15.

A molekuláris biológia alapvető módszerei (PCR, restrikciós analízis,

szekvenálás, Northern- és Southern hibridizálás, stb.) és alkalmazási
lehetőségei az “egyed feletti” és “egyed alatti” kutatásban.

A molekuláris biológia

Az élet szubcelluláris összetevőinek, azon belül is főleg az élethez szükséges szerves

makromolekulák tulajdonságainak megfigyelését és megváltoztatását lehetővé tevő
technikák összessége.

Fő területei:

 A sejt szerkezete és fő építőelemei

 A genetikai információ áramlása
 Sejten belüli jelátvitel
 Fehérjék funkciói
 Genetika
 Bioanalitika
 Biokémia-genomika
 Immunológia, sejt- és mikrobiológia
 Fejlődésgenetika
 Orvosi molekuláris biológia
 Géndiagnosztika
 Gyógyszerészeti kutatás

Elválasztás technikák:

Tisztítandó molekulaféleségek a jellemzőik alapján választhatók el:

 Kémiai
 Fizikai

Elválasztás lehetőségei:

1. Fizikai tulajdonságok alapján

- Agaróz-elektroforézis
- Gélszűrés
- Centrifugálás

2. Kémiai tulajdonságok alapján

- Ioncserés kromatográfia
- Affinitás kromatográfia

3. Fizikai-kémiai tulajdonságok alapján

Szövet és sejtfeltárás módszerei:

 Mechanikus
 Enzimatikus
 Detergens
 Hipoozmotikus sokk
 Fagyasztás-olvasztás
Fontos: a kiszabadult enzimek gátlása, a célmolekula megőrzése (DNáz, RNáz,
Proteináz gátlók)

A makromolekulák nagy része töltést hordoz. Az aminosavak amfoter tulajdonságúak.

Két jelentős módszertani csoport, ami a töltések megoszlásán alapszik: elektroforézis és
ioncserélő kromatográfia.

Ioncserélő kromatográfia

Az ioncserélő oszlopokat olyan gél-gyöngyökkel töltik meg, melyek felszíne pozitív vagy
negatív töltésű: a szétválasztandó molekulák közül az ellentétes töltéssel rendelkezők
megkötődnek az ioncserélőn, a többi pedig gyorsan áthalad az oszlopon.

Elektroforézis

A fehérjék és nukleinsavak frakcionálásában mára minden egyébb szeparációs technikát

felülmúltak érzékenységben, sokféleségben és népszerűségben. Lényegük, jogy vizes
közegben létrehozott elektromos térben a töltéssel rendelkező molekulák elmozdulnak
az ellentétes töltésű elektród felé és ha vándorlásuk iránya vagy sebessége különböző,
egymástól fizikailag elválaszthatók.

Agaróz gélelektroforézis

Az agaróz géleket nukleinsavak frakcionálására használják. Elektroforézis során a gél

szűrőhatást gyakorol: a pórusokon keresztül mozogva a nukleinsav-molekulák
szétválnak, hiszen a kicsik gyorsabban, a nagyok lassabban vándorolnak. Az agaróz
gélelektroforézis DNS-fragmentumok frakcionálásának is rutinmódszere. A futtatást
követően etídium-bromiddal vagy más fluoreszcens festékkel teszik láthatóvá a
nukleinsavakat a gélben.

Hibridizációs technikák

A hibridizációs technikák segítségével adott nukleinsavak méretét, elhelyezkedését,

mennyiségét tudjuk meghatározni.

Southern-blot

Főleg genomi DNS-t tudunk vizsgálni, deléciókat, inszerciókat, génátrendeződéseket,

bizonyos esetekben pontmutációk jelenlétét.

A genomI DNS-t valamely restrikciós endonukleázzal megemésztjük, majd agaróz gélen

megfuttatjuk. A futtatás után a DNS-t egyszálúsítani kell; a gélt NaCl, NaOH
pufferoldatban inkubáljuk. A gélből a DNS-t valamilyen technikával nitrocellulóz, vagy
nejlon membránra transzferáljuk.

A transzfer történhet többféle módon: vákuummal, elektromos áram segítségével és a

hajszálcsövesség jelenségét kihasználva.

(Hajszálcsövesség technika: a gélt valamilyen transzfer pufferrel átitatott vastag

szűrőpapírra helyezzük, végei egy transzfer-puffert tartalmazó tankba lógnak. A gél
tetejére helyezzük a nitrocellulóz membránt, annak a tetejére pedig egy köteg
papírtörülközőt teszünk. A papírtörülköző tetejére plexi- vagy üveglap kerül, melynek
súlya egymáshoz préseli a papírtörülközőket. A papírtörülköző-torony benne lévő apró
 kapillárisok miatt kiszívja a gélből a folyadékot, ami alulról folyamatosan pótlódik. A
folyadék sodorja magával a DNS-t is, ami viszont a nitrocellulóz membránon nem jut át,
ahhoz hozzáköt.)

A membránra transzferált DNS-t erősen rogzíteni kell a membránhoz. Ezt leggyakrabban

a következő módokon oldják meg:

 Szárítókemencében
 Mikróhullámú sütőt használva
 Ultraibolya fény

A rögzítés után a membránt hibridizációs kamrába zárjuk, majd előzetesen egyszálúsított

DNS-t tartalmazó oldattal 42-68 fokon 1 óráig prehibridizáljuk a membránt. Az egyszalú DNS
aspecifikusan leköt minden helyet a membránon és a gélből származó DNS-en. A
prehibridizációval párhuzamosan elkészítjük a radioaktív próbát, melynek többféle módja
lehet.

Prehibridizáció után az oldathoz hozzáadjuk a radioaktív próbát, es 3-12 órát hibridizáljuk a

membránhoz kötött DNS-hez. A hibridizáció során a specifikus próbák a komplementer
hexlekrőlnleszorítják az aspecifikusan kötődő DNS-t. A hibridizáció után mossuk a
membránt. Mosás után a membránt szárítjuk, majd átlátszó fóliába csomagoljuk, és
röntgenfilmmel exponáljuk 16-24 óra hosszat. Az előhívás után tudjuk kiértékelni a filmet.

Northern-blot

Northern-blottal adott specifikus gének működése következtében termelődött RNS-ek

szintjét hasonlítjuk össze. A kísérlet menete nagyon hasonlít a Southern blotnál
megismerttel. Az RNS-ekez méret szerint elválasztjuk, majd specifikus próbákkal hasonlítjuk
össze a különböző mintákban lévő, adott génről átíródott RNS-ek mennyiségét, amiből
következtetni tudunk az adott gének expressziós aktivitására. Fontos különbség, hogy az
elektroforézis előtt az RNS-eket nem kell restrikciós endonukleázzal emészteni, a különböző
méretű RNS-ek szépen elválnak egymástól.

A northen blot egyik legfontosabb alapfeltétele, hogy ép RNS-t kell hozzá izolálni.
Degradálódott RNS-t nem szabad northern blot analízishez használni.

Western blot

A western blot technika poliakrilamid gélen fehérjék specifikus detektálására szolgál.

Immunoblot technika, mely során a gélelektroforézissel elválasztott fehérjék szilárd
hordozóra kötjük, majd jelenlétüket specifikus antitestekkel detektáljuk.

PCR: polimeráz láncreakció

A PCR elve nagyon egyszerű, a kétszálú DNS-szakaszt egyszálúsítjuk, majd

megszintetizáljuk mindkét szál komplementer párját. Ezt ciklikusan ismételve exponenciális
módon felszaporítható a kiválasztott DNS szakasz.

Ha egy egyszálú DNS szakasz ismert részével komplementer szakaszt készítünk, akkor az
megfelelő körülmények között az adott komplementer szekvenciához be fog kötődni a
bázispárosodás szabályának megfelelően. Ha DNS dependes DNS-polimeráztnés dezoxi-
nukleotid-trifoszfátokat adunk a fenti reakcióelegybe, akkor a feltapadt primer 3’ végétől
elkezdődik a komplementer lánc polimerizációja. A polimerizációs reakciót egy idő után
leállítjuk, a két szálat szétválasztjuk. A képződött új szálhoz tervezett komplementer primert
is hozzáadjuk a rendszerhez, a második polimerizációs reakcióban az eredeti szállal azonso
szekvenciájú termék polimerizálódik.

Lépések:

1. Dupla szálnál denaturáció 95 fokon

2. Lehűtjük 45-65 fokra, a primerek megtalálják a komplementer szekvenciájukat

3. A primerek bekapcsolódása után polimerizáció (72-74 fok). Lehűtve ismét

primerek tapadnak be és újrakezdődhet a polimerizáció.

PCR használati lehetőségei:

 Genetikai manipuláció
 Adott élőlények jelenlétének kimutatása
 Szekvenciaanalízis
 Mutációk, polimorfizmusok kimutatása

Szekvenálás

A fehérjék es a nukleinsavak szekvenciáinak meghatározása a molekuláris biológia

legfontosabb feladatai közé tartozik.

A Sanger-féle szekvenálás során tulajdonképpen egy polimerizációs reakció zajlik. Az

ismeretlen DNS szekvencia komplementer szálának egy ismert szekvenciájú részéhez
primert tervezünk, majd egy lehetőleg nagy processzivitású polimeráz segítségével
elkezdjük átírni a másik szálat (puffer, Mg2+ ionok, dNTP). A reakció 4 párhuzamos csőben
zajlik, mindegyik csőbe más-más dideoxi-nukleotidot kell tenni, kis mennyiségben. Ha a 4
párhuzamos mintát a reakciót követően gélen megfuttatjuk, a keletkezett szálak nagyság
szerint elválnak egymástól. Mivel tudjuk, hogy melyik zsebbe melyik dideoxi-nukleotidot
tartalmazó mintát tettük, a gél aljától indulva, visszafelé haladva leolvashatjuk a DNS
szekvenciáját. A DNS-t meg kell jelölni. Ez vagy radioaktív, vagy fluoreszcens módon
történik. Jelölhető az 5’ vég pl. radioaktív foszfáttal, vagy használhatunk előre megjelölt
radioaktív vagy fluoreszcens primereket.

Klasszikusan a szekvenálást radioaktív jelöléssel végezték. A szekvenálás kezdetén a

templát DNS-t egyszálúsítani kell. Felhevítik 95 fokra, majd hirtelen lehűtik jégre téve a
mintát. A gyorsan lehülő DNS nem tudja olyan gyorsan megtalálni a komplementer
szekvenciáját, ezért aspecifikusan, random módon fog kötődni a lehető legközelebbi,
gyakran a saját láncán belüli, részben komplementer szakaszhoz. Az egyszálú templát-
DNS-hez hozzá kell mérni a primert, majd az egészet 65 fokra melegíteni 2 percig. A mintát
ezután hagyjuk lassan kihűlni, a primerek betapadnak a komplementer helyekre. Az így
előkészített DNS-hez hozzámérjük a reakciómixet :puffer, ionok, módosított T7 polimeráz,
dNTP-k, adott ddNTP (szobahőmérsékleten). Majd a reakciót formamidos pufferrel leállítjuk.

Ha genomi DNS-tnszekvenálunk, érdemes a szekvenálandó szekvenciát PCR-el

felszaporítani.

Új generációs szekvenálás

Nagyságrendekkel növeli meg a szekvenálás sebességét, a fent ismertetett Sanger féle

módszerhez képest. Human Genom Project során közel két évtized és számos laboratórium
kooperációja volt szükséges a teljes emberi genom feltérképezéséhez., ma már elegendő
néhány nap és egyetlen készülék.

Restrikciós analízis

Olyan molekuláris biológiai módszer, melyhez retrikciós endonukleázokat, röviden restrikciós

enzimeket alkalmaznak. A restrikciós enzimeket plazmidk hasítására használják.

A különböző baktérium törzseknek különböző restrikciós enzimei vannak, melyeknek eltérő

a felismerési szakasza.

Egy molekuláris biológiai laborban arra használjuk a restrikciós enzimeket, hogy hasítsuk és
ezáltal manipuláljuk a plazmidokat. Olyanok, mint az olló ami a rá specifikus részeket tudja
kivágni a plazmidból, hogy megtisztítsa azt.

Három típusa: I. ; III. típusok molekuláris biológiai szempontból már nélkülözhetőek, míg a II-
esntípus nélkülözhetetlen.

Tulajdonságaik:

 Csak endonukleáz aktivitásuk van, azaz a metilálást mindig egy másik enzim fogja
végezni. A II-es típusnál van egy módosító enzimpár is a metiláló mellett.
 Mindig ugyanott, ugyanúgy, adott enzimre jellemző felismerési szekvencián belül
vagy annak közelében hasítja a DNS-t
 Működésükhöz ATP nem szükséges, Mg2+ viszont kell!

Restrikciós endonukleázok

A nagy méretű DNS-ek darabolására a természet ajánlotta az első biokémiai eszköztárat. A

restrikciós endonukleázok olyan mikrobiális enzimek, amelyek a kétszálú DNS-t a láncon
belülmhasítják valamilyen meghatározott szabály szerint.

A molekuláris biotechnológiában általában a I. típusú restrikciós endonukleázokat

használjuk. Ezen enzimek jellemzői, hogy a metiláció külön polipeptiden heslezkedik el.
Emellett a felismerőhelyben, vagy annak közvetlen közelében hasítanak,
definiáltmpozícióban. Működésükre nincs szükség ATP-re

Az enzimek nevezéktana. A nevük első 3 betűje arra a mikroorganizmusranutal, melyből

izolálták, pl EcoRI; a név többi része egyébb azonosító.