Tripszin tisztítása

affinitáskromatográfiával
A fehérjetisztítás lehetséges lépései
• szövet/szerv/sejt kinyerése az állatból vagy emberből
• szövet homogenizálása
• sejtalkotók elválasztása több lépésben egyre növekvő sebességű és
idejű centrifugálással
• ioncserélő kromatográfia
• gélszűrés
• affinitáskromatográfia (jellemzően utolsó lépés)
Kromatográfiás elválasztás: anyagkeverék összetevői valamilyen
tulajdonságuk alapján megoszlanak két fázis - az ún. álló fázis és
mozgó fázis között.

Kromatográfiás módszer Az elválasztás alapját nyújtó

tulajdonság
ioncserélő kromatográfia a molekulák töltése

gélszűrés a molekulák mérete

vékonyréteg kromatográfia adszorpció szilárd felületen és

oldékonyság oldószerekben
affinitáskromatográfia specifikus kötés az állófázishoz

Affinitáskromatográfia
Az affinitáskromatográfia lépései:
A tisztítandó fehérje kölcsönható
partnerét (a ligandot) rögzítik
(immobilizálják) a kromatográfiás oszlop
töltetéhez (a mátrixhoz)
A mátrixhoz kötött specifikus ligandhoz
csak a „hozzáillő” kötőhellyel rendelkező
molekulák kötődnek, a többi molekula
lemosható.
A ligand reverzíbilisen köti a keveréket
tartalmazó mozgó fázisból a keresett
biomolekulát (fehérjét), amit a mozgó
fázis összetételének (pl. pH-jának)
megváltoztatásával eluálhatunk
(lemoshatunk) a oszlopról
 Affinitás kromatográfiában gyakran használt kölcsönhatások

Tisztítandó molekula A ligandja

enzim szubsztrát, szubsztrátanalóg,
inhibitor, kofaktor
antitest (immunoglobulin) antigén (fehérje v. mikróba fehérjéje)
nukleinsav komplementer szekvencia
hormonreceptor hormon
vitaminreceptor vitamin
A tisztíthatóságot befolyásolja a tisztítandó molekula-ligand kompex disszociációs állandójának
(Kd) nagysága
• Az gyakorlaton albumin-tripszin keverékét („nyers tripszin”)
választjuk szét összetevőire azaz a tripszint tisztítjuk.
• A tripszin egy proteáz enzim.
• A proteázok peptidkötéseket hidrolizálnak (hidroláz enzimcsoport).
• Specifikusan bontják le a fehérjéket (ne hasítson minden peptidkötést)
• Fontosságuk: élelmiszerfehérjék emésztése, fehérjék újra-
hasznosítása, véralvadás, fehérjék aktiválása
Proteáz enzimek csoportosítása
a) aszerint, hogy milyen aminosav vagy ion található az enzim aktív centrumában:
enzim aktív centrum példák
1.szerin-proteáz: tripszin, kimotripszin, elasztáz alkotói
szerin-proteáz Ser – His – Asp tripszin,
2.metalloproteáz: karboxipeptidáz A, aminopeptidázok „ún. katalitikus kimotripszin,
3.savanyú (aszpartil) proteáz: pepszin triád” elasztáz
4.cisztein (tiol) proteáz: katepszinek lizoszómákban metalloproteáz Glu, His , Zn2+ karboxipeptidáz A,
aminopeptidázok
5.treonil proteáz: proteaszóma
savanyú ( karboxil 2 Asp pepszin
v. aszpartil) proteáz

b) a hasítás helye szerint:

1. exopeptidázok, amelyek a fehérje (peptid) láncvégi amino- vagy karboxiterminális aminosavát hidrolizálják:
karboxipeptidáz A, B (lumen) és aminopeptidáz (intracelluláris bontás)
2. endopeptidázok, amelyek a fehérje belsejében hidrolizálnak meghatározott peptidkötést, mert felismerik a peptidkötést
alkotó egyik aminosavat: tripszin (Arg és Lys mellett), kimotripszin (nagy hidrofóbok mellett), elasztáz (kis oldalláncúak
mellett) hasít
A proteázok fontossága
• A tripszinogént egy enteropeptidáz (régiesen
helytelenül enterokináz) az aminoterminális rész
lehasításával tripszinné alakítja

• A tripszin egy „mester” proteáz, számos

emésztőenzimet aktivál limitált proteolízissel pl.
kimotripszinogén, proelasztáz, prokarboxipeptidáz

• A tripszin bázikus Ly és Arg karboxilja (His-t nem! )

által létrehozott peptidkötést (de nemcsak! )
hidrolizál

• A Ser-proteázok a felismert aminosav és egy másik

molekula közti savamamid kötést és észterkötést is
képesek hidrolizálni.
 Proteázok aktivációja Szerin-proteázok aktív centruma

a Ser, Asp, His a zimogénben távol helyezkednek el

Zimogén (inaktív prekurzorok, proenzimek) egymástól, a proteolízist követő konformáció-
formában szintetizálódnak változás teszi lehetővé, hogy térben egymáshoz
ez a szervezet egyik védekező mechanizmusa az önemésztődés, illetve közel kerülnek így létrehozva az aktív centrumot.
szöveti destrukció ellen

Aktivációs módozatok (a megfelelő stimulus

indukálja):

a) kialakult az aktív centrum, de mégsem működik

mert fedett
pl. pepszinogén pepszin

b) preprotein limitált proteolízise (részleges hasítása)

és utána konformációváltozás
pl. tripszinogén tripszin
kimotripszinogén kimotripszin,
proelasztáz elasztáz,
prokarboxipeptidáz A karboxipeptidáz A
Szerin proteázok hatásmechanizmusa
A kísérletben a tripszin képes a BAPNA (N-benzoil-DL-arginil-p-
nitroanilid) savamidkötését hidrolizálni, mert az arginint felismeri

a para-nitroanilin sárga
 Proteáz-inhibitorok
• A tápcsatornán kívül inhibitorok akadályozzák meg,
hogy az aktiválódott enzimek a tápcsatornán kívül is
működjenek és megemésszék a szervezet saját
fehérjéit, ill. szabályozzák az enzimek működését.

• Tripszin-inhibitorok (sokféle)
• A plazma α1-antitripszin (α1-proteáz-inhibitor, szerpin)-
az inhibitor COO- csoportja és a Ser OH –ja között nem
hidrolizáló észterkötés alakul ki, mert az enzim aktív
centruma közben szétesik, „öngyilkos inhibitor”

• Pancreas tripszin inhibitor

• Növényekben, gombákban, baktériumokban is vannak
• Kísérletünkben szója tripszin-inhibitort használunk
(Kunitz típusú), amelyik reverzibilisen kötődik a
tripszinhez ionos kölcsönhatással (is)
• A szója tripszin-inhibitor kovalensen hozzá van kötve az
affinitáskormatográfiás mátrixhoz , de a gátlóképességét megőrzi

• Egyik pozitív aminosavához reverzibilisen kötődik a tripszin negatív

töltésű szubsztrátkötő helye ( elég magas pH-n)
Fehérjék aspecifikus kimutathatósága

280 nm környékén
lévő abszorpciós csúcs
az aromás aminosavak
elnyelésének
köszönhető
• Első csoport hallgatói a következőket csinálják ( 4 munkacsoport, 4 kromatográfiás oszlop )
• Kémcsövek számozása (1-4), 3 ml térfogat bejelölése a frakciók gyűjtéséhez összehasonlítva a 4. csőben levő deszt. vízzel
• Oszlopon a gél regenerálva van, a puffert le kell engedni a gélmátrix szintjéig
• 200 μl nyers tripszint óvatosan fel kell vinni a gélágyra a legkisebb pipettával, nyitni az oszlopot és rögtön az 1. csőbe lecsepegtetni,
amíg a minta szintje a gélágy szintjére csökkent
• Ekkor 3 ml TRIS pH= 8,5 fel kell vinni az oszlopra és folyamatosan gyűjteni 3 ml frakciót ( 1. cső)
• Ezután rögtön felvisszük a 3 ml Na-formiát pH=4,5 puffert és újra 3 ml frakciót gyűjtünk ( 2 .cső)
• Végül felviszünk 3 ml Na-formiát pH = 2,6 puffert és 3 ml frakciót gyűjtünk a (3. cső)
• Az oszlopokat egyszer átmossák TRIS pH = 8,5 pufferrel a főzőpohárba folyatva (és ezzel regenerálják)
• EZUTÁN a második csoport hallgatói a következőket csinálják (4 munkacsoport de csak 3 spektrofotométer)
• Beállítják a spektrofotométereken elsőként a 280 nm hullámhosszt
• A 4. csőből a deszt. vizet egy küvettába öntik, amit azután elhelyeznek a küvettatartó első helyére, majd nulláznak (Zero gomb)
• A csövek tartalmát a számozási sorrendjük szerint beleöntik a maradék három küvettába és lemérik az extinciókat , kitöltik a
táblázat 1. oszlopát, a végén elöblítik a küvettákat
• Ezután átállítják a második fotometriás méréshez a fotométeren a hullámhosszt ( 405 nm)
• 2 új kémcsövet számoznak meg 1. és 3. , az azonos sorszámúak elé teszik őket a tartóállványon
• A középső nagyságú pipettával 1000 μl BAPNA-t mérnek az új kémcsövekbe és az egyik küvettába, az lesz a vak oldat
• Ezután a legkisebb pipettával hozzámérnek a BAPNA-hoz a szedett eluátumból 100 μl-t, a kémcsövek azonos sorszámúak legyenek
• 5 perc szobahőn való inkubálás után mérjük az extinkciókat , a középső oszlopba írjuk
• A jegyzőkönyvben a táblázatban feljegyzik, hogy melyik frakció mit tartalmazott, és az óra végén bemutatják a tanárnak
 Jegyzőkönyv: kitöltött elektronikus v. papír alapú táblázat
frakció abszorbancia 280 nm-en abszorbancia BAPNA-val 405 nm eredmény értékelése: mi van a frakcióban:
vak:víz vak: BAPNA valamilyen fehérje, puffer, tripszin?
1.
2.
3.