EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

Adrenerg stimuláció hatása a szívizomsejtek akciós

potenciáljára, és az őket kialakító ionáramokra

Dr. Ruzsnavszky Ferenc

Témavezető: Prof. Dr. Magyar János

DEBRECENI EGYETEM
MOLEKULÁRIS ORVOSTUDOMÁNY DOKTORI ISKOLA
Debrecen, 2014
Tartalomjegyzék
Tartalomjegyzék ....................................................................................................................... 2
Az értekezésben gyakran használt rövidítések jegyzéke ...................................................... 3
Bevezetés ................................................................................................................................... 4
Irodalmi áttekintés ................................................................................................................... 6
Az adrenerg receptorok .......................................................................................................... 6
A β-adrenerg receptorokhoz kapcsolódó jelátviteli útvonalak ........................................... 9
Az akciós potenciál létrehozásában résztvevő ionáramok ................................................... 13
A kamrai akciós potenciálok morfológiája; regionális különbségek ................................... 15
Akciós potenciálok morfológiájának változása β-adrenerg stimuláció hatására ................. 16
Feszültségfüggő ionáramok és –csatornák a szívizomsejteken ............................................ 17
Feszültségfüggő kalciumáramok a szívizomsejteken ...................................................... 17
Feszültségfüggő káliumcsatornák .................................................................................... 21
Célkitűzés ................................................................................................................................ 32
Anyagok és módszerek ........................................................................................................... 33
Kutya bal kamrai szívizomsejtek izolálása .......................................................................... 33
Elektrofiziológiai mérések izolált sejteken .......................................................................... 34
Hagyományos feszültség-clamp mérések ........................................................................ 36
Akciós potenciál mérések................................................................................................. 39
Akciós potenciál voltage clamp ....................................................................................... 40
Az analízis során felhasznált matematikai formulák............................................................ 41
Statisztikai elemzés .............................................................................................................. 41
Eredmények ............................................................................................................................ 42
Izoproterenol hatása az AP morfológiára ............................................................................. 42
Az izoproterenol hatása függ az AP morfológiájától és az ingerlési frekvenciától ............. 43
Az izoproterenol módosító hatásában részt vevő ionáramok azonosítása ........................... 46
A csatornák foszforiláltságának szerepe a gátlószerek hatékonyságában ............................ 54
Izoproterenol időfüggő hatásai az akciós potenciál morfológiájára ..................................... 55
Az ISO hatására bekövetkező AP-változások az ionáramok időfüggő változásának a
következménye ..................................................................................................................... 57
A jelet közvetítő β-adrenerg receptorok azonosítása ........................................................... 58
A β receptorok szerepe az ISO okozta változások kinetikájában......................................... 60
A foszfodiészteráz barrier szerepének vizsgálata ................................................................. 64
Megbeszélés ............................................................................................................................. 65
Összefoglalás ........................................................................................................................... 71
Summary ................................................................................................................................. 72
Irodalomjegyzék ..................................................................................................................... 73
Tárgyszavak ............................................................................................................................ 83
Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................... 85

2
 Az értekezésben gyakran használt rövidítések jegyzéke

AC: .................... adenilát-cikláz

4-AP: ................. 4-aminopyridin
AP: ..................... akciós potenciál
APD: .................. az akciós potenciál időtartama
APDx: ............... az AP kezdetétől mért azon időtartam, mely az AP amplitúdójához képest
mért x%-os repolarizációig telt el
ATP: .................. adenozin-trifoszfát
cAMP: ............... ciklikus adenozin monofoszfát
CGP-20712A: .... 2-hydroxy-5-[2-[[2-hydroxy-3-[4-[1-methyl-4-(trifluoromethyl)imidazol-2-
yl]phenoxy]propyl]amino]ethoxy]benzamide
DAG: ................. diacil-glicerol
E-4031: .............. 1-[2-(6-Methyl-2pyridil)ethyl]-4-(4- methylsulfonyl aminlbenzoyl)
piperidine
EGTA: ............... etilén-glikol tetraecetsav, 3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-
diazatetradecanedioic acid
EPAC:................ „Exchange Protein directly Activated by cAMP”, cAMP aktivált kicserélő
fehérje
HEPES:.............. 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethane-1-sulfonic acid
HMR-1556: ....... N-[(3R,4S)-3-hydroxy-2,2-dimethyl-6-(4,4,4-trifluorobutoxy)chroman-4-
yl]-N-methylethanesulfonamide
IBMX: ............... izobutil-metilxantin, 1-methyl-3-(2-methylpropyl)-2,3,6,9-tetrahydro-1H-
purine-2,6-dione
ICa,L: ................... L-típusú kalciumcsatornákon átfolyó áram
INCX Nátrium/kalcium ATPáz által létrehozott áram
ICI 118,551: ...... (2R,3R)-1-[(7-methyl-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy]-3-(propan-2-
ylamino) butan-2-ol; hydrochloride
IKr: ...................... késői egyenirányító káliumáram gyorsan aktiválódó komponense
IKs:...................... késői egyenirányító káliumáram lassan aktiválódó komponense
IK1: ..................... befelé egyenirányító K+ csatornák által létrehozott áram
Ito: ...................... tranziens, kifelé irányuló káliumáram („transient outward current”)
ISO: ................... izoproterenol, (RS)-4-[1-hydroxy-2-(isopropylamino)ethyl]benzene-1,2-diol
LQT: .................. long QT-szindróma
PKA: .................. protein kináz A
PKC: .................. protein kináz C
PLB: .................. foszfolambán
PLC: .................. foszfolipáz C

3
 Bevezetés

A szívizomszövet adrenerg aktivációja az emlősszív egyik legfontosabb adaptációs

mechanizmusa. Ezt a hatást legfőképpen β-adrenerg receptorok, és a hozzájuk kapcsolódó
jelátviteli útvonalak közvetítik.
Az adrenerg aktivációra kifejlődő jól ismert pozitív tróphatásokat megelőzően több
ionáram jelentősen fokozódik kamrai szívizomsejteken [4], így az L-típusú kalciumáram
(ICa,L) [5], a késői egyenirányító káliumáram lassú (IKs) [6] és gyors (IKr) komponense [7].
Keveset tudunk az izoproterenol IKr és IKs fokozásának kinetikájáról, ugyanakkor a K+ és
Ca2+ áramok egymáshoz viszonyított időbeli aktivációja fontos szerepet játszhat az adrenerg
aktiváció proaritmiás veszélyének létrehozásában [8].
Az adrenerg stimulációra bekövetkező akciós potenciál (AP) változások nem kellően
dokumentáltak, és jelentős eltérések vannak a különböző speciesek között. Az akciós
potenciál időtartama (APD) nő pl. sertés [9], patkány [10] és tengerimalac [11] kamrai
szívizomsejteken, míg az APD csökken nyúl [5], kutya [6], macska [12], és humán [13]
preparátumokon.
Az eltérő β-adrenerg válasz hátterében a különböző speciesekben az eltérő AP-morfológia
állhat, amit a nem azonos mértékben expresszálódó ionáramok okoznak. Kíváncsiak voltunk,
hogy miként befolyásolja a kalcium- és a késői káliumáram komponenseit a β-adrenerg
stimuláció, valamint az IKr szerepére az adrenerg stimuláció okozta kalciumáram-növekedés
ellensúlyozásában. Megvizsgáltuk és összehasonlítottuk az IKr, IKs és ICa áramok időbeli
aktivációját. A mérések során az áramok amplitúdóinak változása mellett a β-adrenerg válasz
kinetikai sajátságait is vizsgáltuk.
A β-adrenerg stimuláció hatásait az AP-konfigurációra akciós potenciál mérésekkel,
feszültség-clamp és akciós potenciál feszültség clamp módszerekkel vizsgáltuk kutya kamrai
izolált szívizomsejteken. A β-adrenerg receptorok aktiválására izoproterenolt (ISO)
alkalmaztunk. Az AP morfológiájának szerepét epi-, és endokardiális eredetű kutya kamrai
sejtek segítségével vizsgáltuk, emellett midmiokardiális sejtek AP-ját az endokardiális
sejtekéhez hasonlóvá alakítottuk a tranziens outward káliumáram (Ito) gátlásával. Az AP
morfológiájának vizsgálata során a platópotenciál emelkedését, és az akciós potenciál
időtartamának rövidülését vizsgáltuk – az előbbi paramétert a kalcium, az utóbbit pedig az IKr
és IKs áramok markerének tekintettük. Az AP-mérések során kitértünk a változások
frekvenciafüggésének vizsgálatára is, és megkerestük a hatást közvetítő β receptor altípust is.

4
A kutya kamrai szívizomsejtek használatát a kísérletek során az indokolta, hogy a kutya
kardiomiociták ionáramai a humánéhoz nagyon hasonlóak [14].
Eredményeink megmutatták, hogy az izoproterenol akciós potenciál-paramétereit
befolyásoló hatása nagymértékben függ a kiindulási AP morfológiájától, emellett a hatás
fordított frekvenciafüggő.
Kimutattuk, hogy kutya kamrai szívizomsejteken az izoproterenol akciós potenciált
rövidítő hatásáért elsősorban az izoproterenol által aktivált IKs (nem pedig az IKr) fokozása a
felelős. Az ISO okozta IKr és IKs amplitúdó változása jelentősen lassabb az ICa-hoz képest, ami
magyarázható a résztvevő jelátviteli útvonalak eltéréseivel, illetve a cAMP intracelluláris
kompartmentalizációjával. Megállapítottuk, hogy az ISO káliumáramokat fokozó hatásáért a
β1, kalciumáramot fokozó hatásáért pedig mind a β1, mind pedig a β2 receptorok által mediált
jelátviteli útvonalak felelősek.

5
 Irodalmi áttekintés

Az adrenerg receptorok

Az adrenerg receptorok az úgynevezett 7-transzmembrán (7-TM) receptorok

szupercsaládjához tartoznak. Közös tulajdonságuk, hogy a sejtfelszíni membránban
helyezkednek el, és azon 7 α-hélix szakasszal lépnek át. A receptorfehérjék intracelluláris C-
terminálisa felelős a G-fehérje kötéséért. Agonista kötődésére megváltozik a receptor
szerkezete, ami lehetővé teszi a receptor és a G proteinek kapcsolódását [15].
Az adrenerg receptorokat osztályozhatjuk ligandaffinitásuk és aminosav-szekvenciájuk
alapján, így α és β-adrenerg receptorokról beszélhetünk [16]. Az alfa-receptorok α1, és α2
receptorokra oszthatóak, de aminosav homológia alapján mindkét típusnak léteznek további
altípusai. β receptorok közül β1, β2 és β3 adrenerg receptorokat ismerünk.
Az α1-adrenerg receptorok megtalálhatóak a szívizomsejteken is, bár számuk kicsi a β-
adrenerg receptorokhoz viszonyítva. A receptorok a szíven pozitív kronotóp hatást
közvetítenek. Fontos szerepük van emellett a simaizomsejtek kontrakciójában. Az α1 adrenerg
receptoroknak további három altípusa ismert, α1A, α1B, és α1D [17]. Valamennyien a G-fehérjék
Gq altípusán keresztül aktiválják a foszfolipáz C (PLC), a foszfolipáz A2 (PLA2) és
foszfolipáz D jelátviteli útvonalakat [18]. A receptorok emellett befolyásolják a MAPK
útvonalakat is. Agonistáik a noradrenalin, fenilefrin, methoxamin, cirazolin, naphazolin és
xylometazolin. Antagonistáik közül a prazosin, alfuzosin, doxazosin, phenoxybenzamin és
phentolamin a legjelentősebbek [19].
Az α2-adrenerg receptoroknak is három altípusuk van, α2A, α2B, és α2C. Valamennyien a Gi
fehérjéhez kapcsolódnak és a membránkötött adenilát-cikláz (AC) aktivitását gátolva
csökkentik az intracelluláris cAMP szintet. A receptorok központi idegrendszerben sokfelé
megtalálhatóak, emellett zsírsejteken, valamint a gasztrointesztinális traktus, és bizonyos erek
simaizmain is kimutathatóak. Agonistáik a noradrenalin, dexmedetomidin, a medetomidin, a
romifidin, a clonidin és a xylazin. Antagonistái többek között a yohimbin, idazoxan és az α1
receptorokat is gátló phentolamin. A cirazolin az α1 receptorok aktiválása mellett gátolja az α2
receptorokat [19, 20].

6
 A β receptor izomerek, ellentétben az α adrenerg receptorokkal, valamennyien Gs
fehérjéhez kapcsolódnak, és növeli a sejtek adenilát-cikláz aktivitását, ezen keresztül az
intracelluláris cAMP szintet.
A β1 adrenerg receptort a 10. kromoszómán (10q24-26) elhelyezkedő ARDB1 gén kódolja
(1. ábra). A β1 receptorok a szervezetben változatos hatásokat közvetítenek. A vese
juxtaglomeruláris sejtjein fokozzák a reninelválasztást, és a ghrelin elválasztását a gyomor
P/D1 sejtjein. A szívizmon a β1 adrenerg receptor kimutatható a szinuszcsomó,
atrioventrikuláris csomó sejtjein, a Purkinje-rostokon, valamint a pitvari és kamrai
munkaizomrostokon is. Fiatal felnőtt, egészséges humán szíven a legtöbb β receptor (86%) β1,
míg a fennmaradó β receptorok túlnyomórészt (mintegy 14%-ban) β2 [21]. Ez a fiatalkori
β1/β2 receptor arány szinte megegyezik a kutya szíven megfigyelt β receptor-altípusok 85-
15%-os előfordulásával [22]. Idősebb korban a β1/β2 arány 1:1-re csökken, feltehetően a β1
downregulációja miatt [23]. A β1 adrenerg receptorok aktiválódása a szíven pozitív
tróphatásokat közvetít, többek között pozitív chronotróp, dromotróp, inotróp, luzitróp és
bathmotróp hatású. Agonistái az adrenalin, izoproterenol, dobutamin, denopamin és
xamoterol. Antagonistái közé tartoznak a gyógyszerként használt II. osztályú antiaritmiás
szerek. A klinikumban szelektív és nem szelektív antagonistáit egyaránt használják. Szelektív
gátlószerei az atenolol, bisoprolol, betaxolol, metoprolol, nebivolol, stb [19]. Kísérletes
körülmények között CGP-20712A-val is specifikusan blokkolható.
A β2 receptorok nagyfokú szerkezeti hasonlóságot mutatnak a β1 receptorokkal [24]
(1. ábra). A receptort az ARDB2 gén kódolja, mely az 5q31-32 locuson helyezkedik el. A β2
receptor számos helyen előfordul a szervezetben, legismertebb előfordulási helye a különböző
elhelyezkedésű simaizom-sejtek, ahol általában relaxációt közvetítenek, így megtalálhatóak a
bronchusokban, erekben és üreges szervekben jelen levő simaizomsejteken, de előfordulnak
májsejteken, nyálmirigysejteken és szívizomsejteken is. Aktiválódásuk a szívizomrostokon a
β1 receptorokhoz hasonlóan pozitív tróphatásokat közvetít. A β2 receptorok aktiválása a
pitvarokban maximális inotróp választ hoz létre, a kamrákban azonban a maximálisnál kisebb
választ eredményez [25]. A receptorokat aktiválja alacsony koncentrációjú adrenalin, és a
kísérletekben gyakran használt izoproterenol. Más agonistáit a klinikumban asthmaellenes és
tokolítikus gyógyszerekként használják, ilyen például a salbutamol, salmeterol, terbutalin és a
ritodrin. Szelektív antagonistái az ICI 118,551 és a butoxamin, de az összes nemszelektív II.
osztályú antiaritmiás szer (propranolol, sotalol, nadolol) is gátolja [19].
A β3-receptorokat az ARDB3 gén kódolja, ami a 8. kromoszómán (8p12) helyezkedik el. A
receptorok legismertebb előfordulási helye a zsír és barnazsírszövet, szerepük itt a hőtermelés

7
1. ábra: A humán β-adrenerg receptorok szerkezete. A: β1 adrenerg receptor szerkezete. B: β2
adrenerg receptor szerkezete. A humán β1 adrenerg receptor 477, míg a β2 413 aminosavból
áll, az ábrán egy kör egy aminosavat jelöl. Mindkét receptornál a C-terminális vég az
extracelluláris, míg az N-terminális az intracelluláris térben van. A hidrofób transzmembrán
szegmenseket számok jelölik, a ligandkötő zseb kialakításában valamennyi transzmembrán
szegmens szerepet játszik. Az I1-3 az intracelluláris, míg az E1-3 az extracelluláris hurkokat
jelöli. A G-protein aktiválásért az I3-as hurok, és az N-terminális 7. transzmembrán
szegmenshez közeli része felelős. A fehérjék N-terminális végén találhatóak a PKA, és a β-
adrenerg receptor kinázok foszforilációs helyei.
A nagymértékű szerkezeti hasonlóság ellenére a két receptor aminosav-sorrendje csak 54%-
ban egyezik meg. További különbség a két receptor között, hogy a β1 adrenerg receptor
hasonló affinitású adrenalinra és noradrenalinra is, míg a β2 receptor a noradrenalinhoz
képest mintegy 30-szor nagyobb affinitással köti az adrenalint.
Taylor munkája alapján módosítva [3].

és a lipolízis fokozása. A receptorok valószínűleg előfordulnak neuronokon is, központi

idegrendszeri fiziológiás szerepük még nem tisztázott [26]. A β3 receptorokat kimutatták az
epe- és a húgyhólyag falában, ahol relaxáló hatást közvetítenek, valamint az agy
zsírszövetében és a szívizomsejteken is. Szívizomsejteken is kimutatták a jelenlétüket, ahol a
szívelégtelenség miatti szívizom-átépülés folyamatában vehetnek részt. A receptor funkciója a
szívizmon nem tisztázott, egyes szerzők az átépülés okaként, mások a kompenzatórikus, de
később kimerülő védőmechanizmusként látják a szerepét [27]. A receptor specifikus agonistái
az amibegron, solabegron és nebivolol. Antagonistája a SR 59230A, ami azonban α1-gátlással
is rendelkezik.
A β-adrenerg receptorokra jellemző az úgynevezett deszenzitizáció, mely során változatlan
agonista koncentráció mellett, idővel csökken a kiváltott válasz. A jelátviteli útvonalat
rövidtávon gátolja a receptor és Gs-fehérjék interakciójának megakadályozása (uncoupling),
hosszú távon pedig a receptorok downregulációja. Az uncoupling a β receptorok
foszforilációjával történik. Ezt két fehérje befolyásolja, a protein kináz A (PKA), mely a
receptorok heterológ deszenzitizációját okozza, és a β-adrenerg receptor kináz 1-es típusa
(βARK1 vagy GRK2), ami homológ deszenzitizációt közvetít [28].

8
 A β-adrenerg receptorokhoz kapcsolódó jelátviteli útvonalak

A β -adrenerg receptorok szívizomsejteken számos jelátviteli útvonalat aktiválnak, többek

között a cAMP/PKA útvonalat, a PLC/PKC útvonalat, a MAPK, EPAC, és PI3K útvonalakat,
emellett befolyásolják még a NO szintázokat, és a TGF-β szignalizációt is [27].
Az intracelluláris jelátviteli útvonalak végső közös útja a fehérje-foszforiláció, illetve
defoszforiláció. Protein-kinázok katalizálják a foszforilációs folyamatokat, a fehérjék
foszforiláltságát különböző foszfatázok szüntetik meg. A két enzimaktivitás eredője határozza
meg a fehérjék foszforiláltságát és ezen keresztül azok aktivitását. A csatornafehérjék
foszforilációját meghatározó legfontosabb útvonalak a cAMP/PKA útvonal, a PLC/PKC és az
EPAC útvonal.

A cAMP/PKA útvonal

A cAMP/PKA útvonal a Gs és Gi fehérjékhez kapcsolt. A Gs növeli, míg a Gi csökkenti az

adenilát cikláz (AC) aktivitását, és ezen keresztül az intracelluláris cAMP koncentrációt (2.
ábra).
Az adenilát-cikláz enzimek aktivációjukkor az ATP-ből cAMP-t állítanak elő. Az AC
enzimcsaládnak kilenc membránhoz horgonyzott, [29] és egy szolubilis tagja (AC10) ismert
[30]. Az egyes enzimeket 1-től 10-ig terjedő számokkal különböztetik meg.
A G proteinek az adenilát-cikláz membránhoz kötött formáinak (AC1-9) aktivitását
szabályozzák míg szolubilis adenilát-cikláz (AC10) működését nem a G-fehérjék, hanem az
intracelluláris pH-ra a bikarbonát koncentrációváltozásán keresztül befolyásolja [31].
Egyes adenilát cikláz izoformák (AC1, AC3, AC5, AC6 és AC9) aktivitását az
intracelluláris Ca2+ koncentráció változása is befolyásolja, így az érintett jelátviteli
útvonalakat a kalcium modulálhatja [32].
A szívizomban az AC 4, 5, 6 és 7-es izoformák expresszióját írták le. Közülük a
legnagyobb mennyiségben az ötös és hatos izoforma fordul elő szívizomsejteken. Az
expresszálódott AC izoformák mennyisége nem állandó, az életkor előrehaladtával az AC5
szintje növekszik, az AC6 szintje nem változik. Ugyanakkor patológiás körülmények között is
változhat az izoformák aránya, pl. szívelégtelenségben az AC5 szintje változatlan marad, míg
az AC6 expressziója csökken [33].

9
 A cAMP-t a foszfodiészteráz (PDE) enzimek bontják 5’AMP-vé. A két enzimcsalád tagjai
(aktivált adenilát-ciklázok és a foszfodiészterázok) együttesen határozza meg a tényleges
cAMP szintet. A foszfodiészterázoknak is számos, eltérő aktivitású izoformája létezik,
közülük a szívizomsejtekben a PDE1-4 fordul elő. Azon túl, hogy mindegyik izoforma bontja
a cAMP-t, a PDE1 emellett cGMP-t is bont. A foszfodiészterázok speciális szubmembrán
elhelyezkedését írták le a szívizomban [34], ezáltal térben behatárolhatják a cAMP függő
jelátviteli útvonalakat.

2. ábra: Az adenilát-cikláz útvonal. A sejtmembrán 7-TM receptorai ligandkötésükkor Gs-

fehérjéken keresztül aktiválják az adenilát cikázt (AC), ami növeli a sejt cAMP szintjét. A
cAMP közvetlen ioncsatorna hatásai mellett aktiválja a protein kináz A-t (PKA), és
hozzájárul az EPAC útvonal aktiválásához. A PKA membránkötött formában, vagy
AKAP proteinek segítségével a célmolekulához asszociáltan található, így tudja
specifikusan foszforilálni az egyes fehérjéket. A cAMP elbomlását a foszfodiészterázok
(PDE) biztosítják.

A cAMP aktiválja a protein kináz A enzimeket, amelyek számos sejtfolyamatban, így

többek között a sejtanyagcserében, génátírásban, a sejtciklus és az apoptózis szabályozásában
is részt vesznek. Az inaktív PKA enzimnek két katalitikus (C) alegységből, és a hozzájuk
kapcsolt két regulatórikus (R) alegységből áll. A katalitikus fehérjéknek három izoformája
(Cα, Cβ és Cγ), a regulatórikus alegységeknek pedig négy izoformája (RIα, RIβ, RIIα és RIIβ)
ismert. Az R-alegységek homo- vagy heterodimert alkotnak, két-két cAMP kötő helyet
tartalmaznak, amelyek kooperálva kötik a cAMP-t. cAMP kötésekor az R-alegységek
leválnak a C-alegységekről, így a szabaddá váló katalitikus alegységek a gátlás alól

10
felszabadulnak. A PKA enzimnek két típusát különböztetjük meg, a PKA1 RI, míg a PKA2-t
RII regulatórikus alegységeket alkotják.
A PKA1 főként citoplazmatikus enzim, míg a PKA2 különböző sejtorganellumok
membránjához kihorgonyozva található. A PKA2 membránhoz kötéséért az AKAP fehérjék
felelősek. Ezek a horgonyzó fehérjék lokalizálják az enzim működését, és biztosítják a PKA2
enzim célspecificitását. A kihorgonyzott PKA fehérjék ugyanis csak a közelükben lévő
fehérjék működését képesek befolyásolni, köztük a feszültség-függő ioncsatornákét is [35]. A
PKA emellett foszforilálja a β2 receptort [36], az SR membrán ryanodinreceptorát (RYR2)
[37], a foszfolambánt (PLB) [38], a troponin I-t, és a miozinkötő protein C-t is [39]. A PKA
mediált foszforiláció rendszerint stimulálja a fehérjék működését, így a RYR2 foszforilációja
növeli a csatorna aktivitását. A PLB – ami a szarkoendoplazmatikus retikulum Ca2+ ATP-áz
(SERCA2a) egyik legfontosabb regulátora - foszforilációja az általa fenntartott gátlás
felfüggesztése révén növeli a SR kalcium-pumpa aktivitását [25]. A foszforiláció hatásai
nemcsak aktiválóak, hanem gátlóak is lehetnek, így például a β2 receptor foszforilációja a
receptor G-fehérje kötését csökkenti, és elősegíti a receptor internalizációját is. A Kv1.4,
Kv4.2 és Kv4.3 csatornafehérjék foszforilációjakor pedig az Ito áram csökken [40].

A PLC/PKC útvonal

Bizonyos 7-TM receptorok, mint például az α1 adrenerg receptor, és az 1-es, 3-as típusú
muszkarinos receptorok Gq fehérjéhez kapcsoltak, ezen keresztül aktiválják a foszfolipáz C-t
(PLC).
Az aktivált PLC a membrán foszfionozitol-biszfoszfát (PIP2) tartalmát inozitol-1,3,5-
trifoszfáttá (IP3) és diacil-glicerollá (DAG) bontja. Az IP3 a DAG-gal együtt aktiválja a sejt
egyes protein kináz C (PKC) enzimeit, emellett növeli az intracelluláris kalcium koncentrációt
is. Szívizomsejtekben az így felszabadított kalcium szerepe elhanyagolható a kontrakció
kiváltásában, azonban számos sejtfunkció szabályozásában szerepel, ezen kívül szükséges az
ún. klasszikus PKC izoformák aktiválásához is. A protein kináz C enzimek szerin/treonin
kinázok. Eddig 12 PKC izoenzimet írtak le [41]. Néhány PKC izoforma aktiválásában az IP3
is részt vehet, egyfelől direkt módon, másrészt indirekt úton, a kalcium koncentráció
növelésén keresztül. A DAG lipofil molekula, a sejtmembránhoz kötött PKC fehérjéket
aktiválja.

11
 A PKC izoenzimek különböző alcsaládokba sorolhatóak [41]. Az első alcsaládba az ún.
klasszikus protein kináz C (cPKC) altípusok tartoznak. Közös tulajdonságuk, hogy
működésük Ca2+, foszfolipid, és DAG/forbolészter függő [42]. Ebbe a családba tartoznak a
PKCα, PKCβI, PKCβII (melyek splice variánsok) és PKCγ enzimek. A novel alcsaládba
(nPKC) tartozó izoenzimekből hiányzik a C2 kalciumkötő domén, aktiválásukhoz a kalcium
nem szükséges, csak DAG és foszfolipidek. Ide sorolják a PKCδ, PKCε, PKCη és PKCθ
típusokat.
A harmadik, atípusos PKC alcsalád aktivációja jelentősen eltérő, nem aktiválhatóak sem
diacil-glicerollal, sem kalciummal. IP3 [43], foszfatidil-szerin [44] és angiotenzin II [45]
képes őket aktiválni. Közéjük tartozik a PKCλ/ι és a PKCζ.
Létezik egy negyedik PKC alcsalád is, melynek tagjai a νPKC és µPKC. A νPKC
izoformát számos szövetben, így szívizomszövetben is kimutatták. Ubiquitináltsága és
felépítése alapján alapvető „háztartási” funkcióját feltételezik [46].
Az aktivált PKC enzimek számos fehérje foszforilációjára képesek, ezen keresztül
befolyásolják a sejtnövekedést, az idegsejtek ingerelhetőségét és az immunfolyamatokat.
Aktivációjuk simaizom kontrakcióhoz és különböző szekretoros sejteken szekréciófokozáshoz
(nyál, könny) vezet.
A szívizomsejtek PKC izoenzim összetétele faj- és korfüggő. Expressziójukat, illetve
aktivitásukat a szívizmot érő károsodások is módosítják. A vizsgálatok eredményei gyakran
ellentmondanak egymásnak, humán szíven a klasszikus PKCα, a novel δ, ε, θ és az atípusos ξ
és λ formákat találták meg. Emellett különböző kórfolyamatokban megjelenik a PKCβ is [47].
A legtöbb szívizom-preparátumban a PKCα a legnagyobb mennyiségben megtalálható
izoforma. Fizológiás szerepe a kontraktilitás szabályozásában lehet [48]. Expressziója, illetve
aktivitása megnövekszik hipertrófiás, szívelégtelen, vagy a szívizomzatot károsító
modellekben [41, 49].
A PKCβ valószínűleg nem található meg egészséges humán miocitákban, [47] azonban
végstádiumú szívelégtelenségben, és kontrollálatlan diabeteszben is kimutatható [49, 50]. A
PKCδ szerepét feltételezik a reperfúziós károsodás okozásában, specifikus blokkolása
koronária-intervenció során azonban nem váltotta be a hozzáfűzött reményeket [51].
A PKCε szerepét szintén az iszkémiát követő reperfúzióhoz kötik, a PKCδ-val ellentétben
védőhatása lehet a reperfúziós károsodással szemben [52].
A ξ forma szintén megjelenik embrionális szívizomsejtekben, de nem zárható ki a PKCλ-
val történő keresztreakciója [53].

12
 Emellett a PKCη-t kimutatták tenyésztett embrionális kamrai szívizomsejtekben, és
kifejlett nyúl, valamint patkány szívizom lizátumában [47].

Az EPAC útvonal

A cAMP nemcsak a protein kináz A enzimeket, hanem emellett egyéb fehérjéket is képes
aktiválni, ilyen fehérje például az EPAC [54]. Az EPAC, vagy „Exchange Protein directly
Activated by cAMP” a monomer G proteinek GDP disszociációját és GTP kötését katalizálja.
Elsősorban membránhoz asszociáltak, de előfordulnak a mikrotubulusok közelében is. Két
típusuk ismert, az EPAC1 és EPAC2. A két forma expressziója sejttípustól függ, a
szívizomban főként az EPAC1 fordul elő [55].
Az EPAC fehérjék két cAMP kötőhellyel rendelkeznek, egy nagy affinitású cAMP
kötőhely mellett egy kis affinitású kötőhelyük is van. Ez a kis affinitású, másodlagos cAMP
kötő domén valószínűleg a PKA aktivációban játszik szerepet [56].
A fehérjék fontos funkciója az R-Ras és a Rap1/RhoA monomer G proteinek aktivációja,
ezen keresztül szerepük van az integrinek működésében, a sejtpolaritás kialakításában, a
sejtadhézióban, a migrációban, és a sejt alakjának megváltoztatásában. A Rap1-en keresztül
aktiválhatják a PKC-t is [57]. Az EPAC fehérjék emellett közvetlenül aktiválják a SERCA
pumpát és a RyR2-t, ezáltal modulálhatják az excitációs-kontrakciós kapcsolatot és az
intracelluláris kalcium homeosztázist is [58].

Az akciós potenciál létrehozásában résztvevő ionáramok

A kamrai szívizomsejtek akciós potenciálját (AP) számos ionáram együttesen alakítja ki

(3. ábra) [59]. Ezek az ionáramok az akciós potenciál különböző fázisaiban aktiválódnak, és
különböző hatással bírnak annak lefutására.
A kamraizomsejtek elektromos tevékenységét öt fázisra osztjuk (3. ábra). A nem ingerelt
kamrai szívizomsejtekre jellemző a nagy nyugalmi K+ konduktancia, amiért a befelé
egyenirányító káliumcsatornák (IK1) felelősek.
Az akciós potenciál nulladik fázisa alatt idő-, és feszültségfüggő gyors Na+ csatornák
aktiválódnak, sokszorosára növelve a nyugalomban alacsony Na+ konduktanciát. A Na+
ionokra jelentős elektrokémiai hajtóerő hat, ezáltal a csatorna nyitása jelentős befelé irányuló

13
áramot eredményez, így a membránpotenciál értéke a Na+ egyensúlyi potenciálja felé mozdul
el, aminek következtében a sejtmembrán depolarizálódik, ez alkotja az AP felszálló szárát. A
gyors Na+ csatornák a depolarizáció hatására gyorsan inaktiválódnak, az ismételt
ingerelhetőséget - a kiindulási zárt állapotukat - csak a membrán repolarizációja során érik el
újra.
1

Membránpotenciál 0
3
4
Ionáramok INa

ICa,L

ICa,T

INCX

Ito1

Ito2
IKs
IKr
IKur

ICl

IK1

3. ábra: A kamrai szívizomsejtek akciós potenciáljának fázisai és az ezeket létrehozó

ionáramok. Az AP mellett feltüntetett arab számok az AP egyes fázisait jelölik. Varró és
munkatársai munkája alapján módosítva [2].

A gyors Na+ csatornák által okozott depolarizáció következtében bizonyos áramokért

felelős ioncsatornák aktiválódnak, míg mások inaktiválódnak. A nyugalmi membránpotenciál
fenntartásáért felelős nagy K+ konduktancia (befelé egyenirányító K+ csatornák) lecsökken a
befelé történő egyenirányítás miatt, ez megakadályozza repolarizáló hatású K+ áram létrejöttét

14
a nulladik fázis alatt. Az akciós potenciál felszálló szárát követő korai, gyors repolarizációt a
Na+-csatornák gyors inaktivációja és a depolarizációra aktiválódó korai, kifelé irányuló áram
(“transient outward current”, Ito) megjelenése teszi lehetővé. Ez a repolarizáló hatású áram a
felelős az akciós potenciál 1. fázisának a kialakításáért, mely egy gyors, rövid ideig tartó és
csak részleges repolarizáció.
A Na+ -csatornák által kiváltott depolarizáció tartós fennállása aktiválja a hosszú ideig
nyitva tartó („long lasting”, ICa,L) feszültségfüggő kalciumcsatornákat. Ez a depolarizáló
hatású áram a membránpotenciált ismét pozitívabb irányba mozdítja (az AP plató fázisa). A
plató fázis alatt nincsen jelentősebb mértékű repolarizáció az Ito gyors inaktiválódása és a
különböző repolarizáló K+ csatornák lassú aktivációja miatt (2. fázis).
Az AP harmadik fázisában kezdődik meg a repolarizációs folyamat, amely az AP negyedik
fázisára visszaállítja a membránpotenciál nyugalmi értékét. A repolarizációban számos áram
vesz részt. A repolarizáció kezdetén a feszültségfüggő kalciumcsatornákon keresztül átfolyó
áram (ICa) inaktivációja mellett a késői egyenirányító K+ áram („delayed rectifier”, IK) gyors
(IKr) és lassú (IKs) komponenseinek egyre nagyobb mértékű aktiválódása figyelhető meg. Az
ionáramok egyensúlya lassan a repolarizáló áramok felé tolódik. Az alacsony elektrokémiai
hajtóerő miatt a repolarizáció végére a késői K+-áram jelentősen lecsökken, így a
repolarizáció befejezésében a késői káliumáramok szerepe az IK1 mellett nem jelentős [60].
A negyedik fázis (elektromos diasztole) során az extranodális (automáciával nem
rendelkező) szívizomsejtek — így a kamrai munkaizomsejtek — membránpotenciálja a
nyugalmi értéken marad egy újabb AP kiváltásáig. A negyedik fázist meghatározó nagy K+
konduktancia (IK1) felelős a nyugalmi membránpotenciál fenntartásáért.

A kamrai akciós potenciálok morfológiája; regionális különbségek

A kamrai szívizomzatot három rétegre oszthatjuk az egyes régiókban megfigyelhető AP

morfológia szempontjából, így megkülönböztethetünk epikardiális, endokardiális és a kettő
között elhelyezkedő midmiokardiális régiót [59]. A kamra izomzata azonban nem háromféle
sejtből vagy három élesen elkülönülő sejtrétegből épül fel; a köztük levő átmenetek
folyamatosak.
Az epikardiális sejtek ún. „spike and dome” konfigurációjúak (4. ábra). Igen kifejezett az
első fázis repolarizáció, ezután következik a platófázis, amely a nulladik fázisnál lassabb
depolarizációval éri el a maximális membránpotenciál-értékét. A midmiokardiális vagy M-
sejteken kisebb a korai repolarizáció (1. fázis) mértéke, mint az epikardiális sejteken, az

15
endokardiális sejteken pedig minimális. Az akciós potenciálok időtartama is eltérő a kamrafal
különböző rétegeiből származó sejtek között. A midmiokardiális sejtek akciós potenciálja a
leghosszabb, az epikardiális sejteké viszont rövid. A transzmurális különbségeket okozhatja
az Ito eltérő denzitása [61], vagy a kalciumcsatornák újbóli megnyílása is epikardiális sejteken
[62]. A Kv4.3 csatorna expressziója, így az Ito amplitúdója is nagyobb epikardiális, mint
midmiokardiális sejteken [63]. A transzmurális AP inhomogenitás mellett egy apiko-bazális
inhomogenitás is megfigyelhető. A szívcsúcs felé eső, ún. apikális szívizomterületek akciós
potenciálja rövidebb, mint az annulus fibrosus felé eső, ún. „bázis” részen. Ezt a különböző
káliumáramok eltérő aránya okozhatja [64].

4. ábra: Epikardiális (A), midmiokardiális (B) és endokardiális (C) eredetű szívizomsejtek

akciós potenciál morfológiája. Az epi- és midmiokardiális sejtekre jellemző az AP ún. “spike
and dome” morfológiája.

Akciós potenciálok morfológiájának változása β-adrenerg stimuláció

hatására

Annak ellenére, hogy tankönyvi adat az izoproterenol okozta β-adrenerg aktiváció

szívizomra kifejtett hatása, ez a hatás nem kellően tisztázott. Az AP adrenerg stimulációra
bekövetkező változása jelentős speciesfüggést mutat. β-adrenerg stimuláció hatására az AP
időtartama megnő patkány [10], sertés [9], és tengerimalac [4] preparátumokon, míg rövidül
nyúl [5], macska [12], humán [13], valamint kutya [6] sejteken. Emellett az általunk vizsgált
kutya kamrai szívizomsejteken megfigyelhető a platópotenciálok növekedése is.
A β-adrenerg hatásra bekövetkező AP rövidülést előidéző ionáramok még nem teljesen
tisztázottak, és a változások időbeli, egymáshoz viszonyított kinetikája sem ismert, mint
16
ahogyan az adrenerg stimuláció epi-, illetve endokardiális AP-morfológiát módosító hatása
sem. Ismereteink annak ellenére hiányosak, hogy a kardiológiai alapkutatásban a kamrai
szívizomsejtek repolarizációjának és az abban szerepet játszó áramok tulajdonságainak és
befolyásolhatóságának vizsgálata kiemelt jelentőségű, hiszen bármilyen szer, ami a kamrai
szívizomsejtek repolarizációját gátolja, megnyújtja az AP hosszát, és emiatt ún. long QT
(LQT) szindróma kialakulásához vezethet [65]. Ezen túl az akciós potenciál időtartamának
egyes kamrai területek közötti eltérései reentry-aritmiákra hajlamosítanak.

Feszültségfüggő ionáramok és –csatornák a szívizomsejteken

Feszültségfüggő kalciumáramok a szívizomsejteken

Szívizomsejteken a feszültségfüggő kalciumáram két típusát mutatták ki, az L-típusú (ICa,L)

és a T-típusú (ICa,T) kalciumáramot.
A T-típusú kalciumáramot alacsony feszültségű (-50 mV-ig történő) depolarizáció
aktiválja, az áram aktivációja és inaktivációja is gyors kinetikájú [66]. A T-típusú
kalciumáram megtalálható pitvari sejteken, és az ingerületvezetésért felelős szöveteken, de
még nem írták le egészséges felnőtt kamrai munkaizomsejteken, viszont az ICa,T megjelenik
krónikus hipertenzív állatmodell kamrai sejtjein, feltételezhetően előfordul hipertrofizált
humán kamrai miocitákon is [67].
Az L-típusú kalciumcsatornák nagyobb mértékű depolarizáció esetén aktiválódnak,
megnyílásuk feszültségfüggő és késleltetett, a csatornaműködés szabályozásában járulékos
fehérjék is részt vesznek. Az L-típusú kalciumáram a szív valamennyi területén megtalálható.
[68]. A csatornák depolarizációra történő megnyílása jelentősen lassabb a feszültségfüggő
Na+-csatornákénál, emiatt az áram csak minimális szerepet játszik az AP felszálló szárának
kialakításában. A csatornák lassú aktivációja miatt a Ca2+ -beáramlás csak a plató alatt lesz
jelentős. A beáramló kalciumionok a szarkoplazmatikus retikulumból kalcium indukált
kalciumfelszabadulás során tovább növelik a kalciumtranziens amplitúdóját [69].
Az L-típusú kalciumcsatornák heteropentamer fehérjék, egy S4 szupercsaládba tartozó
pórusformáló, 220 kDa tömegű α1 fehérje mellett járulékos α2, β, γ és δ alegységekből állnak
[1] (5. ábra).

17
 5. ábra: Az L-típusú kalciumcsatornák felépítése. A heteropentamer csatorna pórusformáló
α1 alegységéhez egy intracelluláris β, egy transzmembrán γ és δ alegység csatlakozik, az α2
alegység extracellulárisan helyezkedik el. Catterall és munkatársai munkája alapján
módosítva. [1]

Az α1 alegységet szerkezete alapján négy családba oszthatjuk, ezek a Cav1, Cav2, Cav3 és
Cav4. Néhány családba több izoforma tartozik, így például a Cav1 alcsaládnak négy tagja van
(Cav1.1-től 1.4-ig). Az általuk kódolt α1 alegységek képezik a feszültségfüggő, L-típusú
kalciumcsatornákat [70] (6. ábra). Az L-típusú kalciumcsatornák közös tulajdonsága a
dihidropiridin-származékokkal szembeni szelektív érzékenység. Humán szívizmon a CaV1.2-
es csatorna található meg, melyet a 12p13.33 locus-on található CACNA1C gén kódol [70].
Ugyanezen gén által kódolt splice-variánsok kimutathatóak vaszkuláris simaizomsejteken, és
központi idegrendszeri neuronokon is [71].

6. ábra: A feszültségfüggő kalciumcsatornák α1 alegységeinek szekvencia-homológiája.

Az ábra csak az α1 alegységek membránon áthaladó szegmenseinek és a csatornaformáló
huroknak az aminosav-sorrendjét (~350 aminosav) hasonlítja össze, ez alapján 3
alcsaládba (Cav1, Cav2 és Cav3) oszthatóak be az alfa-alegységek. Közülük a Cav1
alcsaládba tartoznak az L-típusú kalciumcsatornák.
18
 A kalciumionok az α1 alegység által létrehozott póruson lépnek be a sejtbe; ezt a fehérjét
négy repetitív transzmembrán domén alkotja. Minden domén hat hidrofób szegmensből áll
(S1-S6), a 4-es szegmens feszültségszenzorként funkcionál [72]. Az ötös és hatos szegmens
közötti nagymértékben konzervatív hurokban található négy, egymáshoz közel található
negatív töltésű glutamát oldallánc (EEEE) felelős a pórus kalcium-szelektivitásáért [73]. Csak
kevés típusú bivalens kation (kalcium, stroncium, bárium) képes átlépni a csatornán, Cd2+,
Co2+, Mn2+ és a három vegyértékű La3+ is gátolja az L-típusú kalciumáramot [1, 72]. A
bivalens kationok a környező térből történő eltávolítása után a kalciumcsatornák
nagymértékben permeabilissá válnak monovalens kationokra. Azonban mindaddig, amíg
legalább egy Ca2+-ion a csatornában kötve van, megakadályozza az egy vegyértékű kationok
belépését a csatorna pórusába. Az ICa,L szervetlen gátlószerei és a kalciumionok valószínűleg
közös kötőhelyekkel rendelkeznek [74], egy vagy két ilyen kötőhely a pórus szelektivitási
filterében van (EEEE szekvencia). A gátlás a gátló ion pórusba kötődése utáni lassú
disszociáció eredménye, amellyel így a permeábilis ionok elől elzárják a csatorna lumenét
[72].
A β alegységek intracelluláris proteinek, négy altípusuk ismert (β1-β4). Két,
nagymértékben konzervatív régióval rendelkeznek, amelyek kapcsolódnak a csatorna α1
alegységéhez. A β fehérjék konzervatív régiói mellett megtalálható 3 variabilis domén
határozza meg a β fehérje altípusát, és hatását a ICa,L amlitúdójára, idő- és feszültségfüggésére
[75].
Az extracellulárisan elhelyezkedő α2 és a transzmembrán δ fehérjék diszulfidhidakon
keresztül kapcsolódnak egymáshoz; a pórusformáló egységhez történő asszociációjuk
megváltoztatja a kapuzási kinetikát, és megnöveli az áramamplitúdókat [76]. Emellett az α2
fehérje javítja a fehérjekomplex membránba történő kihelyeződését [77].
A Cav1.2-es csatornák depolarizációra aktiválódnak, a pontos félaktivációs
feszültségértékek függenek az extracelluláris kalciumkoncentrációtól, és a csatorna járulékos
fehérjéitől. [1] Szívizomsejteken a félaktiváló feszültség körülbelül -15mV [78]. A csatornák
inaktivációja feszültség- és kalciumfüggő folyamat [68, 79]. Az áram inaktivációja fiziológiás
körülmények között 100 ms alatt megtörténik [68]. A kalciumfüggő inaktiváció során a
csatornán belépő, illetve az SR-ből felszabaduló kalciumionok egy részét megkötik a csatorna
α1 alegységének C-terminálisához kötött kalmodulinmolekulák. A kalcium-kalmodulin
komplex a csatorna inaktivációját okozza [80]. A csatorna feszültségfüggő inaktivációja
önmagában nagyon lassú (τ>500ms), ez azonban csak a fiziológiástól eltérő kísérleti

19
elrendezéssel, pl. extracellulárisan alkalmazott báriumionok mellett érhető el [72]. A
fiziológiás körülmények közötti inaktiváció befolyásolja az AP alakját, időtartamát, és a
repolarizáció lefolyását is. Az ICa,L denzitásában és kinetikai jellemzőiben nincsen regionális
különbség, ami a létrehozó csatornák hasonló felépítését valószínűsíti [68].
Az ICa,L gátolható különböző szervetlen kationokkal, a csatornák működése azonban
befolyásolható szerves molekulákkal is, ilyenek a különböző dihidropiridinek,
benzothiazepinek és fenilalkilaminok is. Ez utóbbiak jelentős része klinikailag is használt
kalciumcsatorna-blokkoló.
A kalciumcsatorna-gátlók feltételezhetően három különálló, de allosztérikusan kapcsolt
helyhez kötődnek. A fenilalkilaminok intracelluláris pórusblokkolók, melyek feltételezhetően
a citoplazmatikus oldal felől lépnek be a pórusba, és elzárják azt. Klinikai gyakorlatban
elsősorban a verapamilt és a gallopamilt használják közülük. Receptoruk a hármas és négyes
domén S6 szegmensein megtalálható aminosav-maradványok, hasonlóan helyi érzéstelenítők
Na+ -csatornákon található receptorhelyéhez [81, 82]. A verapamil a Cav1.2-es ioncsatornák
vaszkuláris és kardiális típusa között kevéssé szelektál, terápiás koncentrációban mindkettőt
gátolja. A szíven negatív kronotóp, dromotróp és inotróp hatású, az érrendszeren főleg
arteriális vazodilatációt okoz. Használható vérnyomáscsökkentőként, a negatív tróphatások
miatt nem okoz tachycardiát. Csökkenti a miokardium oxigénigényét, ezért használható
antianginás szerként is. Bizonyos típusú aritmiák, pl. paroxizmális szupraventrikuláris
tachycardia és pitvarfibrilláció esetén indikált a használata.
A dihidropiridinek egyaránt lehetnek ICa,L aktiváló, vagy gátlószerek is; emiatt
feltételezhetően nem a pórus blokkolásán keresztül hatnak, hanem a csatornát alloszterikusan
módosítják, így a csatorna nagyobb valószínűséggel lesz nyitott, vagy zárt állapotban.
Receptorhelyük a hármas domén S5 és S6, valamint a négyes domén S6 szegmensén
található, részben átfed a fenilalkilaminok kötőhelyével. Aktiváló dihidropiridin például a Bay
K8644, míg a gátlószerek közé tartozik pl. a klinikailag is használt nifedipin, nizoldipin,
nitrendipin, amlodipin, felodipin. A legtöbb klinikailag használt dihidropiridin igen szelektív
a vaszkuláris kalciumcsatornákra, terápiás koncentrációban a szívizom kalciumcsatornáit alig
befolyásolják. Széles körben használt vérnyomáscsökkentők, azonban növelhetik a
szívfrekvenciát is, ezért általában kombinált terápiában használják őket.
A benzothiazepinek közül a klinikumban csak a diltiazemet használják. A diltiazem az α
alegységen egy harmadik helyhez kötődik, amely azonban nagymértékben átfed a
fenilalkilamin kötőhellyel [1]. A verapamilhoz hasonlóan kevéssé szelektív a vaszkuláris
kalciumcsatornákra, és indikációi is hasonlóak hozzá. Használható antianginás szerként,

20
vérnyomáscsökkentőként és bizonyos szupraventrikuláris tachycardiáknál antiaritmiás
indikációban is.
Az adrenerg stimuláció széleskörű hatással bír a szívizom L-típusú kalciumcsatornáira. A
kalciumcsatornák β-adrenerg modulációját írták le elsőnek, azóta is az egyik legtöbbet
tanulmányozott jelátviteli útvonal.
Emlős, illetve kétéltű szívizomrostokon a β-adrenerg stimuláció megnöveli a
kalciumáramot [83] a cAMP útvonalon aktivált protein kináz A (PKA) segítségével, mely
több, a kalciumhomeosztázisban részt vevő fehérjét foszforilál, és működésüket befolyásolja
[25]. Így a Cav1.2 csatorna α-alegységének C-terminális részén megtalálható 1928-as
pozíciójú szerint is foszforilálja. A foszforiláció növeli a csatorna nyitvatartási valószínűségét
és a megnyílások időtartamát. A β-adrenerg stimulus valószínűleg nem növeli meg a sejt
felszínén levő kalciumcsatornák számát, bár béka miocitákon megnő a funkcionális,
depolarizációra aktiválódó csatornák mennyisége. Ennek oka feltételezhetően nem új
csatornák membránba történő kihelyeződése, hanem korábban inaktív csatornák kapuzásának
megváltoztatása [84]. Bár a cAMP-PKA útvonal növeli az L-típusú kalciumáramot az α-
alegység foszforilálásán keresztül, ennek mértéke expressziós rendszerben 35% [85], szemben
az izolált sejtekben megfigyelt 2-4 szeres amplitúdó növekedéssel [84]. Ennek egyik oka lehet
a különböző, PKA-t kihorgonyzó fehérjék (AKAP; A-kinase anchor protein) közül a
szívizomzatban kimutatott AKAP-15/18 foszforilálása [86], mely koexpressziós rendszerben
növelte az áram amplitúdóját [87]. Emellett a β alegységek PKA útvonal általi foszforilálása
is több, mint kétszeres ICa,L amplitúdófokozást okoz [88].
A protein kináz C aktiváció hatása bifázisos az L-típusú kalciumáramra, egy átmeneti
növekedést hosszantartó csökkenés követ [89]. Ezt az α-alegység N-terminálisának közelében
levő 2 treonin-maradvány foszforilációja közvetíti, ami csak a szívizomban expresszálódó
izoformánál található meg [84].

Feszültségfüggő káliumcsatornák

A feszültségfüggő K+ csatornákat alfa-alegységük alapján több családba oszthatjuk: Kv1

(Shaker), Kv2 (Shab), Kv3 (Shaw), Kv4 (Shal), Kv5-9 (eag család, eag, elk és erg alcsaláddal)
és a KvLQT1 család. Szívizomsejtekben a káliumcsatornák közül a feszültségfüggő
káliumcsatornák és a rajtuk átfolyó Ito, IK1, valamint az IK különböző komponensei a
legfontosabbak a kamrai szívizomsejtek akciós potenciáljának kialakításában [90]. Az akciós

21
potenciál időtartamának meghatározásában az IK komponensei bírnak jelentős szereppel. Az
Ito akciós potenciál időtartamára kifejtett hatása jelenleg is vita tárgya. Az IK1 -40 mV –nál
pozitívabb membránpotenciálokon deaktiválódik, így szerepe csak a terminális
repolarizációban, és a nyugalmi membránpotenciál fenntartásában van.
Az Ito és IK áramokat létrehozó csatornáknak számos közös strukturális és funkcionális
tulajdonságuk van, valamennyien az ún. hat transzmembrán (6-TM) egységekből felépülő
csoportba tartoznak. Ezek a csatornák négy pórusformáló (α) alegységből, és egy, vagy több
járulékos (β) alegységből állnak. A β alegységek funkciója rendszerint a csatorna
modulációja. Az α alegységek hozzák létre a pórust, amelyen keresztül a káliumionok át
tudnak lépni az elektrokémiai gradiensnek megfelelően. Tartalmazzák a szelektivitási filtert,
mely biztosítja a K+-szelektivitást, a feszültségszenzort, és a kapuzásért felelős struktúrákat,
ami a nyitott és a zárt konformáció között kapcsol. Az α alegységek hat transzmembrán
szegmenst tartalmaznak, a C-és az N-terminálisok is intracellulárisan helyezkednek el. Négy
α alegység összeszerelődése szükséges egy funkcionális csatorna létrehozásához. A
pórusformáló régió az S5 és S6 szegmensek közötti hurok (P-régió), ez a felelős a pórus
formálásáért és az ionszelektivitásért. Ennek a régiónak az aminosav-szekvenciája a Kv
csatornáknál nagymértékben konzervatív, az itt található treonin-x-glicin-tirozin-glicin
(TxGYG) szekvencia lehet felelős a K+-szelektivitásért. Az S4 szegmens pozitív töltésekkel
rendelkezik, főként ez a régió felelős a kapuzás feszültségfüggéséért. Depolarizáció hatására a
csatornák megnyílnak, majd inaktív állapotba kerülnek. Az inaktivációnak két fő típusa van,
az N- és a C-típusú inaktiváció. Az N-típusú inaktiváció rendszerint gyors, és a pórus
intracelluláris szájadékát zárja el „ball and chain” mechanizmussal, az N-terminálison
megtalálható rövid szegmens pórushoz kötődésével. A C-típusú inaktiváció a pórus külső
szájadékát zárja el a pórus körüli struktúrák átrendeződésével. Ez az utóbbi, C-típusú
inaktiváció érzékeny az extracelluláris tér K+ koncentrációjára, és farmakológiailag
befolyásolható. [91]

Tranziens kifelé irányuló áram (Ito)

Az Ito depolarizáció hatására aktiválódó rövid ideig folyó, repolarizáló hatású áram (innen
kapta a nevét; „transient outward current”, Ito, azaz átmeneti kifelé irányuló áram). Az Ito a
szív valamennyi területén megtalálható, a nodalis sejteken is [91].

22
 A tranziens kifelé irányuló áram két komponensét különböztetjük meg. Az Ito (vagy Ito1)
kalciumtól független káliumáram [92], ami nagy koncentrációjú (1-5 mM) 4-aminopyridinnel
gátolható. A másik áramkomponens egy kalciumfüggő kloridáram, egy szintén rövid ideig
fennálló, repolarizáló hatású áram, melyet ezért Ito2-nek is neveznek [93].
Az egyes fajok között eltérések vannak az Ito-t létrehozó áramokban, a káliumáram alkotta
Ito1 a legtöbb fajban kimutatható [94], míg az Ito2 humán szívizmon hiányzik [95],
tengerimalacokban pedig egyik áramkomponens sem mutatható ki [96].
Az áram kinetikája alapján a tranziens kifelé irányuló káliumáramnak (a továbbiakban: Ito)
is két komponensét különböztetjük meg, egy gyors (Itof) és egy lassú (Itos) komponenst.
Az Itof áramot a KCND2 gén által kódolt Kv4.2, és a KCND3 gén által kódolt Kv4.3
ioncsatornák hozzák létre, az Itos-ért a Kv1.4 felelős.
Különböző fajokban eltérhet az egyes csatornafehérjék szerepe, humán szívizomrostokon a
legnagyobb szerep a Kv4.3-as ioncsatornáknak jut [97], amelyek homo-, vagy
heteromultimereket alkothatnak a Kv4.2 csatornákkal [98]. Kutyákon a Kv4.2 nem fejeződik
ki, míg rágcsálók szívizmán a Kv4.2 előfordulása jellemző [64].
A különböző típusú Kv4 csatornafehérjék KChIP (Kv channel interacting proteins)
alegységekkel asszociálódhatnak. Humán szívizmon a Kv4.2 és a Kv4.3 is asszociálódik a
KChIP1 és a KChIP4a alegységekkel [99]. A KChIP1 módosító hatása mindkét
csatornafehérjén hasonló; növeli az áram denzitását, késlelteti az inaktivációt, és gyorsítja az
inaktivációból való visszatérést, valamint a steady-state inaktiváció feszültségfüggését is
pozitívabb membránpotenciálok felé változtatja [98]. A KChIP4a megszünteti a Kv4.3 gyors
inaktivációját [100].
Az Itof depolarizáció hatására gyorsan aktiválódik, a steady-state aktiváció
feszültségfüggése — mint az áram többi biofizikai tulajdonsága is — fajonként kissé eltérő, a
teljes csatornapopuláció felét aktiváló feszültségértékek -10 és +20 mV közöttiek [101]. Az Ito
egy ioncsatornára vonatkozó konduktanciaértéke 10-30 pS közötti [102]. Az inaktiváció
időállandói 25-75 ms közöttiek, feszültségtől függetlenek. A csatornák inaktivációból való
visszatérése erősen feszültségfüggő, hiperpolarizáció csökkenti a visszatéréshez szükséges
időt [103].
Az Itos-t a Kv1.4 csatornafehérje hozza létre, amit a 11p14 locuson megtalálható KCNA4
gén kódol. A tranziens kifelé irányuló káliumáram gyors komponensétől főként lassú
inaktivációból való visszatérése (1-6s közötti időállandó) különbözteti meg. A Kv1.4
moduláló alegységei a KCNAB1 gén által kódolt Kvβ1 és KCNAB2 gén kódolta Kvβ2
fehérjék.

23
 A csatornafehérjék kifejeződése, és az áram denzitása is jelentős eltérést mutat fajok
között, valamint a szívizomzat különböző részein is [14, 104, 105].
Humán szívben az Itof és az Itos is megtalálható [106], bár az Ito-t létrehozó csatornák
sűrűsége a szívizom minden területén meglehetősen alacsony. Az áram nagysága jelentősen
eltérhet az egyes területek, illetve rétegek között. A bal kamra epi- és midmiokardiális
rétegeiben az áram denzitása nagy, míg az endokardiális rétegben viszonylag kis Ito mérhető
[104]. Az endokardiális miocitákban az Ito inaktivációja és inaktivációból történő visszatérése
jelentősen lassabb, ami arra utal, hogy itt főként az Itos fejeződik ki [106]. A csatornafehérjék
expressziója az áramhoz hasonlóan változik. A Kv4,3-as csatornák nagyobb mennyiségben
találhatóak meg epikardiális sejteken, mint midmiokardiális, vagy endokardiális sejteken, és a
Kv1.4 expressziója is nagyobb epikardiális sejteken a midmiokardiumhoz viszonyítva [104].
Az Ito expressziós mintázatában fellelhető eltérések különbségeket eredményeznek a kamrafal
egyes rétegeinek akciós potenciál morfológiájában.
A tranziens kifelé irányuló áram több kórképben is megváltozik. Krónikus pitvarfibrilláció
során csökkent az Ito csatornafehérjék expressziója a pitvari szívizomsejteken. Szívelégtelen
betegekben, illetve pacemakeres kamrai ingerlés során a kamrai munkaizomsejteken csökkent
a csatornafehérje expressziója.
Az Ito hatása a humán szívizomsejtek akciós potenciáljának időtartamára jelenleg nem
egyértelmű. Az endokardium sejtjein az Ito igen kicsi, ezért itt az APD-re gyakorolt hatása
szinte biztosan elenyésző. A szívizomzat többi rétegében azonban nem ilyen egyszerű a
helyzet. Egyes szimulációk szerint az Ito gátlása az akciós potenciál hosszát nem változtatja
meg, más szimulációk alapján kismértékű Ito növelés az első fázis végén negatívabb
membránpotenciállal jár, ami az L-típusú kalciumáram lassabb aktiválódását eredményezi,
emiatt az akciós potenciál hosszabb lesz. Jelentős Ito növelés a membrán idő előtti teljes
repolarizációját okozza, így az akciós potenciál a platófázist mintegy „kihagyva” sokkal
hamarabb ér véget, mint normál esetben.

Késői káliumáram (IK)

A késői káliumáramot létrehozó ioncsatornák depolarizáció hatására a Na+ csatornákhoz

képest viszonylag lassan nyílnak meg.
A késői káliumáramnak kinetikai- és egyenirányító tulajdonságok, az egyes farmakonok
iránti érzékenység, valamint az intracelluláris moduláció szempontjából három komponensét

24
különböztethetjük meg [91]. Ezek az ultragyors komponens (IKur), a gyors komponens (IKr) és
a lassú komponens (IKs).
A késői káliumáram jelenlétét minden szívizomsejtben leírták, ám az egyes komponensek
kifejeződése jelentősen eltér a különböző fajokat, illetve a miokardium különböző régióit
tekintve Az IKs és az IKr mind pitvari, mind kamrai munkaizomrostokon is megtalálható, bár
amplitúdójuk (különösen az IKs-é) kicsi [107]. Az IKur-t eddig csak patkány, kutya és humán
pitvaron írták le.
A késői káliumáram elsődleges szerepet játszik a szívizom akciós potenciáljának
repolarizációjában, azonban az egyes komponensek pontos szerepe az adrenerg stimuláció
során még nem pontosan tisztázott. Az áramot létrehozó csatornafehérjék farmakológiai
befolyásolása vagy szerkezetének megváltozása az áram — és így az akciós potenciál
hosszának — megváltozásához, és így aritmiák kialakulásához vezethet. Ezek közül a
legjellemzőbbek a különböző long-QT szindrómák. Ezekben a betegségekben az akciós
potenciál időtartamának megnyúlása miatt fokozódik a korai utódepolarizációk és a torsades
de pointes kamrai tachycardia kialakulásának valószínűsége, és gyakrabban fordul elő hirtelen
szívhalál.

A késői káliumáram ultragyors komponense (IKur)

A késői egyenirányító káliumáram komponensei közül az IKur aktiválódik a leggyorsabban,

és nem, vagy csak nagyon lassan inaktiválódik [59]. Az áram osztályba sorolása nem
egységes a kutatók között, egyesek a késői káliumáram egyik komponensének tartják, mások
szerint az Ito nem inaktiválódó komponenséről van szó. Gátlószere az Ito-hoz hasonlóan a 4-
aminopyridin. Az áram nem szelektíven blokkolható alacsony koncentrációjú nifedipinnel,
diltiazemmel, TEA-val és kapszaicinnel is [108]. Humán pitvarban a csatorna α alegysége a
Kv1.5, melyet a 12p13 locuson megtalálható KCNA5 gén kódol.
Pitvari előfordulása miatt az áram gátlása segíthet a pitvari aritmiák kezelésében, hiszen
nem kell kamrai mellékhatással számolni.

25
A késői káliumáram gyors komponense (IKr)

Humán kamrai szívizomsejteken a késői káliumáram gyors (IKr) és lassú komponense (IKs)
is megtalálható. Az egyes komponenseket eltérő pórusformáló és járulékos fehérjék hozzák
létre, és kinetikájuk is különböző.
Az IKr α alegysége a Kv11.1es fehérje, melyet a 7q35-36 régióban megtalálható KCNH2
gén (korábbi nevén: hERG, azaz human ether-à-go-go-related gén) kódol. A csatorna β
alegysége a MinK-related peptide 1 (MiRP1) [109]. A MiRP1-et a 21q22.12 helyen
megtalálható KCNE2 gén kódolja. A MiRP1 fehérje az α alegységek kapuzását és
permeabilitását módosítja. A Kv11.1-hez β alegységként a Kv7.1-es csatornák alegysége, a
MinK is kapcsolódhat. A MinK fehérjét szintén a 21q22.12 sávban található KCNE1 gén
kódolja. A fehérje tartalmaz egy transzmembrán domént, de önmagában nem képez
ioncsatornát.
Az IKr -30 mV-nál pozitívabb membránpotenciálokon gyorsan aktiválódik, és gyorsan
inaktiválódik. Pozitív membránpotenciálok mellett a csatornák inaktivációja gyorsabb, mint
az aktiváció folyamata, és ez befelé egyenirányító karakterisztikájúvá teszi a csatornákat. A
csatornák inaktivációból való visszatérése is gyors és feszültségfüggő [110]. A repolarizáció
során a csatorna visszatérése az inaktivációból a nyitott állapoton keresztül valósul meg. Az
inaktivációból történő visszatérés gyorsabb, mint a nyitott állapot és zárt állapot közötti
átmenet (deaktiváció).
Egészséges humán szívizmon az áram feszültségfüggő aktivációja gyors, időállandója
~30ms (+30 mV depolarizáció esetén). Az áram amplitúdója 0 és 10mV között éri el a
maximumát, ennél nagyobb depolarizáció ugyanis az egyre nagyobb mértékű inaktiváció
miatt csökkenti a csatornákon átfolyó áramot [111]. A deaktiváció lassú, és biexponenciális
karakterisztikájú (τ1~600ms, τ2~6,8s –40mV tartófeszültség mellett) [107]. Kutya kamrai
szívizomsejteken az áram aktivációja 50ms alatt megtörténik, a deaktiváció kinetikája a
humán csatornákhoz hasonlóan lassú és biexponenciális (τ1~360ms, τ2~3,3s) [112]. Az áram
deaktivációja rendszerint elég lassú ahhoz, hogy – különösen magas szívfrekvencia esetén –
ne záródhasson be az összes csatorna, ez felveti az áram fordított frekvenciafüggő szerepét a
repolarizációban [111].
Az AP platófázisa alatt csak kis IKr folyik, ez azonban befolyásolhatja az AP hosszát, mert
a plató időtartama alatt a szívizomsejtek impedanciája nagy. Az IKr időbeli lefutása jelentősen

26
hosszabb az IKs-nél, ami egy nagy kifelé irányuló áramot eredményez. Ez a kifelé irányuló
komponens hozzájárul a 3. fázis repolarizáció folyamatához.
A bal kamra különböző területein a késői káliumáram komponenseinek expressziója eltérő
lehet a szívcsúcs és a szívbázis között, valamint az egyes izomrétegek között is [64]. Nyúl
szívizomrostokon az IKr denzitása kisebb a szívcsúcs felé eső, ún. apikális szívizomsejteken,
mint az annulus fibrosus felé eső, ún. „bázis” részen. Ezzel ellentétben, munkacsoportunk
kutya szívizomsejteken sem az áram sűrűségében, sem a csatornafehérje kifejeződésében nem
figyelt meg szignifikáns apiko-bazális vagy transzmurális eltérést [14, 104].
Az áram igen fontos a humán kamrai miociták repolarizációja során, jelentős szerepe van
az AP hosszának meghatározásában. A csatornafehéjék, illetve a kapcsolódó járulékos
proteinek mutációja öröklött LQT-szindrómát okozhat. A KCNH2 gén mutációja a long-QT
szindróma 2. típusát (LQT2) okozhatja, míg a KCNE2 mutációja felelős a long-QT szindróma
6. típusáért (LQT6). Az áram gátlása akár specifikus, akár nem specifikus blokkolókkal ún.
szerzett long QT- szindrómát okozhat. A csatornák érzékenyek az extracelluláris
káliumkoncentrációra, 5 mM extracelluláris [K+] mellett egy ioncsatorna konduktanciája 2
pS, 100 mM-ra növelve a káliumkoncentrációt a konduktancia 10 pS-re nő. Az extracelluláris
káliumszint csökkenése az áramot csökkenti, vagyis a hipokalémia önmagában okozhatja a
QT-szakasz megnyúlását is. Emellett a csökkenő [K+]ec a csatornákat dofetiliddel szemben is
érzékenyebbé teszi. Különböző extracelluláris kationok, így a Ca2+, Mg2+, La3+ is gátolják az
áramot [113]. A szervezet acidózisa is csökkenti az IKr-t, ez esetben ugyanis módosul az
aktiváció feszültségfüggése, és gyorsul az áram deaktivációja.
A legtöbb III. osztályú antiaritmiás gyógyszer elsősorban IKr-t gátol. Szelektív gátlószerei
(E-4031, dofetilid) metánszulfonanilid szerkezetű vegyületek, a kamrai akciós potenciál
hosszát jelentősen növelik.
A Kv11.1 nem szelektív gátlószerei között vannak I-es típusú antiaritmiás szerek
(disopyramid, flecainid). Az IKr gátlását nem csak antiaritmiás szereknél figyelhetjük meg,
hanem bizonyos gyomor-bélrendszerre ható gyógyszerek (pl. cisaprid), antimikrobiális,
antifungális szerek (pl. erythromycin, ketokonazol), antihisztamin ágensek (pl. astemizol,
terfenadin, cetirizin), illetve antipszichotikumok (pl. haloperidol) is gátolják [114]. Ezek a
szerek a csatornák nyitott pórusába kötődnek, majd a csatorna aktivációs kapujának záródása
után bent rekednek és így eldugítják azt.
A β-adrenerg stimuláció a cAMP-n keresztül közvetlen és közvetett módon is befolyásolja
a csatornák működését. A cAMP aktiválja a PKA-t, ami foszforilálja a csatornafehérjét. A
foszforiláció csökkenti az áram amplitúdóját, az aktiváció feszültségfüggését pozitívabb

27
membránpotenciálok felé tolja, és gyorsítja a deaktivációt. Emellett a cAMP közvetlenül is
kötődik a csatornafehérjéhez, ami csatorna feszültségfüggő aktivációját mozdítja negatívabb
membránpotenciálok felé. Az eredő hatás általában az áram amplitúdójának csökkenése.
Ezzel szemben kutya és tengerimalac preparátumokon β-adrenerg stimuláció hatására
növekszik az IKr amplitúdója. Kutya kamrai szívizomsejteken a β-adrenerg stimuláció a
cAMP-PKA útvonalon keresztül az áram 30-50%-os növekedését okozza [7]. Tengerimalac
szívizmon az IKr valószínűleg a csatornák befelé egyenirányításának csökkenése miatt nő.
Ezért feltehetően nem a korábbi mechanizmusok, hanem a [Ca2+]ic növekedés, és az aktivált
PKC általi csatornafoszforiláció lehet a felelős [115].
A késői káliumáramot létrehozó csatornák expressziója egyedfejlődés során is változhat.
Egér embrióban főként Kv11.1 ioncsatornák (IKr) expresszálódnak, újszülött egerekben az
arány megfordul a Kv7.1 ioncsatorna (IKs) javára; ugyanakkor felnőtt egerekben már sem IKr,
sem IKs nem mutatható ki [116].
Kutya modellen létrehozott teljes AV-blokk, és következményes kamrai hipertrófia során
jobb kamrai kardiomiocitákban az IKr csökkent a kontrollhoz képest, míg bal kamra esetén
nem volt szignifikáns eltérés az áram denzitásában [117].

A késői káliumáram lassú komponense (IKs)

A késői káliumáram lassú komponensét a 11p15.5-ös kromoszómasávban megtalálható

KCNQ1 (korábbi nevén KvLQT1) gén által kódolt Kv7.1 α alegység és a MinK (másik nevén
IsK), mint β alegység együttes expressziója hozza létre. A KCNQ család K+ csatornáit a
feszültségfüggő K+ csatornák doménjeinek klasszikus felépítése jellemzi.
A Kv7.1-nek két izoformája létezik, az egyes izoforma az összes aminosavat tartalmazza,
míg a kettes forma egy N-terminálison csonkolt fehérje, amelynek beépülése a csatorna
konduktanciáját csökkenti, és az aktivációhoz szükséges időt is növeli [111]. Az izoformák
kifejeződése befolyásolhatja az áram denzitását. A Kv7.1-es alegységek moduláló β alegység
nélkül gyorsan aktiválódnak.
Asszociálódó alegységük a korábban említett MinK fehérje, ami egy 130 aminosavból álló
kis protein. Egy transzmembrán doménnel rendelkezik, glikolizált N-terminálisa
extracelluláris. Korábban a MinK-t gondolták az IKs pórusformáló alegységének, nevét is
innen, valamint a mérete után kapta; „Minimum sequence required for a K-current”, vagyis a
káliumáramhoz szükséges legrövidebb szekvencia. A fehérjét a 21q22.12 sávban található

28
KCNE1 gén kódolja. A MinK transzmembrán doménje a Kv7.1-hez kapcsolódik, növeli a
konduktanciát, de az aktiváció sebességét drámaian csökkenti, és az aktiváció
feszültségfüggését is pozitívabb membránpotenciálok felé mozdítja el.
Egyetlen Kv7.1-es ioncsatorna konduktanciája 1,8 pS (MinK nélkül) és 5 pS (MinK
alegységgel) között változik [118].
Az IKs -30 mV-nál pozitívabb membránpotenciálok esetén lassan aktiválódik, és a legtöbb
fajban gyorsan deaktiválódik. Az áramnak nincs inaktivációs állapota. Az aktiváció
feszültségfüggését vizsgálva a félmaximális depolarizáló feszültségértékek -13 mV és +26
mV közöttiek [118]. Az IKs aktivációja lassú és feszültségtől független, egészséges humán
kamrai miocitákon az aktivációs idő körülbelül 900 ms. Deaktivációja gyors,
monoexponenciális és a feszültséggel fordítottan arányos (0 mV feszültségen τ~350 ms, -50
mV feszültségen τ~90 ms) [107]. Kutya kamrai szívizomsejteken is hasonló karakterisztikájú
az áram, 0 mV-nál nagyobb depolarizáció esetén lassan aktiválódik (τ~800 ms), és gyors,
monoexponenciális deaktivációt mutat (τ~150ms) [112]. Az aktiváció és deaktiváció
sebessége más fajokban jelentősen különbözhet; tengerimalac esetén, ahol az áramot először
írták le, az aktiváció 5-7 másodperc alatt sem szaturálódik +50 mV feszültség mellett, és az
áram deaktivációja is lassú (τ: 500-1000 ms).
Az IKs specifikus gátlószere a HMR-1556, mely az áramot nanomólos koncentrációban
gátolja. Az áram gátlására gyakran használják még a chromanol-293B-t, ami azonban
nagyobb koncentrációkban már az Ito-t is képes gátolni [119]. Az áram további gátlószerei
közé tartozik a mefloquine és az azilimide. Az extracelluláris K+ koncentráció nincs közvetlen
hatással a csatornák vezetőképességére, azonban az intracelluláris Na+ és Ca2+ koncentráció
emelkedése növeli az IKs-t. Amiodaron krónikus szedése, illetve hipotireózis csökkenti az
áramot. Az IKs amplitúdóját növeli a DIDS, mefenaminsav, nifluminsav, és az L364373 R-
izomerje (az S-izomer azonban gátolja az IKs-t).
β-adrenerg stimuláció az IKs-t is növeli. A csatornát foszforilálja a PKA, ezáltal az áram
aktivációjának feszültségfüggése negatívabb membránpotenciálok felé módosul, az aktiváció
kinetikája gyorsul, a deaktiváció időfüggése pedig lassul. α-adrenerg hatásra a PKC
foszforilálja a MinK alegységet, ami növeli az áram amplitúdóját a feszültségfüggő
paraméterek változtatása nélkül [120].
Az IKs bal kamrán belüli eloszlásában kimutathatóak transzmurális, és apiko-bazális
eltérések is. Kutya szívizmán az áram denzitása kisebb a szívbázison a szívcsúcshoz
viszonyítva [14]. A miokardium egyes rétegeit tekintve az áram denzitása nagyobb az
epikardiális, mint a midmiokardiális sejteken [104].

29
 Az IKr repolarizációban játszott szerepével szemben, az IKs hozzájárulása a normál kamrai
repolarizációhoz jelenleg is vitatott. A tanulmányok többsége az áram gátlásából következő
AP-hosszának változásból próbál következtetni az IKs szerepére. Az IKs szerepe az AP
repolarizációjában valószínűleg speciesfüggő, azonban egymásnak ellentmondó
eredményeket is közöltek. Az áram gátlása az APD-t növeli tengerimalac és humán [121]
szívizmon, míg nyúl szívizomban nincs hatása az APD-re [122]. Kutya szívizom esetén az IKs
gátlása során beszámolnak az APD nyújtásáról [123], és nem szignifikáns változásáról is
[112].
Humán szívizmon a csatornákat alkotó gének mutációja az AP-t nyújthatja, és hosszú QT-
szindrómával járhat együtt. A veleszületett hosszú QT szindróma leggyakoribb formájáért, az
1-es típusú long-QT szindrómáért (LQT1) pont a KCNQ1 gén mutációja a felelős. Emellett a
MinK fehérjét kódoló KCNE1 gén mutációja lehet felelős a long-QT szindróma 5. típusáért
(LQT5). Bár az áram csak kismértékben járul hozzá a szívizomsejtek repolarizációjához, az
akciós potenciál időtartamának növekedése esetén, illetve β-adrenerg stimuláció hatására az
IKs amplitúdója jelentősen fokozódik, megakadályozva az APD túlzott megnyúlását, és
csökkentve az aritmiák előfordulásának kockázatát [124].
Az antiaritmiás szerek kutatásában nagy újdonságnak számít az IKs-t aktiváló szerek
fejlesztése Az IKs aktiválásával ugyanis — a remények szerint — növelhető a refrakter
periódus a kamrai akciós potenciálok hosszának jelentős változása nélkül. Ezáltal
csökkenthető lenne az IKs gátló antiaritmiás szerek proaritmiás kockázata.

A befelé egyenirányító káliumáram (IK1)

Az IK1 a szívizomsejteken leírt első káliumáram, fő funkciója a nyugalmi

membránpotenciál fenntartása a diasztole alatt. Az áram hiányzik a szinuszcsomó és az AV-
csomó sejtjein. Az IK1 a szív többi sejtjén megtalálható, denzitása legnagyobb a Purkinje-
rostokon és a kamrai munkaizomrostokon, kisebb a pitvari izomsejteken. Az IK1 legfőbb
pórusformáló fehérjéje a Kir2.1. Ezt a fehérjét a 17-es kromoszóma q23 régiójában
megtalálható KCNJ2 gén kódolja, emellett az áram létrehozásában a Kir2.2 és 2.3as alegysége
is részt vesz homo- vagy heteromerek formájában. Az IK1 alfa alegysége két transzmembrán
szegmensből áll, a pórusformáló régió ezek között található. Négy alegység képez egy
funkcióképes csatornát.

30
 Egy ioncsatorna konduktanciája 9−45 pS közötti. A csatornák erősen befelé egyenirányító
karakterisztikájúak, amelyért Mg2+, valamint poliaminok (spermidin3+, spermin4+,
putreszcin2+) a csatornák intracelluláris oldalához történő feszültség- és időfüggő kötődése a
felelős [125]. Kötődésük -40 mV-nál pozitívabb membránpotenciálok esetén a kifelé irányuló
áramot deaktiválja, emiatt az IK1 az akciós potenciál felszálló szára alatt gyorsan
deaktiválódik. A plató során nem járul hozzá jelentősen a repolarizációhoz, és lehetővé teszi,
hogy a kamrai szívizomsejtek platófázisa hosszú legyen [59]. A repolarizáció
előrehaladásával a membránpotenciál egyre negatívabb lesz, és így az IK1 fokozatosan újra
aktiválódhat. Bár a repolarizáció előrehaladása során a K+ ionokra ható elektrokémiai hajtóerő
egyre csökken, a Kir2.1 csatornák konduktanciájának növekedése elegendő ahhoz, hogy az IK1
növekedjen a nyugalmi membránpotenciál helyreállításáig. Így feltehetően az IK1 felelős a
terminális repolarizáció viszonylag gyors utolsó szakaszáért, és fenntartja a nyugalmi
membránpotenciált a következő akciós potenciál kiváltásáig.
α1-adrenerg stimuláció humán pitvari munkaizomsejteken gátolja az IK1 áramot PKC
útvonalon keresztül. β-adrenerg hatás humán kamrai szívizomsejteken PKA által közvetített
foszforiláció révén gátolja az IK1-et [126]. Szívelégtelenségben szenvedő betegeken végzett
vizsgálatok során az IK1 nagymértékű csökkenését tapasztalták mind pitvari, mind pedig
kamrai miocitákon.

31
 Célkitűzés

Számos kutató vizsgálta már az adrenerg aktiváció szívre kifejtett hatását. A nagyszámú
közölt adat ellenére a β-adrenerg aktiváció egyes részletei még mindig feltáratlanok és
ellentmondásosak. Ezért célul tűztük ki, hogy kutya kamrai szívizomsejteken megvizsgáljuk a
β-adrenerg stimuláció hatását
- az akciós potenciál morfológiájára epi-, mid- és endokardiális sejteken,
- az akciós potenciál változások frekvencia-függését.
Vizsgáljuk
- az egyes ionáramok (IKs, IKr, ICa) szerepét a β-adrenerg stimulusra adott válaszban,
- az egyes ionáramok szerepét az adaptáció során,
- az ionáram-változások időbeli kialakulását,
- a hatások közvetítéséért felelős β receptort.

32
 Anyagok és módszerek

Kutya bal kamrai szívizomsejtek izolálása

Kísérleteinket kutyák szívének bal kamrájából izolált szívizomsejteken végeztük. A

sejteket ivarérett, kísérleti célra tenyésztett beagle kutyák szívéből nyertük, anterográd
szegmensperfúziós technika alkalmazásával [14]. A 10-20 kg os állatokat 10 mg/kg ketamin-
hidroklorid (Calypsol, Richter Gedeon, Magyarország) és 1 mg/kg xylazin-hidroklorid
(Sedaxylan, Eurovet Animal Health BV, Hollandia) alkalmazásával altattuk. A mellkas
megnyitása után a szívet gyorsan kiemeltük, és a bal elülső leszálló koronária ágat kanüláltuk.
Az artéria vérellátási területének megfelelően Langendorff apparátus segítségével
perfundáltuk a miokardiumot. A perfúzió első 5 percében Ca2+ mentes, taurinnal (2,5 g/l),
piruváttal (175 mg/l), ribózzal (750 mg/l), allopurinollal (13,5 mg/l) és NaH2PO4-tal (200
mg/l) módosított JMM oldatot (Minimum Essential Medium Eagle; Joklik-féle módosítás,
termékszám: M 0518; Sigma) alkalmaztunk a szövet Ca2+ és vértartalmának eltávolítása
céljából.
Ezt a kimosási fázist követően a preparátumot megközelítőleg 25 percig perfundáltuk
kollagenázzal (660 mg/l, 215 u/mg Type II.; Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ,
USA.), borjú albuminnal (2 g/l, Fraction V.; Sigma) és CaCl2-dal kiegészített (50 µM) JMM
„emésztő” oldattal. A sejtizolálás során az oldatokat végig karbogénnel (95% O2, 5% CO2)
equilibráltuk és a perfúziós oldat hőmérsékletét 37 °C-on tartottuk. Az emésztőoldattal történő
perfúzió végén a bal kamra falának midmiokardiális rétegét apró darabokra vágtuk, és az
elfolyósodott szövetdarabokat 50 µM kalciumot tartalmazó, a kimosáshoz is használt
módosított JMM oldatban szuszpendáltuk. Egyes kísérleteinknél a bal kamrai epi-, illetve
endokardiális rétegeket használtuk fel, ebben az esetben az emésztés végén a kamrafal
legkülső, illetve legbelső vékony rétegét vágtuk le, és szuszpendáltuk JMM oldatban.
A sejtszuszpenziókat többször ülepítettük, szűrtük és mostuk egyre növekvő
kalciumkoncentrációjú módosított JMM oldattal. Az izolálást követően a szuszpenzióban levő
sejtek mintegy 40–80 %-a pálcika alakú volt és tiszta harántcsíkolatot mutatott 2,5 mM
kalciumot tartalmazó oldatban (7. ábra). A sejtizolálás befejezése után két-három órával
kezdtük meg a kísérleteket. Felhasználásig a sejteket 14 °C-on tároltuk, Minimum Essential
Medium Eagle (MEM) oldatban (pH=7,4).

33
 7. ábra: Izolált kutya bal kamrai szívizomsejt. Tisztán látható a szívizomsejtekre
jellemző harántcsíkolat.

Minden elvégzett kísérlet összhangban volt a „Guide for the Care and Use of Laboratoy
Animals” (US NIH publication No 85-23. revised 1996) és a Helsinki Deklaráció
alapelveivel. A kísérleti protokollt a Debreceni Egyetem Munkahelyi Állatetikai Bizottsága is
jóváhagyta (2/2011/DE MÁB). A laboratóriumi állatokat felhasználó összes kísérlet jelentésre
került, összhangban az ARRIVE irányelvekkel [127]. A kutatás összhangban volt a „Good
Publishing Practice in Physiology” elveivel is [128].

Elektrofiziológiai mérések izolált sejteken

Kísérleteink során a szívizomsejteket 37 °C hőmérsékleten tartott, 1 ml térfogatú plexiüveg

mérőkádba helyeztük. A kádban levő szívizomsejteket Tyrode oldattal (144 mM NaCl, 5,6
mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM glükóz; pH=7,4),
folyamatosan, 10 ml/perc sebességgel perfundáltuk. A mérések során a Tyrode oldatot
egészítettük ki a megfelelő ioncsatorna-gátló szerekkel, illetve a vizsgált jelátviteli
útvonalakat befolyásoló drogokkal (1. táblázat).
Valamennyi felhasznált vegyszer a Sigma-Aldrich Kft.-től (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA) származott a II-es típusú kollagenáz kivételével, mely a Worthington Biochemical
Corp., Lakewood, NJ, USA terméke. Az izoproterenolt minden kísérlet előtt közvetlenül
oldottuk fel Tyrode oldatban.

34
 Alkalmazott szer Alkalmazott koncentráció Hatás
Nifedipin 5 µM ICa,L gátlószer
Nikkel (II)-klorid 5 mM ICa,T gátlószer
HMR 1556 1 µM IKs gátlószer
E-4031 1 µM IKr gátlószer
Forskolin 3 µM Adenilát-cikláz 5,6 aktivátor
CGP-20712A 300 nM Szelektív ß1 -receptor gátlószer
Izoproterenol 1-1000 nM Nem szelektív ß-receptor aktivátor
ICI 118,551 50 nM Szelektív ß2 -receptor gátlószer
IBMX 10 µM Foszfodiészteráz gátlószer
4-AP 3 mM Ito1 gátlószer
TEACl 20 mM Nem szelektív K+ csatorna gátlószer
1. táblázat: A mérések során használt szerek, a használt koncentrációk és hatásuk

Az elektrofiziológiai mérések kivitelezéséhez Axoclamp-2B, Axopatch 200B (Axon

Instruments Inc., Foster City, CA, USA) és Multiclamp-700A (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA, USA) erősítőket használtunk. A számítógépes vezérléshez és adatgyűjtéshez
pClamp 6.0, és pClamp 9.0 szoftvereket (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)
alkalmaztunk. Az erősítő és a számítógépes szoftver közötti kapcsolatot Digidata 1200 A/D-
D/A (Axon Instruments Inc., Foster City, CA, USA) jelátalakító teremtette meg. Az erősítőből
származó analóg jeleket oszcilloszkópon is megjelenítettük (8. ábra).

35
 Hagyományos feszültség-clamp mérések

A feszültség-clamp és akciós potenciál feszültség-clamp mérésekhez 1,5-2,5 MΩ

ellenállású boroszilikát mikroelektródákat használtunk. A különböző káliumáramok
feszültség-clamp méréseihez használt belső pipettaoldat az alábbi anyagokat tartalmazta: 100
mM K-aszpartát, 45 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 3 mM K-ATP, 5 mM HEPES;
pH=7,2. Kalciumáram mérésekor a belső pipettaoldat módosult, és a következőket
tartalmazta; 110 mM KCl, 40 mM KOH, 20 mM TEACl, 10 mM EGTA, 3 mM K-ATP, 10
mM HEPES; pH=7,2. Az ioncsatornák foszforilálásához a kálium- és kalciumáramok
mérésekor használt belső oldatokat kiegészítettük 3 µM forskolinnal. A szívizomsejteken
mérhető ionáramokat farmakológiai és kinetikai sajátságaik alapján különítettük el.

8. ábra: Az elektrofiziológiai mérőrendszer vázlata

Az árammérések a patch-clamp technika egész sejtes konfigurációjában történtek. Ehhez a

pipetta hegyét a sejt felszínéhez érintve enyhe szívást alkalmaztunk, elősegítve a
nagyellenállású kapcsolat (1–10 GΩ; ún. „gigaseal”) kialakulását. A gigaseal kialakulása után
további szívással, vagy 1-5 ms hosszú, 1,5 V nagyságú elektromos impulzus alkalmazásával
szakítottuk át a pipetta hegye alatti membrándarabot az egészsejtes elrendezés eléréséhez. A
sejtek membránfelületének kapacitását minden kísérlet előtt 10 ms hosszú, -10 mV-ról -20
mV-ra történő hiperpolarizáció segítségével megmértük, és az ionáramokat az így kapott

36
sejtkapacitásra vonatkoztattuk. A feszültség-clamp kísérletekhez felhasznált szívizomsejtek
átlagos kapacitása 137±5 pF volt. A mérési elrendezés teljes soros ellenállása általában 4-8
MΩ-nak adódott, melyet hagyományos feszültség-clamp méréseknél 50–80%-ban
kompenzáltunk. Amennyiben a soros ellenállás ennél nagyobb volt, vagy a kísérlet során
jelentősen változott, a kísérletet sikertelennek tekintettük. A kapott áramgörbéket 100 kHz-es
mintavételi frekvenciával digitalizáltuk, és számítógépen tároltuk a későbbi értékelésig.

Az IKr mérése

Az IKr mérése során a sejteket −40 mV-os tartópotenciálon tartottuk, ami a feszültségfüggő
nátrium csatornákat inaktív állapotban tartotta. Az áramot egy 250 ms hosszú, +10 mV-ra
történő depolarizációs impulzus segítségével aktiváltuk, majd a membránpotenciált
visszaállítottuk a -40 mV-os nyugalmi értékre. Az ingerlési frekvencia 0,05 Hz volt. A
feszültségfüggő kalciumcsatornák aktivációját 5 µM nifedipin alkalmazásával gátoltuk, az IKs
aktiválódását 1 µM HMR-1556-tal akadályoztuk meg. Az áramgörbék analízise során a
farokáram amplitúdóját mértük, melyet a -40 mV-ra történő repolarizáció során mért áram
csúcsértékének és a repolarizációs lépcső végén mért áram különbségéből számoltunk (9.
ábra).

9. ábra: Az IKr viselkedése depolarizáló négyszögimpulzus hatására. Reprezentatív IKr

áramgörbe az alkalmazott feszültségparancs lefutásával együtt ábrázolva. Az IKr
depolarizáció hatására aktiválódik és ugyanekkor inaktiválódik is, majd a sejtmembránt −40
mV-ra repolarizálva az ioncsatornák gyorsan visszatérnek az inaktivációból. Ezt követően
az IKr lassan deaktiválódik.

Az IKs mérése

Az IKs mérése során a feszültségfüggő nátrium csatornák inaktivációja érdekében a sejteket

-40 mV-os tartópotenciálon tartottuk. Az IKs-t egy 3 másodperc hosszú, +30 mV-ra történő

37
depolarizációs impulzus segítségével aktiváltuk. Az impulzust követően a membránpotenciált
a nyugalmi értékre állítottuk vissza. Az IKr-t 1 µM E-4031, míg a feszültségfüggő
kalciumcsatornákat ez esetben is 5 µM nifedipin alkalmazásával gátoltuk. Az ingerlési
frekvencia 0,1 Hz volt. Az analízis során a farokáram amplitúdóját mértük. A -40 mV-ra
történő repolarizáció során az áram csúcsértékének és a repolarizációs lépcső végén mért
értékének különbségéből számoltuk a farokáram amplitúdóját (10. ábra).

10. ábra: Az IKs viselkedése depolarizáló négyszögimpulzus hatására. Reprezentatív IKs

áramgörbe az alkalmazott feszültségparancs lefutásával együtt ábrázolva. Az IKs a
depolarizációt követően lassan aktiválódik, majd a -40 mV-ra történő repolarizáció hatására
gyorsan deaktiválódik.

Az ICa,L mérése

Az L-típusú kalciumáram mérésekor -40 mV-os tartófeszültséggel biztosítottuk a

feszültségfüggő nátriumcsatornák inaktivációját. Az áramot egy 400 ms hosszú, +5 mV-ra
történő depolarizációs impulzus segítségével aktiváltuk.
Az aktiváló impulzust követően a membránpotenciált a nyugalmi értékre állítottuk vissza.
A különböző, feszültségfüggő káliumcsatornák gátlására az extracelluláris oldatban 1 µM E-
4031 (IKr gátlószer), 1 µM HMR-1556 (IKs gátlószer) és 3 mM 4-aminopyridin (Ito gátlószer)
volt jelen. Az áram amplitúdóját a depolarizáló pulzus során kapott negatív csúcs és a
depolarizáló pulzus végén mért értékek különbségéből számoltuk (11. ábra).

38
 11. ábra: Reprezentatív ICa áramgörbe az alkalmazott feszültségparancs lefutásával együtt
ábrázolva. Az ICa a depolarizációt követően gyorsan aktiválódik, majd inaktiválódik.

Akciós potenciál mérések

Az izolált szívizomsejtek transzmembrán potenciáljait 3 M KCl oldattal töltött boroszilikát

mikroelektródákkal regisztráltuk, melyek ellenállása 20−40 MΩ volt. A sejteket folyamatosan
1 Hz frekvenciával, 1 ms szélességű négyszögimpulzusok alkalmazásával ingereltük, melyek
amplitúdóját az ingerküszöb 110−120%-ára állítottuk, így az ingerlés artefaktuma és az AP
felszálló szára között 1−2 ms szünet jött létre. Az AP-okat 200 kHz-es mintavételi
frekvenciával digitalizáltuk, és számítógépen tároltuk a későbbi értékelésig. Mivel a
citoplazmát nem dializáltuk, az akciós potenciál spontán, időfüggő változása legalább egy
óráig elhanyagolható volt ilyen kísérleti feltételek mellett.
Az akciós potenciálok paraméterei közül meghatároztuk a nyugalmi membránpotenciált, a
nulladik fázis maximális meredekségét (Vmax), az akciós potenciál amplitúdóját (APA) és a
repolarizáció 20%-áig, feléig és 90%-áig eltelt időket (rendre APD20, APD50 és APD90). A
nyugalmi membránpotenciál meghatározásakor a diasztolés időtartamból 2 ms-ot átlagoltunk.
A Vmax meghatározásakor az első fázis deriválásával határoztuk meg a változás maximális
sebességét. Az APA-t a nulladik fázis csúcsa és a nyugalmi membránpotenciál különbségéből
számoltuk. Az akciós potenciál időtartamának meghatározásához a repolarizáció 90%-áig
eltelt időtartamot (APD90) használtuk fel. A platópotenciál értékeit az AP időtartamának
felénél (APD90/2) mértük (Vplató). Az akciós potenciálok mérése során minden vizsgált szerrel
legalább 5 percig, vagy a teljes hatás kialakulásáig perfundáltuk a sejteket.

39
 Akciós potenciál voltage clamp

Az akciós potenciál clamp technika a feszültség-clamp technika speciális változata [129].

A módszer lényege, hogy parancsjelként a sejt saját akciós potenciálját alkalmazzuk, nem a
hagyományos feszültség-clamp eljárásnál megszokott négyszög alakú feszültségjelet vagy
feszültségrámpát. További lényeges eltérés a két eljárás között, hogy a hagyományos
feszültség-clamp technika alkalmazása során az extracelluláris, és az intracelluláris tér
összetételét úgy állítjuk be, hogy a mérés során a membránon kizárólag az általunk vizsgálni
kívánt áram haladjon keresztül. Ehhez sokszor a szervezetben élettani esetben elő sem forduló
ionokat (pl. Cs+, Ba2+), és ioncsatorna-gátlószereket használunk. Ezzel szemben az akciós
potenciál clamp technika alkalmazása során a fiziológiás állapotot a lehető legjobban
megközelítő feltételeket biztosíthatjuk a sejtek számára. Az extracelluláris és intracelluláris
tér összetétele az élettanival egyező lehet, csak a vizsgált ionáram szelektív gátlószerét kell
alkalmaznunk. Az akciós potenciál clamp technika során feltétel, hogy a membránon áthaladó
valamennyi nem vizsgált áram a kísérlet teljes időtartama alatt változatlanul a fiziológiás
értéken maradjon.
Az akciós potenciálokat egészsejtes elrendezésben, áram-clamp üzemmódban rögzítettük
normál Tyrode oldatban. A sejteket folyamatosan 1 Hz-es frekvenciájú 1 ms széles küszöb
feletti négyszögjellel ingereltük úgy, hogy az ingerlés amplitúdóját az ingerküszöb
110−120%-ára állítottuk, így az ingerlés artefaktuma és az AP felszálló szára közötti 1−2 ms
szünettel a stimulus műtermékét az akciós potenciál felszálló szárától el tudtuk különíteni.
Sejtenként tíz egymást követő akciós potenciált rögzítettünk 100 kHz-es mintavételi
frekvenciával, majd ezeket átlagoltuk. Feszültség-clamp üzemmódra kapcsolva ezt az átlagolt
jelet használtuk ugyanazon a sejten 1 Hz-es ingerlési frekvenciával feszültségparancsként. Az
így kapott áramjel — a kezdeti néhány ms kapacitív tranziensének kivételével — a nulla
vonalban futó vízszintes görbe volt [129]. Az egyes ionáramokat specifikus gátlószerek
alkalmazásával különítettük el. A gátlószer alkalmazása során visszajátszott AP az áramjel
lefutását módosította, mert a gátolt áramot az erősítőnek kellett pótolnia. Az ionáramok
profilját úgy kaptuk meg, hogy a szerek alkalmazása előtti (végig közel nulla) áramgörbéből
kivontuk a szerhatás után mért áramgörbét.

40
 Az analízis során felhasznált matematikai formulák
1
I norm = n 1. egyenlet
E 
1 +  0,5 
 A 
ahol
E0,5 a félgátló koncentráció (Inorm=0,5),
A a vizsgált anyag koncentrációja,
n a görbe meredeksége, a Hill-koefficiens.

I 1
= V0 , 5 −V 2. egyenlet
I max
ahol 1+ e k

I/Imax a normalizált áram,

V az aktuális membránpotenciál értéke,
V0,5 az a membránpotenciál ahol I=Imax/2,
k a görbe meredeksége.

I = Ai (1 − e ( −t / τ i ) ) + C 3. egyenlet
ahol
A az amplitúdó,
τ az időállandó,
C konstans.

Statisztikai elemzés

A közölt adatok a kísérleti eredmények számtani középértékei ± a középérték körüli

standard hiba. A csoportok összehasonlítása során egyszempontos variancia-analízist
használtunk, melyet Bonferroni-teszt követett, vagy Student-féle kétmintás t-próbát, illetve
önkontrollos t-próbát alkalmaztunk az adott statisztikai kérdéseknek megfelelően. Az adatok
közötti korrelációk meghatározásához lineáris regressziót használtuk. Az eltéréseket p≤0,05
esetén tekintettük szignifikánsnak, melyeket csillag vagy kettőskereszt jelöl.

41
 Eredmények

Izoproterenol hatása az AP morfológiára

Az adrenerg stimuláció akciós potenciálra kifejtett hatását enzimatikusan izolált kutya

kamrai szívizomsejteken vizsgáltuk. Munkánk során izoproterenollal (ISO) aktiváltuk a
szívizomsejtek felszínén megtalálható β-adrenerg receptorokat. Az izoproterenol egy nem
szelektív β-adrenerg agonista, a szívizom α-adrenerg receptorait csak kismértékben aktiválja.
Az akciós potenciál mérések a korábban leírt technikával történtek.
Az izoproterenol hatására két karakterisztikus változás jött létre kutya kamrai
midmiokardiális sejtek akciós potenciálján. Egyrészt emeli, vagyis pozitívabb
membránpotenciálok irányába mozdítja el az akciós potenciál platóját, másrészt rövidíti az
akciós potenciál teljes időtartamát (12. ábra). Mindkét megfigyelt változás reverzíbilisnek
bizonyult az izoproterenol kimosása során.
Az ISO dózisfüggő hatásának tanulmányozása során a sejteket kumulatív módon 1, 10,
majd 100 nM izoproterenolt tartalmazó Tyrode oldattal perfundáltuk. Az egyes
koncentrációkat a teljes hatás kifejlődéséig, 3-4 percig alkalmaztuk. Az izoproterenol által
létrehozott AP paraméterek valamennyi kísérlet során a kísérletek befejezéséig – amennyiben
nem alkalmaztunk valamiféle gátlószert – nem csökkentek az idő előrehaladtával; ebből arra
következtettünk, hogy a mérések ideje alatt nem következett be a β-adrenerg rendszer
deszenzitizációja. Megállapítottuk, hogy az átlagosan 215±9,1 ms hosszú kontroll akciós
potenciálokat 1 nM izoproterenol 201,7±9,2 ms-ra, 10 nM izoproterenol 195,6±6,6 ms-ra, 100
nM izoproterenol pedig 201,6±6,1 ms-ra rövidítette (n=9, p≤0,05). Ugyanekkor a
platópotenciál a kontroll -3,3±2mV értékről 1 nM ISO hatására 2,05±2,5 mV-tal, 10 nM ISO
esetén 14,7±2,3 mV-tal, és 100 nM ISO alkalmazása során 22±2 mV-tal emelkedett (12. ábra
B és C panel) Mind az APD90, mind a platópotenciál változás is szignifikáns 10-100 nM
izoproterenol koncentráció mellett (p≤0,05, n=9). Az izoproterenol hatása reverzibilis volt, az
APD90 és a platópotenciál értékei 5 perc kimosás után rendre 216,8±9,9 ms, és 0,2±2,2 mV
voltak.
A további AP-mérésekhez 10 nM izoproterenolt alkalmaztunk, mert ez a koncentráció
közel maximális választ hozott létre, és a 100 nM-al ellentétben nem növelte az
utódepolarizációk gyakoriságát. Az izoproterenolnak ez a koncentrációja más fajok szívizmán
is közel maximális választ vált ki [130].

42
 12. ábra: Izoproterenol hatása az akciós potenciál konfigurációjára. A; reprezentatív akciós
potenciálok Tyrode-oldatban, 10 nM izoproterenol jelenlétében és kimosás után. Szaggatott
vonal jelöli a 0 mV feszültséget. B, C: az ISO koncentráció-függő hatásai az akciós
potenciál felénél mért platópotenciálokra (B), és a repolarizáció 90%-ánál mért AP-
időtartamokra (APD90, C panel). A kísérleteket 1Hz-es ingerlőfrekvencián végeztük. A
kontrolltól való szignifikáns (p≤0,05) eltérést csillag jelzi. Az n jelöli a kísérletek számát.

Az izoproterenol hatása függ az AP morfológiájától és az ingerlési

frekvenciától

A különböző fajok eltérő AP-morfológiája részben magyarázhatja az adrenerg stimuláció

már említett fajfüggő AP-időtartam változásait. Emellett a kamrai szívizomzat AP-jának
transzmurális inhomogenitása az egyes szívizom-rétegekben szintén hozzájárulhat az eltérő
eredményekhez. Mivel az akciós potenciál kiindulási morfológiájának szerepe nem kizárható
az adrenerg stimuláció által kiváltott hatások esetén, ezért vizsgáltunk az izoproterenol hatását
a különböző transzmurális régiókból származó sejteken is. A sejt származási helye
43
önmagában nem biztosíték annak epi-, mid- vagy endokardiális jellegére, de az akciós
potenciál morfológiájával együtt vizsgálva az egyes sejtek besorolása egyértelmű volt.
Munkacsoportunk korábbi kutatásai során kimutatta, hogy a szívizom akciós potenciáljának
időtartama fordított frekvenciafüggést mutat, azaz alacsonyabb ingerlési frekvencia mellett az
AP időtartama megnyúlik, míg rövidebb ciklusidő esetén megrövidül [131]. Emellett Rochetti
és munkatársai kimutatták, hogy tengerimalac szívizomsejteken az izoproterenol AP-re és az
azt létrehozó ionáramokra kifejtett hatása is frekvenciafüggő [4], ezért kutya szívizomsejteken
vizsgáltuk, hogy az ingerlési frekvencia miként befolyásolja az izoproterenol kezelést. Az
ingerlési frekvenciát a kísérletek során 0,2 és 3 Hz között változtattuk. Egy adott frekvencián
a Tyrode-oldatban mért akciós potenciál időtartamát tekintettük kontrollnak, és ehhez a
kiindulási időtartamhoz viszonyítottuk az ISO hatására bekövetkező APD90 változást.

13. ábra: Az izoproterenol hatásának fordított frekvenciafüggése. A: 10 nM ISO okozta

APD90 csökkenés az alkalmazott ciklusidő függvényében ábrázolva. B: Az A panelen
bemutatott kísérletek eredményei a kontroll akciós potenciál idejének függvényében
ábrázolva. A kontrolltól való szignifikáns (p≤0,05) eltérést csillag jelöli, n a kísérletek
számát mutatja.

Midmiokardiális sejteken az ISO okozta AP-rövidülés fordított frekvenciafüggőnek

bizonyult, a legnagyobb változást alacsony frekvenciáknál, és a leghosszabb kontroll AP
esetében tapasztaltuk (n=6) (13. ábra). Az ingerlési frekvencia növelésével a ciklushossz és az
AP-időtartam csökkenésével párhuzamosan az adrenerg aktiváció okozta változás nagysága is
csökkent. A változások mértékét a 13-as ábra B panelje szemlélteti, ahol a β-adrenerg
stimuláció rövidítő hatását a kontroll akciós potenciál hosszának függvényében ábrázoltuk.

44
Az ábra demonstrálja, hogy az ISO APD-rövidítő hatása a leghosszabb AP esetén bizonyult a
legnagyobbnak.
Az ISO hatását megvizsgáltuk epi- és endokardiális sejteken is. Megállapítottuk, hogy
epikardiális sejteken – a midmiokardiumból származó sejtekhez hasonlóan – az ISO pozitív
irányba mozdította el a platópotenciálokat, emellett frekvenciafüggő módon rövidítette az AP
időtartamát (14. ábra A és C panel). Ugyanekkor az endokardiális sejtek esetén az adrenerg
stimuláció nem rövidítette az akciós potenciál időtartamát (14. ábra B panel), az általunk
vizsgált 0,3-tól 5 másodpercig tartó ciklusidők során az AP időtartama egyszer sem változott
szignifikánsan (14. ábra C panel).

14. ábra: Az akciós potenciál morfológiájának szerepe az izoproterenol indukálta

változásokban. Reprezentatív akciós potenciálok mutatják az ISO hatását epikardiális (A),
valamint endokardiális sejten (B), 1 Hz ingerlési frekvencia mellett. C: epikardiális
(körök) és endokardiális sejtek (háromszögek) akciós potenciál hosszának változása
különböző ingerlési frekvenciákon vizsgálva. D: Midmiokardiális sejtek APD90 értékének
változása ISO hatására különböző ingerlési frekvenciákon vizsgálva kontroll körülmények
között (négyzetek), valamint 4-aminopyridin (rombuszok). A kontrolltól való szignifikáns
(p≤0,05) eltérést csillag jelzi. A kísérletek számát n jelöli.
45
 Ezt követően megvizsgáltuk, hogy az általunk megfigyelt változások mennyiben függenek
az első fázis amplitúdójától, hiszen az epikardiális és endokardiális AP-k között ez az egyik
legszembetűnőbb különbség. Az AP első fázisának létrehozásáért az Ito felelős, amely
midmiokardiális sejteken nagyobb amplitúdójú az endokardium sejtrétegéhez viszonyítva. Az
első fázis szerepének tisztázásához midmiokardiális sejteken 1 mM 4-aminopiridinnel
gátoltuk az Ito-t, ennek hatására a midmiokardiális sejtek akciós potenciálja az endokardiális
sejtekéhez vált hasonlóvá. A 4AP-vel előkezelt midmiokardiális sejteken aktiváltuk a β-
adrenerg receptorokat, a korábbiakhoz hasonlóan 10 nM izoproterenollal. Az ilyen módon
megváltoztatott AP-k hossza az ISO kezelés hatására egyetlen vizsgált frekvencián sem
csökkent (14. ábra D panel). Ebből arra következtettünk, hogy az akciós potenciál
morfológiája befolyásolja a β-adrenerg stimuláció akciós potenciál időtartamát módosító
hatását, és a rövidítő hatáshoz szükséges az AP úgynevezett „spike and dome” konfigurációja.

Az izoproterenol módosító hatásában részt vevő ionáramok azonosítása

A β-adrenerg stimulus során számos ioncsatorna-fehérje foszforilálódik, ezáltal növelve a

csatornán átfolyó ionáram amplitúdóját. Az izoproterenol által befolyásolt áramok közül az L-
típusú kalciumáram növelése régóta ismert, Emellett a késői káliumáram komponenseinek,
különösen az IKr-nek tulajdonítanak jelentős szerepet az AP időtartamának meghatározásában.
Munkacsoportunk korábban már kimutatta, hogy a késői káliumáram lassú komponense is
megnövekszik β-adrenerg stimulusra [7]. Kísérleteinkben ezért kamrai midmiokardiális
sejteken vizsgáltuk az ISO hatását az ICa, az IKr és IKs áramokra.
Midmiokardiális sejteken megvizsgáltuk, hogy az IKr, IKs, valamint az ICa előzetes gátlása
hogyan módosítja az adrenerg stimuláció hatását az AP lefutására. Az eredményeket a csak
izoproterenol jelenlétében, 1 Hz frekvencián mért eredményekhez hasonlítottuk, ahol az ISO
6,8±0,9 mV-os platónövekedést, és 20,4±5,8 ms-os APD90-rövidülést okozott. Kontrollként a
különböző gátlószerekben rögzített AP-kat használtuk.
Az IKr előzetes blokkolására 1 µM E-4031-et használtunk. 1 µM E-4031 az akciós
potenciált szignifikánsan megnyújtotta, majd a sejteket 10 nM ISO és 1 µM E-4031-el
perfundáltuk. A kísérlet végén az izoproterenolt kimostuk a rendszerből.
Megállapítottuk, hogy az IKr előzetes gátlása nem befolyásolta az izoproterenol akciós
potenciált módosító hatását; az akciós potenciál időtartama rövidült, és a platópotenciál is
emelkedett az E-4031et tartalmazó kontrollhoz képest. Az ISO hatása reverzibilis volt (15.
ábra A panel) A kísérletet nyolc sejten elvégezve azt tapasztaltuk, hogy E-4031 és ISO

46
jelenlétében kapott APD90 rövidülés (19,1±8,4 ms), és a platópotenciál emelkedése (6,12±0,8
mV) is közel azonos mértékűek voltak a gátlószer nélküli Tyrode oldatban elértekkel.

15. ábra: Izoproterenol hatása az akciós potenciál konfigurációjára ioncsatorna-gátlók

jelenlétében. A reprezentatív akciós potenciálokat 1µM E-4031 (A), 10 µM HMR-1556
(B), és 5µM nizoldipin (C) alkalmazása mellett rögzítettük. Az izoproterenol okozta
átlagos APD90 változásokat a D panel, míg a platópotenciál változásokat az E panel
mutatja. A kontrolltól való szignifikáns (p≤0,05) eltérést csillag jelzi. A kísérletek számát
n jelöli.

47
 Az IKs gátlására 10 µM HMR-1556-t használtunk, és ebben a kísérletsorozatban a HMR-
1556 jelenlétében mért AP-t tekintettük kontrollnak. A HMR-1556 önmagában alig
befolyásolta az AP paramétereit, azonban ISO hatására a platópotenciál szignifikáns növelése
mellett az APD a várakozásainkkal ellentétben nem csökkent, hanem 16,6±6,3 ms-al nőtt
(n=8, p≤0,05). Az ISO hatása ez esetben is reverzibilis volt (15. ábra B panel). Nyolc mérés
átlaga alapján a HMR-1556ot tartalmazó oldatban izoproterenollal elért platópotenciál-
emelkedés 8,9±0,88 mV-nak adódott. Ezek a platópotenciál-változások némileg nagyobbak
voltak, mint a Tyrode-oldatban tapasztaltak, a különbség azonban nem volt szignifikáns (n=8,
n.s.).
Az L-típusú kalciumcsatornákat 5µM nizoldipinnel gátoltuk, amely meggátolta az AP
platófázisának kialakulását (15. ábra C panel). β-adrenerg stimuláció hatására a nizoldipin
által módosított AP platópotenciálja nem változott jelentősen, hat mérés átlaga alapján
0,58±0,8 mV-os platópotenciál-csökkenést figyeltünk meg (n.s. n=6). A nizoldipinnel gátolt
akciós potenciál hossza sem változott szignifikánsan, 3,9±5,6 ms-os nyúlást tapasztaltunk
(n.s. n=6). Az AP időtartama nizoldipin és izoproterenol jelenlétében annak ellenére nem
változott, hogy a késői káliumáram komponenseit ebben az esetben nem blokkoltuk
specifikus gátlószerekkel. Egyik eltérés sem volt szignifikáns, és az ISO kimosása során sem
kaptunk jelentős változást.
Az egyes ionáramok β-adrenerg stimulációban betöltött szerepének pontosabb
meghatározásához hagyományos patch-clamp technika egészsejtes konfigurációjában mértük
ICa, IKr és IKs ionáramokat.
Az ionáramok méréséhez az anyagok és módszerek részben leírt gátlószereket, illetve
feszültség-protokollokat használtuk. Az izoproterenol nélkül mért áram amplitúdót tekintettük
kontrollnak. A sejteket 1 nM-tól 1 µM-ig egyre növekvő koncentrációjú izoproterenolt
tartalmazó oldattal perfundáltuk, és az ionáramok amplitúdójának változását vizsgáltuk. Az
ISO minden koncentrációját 2-3 percig adagoltunk a sejteknek, ennyi idő alatt az ISO
kifejtette a maximális hatását. Az áram amplitúdóját a sejtkapacitásra normalizáltuk, és az idő
függvényében ábrázoltuk. A kísérleteket követően a kimosás 5-10 percig tartott.
A 16. ábra bal oldalán egy-egy reprezentatív kísérlet eredményét mutatja. A 16. ábra A
részén egy reprezentatív ICa látható. Az ICa amplitúdója dózisfüggő módon növekedett. 100
nM izoproterenol közel maximális változást hozott létre, 1 µM-ra növelve a koncentrációt
nem kaptunk további jelentős növekedést.

48
 16. ábra: Az izoproterenol koncentrációfüggő hatásai az ICa (A, B), IKr (C, D) és IKs (E, F)
ionáramokra. A baloldali panelek egy-egy reprezentatív árammérést mutatnak, melyeknél
a sejtkapacitásra normalizált áramamplitúdókat ábrázoltuk az eltelt idő függvényében. Két
pont között az A,C és E paneleknél rendre 5, 20, illetve 10 másodperc telt el. Függőleges
szaggatott vonalak jelzik az egyre növekvő koncentrációjú izoproterenol perfúziójának,
illetve a kimosásnak a kezdetét. A kontroll áramamplitúdóra normalizált változást a jobb
oldali panelek ábrázolják az alkalmazott ISO-koncentráció függvényében, mellettük a Hill
egyenlet illesztésével kapott értékeket ábrázoltuk. Az átlagértékeket szimbólumok, a
szórást függőleges vonalak mutatják. A kísérletek számát n jelöli.

Öt mérés eredményei alapján meghatároztuk a kalciumáram amplitúdójának ISO-függését

(16. ábra B panel). A kontroll körülmények között mért áram amplitúdóját vettük 1-nek, és
ehhez viszonyítottuk az áram változásait. Az eredményeket Hill-egyenlettel (1. egyenlet)

49
illesztve a válasz relatív maximuma 3,40±0,13-nak, az izoproterenol félaktiváló
koncentrációja 15,3±3,5 nanomólnak, a Hill-koefficiens pedig 1,32±0,04-nak adódott.
Az IKr mérése során a farokáram amplitúdójának változásait vizsgáltuk (16. ábra C és D
panel). Az ISO ez esetben is koncentrációfüggő módon növelte az IKr amplitúdóját, ennek
mértéke azonban jelentősen elmaradt a kalciumáramnál tapasztaltakhoz viszonyítva. Nyolc
kísérlet eredményét az az ISO koncentráció függvényében ábrázoltuk (16. ábra D panel), Hill-
egyenlettel illesztve a maximális válasz 1,33±0,01 volt. A félhatásos ISO koncentráció
13,7±2,5 nM, a Hill koefficiens pedig 1,21±0,28 volt.
Az IKs amplitúdója is dózisfüggő módon nőtt izoproterenol hatására, már 10 nM ISO is
közel duplájára növelte az IKs amplitúdóját (16. ábra E panel). A kumulatív dózis-hatás görbét
a korábbiak szerint ábrázoltuk (16. ábra F panel) és illesztettük Hill-egyenlettel. A β-adrenerg
stimuláció - az IKr-el ellentétben - jelentősen növelte az IKs-t, 4,20±0,04-re fokozva a
farokáram amplitúdóját. Az ISO IKs-t növelő félhatásos koncentrációja a többi áramhoz
hasonlóan 14,5±1,1 nM volt, a Hill koefficiens 0,84±0,05-nak adódott.
Az árammérésekkel kapott eredmények összhangban vannak az AP-mérésekkor
tapasztaltainkkal, nevezetesen a β-adrenerg stimulusra bekövetkező ICa és IKs amplitúdó
növekedés lehet felelős a plató emelkedéséért és az AP rövidüléséért. Az egyes kísérletek
alapján meghatározott félhatásos koncentrációk és a Hill-koefficiensek alapján feltételeztük,
hogy az áramok fokozása egy közös jelátviteli útvonallal valósul meg.
A hagyományos patch-clamp technika alkalmazásakor az ioncsatornákat
négyszögimpulzusokkal aktiváljuk, és equilibrium körülmények között vizsgáljuk a
viselkedésüket. Az AP alatt azonban a membránpotenciál folyamatosan változik, az
ioncsatornák nem egyensúlyi körülmények között működnek. Mivel a vizsgált ionáramok
viselkedése jelentősen eltérhet az equilibrium és nem-equilibrium állapotok között - azaz a
hagyományos feszültség-clamp négyszögimpulzusa és az AP lefutása alatt - ezért az
izoproterenol ionáramokat módosító hatását AP feszültség-clamp módszerrel is
megvizsgáltuk.
Elsőként a sejteket 1 nM és 1 µM között növekvő koncentrációjú izoproterenollal
perfundáltuk (17. ábra A panel). Az ISO növekvő koncentrációjának hatására két jól
elkülöníthető áramcsúcs jelent meg az áramgörbén. Az áramcsúcsok közül az első az AP
lefutását tekintve korábban jelenik meg és negatív irányú, vagyis befelé irányuló (inward)
áram, míg a később megjelenő pozitív irányú kitérés kifelé irányuló (outward) áramot jelez.

50
 17. ábra: Izoproterenol koncentrációfüggő hatása a sejtek membránáram-változására (Im)
akciós potenciál feszültség clamp mérés során (A). A parancsjelként szolgáló AP a
legfelső görbén látható. Alatta a kumulatív ISO dózisok hatásait, míg a legalsó görbén az
izoproterenol kimosásának eredményét ábrázoltuk. A lefelé irányuló kitérések befelé, míg
a felfelé mutatóak kifelé irányuló ISO-aktivált áramokat jelölnek. A szaggatott vonalak
nulla mV-os membránpotenciált, illetve nulla membránáramot jelölnek. B; Áram-
feszültség kapcsolat (fázissík diagram); a 100 nM ISO által aktivált membránáramokat az
AP időtarama alatt mért aktuális membránfeszültség függvényében ábrázoltuk.

A 17. ábra B panelén látható fázissík-diagram (áram-feszültség görbe) alapján a kezdeti

befelé irányuló áramot az ICa, a későbbi kifelé irányulót pedig az IKs és az IKr alkotja. A
megfigyelt változások reverzibilisek voltak, az adrenerg stimulus megszűnte után a kitérések
is közel nullára csökkentek. A további AP-clamp kísérletekben a maximális hatás eléréséhez
100 nM koncentrációjú izoproterenolt alkalmaztunk, kombinálva a korábban használt
különböző ioncsatorna-blokkolókkal. A mérések menete a következő volt: a sejteket egy
specifikus gátlószerrel perfundáltuk, és áram-clamp módban rögzítettük a sejt saját AP-jét,
majd feszültség-clamp módra váltottunk, és a rögzített AP-t használtuk parancsjelként. Ezután
a sejteket a gátlószert és 100nM ISO-t tartalmazó oldattal perfundáltuk. A méréseket többször
megismételve átlagoltuk a különböző gátlószerekkel mért parancsjeleket, valamint a kapott
áramgörbéket is. Minden esetben a görbék átlagait folyamatos, a szórást pedig szaggatott
vonalak mutatják, melyeket az APD90 függvényében ábrázoltunk (18. ábra A-D panel). Az így
kapott áramgörbéket az izoproterenollal aktivált, gátlószer nélküli áramgörbékhez
hasonlítottuk (18. ábra A panel), ezt tekintettük kontrollnak. Az 18. ábra B,C,D paneljein

51
bemutatott áramgörbéket az A panelhez hasonlítva megállapítottuk, hogy az IKr-t gátló 1 µM
E-4031 előzetes alkalmazása nem változtatta meg az ISO által létrehozott áramprofilt. IKs
gátló HMR-1556 esetén az adrenerg stimulus hasonló nagyságú inward, de lényegesen
lecsökkentett amplitúdójú outward csúcsot hozott létre a kontrollként szolgáló 18. ábra A
panelhez viszonyítva.

18. ábra: 100 nM ISO membránáramokra kifejtett hatása AP-clamp mérések alatt Tyrode-
oldatban (A), 1 µM E-4031 (B), 10 µM HMR-1556 (C), valamint 10 µM nizoldipin és
5mM NiCl2 jelenlétében (D). A kísérletek feszültségparancsait, illetve a kapott
áramgörbéket átlagoltuk és az akciós potenciál időtartamának függvényében (az APD90
értékét 100 százaléknak tekintve) ábrázoltuk. Folyamatos vonalak jelzik a kísérletek átlagát,
pontozott vonalak a szórást. A lefelé irányuló kitérések befelé, míg a felfelé mutatóak kifelé
irányuló ISO-aktivált áramokat jelölnek. A szaggatott vonalak nulla mV-os
membránpotenciált, illetve nulla áramot jelölnek. E: A különböző kísérletek során kapott
befelé, és kifelé irányuló áramcsúcsok átlagait az oszlopok mutatják. A kontrolltól való
szignifikáns (p≤0,05) eltérést csillaggal jelöltük. A kísérletek számát n jelöli.

Kalciumáram-mérések során tapasztaltuk, hogy a β-adrenerg stimuláció hatásosan

csökkenti a különböző L-típusú kalciumcsatorna-blokkolók hatékonyságát. 5µM nizoldipin
96±1%-os ICa amplitúdó csökkenést okoz, 100 nM ISO jelenlétében a gátlás mértéke 89±2%-
52
ra csökken (n=7). Ezért kísérleteinkben 10 mikromólosra növeltük a nizoldipin
koncentrációját, kiegészítve 5 mM nikkel-kloriddal, az ICa,T gátlószerével. Ahogyan a 18. ábra
D panelje is demonstrálja, 10 µM nizoldipin és 5 mM NiCl2 jelenlétében elhanyagolható
nagyságú a befelé irányuló áram amplitúdója, és a kifelé irányuló áram amplitúdója is
elmaradt a kontrollhoz képest.
AP-clamp kísérleteink eredményeit a 18. ábra E paneljén foglaltam össze. Meghatároztuk a
befelé és kifelé irányuló áramok sejtkapacitásra normalizált csúcsértékét. Kontroll mérések
során, amikor csak izoproterenollal perfundáltuk a sejteket, 4,62±1,08 pA/pF nagyságú befelé
irányuló, és 2,72±0,53 pA/pF amplitúdójú kifelé irányuló csúcsot kaptunk (n=6). E-4031
esetén nagyon hasonló értékeket kaptunk, az IKr gátlása esetén az inward áramcsúcs 4,78±0,6
pA/pF, míg az outward csúcs 2,1±0,51 pA/pF-nak adódott (n=6, n.s.). HMR-1556
alkalmazása során a befelé irányuló áramcsúcs 5,55±0,67 pA/pF, míg a kifelé irányuló
0,31±0,14 pA/pF volt (n=6, p≤0,05). A kontrollnál nagyobb inward áramok összhangban
vannak az AP-mérésnél is tapasztalt némileg magasabb platópotenciál-emelkedéssel. A
kalciumcsatornák gátlásakor 0,22±0,16 pA/pF nagyságú befelé irányuló, és 1,05±0,21 pA/pF-
os kifelé irányuló áramot mértünk (n=3). Mindkét változás szignifikánsan kisebb volt a
kontrollhoz képest (p≤0,05).

19. ábra: 100 nM izoproterenol membránáramokat módosító hatása AP-feszültség clamp

módszerrel mérve különböző ciklusidők (0,5, 1 és 3 másodperc) mellett. Az 500 ms-os és
3 másodperces ciklushossz során mért inward (A) és outward (B) áramcsúcsokat az 1
másodperces ciklusidőn kapott áramcsúcsokra normalizáltuk. Az 1Hz-es értékektől való
szignifikáns (p≤0,05) eltérést csillaggal jelöltük. A kísérletek számát n jelöli.

A továbbiakban megvizsgáltuk az ingerlési frekvencia változtatásának hatását AP clamp

módszerrel mért inward és outward ionáramokra. A sejteket 0,5, 1 és 3s ciklushosszúságú
impulzusokkal ingereltük, minden frekvencián rögzítettük az AP-t, amelyeket később

53
feszültség-clamp üzemmódban parancsjelként használtunk. Az 1 Hz-es ingerléskor kapott
kifelé és befelé irányuló csúcsokat tekintettük 100%-nak. Az eredményeket a 19. ábra foglalja
össze (n=8, p≤0,05). Megállapítottuk, hogy a ciklushossz növelésével, illetve csökkentésével
párhozamosan nőtt, illetve csökkent mind az inward, mind az outward csúcsok amplitúdója,
de a változás a befelé irányuló áramnál nagyobb mértékű volt.

20. ábra: 3 µM forskolinnal foszforilált (fekete négyzetek), illetve nem foszforilált (üres
négyzetek) ioncsatornák farmakológiai gátlásának vizsgálata. Hagyományos feszültség-
clamp kísérletekkel meghatározott dózis-hatás görbék 10 µM HMR 1556 (IKs gátlás, A
panel), 1 µM E-4031 (IKr gátlás, B panel) és 5 µM nizoldipin (ICa gátlás, C panel) esetén.
Mellettük a Hill egyenletek illesztésével kapott értékek láthatóak. A kísérletek számát n
jelöli.

A csatornák foszforiláltságának szerepe a gátlószerek hatékonyságában

Az ioncsatornák foszforilációja megváltoztathatja az ioncsatornák fehérjéinek szerkezetét,

és így a gátlószerek kötődését, mely így a gátlás mértékének csökkenéséhez vezethet.
Korábban már vizsgáltuk az L-típusú kalciumáram-blokkolók, és az adrenerg stimuláció
egymásra hatását. Ennek során megfigyeltük, hogy kutya kamrai szívizomsejteken az
adrenerg stimulus képes aktiválni a kalciumáramot különböző gátlószerek jelenléte mellett is.
Ezért megvizsgáltuk, hogy a csatornafehérjék foszforiláltságának változása milyen mértékben
módosíthatja az általunk használt gátlószerek hatékonyságát. Ehhez a forskolinnal előkezelt

54
sejteken vizsgáltuk a specifikus gátlószerek ionáramokra kifejtett dózisfüggő hatását. A
forskolin közvetlenül, receptorfüggetlen módon aktiválja az adenilát-cikláz ötös és hatos
altípusát, így elkerülhető a deszenzitizáció. Minden áramnál a gátlószermentes oldatban mért
áramot tekintettük 100%-nak.
A kapott eredményeket a 20. ábra mutatja be, ahol a szerkoncentráció függvényében
ábrázoltuk az elért gátlást. Összehasonlítva a forskolinnal előkezelt és kontroll sejteken kapott
eredményeket megállapítottuk, hogy egyik vizsgált ionáram esetén sem kaptunk szignifikáns
eltérést sem az elért gátlás maximális értékében, sem a félgátló koncentrációkban, illetve a
Hill-koefficiensekben sem. Megállapítottuk, hogy az ioncsatornák foszforilációja nem
változtatta meg szignifikánsan az IKr, IKs és ICa áramok HMR-1556, E-4031, nizoldipin
érzékenységét.

Izoproterenol időfüggő hatásai az akciós potenciál morfológiájára

Az eddig elvégzett kísérletek során megfigyeltük, hogy bár az APD90 rövidülése és a

platópotenciál változása 3 percen belül kialakul, a két folyamat nem egyszerre következik be.
A jelenség vizsgálatakor a kamrafal különböző rétegeiből származó szívizomsejtek akciós
potenciáljait vizsgáltuk. Az AP analízisekor az APD90 mellett meghatároztuk a 20 és 50
százalékos repolarizációig eltelt időtartamot is, melyeket rendre APD20-al és APD50-el
jelöltünk.
A 21. ábra A panelje 10 nM izoproterenol hatásának kialakulását demonstrálja az idő
függvényében epikardiális, midmiokardiális és endokardiális sejteken. 10 nM ISO hatására a
platópotenciálok mindhárom sejttípus esetén (epi-, mid-, és endokardiálison is) pozitívabb
membránpotenciálok felé mozdultak el, ami statisztikailag szignifikáns volt az ISO perfúzió
kezdetétől számított 30 másodpercen belül (21. ábra C panel). 3 perc ISO perfúzió után a
platópotenciálok emelkedésének mértéke hasonló mértékű volt mindhárom sejtpopulációnál.
Midmiokardiális sejteken 9,2±2 mV, epikardiális sejteknél 8,2±1,5 mV, és endokardiális
sejtpopuláció esetén 8,2±0,6 mV-os emelkedést tapasztaltunk öt perc ISO perfúzió után.
Egyik sejttípus esetén sem volt jelentős eltérés a platópotenciál változásának kinetikájában,
mindhárom sejttípusnál 2,5 percet kellett várni a maximális hatás kifejlődéséhez.
Korábbi eredményeinkhez hasonlóan az epikardiális és midmiokardiális eredetű sejtek
izoproterenolra jelentős AP-rövidüléssel válaszoltak; mind az APD50, mind pedig az APD90
csökkent, azonban az APD20 növekedett a kontrollhoz képest. A platópotenciál változásához
hasonlóan, az APD20 növekedése már az izoproterenol perfúziójának kezdetétől számítva 30

55
másodpercen belül szignifikáns volt, míg az APD90 és APD50 rövidülése csak 1,5-2 perccel az
ISO perfúziója után volt szignifikáns mértékű. Az ISO okozta APD20 növekedés 2,5 perc után
midmiokardiális sejteken 11,9±3,1 ms, epikardiális sejteken 20,7±5,4 ms volt. ISO hatására az
endokardiális sejteken is megfigyelhető volt az APD20 növekedése (2,5 perc után 22,1±6 ms),
amely a többi sejttípushoz hasonlóan fél perc után szignifikáns mértékű volt.

21. ábra: 10 nM izoproterenol időfüggő hatása az akciós potenciál morfológiájára

midmiokardiális (bal oszlop), epikardiális (középső oszlop) és endokardiális (jobb oszlop)
szívizomsejteken. A nulla perc jelenti az izoproterenol perfúziójának kezdetét. Az
ingerlési frekvencia valamennyi mérésnél 1 Hz volt.
A: Reprezentatív AP-mérések az ISO hatására kifejlődő változások kinetikájának és
reverzibilitásának bemutatására különböző típusú szívizomsejteken. A szaggatott vonal
nulla mV-os membránpotenciál-értéket jelöl.
B, C: ISO hatására kifejlődő APD (B), illetve platópotenciál (C) változások időbeli
kinetikája több mérés átlagán bemutatva. A platópotenciált az AP időtartamának felénél
mért feszültségként határoztuk meg, míg az APD20, APD 50 és APD 90 az akciós potenciál
20, 50, illetve 90%-os repolarizációjáig eltelt időt jelenti. A kontrolltól való szignifikáns
(p≤0,05) eltérést csillag jelzi. A kísérletek számát n jelöli.

56
Az APD90 rövidülés midmiokardiális sejteken 29,7±6,6 ms, epikardiális sejteken pedig
24,6±7 ms volt (21. ábra B, C panel). Endokardiális sejteken az izoproterenol nem volt képes
csökkenteni sem az APD50, sem pedig az APD90 értékeket (APD90-nél 6,6±1,4 ms). Az
adrenerg stimuláció emellett az endokardiális sejteken egy átmeneti, azonban statisztikailag
nem szignifikáns APD90 nyúlást okozott röviddel az ISO perfúziójának megkezdése után. Az
összes megfigyelt hatás reverzibilis volt az izoproterenol kimosását követő 5 percen belül (21.
ábra A panel).

Az ISO hatására bekövetkező AP-változások az ionáramok időfüggő

változásának a következménye

Az AP alakja és karakterisztikus paraméterei szigorúan függenek a létrehozó ionáramok

amplitúdójától és időbeli aktivációjától. Az izoproterenol az ICa-t és az IKs-t jelentősen, míg az
IKr-t kevéssé növeli. Ezért hagyományos patch-clamp technika egész sejtes konfigurációjában
vizsgáltuk az ISO perfúziója során, hogy a perfúziós idő függvényében hogyan változik az
ICa, IKs és IKr amplitúdója. Az AP mérések eredményeivel összhangban szignifikáns
kalciumáram-amplitúdó növekedést tapasztaltunk 10 nM izoproterenol-expozíciót követő fél
percen belül (22. ábra A panel). Két és fél perc elteltével már maximális választ kaptunk, és
az ISO alkalmazási idejének további növelése már nem okozott jelentős ICa amplitúdó
változást (22. ábra C panel. n=9, p≤0,05.)
A késői káliumáram mérések során az IKr méréseknél a korábban használt 20 helyett 30
másodpercre növeltük a ciklusidőt az eredmények jobb összevethetősége miatt. Az IKs és IKr
amplitúdói is folyamatosan növekedtek az ISO perfúzió során, azonban szignifikáns mértékű
amplitúdó növekedést csak 1 perccel az ISO perfúzió kezdete után kaptunk (22. ábra D és E
panel. n=18 az IKs, illetve n=14 az IKr esetén. Mindkét esetben p≤0,05.). A maximális
amplitúdó növekedést a káliumáramok esetén is 2-2,5 perccel az ISO perfúziója után
tapasztaltuk. A 22. ábra B panelje reprezentatív IKs farokáram-görbéket mutat be, az IKr-t az
amplitúdó kismértékű változása miatt nem ábrázoltuk. Az izoproterenol által létrehozott
változások korábbi kísérleteinkhez hasonlóan reverzibilisek voltak.

57
 22. ábra: Az ICa, IKr és IKs áramok időfüggő aktivációja 10 nM ISO hatására. Reprezentatív
kalciumáram (A) és IKs farokáram (B) görbék, az ISO perfúziójának kezdete óta eltelt
időtartamok jelölésével. Az IKr farokáramokat az izoproterenollal elért kismértékű változás
miatt nem ábrázoltuk.
A kontroll körülmények között mért áram amplitúdójára normalizált kalcium (C), IKs (D), és
IKr (E) áramok aktivációja az ISO-expozíció idejének függvényében ábrázolva. A
kontrolltól való szignifikáns (p≤0,05) eltérést csillag jelzi. A kísérletek számát n jelöli.

A jelet közvetítő β-adrenerg receptorok azonosítása

Az ISO aszimmetrikus stimuláló hatásának magyarázata lehet, hogy szívizomsejteken a β2

adrenerg stimuláció egy lokális cAMP emelkedést idéz elő, ami a kalciumcsatornák egy kis
populációjának a működését befolyásolja, ugyanakkor a β1 adrenerg jelátvitel generalizált
cAMP-növelést hoz létre, ami már nemcsak a kalciumcsatornákat, hanem számos egyéb
ionáram működését is befolyásolja [132, 133]. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy az
izoproterenol által kiváltott karakterisztikus változásokért (az ICa miatti plató emelkedés,

58
valamint az APD90 rövidülése, melyért főleg az IKs áram a felelős) eltérő adrenerg receptorok,
és jelátviteli útvonalak aktiválódása felelős.

23. ábra: Izoproterenol hatása akciós potenciálok lefutására kontroll Tyrode-oldatban (A),
β1 blokkolás (300nM CGP-20712A, B panel), β2 blokád (50 nM ICI 118,551, C panel)
valamint kombinált β1+β2 (300 nM CGP+50 nM ICI; D panel) gátlás mellett. A
midmiokardiális sejteket 5 percig 10 nM izoproterenollal perfundáltuk, az A-D ábra a már
kialakult hatást mutatja a megfelelő gátlószerben rögzített AP-k mellett. Az ISO-indukálta
APD90 (E) és platópotenciál-változások (F) átlagai különböző gátlószerek jelenlétében.
Csillag jelzi a kontrolltól való szignifikáns (p≤0,05) eltérést. Az elvégzett kísérletek száma
zárójelben látható.

59
 Ennek kiderítéséhez a β1, illetve β2 receptorokat specifikus gátlószerekkel gátoltuk. A β2 -
receptorok specifikus gátlására 50nM ICI 118,551-et használtunk [134], míg a β1 -
receptorokat 300 nM CGP-20712A-val blokkoltuk [135]. Ebben a kísérletben kontrollnak a
Tyrode-oldatban mért AP paramétereit tekintettük (23. ábra A).
Megállapítottuk, hogy önmagában vagy kombináltan alkalmazva sem a CGP, sem az ICI
nem változtatta meg az akciós potenciálok morfológiáját. A β1 receptorok előzetes gátlása az
izoproterenol által létrehozott AP-rövidítést nyújtássá változtatta, emellett csökkentette a
kiváltott platópotenciál-emelkedést is (23. ábra B). β2 receptorokat gátló ICI 188,551
jelenlétében az izoproterenol nagyobb mértékű APD-rövidülést okozott, mint a gátlószer
nélkül. Ugyanakkor a β2 adrenerg receptorok gátlása nem befolyásolta az ISO platópotenciálra
kifejtett hatását (23. ábra C). A két gátlószer együttes alkalmazásakor az izoproterenol
jelenlétében mért AP nem különbözött a kontrolltól (23. ábra D).
Az akciós potenciál hosszának átlagos változását a különböző kísérletek során a 23. ábra E,
a platópotenciál változásait pedig az F panel mutatja. A kapott adatokat kontrollhoz
viszonyítva azt tapasztaltuk, hogy β1 blokkoló alkalmazásával az akciós potenciál időtartama
nem csökkent, hanem szignifikánsan növekedett ISO hatására (n=6, p≤0,05). β2 blokkoló
esetén az akciós potenciál rövidülése szignifikánsan meghaladta a β-blokkoló nélküli mérések
során tapasztaltakat (n=7, p≤0,05). A platópotenciálok változása β1 adrenerg receptorok
gátlása során szignifikánsan csökkent a kontrollhoz képest, míg a β2 adrenerg receptor
gátlószer nem befolyásolta ezt a paramétert. A β1 és β2 adrenerg receptor gátlók együttes
használatával az izoproterenol sem az AP időtartamát, sem a platópotenciált nem változtatta
meg szignifikáns mértékben (n=4, p≤0,05).
A β1 és β2 adrenerg receptorokat gátló szerek együttes alkalmazása mellett nem kaptunk
változást ISO perfúziója során. Ebből arra következtettünk, hogy az ICI 118,551 esetén
megfigyelt változásokat csak a β1, míg CGP-20712A alkalmazása során csak a β2 receptorok
közvetítették. A β3 receptoroknak – ha ki is mutathatóak kutya kamrai szívizomsejteken – a
fiziológiás adaptáció során nincs szerepük.

A β receptorok szerepe az ISO okozta változások kinetikájában

Az izoproterenol időfüggő hatásait megvizsgáltuk akciós potenciál feszültség-clamp

módszerekkel is. A méréseket az anyagok és módszerek fejezetben leírtaknak megfelelően
végeztük.

60
 ISO hatására két áramcsúcs jelent meg az áramgörbén. Az áramcsúcsok közül az első az
AP lefutását tekintve korábban jelenik meg és negatív irányú, vagyis befelé irányuló (inward)
áram, míg a később megjelenő pozitív irányú kitérés kifelé irányuló (outward) áramot jelez. A
kezdeti befelé irányuló áramot az ICa, a későbbi kifelé irányulót pedig az IKs és az IKr alkotja.
A 24. ábra A panelje egy reprezentatív kísérlet eredményét mutatja. Az egyes áramgörbéket a
10 nM izoproterenol perfúziójának kezdetétől eltelt különböző időpillanatokban mértük. A
befelé és kifelé irányuló komponensek amplitúdója az időben előrehaladva körülbelül 2,5
percig folyamatosan nőtt, ezt követően állandó szinten maradt. A hatás teljesen kimosható
volt.
β1 blokkoló 300 nM CGP-20712A jelenlétében elvégezve a kísérletet (24. ábra B)
megállapítottuk, hogy az ISO hatását 2,5 perc alatt ez esetben is teljesen kifejtette. Azonban a
β1 blokkolóval történt előkezelés során nem jelent meg a kifelé irányuló áramcsúcs.
Megmértük az A és B paneleken bemutatott kísérletek során kapott áramgörbék befelé és
kifelé irányuló áramok maximális amplitúdóit, majd a kapott értékeket az idő függvényében
ábrázoltuk. Két pont közötti időtartam 1 másodpercnek felel meg (24. ábra C-F panel). Nyilak
jelölik azt az időpontot, amikor az ISO jelenlétében mért áram eltért a Tyrode-oldatban
mérttől. Az ISO az ábrán jelölt 0 időpontban érte el a sejtet, így nyíllal jelölt és a nulla
időpont közti különbséget tekintettük latenciaidőnek. A szaggatott vonalak a görbék kezdeti,
meredek szakaszára kézzel illesztett egyenesek. A 24. ábra D panelje öt, az E pedig hat
kísérlet eredménye alapján készült, ahol minden egyes mérés során az elért maximális
válaszra normalizáltuk az amplitúdókat, és a befelé és kifelé irányuló áramcsúcsok időbeli
változásait ábrázoltuk.
Megállapítottuk, hogy a β1 receptorok gátlása 300 nM CGP-20712A-val megakadályozta a
kifelé irányuló áram megjelenését. Ez arra utal, hogy 300 nM CGP-20712A jelenlétében az
izoproterenol valószínűleg csak a kalciumáramot növelte. Megjegyzendő azonban, hogy az
így aktivált kalciumáram maximális amplitúdója nem érte el a CGP-20712A-előkezelés
nélkül elért amplitúdót.
A befelé, illetve kifelé irányuló áramcsúcsok megjelenésének latenciáját a 24. ábra G
panelje mutatja. Előzetes adrenerg gátlás nélkül a befelé irányuló áram az ISO adagolását
követően 15,6±2,2 másodperc múlva kezdett el növekedni, a kifelé irányuló áram
megjelenése pedig 25,4±2,3 másodperc elteltével jelent meg először. Bár az izoproterenol
CGP-20712A jelenlétében nem aktivált kifelé irányuló áramokat, az inward áramcsúcs
latenciája (15,3±1 s) a kontrollhoz hasonló volt.

61
24. ábra: Az izoproterenol által befolyásolt áramok időfüggő aktivációja AP-feszültség
clamp módszerrel vizsgálva. Az A panel egy Tyrode-oldatban felvett reprezentatív mérés
áramgörbéit mutatja az ISO expozíció kezdetétől eltelt idő jelölésével. A B panel 300nM
CGP-20712A alkalmazása során kapott ISO-indukált áramok görbéit mutatja be. Az
ingerlési frekvencia mindkét esetben 1 Hz volt. Minden görbénél pontozott vonalak jelölik a
nulla áramot, illetve feszültséget. Mindkét panelnél legfelül látható a parancsjelként használt
AP, mely mindig a vizsgált sejt saját AP-je volt. Az ISO által aktivált befelé folyó (inward)
áramokat lefelé, míg a kifelé folyó (outward) áramokat felfelé irányuló kitérések jelzik.
A C és az E panelen reprezentatív mérések, a D és F panelen pedig több mérés átlagai
láthatóak nagyobb időbeli felbontással. A görbéket minden esetben az ISO adagolásának
kezdetétől ábrázoltuk. A reprezentatív görbék készítése során minden egyes rögzített
áramgörbe analízise során meghatároztuk a befelé és kifelé irányuló áramok csúcsértékeit,
és ezeket ábrázoltuk az eltelt idő függvényében. A D és F panelek készítése során a
maximális változásra normalizáltuk a mért áramamplitúdókat, majd az így kapott relatív
értékeket ábrázoltuk az eltelt idő függvényében.
Az izoproterenol módosító hatását Tyrode oldatban a reprezentatív C és az átlagokat
bemutató D panel mutatja. 300nM CGP-20712A előkezelés hatását az E és F panelek
mutatják be. A nyilak jelölik az első jelentős változásig eltelt időtartamot, vagyis a
latenciaidőket, melyeket a G panel foglal össze. A kísérletek számát n jelzi. A kettőskereszt
az inward és outward áramok latenciája közti szignifikanciát jelzi (p≤0,05).

62
 A további kísérletekben β-adrenerg gátlószerek jelenlétében vizsgáltuk az izoproterenol
hatásait az AP paramétereire. A 25. ábra A-D panelje egy-egy reprezentatív kísérlet
eredményét mutatja. Az ábrákon a platópotenciálokat, és az akciós potenciál időtartamát
ábrázoltuk az idő függvényében, két pont közötti időtartam 1 másodperc.

25. ábra: Reprezentatív időfüggő változások az akciós potenciálok időtartamában (APD90)

és a platópotenciálokban (Vplató) normál Tyrode-oldatban (A), 300nM CGP-20712A (B),
50nM ICI 118,551 előkezelés során (C), illetve a két gátlószer kombinációja esetén (D)
izoproterenol hatására. A függőleges szaggatott vonalak jelzik az ISO adagolásának
kezdetét, nyilak jelölik a latenciaidők végét. Az így meghatározott latenciaidőket több
kísérlet átlaga alapján az E panel foglalja össze. A kísérletek számát n jelzi. Csillagok jelzik
a Tyrode-ban mért kontroll adatoktól való szignifikáns eltérést, és kettőskereszt jelöli az
APD90 és Vplató közti szignifikáns különbséget (p≤0,05 mindkét esetben).

63
Függőleges szaggatott vonal jelzi az ISO perfúzió kezdetét, míg nyilak mutatják a
paraméterek legkorábbi változását izoproterenol hatására. A két pont közötti időtartamból
számoltuk a latenciaidőket, amit a 25. ábra E panelje mutat be. A szelektív β-adrenerg
receptor-gátlószerek jelenlétében mért APD90 és platópotenciál-változások megegyeznek a
23. ábrán bemutatottakkal.
β1 adrenerg receptor gátló jelenlétében az APD90 latencia szignifikánsan kisebb volt
(17,6±1,5 s, n=6, p≤0,05), mint a kontroll APD90 latenciája (33,4±3,4 s, n=9), ugyanakkor
hasonló volt a kontroll körülmények között mért (14,1±1,3 s, n=9), és CGP-20712A
előkezelést követő platópotenciál latenciához (15,1±1,6 s, n=6). A CGP-20712A-val
megfigyeltek ellentéte történt ICI 118,551 előkezelés után; az APD90 latenciája (31,1±1,1s,
n=7) a kontrollhoz viszonyítva nem változott, de a platópotenciál emelkedésének késése
megduplázódott (30,2±1,2 másodpercre, n=7), emiatt a két vizsgált paraméter hasonló
késéssel változott. β1 és β2 együttes gátlása a korábbiakhoz hasonlóan megakadályozta az ISO
módosító hatását (25. ábra D).

A foszfodiészteráz barrier szerepének vizsgálata

Az izoproterenol indukált APD és platópotenciál-változások időben eltérő kialakulásának a

hátterében állhat a cAMP kompartmentalizációja. A kompartmentalizáció esetleges
szerepének vizsgálatához izobutil-metilxantinnal (IBMX), egy ismert nem-szelektív
foszfodiészteráz-gátlóval kezelt sejteket vizsgáltunk. AP-méréseket a korábbi kísérletekhez
hasonlóan kontroll körülmények között (26. ábra A), valamint 10 µM IBMX kezelés után is
(26. ábra B) végeztünk. A reprezentatív ábrákon a platópotenciálokat, és az akciós potenciál
időtartamát ábrázoltuk az idő függvényében, két pont között 1 másodperc telt el. Az
izoproterenol perfúzióját szaggatott függőleges vonal, a változások kezdetét pedig nyilak
jelzik. IBMX jelenlétében csökkentettük az izoproterenol koncentrációt, mert IBMX mellett
már 3 nM ISO is akkora mértékű változásokat idézett elő, mint a kontroll esetben használt 10
nM izoproterenol.
A platópotenciál változás latenciája IBMX jelenlétében (13±1,4 s, n=6) hasonló volt a
kontrollban kapott értékekhez (14,1±1,3 s, n=9), viszont az APD90 változás szignifikánsan
gyorsabban kialakult (23,4±2,6 s, n=6, p≤0,05), mint IBMX nélkül (33,4±3,4 s, n=9) (26. ábra
C panel).

64
 Eredményeink valószínűsítik, hogy a Ca2+ és K+-csatornákat befolyásoló β-adrenerg
jelátviteli utakat legalább egy foszfodiészteráz barrier elválasztja egymástól.

26. ábra: Izoproterenol indukálta időfüggő változások az akciós potenciál időtartamában

(APD90) és a platópotenciálban (Vplató) kontroll körülmények között (A) és 10 µM IBMX
előkezelést követően (B). IBMX jelenlétében 3 nM ISO elegendő volt, hogy a kontroll
esetben használt 10 nM izoproterenolhoz hasonló nagyságú változásokat okozzon.
Függőleges szaggatott vonalak jelzik az izoproterenol perfúziójának kezdetét; nyilak jelölik
az első jelentős változásig eltelt időtartamot. Az átlagos latenciaidőket a C ábra oszlopai
mutatják. Csillag jelöli a szignifikáns eltérést a Tyrode-oldatban (10 nM ISO) és 10 µM
IBMX előkezelés után (3 nM ISO) elért izoproterenol-hatás között (p≤0,05). Kettőskereszt
jelzi a szignifikanciát az APD90 és Vplató értékek között (p≤0,05). A kísérletek számát n
jelöli.

65
Megbeszélés

Eredményeink alapján megállapítottuk, hogy a β-adrenerg stimulus akciós potenciált (AP)

rövidítő hatásához szükséges az akciós potenciál úgynevezett „spike and dome”
konfigurációja. A β-adrenerg receptorok stimulálására izoproterenolt (ISO) használtunk, ami
növeli az L-típusú kalciumáram (ICa,L) és a késői egyenirányító káliumáram gyors (IKr) és
lassú (IKs) komponensének amplitúdóját. Megállapítottuk, hogy az izoproterenol félhatásos
koncentrációja közel azonos mindhárom ionáram esetén. β-adrenerg stimulusra a „spike and
dome” konfigurációjú akciós potenciálok frekvenciafüggő módon rövidülnek a plató
megemelkedése mellett. A rövidítésért elsősorban az IKs felelős. Megállapítottuk, hogy
izoproterenol hatására az akciós potenciál paramétereinek változása nem egyszerre következik
be. A kalciumáram amplitúdójának növelése, a plató megemelkedésével együtt időben
megelőzi a káliumáramok amplitúdóinak, illetve az akciós potenciál hosszának (APD90)
megváltozását. Megállapítottuk, hogy az adrenerg stimuláció a kalciumáram fokozását a β1 és
β2 receptorokon keresztül hozza létre, míg a káliumáramok fokozása a β1 adrenerg
receptorokon keresztül történik. A β-adrenerg stimuláció csökkenti a szerves
kalciumcsatorna-blokkolók hatékonyságát, míg a szervetlen ionok által létrehozott gátlást
nem változtatja meg.
Az izoproterenolra adott válaszok jelentősen eltérnek különböző preparátumokon és
kísérleti elrendezésekben [136]. Például az APD90 ISO hatására csökken nyulakban [5],
kutyákban [6], macskákban [12] és humán [13] preparátumokon, míg nyúlik sertés [9],
patkány [10] és tengerimalac [11] preparátumokon.
Ezek a megfigyelések összhangban vannak eredményeinkkel, nevezetesen a „spike and
dome” konfigurációjú akciós potenciál, ami jellemző a kutya, macska és humán szívizomból
származó epi- és midmiokardiális sejtekre, előfeltétele a β-adrenerg hatásra bekövetkező
APD90 rövidülésnek. Emellett minden emlős szívizom-preparátum közös tulajdonsága a
platópotenciál megemelkedése ISO hatására. A kalciumáram növekedését és a platópotenciál
emelkedését is megfigyeltük kutya epi- és midmiokardiális sejteken, és kisebb mértékben az
endokardiális sejteken is. A plató emelkedése szükségesnek tűnik az AP rövidülésében, mert
ICa gátló nizoldipin jelenlétében a platópotenciál-változás nem volt megfigyelhető, és az AP
időtartamát sem változtatta meg az ISO. Nizoldipin jelenléte mellett, az ICa gátlása miatt az
ISO nagyobb mértékű rövidítő hatását vártuk, de ez elmaradt.

66
 A β-adrenerg aktiváció hatására pozitívabbá váló platópotenciál segítheti a kifelé irányuló
áramok, az IKr és IKs aktivációját [6]. Azonban az IKs gátlása megakadályozta az ISO rövidítő
hatásának kifejlődését, ezért arra a következtetésre jutottunk, hogy az ISO rövidítő hatásáért
elsősorban az IKs áram aktiválása lehet felelős. Ez némileg meglepő, hiszen a normál
repolarizáció során az IKs áram amplitúdója 10 pA alatti, míg az IKr-é közel tízszer nagyobb,
körülbelül 80-90 pA [112]. Kísérleteink során az ISO az IKs áramot 4,2-szeresére emelte,
miközben az IKr csak 1,33-szorosára növekedett, ezért a két áram ISO-indukálta hányada
összehasonlítható nagyságú lehet. Ha azt is számításba vesszük, hogy az ISO a
kalciumcsatorna gátló nizoldipin jelenlétében nem rövidítette az AP-t, nyilvánvaló, hogy
valami további változás is szükséges a rövidítő hatáshoz az IK áramok stimulálása mellett. Ez
nagy valószínűséggel a kalciumáram növelése miatt fellépő platóemelkedés lehet. Az IKr
szinte teljesen aktivált a fiziológiás platópotenciálok mellett, emiatt a platópotenciál növelése
kevésbé befolyásolja a repolarizációban betöltött szerepét, míg az IKs a platópotenciál
emelkedése esetén jelentősen megnő [137], emiatt az IKs lesz a repolarizáció domináns
ionárama. Ez a következtetés egybevág Varró [112] és Volders [6] feltételezésével, miszerint
az IKs repolarizációban betöltött szerepe nyugalomban elhanyagolható, de jelentősen megnő
szimpatikus stimuláció alatt.
Az egyik legfontosabb eredményünk az, hogy az ISO csak a „spike and dome”
konfigurációjú akciós potenciálokat rövidíti. Nem figyeltünk meg ugyanis rövidülést
endokardiális, vagy 4-aminopyridinnel előkezelt midmiokardiális sejteken sem. Ezt a
jelenséget magyarázhatja az ISO-indukált indirekt változás az IKs kinetikájában. Epikardiális
sejteken a plató végén jóval pozitívabb feszültségérték mérhető az endokardiális sejtekhez
viszonyítva, ami az epikardiális sejteken valószínűleg nagyobb amplitúdójú IKs-t okoz. Ez
megmagyarázhatja, miért képes az ISO az akciós potenciál időtartamát növelni tengerimalac
szívizomsejteken, ellentétben a macska, kutya és humán szívizomsejtekkel [12].
Érdemes megemlíteni, hogy AP clamp kísérleteink során az ISO megváltoztatta a
kalciumáram áramprofilját [138]. A kalciumáram folyamatosan aktivált volt a korai plató
egész időtartama alatt, és hasonlított a tengerimalacokon akciós potenciál feszültség clamp
során regisztrált kalciumáram-profilhoz [139]. Az L-típusú kalciumcsatornák izoproterenol
okozta foszforilációja jelentősen megváltoztatja a csatornák kapuzását, a nulla mód
valószínűségét csökkenti, a kettes mód valószínűségét pedig növeli. Ennek hatására kisebb
ugyan a csúcsáram amplitúdója, de a későbbi, úgynevezett „window” áram megnő [140].
Pontosan ezt a hatást figyeltük meg kutya kamrai sejteken akciós potenciál feszültség clamp
mérések során.

67
 ISO hatására a kutya kamrai szívizomsejtek akciós potenciál paramétereinek változása nem
egyszerre következik be. Megállapítottuk, hogy az ISO okozta platóváltozás (a kalciumáram
növelésével együtt) hamarabb jelent meg, mint az APD90 rövidülése. Hasonló eredményről
számolt be Liu és munkatársai nyúl szívizomsejteken, ahol az ISO kalciumáram-fokozása
szintén gyorsabb volt az IKs-hez képest [141]. A jelenség egyik lehetséges magyarázata az
lehet, hogy az izoproterenol félaktiváló koncentrációja kisebb a kalciumáram esetén, mint a
káliumáramok esetén. Eredményeink alapján ezt a lehetőséget ki lehet zárni, mert méréseink
szerint az ISO EC50 értéke és Hill-koefficiense mindhárom áramnál közel azonos volt, csak az
aktiváció nagyságában figyeltünk meg eltérést. Ez arra utal, hogy a megfigyelt különbségeket
nem az ISO kötődésének különbségei okozzák. A jelenség magyarázata feltételezi két
párhuzamos, részben független adrenerg jelátviteli útvonal létezését a szívizomsejtekben. A
szívizomsejteken β1 adrenerg receptorok mellett β2 és β3 receptorok is előfordulnak. Fiatal
felnőtt emberekben, és nagyobb termetű emlősökben is a β1 adrenerg receptorok száma
lényegesen nagyobb, mint a β2 receptoroké [142]. A felszíni membrán β1 receptorainak
aktivációja nagymértékű citoszolikus cAMP szint növekedést, generalizált hatásokat vált ki,
melynek része a Ca2+ és K+-áramok növelése is [143]. Ezzel ellentétben a kisebb számban
előforduló β2 adrenerg receptorok a kaveoláris membránban helyezkednek el, ahol a β1
receptorok nem mutathatóak ki [144]. A kaveoláris β2 receptorok mellett megtalálható a
jelátvitelhez szükséges összes fehérje és az L-típusú kalciumcsatorna is. A kaveoláris β2
receptorok stimulációja lokális cAMP növekedést okoz, ami csak a szomszédos
kalciumcsatornákat aktiválja [145]. Bár a β2 adrenerg receptorok Gs és Gi fehérjékhez is
kapcsolódhatnak [146], az ICa növelését valószínűleg a Gs fehérjék által közvetített adenilát-
cikláz aktiváció okozza [143]. A β3 adrenerg receptorok fiziológiás szerepe elhanyagolható,
mert kísérleteink során az egyidejű β1 és β2 gátlás megakadályozta, hogy az ISO bármilyen
hatást kifejtsen.
A β1 és β2 adrenerg receptorok aktivációja különböző módon változtatja az AP
morfológiáját. A β1 adrenerg receptorok aktiválása (β2 gátlás mellett) a platópotenciál
emelkedését és az AP rövidülését is előidézte. Ezzel ellentétben a β2 adrenerg receptorok
izolált aktivációja (egyidejű β1 gátlás mellett) az APD növekedését okozta (rövidülés helyett)
a plató kisebb mértékű emelkedése mellett. Ezt a kalciumáram izolált növelése okozhatja a
káliumáramok növelése nélkül. Emellett a szelektív β1 adrenerg receptorok által közvetített
hatás lassabban alakult ki, mint a szelektív β2 adrenerg aktiváció hatásai. Végül, az időbeli
eltérések eltűntek akár β1, akár β2 szelektív gátlása során, és a foszfodiészteráz barriert
megszüntető IBMX is jelentősen csökkentette a hatások megjelenése közötti időt.

68
 Szelektív β1 és β2 adrenerg receptor gátlószerekkel elvégzett kísérleteink eredményei
alátámasztják az ISO kettős szignalizációját kutya kamrai szívizomsejteken, nevezetesen, az
ISO indukált kalciumáram növekedés jelentős része, és a K+-áramok - az IKr-t és IKs-t is
beleértve - növelése a lassabb β1 útvonalon keresztül történik. A gyorsan aktiválódó,
kaveoláris β2 receptor aktiválódása is növeli a kalciumáramot, de a káliumáramok fokozása
nélkül [147]. Ez magyarázhatja az időbeli eltéréseket az ISO okozta platópotenciál- és APD90
változások kinetikájában, és a szelektív β1 gátlás során megfigyelt AP időtartam növekedést
is. Ez összhangban van a korábbi irodalmi adatokkal, hiszen nyúl szívizomsejteken a β1
gátlása megakadályozta az ISO okozta APD rövidítést [148], és β1 gátlószer jelenlétében az
ISO kutya szívizomsejteken sem növelte az IKr-t [7]. Más szerzők a szívizom kalcium- és
káliumáramainak adrenerg stimulációját is vagy különbözőnek, vagy egymástól függetlennek
vélik [149, 150]. Az ICa kettős adrenerg befolyásolását az támasztja alá, hogy a platópotenciál,
és az APD változása közti időbeli különbség eltűnt akár a β1, akár a β2 adrenerg receptorok
blokkolása esetén. A különbségek szignifikánsan csökkentek IBMX jelenlétében, amiből arra
következtettünk, hogy a foszfodiészteráz barrierekkel körülhatárolt cAMP-kompartmentek
szintén felelősek lehetnek a megfigyelt különbségekért. IBMX jelenlétében az ISO okozta
APD90 rövidülés korábbi megjelenéséért a cAMP-nek a kaveoláris kompartmentekből a
citoplazma többi részébe történő diffúziója lehet felelős (amit az intakt foszfodiészteráz
barrier egyébként megakadályozna). Azonban nem zárható ki az IBMX közvetlen hatása a
citoplazma egyéb kompartmentjeiben sem. Hejiman et al. (2011) nemrégiben közölt in silico
modelljében az adrenerg receptorok, kompartmentek és jelátviteli útvonalak nagyban
hasonlítanak az általunk feltételezetthez [151].
A kalciumáramnak a káliumáramok növeléséhez viszonyított gyorsabb emelkedése
hasznos, ha a szív gyorsan akarja fokozni a teljesítményét. Ez azonban a káliumáramok
későbbi aktivációjával jelentős proaritmiás veszélyt is hordoz, mert növeli a korai
utódepolarizációk esélyét, amelyek adrenerg aktivációkor egyébként is nagyobb eséllyel
fordulnak elő [8]. Számítógépes szimulációk is alátámasztják ezt a feltételezésünket [141]. A
torsades de pointes kamrafibrillációval járó hirtelen szívhalálok előidézésében jelentős
szerepe van erős adrenerg stimulusnak, főleg bradikard szívműködés mellett (pl. a reggeli
ébresztőóra hatására) [152]. Az ISO aszimmetrikus hatása (epikardiális sejteken rövidít,
endokardiálison viszont nem) szimpatikus stimuláció során megnövelheti a transzmurális
inhomogenitást, így az aritmiák előfordulását is. Említésre méltó még, hogy az ISO fordított
frekvenciafüggő hatása talán nem kapcsolódik a befolyásolt ionáramok ismert fordított
frekvenciafüggéséhez, mert kísérleteinkben a ciklushossz növelésével a kalciumáram

69
fokozása nagyobb volt, mint az IKs áram növelése (19. ábra). Erre a szívizom általános
viselkedése ad magyarázatot, nevezetesen a szívizmon az AP időtartama fordított
frekvenciafüggő, a változások mértéke függ az akciós potenciál kezdeti időtartamától. Ezt
alátámasztják a 13. ábrán bemutatott eredményeink.
Eredményeink alapján a szelektív β2 gátlók alkalmazása valószínűleg megszüntetné a
kalcium-és káliumáramok késése közti különbséget, így az utódepolarizációk veszélyét
csökkenthetik. Ez hasznos lehet a klinikai gyakorlatban is az egyedi β-blokkoló terápia
beállítása során.
Az ISO aktiválta IKr-nek kutya – és valószínűleg humán – kamrai szívizomsejteken fontos
klinikai következményei lehetnek. A hármas típusú antiaritmiás szerek, melyek rendszerint az
IKr-t gátolják, a korai utódepolarizációk esélyét növelhetik, a korai utódepolarizációk pedig
torsades de pointes aritmiát idézhetnek elő [153] a csökkent repolarizációs rezerv miatt [154].
A szimpatikus aktivitás önmagában is fokozza a korai utódepolarizációk előfordulását, így a
káliumcsatornák gátlása nagyon veszélyessé válhat adrenerg stimuláció mellett [152]. Az IKs
gátlók hármas típusú antiaritmiás szerként történő használata előnyösnek tűnik a
frekvenciafüggő tulajdonságuk miatt [155]. Eredményeink alapján feltételezzük, hogy IKs
gátló szerek nagyobb veszélyt hordoznak öröklött vagy szerzett long-QT szindrómában
szenvedő betegeknél, mint a „klasszikus”, IKr-t gátló hármas típusú antiaritmiás szerek, mert
szimpatikus aktiváció során elvész a repolarizációhoz szükséges mechanizmus. Ez fontos
lehet annak ellenére is, hogy az IKs-nek fiziológiás körülmények között a repolarizációban
nincs jelentős szerepe. Új antiaritmiás szerek, vagy kezelési stratégiák kidolgozásánál ezt
figyelembe kell venni.
Az ioncsatornák foszforilációja megváltoztathatja az ioncsatornák fehérjéinek szerkezetét,
és így a gátlószerek kötődését, mely így a gátlás mértékének csökkenéséhez vezethet. Ezért
vizsgáltuk az L-típusú kalciumáram-blokkolók, és az adrenerg stimuláció egymásra hatását.
Megfigyeltük, hogy az adrenerg stimulus képes aktiválni kutya kamrai szívizomsejteken a
kalciumáramot különböző szerves gátlószerek, például 5 µM nifedipin mellett is. Az
izoproterenol azonban nem tudta növelni az ICa amplitúdóját a pórust elzáró szervetlen
kationok alkalmazása során. Eredményeink alapján a klinikumban használt kalciumcsatorna-
gátló szerek csökkent hatékonyságúak lehetnek megnövekedett szimpatikus tónus esetén, amit
a terápia beállításakor figyelembe kell venni.

70
 Összefoglalás
Bevezetés
Az izoproterenolnak (ISO) a kamrai szívizomsejtek ionáramaira, az akciós potenciálra
(AP) gyakorolt hatásai nem kellően tisztázottak. Ezért vizsgáltuk az ISO módosító hatását az
akciós potenciál konfigurációjára, az L-típusú kalciumáramra (ICa,L), valamint a késői
egyenirányító áram lassú (IKs) és gyors (IKr) komponensére. Kitértünk a változások
kinetikájának és frekvenciafüggésének vizsgálatára is.
Anyagok és módszerek
Az ICa, IKs, és IKr mérésekhez hagyományos feszültség-clamp technika egészsejtes
konfigurációját, valamint akciós potenciál feszültség-clamp méréseket végeztünk. Az AP
méréseket nagy ellenállású mikroelektródákkal végeztük, izolált kutya kamrai sejteken.
Főbb eredmények
Az ISO epikardiális és midmiokardiális sejteken az akciós potenciálok reverzibilis
rövidülését okozta a plató emelésével együtt. Ezek a változások az IKs és ICa amplitúdóinak
többszörös növekedésével jártak, az IKr mérsékelt fokú stimulálása mellett. Endokardiális
sejteken az ISO nem okozott AP-rövidülést. Az IKr előzetes gátlása nem módosította az ISO
hatását, de IKs blokkolásakor az akciós potenciál ISO hatására megnyúlt. A kalciumcsatornák
előzetes gátlása mind az akciós potenciál rövidülését, mind a plató emelését megakadályozta.
Megfigyeltük, hogy az ingerlési frekvencia csökkentésével az ISO nagyobb
amplitúdóváltozást okozott az ICa és az IKs esetén. Az ISO okozta platónövekedés és az ICa
növekedése hamarabb következett be, mint az akciós potenciál rövidülése, az IKr, vagy az IKs
stimulálása. β blokkolókkal végzett kísérleteink során megállapítottuk, hogy a β1 receptorok
gátlása az ISO okozta rövidülést nyújtássá változtatta, a platóváltozás latenciája pedig
csökkent. Ezzel ellentétben, a β2 receptorok gátlása fokozta az AP rövidülését, és növelte a
plató változásának latenciáját. Mindkét receptortípus egyidejű blokkolása meggátolta az ISO
hatásának kifejlődését. A foszfodiészterázok gátlása csökkentette az időbeli különbséget a
platópotenciál és az AP rövidülés megjelenése között.
Összefoglalás
Az ISO hatásai kutya kamrai sejteken nagyban függenek az akciós potenciál
konfigurációjától, és az ISO-indukálta IKs és nem az IKr lehet a felelős az akciós potenciálok
rövidüléséért. Az ISO az IKr, illetve az IKs változtatásánál gyorsabban, rövidebb latenciával
növelte a kalciumáramot, a jelenségért a különböző adrenerg útvonalak, illetve a
kompartmentalizáció lehet felelős.
71
 Summary
Background and purpose
Little is known about the role of action potential morphology in the isoproterenol (ISO)
induced changes in ion currents. Therefore, the effects of ISO on action potential
configuration, L-type Ca2+ current (ICa), slow component (IKs) and fast component (IKr) of the
delayed rectifier K+ current were studied and compared in a frequency-dependent manner,
along with the timing of activation of each current.
Experimental approach
Whole cell configuration of the patch-clamp technique in either conventional voltage
clamp or action potential voltage clamp modes were used to monitor ICa, IKs, and IKr, while
action potentials were recorded using sharp microelectrodes.
Results
In epicardial and midmyocardial cells ISO caused reversible shortening of action potentials
accompanied by elevation of the plateau. These effects were associated with multifold
enhancement of ICa and IKs and moderate stimulation of IKr. ISO-induced action potential
shortening was absent in endocardial cells. IKr blockade failed to modify the ISO effect, while
action potentials were lengthened by ISO in the presence of IKs blocker. Both action potential
shortening and elevation of the plateau were prevented by pretreatment with ICa blocker. Both
ICa and IKs currents increased with increasing the cycle length. The ISO-induced plateau shift
and ICa increase developed earlier than the shortening of APD and stimulation of IKs and IKr.
Blockade of β1 adrenoceptors converted the ISO-induced shortening of APD to lengthening,
decreased the latency of the plateau shift. In contrast, blockade of β2 receptors augmented the
APD-shortening effect and increased the latency of plateau shift. All effects of ISO were
prevented by simultaneous blockade of both receptor types. Inhibition of phosphodiesterases
decreased the differences observed in the turn on of the ISO induced plateau shift and APD
shortening.
Conclusion
The effect of ISO in canine ventricular cells depends critically on action potential
configuration, and the ISO-induced activation of IKs – but not IKr – may be responsible for the
shortening of action potentials. ISO-induced activation of ICa is turned on faster than the
stimulation of IKs and IKr in canine ventricular cells due to the involvement of different
adrenergic pathways and compartmentalization.

72
 Irodalomjegyzék

1. Catterall, W.A., et al., International Union of Pharmacology. XLVIII. Nomenclature

and structure-function relationships of voltage-gated calcium channels. Pharmacol
Rev, 2005. 57(4): p. 411-25.
2. Varro, A. and J.G. Papp, The impact of single cell voltage clamp on the understanding
of the cardiac ventricular action potential. Cardioscience, 1992. 3(3): p. 131-44.
3. Taylor, M.R., Pharmacogenetics of the human beta-adrenergic receptors.
Pharmacogenomics J, 2007. 7(1): p. 29-37.
4. Rocchetti, M., et al., Rate dependency of beta-adrenergic modulation of repolarizing
currents in the guinea-pig ventricle. J Physiol, 2006. 574(Pt 1): p. 183-93.
5. Dukes, I.D. and E.M. Vaughan Williams, Effects of selective alpha 1-, alpha 2-, beta
1-and beta 2-adrenoceptor stimulation on potentials and contractions in the rabbit
heart. J Physiol, 1984. 355: p. 523-46.
6. Volders, P.G., et al., Probing the contribution of IKs to canine ventricular
repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation, 2003.
107(21): p. 2753-60.
7. Harmati, G., et al., Effects of beta-adrenoceptor stimulation on delayed rectifier K(+)
currents in canine ventricular cardiomyocytes. Br J Pharmacol, 2011. 162(4): p. 890-
6.
8. January, C.T. and J.M. Riddle, Early afterdepolarizations: mechanism of induction
and block. A role for L-type Ca2+ current. Circ Res, 1989. 64(5): p. 977-90.
9. Taggart, P., et al., Interplay between adrenaline and interbeat interval on ventricular
repolarisation in intact heart in vivo. Cardiovasc Res, 1990. 24(11): p. 884-95.
10. Ogura, K., et al., Inhibition of beta-adrenergic signaling by intracellular AMP is
independent of cell-surface adenosine receptors in rat cardiac cells. J Mol Cell
Cardiol, 2007. 43(5): p. 648-52.
11. Belardinelli, L. and G. Isenberg, Actions of adenosine and isoproterenol on isolated
mammalian ventricular myocytes. Circ Res, 1983. 53(3): p. 287-97.
12. Malfatto, G., M. Rocchetti, and A. Zaza, The role of the autonomic system in rate-
dependent repolarization changes. Heart Rhythm, 2010. 7(11): p. 1700-3.
13. Taggart, P., et al., Effect of adrenergic stimulation on action potential duration
restitution in humans. Circulation, 2003. 107(2): p. 285-9.
14. Szentadrassy, N., et al., Apico-basal inhomogeneity in distribution of ion channels in
canine and human ventricular myocardium. Cardiovasc Res, 2005. 65(4): p. 851-60.
15. Lameh, J., et al., Structure and function of G protein coupled receptors. Pharm Res,
1990. 7(12): p. 1213-21.
16. Jenkinson, D.H., Classification and properties of peripheral adrenergic receptors. Br
Med Bull, 1973. 29(2): p. 142-7.
17. Piascik, M.T. and D.M. Perez, Alpha1-adrenergic receptors: new insights and
directions. J Pharmacol Exp Ther, 2001. 298(2): p. 403-10.
18. Perez, D.M., M.B. DeYoung, and R.M. Graham, Coupling of expressed alpha 1B- and
alpha 1D-adrenergic receptor to multiple signaling pathways is both G protein and
cell type specific. Mol Pharmacol, 1993. 44(4): p. 784-95.
19. Fürst, Z., Kémiai ingerületátvitel. Kolinerg és adrenerg transzmisszió, in
Farmakológia. 2004, Medicina Könyvkiadó Rt: Budapest.

73
20. Ruffolo, R.R., Jr. and J.E. Waddell, Receptor interactions of imidazolines: alpha-
adrenoceptors of rat and rabbit aortae differentiated by relative potencies, affinities
and efficacies of imidazoline agonists. Br J Pharmacol, 1982. 77(1): p. 169-76.
21. Stiles, G.L., S. Taylor, and R.J. Lefkowitz, Human cardiac beta-adrenergic receptors:
subtype heterogeneity delineated by direct radioligand binding. Life Sci, 1983. 33(5):
p. 467-73.
22. Manalan, A.S., H.R. Besch, Jr., and A.M. Watanabe, Characterization of [3H](+/-
)carazolol binding to beta-adrenergic receptors. Application to study of beta-
adrenergic receptor subtypes in canine ventricular myocardium and lung. Circ Res,
1981. 49(2): p. 326-36.
23. Lohse, M.J., S. Engelhardt, and T. Eschenhagen, What is the role of beta-adrenergic
signaling in heart failure? Circ Res, 2003. 93(10): p. 896-906.
24. Stiles, G.L., et al., The cardiac beta-adrenergic receptor. Structural similarities of
beta 1 and beta 2 receptor subtypes demonstrated by photoaffinity labeling. J Biol
Chem, 1983. 258(13): p. 8443-9.
25. El-Armouche, A. and T. Eschenhagen, Beta-adrenergic stimulation and myocardial
function in the failing heart. Heart Fail Rev, 2009. 14(4): p. 225-41.
26. Skeberdis, V.A., Structure and function of beta3-adrenergic receptors. Medicina
(Kaunas), 2004. 40(5): p. 407-13.
27. Yang, J., et al., A pathway and network review on beta-adrenoceptor signaling and
beta blockers in cardiac remodeling. Heart Fail Rev, 2013.
28. Lefkowitz, R.J., G protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and
beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem, 1998. 273(30):
p. 18677-80.
29. Sunahara, R.K., C.W. Dessauer, and A.G. Gilman, Complexity and diversity of
mammalian adenylyl cyclases. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1996. 36: p. 461-80.
30. Buck, J., et al., Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in
mammals. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(1): p. 79-84.
31. Chang, J.C. and R.P. Oude-Elferink, Role of the bicarbonate-responsive soluble
adenylyl cyclase in pH sensing and metabolic regulation. Front Physiol, 2014. 5: p.
42.
32. Cooper, D.M., et al., Ca(2+)-sensitive adenylyl cyclases. Adv Second Messenger
Phosphoprotein Res, 1998. 32: p. 23-51.
33. Espinasse, I., et al., Decreased type VI adenylyl cyclase mRNA concentration and
Mg(2+)-dependent adenylyl cyclase activities and unchanged type V adenylyl cyclase
mRNA concentration and Mn(2+)-dependent adenylyl cyclase activities in the left
ventricle of rats with myocardial infarction and longstanding heart failure. Cardiovasc
Res, 1999. 42(1): p. 87-98.
34. Rochais, F., et al., A specific pattern of phosphodiesterases controls the cAMP signals
generated by different Gs-coupled receptors in adult rat ventricular myocytes. Circ
Res, 2006. 98(8): p. 1081-8.
35. Thomas, D., et al., Deletion of protein kinase A phosphorylation sites in the HERG
potassium channel inhibits activation shift by protein kinase A. J Biol Chem, 1999.
274(39): p. 27457-62.
36. Wallukat, G., The beta-adrenergic receptors. Herz, 2002. 27(7): p. 683-90.
37. Marx, S.O. and A.R. Marks, Regulation of the ryanodine receptor in heart failure.
Basic Res Cardiol, 2002. 97 Suppl 1: p. I49-51.
38. Mattiazzi, A., et al., Role of phospholamban phosphorylation on Thr17 in cardiac
physiological and pathological conditions. Cardiovasc Res, 2005. 68(3): p. 366-75.

74
39. Chen, P.P., et al., Protein kinase A-induced myofilament desensitization to Ca(2+) as
a result of phosphorylation of cardiac myosin-binding protein C. J Gen Physiol, 2010.
136(6): p. 615-27.
40. van der Heyden, M.A., T.J. Wijnhoven, and T. Opthof, Molecular aspects of
adrenergic modulation of the transient outward current. Cardiovasc Res, 2006. 71(3):
p. 430-42.
41. Rybin, V.O. and S.F. Steinberg, Protein kinase C isoform expression and regulation in
the developing rat heart. Circ Res, 1994. 74(2): p. 299-309.
42. Puceat, M., et al., Differential regulation of protein kinase C isoforms in isolated
neonatal and adult rat cardiomyocytes. J Biol Chem, 1994. 269(24): p. 16938-44.
43. Nakanishi, H., K.A. Brewer, and J.H. Exton, Activation of the zeta isozyme of protein
kinase C by phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. J Biol Chem, 1993. 268(1): p.
13-6.
44. Gschwendt, M., et al., Protein kinase C zeta and eta in murine epidermis. TPA induces
down-regulation of PKC eta but not PKC zeta. FEBS Lett, 1992. 307(2): p. 151-5.
45. Jalili, T., et al., PKC translocation without changes in Galphaq and PLC-beta protein
abundance in cardiac hypertrophy and failure. Am J Physiol, 1999. 277(6 Pt 2): p.
H2298-304.
46. Hayashi, A., et al., PKCnu, a new member of the protein kinase C family, composes a
fourth subfamily with PKCmu. Biochim Biophys Acta, 1999. 1450(1): p. 99-106.
47. Erdbrugger, W., et al., Protein kinase C isoenzymes in rat and human cardiovascular
tissues. Br J Pharmacol, 1997. 120(2): p. 177-86.
48. Braz, J.C., et al., PKC-alpha regulates cardiac contractility and propensity toward
heart failure. Nat Med, 2004. 10(3): p. 248-54.
49. Bowling, N., et al., Increased protein kinase C activity and expression of Ca2+-
sensitive isoforms in the failing human heart. Circulation, 1999. 99(3): p. 384-91.
50. Inoguchi, T., et al., Preferential elevation of protein kinase C isoform beta II and
diacylglycerol levels in the aorta and heart of diabetic rats: differential reversibility to
glycemic control by islet cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(22):
p. 11059-63.
51. Steinberg, S.F., Cardiac actions of protein kinase C isoforms. Physiology (Bethesda),
2012. 27(3): p. 130-9.
52. Dorn, G.W., 2nd, et al., Sustained in vivo cardiac protection by a rationally designed
peptide that causes epsilon protein kinase C translocation. Proc Natl Acad Sci U S A,
1999. 96(22): p. 12798-803.
53. Disatnik, M.H., G. Buraggi, and D. Mochly-Rosen, Localization of protein kinase C
isozymes in cardiac myocytes. Exp Cell Res, 1994. 210(2): p. 287-97.
54. Bos, J.L., Epac: a new cAMP target and new avenues in cAMP research. Nat Rev Mol
Cell Biol, 2003. 4(9): p. 733-8.
55. Kawasaki, H., et al., A family of cAMP-binding proteins that directly activate Rap1.
Science, 1998. 282(5397): p. 2275-9.
56. Rehmann, H., et al., Structure and regulation of the cAMP-binding domains of Epac2.
Nat Struct Biol, 2003. 10(1): p. 26-32.
57. Wang, H., et al., Phospholipase C epsilon modulates beta-adrenergic receptor-
dependent cardiac contraction and inhibits cardiac hypertrophy. Circ Res, 2005.
97(12): p. 1305-13.
58. Pereira, L., et al., The cAMP binding protein Epac modulates Ca2+ sparks by a
Ca2+/calmodulin kinase signalling pathway in rat cardiac myocytes. J Physiol, 2007.
583(Pt 2): p. 685-94.

75
59. Zaza, A., An introduction to Cardiac Cellular Electrophysiology. 2000, Harwood
Academic Publishers, Newark. p. 59-82.
60. Shimoni, Y., R.B. Clark, and W.R. Giles, Role of an inwardly rectifying potassium
current in rabbit ventricular action potential. J Physiol, 1992. 448: p. 709-27.
61. Li, G.R., et al., Transmural heterogeneity of action potentials and Ito1 in myocytes
isolated from the human right ventricle. Am J Physiol, 1998. 275(2 Pt 2): p. H369-77.
62. Fulop, L., et al., Reopening of L-type calcium channels in human ventricular myocytes
during applied epicardial action potentials. Acta Physiol Scand, 2004. 180(1): p. 39-
47.
63. Liu, D.W. and C. Antzelevitch, Characteristics of the delayed rectifier current (IKr
and IKs) in canine ventricular epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes.
A weaker IKs contributes to the longer action potential of the M cell. Circ Res, 1995.
76(3): p. 351-65.
64. Norbert Szentandrássy, J.M., Péter Pál Nánási, Electrical inhomogeneity in
mammalian ventricular myocardium, in Advances in cardiomyocyte research, P.P.
Nánási, Editor. 2009, Transworld Research Network, Kerala. p. 76-79.
65. Drici, M.D. and J. Barhanin, Cardiac K+ channels and drug-acquired long QT
syndrome. Therapie, 2000. 55(1): p. 185-93.
66. Carbone, E. and H.D. Lux, Kinetics and selectivity of a low-voltage-activated calcium
current in chick and rat sensory neurones. J Physiol, 1987. 386: p. 547-70.
67. Benitah, J.P., et al., Voltage-gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic
heart: a review. Basic Res Cardiol, 2002. 97 Suppl 1: p. I11-8.
68. Marbán E, O.R.B., in Cardiac Electrophysiology: From Cell to Bedside, J.J. Douglas
P. Zipes, Editor. 1995, Saunders: Philadelphia. p. 11-21.
69. Fozzard, H.A., Excitation-contraction coupling in the heart. Adv Exp Med Biol, 1991.
308: p. 135-42.
70. Ertel, E.A., et al., Nomenclature of voltage-gated calcium channels. Neuron, 2000.
25(3): p. 533-5.
71. Welling, A., et al., Alternatively spliced IS6 segments of the alpha 1C gene determine
the tissue-specific dihydropyridine sensitivity of cardiac and vascular smooth muscle
L-type Ca2+ channels. Circ Res, 1997. 81(4): p. 526-32.
72. Hille, B., in Ion channels of Excitable Membranes. 2001, Sinauer: Dunderland. p. 95-
129.
73. Catterall, W.A., Structure and function of voltage-sensitive ion channels. Science,
1988. 242(4875): p. 50-61.
74. Hagiwara, S., J. Fukuda, and D.C. Eaton, Membrane currents carried by Ca, Sr, and
Ba in barnacle muscle fiber during voltage clamp. J Gen Physiol, 1974. 63(5): p. 564-
78.
75. Yamaguchi, H., et al., Multiple modulation pathways of calcium channel activity by a
beta subunit. Direct evidence of beta subunit participation in membrane trafficking of
the alpha1C subunit. J Biol Chem, 1998. 273(30): p. 19348-56.
76. Gurnett, C.A., M. De Waard, and K.P. Campbell, Dual function of the voltage-
dependent Ca2+ channel alpha 2 delta subunit in current stimulation and subunit
interaction. Neuron, 1996. 16(2): p. 431-40.
77. Shistik, E., et al., Ca2+ current enhancement by alpha 2/delta and beta subunits in
Xenopus oocytes: contribution of changes in channel gating and alpha 1 protein level.
J Physiol, 1995. 489 ( Pt 1): p. 55-62.
78. Benitah, J.P., J.L. Alvarez, and A.M. Gomez, L-type Ca(2+) current in ventricular
cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol, 2010. 48(1): p. 26-36.

76
79. Findlay, I., Physiological modulation of inactivation in L-type Ca2+ channels: one
switch. J Physiol, 2004. 554(Pt 2): p. 275-83.
80. Lee, A., et al., Ca2+/calmodulin binds to and modulates P/Q-type calcium channels.
Nature, 1999. 399(6732): p. 155-9.
81. Hockerman, G.H., et al., Molecular determinants of high affinity phenylalkylamine
block of L-type calcium channels in transmembrane segment IIIS6 and the pore region
of the alpha1 subunit. J Biol Chem, 1997. 272(30): p. 18759-65.
82. Striessnig, J., Pharmacology, structure and function of cardiac L-type Ca(2+)
channels. Cell Physiol Biochem, 1999. 9(4-5): p. 242-69.
83. Vassort, G., et al., Effects of adrenaline on membrane inward currents during the
cardiac action potential. Pflugers Arch, 1969. 309(1): p. 70-81.
84. Catterall, W.A., Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu Rev
Cell Dev Biol, 2000. 16: p. 521-55.
85. Gao, T., et al., Identification and subcellular localization of the subunits of L-type
calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J Biol Chem, 1997.
272(31): p. 19401-7.
86. Gray, P.C., et al., Primary structure and function of an A kinase anchoring protein
associated with calcium channels. Neuron, 1998. 20(5): p. 1017-26.
87. Fraser, I.D., et al., A novel lipid-anchored A-kinase Anchoring Protein facilitates
cAMP-responsive membrane events. Embo j, 1998. 17(8): p. 2261-72.
88. Bunemann, M., et al., Functional regulation of L-type calcium channels via protein
kinase A-mediated phosphorylation of the beta(2) subunit. J Biol Chem, 1999.
274(48): p. 33851-4.
89. Satoh, H., Inhibition in L-type Ca2+ channel by stimulation of protein kinase C in
isolated guinea pig ventricular cardiomyocytes. Gen Pharmacol, 1992. 23(6): p. 1097-
102.
90. Snyders, D.J., Structure and function of cardiac potassium channels. Cardiovasc Res,
1999. 42(2): p. 377-90.
91. Nerbonne, J.M., Molecular basis of functional voltage-gated K+ channel diversity in
the mammalian myocardium. J Physiol, 2000. 525 Pt 2: p. 285-98.
92. Oudit, G.Y., et al., The molecular physiology of the cardiac transient outward
potassium current (I(to)) in normal and diseased myocardium. J Mol Cell Cardiol,
2001. 33(5): p. 851-72.
93. Hiraoka, M. and S. Kawano, Calcium-sensitive and insensitive transient outward
current in rabbit ventricular myocytes. J Physiol, 1989. 410: p. 187-212.
94. Jost, N., et al., Effect of the antifibrillatory compound tedisamil (KC-8857) on
transmembrane currents in mammalian ventricular myocytes. Curr Med Chem, 2004.
11(24): p. 3219-28.
95. Zygmunt, A.C., et al., Larger late sodium conductance in M cells contributes to
electrical heterogeneity in canine ventricle. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2001.
281(2): p. H689-97.
96. Hirano, Y. and M. Hiraoka, Barium-induced automatic activity in isolated ventricular
myocytes from guinea-pig hearts. J Physiol, 1988. 395: p. 455-72.
97. Dixon, J.E., et al., Role of the Kv4.3 K+ channel in ventricular muscle. A molecular
correlate for the transient outward current. Circ Res, 1996. 79(4): p. 659-68.
98. Guo, W., et al., Role of heteromultimers in the generation of myocardial transient
outward K+ currents. Circ Res, 2002. 90(5): p. 586-93.
99. Roberds, S.L. and M.M. Tamkun, Developmental expression of cloned cardiac
potassium channels. FEBS Lett, 1991. 284(2): p. 152-4.

77
100. Holmqvist, M.H., et al., Elimination of fast inactivation in Kv4 A-type potassium
channels by an auxiliary subunit domain. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(2): p.
1035-40.
101. Campbell, D.L., et al., The calcium-independent transient outward potassium current
in isolated ferret right ventricular myocytes. I. Basic characterization and kinetic
analysis. J Gen Physiol, 1993. 101(4): p. 571-601.
102. Benndorf, K. and B. Nilius, Properties of an early outward current in single cells of
the mouse ventricle. Gen Physiol Biophys, 1988. 7(5): p. 449-66.
103. Gross, G.J., R.P. Burke, and N.A. Castle, Characterisation of transient outward
current in young human atrial myocytes. Cardiovasc Res, 1995. 29(1): p. 112-7.
104. Szabo, G., et al., Asymmetrical distribution of ion channels in canine and human left-
ventricular wall: epicardium versus midmyocardium. Pflugers Arch, 2005. 450(5): p.
307-16.
105. Varro, A., et al., Ionic currents and action potentials in rabbit, rat, and guinea pig
ventricular myocytes. Basic Res Cardiol, 1993. 88(2): p. 93-102.
106. Nabauer, M., et al., Regional differences in current density and rate-dependent
properties of the transient outward current in subepicardial and subendocardial
myocytes of human left ventricle. Circulation, 1996. 93(1): p. 168-77.
107. Iost, N., et al., Delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular
myocytes. Cardiovasc Res, 1998. 40(3): p. 508-15.
108. Grissmer, S., et al., Pharmacological characterization of five cloned voltage-gated K+
channels, types Kv1.1, 1.2, 1.3, 1.5, and 3.1, stably expressed in mammalian cell lines.
Mol Pharmacol, 1994. 45(6): p. 1227-34.
109. Abbott, G.W., et al., MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is
associated with cardiac arrhythmia. Cell, 1999. 97(2): p. 175-87.
110. Spector, P.S., et al., Fast inactivation causes rectification of the IKr channel. J Gen
Physiol, 1996. 107(5): p. 611-9.
111. László Virág, I.B., Rapid and slow delayed rectifier potassium currents and the
repolarization reserve, in Advances in cardiomyocyte research, P.P. Nánási, Editor.
2009, Transworld Research Network: Kerala. p. 129-130.
112. Varro, A., et al., The role of the delayed rectifier component IKs in dog ventricular
muscle and Purkinje fibre repolarization. J Physiol, 2000. 523 Pt 1: p. 67-81.
113. Ho, W.K., et al., Voltage- and time-dependent block of delayed rectifier K+ current in
rabbit sino-atrial node cells by external Ca2+ and Mg2+. J Physiol, 1996. 494 ( Pt 3):
p. 727-42.
114. Mitcheson, J.S., et al., A structural basis for drug-induced long QT syndrome. Proc
Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(22): p. 12329-33.
115. Heath, B.M. and D.A. Terrar, Protein kinase C enhances the rapidly activating
delayed rectifier potassium current, IKr, through a reduction in C-type inactivation in
guinea-pig ventricular myocytes. J Physiol, 2000. 522 Pt 3: p. 391-402.
116. Wang, L., et al., Developmental changes in the delayed rectifier K+ channels in
mouse heart. Circ Res, 1996. 79(1): p. 79-85.
117. Volders, P.G., et al., Downregulation of delayed rectifier K(+) currents in dogs with
chronic complete atrioventricular block and acquired torsades de pointes. Circulation,
1999. 100(24): p. 2455-61.
118. Balser, J.R., P.B. Bennett, and D.M. Roden, Time-dependent outward current in
guinea pig ventricular myocytes. Gating kinetics of the delayed rectifier. J Gen
Physiol, 1990. 96(4): p. 835-63.

78
119. Thomas, G.P., U. Gerlach, and C. Antzelevitch, HMR 1556, a potent and selective
blocker of slowly activating delayed rectifier potassium current. J Cardiovasc
Pharmacol, 2003. 41(1): p. 140-7.
120. Varnum, M.D., et al., The min K channel underlies the cardiac potassium current IKs
and mediates species-specific responses to protein kinase C. Proc Natl Acad Sci U S
A, 1993. 90(24): p. 11528-32.
121. Bosch, R.F., et al., Effects of the chromanol 293B, a selective blocker of the slow,
component of the delayed rectifier K+ current, on repolarization in human and guinea
pig ventricular myocytes. Cardiovasc Res, 1998. 38(2): p. 441-50.
122. Lengyel, C., et al., Pharmacological block of the slow component of the outward
delayed rectifier current (I(Ks)) fails to lengthen rabbit ventricular muscle QT(c) and
action potential duration. Br J Pharmacol, 2001. 132(1): p. 101-10.
123. Nakashima, H., et al., In vivo electrophysiological effects of a selective slow delayed-
rectifier potassium channel blocker in anesthetized dogs: potential insights into class
III actions. Cardiovasc Res, 2004. 61(4): p. 705-14.
124. Jost, N., et al., Restricting excessive cardiac action potential and QT prolongation: a
vital role for IKs in human ventricular muscle. Circulation, 2005. 112(10): p. 1392-9.
125. Lopatin, A.N., E.N. Makhina, and C.G. Nichols, Potassium channel block by
cytoplasmic polyamines as the mechanism of intrinsic rectification. Nature, 1994.
372(6504): p. 366-9.
126. Koumi, S., et al., beta-Adrenergic modulation of the inwardly rectifying potassium
channel in isolated human ventricular myocytes. Alteration in channel response to
beta-adrenergic stimulation in failing human hearts. J Clin Invest, 1995. 96(6): p.
2870-81.
127. McGrath, J.C., et al., Guidelines for reporting experiments involving animals: the
ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol, 2010. 160(7): p. 1573-6.
128. Persson, P.B., Good publication practice in physiology 2013: revised author
guidelines for Acta Physiologica. Acta Physiologica, 2013. 209(4): p. 250-253.
129. Fischmeister, R., et al., Channel currents during spontaneous action potentials in
embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J, 1984. 46(2):
p. 267-71.
130. Katsube, Y., et al., Differences in isoproterenol stimulation of Ca2+ current of rat
ventricular myocytes in neonatal compared to adult. Eur J Pharmacol, 1996. 317(2-3):
p. 391-400.
131. Banyasz, T., et al., Reverse rate dependency is an intrinsic property of canine cardiac
preparations. Cardiovasc Res, 2009. 84(2): p. 237-44.
132. Chen-Izu, Y., et al., G(i)-dependent localization of beta(2)-adrenergic receptor
signaling to L-type Ca(2+) channels. Biophys J, 2000. 79(5): p. 2547-56.
133. Kuschel, M., et al., G(i) protein-mediated functional compartmentalization of cardiac
beta(2)-adrenergic signaling. J Biol Chem, 1999. 274(31): p. 22048-52.
134. Lemoine, H., B. Ehle, and A.J. Kaumann, Direct labelling of beta 2-adrenoceptors.
Comparison of binding potency of 3H-ICI 118,551 and blocking potency of ICI
118,551. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1985. 331(1): p. 40-51.
135. Kaumann, A.J. and H. Lemoine, Beta 2-adrenoceptor-mediated positive inotropic
effect of adrenaline in human ventricular myocardium. Quantitative discrepancies
with binding and adenylate cyclase stimulation. Naunyn Schmiedebergs Arch
Pharmacol, 1987. 335(4): p. 403-11.
136. Levesque, P.C., et al., Anion and cation modulation of the guinea-pig ventricular
action potential during beta-adrenoceptor stimulation. Pflugers Arch, 1993. 424(1): p.
54-62.

79
137. Jost, N., et al., Contribution of I Kr and I K1 to ventricular repolarization in canine
and human myocytes: is there any influence of action potential duration? Basic Res
Cardiol, 2009. 104(1): p. 33-41.
138. Banyasz, T., et al., Endocardial versus epicardial differences in L-type calcium
current in canine ventricular myocytes studied by action potential voltage clamp.
Cardiovasc Res, 2003. 58(1): p. 66-75.
139. Linz, K.W. and R. Meyer, Control of L-type calcium current during the action
potential of guinea-pig ventricular myocytes. J Physiol, 1998. 513 ( Pt 2): p. 425-42.
140. Kamp, T.J. and J.W. Hell, Regulation of cardiac L-type calcium channels by protein
kinase A and protein kinase C. Circ Res, 2000. 87(12): p. 1095-102.
141. Liu, G.X., et al., Differential conditions for early after-depolarizations and triggered
activity in cardiomyocytes derived from transgenic LQT1 and LQT2 rabbits. J Physiol,
2012. 590(Pt 5): p. 1171-80.
142. Post, S.R., H.K. Hammond, and P.A. Insel, Beta-adrenergic receptors and receptor
signaling in heart failure. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1999. 39: p. 343-60.
143. Xiao, R.P. and E.G. Lakatta, Beta 1-adrenoceptor stimulation and beta 2-
adrenoceptor stimulation differ in their effects on contraction, cytosolic Ca2+, and
Ca2+ current in single rat ventricular cells. Circ Res, 1993. 73(2): p. 286-300.
144. Davare, M.A., et al., A beta2 adrenergic receptor signaling complex assembled with
the Ca2+ channel Cav1.2. Science, 2001. 293(5527): p. 98-101.
145. Nikolaev, V.O., et al., Beta2-adrenergic receptor redistribution in heart failure
changes cAMP compartmentation. Science, 2010. 327(5973): p. 1653-7.
146. Xiao, R.P., X. Ji, and E.G. Lakatta, Functional coupling of the beta 2-adrenoceptor to
a pertussis toxin-sensitive G protein in cardiac myocytes. Mol Pharmacol, 1995.
47(2): p. 322-9.
147. Best, J.M. and T.J. Kamp, Different subcellular populations of L-type Ca2+ channels
exhibit unique regulation and functional roles in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol,
2012. 52(2): p. 376-87.
148. Zhu, Y., et al., Sex differences in repolarization and slow delayed rectifier potassium
current and their regulation by sympathetic stimulation in rabbits. Pflugers Arch,
2013. 465(6): p. 805-18.
149. Harada, K. and T. Iijima, Differential modulation by adenylate cyclase of Ca2+ and
delayed K+ current in ventricular myocytes. Am J Physiol, 1994. 266(4 Pt 2): p.
H1551-7.
150. Walsh, K.B., T.B. Begenisich, and R.S. Kass, Beta-adrenergic modulation in the
heart. Independent regulation of K and Ca channels. Pflugers Arch, 1988. 411(2): p.
232-4.
151. Heijman, J., et al., Local control of beta-adrenergic stimulation: Effects on ventricular
myocyte electrophysiology and Ca(2+)-transient. J Mol Cell Cardiol, 2011. 50(5): p.
863-71.
152. Nalivaiko, E., C.G. De Pasquale, and W.W. Blessing, Ventricular arrhythmias
triggered by alerting stimuli in conscious rabbits pre-treated with dofetilide. Basic
Res Cardiol, 2004. 99(2): p. 142-51.
153. Roden, D.M., Pharmacogenetics and drug-induced arrhythmias. Cardiovasc Res,
2001. 50(2): p. 224-31.
154. Biliczki, P., et al., Interaction of different potassium channels in cardiac
repolarization in dog ventricular preparations: role of repolarization reserve. Br J
Pharmacol, 2002. 137(3): p. 361-8.
155. Salata, J.J., et al., A novel benzodiazepine that activates cardiac slow delayed rectifier
K+ currents. Mol Pharmacol, 1998. 54(1): p. 220-30.

80
81
82
83
Tárgyszavak
Akciós potenciál, β-adrenerg receptorok, IKr, IKs, izoproterenol, késői káliumáram,
kalciumáram, kalciumcsatorna-blokkolók, kutya kamrai szívizomsejtek, kamrai repolarizáció,
patch clamp.

Keywords

Action potential, β-adrenergic receptors, IKr, IKs, isoproterenol, late potassium current,
calcium current, calcium channel blockers, canine ventricular myocytes, ventricular
repolarisation, patch clamp.

84
Köszönetnyilvánítás
Köszönetemet fejezem ki dr. Csernoch László professzor úrnak, aki az Élettani Intézet
igazgatójaként megteremtette az értekezésben bemutatott kísérletek kivitelezésének feltételeit.
Köszönöm témavezetőmnek, dr. Magyar János professzor úrnak áldozatkész segítségét,
bátorítását, elméleti és gyakorlati tanácsait, amelyekkel bevezetett a laboratórium mindennapi
életébe, valamint az értekezés megírásában nyújtott nélkülözhetetlen segítségét.
Köszönettel tartozom az Szív-elektrofiziológia Laboratórium vezetőjének, dr. Nánási
Péter professzor úrnak a hasznos tanácsokért és bátorításért. Emellett szeretnék köszönetet
mondani dr. Szentandrássy Norbertnek, dr. Bányász Tamásnak és dr. Horváth Balázsnak, akik
számtalan elméleti és gyakorlati útmutatással segítettek. Köszönettel tartozom jelenlegi és
volt munkatársaimnak, dr. Bárándi László Viktornak, dr. Hegyi Bencének, dr. Váczi
Krisztinának és Kistamás Kornélnak a mérések kivitelezésében nyújtott segítségükért,
emellett az Élettani Intézet minden jelenlegi és volt munkatársának, hogy támogattak és
segítették munkámat.
A kísérletek előkészítése során nélkülözhetetlen segítséget nyújtottak Víghné Horváth
Katalin és Sági Éva asszisztensek.

A doktori képzési programot a TÁMOP-4.2.2/B-10/1-2010-0024 sz. projekt támogatta. A

projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával
valósult meg.

85