Debreceni Egyetem ÁOK, Élettani Intézet

Korszerű vizsgálómódszerek az
élettudományokban
A jelátviteli folyamatok molekuláinak
protein és RNS szintű vizsgálata
(immuncito- és hisztokémia, konfokális
mikroszkópia, Western blot, kvantitatív
„real-time” PCR)

Tóth István Balázs

IMMUNHISZTOKÉMIA ÉS
IMMUNOCITOKÉMIA
 Immuncito/hisztokémia
 Általánosan
- minden olyan sejtalkotó kimutatható, amit a sejt termel
(peptidek és proteinek)
- enzimek, receptorok, citoszkeletális komponensek,
mediátorok, etc,
- csak szemikvantitatív, ugyanakkor a tendencia vizsgálható
- bizonyos kvantitatív vizsgálat lehetséges (image analizáló
szofverek)
- fénymikroszkópos és fluoreszcens jelölések

 Milyen anyagon?
- Szöveten – immunhisztokémia
- Sejten - immuncitokémia
 Immuncito/hisztokémia - Alaplépések
 Metszetek el- és előkészítése
- Fagyasztott, paraffinbe ágyazott (asszisztencia!)
- Antigénfeltárás a paraffinos metszetek esetében (főzés,
„kuktázás”, mikrohullám, különféle pH-jú pufferek)

 Antitestek kiválasztása
- Egyszeres vagy többszörös jelölések
- NB!!! nagy figyelem az antitestek kiválasztását illetően –
SPECIES!!!

 Festési eljárás kiválasztása

- NB!!! háttér és/vagy magfestés (pl. metilzöld, DAPI)
- Szigorúan optimalizált protokollok
Alapfeltétel
 IMMUNHISZTOKÉMIA
Festési eljárások, detekciós rendszerek
 Direkt módszerek
• A jelölt elsődleges antitest reagál a szöveti antigénnel

• Gyors
• Viszonylag kevés nem specifikus reakció
• A jel erősítése kicsi
• Erősen kifejeződő antigének kimutatására
• Nem a legelterjedtebb módszer
Kétlépéses indirekt módszerek

• A szöveti antigénhez egy jelöletlen

elsődleges antitest kötődik
• Elsődleges ellen termeltetett jelölt
másodlagos antitestet
• Enzim-szubsztrát reakció/fluoreszcens jel

• Flexibilis
• Magasabb érzékenység
• Keresztreakciók az endogén immunglobulinokkal
→ Serum preinkubáció
Kétlépéses indirekt módszerek
Kettős jelölés

PKC - Texas Red

Magfestés - DAPI
Kétlépéses indirekt módszerek
Hármas jelölés

mk

VR1 – Rhodamide – piros

NKI/beteb – FITC – zöld
Melano- Magfestés – DAPI – kék
cyták
DP
Háromlépéses indirekt módszerek

• Az előző technikához képest egy

harmadik antitest alkalmazása
• A két enzimkonjugált másodlagos
antitest egymásra épül
• Különösen kis mennyiségű epitóp
kimutatására használatos

• A festés erősségének növelése

Enzim-immunkomplex módszerek
(APAAP, PAP)
• Nem konjugált elsődleges antitest
• Nem konjugált másodlagos antitest (híd antitest,
feleslegben)
• Oldott enzim-immunkomplex (APAAP vagy PAP)
• Az elsődleges és az immunkomplex antitestjének
ugyanazon fajból kell származnia

• Előzőekhez képest legnagyobb érzékenység

• Ez az antitesthez kötött enzimmolekulák nagy
számára vezethető vissza
 (Strept)avidin-biotin módszerek
• A streptavidin/avidin biotinhoz való nagy affinitásán (Km=10-15 M)
alapul
• 4 biotinkötő hely
• Nem konjugált elsődleges antitest
• Biotinilált másodlagos antitest
• Avidin/biotin enzimkomplex (ABC) / enzimjelölt streptavidin (LSAB)
• Substrate-chromogen reakció (HRP, AP)

• Ma a legelterjedtebb módszer
• Igen magas érzékenység
• Endogén biotinok gátlása szükséges lehet
• Az alapmódszer módosításával növelhető a
szenzitivitás, leegyszerűsíthető az eljárás
 (Strept)avidin-biotin módszerek
Általános ABC eljárás és LSAB módszer

• Az avidin-(vagy
streptavidin) biotin- • Elsődleges antitest
enzimkomplex a biotinilált • Biotinilált másodlagos antitest
másodlagos antitesttel
• Streptavidin-enzim konjugátum
reagál
• Szubsztrát-chromogén reakció
• Avidin és biotinilált enzim
megfelelő aránya
(Strept)avidin-biotin festés

HSZ

HSZ

Pozitív kontroll Negatív kontroll

VR1 - DAB VR1 + Blocking peptide
(Strept)avidin-biotin festés

SBK

BK

400x 400x

VR1- DAB VR1 - VIP SK4600

 (Strept)avidin-biotin festés
Kettős jelölés

400x
400x

VR1- DAB – barna VR1- DAB – barna

CD1a – Fast Blue - kék Tryptase – Fast Blue - kék
(Strept)avidin-biotin módszerek
Tyramid jelerősítés (TSA)
• Az avidin-(vagy streptavidin) biotin-
enzimkomplexhez egy speciális
jelerősítő reagenst adunk
• Reagens: biotintatralmú szubsztrát
(Biotin-Tyramid), melyből a peroxidáz
egy reaktív és oldhatatlan vegyületet hoz
létre (biotin precipitáció)
• A precipitált biotin a következő lépésben
peroxidázjelölt enzimmolekulákat köt

• A standard módszernél 100x érzékenyebb

• Nagy háttérfestődés
 (Strept)avidin-biotin módszerek
Tyramid jelerősítés (TSA)

VR1 - TSA - FITC VR1- DAB

(Strept)avidin-biotin módszerek
Tyramid jelerősítés (TSA)

ORS
ORS

IRS

IRS

dp
DP
mk DAB

TSA

VR1 - DAB VR1- TSA - Rhodamide

(Strept)avidin-biotin módszerek
Tyramid jelerősítés (TSA)

Immunfluoreszcens

TGF2

TSA

Kontroll Kezelt
 Polimerkapcsolt módszerek

• Enzim- és antitestjelölt polimer(dextran)

• EPOS (Enhanced Polymer One-Step
Method): konjugált másodlagos antitest
• En-Vision: indirekt módszer

• Igen gyors, egyszerűen kivitelezhető

• Érzékeny
• Nincs endogén biotinnal való keresztreakció
• Rövidebb inkubációs idő (~10 perc)
• Csak egér és nyúl ellenes polimer
 Hibakeresés és megoldásaik
1. A kontrollok, próbák és háttér csekély festődése
• A reagensek, antitestek nem megfelő
higítása, inkubációs idő vagy hőmérséklet
• Az antitest nem a megfelelő pufferben van
higítva
• Antitestek, reagensek nem megfelelő
minősége, tárolhatóság túllépése
• Antitest disszociál az antigénről
• Alkoholban oldódó magfestők használata
alkoholban oldódó chromogenek
jelenlétében
• Túl erős magfestő elfedi a festődést
• Alacsony génexpresszió, pl. tumorok,
helytelen fixálási eljárás
• Antitest és reagensek kititrálása
• TBS/PBS, megfelelő pH, ionerősség,
stabilizátor, detergensek használata
• Termékek előírás szerinti tárolása, aliquotok
használata, a felolvasztás-lefagysztás elkerülése
• Mosás, híd-antitest
• Vizes bázisú magfestők, DAB chromogen
használata
• Inkubációs idő csökkentése, hígítás, más
magfestő
• Érzékenyebb detekciós rendszer,
inkubációs idő ↑, antigén feltárás
• Túl nagy antigénmennyiség sztérikus gátlása • Elsődleges antitest kisebb koncentrációja
• Nem megfelelő fixálók: az antigén vagy
epitópja károsodik, antigén kioldódása • Alkalmas fixáló kiválasztása
• Az immunreaktivitása a beágyazás során
sérül vagy csökken • Paraffinbeágyazás 60 fok alatt
• Az IR a deparaffinálás során csökken
• 60 fok alatti deparaffinálás
• Fölöslegben maradt blokkoló oldat a
szövetben
• Mosás
• Nem elégséges antigénfeltárás
• Proteolitikus emésztés, ideje függ a fixálás
módjától, idejétől, antigén, antitest sajátságaitól

2. A pozitív kontroll adekvát, a próba csekély festődése, háttér

• A próba túl hosszú idejű fixálása pl. • Fixálás standardizálása, antigén feltárás
formalinban
• Metszés során keletkezett artefaktumok
• A próba egy része nem fixált
 3. A kontroll és a próbák háttérfestődése

• A substrat/chromogen oldatok hosszú • Inkubációs idő lecsökkentése

inkubációs ideje
• A másodlagos antitest keresztreakciója a • Megfelelő normálszérum alkalmazása
szöveti antitestekkel
• Az antitestek, reagensek mennyisége • Megfelelő higítás, inkubációs idő, hőmérséklet

• Tárgylemezek nem megfelelő mosása • Mosás közben enyhe rázatás

• Mosópufferben kevés a detergens vagy só
• Nem elégséges antigénfeltárás
• Antigéndiffúzió • Fixálás standardizálása
• A metszetek túl vastagok • Metszés standardizálása
• Endogén biotin jelenléte • Avidin-biotin block
• Részlegesen kiszáradt metszet
• Chromogen granulák
• Beágyazó médium nem megfelelő
eltávolítása
IMMUNCITOKÉMIA
 Alapprotokoll – Egyszeres jelölés
a sejtek tenyésztése fedőlemezen
(ha nem adherens, akkor a sejtek kitapasztása)


fixálás 4 oC-os acetonnal vagy paraformaldehiddel



blokkolás & permeabilizálás (BSA & Triton-X 100)



inkubáció nyúlban vagy egérben termelt elsődleges antitesttel



inkubáció biotinilált anti-nyúl vagy -egér másodlagos antitesttel



inkubáció anti-biotin streptavidin-konjugált Texas red antitesttel



fedés DAPI-val (magfestés)



vizsgálat fluoreszcens mikroszkóppal vagy konfokális mikroszkóppal

 Egyszeres jelölés – Texas Red
tenyésztési napok
2 4 6 8 10

PKC

PKC

PKC

PKC
 Immuncitokémia
Texas Red & FITC (kettős jelölés)
PKCg (piros-Texas red) expressziója nő az humán vázizomsejtek
differenciálódásával (desmin; zöld-FITC) párhuzamosan

4d 8d 12d

16d 25d
 Immuncitokémia
Texas Red & FITC & DAPI (hármas jelölés)
P2X2 receptor (piros-Texas red) expressziója humán vázizomsejtekben
(az izomspecifikus marker desmin; zöld-FITC) (magfestés: kék-DAPI)
KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA
 Konfokális mikroszkópia
 Általánosan
- minden olyan sejtalkotó kimutatható, amit a sejt termel
(peptidek és proteinek)
- enzimek, receptorok, citoszkeletális komponensek, etc.
- a szubcelluláris lokalizáció és integritás meghatározása
- kvantitatív meghatározás lehetséges (image analizáló
szofverek)
- csak fluoreszcens jelölések (lézeres gerjesztés)
- optikai „szeletelés”
- 3D képek
- „Real time” is kivitelezhető

 Milyen anyagon?
- Szöveten
- Sejten
 Konfokális mikroszkópia
Kontroll IGF-I Kontroll IGF-I

 

g z

 

Konfokális képek, FITC jelölés, nagyítás: 630x

 Konfokális mikroszkópia

Kontroll IGF-I

Konfokális képek, FITC jelölés, nagyítás: 630x

 Konfokális mikroszkópia
Kvantitatív elemzés
Kontroll IGF-I

Konfokális képek, FITC jelölés, nagyítás: 630x

Real-time konfokális mikroszkópia

0 min 2 min 5 min

10 min 15 min 20 min

WESTERN BLOT
 Western blot

 Jellemzők
- minden, ami fehérje (receptor, enzim, sejtalkotó, etc.)
- nagy specificitás
- kvantitatív!!!, az immunreaktív csíkok denzitometriás
vizsgálatával (OD)

 Általánosan
- elektroforézis: töltéssűrűség & feszültséggradiens (CAVE!)
- anód (+) & katód (-)
- zóna elektroforézis:
- hordozó közegben (agaróz, poliakrilamid)
- molekulaszűrő hatás  elválasztás méret szerint
 Western blot
 PAGE
- akrilamid & biszakrilamid  polimerizáció
- AMPER & TEMED  indukció & stabilizáció
- vátoztatható sűrűség (3.5-20%), tehát szűrőképesség
 Western blot
 SDS-PAGE
- SDS - detergens
- minden fehérje NEGATÍV töltésű
- minden fehérje EGYFORMA ALAKÚ
- segítség: DTT jelenlétében főzés (denaturáció & S-S híd bontás)
- Eredmény: a fehérjék MÉRET ALAPJÁN szétválaszthatók!!!
 Western blot
 Laemmli-féle diszkontinus puffer-gél rendszer
- felső gél: pH 6.8  koncentrálás a startvonalon
- alsó gél: pH 8.8  igazi szétválasztás
- puffer: Tris/Glicin
 Western blot
• Protokoll
a sejtek összegyűjtése lízis-pufferben (hipotóniás, proteáz gátlók)

ultrahangos feltárás (szonikálás)

proteinmeghatározás

minták elkészítése SDS-mintapufferben

X%-os SDS-PAGE

elektrotranszfer nitrocellulóz-membránra

inkubáció egérben vagy nyúlban termelt elsődleges antitesttel (jelölés)

inkubáció torma-peroxidáz-konjugált anti-egér vagy -nyúl másodlagos antitesttel

vizualizálás ECL (kemilumineszcens) kit segítségével
Western blot – A minták el- és előkészítése
Western blot – A proteinmeghatározás
Western blot – A futtató rendszer
Western blot – A futtató rendszer
Western blot – Az alsó gél
Western blot – A felső gél
Western blot – A mintafelvitel (loading)
Western blot – A futtatás (SDS-PAGE)
Western blot – A blottolás (elektrotranszfer)
Western blot – Az immunfestés
Western blot – A mosás
Western blot – Az előhívás
Western blot – A proteinfestés
Western blot – A film
Western blot – A film
Western blot – A film
Western blot – A GelDoc rendszer
Western blot – A denzitometria
Western blot – A denzitometria
Western blot – A denzitometria
Western blot – A denzitometria
Western blot – A publikáció

BP ORS HaCaT

VR1
 Western blot – A publikáció
Kvantitatív denzitometria

A B
Days of culturing
2 4 6 8 10
  e 
PKC 120
  z 

PKC 100

Normalized OD (%)
80
PKCe
60
PKC
40
PKC
20
PKC
0
PKCz
2 4 6 8 10
Days of culturing
Western blot – Előhívás helyett:
LAS-3000 Intelligent Darkbox
Western blot – Denzitometria helyett:
Kemilumineszcencia intenzitás
 Western blot – Prezentáció

Humán Kutya Csirke C2C12

szívizom porc PKCα

113 kDa
91 kDa
PKCα

49,9 kDa
Katalitikus alegység

35,5 kDa
RT-PCR
Mi a PCR?
“The polymerase chain reaction (PCR) is a biochemical technology in molecular
biology to amplify a single or a few copies of a piece of DNA across several
orders of magnitude, generating thousands to millions of copies of a particular
DNA sequence.”

(~A polimeráz láncreakció egy biokémiai módszer

a molekuláris biológában, ami lehetővé teszi egy
adott DNS szekvenica egy vagy néhány
példányának több nagyságrenddel történő
felsokszorozását, melynek eredményeként az
adott szekvencia több ezer vagy akár millió
példányban készül el.)

A PCR lehetővé teszi

specifikus DNS
szekvenciák detektálását
PCR – Mire való?
Miért csináljunk PCR-t? Mi érdekel?

• Szervek
• Szövetek Funkciók és szabályozásuk
• Sejtek

Egyes molekulák szerepe

Milyen molekulák?

A sejt molekulái
Kis molekulák
• Szerves molekulák
• Szervetlen molekulák

Makromolekulák
• Lipidek
• Fehérjék
• Nucleinsavak
Proteinek és nuklein savak
A fehérjék a fő “végrehajtók”
• Enzimek
• Receptorok
• Transporterek
• Regulátorok
• Stb.
A fenotípus fő meghatározói
A “hozzájárulásuk” expresszió és aktivitás függő
Expressziós vizsgálatok
Proteinek és nuklein savak
Nuklein savak
• DNS - genome
- Információ tárolás
• RNS - transcriptome
- messengerek
- regulátorok, etc.
A fehérjék és nukleinsavak közeli kapcsolata
– A gének…
A gén definiciója:
1860s–1900s: Gene as a discrete unit of heredity
1910s: Gene as a distinct locus
1940s: Gene as a blueprint for a protein – information
1950s: Gene as a physical molecule – DNA
1960s: Gene as transcribed code – structure of DNA, genetic code
→ Central Dogma: DNA → mRNA → protein
1970s–1980s: Gene as open reading frame (ORF) sequence pattern
The entire nucleic acid sequence (usually a DNA sequence) that is necessary for the synthesis of a
functional polypeptide or RNA sequences.
(Darnell, Lodish & Baltimore: Molecular Cellbiology, 2nd ed., 1990)

Gerstein M B et al. Genome Res. 20071

…és a génexpresszió
A gén modern koncepciója

A gén definiciója:
1860s–1900s: Gene as a discrete unit of heredity
1910s: Gene as a distinct locus
1940s: Gene as a blueprint for a protein – information
1950s: Gene as a physical molecule – DNA
1960s: Gene as transcribed code – structure of DNA, genetic code
→ Central Dogma: DNA → mRNA → protein
1970s–1980s: Gene as open reading frame (ORF) sequence pattern
The entire nucleic acid sequence (usually a DNA sequence) that is necessary for the the synthesis
of a functional polypeptide or RNA sequences.
(Darnell, Lodish & Baltimore: Molecular Cellbiology, 2nd ed., 1990)

A genomi DNS-nek csak 1-2%-a fehérje kódoló régió

Humán genom = kb. 20-25,000 fehérje kódoló gén
Az ismert RNS gének száma kb. ugyanennyi
A gének átfedőek lehetnek
1 gén = 1 fehérje
Gerstein M B et al. Genome Res. 20071
Modern concept of a gene

Definitions of a gene:
1860s–1900s: Gene as a discrete unit of heredity
1910s: Gene as a distinct locus
1940s: Gene as a blueprint for a protein – information
1950s: Gene as a physical molecule – DNA
1960s: Gene as transcribed code – structure of DNA, genetic code
→ Central Dogma: DNA → mRNA → protein
1970s–1980s: Gene as open reading frame (ORF) sequence pattern
The entire nucleic acid sequence (usually a DNA sequence) that is necessary for the the synthesis
of a functional polypeptide or RNA sequences.
(Darnell, Lodish & Baltimore: Molecular Cellbiology, 2nd ed., 1990)

A current computational metaphor:

Genes as “subroutines” in the genomic operating system

The gene is a union of genomic sequences encoding a

coherent set of potentially overlapping functional products.
Gerstein M B et al. Genome Res. 2007
 A gén modern koncepciója
A gén olyan genomi szekvenciák egysége ami potenciálisan átfedő funkcionális
termékek koherens egységét kódolja.

Gerstein M B et al. Genome Res. 2007;17:669-681

Copyright © 2007, Cold Spring Harbor Laboratory Press
 Mit detektáljunk?

mRNS

Gerstein M B et al. Genome Res. 2007;17:669-681

Copyright © 2007, Cold Spring Harbor Laboratory Press
Célok

Fehérjekódoló gének exprssziójának vizsgálata

mRNS
anlízis:

(Q)PCR
Történelmi háttér

1953 James D. Watson and Francis Crick 1962

publish the structure of DNA

1957 Arthur Kornber identifies the 1993

1st DNA polymerase 1959

1960s H. Gobind Khorana and others:

elucidation of the genetic code
1968
1976 Isolation of DNA polimarase from
Thermus aquaticus

1977 Frederick Sanger: DNA sequention

1980

1986 Kary Mullis presents PCR

Csináljunk PCR-t!
RNS-ből kiindulva – reverz transcripció (RT)

Cél: Az RBS másolása komplementer DNS

szekvenciába (cDNS)

Hozzávalók:
- RNS templát
- Reverz transzkriptáz enzim
- Primerek:
- szekvencia specifikus primer
- oligo dT primer – mRNS specifikus
- random primer – minden RNS-t felismer

- dNTP
- puffer, ionok
- RNAse inhibitor (opcionális)
A klasszikus PCR elvei – a reakcióelegy
- DNs templát
- Hőstabil DNS polimeráz – Taq polymerase
- Forward és reverse primerek – Tm~ ugyanaz (2 oC)
- A polimeráz csak duplaszálú DNS-ről tud indulni
- Specifitás
- dNTP-k (Deoxinukleozid trifoszfátok)
- Puffer oldat
- Ionok (Mg2+!)
A klasszikus PCR elvei – az amplifikáció (sokszorozás)

95oC 60oC 72oC

20 s 30 s 1 min

20-40 cycle

21= 2 kópia
22= 4 kópia

23= 8 kópia
A klasszikus PCR elvei – a detekció
Agaróz-gélelektroforézis
Ethidium bromid jelölés (karcinogén)
UV fluoreszcencia
Minőségi analízis (specifitás): A termék (amplikon) mérete
Mennyiségi analízis: fluoreszcencia intenzitás
- semi-kvantitatív
- FONTOS: próbáljunk az amplifikáció exponenciális fázisában detektálni
- belső kontrollok használata

Size (bp) PKC isophorms

z l
1 2 3 4 5 bp

TGF2 565
547
418 -actin 420
359
Előnyök és hátrányok

• Optimalizáció szükséges
• Olcsó - primer koncentrációja
- primerek - Mg2+ koncentráció
- készülék - hőmérséklet
• Flexibilis → gradiens PCR
• különböző gének – különböző
protokoll → Sok munka, idő és minta!
• Ethidium bromid
• Szemikvantitatív

271 bp

MgCl2 (mM) 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4

primer (pmol/ul) 0,3 0,6 1 0,3 0,6 1 0,3 0,6 1 0,3 0,6 1
Hagyományos vs. kvantitatív PCR
Hagyományos PCR QPCR

Ugyanazok az alapelvek

Detekció: Detekció:
- Gélelektroforézis után - A reakció során
- Fluoreszcens festék - Fluoreszcencia
- Végpont - Valósidejű (Real-time)
Szemikvantitatív Kvantitatív
- abszolút
- relatív
Optimalizálás szükséges Optimalizálás az alkalmazott detekciós
módszer (real-time chemistry) függvénye

Készülék kb. 3-4,000 Euro Készülék kb. 20,000 Eurotól

Olcsó reagensek Raegensek drágábbak (az alkalmazott
technika függvényében)
Festék és próba alapú valós idejű detekció
Festék alapú detekció Próba alapú detekció

Kettősszáló DNS-hez kötődő Fluoreszcensen jelölt nukleinsav próba

fluoreszcens festék (szonda) kötődik az amplikonhoz
→ Minden duplaszálú DNA-t detektál → Csak a specifikus terméket detektálja
- A detekció további extra lépéseket
igényelhet

Specificitás alapja: Specificitás alapja:

- Primer kötődése - Primer kötődése
- PCR kondíciók - PCR kondíciók
- Próba hibridizáció
Festék és próba alapú valós idejű detekció
Festék alapú detekció
Optimalizálás:
- Mint a hagyományos PCR estén
- optimalizált hagyományos PCR
protokol adaptálható
Flexibilis, mint a hagyományos PCR
Minden primer esetén egyedi kondíciók
Próba alapú detekció
Optimalizálás:
- praktikusan nem szükséges
(előretervezett assayk esetében)
Flexibilis, számos aplikáció
Universal conditions (predesigned
assays)
Multiplexing (egy csőben több
különböző reakció egyidőben)
lehetséges
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

Reporter Quencher
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

→ Intakt próba esetén nincs reporter

szignál – a quencher elnyomja
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

95oC 60oC 72oC

20 s 30 s 1 min

20-40 ciklus

21= 2 kópia
22= 4 kópia

23= 8 kópia
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

Fluoreszcencia
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

4. ciklus
A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

5. ciklus
A fluoreszcencia
exponeciálisan
nó
Amplifikáció és detekció TaqMan próbával

Fluoreszcencia Real-time fluorescence

Végpont

ciklusszám
Detekció SYBR Green festékkel
Real-time fluorescence
Fluorescence

End-point

Cycles

• Egy extra lépés minden ciklusban: hibridizáció, miközben a

festék bekötődik – fluoreszcencia detektálása
• Olvadási görbe (melting curve) analízis követi
 Detekció SYBR Green festékkel – melting curve
Real-time fluorescence
Fluorescence

End-point

Cycles
A reakció végén a terméket
lassan fűtjük. Ilyenkor a
hibridizációs hőmérséklet
elérésekor a két szál disszociál
amit a festék
fluoreszceniájának csökkenése
kísér. Ha egy termék van csak,
a disszociáció egy lépésben, egy
adott hőmérsékleten
következik be – specificitás
ellenőrzése.
A detekció precizitása

Fluorescencia

Nagy szórás a plátófázisban

- Nagy precizitás
- Exponentciális növekedés

Ciklusszám
Refrencia festék és Rn – fokozott precizitás
Egy passzív referencia

Fluoreszcencia
festék hozzáadása (ROX)
→ Normalizáció
- Intenzitás szórása ↓
- High precision
- Térfogat szórása↓ - Exponential growth

Normalizált reporter
Csökkent variabilitás

szignál (Rn)
Fokozott precizitás
Reporter szignál
Rn=
Passzív referencia
Ciklusszám
 Lineáris y tengely

Logaritmikus nézet

Logaritmikus y tengely
A mennyiségi meghatározás alapjai– A „cycle
threshold” (Ct)
Fluoreszcencia

Ct érték

Küszöb

Alapvonal Ciklusszám
Mennyiségi meghatározás

Abszolút Relatív
kvantifikáció kvantifikáció

Pontos kópiaszám vagy Relatív emelkedés vagy

mennyiség csökkenés
Kalibrációs görbe alapján ∆Ct alapján
Abszolú kvantifikáció

10x hígítás→ +3.32 Ct

2x hígítás→ +1 Ct

Ct
Ismeretlen minta
Ct

Pontos kópiaszám Kópiaszám

Relatív expresszió - belső kontrol
Normalizálás egy (vagy több) belső kontrol génre
Belső kontrolra normalizálással kiküszöbölhető
- kiindulási RNS mennyiség varianciája
- RT hatékonyság varianciája
Jó belső kontrol – Minden mintában egyforma mennyiségben expresszálódik
- Nehéz kísérletileg ellenőrízni
- „elméleti” kontrolok – háztartási gének, strukturális fehérjék, stb.

• 18S rRNS • -Glucuronidase

• Acidic ribosomal protein
• - Actin (ACTB)
• Cyclophilin A (PPIA)
• Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH)
• Phosphoglycerokinase
• Hypoxanthine ribosyl transferase
• Transcription factor IID, TATA binding
protein
• Transferrin receptor
• 2-Microglobulin
Relatív expresszió - belső kontrol

• - Actin (ACTB)
• Cyclophilin A (PPIA)
• Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)

Több belső kontrol – fokozott megbízhatóság

- Különböző biológiai folyamatokban résztvevő gének
- Egymáshoz is hasonlítjuk
- Geometriai átlaguk – stabilabb
Relatív expresszió – ∆Ct

Ct = Cttarget – Ctendogenous control

Relatív expresszió – ∆Ct

Ct = Ctcélgén– Ctbelső kontrol

Kontrol minta Kezelt minta

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Relatív expresszió – ∆Ct

Ct = Ctcélgén– Ctbelső kontrol

Kontrol minta Kezelt minta

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Ct=10
Relatív expresszió – ∆Ct

Ct = Ctcélgén– Ctbelső kontrol

Kontrol minta Kezelt minta

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Ct=10 Ct=7.5
Relatív expresszió – 2-∆Ct

Ct = Ctcélgén– Ctbelső kontrol

Kontrol minta Kezelt minta

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Ct=10 Ct=7.5
2-Ct= 0,000976 2-Ct= 0,005524
Relatív expresszió – 2-∆Ct

Ct = Ctcélgén– Ctbelső kontrol

0,006

Relative expression of target gene

0,005

(endogenous control =1)

0,004

0,003

0,002

0,001

0,000
control treated

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Ct=10 Ct=7.5
2-Ct= 0,000976 2-Ct= 0,005524
Relatív expresszió – ∆∆Ct

Ct = Ctkontrol minta– Ctkezelt minta

0,006

Relative expression of target gene

0,005

(endogenous control =1)

0,004

0,003

0,002

0,001

0,000
control treated

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Ct=10 Ct=7.5
Relatív expresszió – ∆∆Ct

Ct = Ctkontrol minta– Ctkezelt minta

0,006

Relative expression of target gene

0,005

(endogenous control =1)

0,004

0,003

0,002

0,001

0,000
control treated

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Ct=10 Ct=7.5
Ct=-2.5
Relatív expresszió – ∆∆Ct

Ct = Ctkontrol minta– Ctkezelt minta

6

4
x-fold increase
(control = 1) 3

0
treated treated2 treated3

Ct=26 Ct=36 Ct=25 Ct=32.5

Ct=10 Ct=7.5
Ct=-2.5
2-∆∆Ct: 5.657-fold increase
Assay tervezés és specifitás
Általános elvek:
Rövid amplikon – nagyobb hatékonyság

Primerek:
- Tm: 58-60 oC
- ∆Tm < 2 oC
- Ne legyen comlementer szekvenicai a párok között
- Kerüljük a sorban azonos nukleotidokat egymás után
- G és C optimális száma és pozíciója
- stb.

Proba:
- Rövid
- Ne legzen belső homológia
- Ne legyen homológ a primerrel
- Ne legyen G az 5’ végen (jelcsilapítás)
- Proba Tm legyen magasabb mint a primer Tm (8-10oC)
- stb.
Assay tervezés és specifitás
Fehérjekódoló mRNS detekciójához exon-exon határt
célozzunk
Assay tervezés és specifitás
Fehérjekódoló mRNS detekciójához exon-exon határt
célozzunk

És/vagy DNáz kezeléssel távolítsuk el a genomi DNS szennyezést

Assay tervezés és specifitás

Kész megoldások:
Előre tervezett primerek
és próba egyetlen csőben
 Assay tervezés és specifitás

Hs00234244_m1

Kész megoldások: Előre tervezett primerek és próba egyetlen csőben –

katalógusból választható minden génre
Egy kritikus lépés – a minta minősége

Szövet
Mintagyűjtés
Tárolás
RNS tisztítás
RNS
Tárolás
DNáz kezelés
Reverz transzkripció
cDNA

Q-PCR
Expressziós
eredmények Rnases!!!
Minőségi (és mennyiségi) kontrol

Fotometriás mérés
- Nanodrop spektrofotometer

A260: nukleinsavak elnyelési

maximuma 260 nm
x50 – DNA
x40 – RNA
x33 – ssDNA

A280: Fehérjék

A260/A280 > 1.8

A230: szerves oldószerek

Minőségi (és mennyiségi) kontrol

Festék alapú detekció

- RNS-t és DNS-t meg lehet különböztetni
 Jó minőségű minta, tiszta
Minőségi (és mennyiségi) kontrol riboszomális RNS csúcsokkal

Bioanalyzer (Agilent)
Chip alapú mikrogélelektroforézis RNS
festékkel

Erősen degradált minta

Hogyan javíthatjuk a minta minőségét?
Általános elvek:
• Rnázok eltávolítása a munkafelületről – Rneasy, Rnase
erease
• Rnázok eltávolítása a kézről– kesztyű
• Rnázok eltávolítása a reakcióközegből – inhibitorok
• Dolgozzunk tisztán (PCR clean!)
• Dolgozzunk gyorsan
• Jégen
• Tárolás -80 oC
• RNAlater?
• Trizol/TRIreagent?
- fenol és guanidin tiocianát
• Gyors mintafeldolgozás
 Kérdések?
Ha kérdése lenne az előadás anyagával
kapcsolatban, az alábbi címre írhat emailt:
helpdesk.phys@med.unideb.hu.
Az email tárgyában hivatkozzon a karra, szakjára,
évfolyamára, a kurzus és az előadás címére valamint az
adott előadás oktatójára pl.:
ÁOK, Ált. orvos, 2. évf., Modern technikák kurzus,
fehérje, RNS és DNS szintű vizsgálatok, Tóth I. B.