
rendelkezve, biológiai egységet használtak összehasonlítási alapként. Oxford-egységnek (NE)
tekintették azt a legkisebb penicillin mennyiséget, amely egy bizonyos Staphylococcus törzs
növekedését 50 ml táptalajban képes gátolni. (Ez ma o.6 mg kristályos benzilpenicillin Na-
sónak felel meg.)
Fleming 1940 november 14.-én a Gyógyszerészeti Társaság tudományos űlésén
számolt be az eredményekről. A háborúba keveredett Angliából ezekkel az eredményekkel
indult 1941 júliusában Florey és Heatley az Egyesült Államokba az elnök anyagi támogatását
kérni az eredmények továbbfejlesztéséhez.— A kormányszervek felismerték a téma katonai
jelentőségét. (Az első világháborúban megsebesült katonák több mint 50%-a szepszisben halt
meg!) A Pentagon a Northern Regional Research Laboratory (NRRL Peoria, Illinois)
fermentációs osztályán R. D. Coghill és A. N. Richards mikrobiológusokat bízta meg a téma
vitelével. — David Perlman, a Wisconsin egyetem munkatársa szerint a termelő törzsek
kiválasztásában az USA lakosságának a segítségét is igénybe vették. Közhasznú hazafias
tevékenységgé vált a különböző helyekről származó gombatenyészetek eljuttatása a
Mezőgazdasági Minisztérium által fenntartott NRRL törzsgyűjteményébe, ahol szorgalmas
munkával minden tenyészet biológiai aktivitását megvizsgálták. Az összegyűjtött törzsek
közül egy háziasszony által beküldött grépfruitról származó Penicillium (notatum)
chrysogenum néven leírt tenyészet a Fleming által izoláltnál 10-szer nagyobb biológiai
aktivitást mutatott. Később (feltehetőleg szabadalmi okokból) a notatum előnév lemaradt.
Ebből az izolátumból fejlesztették ki a gyógyszeripar fermentációs üzemeiben világszerte
felhasználásra kerülő törzseket. — Az első felhasználásra került barna por mindössze 1%
hatóanyagot tartalmazott. A tisztításban való előrehaladás a kémiai szerkezet felderítésének
lehetőségét igérte. Abban reménykedtek, hogy a kémiai szerkezet ismeretében a viszonylag
kisméretű hatóanyag kémiai szintézisére lehetőséget találnak. — A szerkezetkutatásban l944-
ben már 59 kutatóhely vett részt teljes katonai titoktartás mellett. Ma már köztudott, hogy a
kutató munkát az zavarta, hogy a különböző laboratóriumokban előállított gombatenyészetek
szűrletei több mint 20 különféle penicillin keverékét tartalmazták, amelyeket az angol abc

54
betüivel jelöltek. Az USA laboratóriumaiban előállított penicillin készítményeknek a fizikai-
kémiai adatai jelentős mértékben eltértek az Angliában, szeszgyártási maradékon előállított
készítmények vizsgálatakor nyert adatoktól. Az egyik esetben G-penicillin (benzil-penicillin),
a másik esetben F-penicillin (pentenil-penicillin) volt a főtermék. Angliában a szeszgyártás
maradékát (distillers solubl) használták táptalajként, az US kutatói viszont a táptalaj nitrogén
forrásaként a keményítőgyártás melléktermékét, a fenilecetsavat is tartalmazó kukorica
áztatólé tejsavas erjesztéssel dúsított koncentrátumát alkalmazták. A tenyésztő táptalaj kémiai
összetételének meghatározó jelentőségét felismerve javasolták prekurzor alkalmazását. A
tápközeghez adott fenilecetsav jelenlétében a kutató laboratóriumokban világszerte főleg
benzil-penicillin képződött a tenyésztési ciklus második fázisában.—A penicillin szerkezeti
képletét megismerve, a királis szénatomok száma visszarettentette a kemikusokat a hatásos
H-C == C-H H O H H H CH3
| | | || | : : |
H-C C — C — C — N — C — C — S — C — CH3
|| || | | | |
H-C — C-H H O=C — N ——— C —H
|
G-Penicillin szerkezeti képlete O=C—OH
vegyület kémiai szintézisétől. Így a biológusokra hárult a fáradtságos feladat, jobban termelő
mutáns előállítása.
Kezdetben négy gyógyszergyártó vállalat (Pfizer, Lederle, Merck, Squibb) és több
kutató laboratórium, (Carnegie Institute, University of Minnesota, University of Wisconsin)
kapcsolódott a munkába. A katonai titoktartás szabályait betartó együttműködés a különböző
kutatóhelyek között tökéletes volt. A hadügyminisztérium szakemberei ezt az életmentőnek
tűnő anyagot minél előbb a szövetséges hatalmak katonakórházaiba kívánták juttatni.— Az
anyagi és a szellemi erőfeszítés hamarosan eredményt hozott. 1943 májusában az új
gyógyszert már 300 sebesült esetében alkalmazhatták teljes sikerrel a szepszis kialakulásának
akadályozására, illetve gyógyítására, sőt 1944-ben már indokolt esetben a polgári kórházak
számára is engedélyezték a hatásos anyag, a G-penicillin alkalmazását. 1944 júliusában a
király - a V-bombák rendszertelen érkezése miatt a királyi palota alagsorában rendezett
ceremonia keretében - tudományos érdemeit elismerve lovaggá ütötte Sir Alexander
Fleminget. — A Wisconsin egyetemen nyert mutáns a törzsgyüjteményben - Penicillium
chrysogenum NRRL 1951 számon - ma is megtalálható. Ez a törzs szénforrásként laktózt
tartalmazó, közel semlegesen tartott, jól levegőztetett táptalajon termeli a Gram-pozitív
mikroorganizmusok növekedését akadályozó antibiotikumot. Az inokulum szénforrása
azonban glükóz volt, mivel az antibiotikumot termelő gomba spórái csak glükóz szénforráson
csírázva képesek növekedni, viszont represszálja az antibiotikum szintézisében szereplő
enzimek képződését.
Az azetidinon szerkezetű antibiotikumok használatbavételét követően Abraham
sejtését igazolva, rezisztens kórokozók jelentek meg a kórházakban, ami indokolta az új
antibiotikumok felfedezését célzó nem csekély anyagi hasznot hozó, eredményes
kutatómunka szervezését. A katonai költségvetés a háború utolsó éveiben 30 millió dollárral
támogatta a program sikerét. A munkában résztvevő kutatóhelyek száma közben 20-ra
növekedett. A heti penicillin termelés 1943 végére elérte a 100 grammot (100 ezer NE
penicillin akkor 20 dollárba került, ez ma 1 milliárd NE ára). A fejlődés ütemét mutatja, hogy
1944-ben a havi termelés meghaladta a 200 kg-ot, amely 1946-ban évi 32 tonnára emelkedett.
Közel tíz év telik el a Penicillium notatum penész által termelt anyag, a penicillin
hatásának felismerésétől, a parenterális gyógyászati alkalmazásáig. — Ettől az időponttól
ugrásszerű a fejlődés. — Mi volt vajon a kezdeti sikertelenség oka?— Nem más, mint az,
hogy a kémiai tevékenység modern módszerei, a kis mennyiségű anyagok ma már megoldott
tisztítási eljárásai az időben ismeretlenek voltak, illetve még gyermekcipőben jártak. Nem

55
utolsó sorban éppen a biológiailag aktív anyagok tisztítására való törekvés volt a serkentője e
mikrokémiai módszerek fejlesztésének.— Ezen időszakban a kutató kapacitás jelentős részét
világszerte a gyógyszeripar által támogatott, szép eredményekkel dicsekvő (salvarzán,
prontozil stb.) kemoterápia fejlesztése vonta el. Ebben az időszakban a kemoterápiai
módszerek tökéletesedésével egy új gondolkodásmód terjedt el a fertőzéses megbetegedések
leküzdése területén. Tüneti kezelés helyett, a gazdaszervezet károsítása nélkül a kórokozó
elpusztítására törekedtek.
A benzil-penicillin képződést katalizáló három enzim, [ACVs, IPNs, IAT] működése:

L-α-aminoadipinsav L-cisztein L-valin

| ATP ATP ATP
A három enzim
O H H SH CH3 képződését glükóz
|| | | | |
HOOC−−CΗ−CΗ2−CH2−CH2−−C−−N—C—CH2 H H−C−−CH3 represszálja!!!
| | | |
NH2 O=C ——— N ——— C—H
|
δ−(L-α-aminoadipil) - L-ciszteinil - D-valin COOH ACV tripeptid szintetáz (ACVs)
Fe++ O2 Mg++ ATP ditiotreitol
Izopenicillin -N-szintetáz (IPNs)
H H H H O H H H CH3
| | | | || | : : |
HOOC—C—C—C—C—C— N — C— C—S— C—CH3
| | | | | | |
H 2N H H H O=C—N———C—H
:
izopenicillin-N COOH
(δ)-L-α-aminoadipilsavval acilezett 6-amino-penicillansav
Izopenicillin aciltranszferáz (IAT)
COOH
|
H2C—CH2—N—H
6-oxopiperidin-2-karbonsav | |
H2C—CH2—C = O
NAD+ >>>> NADH
H H CH3 H H CH3
: : | : : |
HOOC-CH-CH2-CH2-CH2-CO-NH-C---C—S—C—CH3 (BENZIL)--CO-NH-C---C—S—C—CH3
| | | | | | |
NH2 O=C---N-------C—H penicillinaciláz O=C---N-------C—H
: :
COOH (BENZIL)-CO-S—CoA COOH
izopenicillin-N
(δ)-L-α-aminoadipilsavval acilezett 6-amino-penicillansav G-penicillin (benzil-penicillin)

Az aciláz által leválasztott aminoadipilsav átmenetileg gyűrűs formában (6-oxopiperidin-2-

karbonsav) szabadul majd adenilsavval vegyesanhidridet képezve újra részt vehet az izo-
penicillin N bioszintézisben.
A történelmi előzményekre gondolva már időszámításunk előtt 5-600 évvel készült
kínai feljegyzések említik, hogy szójababon nőtt gombák nedvével furunkulusok, gennyes
fertőzések leküzdhetők. A tudománytörténet Roberts 1870-ben közzétett dolgozatát tekinti az
első antibiózisra utaló híradásnak. Ebben a szerző leírja, hogy Penicillium glaucum
tenyészetében nem növekednek a baktériumok. Ilyen jelenséget több klinikai laboratóriumban
észleltek, sőt több esetben mint figyelemreméltó tapasztalat közlésre is került, mégsem lett

56
belőle piacképes termék. — A második világháború után azonban a penicllin előállításával a
gyógyítás történetében új korszak kezdődött. Az antibiotikumok megjelenése az orvosi
gyakorlatban, a fertőző betegségek elleni küzdelemben addig nem tapasztalt forradalmi
fejlődést jelentett. Széleskörű gyógyászati alkalmazásuk az átlagéletkor meghosszabbodását
jelentette. A genetikailag megalapozott egyéni különbségek, az öröklött ellenálló képesség
szintjében jelentkező eltérés szelekciós hatása csökkent. Az addig ritkábban előforduló halált
okozó megbetegedések ennek következtében előtérbe kerültek (rák, keringési problémák). A
gyermekhalandóság csökkenése, a szeptikus folyamatok kialakulásának megakadályozása, a
fertőző betegségek leküzdése a lakosság életkori összetételét jelentősen megváltoztatta. Nem
csekély mértékben az antibiotikumok használatának terjedése is hozzájárul a Föld
népességének ugrásszerű növekedéséhez, ami áttételesen a társadalmi átalakulásokra is
hatással van. — Az antibiózis fogalma a biológiában régóta ismert, mint a szimbiózis
ellentéte. A kifejezést először Vuillemin használta 1889-ben megjelent dolgozatában. —
Hagyománytiszteletből antibiotikumnak nevezzük azokat a mikroorganizmusok
életműködését gátló vegyületeket, amelyeket a létért való küzdelem jegyében a
mikroorganizmusok termelnek. E vegyületek utáni kutatás és a kiválasztott vegyületek
nagyipari előállítása a gyógyszeripar dinamikusan fejlődő ágát teremtette meg.

Miért nem toxikus a β-laktám antibiotikun?

A sejtfal peptid vázának továbbépítését a membrán külső felületén működő transzglikozidáz
[TGáz] és a transzpeptidáz [Tpáz] végzi. Ez az utóbbi enzim a muropeptid terminális D-alanin
elemének eltávolításával felszabaduló karboxil csoportot illeszti a már meglevő murein váz
szabad aminocsoportjához. A transzglikozidáz pedig a peptidoglükán építőelem diszacharid
komponensét a glükán polimer terminális hexóz C4 atomjához kapcsolja. Az újabb építőelem
két ponton való kapcsolásával nő a térhálós szerkezetű sejtfal.

A transzpeptidáz reakció végbemenetele közben a szubsztrátum átmenetileg acilezi az

enzimet és az acilezett enzimről kerül az acilező ágens a muropeptid sejtfal N terminális
amino csoportjára.

57
Az azetidinon molekula merevített szerkezete éppen a muropeptid építőelem D-alanin-D-
alanin dipeptid szerkezetéhez hasonlít. Nem meglepő tehát, hogy nagyfokú szerkezeti
analógia miatt a penicillin a sejtfalépítő transztpeptidáz (TPáz) aktív centrumába kötődve
acilezi, inaktíválja az enzimet és ezzel a peptidoglükán sejtfal építését akadályozva végül is a
baktérium pusztulását okozza

A muropeptid
D-Ala-D-Ala
vége

G-penicillin

58
Fleming felfedezését követően hosszabb ideig úgy vélték, hogy a penám váz szintézisére csak
a Penicillium nemzetség néhány faja jöhet számításba. Az a tapasztalat, hogy a Penicillium
tenyészhelyén baktériumok nem fordulnak elő, a létért folytatott küzdelemben való szerepe
joggal kérdőjelezhető volt. A hatásos antibiotikum fekszaporodása csak mesterséges
körülmények között, semleges körüli pH estén figyelhető meg. Közel húsz év telik el Fleming
emlékezetes bejelentése után a második β-laktám típusú antibiotikum felfedezéséig. Brotzu
1948-ban közli, hogy egy Cephalosporium acremonium törzs tenyészlevében igen erős széles
spektrumu antibakteriális hatás észlelhető (J. Gen. Microbiol. 47:1952). A fermentlé több
biológiailag aktív terméket tartalmaz. A Cepalosporin-C hatóanyagon és a 6-
aminopenicillansav D-α-aminoadipinsavval acilezett Gram-pozitív és Gram-negatív
kórokozók ellen hatásos származékán, a penicillin-N antibiotikumon kívül egy savanyú
természetű szteroid vázat tartalmazó kefalosporin-P-nek nevezett helvolinsav származék
jelenlétét is bizonyították. A főtermékként megjelenő Cephalosporin-C-nek elnevezett
azetidinon (β-laktám) származékot Abraham és Newton izolálta 1961-ben. Később a törzs
rendszertani hovatartozását végző mikológusok az antibiotikumot termelő törzset helyesen
Acremonium chrysogenum névvel különítették el a Cephalosporium fajoktól. A termelő törzs
nevének változása nem befolyásolta az antibiotikum elnevezését. Megjegyzendő, hogy a
Penicillium chrysogenum illetve az Acremonium chrysogenum élőhelyén a savanyú pH
viszonyok miatt nem szaporodnak a baktériumok, a nyomokban termelődő β-laktám
antibiotikum pedig savkatalizálta reakció keretében elbomlana.)
NH2 H H H O H H H H
| | | | || | : : |
HOOC — C — C — C — C — C — N — C — C — S — C — H O
| | | | | | | ||
H H H H O=C — N — C== C — CH2— O — C — CH3
| Cephalosporin-C szerkezeti képlete
O=C—OH
(δ)-D-α-aminoadipilsavval acilezett 7-amino-kefémsav.acetát

H 2N H H H O H H H CH3
| | | | || | : : |
HOOC—C—C—C—C—C— N — C—C—S—C—CH3
| | | | | | |
H H H H O=C—N —— C—H
:
Penicillin-N (δ)-D-α-aminoadipilsavval acilezett 6-amino-penicillansav COOH

A második azetidinon szerkezetű antibiotikum izolálása után szervezett kutatómunka indult

újabb β-laktám szerkezetű hatóanyagok előállítása céljából, kiterjesztve a vizsgálatokat a
prokariótákra. Hamarosan új vegyületcsoportot a carbapenemeket fedezték fel egymástól
függetlenül a Merck és a Beecham kutatói, a Streptomyces fajok által termelt
thienamycineket. Ez esetben a kén atom nem az anellált gyűrűben, hanem tioetanolamin
származékként tioéter kötésben található. (Streptomyces clavuligerus, S olivaceus, Erwinia
carotovora, Serratia sp.)
CH3 Tienamicinek szerkezeti képlete
|
HO-C-H H O CH3 H H
: : || | : :
H—C—— C ———CH2 HO—S—O—C—– C——C———CH2 H H
| | | || | | | | | |
O=C--------N---C== C—S—CH2--CH2--NH2 O H O=C —–N —C==C––S—C=C---N---C---CH3
| | | ||
COOH COOH H O

59
Ugyancsak Streptomyces törzsek termelik a. Merck és az Eli Lilly kutatói által felfedezett
cefamicineket. A Streptomyces clavuligerus, törzsek által termelt cefamicin származékok
különlegessége a 7-α-metoxi csoport megjelenése és az oximetil csoport hiánya, illetve
karbamoilezettsége.
CH3
|
NH2 H H H O H O H
| | | | || | : :
HOOC— C — C — C — C — C — N — C — C — S — CH2 O
| | | | | | | ||
H H H H O= C — N —C===C—CH2—O—C—NH2
|
Cephamycin szerkezete O=C−OH

A cefém váz penicillináznak ellenálló tulajdonsága, a nitrogén külső elektronpályáján levő

elektronpár részvételéből adódó kvázi konjugált elektron eloszlásból következik
Azetidinon gyűrűt tartalmaznak a
monolactamok. Képviselőjüket a
nocardicint Fujisava izolálta
Nocardia uniformis tsuyamanensis
tenyészlevéből. A molekula
ciszteinből és homo-szerinből, a
p-hidroxi-fenilglicin oximino
származékából épül fel.

A hetvenes évek végén végzett kutatómunka N-szulfonil azetidinon gyürűt tartalmazó Gram-
negatív törzsekre ható β-laktám vegyületek felfedezéséhez vezetett. Monobaktám néven
tárgyalja őket a irodalomm mert baktériumok (Pseudomonas acidophila, Gluconobacter,
Acetobacter, Agrobacterium radiobacter) tenyészlevéből izolálták őket. A 3-amino-
baktámsav alapváz savanyú természetét az N-szulfonsav csoport okozza. A β-helyzetű amino-
csoportot különféle savak, illetve savszármazékok acilezik. Több esetben a 3-α-helyzetű
hidrogént metoxi csoport helyettesíti.
CH3 H H H O H H
| | : | || | :
O=C-------N--------C------CH2 --CH2----C-----C-----N------C-----CH2
| | | | |
O=C-------N NH O=C---- N
|
SO3 K+ O=C−−CH3 SO3 K+

Az Agrobacterium radiobacter törzs termékében az acilező sav aromás gyűrűt tartalmaz.

Ezek az utóbbi azetidinon szerkezetű antibiotikumok gyógyászati felhasználásra nem
kerültek, de a megszerzett biokémiai ismeretek termékenyítőleg hatottak az új hatóanyagok
előállítását célzó kutató munkában.

A század második felében végzett kiterjedt vizsgálatok megerősítették, hogy a bioszintetizáló

rendszer a tömlősgombák számos nemzetségben előfordul. A molekuláris biológiai
vizsgálatok egyértelműen a gén prokarióta eredetére utalnak, ahol a hatásos anyag
megjelenése valóban előnyt jelent a létért való küzdelem szinpadán. A gombák kialakulásuk
idején, egy milliárd évvel ezelőtt a prokariótákban addig kialakult örökítő anyagot változtatás
nélkül átvették, függetlenül attól hogy az átvétel számukra előnyt jelentett vagy nem.

60
A Beecham Laboratórium kutatói által vizsgált Streptomyces clavuligerus tenyészlevéből egy
clavulansavnak elnevezett vegyületet is izoláltak. Ez a
vegyület a tiazolidin gyűrű helyett oxazolidin gyűrűt
tartalmaz. A kén helyett oxigént tartalmazó alapváz acilező
aktivitása fokozott mértékű. A C6 szubsztituens hiánya miatt
antibakteriális hatást ugyan nem mutat, de a penicillináz
enzimet képes inaktíválni.

A clavulánsav hatásmódja

A β-laktam bontásáért
felelős -SH csoportot a
felnyíló laktám gyürű
acilezi.

Ezt követőleg az oxazol

gyürű felnyílása után a
reaktív oldallánc stabil
tioéter kötésbe lép az enzim
másik SH csoportjával.

Széles spektrumú
félszintetikus penicillin
származékokkal együtt
adagolva azóta is a
penicillin rezisztens
fertőzések leküzdésére
használják.

61
A hatásos termék a fonalas gomba intenzív anyagcserét folytató csúcssejtjében képződik, a
növekedési szakaszt követő ugynevezett idiofázisban, amikor jelentős mennyiségű fehérje
képződése már nem észlelhető.

Ezen ismeret birtokában olyan mutánsokat különítettek el, amelyek az induló sporaszám
függvényében pellet képzésre hajlamot mutattak. Ez a tenyészlé egységnyi térfogatában nem
csak növelte a csúcssejtek számát, de javult a tenyészet levegőztethetősége is, ami a
metabolikus aktivitás szhintje szempontjából is előnyös volt.

62
 KONVERZIÓRA ALKALMAS SEJTTÖMEG FELHASZNÁLÁSA.
Az eljárás kifejlesztésének első lépése a fenilecetsav lehasítását végző mikroorganizmus
kiválasztása, illetve teljesítményének fejlesztése. A mikroorganizmus teljesítőképességét
agardiffúziós módszerrel célszerű vizsgálni. A kinőtt mikroorganizmus foszfátpufferben
készült sejtszuszpenziójához foszfát pufferben készült G-.penicillin oldatot adva 28 ˛°C
hőmérsékleten egy csepp toluol jelenlétében kerül a termosztátba. (A kontroll cső
sejtszuszpenzió nélkül tartalmazza a penicillin oldatot.) Az inkubált csövekből vett minta
centrifugált és megfelelően higított felülúszó 0.1 ml-ét Bacillus subtilis spóraszuszpenzióval
fertőzött agarlemezen készített lyukakba cseppentjük. Ezek közül három lyukba fenilecetsav
klorid került. Az agarlemezt 37 °C-on inkubálva egy éjszakán keresztül, a gátlási zóna
átmérője számszerüsíti a tenyészet teljesítményét. A kontroll a penicillint tartalmazó
reakcióelegy gátló hatását mutatja. A sejtszuszpenziót tartalmazó minta viszont a penicillin
gátló hatásának csökkenését jelzi az idő függvényében. A fenilecetsav-kloriddal kiegészített
lyukak körül jelentkező gátló hatás a 6-aminopenicillinsav acilezésével nyert antibiotikus
hatást számszerüsíti. A fenilecetsavklorid adagolás nem befolyásolja a gátló hatás
csökkenését, ha valóban penicillináz inaktíválta a G- penicillin oldatot.
Az egyik ipari gyakorlatban alkalmazott eljárás szerint a 2% kukoricalekvárt
tartalmazó, enyhén lúgos (pH 8) körülmények között üledékmentesre szűrt táptalj
induktorként 0.1% ammonium fenilacetátot tartalmazott. Az enzim katabolikus
represszálhatósága miatt a tápközeg metabolizálható szénforrást, így glicerint sem
tartalmazhat. Az 1 % rázott lombikban készült Escherichia coli tenyészettel oltott, enyhén
kevert (300 fordulat/perc) tenyészet 26 C°–on mindössze 1/5 térfogat levegő átfúvása mellett,
26 óra alatt éri el a maximális enzimszintet, miközben a pH az ammonia termelés hatására az
indulási értékről 8,5-8,9-re emelkedik. A kifejlődött tenyészet szupercentrifugával (15000
ford/perc) elkülönítve, 1/10-ed térfogatra sürítve. 10% penicillin-sót tartalmazó csapvízben
kerül felhasználásra. A sejtfal áteresztőképességét 0,01% butilacetát adagolása növeli. A
reakcióelegy pH-ja a felszabaduló prekurzor hatását ellensúlyozva folyamatos lugadagolással
pH-8 értéken tartandó. A reakció befejeztét a savanyodás mértékének csökkenése jelzi. Az
újabb centrifugálással eltávolított sejttömeg ismételten felhasználható. A felülúszóból, a
széteső sejtekből kikerült penicillin-acilázt tartalmazó fehérje eltávolítása után a
reakciótermék, a 6-APS, hűtve, az izoelektromos pontján kristályosítható. — A sejtből
kiszabaduló aciláz azonban az ismételten felhasználásra kerülő sejttömeg összaktivitásából
hiányzik.— Az összegyüjtött sejtek csapvizes szuszpenziójához adott 0.1% glutárdialdehid a
membránfehérjék és a sejtfal aminocsoportjaival reagálva az enzimet képződési helyére
rögzíti. Ez a reagens azonban nem csak a sejtek ellenállóképességét növeli, de
természetszerüleg az aciláz aminocsoportjaival is reagál, amit az aktivitás csökkenése jelez.
Ezért fél óra kezelés után a feleslegben levő bifunkcionális reagenst ammonia adagolásával
inaktíválni kell. Az így kezelt Escherichia coli sejtek mechanikai ellenállóképessége a
sejtfeltáráshoz használt ultrahang készülék roncsoló hatását is elviseli. — A korabeli hazai
viszonyoket jellemzi, hogy azidőben a fermentációs ipar nem rendelkezett olyan
szupercentrifugával, amely nagy mennyíségű (20-30 m3) baktérium tenyészetből a sejteket
képes lett volna elkülöníteni. Ilyen eszköz beszerzésére valuta sem állt rendelkezésre. A
helyzetet felmérve, a hazai eszközállomány felhasználásával mégis sikerült elindítani — egy
évvel a Natur-ben megjelent közlemény után — az ipari körülmények között is gazdaságos 6-
APS termelést (150782 14.04.61 magyar szabadalmi bejelentés) mégpedig rögzített sejtekkel.—
A maximális enzimszintet elért tenyészethez adott nátrium foszfát oldódása után kálcium
kloriddal gél nyerhető, amely megkötve a baktériumsejteket szűrőprés segítségével könnyen
elkülöníthető, majd butilacetát jelenlétében a pH 8 folytonos ellenőrzése mellett penicillin
hasítására használható. Az átalakítás befejeztével szűrőprés segítségével nyert baktérium
mentes 6-APS tartalmú oldat félszintetikus készítmény alapanyagául szolgál. A kálciumfoszfát-

63
gél által megkötött sejtek pedig ismételt felhasználásra kerültek. A módszer előnye volt, hogy a
gél a sejtlízis miatt kiszabadult enzimet is megkötötte, így a kiszűrt gél enzimaktivitása
észrevehetően nem csökkent.

7-AMINO KEFÉMSAV (7-ACA) és

szármaszékainak ELŐÁLLÍTÁSA
A kefalosporin származékok penicillináz
rezisztenciája a kutatók figyelmét a 7-
aminokefém váz mikrobiális előállíthatóságára
irányította. Amíg az L-α-aminosavval
acilezett termék szelektív dezacetilezésre jól
használható a Bacillus subtilis, vagy más
baktérium aciláza, mindezideig nem sikerült
mikróbát találni a kefalosporin-C D-α-
aminoadipinsav oldalláncának gazdaságos
lehasítására.

Dezacetil 7-aminokefémsav előállítása

cephalosporin C antibiotikumból.
Egyetlen meg nem erősített japán közlemény állítja a
reakció végbemenetelét. Cseh szerzők két lépéssel
oldották meg a feladatot. Az első lépésben a
Trigonopsis variabilis D-aminosav oxidáza az
oldalláncot ketoadipinsavvá oxidálja hidrogénperoxid
és ammonia fekszabadulása mellett, amit már a
baktériumokban, például akár a Pseudomonas fajokban
is előforduló aciláz könnyen eltávolíthat. A kétlépéses
biokonverzió, jelenleg nem versenyezhet a kémiai 7-
ACA előállítási eljárással. A feladat géntechnológiai
megoldása várható, amennyiben a kefalonsporin-C
termelő törzsbe sikerül működöképesen a fenti
reakciókat katakizáló enzimek génjeit beépíteni.

Az Acremonium chrysogenum-ban természetes

körülmények között végbemenő gyűrűtágítási reakció
kémiai megfelelője iparilag is végrehajtható. A cefém
váz a viszonylag olcsó V-penicillinből könnyen
kivitelezhető reakcióval nyerhető. — oxidáló
reagensekkel előállítható szulfoxid köztiterméken
keresztül.
A tiazolidin gyűrű átrendeződése p-toluolszulfonsav jelenlétében refluxolva történik.

64
A végtermék penicillináz rezisztens, gyomorsav-stabil tehát szájon keresztül adható
gyógyszerként forgalmazható.A fenoxiecetsav eltávolítására kémiai, illetve enzimológiai
módszer egyaránt használható. A kémiai módszerrel kapott köztes termékről Bacillus subtilis
tenyészetével távolítható el a fenoxiecetsav. Az így nyert dezacetoxi-7-amino-
kefalosporánsav hatásos félszintetikus antibiotikumok kiindulási anyagaként hasznosítható.

A kefém alapváz nagyobb stabilitása

miatt 7-amino-kefalosporánsav (7-
ACA) előállítása jó hatásfokkal
történhet kémiai úton a 6-APS
előállítási eljárás analógiájára.

A aminoadipinsav-N-en tercier-
butiloxikarbonillal védett
kefalosporin-C dibenzil észterét
piridinben, foszfor-pentakloriddal
alacsony hőmérsékleten,(cseppfolyós
nitrogén) iminokloriddá alakítják.
Ebből alkoholizissel imino-éter
nyerhető.
Az ezt követő hidrolízis, valamint a
védőcsoportok eltávolítása ma már a
peptid szintézis rutin feladata.
A végtermék az első ábrán szereplő
hatásos félszintetikus származékok
előállításához használható.
xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

H H H H
| : : |
H— N — C — C — S — C — H
| | |
O=C — N — C==C — CH2— OH
|
O=C—OH
Dezacetil 7-amino-kefémsav (7-amino-cephemsav) szerkezeti képlete (A védőcsoportok
eltávolítása után)

Az így nyert 7-amino-dezacetoxi cefalosporánsavból készül az előzőkben említett cephalexin

(kefalexin), mégpedig tercier-butiloxi-karbonillal védett D-fenil-glicinnel való N-acilezéssel,
amit a védőcsoport eltávolítása követ.

65
 L- GLUTAMINSAV ELŐÁLLÍTÁSA

A XX.ik század első felében, főleg konzervipari felhasználásra gabona csírából állították elő
ipari méretben a glutaminsavat. A csírázó növényben meginduló fehérjeszintézishez
szükséges aminosavak képződésekor ugyanis a glutaminsav amino donorként nagy
mennyiségben kerül felhasználásra a transzaminációs folyamatokban. A szétroncsolt csíra
vizes szuszpenziójából a glutaminsav - lévén amino dikarbonsav - könnyen kinyerhető. A
nyomokban megtalálható természetes eredetű szennyezés nem zavarja az élelmiszeripari
felhasználókat. Az acetilénből vagy akrilonitrilből kiinduló kémiai (Strecker) szintézissel
nyert DL glutaminsav csak reszolválás után kerülhetne élelmiszeripari felhasználásra.
Tudvalevő, hogy csak az L-enantiomer stimulálja az izlelőbimbókban elhelyezkedő
receptorokat, a D enantiomer teljesen íztelen.

Az antibotikum termelés céljára kifejlesztett bioreaktor az ötvenes években lehetőséget adott

viszonylag elfogadható áron élelmiszeripari alapanyagok előállítására. Japán kutatók
eredményei irányították a figyelmet az aminosavak mikrobiológiai előállíthatóságára.
Szorgalmas munka eredményeként, mintegy 2000 átvizsgált prokariota és eukariota között
több olyan törzs is akadt, amelyik glükózt hasznosítva nagy mennyiségben választott ki
glutaminsavat a tápközegbe. A mikroszervezetekről szerzett élettani ismeretek alapján
várható volt, hogy ammónia jelenlétében a képződő glutaminsav felszaporodik a
környezetben, ha az α-ketoglutársav dekarboxilezésének a lehetősége csökken. Escherichia
coli-ból mutagén kezelésssel előállítottak glutaminsavat termelő α-ketoglutarát-dehidrogenáz
hiányos törzset. Az élelmiszeripar azonban az E. coli alkalmazásától tartózkodik. Kiemelkedő
termelő képességet mutatott egy Gram-pozitívan festhető baktérium csoport néhány variánsa.
Kinoshita és munkatársai által izolált baktérium törzset a termelőképességére utalva
Micrococcus glutamicus néven írták le (J. Gen. Appl. Microbiol. 3:276) Megjegyzendő, hogy
az ipari hasznosíthatóság céljából végzett kutatómunka közben nem rendszertani
szempiontból vizsgálják a számukra elérhető mikroorganizmusokat. Ezért a fajnév általában
szoros kapcsolatban van a törzs gyakorlati értékével. A nemzetség név pedig a mikroszkópi
látvány alapján adatik. Ebből következik, hogy az első felfedezést követően a taxonomus a
törzs rendszertani helyét a kornak megfelelő vizsgálatok alapján illeszti rendszertani helyére.
Ezt a 30 g/liter glutaminsav termelésére képes törzset a Kiova & Hakko Kogyo Co. Ltd.
hamarosan ipari termelő törzsként hasznosította Corynebacterium glutamicum néven. Mások
Brevibacterum, Microbacterium, illetve Arthrobacter néven izoláltak glutaminsav termelésre
alkalmas egymástól alig megkülönböztethető törzseket. Ezek a Gram-pozitív, nem spórázó,
nem mozgó baktériumok a növekedésükhöz biotint igényelnek, amit a természetes
élőhelyükön kellő mennyiségben megtalálnak. A törzsekre jellemző, hogy az α-ketoglutarát-
dehidrogenáz aktivitásuk nem mutatható ki, illetve elhanyagolhatóan csekély, viszont a
glutamát-dehidrogenáz aktivitásuk feltűnően magas értéket ér el. A törzsek glutamát termelő
képessége az izocitrát-liáz aktivitás genetikai úton történő csökkentésével fokozható.
A glükóz szénforrást a Corynebacterium glutamicum törzs köztes anyagcseréje az
Embden-Meyerhof-Parnas úton, valamint a pentózfoszfát cikluson keresztül, a trikarbonsav
ciklusba táplálja, ahol a szénváz citromsavon, izocitráton keresztül oxidatív dekarboxilezéssel
α-keto-glutársavvá alakul. Ebből a glutarát dehidrogenáz hiány miatt felszaporodó termékből
reduktív aminálással képződik a glutaminsav.
Egy önálló kis ciklusként, a NADP-függő glutamát dehidrogenáz működéséhez a NAPH
szintet az izocitrát-dehidrogenáz ekvivalens mennyiségben szolgáltatja. Az oxidatív
dekarboxilezéskor képződő redukált kofaktort használja fel a szervezet az ammonium ion

66
beépítéséhez. A vegyipar által előállított mikrobiális eredetű nátrium-glutamát évi
mennyisége már meghaladja a 350 ezer tonnát.

GLÜKÓZ Corinebacterium glutamicum tenyészetben a

o
ATP ∆G GLUTAMINSAV BIOSZINTÉZIS VÁZLATA
hexokináz -16 kJ
ADP NADP+ NADPH
G-6-P 6-PG
G6P dehidrogenáz (-NADPH)
G6P-izomeráz +1,6 kJ NADP+
6-PG dehidrogenáz CO2
F-6-P NADPH
(−ATP, −citrát)
ATP Pi
F6P-kináz bisz-foszfatáz Ru-5-P
(+ADP,+AMP) epimeráz |
-14.2 kJ ADP Xu-5--P
F-1,6-P2
aldoláz +23,98 kJ foszfoketoláz Pi

DHAP GAP
+7.6 kJ izomeráz Acetil-P
NAD+ Pi
GAP dehidrogenáz + 6,279 kJ
NADH
1,3-PG
ADP
PG kináz -18,84 kJ
ATP CoA-SH Pi
3-PG
PG mutáz | + 4,43 kJ foszfotranszacetiláz
2-PG
PG enoláz |−−>H2O + 1,8 kJ
P-E-P ADP
-31,39 kJ
PEP- piruvát kináz (+FDP −citrát)
karboxiláz ATP CoA-SH
GDP TPP CO2 NAD+ NADH
Pi CO2 PIRUVÁT −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−>Acetil-S-CoA
PEP CO2 ATP piruvát dehidrogenáz (−ATP)
karboxi piruvát karboxiláz (+acetil-CoA)
CO2 kináz
GTP ADP citrát szintetáz (−ATP)
OXÁLACETÁT
NADH CIT--RÁT
almasav dehidogenáz − 28,046 kJ akonitát hidratáz
NAD+
ALMASAV IZOCITRÁT
malát szintetáz

Acetil-CoA NAD(P)+
izocitrát- (+ADP)
H2O (gyenge) izocitrát liáz dehidrogenáz
fumaráz NAD(P)H
GLIOXILÁT CO2
FUMARÁT SZUKCINÁT α-ketoGLUTARÁT
FADH2 FAD (+ADP) NADPH
szukcinát dehidrogenáz glutamát dehidrogenáz NH3
(-ATP)
NADP+
Net: 3 NADH + ATP (zárojelben) a szabályozó metabolitok L-GLUTAMINSAV

A glutaminsavat termelő szervezetekben az izocitrát dehidrogenáz és a glutaminsav

dehidrogenáz aktivitás lényegesen meghaladja az átlagot. Az enzim működését a felgyülemlő
glutaminsav ugyan gátolja, de ha ennek a terméknek az eltávolítása megoldódik, akkor a
glutaminsav termelés akadálytalanná válik. A ciklus működésének a feltétele a rendszer
anaplerotikus feltöltése. Ezt a piruvát karboxiláz és a malát enzim végzi. A karboxiláz
szerepét igazolja, hogy jelzett szén-dioxid jelenlétében a glutaminsav karboxil csoportja

67
mindig radioaktív. A piruvát karboxiláz egy nagy moltömegű, négy alegységből álló
alloszterikusan szabályozott enzim komplex, amelynek működését az acetil-CoA serkenti. Az
enzim lizin oldalláncához biotin kapcsolódik. Az ATP segítségével aktíválódó szén-dioxid
(foszforsav-szénsav vegyesanhidrid) kapcsolódik a biotin nitrogénatomjához. Ez az aktiv
állapotban levő szénsav származék (karboxibiocitin) ideális karboxilező ágens, amely
piroszőlősavval reagálva oxálecetsavat képez. Az oxálecetsav feldúsulása nem fenyeget, mert
acetil-CoA-val reagálva citráttá alakul, amelyből az igen aktív NADP függő izocitrát
dehidrogenáz működésének eredményeként α-ketoglutarát képződik. Ammonium ion
hiányában azonban a környezetben megjelenik az α−ketoglutarát.
A foszfoenol-piroszőlősav megjelenéséig a reakciósor önfenntartó az energiagazdag
foszfátkötések szempontjából, sőt NADH és NADPH felesleg mutatkozik a G6P- és GAP-
dehidrogenáz valamint a piruvát-dehidrogenáz működésének az eredményeként. A glioxilát
ciklus részvétele az oxálecetsav képződésben glükóz szénforrás használatakor jelentéktelen,
különösen az izocitrát-liáz aktivitásban sérült nemesített törzs esetében. Elvileg 1 mol
glükózból 1 mol glutaminsav nyerhető.

C6H12O6 + NH3 + 1,5 O2 = C5H9O4N + CO2 + 3 H2O

Az ipari technológia kialakításakor az elméletileg leggazdaságosabb ideális állapot

megközelítésére kell törekednünk annak ellenére, hogy ezt az elméleti értéket az ipari
gyakorlatban nem lehet elérni. A 60 %-os átalakítás már elfogadható értéknek tekinthető. A
termelés szintjét valójában a szénforrás koncentrációja és a glutaminsav környezetbe való
kiválasztásának a sebessége határozza meg. A reakcióterméknek a környezetbe való megjelenése
végeredményben természetellenes folyamat, hiszen a köztesanyagcsere értékes termékéről van
szó. Ennek ellenére a glutaminsav kiválasztást a membrán áteresztőképességének a
megváltozása teszi lehetővé. Tween 60 detergens adagolásával például fokozható az aminosav
kiválasztása. A glutaminsavat termelő törzsek csekély szukcinát szükségletét egyrészt a
viszonylag gyenge izocitrát-liáz aktivitás, másrészt az oxálecetsavból induló reduktív folyamatok
elégítik ki. A glioxilsav pedig acetil-CoA felhasználásával a ciklus feltöltését segíti.
A kutatómunka eredményeként kiválasztott természetes biotin igényes mutáns tiszta
tenyészete a kialakított üzemi körülmények között csak fellazult membrán szintézisére képes.
A biotin-szint ugyanis az acetil-CoA karboxiláz aktivitást befolyásolva a membrán minőségét
befolyásoló zsírsav bioszintézisben okoz zavart. A foszfolipidszintézis zavara az L-
glutaminsav spontán kiáramlását segíti elő. Természetes élőhelyén a mutáns biotin igénye
nem jelent élettani problémát, mert ez a vitamin a környezetből felvehető. Ez a felismerés
lehetővé tette a gazdaságos glutaminsav termelést biotinban gazdag olcsó szénforrás
felhasználásával. Ennek felismerése a cukorgyártás melléktermékeként képződő biotinban
gazdag melasz felhasználhatóvá vált az ipar számára.
Az iparban használt termelő törzs limitált biotin jelenlétében (2,5-3 µg/liter) nagy
mennyiségű glutaminsavat választ ki a környezetbe. A baktérium növekedése szempontjából
ez nem előnyös. A termelés szempontjából viszont hasznos a visszafogott növekedés. A
tápközeg biotin tartalmának növelése (5 µg felett) a prolinképződést serkenti. A biotin
mennyiségét tizszeresre emelve glutaminsav helyett a glükózból képződő tejsav és szukcinát
jelenik meg a tenyészlében. Oxigén hiány a redukált kofaktorok feldúsulása miatt a tejsav és
borostyánkősav képződésnek kedvez, túllevegőztetés hatására viszont az ammonium ion
kiűzése miatt a glutaminsav helyett α-ketoglutarát szaporodik fel a tenyészlében. Ipari
méretben szénforrásként 10-20 % szacharóztartalmú táptalajt, melaszt, vagy keményítő
hidrolizátumot használnak. A glutaminsav szintézishez szűkséges ammóniát vagy gázalakban
levegővel elegyítve vagy karbamid formájában adagolják. Az eljárást pH=8 körüli értéken
vezetik. A szénforrás hasznosítás általában meghaladja az 50 %-ot

68
 A termék kinyerése szempontjából ipari körülmények között 10 %-ot meghaladó
glutaminsav szint elérésére törekednek. Ezt a termelési szakaszban adott glükózzal érik el. A
tenyésztés hőmérsékletének emelése rontja az oxigén beoldódását, azaz a tenyészet
oxigénellátását. Általában 28-35 oC-on vezetett 5-6 napos fermentációs lépés végén, a beadott
szénforrás felhasználása után nyert sejtmentes szűrletből történik a glutaminsav elkülönítése.
A táptalajban maradó cukor zavarja a glutaminsav kristályosodását. A sejtmentes szűrletet
hevítve besűrítik, a képződő csapadékot forrón kiszűrik. A nyert éles szűrletet hagyják
lehűlni. 90 oC-ról induló kristályosodáskor apró, ß formának nevezett tűkristályokat nyerünk,
amely sok esetben az anyalúg szennyezését is magába hordozza. 70 oC-on vezetett
kristályosodás körülményei között az α-formát, prizma alakú kristályokat nyerhetünk.
Egy 1975-ben bejelentett US szabadalom (3929575) szerint a Brevibacterium
divaricatum NRRL B-231 törzs inokulum táptalaja literenként 40 g glükózt, 1 g K2HPO4-ot,
0,5 g MgSO4.7 H2O-t, 1 g élesztőkivonatot és 8 g karbamidot tartalmazott A tenyésztés 16
órán keresztül 35 oC-on folyt. A 6 % oltóanyaggal oltott főfermentáció tápközege literenként
121 g glükózt, 5 g ammónium acetátot, 6 g keményítőhidrolizátumot, 1,2 g kálium-foszfátot,
1,2 g kálium szulfátot, 6 g magnézium szulfátot, kevés vasat és mangánt tartalmazott. A
tenyésztés megindításakor 0,65 ml olajsavat adagolnak literenként. A pH-t ammónia
adagolásával 7,8 értéken tartják. A sejtszaporodási szakasz végén – általában a 14-ik órában
– a tenyésztés hőfokát 32 oC-ról 38 oC-ra emelik. A glükóz szint 1 %-ra csökkenésekor kezdik
a glükóz adagolást, ami általában literenként 160 g glükóz adagolását jelenti. A levegőztetést
úgy szabályozzák, hogy az elmenő levegő széndioxid tartalma ne haladja meg a 4.5 térfogat
% értéket. A tenyészlé glutaminsav tartalma általában 35 órás korban éri el a 100 g/liter
értéket.

Glutaminsav teremelés ecetsavból

Nagyipari méretben kémiai úton

előállítható ecetsavból is gazdaságosan
nyerhető glutaminsav.

Ecetsav szénforrásból természetesen a

feltöltést a glioxilát ciklus végzi.

3 HOOC-CH3 + NH3 + 1,5 O2 =

HOOC-CH2-CH2-HCNH2-COOH + CO2
+ 3 H2O

69
 ESSZENCIÁLIS AMINOSAVAK IPARI ELŐÁLLÍTÁSA

A növényi fehérje aminosav összetétele lényegesen különbözik az állati szervezetben

előforduló fehérje aminosav tartalmától. (kukorica: 0,2%, zab:0,5%, árpa: 0,4%, búza: 0,6%,
szója 2,3%, élesztő 3,4%, tejpor:2,5%, húsliszt: 2,6% lizint tartalmaz) Ezért a növényi fehérje
jobb hasznosulása takarmányként elősegíthető megfelelő arányban adott esszenciális
aminosavakkal. A nem teljes értékű növényi fehérjét az állati szervezet csak saját aminosav
igényének megfelelő mértékben, a saját fehérjére jellemző aminosav arányban képes
hasznosítani. A tenyészállatok a számukra fölösleges aminosavakat az anyagcsere
enzimrendszerének segítségével lebontják, átalakítják, a fölös szénvázat pedig elégetik.

A takarmány kukorica 0,11% metionint 0.21% lizint 0,36% treonint tartalmaz

a takarmány búza 0,23% metionint 0,61% lizint 0,50% treonint tartalmaz
a takarmány árpa 0,17% metionint 0,41% lizint 0,36% treonint tartalmaz
a szójaliszt 0,53% metionint 2,31% lizint 1,41% treonint tartalmaz.

Az ideális takarmányban a lizin hiány kielégítése után a treonin és a metionin igény

jelentkezik. A mikrobiológiai eljárással nyerhető aminosavak közül általában a lizin, a
triptofán és a treonin kerül felhasználásra tápanyagkiegészítőként. A világ évi lizintermelése
250 ezer tonna. A treoninból 10 ezer tonna kerül felhasználásra. Az évi triptofán termelés
mindössze 200-300 tonna. Az állattápszerben évenként felhasznált 300 ezer tonna DL
metionin kémiai szintézissel készül, mert a sertések és a szárnyasok racemáza a DL-metionin
100%-os hasznosulását biztosítja. Ha a kukorica lisztet 0.2% lizinnel kiegészítjük, akkor a
fehérje hasznosíthatósági hányadosa 0.85-ről 1.05-re emelkedik, de ha 0.2% lizinen kívül még
0.07% triptofánt is adagolunk akkor a hasznosíthatósági hányados 2.55-re emelkedik. A rizs
fehérjetartalmának kiegészítése 0.2% lizinnel és ugyanennyi treoninnal a hasznosíthatósági
hányadost 0.5-ről 2.61-re növeli. Még a szójaliszt is kiegészítésre szorul. Kémiai szintézissel
nyerhető metioninnal válik teljes értékűvé.
A szabályozási mechanizmus az élő világban azonos elvek szerint működik, de
nemek, fajok sőt törzsek esetében, a szabályozás kivitelezésében eltérések lehetnek. A
szakember éppen ezeket a kivitelben jelentkező különbségeket hasznosítja. Az esszenciális
aminosavak fermentációs úton folyó előállítása nem más, mint a modern mikrobiológiai
alapkutatás eredményeinek gyakorlati alkalmazása; nem kevesebb, mint az aminosav-
bioszintézis szabályozó mechanizmusainak megismerését követő tudatos genetikai munka
eredményeinek ipari gyakorlatban való használata.
A citoplazmában folyó nitrogén anyagcsere didaktikai szempontból anabolikus és
katabolikus folyamatra különíthető. Valójában a két folyamat egymáshoz kötődve, egymást
kiegészítve működik szoros kapcsolatban a szénhidrát anyagcserével. A mikrovilág ide sorolt
anabolikus folyamatai életfontosságúak az egész élővilág fennmaradása szempontjából, mert az
esszenciális aminosavak bioszintézisére, a légköri nitrogén megkötésére, bizonyos vitaminok,
cobalamin származékok előállítására csak a mikrovilág, ezen belül a prokariota flóra képes.
Az aminosavakat aktiváló enzimek csekély mérvű szubsztrát-specifitása csak meghatáro-
zott összetételű aminosav készlet [pool] esetén tudja biztosítani a tRNS állomány helyes
feltöltését. A fölösleges aminosavak eltávolítása tehát létkérdés a mikróba számára. A kon-
centráció viszonyok, az arányok bármilyen okból bekövetkező eltolódása, hibás tRNS feltöltést
és ennek következményeként hibás, működésképtelen fehérjék szintézisét okozhatja. Nem
meglepő tehát, hogy a bioszintézis és a lebontás szabályozottságának bonyolultan, de
eredményesen működő mechanizmusa alakult ki az evolúció során. A gazdaságos életvitel
érdekében a citoplazmában található peptidázok lebontják a működésképtelen fehérjéket,
építőelemeik más irányú felhasználásra kerülhetnek.

70
A fehérjeszintézishez szükséges aminosavak előállítására az úgynevezett vad törzsek általában
képesek. Ez a bioszintézis a citoplazmában, a szénhidrátanyagcsere köztestermékeit hasznosítva,
nem csekély energia befektetéssel illetve anyagfelhasználással szigorúan szabályozott
körülmények között folyik. Az aminosav készlet optimális minőségi és mennyiségi összetételét a
bioszintézis első reakcióját katalizáló enzimre ható visszacsatoló (feed-back) mechanizmus
szabályozza, szükség szerint gátolva vagy serkentve működését. Egy-egy aminosav feldúsulása a
túlélés érdekében a lebontására specifikus enzimrendszerek képződését indukálja.
Esszenciális aminósavak szabályozott szintézise ASZPARTÁT aszparaginsavból (Escherichia coli)
[HomTre] [Liz]
{strukturgén NEVE} ATP
[1] izoenzim képződését [Tre és Ile] gátolja {lysC} aszpartát-kináz
[2] izoenzim képződését [Met] gátolja [1] [2] [3]
[3] izoenzim képződését [Liz] gátolja ADP
[1a] izoenzim képződését [Tre] gátolja ASZPARTIL FOSZFÁT
[2a] izoenzim képződését [Met] gátolja
NADPH
feed-back gátlás jelzése: |Tre] |Liz] |Hom] |Ile] |Val] |Leu] {asd} aszpartátfélaldehid-dehidrogenáz
NADP+

ASZPARTÁT-ß-FÉLALDEHID
= |Liz] [Tre] [Met] NADH

{dapA} dihidrodipikolinát-szintetáz {thrA} {hom} homoszerin-dehidrogenáz

piruvát
[1a]- [2a] NAD+
2,3-DIHIDROXI-DIPIKOLINÁT HOMOSZERIN
|Tre]=
NADPH ATP
{dapB} dehidrogenáz {thrB} homoszerin-kináz
NADP+ ADP = |Met]
∆ -PIPERIDIN-2,6-DIKARBOXILÁT
1
HOMOSZERIN-FOSZFÁT szukcinilCoA

szukcinil-CoA H2O aciltranszferáz

{dapC} acil transzferáz {thrC}treonin-szintetáz CoA-SH
Pi
N-SZUKCINIL- TREONIN O-SZUKCINIL
2-AMINO-6-ΚΕΤΟ- |Ile] = HOMOSZERIN
L-PIMELÁT { ilvA} treonin-dezamináz
piruvát NH3
α-KETOIZOVALERÁT α−KETOBUTIRÁT cisztein
Glutamát =|Leu] /\
{dapD}transzamináz ipm.szintáz [Val]= { ilvBN} AHS szintetáz cisztation γ-szintetáz
α-ketoglutarát acetil-CoA <-------piruvát--------->
szukcinát
Ν-SZUKCINIL-L,L-2,6- α-IZOPROPIL- α-ACETO- CΟ2 α-ACETO-
DIAMINOPIMELÁT MALÁT LAKTÁT α-HIDROXI- CISZTATION
BUTIRÁT
(dapE)deszukciniláz NADPH NH3
ipm.izomeráz {ilvC} reduktáz,mutáz cisztation ß-liáz
+
szukcinát NADP piruvát
L,L -2,6- ß-IZOPROPIL- α,β−DIHIDROXI- α,β−DIHIDROXI- HOMOCISZTEIN
DIAMINO- MALÁT IZOVALERÁT ß-METILVALERÁT
PIMELÁT NAD+
{ilvD}dihidroxisav-dehidráz N5-metil-FH4
{dapF} epimeráz ipm.dehidrogenáz metil-transzferáz
H2O FH4
NADH
mezo-2,6- α−KETO- α−KETO α−KETO-ß-
DIAMINO- IZOKAPROÁT IZOVALERÁT METILVALERÁT
PIMELÁT
glutamát glutamát
( lysA}dekarboxiláz transzamináz-B {ilvE} transzamináz-B
CO2 α-ketoglutarát α-ketoglutarát

LIZIN LEUCIN VALIN IZOLEUCIN METIONIN

Az Escherichia coli-ban kialakult mechanizmus aszparaginsavból indulva nem csak a lizin

finoman szabályozott képződését, de más esszenciális aminosavak treonin, metionin és az
elágazó szénláncú valin, izoleucin és leucin bioszintézisét katalizálja. Az összetett rendszer

71
gazdaságos működtetését egyrészt izoenzimek működése biztosítja, másrészt a kritikus elágazási
pontokon a végteremék okozta visszacsatolás (feed-back mechanizmus) hatása érvényesül.
Megjegyzendő, hogy a diaminosav a peptidoglükán sejtfal felépítés nélkülözhetetlen eleme A
sejtfal felépítés bifunkcionális építőelemként szerepel az L-lizin, az L,L-diaminopimelinsav
illetve a mezo-diaminopimelinsav.
Az igényeknek megfelelő mértékben oxálecetsavból képződő aszparaginsav
foszforilezését első lépésként három represszálható izoenzim végzi. Az izoenzimek képződését
szelektíven az összekapcsolódó bioszintézis út végtermékei (az egyiket lizin, a másikat metionin,
a harmadikat pedig az izoleucin) represszálják. Ez indokolt, mert az aszpartilfoszfátból
(aszparaginsav-foszforsav vegyesanhidrid) NADPH igényes reduktív hidrolízissel képződő
aszparaginsav-ß-aldehid valójában olyan közös köztes termék, amely kiindulási anyag az említett
aminosavak bioszintéziséhez.
A szabályozás enzimszinten is érvényesül. A lizinnel represszálható izoenzim működését
a lizin - mint végtermék - alloszterikusan is gátolja. Az izoleucinnal és treoninnal represszálható
izoenzim működését pedig két végtermék, a treonin és a homoszerin befolyásolja. A metioninnal
represszálható izoenzim biztosítja a rendszer működéséhez szükséges aszpartát-ß-félaldehid
alapszintet.
Az aszpartát β-félaldehid piruváttal reagálva dihidrodipikolinát-szintetáz (dapA)
jelenlétében 2,3-dihidrodipikolináttá kondenzálódik. A kondenzációt végző enzimnek a
specifikus aktivitása a végtermék képződését meghatározza, működését a lizin felszaporodása
alloszterikusan szabályozza. Az aszparaginsav-ß-félaldehidből két NADPH függő homoszerin-
dehidrogenáz izoenzim végzi a többi esszenciális aminosav képződéséhez szükséges homoszerin
szintézisét. Az egyik képződését metionin represszálja, a másik dehidrogenáz képződését pedig
a treonin és az izoleucin felszaporodása befolyásolja. Ez utóbbi működését a treonin, mint
végtermék alloszterikusan is gátolja. A homoszerinből indul a cisztationon és homociszteinen
keresztül vezető metionin szintézis. Az első enzim aktivitását a homoszerinszukcinil-
transzferáz működését a metionin, mint végtermék alloszterikusan gátolja. A homoszerinből
induló treonin szintézis első enzimének, a homoszerin-kináznak a működését
természetszerűleg a treonin szabályozza alloszterikusan. Az izoleucin a treoninból induló
bioszintézis első enzimének a treonin dezamináznak a működését gátolja alloszterikusan,
ugyanakkor represszálni képes a bioszintézisben résztvevő enzimek képződését. Az izoleucin
szintézisút második enzimének, az acetohidroxisav szintetáznak a működését a valin gátolja
alloszterikusan, mivel a valin szintézis szempontjából ez szerepel első enzimként. Az enzim
közös használata miatt az ebből adódó veszélyt úgy oldja fel a rendszer, hogy a treonin
dezamináz által szolgáltatott α -ketovajsav előnyt élvez a piruváttal összehasonlítva a
kondenzációt katalizáló enzim aktív felületén. A leucin szintézishez a valin szintézis
köztesterméke az α-ketoizovaleriánsav szolgál kiindulásul. A négy reakciólépést igénylő
bioszintézis első enzimének az acetil-CoA-t igénylő izopropilmalát szintetáznak a működését
a leucin gátolja alloszterikusan.
Az elágazó szénláncú aminosavak bioszintézisének bonyolult szabályozottsága külön
figyelmet érdemel a közösen használt enzimekre való tekintettel. A zavartalan
fehérjeszintézishez ugyanis a három aminosav optimális aránya szükséges. Erre való
tekintettel bármelyik aminosav feldúsulása, vagy a környezetben való megjelenése esetén
indukálódik a lebontást végző enzimrendszer, amely azután kiegyenlíti az eltérést.
A körülményektől függő mértékben a mikroba a bioszintézisben érdekelt enzimek
mennyiségét a represszor eltávolításával - azaz a struktúrgének átírásának engedélyezésével - a
szükségletnek megfelelő mértékre növelheti (derepresszió). Mivel a fehérjeszintézis anyag és
energiaigényes folyamat, a gazdaságos életvitelt szolgálja a szabályozást finomító második
rendszer (attenuator) működése, amely végül is a feltöltött tRNS mennyiségének függvényében
engedélyezi a bioszintézisben érdekelt gének átírását.

72
 AZ AROMÁS AMINOSAVBIOSZINTÉZIS SZABÁLYOZOTTSÁGA
(L-triptofán előállítása )

A reakciósor piacképes termékének tekinthető L-triptofán bioszintézisének és a szintézisút

szabályozottságának felderítése a XX-ik század ötvenes éveiben folyó alapkutató munka
eredménye. Az aromás aminosavak szintézisét végző enzimrendszer a három aminosav
hiányában nagy mennyiségben képződik. Csak az általuk termelt aminosavak felszaporodása
csökkenti ezen enzimek képződését. A fölös mennyiségben jelenlevő aminosav, esetünkben a
triptofán a represszor fehérjéhez, az pedig a triptofán operon promoter régiójához kötődve
megakadályozza az RNS-polimeráz működését. Ezzel a triptofán operonban kodolt enzimek
szintézisét represszálja.
A mikrobiális bioszintézis a pentóz-foszfát ciklusból leágazva, foszfo-2-keto-3-dezoxi-
heptonát-aldoláz által katalizált reakcióval indul. A rendszer enzimszinten és génszinten
szabályozva izo-enzimek felhasználásával teljesíti feladatát. A bioszintézis köztes termékeinek a
képződése is feed-back szabályozás alatt áll, mert nem csak az esszenciális aromás aminosavak
szintézise, de egyes vitaminok (PAB, nikotinsav, etc.) képződése is innen ágazik el.
A szabályozás finomítása céljával Escherichia coli esetében a foszfoenol-piroszőlősav és az
eritróz-4-foszfát kondenzációját három izoenzim (foszfo-2-keto-3-dezoxi-heptonát aldoláz)
katalizálja. Mindegyik aktivitását alloszterikusan valamelyik végtermék és egy köztes-termék
befolyásolja. Az egyik fenilalaninra és prefénsavra, a másik triptofánra és korizminsavra
érzékeny, a harmadik működését pedig tirozin és prefénsav gátolja.

Az aromás bioszintézisút első

végtermékek által szabályozott
izoenzimek által katalizált
reakciója (Escherichia coli)
a 3-DEZOXI-D-ARABINO-
HEPTULONSAV-7-FOSZFÁT
képződését segíti

A második polivalensen szabályozott alloszterikus enzim a shikiminsav-dehidrogenáz,

amelynek működését alloszterikusan négy ligandum, a tirozin, a fenilalanin, a korizminsav és a
prefénsav befolyásolja.

Az aromás
bioszintézisúton a
shikiminsav
képződését katalizáló,
shikimát
dehidrogenáz

végtermék álzal történő szabályozása

73
Az aromás aminosavak pentózfoszfát ciklusból leágazó, szabályozott bioszintézisét katalizáló
reakciósort bemutató vázlaton jól követhető a teljes folyamat

FOSZFO-ENOLPIRUVÁT + ERITRÓZ-4-FOSZFÁT

foszfo-2-keto-3-dezoxiheptonát-aldoláz [–Phe] [–Tir ] [– Trp ]

[–pref] [–kor] –
[ pref]

3-DEZOXI-D-ARABINO-HEPTULONSAV-7-FOSZFÁT
dehidrokvinát szintetáz Pi
5-DEHIDROKVINÁT
5-dehidrokvinát-dehidratáz H2O
3-DEHIDROSHIKIMINSAV
NADPH
shikimát dehidrogenáz [–Phe][–Tir][–pref][–kor]
NADP+
D-SHIKIMINSAV
ATP
shikimát-kináz
ADP
SHIKIMINSAV –FOSZFÁT
piruvil-shikimát-foszfát szintetáz P-E-P
5-ENOLPIRUVIL--SHIKIMINSAV-3-FOSZFÁT
korizmát-szintetáz Pi
KORIZMINSAV

Glutamin
____
korizmát mutáz antranilát szintetáz trpE gén
Glutamát [–Trp]
Piruvát
[–pref] }asszociátum
ANTRANILÁT
asszociátum{ P-R-PP
}asszociátum antranilát-foszforibozil-transzferáz___ trpD gén

PREFENSAV PP
[–Phe] N-(RIBOZIL-5'-FOSZFÁT-ANTRANILÁT
NAD+ [–Tir] foszforibozil-antranilát izomeráz
H2O ENOL-1-o-KARBOXIFENILAMINO-1-
pref-dehidratáz pref-dehidrogenáz -DEZOXIRIBULÓZ-FOSZFÁT
CO2 NADH H2O
indol-3-glicerin-foszfát szintetáz trpC gén
CO2 CO2
INDOL-3-GLICERIN-FOSZFÁT
FENIL-PIRUVÁT p-HO-FENIL-PIRUVÁT L-SZERIN
<<<<<<Glutamát>>>> triptofán szintetáz (tetramer)
transzamináz GAP 2 α alegység trpA gén
>> α-ketoglutarát
α <<< 1 β2 alegység trpB gén

L-FENILALANIN L-TIROZIN L-TRIPTOFÁN

74
 A szerkezeti képlet feltüntetése a tanulmányozó számára segítheti a folyamat követését

PEP + eritrózfoszfát Deox.arabino.hept.7-P Dehidrokvinát

COOH O=C-H DAHP CH2–OPO3 Dehidrokvinát HO COOH
| | szintetáz | szintetáz \/
C–OPO3 H-C-OH H-C-OH O COOH H2C—C––CH2
|| | | / | |
CH2 H-C-OH PI H-C OH CH O=CH–CH–CH–OH
+ | | | NAD+ NADH |
CH2-OPO3 CH—CH2 OH
[Phe–, tir–, triptofán–] Dehidrokvinát
(végtermék szabályozás) -dehidráz
- H2O
Enolpiruvinilsikimátszintetáz- 3-P Sikimát-kináz ATP
COOH COOH COOH COOH
| | | Shiki- |
HC==C––CH PI PEP HC==C––CH HC==C––CH mát HC==C––CH
| | COOH | | | | Dehid | |
O3PO–CH–CH–CH–O–C O3PO–CH–CH–CH–OH HO–CH–CH–CH–OH roge- O=CH–CH–CH–OH
| || | | náz |
OH CH2 OH OH OH
Korizmát-szintetáz pI

KORIZMÁT ANTRANILÁT FOSZFORIBOZILANTRANILÁT

COOH Antranil szintetáz COOH Antranilát- HOOC OH OH
| Gln Glu OH | foszforibozil | | |
HC–C==CH CH2 HC–C==C—NH2 transzferáz HC=CH–C CH——CH
|| | || || | | || | |
HC–CH–CH–O–C–COOH HC–CH=CH HC=CH–C–NH–CH–O–CH
| H3C–CO–COOH PRPP PPI |
OH [Phe–] [Tir–] CH2OPO3
[Tri–] (végtermékgátló)
Korizmát-mutáz Foszforibozil-antranilát-izomeráz
HOOC CH2–CO–COOH HOOC OH OH OH
\/ | | | |
HC—C— CH Prefenát-dehidrogenáz HC=CH–C C—–CH—CH
|| || | || || |
HC—CH–CH HC=CH–C–NH– CH CH2OPO3
|
OH NAD+
Prefenát-dehidráz Indolglicerofoszfát szintetáz
H2O NADH
CO
CO2 2 CO2 H2O
HC-CH=C-CH2-CO-COOH HC–CH=C–CH2–CO–COOH OH OH
|| | || | | |
HC–CH=CH C–CH=CH HC–CH–C——–C—–CH—CH
| | || || |
OH HC=CH–C–NH–CH CH2OPO3
Fenilalanintranszamináz Tirozin-transzamináz
Glutamát Glutamát triptofán-
α-ketoglutarát
α α-ketoglutarát
α szintetáz
NH2
|
HOCH2–CH-COOH
HC-CH=C-CH2-CO-COOH HC–CH=C–CH2–CO–COOH HC=O SZERIN
|| | || | |
HC–CH=CH C–CH=CH H-C-OH
| |
L-FENILALANIN OH L-TIROZIN H2-C-OPO3

GAP L-TRIPTOFÁNNH2
|
HC–CH–C——–C—–CH2—CH
| || || |
HC=CH–C–NH–CH COOH

75
Az összefoglaló vázlaton feltüntetett, és zavartalanul folyó bioszintézisút korizminsavnál
elágazik. A két arómás aminosav, a fenilalanin és a tirozin szintézise irányába a korizmát
szintetáz termékéből a prefénsav képződést két korizmát-mutáz izoenzim katalizálja. Az egyik
izoenzim fenilalaninra, a másik tirozinra érzékeny. Mindegyik asszociátumot képez a
megfelelő aminosav szintézisét katalizáló következő enzimmel: a fenilalaninra érzékeny
izoenzim a prefenát-dehidratázzal, a tirozinra érzékeny pedig a prefenát-dehidrogenázzal
alkot komplexet. Az asszociátumok működését triptofán serkenti. Ez a hatás a két
aminosavnak a fehérjeszintézis szempontjából kedvező arányban való képződését segíti.

Phe–
Tir–

Fenilalanin és tirozin
bioszintézis
szabályozása
korizmáttól a
ketosavképzodésig

A fenilalanin és a tirozin szintézis utolsó lépését azonos enzim, egy-egy glitaminsavval

működő transzamináz katalizálja.

76
A triptofán finoman szabályozott képződése két enzimből álló komplex, az antranilát
szintetáz és az antranilát-foiszfo-ribozil-transzferáz együttműködésével indul. A két
alegységből álló antranilát szintetáz, szoros asszociátumot képez az ugyancsak két
alegységből álló antranilát-foszforibozil-transzferáz-zal. Az antranilsav szintézishez
nélkülözhetetlen glutaminkötőhely ugyanis csak
az ép asszociátumon alakul ki. A komplex
azonban a képződött végtermék (triptofán)
jelenlétében szétesik.

Most kap feladatot a foszfo-ribozil-

antranilát izomeráz, amely a foszforibozil-
antranilsavból kialakítja az enol-1-o-
karboxifenil-amino-1-deoxi-ribulóz foszfát
szerkezetet.

Ez utóbbit CO2 és víz eltávolításával

az indol-3-glicerol-foszfát szintetáz
indol-glicerol-foszfáttá alakítja.
Amint látható létrejött az indolváz.

77
Az utolsó enzimkatalizálta történést a négy alegységből álló triptofán-szintetáz katalizálja,
amely az indolt a szerin harmadik szénatomjához kapcsolja egy glicerinaldehid-3-foszfát
felszabadításával.

Az indol-3-glicerol-foszfátból két gén terméke

a trpA gén kodolta 2 α alegység és
a trpB kodolta β2 (dimer)
alegységekből álló triptofán szintetáz
szerinre cseréli a glicerinaldehid 3-foszfátot
és így létre hozza azt L-triptofánt

A képződött termék érzékenysége a ß-

szénatomhoz kapcsolódó delokalizált
elektronszerkezetű indol jelenlétével
magyarázható

xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx

78
Yanofsky és munkatársai a triptofán szintézisért felelős enzimek képződésének szabályozási
mechanizmusát molekuláris biológiai szinten vizsgálva egy olyan új általános jellegű
felismerésre jutottak, amely az aminosavval töltött tRNS addig csak sejtett szabályozó
szerepének módjára magyarázatot adott. A triptofán szintetáz mRNS információ előtt egy 160
bázis terjedelmű szabályozási feladatot ellátó attenuátor régiónak elnevezett szakasz található.
Ennek a szakasznak az a feladata, hogy a promoter régiónak a represszor fehérje távoztával
bekövetkező felszabadulása után meginduló RNS-polimeráz működését megszakítsa az
esetben, ha a triptofánnal töltött tRNS a fehérjeszintézis szempontjából még kielégítő
koncentrációban jelen van a rendszerben.
A mRNS esetében a kódolt fehérjére vonatkozó információ előtt minden esetben a
riboszómához kötődést biztosító szakasz található. A fehérje szintézise az eubaktériumoknál
AUG kodonnal (formilmetioninnal) indul. A DNS-szálon akár egy génen belül is egyidejűleg
több RNS-polimeráz is működhet, sőt az enzimről folyamatosan letekeredve képződő mRNS-
fonalakon körülbelül 40 bázisnyi távolságban már megindul a fehérjeszintézis. Ebből az
következik, hogy meglehetősen kis területen egyidejűleg.változatos biokémiai reakciók (RNS ill.
fehérje-szintézis) tömege folyik. Ezt a lehetőséget használja ki az élő szervezet az aminoacilezett
tRNS szabályozó szerepének a megjelenítésére. Ennek keretében a promoter régión kötődő
RNS-polimeráz, az operátorhoz kötődő represszor fehérje távoztával elindulhat a struktúrgén
irányába. Az RNS-polimeráz működése azonban megszakad akkor, ha a megfelelő aminoacil-
tRNS a fehérjeszintézis szempontjából szükséges koncentrációban jelen van a mikrobasejtben.
Az első vázlat a triptofán represszáló hatását ábrázolja. A triptofánnal terhelt represszor
az operátor régióhoz kötődve akadályozza az RNSpolimeráz működését.
______________________________________________________________________
I promoter I operátor I attenuátor I trpE gén I trpD gén I trpC gén I trpB gén I trpA gén I
|----------------represszor --------------|-------------|-------------|------------| ------------|------------|-
RNS > triptofán
polimeráz (korepresszor)

A második vázlat a derepresszió jelenségét ábrázolja. Triptofán hiányában a korepresszor

(esetünkben triptofán) nélküli represszor fehérje lemozdul az operátorról. Ennek következtében
elindulhat a transzlációs folyamat. Az RNS polimeráz elindul a struktúrgének felé. Közbe
__________________________________________________________________________
I promoter I operátor I attenuátor I trpE gén I trpD gén I trpC gén I trpB gén I trpA gén I
-|----------------|------------|--------------|------------ |-------------|------------|------------|-------------|--
RNS
polimeráz ---->
represszor truktúrgének: E = antranilát-szintetáz
D = antranilát-transzferáz
C = IGP-transzferáz
B = triptofán-szintetáz B
A = triptofán-szintetáz A
találja azonban vezérpeptid információ tartalmát, aminek átírása után folytatja tevékenységét a
struktúrgének irányába, Az egyre növekedő RNS-hez tapadva a riboszóma, a szükséges
acilezett tRNS jelenlétében megkezdi a vezérpeptid szintézisét. Siker esetén a képződő RNS
szálon történő komplememt képzés az RNS-polimeráz eltávolítását okozó termináló hurok
képződését okozza. — trip-tRNS hiányában a vezérpeptid szintézise leáll, az RNS-polimeráz
pedig zavartalanul folytathatja útját a struktúrgének irányába.

79
A triptofán operon átírását befolyásoló attenuátor régió szabályozó szerepe

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys

pppAAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAA
riboszómakötő szakasz G G
G l
U y
AUAAGAGAUUAAACAAGUUUUUUUU - ACCCAUAGACUAACGAAAUGCGUA - U T
A C-G C-G r
C G-C C-G p
A G-C A-U T
A G-C C-G r
U C-G U–U G p
G G-C A C A
C G-C U G r
A A U G-C g
A U–A–A U-A T
A ez a komplementer bázisok által stabilizált termináló G-C h
C hurok leszorítja a σ faktor nélküli RNS-polimerázt a templátról A-U r
A C U S
CAAAAACCGACUCUCUCGAACUGCUG...... G-C e
ezért a triptofán-szintetáz struktúrfehérje génjei nem íródnak át G-C r
G U
C G
A–A–A

Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Lys Gly

pppAAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGU
riboszómakötő szakasz U
ACGAAAUGCGU G
A A G
UCAGA - UUCACC U
U-A G
Trp-tRNS hiány miatt a vezérpeptid képződése az UGG kódnál A-U G
leáll, a polimeráz a komplementer kötések átrendeződése miatt C-G C
zavartalanul tovább haladva megkezdheti a triptofán-szintetáz C U G
struktúrgén átírását C-G C
A A A
G-C C
C-G U
C-G U
C-G C
AAUAAGAGAUUAAACAAGUUUUUUUUCGGGCGAGUAAUCCG – C–A–1–A–A–G–U–C
C
A Met Gln Thr ....
AAUGCAAACACAAAAACCGACUCUCUCGAACUGCUG......

Elkezdődik a struktúrgének információja előtt elhelyezkedő attenuátor szakaszon kódolt rövid

vezérfehérje szintézise. A vezérpeptid információja a promoter régiót követő rövid ribo-
szómakötő szakasz után, a szokásos AUG kodonnal kezdődik és UGA kóddal végződik. Az
RNS-polimeráz által szintetizált mRNS-láncon, amelynek szekvenciája több komplementer
szakaszt is tartalmaz, a polimerázt 40 bázisnyira követve folyik a vezérfehérje képződése. A két
szintézis (mRNS-képződés és peptidszintézis) közel azonos sebességgel folyik. A vezérpeptidtől
30 bázisnyi távolságra, jóval a struktúrgéneket iniciáló kodon elött található az a termináló
hurok, amely képes lenyomni a σ-faktor nélküli, lazán kötődő polimerázt a templátjáról. A
termináló hurok azonban, csak az esetben alakulhat ki, ha a vezérpeptid szintézise zavartalanul
megtörténik. Az RNS-polimeráz tehát leválik az operonról és σ-faktorral kiegészülve újra kezdi
működését a promoter szakasznál. Az anyagveszteség csekély, mert a jelenlevő proteázok a
funkció nélküli vezérpeptidet lebontják, és az aminosavak visszakerülnek a bioszintetikus
folyamatba. Triptofán esetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, de

80
szekvenciájában közvetlenül egymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos arányban
különösen nagy gyakoriságot jelent, mivel a prokariótákban általában 100 aminosavra jut egy
triptofán.
A vezérfehérje gén a triptofán szintézist katalizáló struktúr gének előtt található

Ha azonban triptofánnal töltött tRNS hiányában megakad a vezérfehérje képződése, akkor a

vezérszekvencia bázissorrendjében levő komplementer szakaszok által létrehívott új
párkapcsolat kialakulása (73-84 és 108-119 bázisok között) nem engedi kialakulni a termináló
hurkot. Ennek következményeként a polimeráz a kritikus szakaszon tovább haladhat a
struktúrgének AUG kezdő
kodonja felé, és hamarosan
megkezdi, ez esetben az
aromás aminosav képződését
katalizáló enzimek, tehát a
triptofán-operonba szerve-
ződött struktúrgének átírását.
Elkezdődik az aromas
aminosav bioszintézisét
végző enzimek képződését
irányitó mRNS szintézise.
///Az ábra a strukturgének
elhelyezkedését mutatja a bázispárok számának a feltüntetésével, az mRNS képződését befejező
termináló hurok szerkezetével kiegészítve.(Lásd az előző ábrán a 4 jelű hurkot.)/////
Amikor a végtermék által (feed-back) szabályozott, triptofánt szintetizáló rendszer aktív
tevékenysége a vezérpeptid szintéziséhez elegendő triptofanil-tRNS szintet állít be, a struktúr-
gének további átírása megszűnik.

81
Az acilezett trptRNS jelenlétében a
termináló (4) hurok leválasztja az
átírást végző enzimkomplexet a
képződő RNS molekuláról, és ezzel
befejeződik az RNS-polimeráz
tevékenysége
Triptofán hiány esetében a
korepresszor (esetünkben triptofán)
nélküli represszor fehérje lemozdul az
operátorról. Így elindulhat az RNS-
polimeráz a struktúrgének felé.
Hamarosan megindul a transzlációs
folyamat. Elkezdődik a struktúrgének
információja előtt elhelyezkedő
attenuátor szakaszon kódolt rövid
vezérfehérje szintézise. A vezérpeptid információja a promoter régiót követő rövid ribo-
szómakötő szakasz után, a szokásos AUG kodonnal kezdődik és UGA koddal végződik. Az
RNS-polimeráz által szintetizált mRNS- láncon, amelynek szekvenciája több komplementer
szakaszt is tartalmaz, a polimerázt 40 bázisnyira követve folyik a vezérfehérje képződése. A két
szintézis (a mRNS- és a peptidszintézis) közel azonos sebességgel folyik. A vezérpeptidtől 30
bázis távolságra, jóval a struktúrgéneket iniciáló kodon előtt található az a termináló hurok,
amely képes lenyomni a σ-faktor nélküli, lazán kötődő polimerázt a templátjáról. A termináló
hurok azonban, csak az esetben alakulhat ki, ha a vezérpeptid szintézise zavartalanul megtör-
ténik. Az RNS-polimeráz tehát leválik az operonról és σ-faktorral kiegészülve újra kezdi
működését a promoter szakasznál. Az anyagveszteség csekély, mert a jelenlevő proteázok a
funkció nélküli vezérpeptidet lebontják, és az aminosavak visszakerülnek a bioszintetikus
folyamatba. Triptofán esetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, de
szekvenciájában közvetlenül egymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos arányban
különösen nagy gyakoriságot jelent, mivel a prokariontákban általában 100 aminosavra esik egy
triptofán.
Ha azonban triptofánnal
töltött tRNS hiányában megakad a
vezérfehérje képződése, akkor a
vezérszekvencia bázissorrendjében
levő komplementer szakaszok által
létrejött új párkapcsolat nem engedi
kialakulni a termináló hurkot. Ennek
következményeként a polimeráz a
kritikus szakaszon tovább haladhat a
struktúrgének kezdő kodonja felé.
Hamarosan megkezdi az illetékes
aminosav képződését katalizáló
enzimek, ez esetben a triptofán-
operonban lltező struktúrgének
átírását, a mRNS szintézisét. —
Amikor a végtermék által (feed-
back) szabályozott, triptofánt szintetizáló rendszer aktív tevékenysége a vezérpeptid szin-
téziséhez elegendő triptofanil-tRNS szintet állít be, a struktúrgének további átírása megszűnik.

82
 A σ-faktor nélküli RNS-polimeráz lemozdul a DNS-ről a
termináló hurok hatására

Hasonló szabályozó rendszer irányítja a többi aminosav szintézisét katalizáló enzimek

struktúrgénjeinek átírását is. Példaként vizsgáljuk az aminosavbioszintézist végző enzimek
struktúrgénjeinek átírását befolyásoló úgynevezett VEZÉR-PEPTIDEK szerkezetét:
Triptofán szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezete
Met-Lys-Ala- Ile-Phe-Val-Leu--Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser
Hisztidin szintézis enzimeinek képződését akadályozó_vezérpeptid szerkezete
Met-Thr-Arg-Val-Gln-Phe-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Pro-Asp
Fenilalanin szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezete
Met-Lys-His-Ile-Pro-Phe-Phe-Phe-Ala-Phe-Phe-Phe-Thr-Phe-Pro
Treonin és Izoleucuin szintézis enzimeinek képződését akadályozó vezérpeptid szerkezete
Met-Lys-Arg-Ile-Ser-Thr-Thr-Ile-Thr-Thr-Thr-Ile-Thr-Ile-Thr-Thr-Gly-Asn-Gly-Ala-Gly
*(A vastagítás jelzi a szabályozást végző aminósavval acilezett tRNS ügydöntő szerepét)
A vezérpeptidek kémiai szerkezetében az illetékes aminosav több példányban szerepel.
Triptofán esetében ez a vezérpeptid mindössze 14 aminosavból épül fel, de szekvenciájában
közvetlenül egymás után két triptofánt tartalmaz, amely százalékos arányban különösen nagy
gyakoriságot jelent, mivel a prokariótákban általában 100 aminosavra esik egy triptofán.
Hisztidin esetében 7 szomszédos kodon igényel feltöltött hisztidil-tRNS-t.
A fenilalanin-szintézis enzimeinek képződését szabályozó vezérfehérje 7 fenilalanil-tRNS
jelenlétét igényli az RNS-polimeráz leválasztásához.

Figyelemre méltó a treonin és az izoleucin struktúrgénjeinek átírását szabályozó vezérpeptid

szerkezete, amely alternáltan 8 treonin és 4 izoleucinal feltöltött tRNS-t igényel. Ez esetben
tehát a treonin és az izoleucin szintézist katalizáló enzimek génjeinek átírását csak az izolucinnal,
illetve treoninnal töltött tRNS jelenléte akadályozhatja ha mindkét aminosavval feltöltött tRNS
jelen van a rendszerben.

83
Az ismertetett átírás mechanizmusát több antibiotikum képes gátolni. Az ansaláncú rifamicin-
származék, például rifampicin az RNS polimeráz ß-láncához kötődve akadályozza az RNS-
szintézis megindulását. A citosztatikus hatású antibiotikumok közé sorolt actinomycin-D a DNS-
bázispárok közé ékelődve akadályozza a kettős spirál fellazulását, a két szál szétválását,
végeredményben az RNS szintézisét. Megjegyzendő, hogy ez az antibiotikum a DNS-
replikációt csak nagyobb koncentrációban alkalmazva képes gátolni, mivel a helikáz nagyobb
energiával lazítja fel a dupla spirál bázispárjait, mint az RNS-polimeráz. Mindezt felül
szabályozza a szuperfeltekeredett állapot lazítását végző DNS-giráz működése, amit a
novobiocin antibiotikum, illetve a magnézium-kötő kinolon származék, a széles spektrumu
ciprofloxacin befolyásol.

Az optimális aminosav szint fenntartására szolgáló komplex rendszer elemei az élő sejtben:
1, a környezetből történő aminosav felvétel transzportmechanizmusa,
2, attenuáltan szabályozott, mRNS képződés által befolyásolt enzimállomány,
3, alloszterikusan ellenőrzött bioszintézis (feed-back),
4, katabolikusan derepresszálható lebontó rendszer (C és N hiány).

A bioszintézisben nélkülözhetetlen enzimek sérülése vagy elvesztése a mikroba aminosav

igényeként jelentkezik. Ezek a hiánymutánsok (auxotróf törzsek) jól használhatók a mikrobiális
genetikai munkákban. A szabályozási mechanizmust érintő genetikai beavatkozással, bizonyos
enzimek működésének akadályozásával vagy éppen bizonyos utak serkentésével egy-egy
aminosav előállítására gazdaságosan használható mutánsok nyerhetők. Ilyen genetikailag hibás
törzsek képességeit glutaminsav, lizin, fenilalanin, triptofán, treonin, izoleucin ipari előállítására
hasznosítják.

84
 ELJÁRÁSOK TRIPTOFÁN ELŐÁLLÍTÁSÁRA
Triptofán szintézis L-szerinből és indolból.
L-szerinből és indolból a triptofán szintetáz aktivitást hasznosítva gazdaságosan lehet nyerni
ezt az esszenciális aminosavat. A triptofán-szintetáz (EC. 4.2.1.20) minden prototróf
mikroorganizmusban előfordul a triptofán bioszintézist végző reakciósor utolsó tagjaként. Az
Escherichia coli-ban ez az enzim 140.000 móltömegű piridoxálfoszfát kofaktorral működő
tetramer. Két α alegységből és egy β2 dimerből épül fel. Az érintetlen tetramer komplex in
vivo az indol-3-glicerol-foszfátból és az L-szerinből L-triptofánt és glicerinaldehid-3-foszfátot
alakít. A tetramerből könnyen kiszakadó α alegység az indol-3-glicerol-foszfát szétesését
katalizálja indolra és glicerinaldehid-3-foszfátra. A β2dimer az indolból és L szerinből történő
triptofán szintézist katalizálja, de elősegíti a szerin bomlását piruvátra és ammóniára. A
tetramer enzim előállítására alkalmas törzset a triptofánigényes mutánsok közül célszerű
kiválasztani. Triptofán-limitáció körülményei között növekedő tenyészetben várható a
bioszintézisben érdekelt enzimrendszer derepressziója. Miles Escherichia coli-B-ből
előállított mutánsában az oldható fehérje 16 %-át tette ki ez a fehérje. A sejtekben képződött
enzim nem csak triptofán előállítására, de különböző triptofán analógok szintézisére is
sikerrel használható. Az enzim stabilitása és aktivitása nagyobb, mint a tisztított formában
kinyert β2dimeré. Növeli az
enzim aktivitását, piridoxál-5-
foszfát adagolása a
reakcióelegybe. A mellékelt
ábrán jól követhető a P-5-P
szerepe a kvinoidális köztes
tereméken keresztül vezető
reakcióban.
A triptofán szintetázt nagy
mértékben termelő, triptofán
előállítására alkalmas törzs
olyan fenilalanin– és tirozin–
igényes mutáns, amely
5-metiltriptofán,
6-fluor triptofán,
4-metil-triptofán,
p-fluor-fenilalanin,
p-amino-fenilalanin
triptofán-hidroxamát
jelenlétében is képes nöni,
tehát ezekre rezisztens.
Az enzimkomplex az elölt
sejtbe glutárdialdehiddel
rögzíthető és bioreaktorban
két hét felezési idővel
használható triptofán
előállítására.

85
A termelő törzs kiválasztásakor fontos szempont a szerin szintézis színvonala. Szénforrásként
a megvalósított eljárásokban glükózon kívül glicerin, alkohol, növényi olaj azaz zsírsav is
számításba jöhet. A különbség a regenerálandó kofaktorok mennyiségében szembetűnő. A
technológiai paraméterek optimálása éppen ezt az élettani feladatot van hivatva megoldani.
1
/2glükóz +NH3 + 2 NAD+ szerin + 2 NADH + 2 H+
glicerin + NH3 + 2 NAD+ szerin + 2 NADH + 2 H+
+
zsírsav + NH3 + 3 FAD + 3 NAD szerin + 3 FADH + 3 NADH + 3 H+
2etanol+NH3+ATP+FAD+3NAD++2NADP+ szerin+ADP+FADH2+3NADH+2NADPH
A szerin bioszintézis látszólag szabályozatlanul folyik, mivel élettani szempontból ez az
aminosav központi szerepet játszik az anyagcserében. Bioszintézise a glikolízis köztes
termékéből a glicerinsav-3-foszfátból indul 2-keto-3-foszfo-glicerinsavon és foszfo-szerinen
keresztül, de képződhet C1 töredék felhasználásával glycinből is. A glicerinsav-3-foszfát
hexózból, pentózból, triózból származhat, de a Krebs-ciklusban fontos szerepet játszó
oxálecetsavból a glükoneogenezis lépéseit hasznosítva is képződhet.
Szerin szintézis glükóz
<<<<<<<<<
ATP
>>>>>>>>ADP
glükóz-6-foszfát

fruktóz-6-foszfát
<<<<<<<<
ATP
>>>>>>>>ADP
glicerin fruktóz-1,6-biszfoszfát
<<<<<<
ATP
>>>>>>ADP NAD+ NADH
α-glicerinfoszfát dihidroxi-aceton-foszfát Glicerinaldehid-3-foszfát
NAD+ >>>>>> P
i
NADH <<<<<<
Glicerinsav-1,3-biszfoszfát
<<<<<<
glioxilát szukcinát ADP
>>>>>>ATP
<<<<<
FAD H2C-O-PO3H2
>>>>>FADH2 H-C-OH
2-P-G COOH 3-P-G
<<<<<<
fumarát NAD+
izocitrát >>>>>>NADH
H 2O H2C-O-PO3H2
C=O
malát ac.CoA 2-keto-3-P-G COOH
citrát glutamát
<<<<<
NAD+ α-ketoglutarát
>>>>>NADH H2C-O-PO3H2
GTP GDP H-C-NH2
ac.-CoA oxálacetát P-E-P 3-foszfo-szerin COOH
>>>>>>
NADPH CO2 Pi
+
<<<<< NADP acetil-CoA
>>>>>>
NADH H2C-OH
acetaldehid <<<<<<<< NAD
+
zsírsav β lebontás H-C-NH2
>>>> >>>>>>>>
NADH FADH2 COOH
+
<<<<<NAD <<<<<<< FAD L-SZERIN
etanol
zsírsav

Prekurzorok alkalmazásával vezetett triptofán szintézis esetében célszerű 5-metiltriptofánra,

illetve 5-fluor-triptofánra rezisztens derepresszált mutánsokat használni. A derepresszált

86
törzsekben a bioszintézisben szerepet játszó enzimszint a vad törzsben mért érték 200-
szorosát is elérheti. A magasabb enzimszint a céltermék túltermelését, főtermékként való
megjelenését eredményezheti.
A derepresszált mutáns előállítására egyszerű lehetőség adódik, mert a tRNS aciláz a
szubsztrátspecifitásának függvényében a sejten belül kialakuló koncentrációviszonyoktól
függő mértékben a novekedő tenyészethez adagolt aminosav analóggal tölti fel a triptofanil-
tRNS-t. Ennek az a következménye, hogy a sejtfehérje olyan arányban tartalmazza az
aminosav analógot, amilyen arányban a tRNS aciláz tévedett. Élettani következményként az
elkészült hibás fehérjék arányában az egyed életképessége akár a teljes életképtelenségig
csökkenhet. Nagyszámú egyed között - mutagénekkel való kezeléssel fokozható mértékben -
előfordulhatnak olyan változatok (variánsok), amelyek nagyobb mennyiségben termelve a
természetes aminosavat, kompetitiven kiszorítják az analógot az acilezési reakcióból, azaz a
növekedést gátló aminosav analóg jelenlétében is képesek növekedni.
Az aminosav túltermelésnek különböző oka lehet. Adott esetben, a bioszintézisben
érdekelt enzimek képződnek nagyobb mennyiségben, tehát konstitutívan derepresszált
mutánsokká váltak.
Más esetben a szabályozási mechanizmus hibájával, a feed-back érzékenység
elvesztésével találkozunk.

A központi szerepet betöltő aminosavak szabályozás nélküli képződése

transzamináz
glicerinsav-3-foszfát G-2-P PEP piruvát glutamát oxálacetát
<<<<
NAD+
foszfoglicerát-dehidrogenáz transzamináz
>>>NADH α-ketoglutarát aszpartát

hidroxi-piruvát-3-foszfát foszfatáz
<<<<<
Glutamát hidroxipiruvát
transzamináz
>>>>α-ketoglutarát glicin
szerin-foszfát Pi glioxilát transzamináz

>>>>
acetil-CoA foszfatáz
>>>>CoA-SH L-SZERIN glutamát α-ketoglutarát

acetil-szerin piruvát alanin

transzamináz
H2S >>>>>>> >>>>>acetát H2O NH3 + H2S
dezamináz
cisztein

L-tripotofán szintézishez természetesen kémiai szintézissel előállított L-szerin is használható,

ha például valamilyen piacképes hasznos termék előállítása közben mellék-termékként
szaporodik fel.

Erre példa a sejtfal bioszintézist gátló D-cikloszerin gyártás esete.

87
D-CIKLOSZERIN
Ezt az egyszerű szerkezetű, (D-4-amino-3-izoxazolidon) Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok
növekedését gátló, főleg antituberkulotikumként felhasználásra került antibiotikumot az ötvenes évek derekán,
négy egymástól független kutatócsoport, négy különböző Streptomyces törzs fermentlevében találta (Harned: S.
orchidaceus. Shull: S.lavendulae. Harris: S. garyphalus. Kuzikava: S. roseochromogenes ). Ez az amfoter
tulajdonságú savstabilis vegyület ketoenol tautomériát mutat, vizes oldatban hosszabb idő alatt dimerizálódik.

H
+ + |
NH3 NH3 NH2 NH2 N N
| | | | / \ // \
H2C−−−C−H H2C−−−C−H H2C−−−C−H H2C−−−C−H H2C−−−CH C O
| | | | | | | | | | | |
O C-OH O C-O− O C=O O C-O− O C HC−−−CH2
\ // \ // \ / \ // \ // \ /
N N N N N N
| |
H H
4,5 pH tautomer alakok 7,4 pH dimer forma

A cikloszerin gyűrűs formában merevített szerkezete a D-alanin térszerkezetéhez hasonlít. Kompetitív gátlással
akadályozza azokat a reakciókat, ahol az enzim szubsztrátuma, illetve terméke D-alanin. Gátolja a D-Ala-D-Ala
szintetáz működését, de nem akadályozza az aminosav aktíválását.

Gátolja a D-alanin és a D glutaminsav-transzamináz aktivitását és gátolja az alanin permeáz működését. Az

alanin racemáz működését az enzim kofaktorával a piridoxál-foszfáttal reagálva gátolja.

A cikloszerin a D-Ala-D-Ala peptid szintézisét gátolva a sejtfal alkotórészeként nélkülözhetetlen muramil-

pentapeptid képződését akadályozza. Mikroszkoppal vizsgálva - cikloszerin jelenlétében - a baktériumokon a
penicillin hatásához hasonló jelenség figyelhető meg. A sejtfalszintézis szelektív gátlása miatt először
szferoplaszt képződik, majd a sejtek szétszakadása a baktériumtenyészet feltisztulásához vezet. Antibakteriálás
hatását csökkenteni lehet in vivo D-alanin adagolásával. A D-cikloszerin például hatástalan a TBC-vel fertőzött
egereken, illetve a tengerimalacon, mivel ezen két állatfaj magas endogén D-alanin szintje hatástalanítja az
antibiotikumot. Humán TBC fertőzés leküzdésére izonikotinsav hidraziddal szokták alkalmazni.

Egyszerű kémiai szerkezete miatt a szabadalmi bejelentésekben leírt bioreaktorban kivitelezhető

módszereket ipari méretben csak átmenetileg használták. Előnyösebb és gazdaságosabb a kémiai szintézis D-
szerin metilészterből. A szerin kémiai szintézisével nyert racemátból a D-forma elkülönítendő. A
melléktermékként velszaporodó L-szerin adott esetben L-triptofán előállítására használható.

88
Triptofán szintézisre használható a reverzbilisen működő triptofanáz (EC. 4.1.99.1.)
amely természetes körülmények között – egyes baktériumokra jellemzően – a triptofán
lebontására szolgál. (E. coliindol+, Klebsiella ndol–, Salmonellaindol–, Edwardsiellaindol+,
Providencia indol+ viszont a Proteus és a Shigella lehet indol+, illetve ndol– is)

indol + piruvát + ammónia ——> triptofán + víz

Ez a reakció végeredményben a
baktériumokban előforduló jól ismert
katabolikus α,β-eliminációs reakció
visszafordítása. Nakazawa (1972) Proteus
rettgeri tenyészetét használta
enzimforrásként. A katabolikus enzim
képződését nem csak a könnyen
metabolizálható szénforrás, de a
nitrogénforrás is represszálja. A promoter
régióhoz kötődő aktív glutamin szintetáz és
egy speciális fehérje komplexe serkenti az
RNS polimeráz aktivitását az esetben, ha
egyidejűleg a cAMP-CAP komplex is jelen
van. A glutamin-szintetáz 12 alegységből
álló óriás enzimkomplex, amelynek
működését glikokoll, alanin, triptofán,
hisztidin, karbamoil-foszfát, glükózamin, citidil-trifoszfát, és adenilsav multivalensen gátolja.
Teljesen inaktív állapotban minden
alegységének tirozil oldallánca
adenilsavval van acilezve. A fenti
aminonitrogént tartalmazó
vegyületek limitált mennyiségben
való jelenléte a tápközegben
előnyösen hat a nitrogénkatabolikus
enzim képződésére. Szénhidrátban
és egyéb nitrogénforrásban szegény
táptalajon az enzim képződését
triptofánnal indukálni lehet. A
rekció közben felszabaduló indol
azonban gátolja a baktérium
növekedését. A gátló hatás polyoxietilén-alkil-fenoléter adagolásával védhető ki. Ez a
detergens mikrocseppekbe zárva megköti a felszabaduló indolt. Ílyen körülmények között
növekedő baktérium oldható fehérjetartalmának 6 %-a triptofanáz.

A kifejlődött tenyészetből elkülönített sejtekhez literenként 80 g nátrium-piruvátot, 80 g

ammónium-acetátot, 10 mg piridoxál-5-foszfátot, 1 g nátrium-szulfátot és 100 ml metanolban
oldott 60 g indolt adva enyhén alkalikus (8,8 pH) körülmények között, 34 oC-on keverve, két
nap alatt 75 g triptofán képződik. Az egyensúlyi reakciót teljessé lehet tenni, ha a
reakcióelegyből a triptofánt kivonjuk, például inozinnal, ami a képződő triptofánnal
vízoldhatatlan komplexet ad. Az eljárást sikerrel használják triptofán analógok, például 5-
hidroxitriptofán előállításra.

89
 L-TRIPTOFÁN NYERÉSE RACÉM HIDANTOIN SZÁRMAZÉKBÓL
A teljességre törekedve nem hagyható figyelmen kívül egy bakteriális enzim a hidantoináz
ipari alkalmazása L-triptofán előállítására. Ez az 5-hidroximetil-hidantoinnal indukálható
enzim (Sano. 1977. Agric. Biol.Chem. 41:819) a racém indolil-metil-hidantoinból első
lépésben az L-triptofán N-karbamoil származékát állítja elő, majd második lépésként távolítja
el a karbamoil csoportot. Az átalakítandó szubsztrátum gyakorlatilag teljes mértékben
eladható termékké alakítható, mert az indolil-metil-hidantoin 8-9 pH tartományban spontán
racemizálódik. Az indukált baktériumsejtek membránjának átjárhatóságát a reakcióelegyhez
adott toluol fokozza, de az elegy baktériumos fertőződését is megakadályozza.

H H O H H
| | || | |
H–C=C–C——C– CH2− C– C – N-H H–C=C–C——C—CH2—C— COOH
| || || | | | || || |
H–C=C–C–N–C-H H-N —– C=O H–C=C–C–N– C–H H–N—C=O
| | | | |
H H Η 2Ο H H NH2
hidantoináz N-karbamoil-L-triptofán
rac-indolilmetil-hidantoin
formamid
pH = 9 D-indolilmetil-hidantoin L-triptofán

Bioszintézis prekurzorok felhasználásával. Az egyik jól ismert módszer antranilsav

adagolással valósítható meg. Ez esetben az antranilsav adagolás a triptofánra érzékeny
alloszterikusan feed-back szabályozott reakciót kerüli meg, ha a másik szubsztrátum az 5-
foszforibozil-1-pirofoszfát kellő mennyiségben rendelkezésre áll. Ilyen eljárásokat dolgoztak
ki Hansenula anomala, Candida utilis, Bacillus subtilis antranilsav auxotróf törzseit
használva. A növekedő szakasz után kezdődik az antranilsavat tartalmazó tápoldat adagolás
vigyázva arra, hogy az antranilsav szint 0,5 % alatt maradjon.
sejt tömeg L-triptofán
+ o
o
A táptalaj összetétele (H. anomala)
o
5 % glükóz
0,3 % ammónium-nitrát 50g -- o
5g--
0,05 % káliumdihidrogén-foszfát o
o ++
0,2 % dinátriumhidro-foszfát +
+
0,1 % nátriumdihidrogén-foszfát o
+
0.05 % magnézium-szulfát o
+ o
0,01 % nátrium-klorid o
+
0,001 % ferro-szulfát o
+
0,1 % élesztőkivonat o
+
2 % kalcium-karbonát o
+
0,2 % antranilsav induláskor, o
majd naponta adagolva
24 48 72 96 120 h

90
 L-TRIPTOFÁN BIOSZINTÉZIS SZÉNHIDRÁTBÓL ÉS AMMÓNIÁBÓL.
Leggazdaságosabb előállítási módja a mutánsok felhasználásával végzendő teljes bioszitézis.
Az iparilag használható mutáns előállításához az eddigi tapasztalatok alalpján a
Corynebacterium glutamicum vad törzsből indulva fenilalanint és tirozint igénylő, kétszeresen
auxotróf korizmát-mutáz hiányos törzset izoláltak. Ez a törzs limitált fenilalanin és tirozin
jelenlétében tenyésztve képes volt csekély mértékben triptofánt termelni, mivel a felszaporodó
korizminsav továbbalakulását nem tudta megakadályozni a triptofánra érzékeny,
alloszterikusan szabályozható antranilát szintetáz. A következő feladat éppen a feed-back
mechanizmus hatástalanítása volt.
Ennek a feladatnak a teljesítése
érdekében egymás után végzett
műveletekben 5-metil-triptofánnal,
5 fluor-triptofánnal, 4-metil-
triptofánnal és triptofán-
hidroxamáttal szemben rezisztens
mutánsokat izoláltak. Ezek közül
választották ki a jobban termelőket
és azokkal végezték tovább a
klasszikus genetikai tevékenységet,
az előállított mutánsok vizsgálatát.
Ezek között a triptofán analógra
rezisztens Tir− Phe− mutánsok legjobbjai már 0,5% triptofánt termeltek mélyfermentációs
körülmények között. Logikailag várható, hogy fokozódik a triptofán termelés, ha a fenilalanin
és tirozin érzékeny alloszterikus enzimek feed-back érzékenységét is sikerül megszüntetni. A
további genetikai beavatkozásokban p-fluor-fenilalaninra, majd p-amino-fenilalaninra
rezisztens mutánsokat állítottak elő. Végül tirozin-hidroxamátra, illetve fenilalanin-
hidroxamátra rezisztens módosulatokat választottak ki. Szisztematikusan mindíg a legjobbnak
látszó mutánssal végezték a következő genetikai módosítást. — A munka eredményeként
olyan genetikailag stabilnak tekinthető törzshöz jutottak, amely 12 g triptofán/liter
termelésére volt képes. A táptalaj 10 % redukáló cukrot, 2 % ammónium-szulfátot, 1 %
kukoricalekvárt és 2 % kalcium-karbonátot tartalmazott. A mutáns triptofán
termelőképessége ezen kezelések ellenére sem vesztette el teljesen a fenilalanin és tirozin
érzékenységét. A technológia kialakításakor ezen két aminosav aktuális koncentrációját a
táptalajban analitikai mérésekkel limitáló szintre kell beállítani.
Aminosav forrásként előnyösen használható a szójafehérje hidrolízátuma fenilalanin
kiegészítéssel. A két aromás aminosav egymáshoz viszonyított arányának meg kell egyezni a
mutáns fehérje-összetételében mért aránnyal. A táptalaj szuboptimális aromás aminosav
tartalma meghatározó jelentőségű. Ettől való eltérés lefelé elmaradást okoz a növekedésben,
felfelé pedig a triptofán termelés csökkenésével jár. A beállított táptalaj összetétel csak a
fermentációs paraméterek szigorú állandósága esetében hozhat eredményt. A hőmérsékletben,
a levegőzésben és a keverésben, vagy az induló sejtszámban való változtatás az aminosavak
felhasználását is változtatja, ami végül a triptofán termelésben való eltérés okozója lehet.
Meghatározó jelentősége van a technológiai előírások betartásának és a fermentációs
berendezés, műszaki színvonalának. A glükózból folyó triptofán szintézis oxigén igényéről
fogalmat alkothatunk a vázlat alapján. A szintézis energia és anyagigénye független a törzstől,
ezért az Escherichi coli adatai nem különböznek a C. glutamicum -étól. Egyetlen triptofán
képződéséhez 3 glükóz és 2 ammónia szükséges, miközben 1 piruvát, 4 szén-dioxid képződik,
miközben nyolc redukált kofaktor és öt ADP regenerálása terheli az anyagcserét. A piruvát
elégetés is az anyagcsere feladata. Mindent összevetve triptofán molekulánként 11 NAD(P)H
visszaoxidálását kell gazdaságosan megoldani.

91
 L-ASCORBINSAV ELŐÁLLÍTÁSÁHOZ KAPCSOLÓDÓ TEVÉKENYSÉG
A scorbut megszüntetésére alkalmas C-vitamint 1928-ban Szent-Györgyi Albert izolálta
mellékveséből és narancsból (Biochem J. 1928.22:1387) Az aszkorbinsav kémiai
szerkezetének felderítése több kémiai szintézisút kimunkálására késztette a vegyész
kollegákat. Egymástól függetlenül 1933-ban Reichstein és Haworth kutatási eredményei
kerültek ismertetésre (Nature 1933.132:280; Soc. 1933 1419). Az akkor kidolgozott eljárások
elemeit ma is használják az évenként tübb mint harmincötezer tonna C-vitamin előállítására.
A Reichstein által kidolgozott eljárás egy ma is gazdaságosan végezhető mikrobiológiai lépést
hasznosít. — A glükózból katalitikus hidrogénezéssel nyert szorbitot mikrobiális eljárással
dehidrogénezik. A képződött szorbóz diacetonidjából kémiai oxidációval állítják elő a
diaceton-2-keto-gulonsavat, amiből további kémiai lépések (észterezés, enolizáció,

laktonképzés) segítségével nyerik a 2-keto-gulonsav-metilésztert, amiből lugos hidrolízissel

aszkorbinsav képződik.
A dehidrogénezés Acetobacter xylunum, illetve Acetobacter suboxydans törzsekkel
végezhető, amely baktériumok növekedésükhöz pantoténsavat, p-aminobenzoesavat és
nikotinsavat igényelnek. Igényüket a tápközeghez adott élesztőfőzet elégíti ki. — Az eljárás
másik kényes pontja a katalitikus hidrogénezéssel előállított szorbit jelentős nikkel tartalma.
A Raney-nikkel katalizátorból származó szennyezést nehéz maradéktalanul eltávolítani. Az
ipari eljárásban az Acetobacter suboxydans olyan mutánsát alkalmazzák, amely literenként 24
mg nikkelt tartalmazó biokonverziós elegyben is működőképes.

Az első időkben az átalakítást felületi tenyészetben végezve néhány hét alatt a szubsztrátum
80-85%-a szorbózzá alakult D-fruktóz és 5-keto-D-fruktóz képződése mellett. Az első sikeres
sűlyesztett oxidációs eljárásról Wells és munkatársai 1937-ben számolnak be. Szorbitot és
élesztőkivonatot tartalmazó táptalajon nőtt tenyészet 35-40 óra alatt a szubsztrátum 60 %-át

92
átalakította. Mivel a szbsztrátumként szereplő szorbit nagyobb koncentrációban gátolja a
baktérium növekedését, ezért 10%-ról indulva menetközben több részletben ráadagolva érik el
a 35 %-os szorbit koncentrációt. A táptalaj 0.5% élesztőkivonatot tartalmaz. A tenyészközeg
kémhatását 4-6 pH-n tartva 30°C-on indítják, majd a hőmérsékletet 35°C-ra emelve 30 óra
alatt fejeződik be a biokonverziós folyamat. — Ezt követőleg az elegy alakos elemeit, a
sejtroncsokat szűréssel eltávolítják, majd ionmentesítés után enyhe körülmények között
töményítve, a hűtött anyalugból a szorbózt kristályos formában elkülönítik. Általában a
kiindulási szorbitra számolva 87-89 %-os hozammal nyerhető a szorbóz C-vitamin gyártáshoz
szűkséges minőségben. A teljes folyamatot tekintve 2 kg glükózból 1 kg C-vitamint lehet
előállítani.

A mikrovilág enzimkészlete a szintézisút további kémiai lépéseinek helyettesítésére is képes.

David Perlman vezetésével dolgozó kutatócsoport Gluconobacter melanogenus biokémiai
aktivitását hasznosítva a szorbózból szorbozont, L-xilohexogulozt állított elő, amit ugyanez
az organizmus tovább oxidált 2-keto-L-gulonsavvá. Ez utóbbi átalakítás azonban
meglehetősen gyenge eredménnyel ment, ezért különböző mikroorganizmusok aldehid-
oxidáló képességét hasonlították össze, sőt az eredeti vad törzsből mutagén kezeléssel
igyekeztek alkalmasabb enzimforráshoz jutni. Végül is egy Pseudomonas putida ATCC
21812 törzs felhasználásával
80%-os hatásfokkal lehetett
szorbozonból indulva 2-keto-L-
gulonsavhoz jutni. A szorbozon
koncentrációja azonban alig
haladta meg az 5 mg/ml értéket,
ami az eredmény gyakorlati
használhatóságát kérdőjelezi.
Kezdettől felmerült a vágy a
katalitikus hidrogénezési lépés kiváltására. A szorbit oxidációban szereplő baktériumok
biokémiai aktivitásának a vizsgálata egy alternatív út kimunkálásának lehetőségével
kecsegtetett. Közismert volt, hogy az Acetobacter suboxidans glükózból egyetlen
fermentációs ciklusban 5-keto-D-glükonsavat állít elő, mégpedig 10 %-nyi glükózt tartalmazó
reakóelegyben 90%-os elméleti hozammal. A biokonverziós folyamat részletes vizsgálata két
egymást követő lépés szerepét tisztázta. Az első lépés egy FAD enzim által katalizált
glukonsav képzés. A folyamat közben képződő FADH2 regenerálása a légköri oxigén
felhasználásával hidrogén-peroxid képződés közben történik.

A glukonsav képződést katalizáló hexóz-oxidáz enyhén savanyú körülmények között (pH 5) a

membránhoz kötve glükózból δ-glukonolaktont állít elő. Ez a gyürüs szerkezetű, elektromos
töltéssel nem rendelkező vegyület könnyen jut a periplazmikus térbe, ahol a membrán külső
felületéhez kötött laktonáz glükonsavvá hidrolizálja. A glukonsav tovább alakulását savanyú
körülmények között (pH 4.5) a membránhoz kötött 5 ketoreduktáz katalizálja, eltávolítva az
5-ös szénatomhoz kötött hidrogént. — Az enzim szerkezete az egyensúlyi reakciót a
savképződés irányába tólja. A reakcióelegybe adagolt kalciummal lehet a ketosavképződést
fokozni. A reakcióelegybe juttatott kalciumkarbonát elősegíti a vízben rosszul oldódó
kálcium-5-keto-glukonát képződést. A reakcióelegybe juttatott kálcium mennyisége kritikus a
folyamat kedvező irányba terelése szempontjából. Ekvivalens mennyiségben adva rontja a
ketonizáció esélyét, főtermékként glukonsav képződik. —

A szaporodás és a termékképződés pH optimuma eltér. A semlegesítés csökkenti a baktérium

növekedését.— A reakcióelegy hőmérséklete is eltérő hatást vált ki. A növekedés

93
hőoptimuma 27-30 °C. A glukonolakton képződés sebessége növelhető a hőmérséklet
emeléssel, a ketonizáció folyamatát viszont gátolja ez a beavatkozás. Megjegyzendő, hogy az
azonos rendszertani egységbe sorolt mikróbák ketonizációs aktivitása jelentősen eltérhet.
Ebből a szempontból az Acetobacter suboxidans ATCC 621 törzs a legaktívabb.

A teljes biokonverziós folyamatban azonban nem csak a membránhoz kötött enzimek vesznek
részt, szerepet kapnak a citoplazmában működő enzimek is. A glükóz a permeáz segítségével
glükóz-6-foszfát formájában jelenik meg a citoplazmában, ahonnan egyrészt a NADP+
igényes G-6-P-dehidrogenáz és 6-P-G-dehidrogenáz által katalizált uton dekarboxileződve, a
pentózfoszfát ciklus igényét, másrészt a citrát ciklust támogató glükolízis által a mikróba
energiaigényét elégíti ki.
Az Acetobacter suboxidans
membránhoz kötött FAD igényes
dehidrogenáza Ca++ jelenlétében a
glükózból kálcium-glükonátot képez,
amit a NAD+ igényes 5-ketoreduktáz
alakít 5-ketoglükonsavvá. 10 %-os
glükóz oldatból 33 óra alatt 25°C-on
90%-os hozammal nyert 5-
ketoglükonát-kálciumból katalitikus
hidrogénezéssel kalcium L-gulonát és
D-glukonát elegyét nyerték. A könnyen
elválasztható L-gulonát mikrobiológiai
úton alakítható 2-keto-L-gulonsavvá
(US.Pat:4155812). A D-glukonát pedig
ismételten visszavezethető a
folyamatba.

Mások a 2,5-diketo-glükonsav utat

előnyösebbnek tartják. Pseudomonas
albosesamae ATCC 21998; Acetobacter
melanogenus ATCC 9937; illetve az
Acetobacter cerinum segítségével két-
három nap alatt 16.5%-os glükóz oldatból
95%-os kihozatallal nyerhető a 2,5-
diketoglükonsav. Tovább lépve az 5-
ketocsoport Corynebacterium és
Brevibacterium törzsekkel szelektíven
redukálható. —

Sonoyama és munkatársai szerint

Acetobacter melanogenus ATCC 9937 és Brevibacteriun ketosoreductum ATCC 21914
törzsek kevert tenyészetével glükózból egy lépésben 2-keto-gulonsav nyerhető (US
Pat:3998697). A kevert tenyészet bizomytalan reprodukálhatósága miatt nem került ipari
gyakorlatba.

94
 GLÜKÓZ-FRUKTÓZ CUKORSZÖRP NAGYIPARI ELŐÁLLÍTÁSA
Európa népessége minden bizonnyal a történelmi idők elött is ismerte az édesség varázsát. A
gyümölcsből főzéssel készített lekvár, a méhek által gyüjtött méz piacképes termék volt. Dél-
Amerika felfedezése után, a cukornádból kipréselt sejtnedvből kristályosodó termék, a
nádcukor megjelenése Európa élelmiszerpiacán az édesipar fejlődését hozta. A napoloni
háborúk idején meghirdetett tengeri blokád következményének felszámolása céljából, a
kontinens cukorigényének a tengerhajózástól független megoldása vezetett a répacukorgyártás
kifejlesztéséhez. Az így előállított kristálycukor azonban a fejlesztések ellenére sem volt
képes a piaci versenyben hátrányos helyzetén javítani. Az enzimek nagyipari
hasznosíthatósága a huszadik század 70-es éveiben azonban a mérsékelt égőv édesipara
számára is előnyös helyzetet teremtett, ami a répacukor gyártás visszaszorulását hozta.
Marshall és Kooi 1957-ben közölték, hogy a Pseudomonas hydrophila a glükózt képes
fruktózzá izomerizálni. — A felismerés 20 éven keresztül csipkerózsika álmát aludta. A
hetvenes években jelentkező cukorhiány, a nádcukor árának hirtelen emelkedése előhívta a
feledésből az addig csak irodalmi adatnak tekintett közlést. Kiderült, hogy a felfedezés ipari
gyakorlatba vétele jelentős gazdasági hasznot hoz a felhasználóinak. Mikrobiális izomeráz
alkalmazásával lehetőség adódott keményítő alapanyagból a nádcukornál gazdaságosabban,
10-15%-kal olcsóbban előállítani az édesipar, konzervipar
és a szörp üzemek számára a glükóz-fruktóz keveréket, az
invertcukrot. (Az élelmiszeripar a kristályosodó szacharózt
minden esetben invertált formában hsználta.) Ennek az
ipari eljárásnak az elterjedésével a cukorgyárak
elvesztették monopol helyzetüket.— Az első üzemek az
Egyesült Államokban kezdtek termelni főleg kukorica-
keményítőből. 1980-ban már Japánban is 17 üzem
működött. Európa sem akart elmaradni a versenyben.
Hazánkban Szabadegyházán épült ilyen szörpüzem. Az
eljárás elterjedésében nagy szerep jutott az enzimrögzítési technológia alkalmazásának, mivel
így az előálllított biokatalizátort hosszú ideig lehetett folyamatos üzemben alkalmazni. A
modern géntechnológiai módszerekkel előállított, és szántóföldi termelésbe fogott Zea mays
törzs biológiai tulajdonsága (gyomirtó rezisztencia) a kukoricakeményítő előállítási árát is
kedvezően befolyásolja.
A piaci helyzet stabilizálásán kívül az eljárás az egészséges táplálkozás szermpontjából is
nagy jelentőségű fejlesztésnek tekinthető, mivel a glükóz-fruktóz keverékből a fruktóz
kromatográfiás módszerrel könnyen elkülöníthető. A visszamaradó glükózszörp többszöri
visszaforgatásával a keményítő a glükóznál kétszer édesebb fruktóz sziruppá alakítható
(Starch 1980,32:11; 1981 33:55). Fruktózt a cukorbetegek is fogyaszthatnak, mivel a
glükóznál lassabban szivódik fel és az anyagcserében is lassabban hasznosul. Ez az izomeráz
természetes életkörülmények között a mikroorganizmus életbenmaradását biztosítja xilózon,
mint egyedüli szénforráson. Ezzel a szénforrással a mikrovilág nap mind nap találkozik, mivel
a xilózból álló polimer - a xilán - a hemicellulóz alkotórészeként a növényvilág fontos
építőeleme. Ennek a polimernek a lebontását egy indukálható enzim, a xilanáz végzi. A
hidrolízis hatására megjelenő pentóz - a xilóz - azonban nem bontható, mert a mikrobiális
enzimek között nen akad olyan, amely a xilózból foszforsavésztert alakítana, márpedig ez
feltétel a szénhidrátanyagcserébe való bekapcsolódásnak.
A mikroorganizmusok egy részében előforduló izomeráz azonban képes az
aldopentózt ketopentózzá alakítani, a hatására képződő xilulóz foszforilezésére szolgáló
enzim viszont minden mikroorganizmusban működőképes. (A baktériumok egy csoportja
xiliten keresztül vezető kerülő úton képes hasznosítani a pentózokat, ennek jelentősége

95
azonban csekély.) A xilóz-ketoizomeráz /EC.5.3.1.5./ a szubsztrátum hasonlósága miatt az
egy szénatommal hosszabb szénhidrátot, a glükózt is
elfogadja szubsztrátumként, és közel azonos
sebességgel fruktózt állít elő belőle. Ennek a
lehetőségnek a felismerése után nagy számú törzs
(Streptomyces, Nocardia, Arthrobacter és Bacillus)
enzimkészletét vizsgálták meg, keresve azt a törzset,
amelyik ezt az enzimet az ipari elvárásoknak megfelelő
szinten termeli. Könnyíti a munkát, hogy egyedüli
szénforrásként xilánt tartalmazó táptalajon csak azok a
szervezetek növekednek, amelyek egyrészt
extracelluláris xilanázt termelnek, másrészt xilóz-ketoizomerázzal is rendelkeznek. Az utóbbi
enzim, általában intracelluláris. A tápközegben ez az enzim csak a sejtmembrán károsodása
esetén jelenik meg.— Mindkét enzim képződését katabolikus represszió szabályozza.
Képződésük előfeltétele a könnyen metabolizálódó szénforrás, például glükóz hiánya.—
A hiány bizonyos kulcsenzim működésének szelektív gátlásával is előidézhető. A xilóz-
ketoizomeráz működése felfüggeszthető egy glükóz-analóggal, a szorbittal. Ez a hexit
elfoglalja az enzimfehérjén a glükóz-, illetve a xilóz-kötőhelyet és csak fölös mennyiségben
adott glükóz vagy xilóz képes kiszorítani onnan. Ezzel a módszerrel a katabolikus represszió
hosszabb ideig felfüggeszthető.
Az enzimes eljárás gazdaságos kivitelezése szempontjából az izomeráz enzim néhány
tulajdonságát is célszerű vizsgálni. Az enzimműködés általában kobaltot igényel. Ezt az iont
egészségi okokból el kell távolítani a szirupból. Gyakorlati szempontból ezért fontos, hogy az
enzim nagy cukorkoncentráció (40%) esetén is működőképes maradjon, továbbá, hogy.
magashőmérsékleten (70-80 °C-on), közel fiziológiás pH-nál az enzimet tartalmazó sejtek ne
lizáljanak. Egyes eljárások enzimkészítménye 100 °C-on is használható nyomásálló
reaktorban. Az enzimtermelés céljára azt a törzset választják, amelyik mindezen feltételeknek
megfelelve az enzimszint szempontjából is kiemelkedő teljesítményre képes. — A törzs
szabályozó rendszerét klasszikus genetikai mdszerekkel módosítva sikerült az enzimszintet
60-80%-kal növelni. Géntechnológiai módszerekkel az Upjohn kutatói az enzimképződést
négyszeresre fokozták (Appl. Environ. Microbiol. 1983.45:1402).
A GYIKI kutatói által kiválasztott törzs a Streptomyces matensis (MNG-138—170004
02.06.75 magyar szabadalom), amelynek a fenntartására egyedüli szénforrásként xilánt
tartalmazó táptalaj a
legalkalmasabb. Gazdasági
meggondolásból az enzimtermelő
táptalaj kezdetben glükózt
tartalmaz, mégpedig olyan
mennyiségben, hogy az a
logaritmikus fázis elejéig elfogyjon.
A glükóz elfogyásakor a kifejlődött
sejttömeghez adott xilóz indukálja
az izomeráz képződést. A xilóz
mellé adott szorbit a mesterségesen
fenntartott látszólagos xilulóz hiányt
okozva az izomeráz túltermelését
eredményezi. A maximális enzimszint elérésekor, mivel az izomeráz 80°C-on sem
inaktíválódik, célszerű a tenyészet felmelegítésével elölni a sejteket és egyben inaktíválni a
hőérzékeny proteolitikus enzimeket, megakadályozandó a fonalas sejtek lízisét.

96
FRUKTÓZ-SZÖRP ELŐÁLLÍTÁSA— AZ ELJÁRÁS KIFEJLESZTÉSE
Természetes forrásból származó mikróba szuszpenzió

Egyedüli szénforrásként xilánt tartalmazó minimál

táptalajra szélesztés, majd egy hét inkubálás 30 °C-on

Szélesztés xilánt tartalmazó minimál táptalajra

Tiszta tenyészet izolálása ferde agar táptalajra

A törzs tisztaságának ellenőrzése komplett táptalajra

szélesztéssel, ismételt vissza-oltogatás xilánt tartalmazó
táptalajra

Ellenőrzött tiszta tenyészettel xilózt tartalmazó folyékony

táptalaj oltása

48 órán keresztül levegőztetve kerve

A kinőtt tenyészetek sejtjeinek elkülönítése

centrifugálással

A sejtek inkubálása 30 %-os glükóz oldatban 60 °C-on

A glükóz-fruktóz arány változásának vizsgálata
A legaktívabb tenyészetekkel xilózos cső oltása
Különböző hőfokon inkubálva 1-2-3 napos korban

A legaktívabb tenyészetek sejtjeit ismételten 30%-os

glükóz oldatba szuszpendálni

A legaktívabb törzsekkel optimális hőmérsékleten ideális

korú tenyészetet készítünk

A tenyészetet elkülönítve glükóz oldatban inkubálni

különböző hőfokon
72 óra inkubálás után a sejteket ismételten
szuszpendáljuk, legalább hat alkalommal és 72 órában
mérjük az G/F arányt és a felezési időt
A mérés ismétlése a legelőnyösebbnek talált 3 törzs-zsel
Kiegészítve a fehérjetartalom változás vizsgálatával.
A törzs fenntartása egyedüli szénforrásként xilánt
tartalmazó táptalajon történik.
Fokozható az izomeráz kötődése a sejt alkotórészeihez
glutárdialdehiddel, amely vegyület az enzim és a
közelében levő sejtalkotórész ideális távolságban levő
aminocsoportjai között létesít kovalens kötéseket. Az így nyert enzimkészítmény tartós
használatra alkalmas. 40 nap folytonos használat után feleződik az aktivitása.

97
A glükóz-fruktóz izomeráz az az enzim, amelynek az előállítására folytonos fermentációs
technológiát dolgoztak ki. Az eljárást évtizedek óta ipari méretben használja a Novo Industry
A/S. Az intracelluláris enzimet egy atipikus termofil Bacillus coagulans konstitutív módon
termeli. A tenyésztés hőmérséklete 50°C, ami a közel semleges optimális pH mellett a
tápanyagban gazdag táptalajon, a környezetből származó idegen mikróbák elszaporodását
nehezítve a tenyészet homogenitását elősegíti.— A táptalaj előkészítésére, sterilezésére, az
egész apparátus bakteriológiai tisztaságát szolgáló módszerek kidolgozására különös gondot
fordítottak. A termelő törzs genetikai stabilitása akár 1000 órás folytonos tenyésztést is elbír a
biológiai teljesítőképesség észrevehető változása nélkül. — A törzs eredetileg endospora
képző volt, ezért a folytonos fermentációs technológia kidolgozása céljából klasszikus
genetikai módszerek alkalmazásával olyan stabil nemspórázó mutánsát állították elő,
asmelyben a litikus hatású enzimek képződésének a szabályozása nem sérült meg
A folytonos eljárás termelékenysége 3-4-szerese a szokásos eljárásnál kapott értéknek, ami a
viszonylag nagy higítási rátával magyarázható. (µ = 0.1-0.4 óra–1). A nagyobb
termelékenység kompenzálja a drágább táptalaj és a költségesebb technológia alkalmazásának
hátrányait. Az évtizedek óta használatban levő eljárás a lehető legalacsonyabb
glükózkoncentráció mellett, oxigénlimitált körülmények között, a higítási sebesség
változtatásával biztosítja a maximális specifikus aktivitású sejtek nagy mennyiségének a
képződését.
Az élelmiszeripari felhasználáson
kívül újabban eredményesen
alkalmazzák a glükóz-fruktóz
izomerázt a növényekben nagy
mennyiségben előforduló xilánból
folyó alkoholgyártáshoz (bioetanol).
A xilán hidrolízisekor felszabaduló
xilóz hasznosítására két lehetőség
terjedt el az élővilágban. Az egyik a
xilóz redukciója xilitollá, amit egy
NADPH függő oxidoreduktáz
katalizál. A képződő xilitolt egy
NAD függő dehidrogenáz alakítja
xilulózzá. Ezt a terméket foszforilezi
a xilulokináz, és ezzel a reakcióval
indulhat a pentózok alkoholos
erjedése.

Két xilózból 3 etanol mellett

3 ATP,
4 szén-dioxid és
2 NADH képződik.
A NADH REGENERÁLÁSA aerob
körülményeket igényel.
Anaerob körülmények nem javítják
a helyzetet

98
A másik megoldás, ha az erjesztendő xilózhoz izomerázt adunk. Ez esetben a szubsztrátum
hasznosítása jobb. Három xilózból 5 etanol,
5 ATP, és
5 szén-dioxid képződik.
Ez az út lehetőséget ad az élesztők használatára.

99
BIOETANOL A szeszgyártás alapanyaga kezdetben a cukorgyártás melléktermékeként
visszamaradó melasz volt. A piaci igényekhez alkalmazkodva, adott esetben a cukorkihozatal
növelése a melasz mennyiségét csökkentette, ellenkező esetben növelte, ami a
szeszgyártásban bizonytalanságot okozott. A szesz iránt növekedő kereslet hatására a
keményítő gyárak mellé is szeszgyárak települtek. Először a keményítő és glükóz gyártás
hulladékát hasznosították. Később az igényeknek megfelelően adott esetben a keményítő
jelentős része alkoholként került a piacra. Az alkohol-gyártás a mezőgazdasági termelésben
jelentkező időjárás okozta hullámzásokat pufferként tudta felfogni. Az esetenként
bekövetkező túltermelés nem vezetett az eladhatatlan termékek felszaporodására, azaz nem
csökkentette a termelési kedvet. A szénhidrát tartalmú termékeket túltermelés esetén
(burgonya, kukorica) alkohollá alakítva értékállóan lehetett tárolni. Az alkoholgyártás
gazdaságosságát vizsgálva össze kell vetnünk a cukorgyártásban hasznosított mezőgazdasági
termékek előállítási költségeit és a belőlük nyerhető hasznos termékek mennyiségét.
Egy tonna 73% víztartalmú cukornád átlag 769 kg cukortartalmú nádszár mellett 231
kg levél és szárcsúcsi részt tartalmaz. A nádszárból felaprítás után 174 kg szárazanyagot
tartalmazó vizes oldatot lehet kipréselni. A visszamaradt növényi maradék száraz súlya 97,4
kg, amelyből elégetve 3,3 kg hamu marad vissza. A víz-oldható frakcióban 122,5 kg
fermentálható szénhidrát és 51,9 kg nem fermentálható anyag (19,5 kg nitrogén tartalmú
vegyület, 5-6 kg lipid, 13 kg hamu) található.
Egy tonna cukorrépából 515 kg szénhidrátot tartalmazó gyökér és 485 takarmányként
hasznosítható répafej és levél különíthető el. A répa több mint 81% vizet tartalmaz. A
lefejezett gyökérből 84,8 kg szárazanyag tartalmú víz-oldható anyag és 26,2 kg
szárazmaradékot tartalmazó, takarmányként hasznosítható extrahált gyökér maradvány
képződik. A víz-oldható anyag 66,4 kg fermentálható szénhidrátot és 18,4 kg nem
fermentálható maradékot tartalmaz.
Ha az adatokat az egy hektáron termelhető ipari növény mennyiségével összevetjük,
akkor nyilvánvalóvá válik a cukornád termelésére alkalmas klimatikus viszonyokkal
rendelkező államok gazdasági előnye. (foton/m2) Ez az előny fokozódik, ha a két alapanyagból
nyert melléktermék a nádmelasz és a répamelasz fermentálhatóságát összehasonlítjuk. A
cukornád melasz nagyobb cukor, biotin és foszfor tartama előnyösen befolyásolja az alkohol
termelését. Üzemanyagként való használatát az árviszonyok, a gazdasági meggondolások
egyértelműen meghatározzák.
A 70-es években bekövetkező olajár-robbanás a gazdasági szakértők figyelmét az
etanolra fordította. Ez a környezetvédők igényeit kielégítő energiahordozó vegyipari
alapanyagként petrokémiai termékek előállítására is használható. A mezőgazdasági
termelésbe fogható területek limitált volta és az előállítási költségek azonban óvatosságra
intenek. Nem véletlen, hogy csak azokban az államokban került gyakorlati megvalósításra ez
a program, ahol a mezőgazdasági termelés túltermelési válsággal küzd, illetve jelentős
mennyiségű nyersolajat importál. Braziliában a “proalcool” program keretében az 1976-ban
700 millió literes etanol termelést négy év alatt 4 milliárd literre emelték. Ez 450 ezer autó
átállítását jelentette etanol üzemre. Az olajimport csökkentése miatt növelték az etanol
termelést Dél-Afrikában is. Az USA “Gasohol” programja évi 400 millió liter etanol
üzemanyagként való hasznosítását teszi lehetővé. Az etanol nagyipari előállításának energia
igénye: cukornádból 18 MJ/kg etanol, kukoricából 19,4 MJ/kg etanol. Az etanol energia
tartalma (26,6 MJ.kg-1) alacsonyabb a motorbenzinénél (43,8 MJ kg-1), oktánszáma viszont
90-100 között van.
A cukornádból nyert etanol 20%-kal, a kukoricából nyert 50%-kal drágább, mint a
cukoripari melléktermékből, a melaszból nyerhető etanol. A melasz mennyiségét viszont a
cukorgyárak kapacitása egyértelműen meghatározza.

100
A répacukor gyártás technológiai áttekintésekor ipari gyakorlati példaként vizsgáljuk meg a
Lehrter Zucker AG (D-3160 Lehrte) szenny-víztisztító rendszerének a működési adatait. Ez az
üzem naponta 2000 m3 szennyvizet termel, amely átlagban 7000 mg/l (BOI) biológiailag
oxidálható szerves anyagot tartalmaz. A nagy szervesanyagtartalmú szennyvízet (1) két
hőcserélőn (2) átvezetve a metántermelő szakasz optimális hőmérsékletére melegítik fel részben
az üzemből származó ipari vizzel (3), illetve a bepárlóból származó (4) kondenzátummal. A
vasbetonból készült 3 kamrás összesen több mint 5000 m3 hasznos térfogatú anaerob reaktor (5)
némi denitrifikáció mellett naponta 7500 m3 gázt termel (80% metán tartalommal), miközben az
oxidálható szerves-anyag tartalom 1500 BOI-értékre csökken.
A nitrtifikációt is végző aerob szakasz (11) céljára szolgáló, 3500 m3 térfogatú, levegőz-
tetett reaktorban 1000 m3/óra levegő átfúvásával a tisztított szennyvíz oxidálható szervesanyag
tartalmát 80-100 BOI-egységre csökkentik. Az aerob szakasz után egy végső denitrifikáló térben
(10) találkozik az anaerob köztesülepítőből származó előtisztított szennyvíz és az utóülepítőből
származó (8) eleveniszap, valamint a nyerscukorsűrítőből származó, a hőcserélőn átvezetett még
meleg kondenzátum (4).
A metánt fermentáló reaktorban a biomassza leülepedését a gáztartályból visszavezetett
biogázzal (16) akadályozzák meg. A metánreaktorból egy köztes gázmentesítő kamrán (6)
átvezetve kerül a részben tisztított szennyvíz a köztes ülepítőbe (7). Az itt felgyűlő eleven iszap
nagy része (8) visszakerül a metántermelő (5) reaktorba. A fölösleg (9) szárításra kerül.
Az anaerob fázisban képződő biogáz egy részét a gáztartály (15) gyűjti, a gáz nagyobbik
hányada (18) teljes mértékben fedezi a 850 m3 térfogatú utótisztítóban (13) felhalmozódó, illetve
a köztes ülepítőből származó mikroszervezetek (9) szárításához szükséges energiát. A biogáz
rendszert az elmaradhatatlan biztonsági fáklya (17) zárja.
A tisztított szennyvíz, mely a kiindulási szerves anyag tartalom alig két százalékát
tartalmazza, végül az utóülepítőből kerül (14) a környezetbe.
D betü jelzi a rendszer azon szakaszait, ahol denitrifikációt igénylő szennyezés még
előfordulhat.

101
 Tanulságos megismerni az 1 tonna alapanyagból előállítható etanol mennyiségét.
Cukornád 70 liter Nyárfa 160 liter
Répagyökér 95 liter Burgonya 100 liter
Melasz 280 liter Kukorica 370 liter
Az 1 hektáron termelhető alapanyag és a belőle nyerhető alkohol mennyiségét
Átlag Kiemelkedő Átlag Kiemelkedő
Cukornád 60 tonna 12,5 tonna 4200 liter 8750 liter
Cukorrépa 30 tonna 56 tonna 2850 liter 5320 liter
Nyárfa 15 tonna 30 tonna 2700 liter 5400 liter
Kukorica 5 tonna 7 tonna 1850 liter 2590 liter
A teljesség kedvéért az alapanyag előállítás energia igényét is számításba kell venni
Cukornád Brazilia 16 GJ/ha 4,0 MJ/kg etanol
Cukorrépa Új-Zéland 16 GJ/ha 5,3 MJ/kg etanol
Kukorica USA 21,8 GJ/ha 12,3 MJ/kg etanol
Az ipari szesztermelés jelentős hányada ma a gabonafélék szénhidrát tartalmának a
hasznosításával készül. A keményítő savas hidrolízise ugyan könnyen kivitelezhető, azonban
toxikus melléktermékek (levulinsav, 5-hidroxmetilfurfurol, hangyasav) képződnek. A sav
koncentráció optimálásával és a hőmérséklet megválasztásával javítani lehet a helyzeten,
mégis az utóbbi időben az enzimes bontást alkalmazzák világszerte.
α-AMILÁZ (α-1,4-glukan-4-glukano hidroláz) random bontja a keményítő α-1,4
kötéseit. A mikroorganizmusokban előforduló 60 kd méretű enzim nem bontja az α-1,6
kötést, de az α-1,6 kötés szomszédságában levő α-1,4 kötést sem. Ezért a reakció termékben
jelentős mennyiségben fordulnak elő oligomerek. Az Aspergillus oryzae által termelt enzim
például keményítőből 4 % glükózt, 56 % maltózt, 28 % maltotriózt és egyéb oligoszacharidot
tartalmazó maltóz szirupot készít:
β-AMILÁZ (α-1,4-glukán maltohidroláz) a Bacillus genusban előforduló enzim a
keményítő redukáló végén kezdve maltóz egységeket hasít le. Nem bontja az 1,6 kötéseket.
GLUKOAMILÁZ. Széles spektrumú, a poliszacharid nem redukáló végétől indulva az
1,3, 1,4, és 1,6 kötéseket bontja. Főleg gombákban Aspergillus awamori, Aspergillus niger,
Rhizopus fajokban fordul elő. Keményítőből 97 % glükózt, 1,5 % maltozt és valamennyi
egyéb oligoszacharidot tartalmazó elegyet készít. Az α-amiláz jelenléte gyorsítja a reakciót,
fokozza az eljárás teljesítményét.
A fenti enzimek keveréke jó hatásfokkal, de az egyes növényfajokból származó
keményítőt eltérő sebességgel glükózig bontja. A gabonakeményítő például könnyebben
bontható, mint a burgonyakeményítő. Sok helyen a kukorica teljes feldolgozására törekedve
az egyes termékek, például csíraolaj, áztatólé, keményítő, glükózszörp, izomeróz stb. árában
jelentkező gazdasági haszon javítja az alkohol termelői árának alakulását. Jelentős javulás
várható az alapanyag keményítő, cellulóz, hemicellulóz, fehérje, lipid, nukleinsav és
hamutartalmának ismeretében, a növényi maradék fermentálhatóvá alakításától.

<Cellulózt bontó mikroszervezetek természetes élőhelyükről különleges dúsító eljárással

izolálhatók. Ilyen dúsító táptalaj összetétele lehet 100 ml desztillált vízben oldva 0.1 g NaNO3;
0.1g K2HPO4; 0.03g KCl; 0.05g MgSO4.7H2O; 0.05 g élesztőkivonat; 0.05g pepton; 1 g
Macherey Nagel 300-as kristályos cellulózpor; 2 g agar-agar A mikroelem igény kiegészítése
céljából 0.1 ml baktérium mentesre szűrt nyomelem oldat adagolása (1000 ml desztillált vízben
oldva 100mg MnCl2.4H2O; 100mg CoCl2; 10mg CuSO4; 10mg Na2MoO4.2H2O; 20mg ZnCl2;
5mg LiCl; 5mg SnCl2.2H2O; 10mg H3BO3; 20mg KBr; 8mg NaFe3+-trihidrát) szükséges. Ha a
tenyésztést 44–60°C tartományban végezzük, akkor a cellulózt hasznosító törzsek kiemelésére
van lehetőség. A 8-10 nap után izolálható telepek közül hatásos törzsek izolálhatók. Ezek

102
tisztasága többszöri hígítás után karboximetil-cellulózt tartalmazó táptalajra szélesztve
igazolható. A telep körül képződő kráter a CMC bontó aktivitásról tudósít.>

Nem hagyható figyelmen kívül, hogy az oligomerből illetve a polimerből felszabaduló

monomer az egyensúlyi állapot eléréséig változtatja szerkezetét
Az anomerek átalakulása spontán folyamat, amiről a forgatóképesség változása informál

[a]20D= +112.2°, α-D-glükopiranóz β-D-glükopiranóz [a]20D= +18.7°.

A vízben oldott monomer forgatóképessége folyamatosan változik, amíg el nem éri az

egyensúlyi állapot (1/3 α-D-glükóz <> 2/3 β-D-glükóz) adta értéket, a + 52.7°-ot a dextróz
(jobbra) forgató képességét. A hidrolízist követő anomerizáció határozza meg a
reakcióképességet. Az enzim az egyik anomert kedveli.

103
 A CIKLODEXTRIN BIOLÓGIÁJA
A piacképes β-ciklodextrin apoláros belső teret kialakító hét glükopiranóz egységet
tartalmazó gyürűs vegyület, amelynek vizoldhatósága a külső felületén elhelyezkedő hidroxil
csoportok következménye. Ez a termék, különböző apoláros vegyületek, gyógyszerek vizes
rendszerbe juttatására alkalmas. Ebből következően, mint metabolizálódó csomagoló anyag
hasznosítható. A vegyület a 70 kd méretű ciklodextrinogenáz aktivitását hasznosítva állítható
elő keményítőből. — Schardinger a XX. század első éveiben észlelte, hogy egy Bacillus
macerans törzs, keményítőt tartalmazó táptalajon nem-redukáló kristályos anyagot állít elő.
A szakirodalom a felfedező iránti tiszteletből Schardinger dextrinként említette. (Zentr. Bact.
Parasiten. 1905.14:172-81; 1911.29:188-97) — E vegyületek komplexképző tulajdonságára
Pringsheim hivta fel a figyelmet (Ber. Deut. Chem. Ges. 1912.45:2533-46; 1913.46:2659-74;
1914.47:2565-72)— A harmincas évek közepén Freudenberg és munkatársai vizsgálták
részletesen a fenti komplexképző vegyületek szerkezetét. Kiderült, hogy hat, hét és nyolc
glükopiranoz egységet tartalmazó gyürük, amelyet a görög α, β, γ, betüivel jelöltek. (Ann.
Chemie. 1935.518:102-108).

A ciklodextrinek képződését katalizáló enzimek vizsgálatával Tilden és Hudson a negyvenes

évek elején foglalkoztak (J. Bact. 1942.43:527-44). — A hatvanas években DePinto

104
részletesen vizsgálva a Bacillus macerans enzimkészletét a ciklodextrinogenázon kívül egy
intracelluláris ciklodextrináz aktivitását is kimutatta. (Science 1964.146:1064-66) — A
hetvenes években japán kutatók – Horikoshi és munkatársai – ciklodextrin-glükozil-
transzferázt termelő alkalofil baktériumokat izoláltak (Agr. Biol. Chem 1971. 35:1783-91).
Kitahata és munkatársai pedig részletesen összehasonlították a Bacillus macerans és a
Bacillus megaterium enzimkészletét (Agr. Biol. Chem. 1974. 38:387-93).
A ciklodextrin- (CD) alapú, nem kovalens molekulakomplexek a 70-es évek közepétől
indultak el a tudományos érdekességek világából a gyakorlati
alkalmazás, a termékfejlesztés irányába. A CD-technológia
nemzetközileg elismert úttörője és irányitója Szejtli József volt,
így a téma igazi hungarikumnak számít. Ennek bizonyítéka az
is, hogy a ciklodextrineket 100 kg-os léptékben, a világpiacot
megelőzve, már a 80-as években gyártották a Chinoinban.
A CD-molekulák különleges sajátossága, hogy
hossztengelyük mentén mindkét végén nyitott üreggel
rendelkeznek. Ezekbe az üregekbe alifás molekulák, két-három
aromás gyűrűből álló szerkezetek részben vagy egészben
beleférnek. A glükózegységek konformációja következtében a
CD-molekula amfifil jelleget mutat: a CD-k üregét bélelő
glikozidos oxigénatomok és hidrogének miatt a molekula belső
felszíne apoláris sajátságú, ám a külső felszínen lévő hidroxilcsoportok kívülről polárissá
teszik (J. Szejtli, Cyclodextrin Technology, Kluwer Acad. Publ., 1988.). A ciklodextrinek
funkcionális jellemző tulajdonsága a zárványkomplex-
képzés. A CD-k képesek magukba zárni a víznél
kevésbé poláris, geometriailag az adott üregnek
megfelelő méretű ún. vendégmolekulákat, melyek
lehetnek gyógyszerek, aromák, színezékek, növényvédő
szerek, illatanyagok stb. A CD-zárvány-komplexek
képződésekor az üregnek megfelelő méretű, apoláris
vendégmolekulák és a CD-gazdamolekula között nem
kovalens másodlagos kölcsönhatás lép fel. A képződött
komplexben a bezárt vendégmolekula időlegesen, a
körülményektől függő mértékben, átmenetileg
megváltoztatja fizikai és kémiai sajátságait.
1975–2005 között a fejlesztés iránya a
CD-k komplexképző segédanyag-
funkcióinak feltárása volt. Ekkor
derítették ki, hogy alkalmazhatók
oldékonyság-fokozó, hatóanyag-
stabilizáló diszpergálószerként.— A
kezdeti 30 év alatt a gyógyszeripari
alkalmazások eredménye: 40 piacra vitt
sikeres készitmény (K. H. Frömming, J.
Szejtli, Cyclodextrins in Pharmacy,
Kluwer Acad. Publ., 1994.).
Az üres alfa-ciklodextrinek
kölcsönhatásba lépnek a zsírsavakkal,
mint.zsírsav komplexáló szerek…. A bezárt zsírsav nem disszociál, szinte vizoldhatatlanná
válik. Egy-egy αCD üreg 5-6 darab CH2- csoportot képes fedni. Folyamatos fogyasztása
csökkenti a zsírfelszívódást. — Az ábrán bemutatott esetben 180 napon keresztül napi 3g alfa-

105
ciklodextrin fogyasztása mellett a szérumtriglicerid tartalom 46%-kal, a testttömeg 10%-kal
cskkent.

Letális toxint termelő mikroorganizmus elleni küzdelem

Tankönyvi adatként ismerve a Bacillus anthracis, a lépfene kórokozójának támadási
mechanizmusát jól tudott, hogy a protektív antigén heptamerje ül a sejtmembránban
pórusként. A lépfene kórokozója egy
letális (LF) faktort és egy edema
(EF) faktort választ ki, amelyek ezen
heptamer póruson jutnak a sejtbe.
Újszerű védekezés lehetősége nyílik
meg a bakteriális toxinok ellen,
mivel egy kémiailag pontosan
hangolt CD, a heptakis per-6-[3-
aminopropilthio]-β--CD 0.2 nM
koncentrációban, az Anthrax porusba
illeszkedve gátolja az LF sejtbe
jutását. (Karginov et al. PNAS 2005
102.42 15075) A kémiailag
módosított ciklodextrin a giráz
működését gátló ciprofloxacin
hatását potencírozva javítja a
gazdaszervezet túlélési lehetőségét.

106
A giráz működáse nem csak a sejt osztódása, azaz a DNS állomány megkettőződése
szempontjából életfontosságú, de a sejt életműködése mRNS képződése szempontjából is
nélkülözhetetlen, nem helyettesíthető tevékenység. A kettős szálú DNS a helykihasználás
céljából nyugvó állapotban szuperhélix formában, kettősen feltekeredve alkotja a
maganyagot. Ebből következően a szuperhelix a DNS replikáció illetve az mRNS képződés
előtt az információ kezdőpontjánál fellazítandó, majd átmenetilag felhasítandó, végül újra
összekapcsolandó az információt hordozó kettős szálú nukleinsav. Ezt a bonyolult folyamatot
katalizálja a négy alegységből szerveződött DNS-giráz enzim-komplex, amely az igénynek
megfelelően, a szuperfeltekeredett DNS-re kapcsolódva indítja a folyamatot. Mivel az
összekapcsoláshoz szükséges energiát a magnézium jelenlétét igénylő ATP hidrolízis
szolgáltatja, nem kétséges, hogy a Mg++ hiánya a folyamatot markánsan gátolja. — 1962-ben
észlelték a nalidixsav giráz-enzim működését gátló hatását. Az alapvegyület sokoldalúan
fejlesztett változatai közül a ciprofloxacinnak nevezett széles spektrumú magnéziumot kötő,
fluórtartalmú kinolonkarbonsav származék bizonyult a leghatásosabbnak.

A giráz enzimkomplex működésének gátlása mint látjuk a mikroszervezetek szaporodását

akadályozza. Bonyolitja a helyzetet, ha a kórokzó letális toxint is termel. Jó példa erre a
Bacillus anthracis okozta kóreset.

107
 A CIKLODEXTRIN ELŐÁLLÍTÁS TECHNOLÓGIAI KÖRÜLMÉNYEI
A Schardinger által vizsgált Bacillus macerans törzs erősen fénytörő ellipszoid endospórát
képez. Húslevest és keményítőt tartalmazó
táptalajon 38 C°-on már a második napon
megindul a spórázás, ami a negyedik napra
a sejtek teljes lízisével fejeződik be.
Alacsonyabb hőmérsékleten, például 28
C°-on tenyésztve nem következik be a
spórásodás. A tenyészet spórásodásával
együttjáró lízis bekövetkeztekor jelenik
meg a tenyészet szűrletében a ciklodextrin
képződést katalizáló ciklodextrinogenáz,
miközben amiláz aktivitást a sejtmentes
felüluszóban ekkor sem lehet kimutatni.
Optimális tápközeg: 5% zabpehely, 0,4%
ammoniumszulfát, 0,2% káliumfoszfát, 1% kálciumkarbonát, 6,8 pH A kezdetben viszkózus
állományú tápközeg a tenyészet növekedése közben felhigul. A membránhoz kötött
amilolitikus aktivitás hatására - redukáló termék megjelenése nélkül - a keményítőből
felszabaduló szénhidrát a sejt belső terében foszforilezve hasznosul. A sűlyesztett fermentáció
lefutását bemutató ábrán jól követhető, hogy a növekedés befejeztével jelenik meg a
ciklodextrinogenáz aktivitás hasznos terméke, a ciklodextrin, a CD. Az élősejtszám nem
csökken, mert a vegetatív sejtek életképes spórává alakulnak, amit igazol a légzési aktivitás
csökkenése. A fejlődés korai szakaszában a tápközeg glükóz tartalma katabolikusan
represszálja a sejtmembránhoz kötött amilolitikus aktivitást hordozó fehérjék kiszakadását. A
növekedési szakaszban a glükóz akadályozza a ciklodextrinogenáz aktivitás megjelenését.
Ezzel szemben a spórásodási szakaszban adagolt glükózzal a ciklodextrinogenáz képződését
nem lehet represszálni. A spórázó tenyészethez adagolt fehérjeszintézist gátló kloromycetin
(klóramfenikol) sem gátolja a ciklodextrinogenáz megjelenését. Ez azt sugallja, hogy az
enzimaktivitás megjelenése nem de novo fehérjeszintézis eredménye, hanem a növekedési
szakaszban képződő és a sejtmembránhoz kötve működő amilolitikus enzim válik szabaddá a
sejtlízis következményeként. A membránból kiszakadó enzim szerkezete általában
megváltozik a membránba rögzítő hidrofob szakasz lehasadása miatt. Esetünkben ez a
hidrofob, apoláros szakasz nem hasad le, hanem a transzglikozilezés irányába érvényesíti a
hidrolitikus hatást. Ezt az aktivitást ciklodextrin-glükozil-transzferáz néven írták le japán
kutatók.
A keményítő molekula natív állapotban egy balmenetű csavarra emlékeztető csőnek
fogható fel, amelynek belső ürege apoláros természetű. Ez abból következik, hogy a 4-es
szénatomhoz kapcsolódó ekvatoriális hidroxil és a következő glükóz molekula egyes
szénatomjának axiális hidroxilja között alakul ki a glikozidos kötés. Amit a kettes és hármas
szénatomokhoz kapcsolódó hidrogénhíd tovább merevít. Ez a szerkezet marad meg a
ciklodextrin képződéskor. A gyürű külső oldalán elhelyezkedő hatos szénatom hidroxil
csoportja jelenti a hidrofil jelleget a belső apoláros üreggel szemben. A reverzibilisen működő
ciklodextrinogenáz apoláros karakterű fehérjelánca a keményítő-csőben elhelyezkedve úgy
orientálja az aktív centrumot, hogy a glikozidos kötés bontásakor a helikális szerkezet miatt
térközelben levő láncvégi glükóz molekulával kapcsolva az eredetihez hasonló természetű
glikozidos kötést alakít ki. — A ciklodextrin feldúsulása esetén az enzim apoláros szakaszán
nagy gyakorisággal a reakciótermék helyezkedik el, megakadályozva ezzel az enzim
kapcsolatát természetes szubsztrátumával, a keményítővel.
A biotechnológiai folyamatok irányításához megfelelő analitikai módszerek
kidolgozása szűkséges, ami ez esetben nehezen teljesíthető. A Kitahata által használt módszer

108
azon a feltételezésen alapul, hogy a ciklodextrinogenázt termelő mikróbák tenyészlevében
amiláz aktivitás nem jelenik meg. A reakcióelegybe juttatott keményítő fogyása, a keményítő-
jód komplex színelnyelésének csökkenése a képződő ciklodextrinnel arányos. Az eredmény
értékelését megkönnyíti a Tilden és Hudson módszerként ismert eljárás alkalmazása. Eszerint
0.5 ml enzimoldatot 1 ml 3%-os keményítő oldattal inkubálnak, majd az időnként kivett 3
csepp mintához 1 csepp káliumjodidos-jód oldatot /0,1 M KJ oldatban 0.1 n J2/ adva
mikroszkóppal megfigyelhető a ciklodextrin-jódkomplex hexagonális kristályainak
megjelenése.
Négy-öt napos, spóratömeggé alakult tenyészet szűrletéből a ciklodextrinogenáz
aktivitás jelentős részét hődenaturált /120°C-on 20 percig kezelve/ keményítőszemcsékre
adszorbeálva, szelektíven lehet kinyerni. A tenyészlé szűrletéhez 5% denaturált keményítőt
adva 4°C-on 20 percig keverve a felülúszóban aktivitás nem mutatható ki. A kiszűrt
keményítő szemcsékről 40°C-on desztillált vízzel leoldható az enzim, amely fagyasztva
szárítva aktivitásvesztés nélkül tárolható. — A 70 kd méretű enzim 5.5 pH-n 40°C-on
műküdik maximális aktivitással.
xxxxxxxxxxxxx
2005-től napjainkig a ciklodextrinek újabb érdekes funkcionális sajátságait fedezték fel.
Felismerték a membrán-aktív CD-származékok alkalmazásának kedvező gyógyászati hatását.
A membrán-CD kölcsönhatások molekuláris mechanizmusának felderítése új utat nyitott a
multidrug-rezisztencia feloldása felé. Kiderült, hogy egyes ciklodextrinek bejutnak az élő
sejtbe, tehát az intracelluláris anyagtranszportban is alkalmazhatók, sőt a vér-agy gáton
történő anyagtranszport lehetőségét is igazolták.

Oldékonyságfokozó ciklodextrinszármazékok
A lipofil anyagok vízoldékonyságának
fokozására ez idáig két általánosan
engedélyezett CD-származékot használunk [J.
Pitha, J. Pharm. Sci. (1985) 74, 9, 987–990.].
A 2-hidroxipropil-béta-CD (HPBCD) az
Egyesült Államok és az Európai Unió
gyógyszerkönyveiben is hivatalos. Az anyag
kompozit izomerkeverék, mely így nem
kristályosodó, amorf alakban kiváló oldószer.
— Az anionos – szintén izomerkeverék –
szulfobutiléter-béta-ciklodextrin (SBEBCD)
az Egyesült Államokban forgalmazott
injektábilis formulációk általános
szolubilizálószere. (R. Rajewski et al., J.
Pharm. Sci. (1995) 84, 8, 927–932.)

Kozmetikai, élelmiszeripari és háztartás-

vegyipari alkalmazások A CD-k legnagyobb
mennyiségben történő alkalmazása éppen ezen
a területen valósult meg. (2009-ben 7 ezer
tonnát használtak fel.) A cél itt is a CD-k molekuláris kapszulaként történő alkalmazása
(parfüm-, aromastabilizálás, lipidek, instant italok szolubilizálása) (L. Szente, J. Szejtli,
Trends in Food Sci. Technol. (2004) 15, 3–4, 137–142.)

109
Analitikai alkalmazások A CD-k az analitikai kémia szinte minden területén alkalmazhatók,
a legelterjedtebben mégis az enantiomerek elválasztásában használják őket. A királis CD-
üregek segítségével mind álló, mind mozgó fázisú elválasztások végezhetők. Az eddig ismert
44 500 ciklodextrin tárgyú közleményből 2800 cikk szól a CD-alapú királis elválasztásokról.
Ma a világon legalább húszféle CD-alapú terméket forgalmaznak királis elválasztásokra (Zs.
Bikadi et al., Current Drug Disc. Technol. (2007) 4, 282–294.)

Az elmúlt 35 év meglepetései: Meglepő módon a koleszterinaffinitást mutató CD-k

megváltoztatják a lipidöszszetételt az élő sejtek lipiddús membránszakaszain, befolyásolják a
membrán fluiditását, a membránfehérjék működését (K. Kamau et al., In vitro Cell. and Dev.
Biol. Animal.2005. 41, 7, 207–216.) További meglepetés az a felismerés, hogy a HPBCD és a
metil-CD-k hatékonyan gátolják a HIV-vírus fertőzőképességét. Ma klinikai fázisban van egy
ilyen, HPBCD-t tartalmazó antivirális szer fejlesztése (Z. Liao et al., AIDS Res. Human
Retroviruses 2001. 17, 11, 1009–1019.)— Váratlan siker lett egy kémiailag pontosan
módositott CD önmagában mutatott erős farmakológiai hatása, mely forradalmasította a
klinikai aneszteziológiát. A Sugammadex/Bridion® felfedezése a tökéletes gazda–vendég
komplexképzés gyakorlati alkalmazhatóságának szép példája és a CD-kémia legjelentősebb
felfedezése (M. Naguib, Anesthesia and Analgesia (2007) 104, 3, 575–581.)— Szintén az
üres CD-nanoüreg érzékeny felismerőképességén alapul egy meglepő DNS-diagnosztikai
lehetőség. (J. Clarke et al., Nature Nanotechnology 2009- 4, 4, 265–270.) Automatizálható,
specifikus, érzékeny DNS-szenzor fejlesztése folyik az Oxfordi Egyetemen pórusképző
fehérjébe ültetett CD-származékkal.

ÖSSZEGEZVE elmondható, hogy az elmúlt 35 év alatt a ciklodextrin technológia a modern

ipar szinte minden területén talált gyakorlati alkalmazást. Eddig 45 gyógyszer, kb. ezer
élelmiszeripari- kozmetikai- és háztartásvegyipari termék szolgálja az emberiség egészségét,
kényelmét. Az 1975-ben, Szejtli József által kezdeményezett és évtizedekig „vezényelt” CD
technológia napjaink tankönyvi tétele. A munkásságunk kezdetekor néhány grammos szintű,
kétes jövőjű anyagokból ma évi 12-14 ezer tonnát használnak fel. A CD-k tudományos
publikációs dinamikája is töretlen, jelenleg 44.500 CD-tárgyú közlést tartunk nyilván,
melyben a magyar kutatók hozzájárulása igen jelentős.— Tán emiatt tartják még 35 év után is
a magyar CD kutatást és a Szente Lajos vezette CycloLab-ot a világ ciklodextrin technológiai
központjának. [Ciklodextrin Kutató Fejlesztő Laboratórium Kft ]

110
 KÖRNYEZETET SZENNYEZŐ ANYAGOK BIOLÓGIAI HASZNOSÍTÁSA
A szerves anyagok anaerob lebontása évmilliárdok óta nélkülözhetetlen részfolyamata a Föld
felszín anyagforgalmának. A tudomány ezzel az érdekes és még ma is sok nyitott kérdést
tartalmazó problémakörrel a tavak fenekén felszaporodó üledék rothadási folyamatainak
vizsgálatakor, a tőzegmocsarak különleges biológiai jelenségeinek vagy a kérődzők bendőjében
végbemenő átalakulásoknak a magyarázatakor találkozott.
A szemétgödrökben, illetve trágyatárolókban folyó anaerob folyamatok alapjelenségei
hosszú ideig senkit sem érdekeltek, annak ellenére, hogy ugyanakkor a jelenség gyakorlati
hasznát közösen élvezte az emberiség. Amikor Franciaországban Louis H. Mouras de Vesoul
1860-ban zárt emésztőgödröt épített a birtokán, valószínűleg csak a kellemetlen illatanyagok ki-
szabadulását akarta megakadályozni. Később az emésztőgödörben végbemenő folyamatot
figyelve megállapította, hogy a szilárd növényi hulladékok egy idő után teljesen elfolyósodnak.
A képződő gáz (biogáz) hasznosítására azonban nem gondolt. Az irodalmi adatok szerint először
1895-ben Donald Cameron használta a kiáramló gázelegyet fűtőanyagként. Az Exeter-ben épí-
tett, nagy emésztőtartályai körül ezzel a gázzal világítottak.
A század első felében a szennyvíztisztítást energiaigényes aerob módszerrel próbálták
megoldani. Az eljárás valójában a biológiailag eloxidálható szervesanyag-tartalom (AOX)
lebontásához szükséges levegő mennyiségének a meghatározására szolgáló analitikai módszer
megnövelt méretű változatának tekinthető. A szennyvizet ugyanis a szervesanyag-tartalmának a
biológiai lebontásához szükséges oxigén mennyiségével lehet minősíteni. Az aerob bomlást
elősegítő levegőztetés azonban nagy felületet és nem kevés energiát igényelt.

A levegőztetett szakasz után elhelyezett ülepítő medencék biológiai folyamatait nem vizsgálták.

A felhasznált felület csökkentése és a levegőbuborékok oxigén tartalmának jobb kihasználása

érdekében 30 méternél magasabb toronyreaktorokat építve igyekeztek gazdaságosabbá tenni az

111
eljárást. Megfelelő fúvókák alkalmazásával a 8-10%-os oxigén kihasználás 40-60%-ra emelhető
A túlfolyó tölcsérben felgyűlő biomassza egy részét szükség esetén visszavezetik a kezelőtérbe.

Az aerob szennyvíz tisztítónak — a beruházási költségen túl — jelentős az energiaigénye, a

közösséget terhelő költségigénye. Tovább fokozható a tisztítás hatásfoka tiszta oxigén
bevitelével. — Ugrásszerű fejlődést hozott a hetvenes években jelentkező energiakrízis. A
nyersolaj árának emelkedése. a szakemberek figyelmét az energetikailag kedvezőbb anaerob
módszerekre irányította. Az aerob eljárással történő tisztításkor a szennyvíz eloxidálható
széntartalmának 45 %-a széndioxid alakjában távozik; a bevitt anyag fele a szennyvíziszapban
dúsul fel (ez később elégethető); 5 % pedig az elfolyó tisztított vízben marad oldva. Anaerob
módszerrel viszont ugyanebből a szennyvízből a metabolizálható széntartalom 80 %-a metán és
széndioxid formájában gázfázisba vihető, miközben a szennyvíziszapban l0 %, az elfolyó
tisztított vízben ugyancsak l0 % széntartalom van jelen. Ez utóbbi érték közel felére
csökkenthető, ha az anaerob rendszer után egy kisméretű aerob reaktort működtetünk.

Az anaerob reaktorból távozó biogáz összetételét a szennyvíz kémiai összetétele jelentős

mértékben befolyásolja: Szénhidrátból 50 % metán és ugyanennyi széndioxid képződik. A
fehérje tartalmú szennyvízből képződő széndioxid és metán aránya 3:7, de jelentős az
ammóniaképződés. Lipidekből 67 % metántartalom mellett 33 % széndioxid képződik.
Természetesen különböző technológiai fogásokkal - hidrogén bevitellel vagy a széndioxid és
az ammónia eltávolításával - a gázelegy (biogáz) metántartalma lényegesen növelhető. A
gazdasági haszon számottevő, hiszen a hexóz aerob lebontásakor 2803 kJ/mol energiát
szolgáltat, anaerob körülmények között viszont mindössze l32 kJ/mol szabadul fel. A
különbség jelentős hányadát a fűtőanyagként használható metán tartalmazza. A
szeméttelepeken folyó metánképződésről Jones és Owen már 1934-ben beszámolt. Az
energiabőség miatt azonban erre a felfedezésre senki sem figyelt fel. Csupán a 60-as években
kezdtek német és amerikai mérnökök e felismerés gyakorlati hasznosításával foglalkozni. Az
első gáztermelő üzem a Palos Verdes Landfillnél 1975-ben indult. A szeméttelepről nyert gázt
elektromos energia termelésére hasznosították. Ezt követőleg egyre több hasonló üzem épült
szerte a világon. Egy1988-ban megjelent statisztikai adat szerint addig 15 országban 146
üzem kezdte meg a működését. Az így nyert gáz általában 55 % metánt tartalmazott. A
termelt gáz mennyisége évenként 825.000 tonna szénnel egyenértékű fűtő teljesítményt jelent.
A metánképződést mint általános jelenséget a Föld különböző pontjain végzett vizsgálatok
igazolják. A mérhető csekély koncentráció ellenére a Föld évi metántermelése meghaladja a
gigatonna mértéket. Ez a metánmennyiség különböző mikroorganizmusok egymást segítő és
kiegészítő tevékenységének eredményeként kerül a légkörbe. A szerves anyagból folyó
biológiai metánképződés négy, biokémiailag jól megkülönböztethető szakaszra osztható,
mivel az egyes szakaszok mikroflórája számára az optimális fizikai-kémiai körülmények
jelentős mértékben eltérnek.

Az első lépésben nagyméretű szerves molekulák, polimerek, fehérjék, poliszacharidok

lebontása folyik. Ezt a feladatot különböző mikroaerofil és fakultatív anaerob szervezetek
extracelluláris enzimei végzik nagyon hatásosan.

A második lépésben nagyobb molekulák lebontása folyik, miközben C-1 töredékek,

szerves savak, alkoholok, széndioxid és hidrogén képződik. Ezt a szakaszt a reakcióelegy
savanyodása miatt acidogén fázisnak nevezik. Az itt működő gyors növekedésű mikrobák ezt
a savanyodást jól tűrik.

112
 A harmadik lépésben a fenti vegyületekből a szerves savak és alkoholok
továbbalakulása közben főleg ecetsav képződik. Acetogén fázisnek nevezik ezt a szakaszt
(Acetil-S-CoA), mert mikrobiális úton ecetsav képződhet közvetlenül széndioxidból és
hidrogénből is.

A befejező szakasz a metánképződés, amely molekulánként legalább egy ATP

képződésével jár. Ebben a fázisban az ecetsav, valamint a C-1 töredékek: metanol,
formaldehid, formiát, metilamin szolgáltatják az alapanyagot a metánképződéshez, de a jelen-
levő széndioxid és hidrogén is metánná alakul. Innen származik a metanogén fázis elnevezés.
A négy szakasz természetes körülmények között térbelileg nem különül el, ezért a
metánképződés sohasem éri el a célüzemekben, illetve laboratóriumokban megvalósítható
teljesítményt. Itt ugyanis a négy szakaszt térben elkülönítve, két reaktorban folytatják le, ami
az optimális rekciókörülmények biztosítását lehetővé teszi. Az ősbaktériumok és az
eubaktériumok biokémiai és élettani különbségeit ismerve nem csodálkozhatunk azon, hogy
az anaerob szennyvíztisztítás technológiájának kialakításakor a két szakasz térbeli
szétválasztására törekedtek. Ezzel a lebontandó szerves anyag összetételétől többé-kevésbbé
függetlenné vált a metánképződés. A rendszert tovább fejlesztve a lassan szaporodó
metanogének porózus üveggyűrűre rögzítésével olyan sejttömeget lehet a biogázt termelő
reaktorban felhalmozni, amely a térfogategységre vonatkoztatott aktivitást a gazdaságosság
szintjére emeli. A képződő metán a rendszer működtetéséhez szükséges energiaigényt bőven
fedezi.

Az első reaktorban egymás tevékenységét segítő mikroaerofil, fakultatív anaerob és szigorúan

anaerob baktériumk konzorciuma működik. Ezek széles pH tartományban képesek osztódni,
mégpedig a baktériumokra jellemző 30 perces generációs idővel. Zömmel mezofilek, optimális
hőmérsékletük 35 oC. A jelenlevő oxigéntűrő szervezetek rövid idő alatt felhasználják a
kezdetben jelenlevő oxigén nyomait is. Az első reaktor konzorciuma a nagy molekulák
(polimerek) hidrolízisét, szerves savak, alkoholok akár C-1 töredékekig való lebomlását,
széndioxid és hidrogén képződését teszi lehetővé. Ezzel előkészítik a fermentációs
körülményeket az acetogén és metanogén fázis számára.

A hidrogén az anaerob, illetve fakultatív anaerob szervezetekben folyó fermentáció

végtermékeként jelenik meg. Fontos szerepet kap a bélbaktériumokban működő hangyasav de-
hidrogenáz és a piruvát-formiát liáz

H3C-CO-COOH + CoA-SH —> acetil-S-CoA + HCOOH

HCOOH —> H2 + CO2

A Clostridium-okban a foszforoklasztikus reakciót segíti a ferredoxin hidrogenáz

ferredoxin-hidrogenáz
piruvát + szervetlen-foszfát ———————————> acetilfoszfát + H2 + CO2
ox
red ferredoxin

A Clostridiumon kívül hidrogént termelnek még többek között az Eubacterium, a Peptococcus

és az Aerobacter fajok. Az itt tevékenykedő mikroorganizmusok gyorsan szaporodva hatásosan
képesek alkalmazkodni a szubsztrátum minőségében bekövetkező változáshoz. Ezt az
alkalmazkodóképességet a technológiai paraméterek szabályozásával segíteni lehet. Nyilvánvaló,
hogy a szennyvíz kémiai összetételének állandó volta nagy mértékben képes fokozni a rendszer

113
működésének biztonságát és gazdaságosságát. Ezért ezeket a szennyező anyagra optimalizált
technológia szerint működő reaktorokat közvetlenül a szennyvizet termelő üzem mellé telepítik,
és ezzel a kommunális szennyvíztisztító berendezéseket tehermentesítik.

A vázlatrajzon követhetően az Uhde/Schwarting anaerob szennyvíztisztító eljárás egy

fakultatív anaerob mikroorganizmusok hatásos savanyító tevékenységét biztosító BO1 jelű
fermentorban bontja le a szennyvíz szervesanyagtartalmát. A fermentlé hőmérsékletét 35 °C-
on tartja a beépített WTO1 hőcserélő, amelynek hatásfokát a TIC szabályzó ellenőrzése alatt
működő VO2 szelep befolyásolja. Az optimális pH (4,5-5,5) beállítását az LI szabályzó végzi.
A szennyvíz betáplálása a PO1 szivattyú feladata.

A fermentlé a VO1 szelep állásától függő ütembe kerül át az obligát anaerob ősbaktériumokat
foglalkoztató BO2 fermentorba, amelynek optimális hőmérsékletét (55 °C) a VO3 szelep által
ellenőrzött WTO3 hőcserélő állítja. A második reaktorban az ősbaktériumok az előbbiből
származó elegyet ecetsavvá, végül pedig metánná és széndioxiddá alakítják. Az acetogén és a
metanogén funkciót végző szigorúan anaerob, termofil baktériumok közössége különleges tu-
lajdonságú, lassú növekedésű fajokból áll össze. A generációs idő harminc órától harminc napig
változhat, amit az itt működő (Archaeobacteria) baktériumfajok biológiai tulajdonságai
határoznak meg. Legismertebb rendszertani csoportként a Methanobacteriales rend említhető. A
rendszer optimalizálásával és egy kisméretű aerob utóreaktor működtetésével, a tisztított
szennyvíz az üzemen belül újra felhasználhatóvá válik. A tisztítás hatásfokának látványos
bizonyítékaként Japánban aranyhalakat tenyésztenek a tisztított szennyvízben. A két fermentor
között szűkség esetén a PO2 szivattyú teremt kapcsolatot, amely a perforált lemezzel
szétválasztott BO3 fermentorból nyert sejtmentes lével képes higítani a BO1 fermentor
tartalmát. A BO2 fermentorban képződő tisztított szennyvíz a WTO2 hőcserélőn keresztül
hagyja el a rendszert, amely a BO1-ből a BO2 fermentorba átfolyó fermentlevet előmelegíti.
Mindkét fermentorból a komposztálásra kerülő leülepedő mikroorganizmusokat egy-egy
csavarszivattyú távolítja el. A fermentorokban képződő biogáz metántartalma gázmotor
működtetésével megtermeli a rendszer működtetéséhez szűkséges elektromos energiát.
Mindkét fermentorból a kiülepedő, komposztálandó mikroorganizmusokat egy-egy
csavarszivattyú távolítja el.

114
A tápanyagokként hasznosuló nitrogéntartalmú vegyületek lebontása - a sejt anyagainak
felépítéséhez szükséges szerves nitrogénigényen felül - jelentős ammóniaképződéssel jár. Ezért a
biogázban a lebontandó szerves anyag összetételétől függően mindig találunk több-kevesebb
ammóniát.
Ammóniában dús szennyvíz tisztítása erre a célra kialakított nirtrifikációt és denitrifikációt végző
sorba kapcsolt egységek működtetését igényli.
A nitrifikáció során aerob körülmények között a Nitrosomonas törzsek az ammóniát nitritig, a
Nitrobacter nemzetség pedig tovább nitrátig oxidálja.

NH4+ + 1,5 O2 2 H+ + H2O + NO2– ∆H = –301-től –352 kJ

NO2- + 0,5 O2 NO3 – ∆H = –65 –től – 88 kJ

Anaerob körülmények között a két faj asszociátuma egymást segítve a nitrátlégzés terhére végzi
az ammónia oxidációját

5 NH3 + 3 NO3– 4 N2 +9 H2O + 2 H+ G° = –1483 kJ

Ammóniában gazdag szennyvíz denirifikálását végzõ eljárás folyamatábrája

A denitrifikáció szigorúan anaerob körülményeket igényeL. Elektronforrásként a szennyvíz

dehidrogénezhető szénforrása szolgál. A folyamatábrán metanol szerepel oxidálható
szubsztrátumként

NO3– + 6H+ + 5 e– 0,5N2 + 3 H2O NO3– + 0,33 CH3OH NO2– + 0,67H2O

NO2– + 0,5 CH3OH –
0,5 N2 + 0,5 CO2 + 0,5 H2O + OH némi lugosodással.

A denitrifikáló egységben Thiobacillus denitrificans, Micrococcus denitrificans, Pseudomonas,

Serratia, Achromobacter nemzetség elektron akceptorként nitrátot használó törzsei végzik.

2 NO3 > 4 e- > 2 NO2 > 4 e- > 2 NO > 2 e- > N2O > 2 e- > N2

Az anaerob folyamat közben jelentős energia szabadul fel, amely a műveletet végző
szervezetek számára a szénforrás gazdaságos hasznosítását jelenti.

115
nitrifikáló egységek vázlatrajzai

A nitrifikáló egységekben a levegőztetés hatékonyságát toronyreaktorok kifejlesztésével és

megfelelő levegőztető fúvókák alkalmazásával lehet fokozni. A levegőztetett reaktor általában
15-20 méteres toronyként magasodik a felszín fölé, de gyakran süllyesztik a felszín alá. A
Ilyen berendezésben a finom eloszlásban bejuttatott levegő oxigéntartalmának 70-80 %-a a
légbuborék úthosszával arányosan felhasználásra kerül A levegőztetett reaktor után
elhelyezett ülepítőből távozik a kezelt szennyvíz. A kiülepedett aktív biomassza egy része a
levegőztetett reaktorba visszatáplálva növeli annak a teljesítményét. Az ülepítő hatásfokát
mechanikai úton (végtelenített szalaggal) lehet javítani.

A tápközeg kéntartalma is redukált formában van jelen a reakciótérben. A sejttömeg kifejlő-

déséhez szükséges mennyiségen felül a kénhidrogén egyrészt a gázfázisban a biogáztelepek
jól ismert illataként jelentkezik, másrészt a jelenlevő fémekkel reagálva fémszulfidok
alakjában kicsapódik, ami a szennyvíziszap (zagy) fekete színét okozza. A kénhidrogén
toxikus hatása zavarhatja a rendszer működését, amit mésztej adagolásával lehet kivédeni

Megoldandó kérdés még, mi történjék a feleslegben képződő sejttömeggel? Az első reaktor

eubaktérium sejtjei - inaktiválás után - állattápszerként jól hasznosíthatók. A második reaktor
baktériumtömege azonban zömmel az ősbaktériumok csoportját képviseli. A bennük nagy
mennyiségben előforduló fitanil-éter származékok miatt inkább talajerő pótlóként célszerű
hasznosítani. Ez a vegyületcsoport ugyanis a talaj mikrobaközössége számára jól használható,
a magasabb rendűek viszont szerény enzimkészletükkel nem képesek hasznosítani. —

Az actinomycesek közé sorolt mikroszervezetek pótolhatatlan szerepet játszanak a komposztálás

folyamatában a növényi poliszacharidok (cellulóz, hemicellulóz, lignocellulóz) lebontásával. A
növényi lignocellulóz felépítettségéből következően nehezen lebontható. A szorosan kötegekbe
rendezett cellulóz láncokhoz rövidebb hemicellulóz egységek tapadnak. Ehhez kapcsolódnak
extenzinek közvetítésével a savas karakterű pektin láncok. Az egész képződményt a lignin
(fenilpropán egységekből álló polimer) szilárdítja az egyes növénycsoportokra jellemző
lignocellulózzá.

A városi (kommunális) szennyvíz korszerű tisztítására példaként szerepeltethető a FARE

segélyből Debrecenben épített tisztítómű, amely a város teljes szennyvíz mennyiségének
(50000 m3 /nap) tisztítását a szigorú EU szabványnak megfelelően végzi. A kialakított
rendszer a levegőztetett aerob és fakultatív anaerob tisztítási műveletet, valamint a
metanogéneket foglalkoztató szigorúan anaerob reaktorok tevékenységét egységes
rendszerben önfenntartó módon működteti.

116
A Debrecenben megépített szennyvíztisztító vázlatos rajza és helikopterről készült felvétele.

117
A szennyvíztisztító mikroflórája és faunája változatos. Az ősbaktériumok és az
eubaktériumok mellett egysejtűek, gombák és algák konzorciumának tekinthetők. Az aerob
körülmények között szaporodó szervezetek nagyobb hányada elpusztulva az anaerob szakasz
tápanyagforrásaként hasznosul. A képződött metán gázmotorokkal működő áramfejlesztői a
centrifugák, a légkompresszorok, a rendszert mozgató átemelő szivattyúk, és szárító
berendezések energia igényét bőven fedezi. A vázlatrajzon látható, hogy az anaerob fázis után
a tisztított szennyvízzel a városból
bejutó szennyet optimális értékre
hígítják. A tisztított lé csak a
levegőztető medence után található
utóülepítőn keresztül hagyhatja el a
telepet. A biogázt termelő reaktor
térfogatra számított teljesítménye
jelentősen növelhető, ha a
mikroszervezetek konzorciuma
porózus üvegágyra (Siran; Schott,
Mainz) telepedve fejtik ki metanogén
aktivitásukat. A térfogategységben
levő aktív baktérium tömeg
mennyisége egy nagyságrenddel
növelhető. A tisztítóműben képződő
mikroorganizmusok az anaerob
szakasz után elhelyezett
iszapvíztelenítő berendezésen

porozus Siran üvegfelületen fejlõdõ keresztül kerülnek komposztálásra.

Methanobacterium és Methanosarcina tenyészet
xxxxxxxxxxxxxxx

From: Szentirmai Attila [mailto:szentirmai.attila@science.unideb.hu] September 21, 2011 12:42 PM

Cc: szentirmai.attila@science.unideb.hu
Subject: RE: Biomernok mesterszak_zarovizsga tetelek_Biotermék technológia
1. Gyulladásgátló kortikoidok jelentősége, gazdaságos előállítása
2. szteroid alapváz (androsztén váz) gazdaságos nyerése természetes
alapanyagból
3. ösztrogén váz előállítása prokirális kiindulási anyagból
4. a β-laktám szerkezet jelentősége; rezisztencia fejlesztése; spektrum
szélesítés; savállóság biztosítása 6-aminopenicillansav használatával
5. aminosavbioszintézis szabályozottsága
6. izocukor program, bioetanol program, környezetkímélő megvalósítása
(a cukoripari szennyvíz tisztítása)
7. környezetet szennyező anyagok biológiai hasznosítása
Xxxxxxxxxx

118
1.)Hogyan akadályozható meg a szterin váz lebomlása?{például: prednizolon
előállítása esetén vagy AD nyerése szterinekből program kivitelezésekor}
a) Indukált ∆1-dehidrogenáz működtetése tápanyagmentes vizes közegben
b) A 9α-oxigenáz enzim működésének szelektív gátlásával (oxin)
c) A ∆1-dehidrogenáz, vagy 9α-oxigenáz hiánymutáns használatával

2.)Milyen reakciósor műküdése képes eltávolítani a szterinoldalláncot

A zsírsav lebontáshoz hasonlóan, az úgynevezett "β-lebontás szabályai szerint.
Az első oxigénfunkció az alifás láncra, a proton-gazdag szénatomra kerül

3.)Milyen lépések alkalmazásával nyerhetünk biokonverziós reakcióban

használható mikroszervezetet (clon)?{Pl.: AD nyerése szitoszterinből}
a/1) Egyedüli szénforrásként az átalakítandó anyagot tartalmazó tápközegbe
vitt populációból az átalakításban közreműködő szervezetek szaporodnak.
a/2)Azonos tápközegbe történő ismételt átoltással felerősített tenyészetből
szilárd táptalajra szélesztéssel izolálható a törzs (clon) tiszta formában.
a/3) A clon stabilitása, homogenitása többszöri átoltást követően igazolandó.

b/1) A jól kifejlett homogén tenyészettel oltott tápközeg egyedüli szénforrásként

az átalakítandó anyagot tartalmazza.
b/2) Meghatározandó az idő függvényében észlelhető változás analitikai
módszerekkel. (Ez lehet biológiai vagy kémiai.) Szubsztrátum fogyása, a
termék képződése (melléktermékek száma és mennyisége??)
b/3) A fizikai és kémiai körülmények változtatásával optimalizálandó az eljárás.

c/1) A kiválasztott mikroorganizmustól elvárt tevékenység szempontjából

ideális körülmények között tartott tenyészetben az idő függvényében
észlelhető változás analitikai értékelése minősíti a törzset.
c/2) A törzs biztonságos tárolására szolgáló módszer kidolgozása és ellenőrzése

d) Meghatározva a konverzió hatásfokát és a melléktermék(ek) megjelenését az

inkubációs idő függvényében, kialakítható az ipari körülmények között
alkalmazható eljárás protokollja.

4.)Milyen enzimreakciók működése eredményezi szteránváz lebomlását?

A ∆1-dehidrogenáz, és a 9α-oxigenáz enzimek egymást követő működése
eredményezi a gyürüs rendszer felnyílását,
5.) Milyen biokonverziós lépések kidolgozása javította a gyulladásgátló
kortikoidok (pl. prednizolon) gyógyszerpiaci helyzetét?
A ∆1- dehidrogénezés és a 11β-hidroxilezés optimális technológiájának
kombinált eljárás keretében való alkalmazása ipari méretben a köztes
termék kinyerése nélkül.

119
6.)Miért előnyös a ∆1- dehidrogenáz és a 11β-oxigenáz képződését serkentő
induktorként androszténdiont (AD) alkalmazni?
1). AD a nagy mennyiségben rendelkezésre álló alapanyagból (növényi
szterinekből) viszonylag gazdaságosan nyerhető.
2). Mint induktor célzottan a kívánt enzim képződését serkenti.
Például: ∆1-dehidrogenáz indukció; 11-hidroxiláz indukció

7.)Hogyan sikerült az androszténdion gazdaságos előállítása szterin oldalánc

lebontással?
1) Egyedüli szénforrásként szterineket tartalmazó táptalajon növekedő
populációból izolálható az alap (clon) törzs
2) Az előbbi törzs 9α-hidroxiláz aktivitásának szelektív gátlásával
3) A kiválasztott törzsből előállított ∆1-dehidrogenáz, illetve 9α-hidroxiláz
hiánymutáns használatával

8.)Milyen hidroxilezési lépésekről hallott a mikrobiális élettani tanulmányai

során?
a) FAD katalizálta dehidrogénezést (szukcinát-fumarát-malát) követő vizfelvétel
eredményeként. (a fumaráz működéseként)
b) A szubsztrátum molekula elektrongazdag pontján történő hidroperoxid
kialakulását követő NADPH-t igénylő vízképzéssel.
c) Vas kofaktort hasznosító hidroxiláz közvetítésével
(tercier alkohol! Például 9α-hidroxiláz működtetésével!)

9.)Mit tud a sztatinok szterinszint csökkentő (gombamembrán képződést gátló)

szerepéről?
Ezek a vegyületek (antimetabolitok) természetes körülmények között, a létért
folytatott ádáz küzdelemben, a gombamembrán felépítéséhez
nélkülözhetetlen ergoszterin képződését akadályozva az életterületen
rivális gomba növekedését gátolják. {Az acetil-CoA-ból képződő (β-
hidroxi-β-metilglutaril-CoA) köztestermékből a mevalonsav dehidrogenáz,
másnéven glutaril-CoA reduktáz által végzett reakció adja a
szteroidbioszintézis teljesítményét meghatározó építőelemet, a a szterin
bioszintézis nélkülözhetetlen köztestermékét (3-R-mevalonát) }

10.)A gyulladásgátló prednizolon gazdaságos előállítása milyen biológiai lépés

folyamatbatételét igényli, és milyen mikroszervezet alkalmazható erre a célra?
Α hidrokortizon ∆1-dehidrogénezése prokarióták enzimkészletével.
Ilyen például a Corynebacterium simplex

120
11.)A szzterán váz bomlása milyen tevékenységgel akadályozható?
a) Nem növekedő tenyészetben, a lebontásban érdekelt indukálható enzimek
képződése nem következik be. (például tápanyag hiányában; Vizben
szuszpendálva végzett eljárás közben.)
b) Szelektív indukcióval nyerhető ∆1-dehidrogénező tenyészet csapvízben is
képes a folyamat katalizálására, segítésére.
c) A bomláshoz nélkülözhetetlen, de indukálható 9α-hidroxiláz
működésképtelenné tétele szelektív hatású kemikáliával.
d) 9α-hidroxiláz hiányos mutáns előállításával

12.)A racém norszteroidok előállítására kidolgozott Smith-Torgov eljárás,

milyen beavatkozással válik alkalmassá enantiomer norszteroidok szintézisére?
A leendő szteroid D gyürüjén, az alkil csoport szomszédságában levő két
karbonil csoport azonos valószínűséggel reagálva, egyaránt alkalmas a C
gyürű kialakítására. – Gyürűzáráskor ezért képződik racém norszteroid. –
Az egyik karbonil reakcióképességét szelektív módon felfüggesztve
gyürűzáráskor irányítottan csak D, vagy L norszteroid képződik.

13.)A totálszintézissel nyert metilszekodion szelektív redukciója milyen enzim

használatával oldható meg?
Alfa-, illetve béta-hidroxiszteroid oxidoreduktáz alkalmas a feladatra.
Az élesztők közül olyan rörzs választandó ki, illetve állítandó elő,
amelyikben a két emzim aktivitása jelentős mértékben különbözik.
A két enzim működését az aktuális NADH szint eltérően befolyásolja.
Metabolizálható szénforrás ellátottság mellett a szelektíb légzésgátlás
fizikai, illetve kémiai úton, esetleg gátló vegyületek használatával oldható
meg.

14.) Minek köszönhető a Penicillium fonalas gomba által termelt anyag sikere a
bakteriális fertőzés elleni küzdelemben?
A hatásos anyag biokémiailag a prokarióta olyan szerkezeti elemének, a
gazdaszervezetben elő nemforduló„peptidoglükán” sejtfalnak a
képződését zavarja; ezért nem jelentkezik toxikus mellékhatás.

15.)Mit tud a β-laktám (azetidinon) szerkezetü antibiotikumok hatásmódjáról?

A hatóanyag (azetidinon) az eubaktériumok peptidoglükán sejtfalának
képződését katalizáló D-Ala-D-Ala dipeptidre specifikus transzpeptidáz
aktiv centrumába kerülve képes azt acilezni. Ezzel inaktíválja a
sejtfalképződést katalizáló enzimet. A periplazmikus térben folyó
sejtfalszintézis gátlás miatt az egyre növekedő citoplazma képződése
végül szétpukkasztja a mikroszervezetet.

121
16.)Miért nem hatásos a G és V penicillin a Gram negatív baktériumok okozta
fertőzés leküzdésére?
A Gram negatív baktériumok külső membránján való áthaladást akadályozza a
penám váz savanyú karaktere

17.) Miért tekinthető mérföldkőnek a 6-aminopenicillansav gazdaságos

előállítása?
Mert a Penicilliun chrysogenum által termelt β-laktám antibiotikum
köztestermékéből az eubaktériumokra ható, széles spektrumu, saválló,
penicillináz rezisztens, nem toxikus hatóanyagot lehetett előállítani.

18.)Milyen elektronszerkezeti tulajdonság segíti a cephém váz penicillináz

tűrését?
A kvázi delokalizált elektron eloszlás | | |
O=C — N — C== C —
|
O=C–OH

NH2 H H H O H H H H
| | | | || | : : |
HOOC — C — C — C — C — C — N — C — C — S — C — H O
| | | | | | | ||
H H H H O=C — N — C== C — CH2— O — C — CH3
| Cephalosporin-C képlete
O=C—OH

H-C == C-H H O H H H CH3

| | | || | : : |
H-C C — C — C — N — C — C — S — C — CH3
|| || | | | |
H-C — C-H H O=C — N ——— C —H
|
G-Penicillin szerkezeti képlete O=C—OH (Másnéven:Benzil-penicillin)

19.)A penicillin miért a növekedési fázist követő idiofázis terméke?

A penicillin képződés szempontjából azért előnyös a növekedési fázist követő
idiofázis, mert a szénhidrátmetabolizmus teljesítményének a csökkenése
nem csak a fehérjeszintézist érinti, de a NADPH szint alakulásán keresztül
a glutation reduktáz működését is zavarja. A glutation redukáló
körülmények között ugyanis, az ACV tripeptid szerkezeti analógjaként
képes befolyásolni az IPN-szintetáz működését.
(γ-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin <—> δ-L-α-aminoadipil-L-ciszteinil-D.valin)
γ-L-glutamil = γ-L-α-aminoglutar
Redukáló körülmények között a G-SH szubsztrátanalógként gátolja, oxidálódva,
–G-S-S-G– formában viszont már nem zavarja az izopenicillin-N.szintetáz
működését.

122
19.) A gombákban miért a logaritmikus növekedési szakaszt követő stacuoner
(idio) fázisban képződnek az azetidinon szerkezetű (ß-laktám) antibiotikumok?
A penicillin képződés szempopntjából azért előnyös.a nüvekedési fázist követő
idiofázis, mert a szénhidrátmetabolizmus teljesítményének a csökkenése nem
csak a fehérjeszintézist érinti, de a NADPH szint alakulásán keresztül a glutation
reduktáz működését is gátolja. A glutation ugyanis az ACV tripeptid szerkezeti
analógjaként képes befolyásolni az IPN-szintetáz működését. (2G-SH <>G-S-S-
G) oxidálódva viszont már nem zavarja az izopenicillin-N.szintetáz működését.
(γ-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin <>δ-L-α-aminoadipil-L-ciszteinil-D.valin)

20.) Mit tud a D-ösztradiol szintézis kulcs-intermedierjének az előállításáról?

1.)- Malátakivonatot tartalmazó ferdeagaron kinőtt Saccharomyces uvarum
tenyészettel oltott kukoricalekvárt és malátakivonatot tartalmazó levegőztetett
tenyészettel (inokulum) —2x108 sejtszám elérésekor— 10% répacukrot is
tartalmazó táptalajt oltunk
2.)- A 28 °C-on növekedő levegőztetett élesztőtenyészethez 8-10 órás korban
ßnaftolt adunk, ami ennél a törzsnél visszaszorítja az α-enzim aktivitását
3.)- A habzás gátlása céljából dodecilbenzolszulfonsav és polipropilénglikol
elegy adagolása után, 24 órás korban (2-3x108 sejtszám elérésekor) a szekodion
szubsztrátum mikrokristályos formában kerül a tenyészethez (etilszekodion
esetében detergens adagolása is szükséges) A pH csökkenése előnyös, mert a
baktériumos fertőzés lehetőségét hátráltatja
4.)- A széndioxid képzés csökkenésekor Kb 30 óra múlva 10%-nyi szacharóz
adagolás szükséges.
5.)- A redukált termék nagyméretű, az élesztősejt méretét többszörösen
meghaladó kristályként jelenik meg. Így az élesztősejtektől szűréssel
elkülöníthető a kristályos nyers termék.
6.)- A nyers termék acetonból átkristályosítva, majd éterrel mosva 96%-os
tisztaságu termék, kiindulási anyagként használható a 19-norszteroid
szintézishez

21.) Clavulansav szerpe a prokarióták evoluciójában, és a gyógyászatban

Természetes körülmények között a Streptomyces clavuligerus tenyészlevében
felszaporodó antibakteriális cefamicin ß-laktám szerkezete a penicillináz enzim
inaktíválására alkalmas clavulánsav termelésével megőrizhető. Ez a tiazolidin
helyett oxazolidin gyürőt tartalmazó ß-laktám szerkezetű vegyület inaktíválja a
ß-laktám szerkezetet hidrolízáló fehérjét, a penicillinázt, ami a gyógyászatban is
eredményesen használható. A Biogál például a széles spektrumu Amoxicillin-t
(D-α-amino-p-hidroxi-fenilacetamido-penicillansav) az ampicillin p-hidroxi
analógját clavulánsavval kiegészítve forgalmazta.

22.) Hogyan történt a konzervipar glutaminsav igényének kielégítése a huszadik

században?

123
A század első felében csiráztatott gabonamagvakból nyerték ki a felszaporodó
glutaminsavat. – A növekedés fehérje igényéhez aminosav kell, aminek indulási
terméke az L-glutaminsav – A levegőztethető bioreaktorok kifejlesztése
lehetővé tette a növekedő sejtben felszaporodó aminosav mikrobiális
előállítását.

23.) Milyen követelmények teljesülése szolgálja a prokariotában az L-

glutaminsav termelését?
1.)- A termelő törzs a humán szervezet számára veszélyforrást nem jelenthet.
2.)- A környezetbe választja ki a reduktív ammónia felhasználásával nyert
célterméket, a glutaminsavat.
3.)- A piruvát larboxiláz működését a tápközeg biotin tartalma befolyásolja:
limitált= 2.5 ug biotin jelenlétében a membrán átereszt # 5 felett =prolin kiválás
#15-20 felett tejsav, borostyánkősav dusul fel a tenyészlében
4.)- Az ammonia szint meghatározó jelentőségű A 8 pH tartása előnyösen
ammoniával történhet. A túllevegőztetés kifújja az ammóniát, Ammonia hiány
hatására feldúsul az α-ketoglutarát
5.)- Az oxigénhiány csökkenti az ATP szintet, emelkedik a borostyánkősav és a
tejsav szint
6.)- Glükóz adagolással a kihozatal előnyössé tehető. Célfeladat legalább 10%-
os glutaminsav szint (100g/liter) elérése a tenyész lében
Kristályosítás 90 °C tű kristály 70 °C prizma

24.)-Milyen igény kielégítését szolgálja az esszenciális aminosavtermelés ipari

megvalósítása?
A nagyüzemi hústermelés, tojástermelés piaci szempontjának érvényesülése a
takarmány aminosavkészleténak függvényében igényli az esszenciális
aminósavakkal való kiegészítést.

25.)-Hogyan érvényesül alloszterikus szabályozás az aromás vegyületek

bioszintézisénél?.
1.)-Fszfoenolpiruvát és eritróz-foszfát heptonát-7-foszfáttá kondenzálását
katalizáló enzim működését nem csak a három aromás végtermék, de a
prefénsav és a korizminsav is képes alloszterikusan befolyásolni
2.)-A shikiminsav képződését katalizáló enzim működését nem csak a két
végtermék (Phe, Tir). de a prefenát és a,korizmát is alloszterikusan befolyásolja
3.)-Korizminsav antranilsavvá alakulását katalizáló asszociátum (anthranilát
szintetáz és foszforibozil transzferáz) szétesését okozza a Trp felszaporodása
4.)-A fenilalanin és a tirozin irányába a korizmát szintetáz termékéből a
prefénsav képződést két korizmát-mutáz izoenzim katalizálja, asszociátumot
képezve a fenilalaninra éruzékeny prefenát-dehidratázzal, illetve a tirozinra
érzékeny prefenát-dehidrogenázzal.

124
26.) Miből adódik a növekedési szakasz(fehérjeszintézis)energiaigénye? ( ATP)
1.)A növekedési szakaszt jellemzi a riboszóma számának növekedése
(ribonukleotid trifoszfátból pirofoszfát kiválással hosszabbodik a nukleinsav)
2.)A mRNS és tRNS szintézis energiaigénye (az igényelt tRNS készlet
kialakítása, aminosavval való acilezés)
3.)Az aminosav bioszintézis, ill. a transzport mechanizmus energiafogyasztása
4.)A riboszómán történő fehérjelánc képződésének energiaigénye (ATP, GTP)

27.) Mi iindokolja a szabályozási mechanizmus kifejlődését? (gazdaságosság)

1.)- Az aminosav bioszintézis helyett a környezetből történő aminosav
transzport támogatása
2.)- Az attenuáltan szabályozott mRNS képződés által befolyásolt
enzimállomány teljesítménye
3.)- Alloszterikusan ellenőrzött bioszintézis (feed-back szabályozás; gátló és
serkentő hatása.)
4.)- Katabolikusan derepresszálható lebontó rendszer (C és N hiány)
működtetése
– Aminosavhordozó represszor fehérje (promoternél) akadályozza az
RNSpolimeráz indulását
– Egy ill, több alloszterikus kötőhellyel rendelkező fehérje (izoenzimek)
indítja a bioszintézist
–Az elágazásoknál végtermékkel szabályozott enzimkomplex funkcionál
(Az aromás termékek képződését szolgáló alloszterikusan szabályozott ciklus
mechanizmusa törzsenként eltérő lehet, ezért indokolt a részletes vizsgálata)

28.)- Milyen beavatkozással növelhető az aminosav-bioszintézis teljesítménye?

1.)- Toxikus aminosav-analógok hatását elviselő mutánsok izolálása
2.)- Az aminosavtermelő mutánsok számára optimális tenyésztési körülmények
kialakítása

29.)- Milyen aminosavanalóg volt sikeres az L-triptofán termelés esetében?

Humánegészségügyi szempontból az E. coli esetében feltárt mechanizmustól
kényegesen eltérő Corynebacterium glutamicum vad törzsből indulva 5-metil-
triptofán, 5 fluor-triptofán, 4-metil-triptofán, triptofán-hidroxamáttal szemben
rezisztens mutánsok közül kiválasztott legjobban teremelő törzs p-fluor-
fenilalaninra, p-amino-fenilalaninra, tirozin-hidroxamátra, illetve fenilalanin-
hidroxamátra rezisztens mutánsa adta legjobb eredményt. –
Hasonló eredményt hozott, ha fenilalanint és tirozint igénylő, kétszeresen
auxotróf korizmát-mutáz hiányos törzsből triptofán analógokra rezisztens
mutánsokat izoláltak.–
A glükózt és ammoniumszulfátot tartalmazó táptalaj kukoricalekvárral való
kiegészítése ellenére fenilalanin adagolás hatásosan növelte a triptofán
képződést.

125
30.)- Milyen triptofán termelési lehetőségről hallott?
5-metil triptofánnal derepresszált E. coli tenyészet sejtjtjeit L-szerint és indolt
tartalmazó reakcióelegybe szuszpendálva L-triptofán képződik
Antranilsav igényes prkariota és eukariota mutánsok jól kinőtt
tenyészetéhez antranilsavat adagolva jelentős triptofán képződés tapasztalható

31.) Milyen tevékenység vezet a glükóz-fruktóz cukorszörp előállítására?

1.)- A törzs kiválasztása egyedüli szénforrásként xilánt tartalmazó minimál
táptalajon
2.)- A kiválasztott törzsek összehasonlítása xilózt tartalmazó táptalajon
3.)- A legjobban növekedők sejteket centrifugálva 30%-os glükóz oldastban 60
°C on inkubálva időnként vett minta izomeráz aktivitását meghatározzuk
4.)- A legjobb eredményt mutató törzs ismételt használatával meghatározandó a
felezési idő
5.)- A kiválasztott törzs fenntartására szolgáló módszer kidolgozása (a
tulajdonság őrzésével

32.) Miért előnyös az izomeráz képződés szempontjából szorbit adagolása az

enzimtermelő tenyészethez?
Xilóz szénforrás esetében a szorbóz átalakíthatatlan szubsztrátanalógként –
hiányjelenséget okozva – fokozza az izomeráz képződést. (az élni akarás
teljesülése)

33.) Milyen módszerrel rögzíthető az izomeráz az enzimtermelő sejthez?

A legeredményesebb sejtek enzimtartalma glutárdialdehiddel rögzítve javítja a
felezési időt(a rögzítési reakció ammonium hidroxid adagolásával leállítható!)

34.) A Schardinger (ciklo)dextrin képződése, és szerkezetéből következő

gyakorlati hasznosítása
A hidrolizáló enzim apoláros szerkezetéből adódóan képződik a víuben gyürűs
szerkezetű cső alakban, kolloid formában létező keményítőből ciklodextrin. A
glükóz molekulák külső oldalán elhelyezkedő alkoholos hidroxil csoport
vízoldékonyságot bizztosít. A belső oédal apoláros tulajdonsága viszont
vízoldhatatlan anyagok befogadására alkalmas. Ideális fiziológiailag is
hasznosuló csomagolóanyag!

126