Immundiagnosztika

Alkalmazási területei
• fertőző betegségek diagnosztikája
• mikroorganizmusok (vagy más antigének) azonosítása, besorolása
• az aktuális immunállapot meghatározása
• a vakcinázás hatékonyságának ellenőrzése
• az immunrendszer működésének ellenőrzése
• túlérzékenységi reakció kórjelzése
• autoimmun betegségek kórjelzése

A diagnózis felállításához figyelembe kell venni a kórelőzményt, valamint a

klinikai és egyéb vizsgálatok eredményeit és a szerológiai vizsgálatok
eredményét azokkal összevetve kell értékelni!

In vitro vagy ritkábban In vivo módszerek

• szerológiai tesztek
• celluláris próbák
 Szerológiai reakciók
Antigén és ellenanyag reakciók

Szerológia (szérum)

• Antigén kimutatása specifikus, standard ellananyagokkal

• Ellenanyagok kimutatása specifikus, standard antigénekkel

(Diagnosztikai célra savópár vizsgálata)
 Atg-Ea reakció szakaszai
Elsődleges reakciók
• látható reakciók nélkül
• gyors, visszafordítható folyamat
Másodlagos reakciók
• agglutináció, precipitáció, komplement rendszer aktiválása
• a mozogni képes szervezetek helyhez kötése
• fagocitózis aktivitásának növelése
• neutralizáció, élő kórokozók elpusztítása

A kötések külön-külön gyengék, együtt erősek

Hidrofób kötés
Antigénkötő Antigénkötő
hely hely

Hidrofil kötés

Epitóp
Variábilis
domének
Elektrosztatikus
kötés
Kapocsrégió
Konstans
domének
van der Waals kötés
Kvalitatív teszt
Ea felező hígítása
az Atg vagy Ea jelenlétének meghatározása a cél

Kvantitatív módszer
az Atg vagy az Ea relatív mennyiségének
meghatározása titrálással
cc
Titer meghatározása

Az Ea-ból (vagy Atg-ből) (kettes alapú) hígítási sort

készítünk és minden egyes hígításhoz ismert 1:2
mennyiségű Atg (vagy Ea) oldatból azonos
térfogatot adunk.

Titer: az a legmagasabb hígítási fok, ahol a 1:4

homológ Atg-nel (vagy Ea-gal) még látható Stb…
szerológiai reakció tapasztalható.

Ea hígítások

+ + +
Ismert mennyiségű Atg
 A szerológiai próbák hibalehetőségei 1
(fals pozitív vagy fals negatív reakciók)

Technikai hibák

Negatív és pozitív kontrollvizsgálatok egyidejű elvégzésével kiküszöbölhetők

1. Az alkalmazott módszer érzékenysége alacsony

2. A vizsgálat a fertőződés korai stádiumában kerül elvégzésre

(még nincs kimutatható ellenanyag)

3. Zónajelenség (Atg vagy Ea túlsúly)

 antigén ellenanyag
3.

Ellenanyag Precipitáció
túlsúly
Ellenanyag mennyisége

Egyensúly

Antigén
túlsúly

Antigén mennyisége
 A szerológiai próbák hibalehetőségei 2
(fals pozitív vagy fals negatív reakciók)

Biológiai hibák

Nehezebb kizárni, mint a technikai hibákat

1. Immunszuppresszió

2. Keresztreakció

• Egy adott antigénnel szemben képződő ellenanyag képes másik,

tőle független antigénnel is reagálni

• Különböző antigének hasonló vagy egyező epitópjai

• Poliszacharid antigének esetében gyakori

• A kereszt-reagáló Atg affinitása alacsonyabb

 a kereszt-reagáló Atg-k hígításával ellenőrizhető
 a homológ Atg-nel magasabb titer mérünk
Keresztreakció

Az ellenanyag szelektíven kötődik

a konkrét antigén megfelelő
epitópjához

Keresztreakció fordul elő, amikor a

keresett antigén egyes részei
hasonlítanak egy másik antigénhez
 Fals reakciók

Valós állapot

Pozitív Negatív

Pozitív Valós pozitív Fals pozitív

Teszt
eredmény
Negatív Fals negatív Valós negatív
 Szerológiai módszerek
1. Agglutináció
2. Precipitáció
3. Vörösvértest
• Hemagglutináció / hemagglutináció gátlás
• Komplement kötési próba
• Hemadszorpció-gátlás
4. Sejttenyészet
• Vírus neutralizáció
• Toxin neutralizáció
• (Baktérium neutralizáció)
5. Enzim
• ELISA
• Immunhisztokémia
6. Fluoreszkáló anyagok
• Immunfluoreszcencia teszt
• FACS
7. Radioaktív anyagok
• Immunprecipitáció
• Radioimmun vizsgálat (RIA)
8. Színes anyagok/latex
 Agglutinációs próbák
Az Ea-ok által összekapcsolt részecskék összecsapódása
(oldhatatlan antigének és oldott ellenanyagok)

Feltételek
• Az Ea min. bivalens, az Atg-en min. 2 epitop

• Fizikai és kémiai feltételek (ionerősség, pH, környezeti hőmérséklet)

• A kötőhelyek és az epitopok számának megközelítő ekvivalenciája (ideális

esetben)

Antigén
determináns
Antigén részecske lehet

- baktérium
pl.: E. coli, Salmonella, Listeria, Streptococcus
szeroptipizálás, specifikus antiszérum használatával

- parazita
pl.:Toxoplasma antigén meghatározás

- fonalas és élesztőgombák
pl.: Candida albicans, cryptococcosis szerotipizálása

- vörösvértest (vagy más sejtek)

pl.: vércsoport meghatározás
 Agglutinációs próbák típusai
Passzív agglutinációs próba

Az Ea vagy az Atg részecskéhez kötött

• Részecske: latex, baktérium, agaróz gyöngy stb.
• Ea/Atg: rheumatoid faktor, mikrobiális antigének (pl. APP)

Specifikus ellenanyag Staphylococcus aureus Specifikus

Latex golyó
Latex Latex
Cowan 1 törzs ellenanyag

Antigén Antigén

Passzív agglutináció Passzív agglutináció

 Agglutinációs próbák típusai

Direkt agglutináció

Az antigén része egy nagyobb méretű részecskének

(pl.: baktérium, vörösvértest, gomba)

• Tárgylemez agglutináció
• Csőagglutináció
• Mikroagglutináció
• Coombs próba
• Haemagglutinációs próbák
• ABR próba Epitóp

Late
x
 Szérum tárgylemez agglutinációs próba
Tárgylemez agglutinációs értékelése

próba
(kvalitatív teszt)

Minta:
• szérum
• alvadásában gátolt teljes vér

A festett antigének mennyiségét úgy

állítják be, hogy a mintát és az
antigén oldatot 1:1 arányban
elegyítve a specifikus ellenanyagok
jelenlétét kimutassa.

Ha a minta specifikus ellenanyagot

tartalmaz, a tárgylemez-agglutináció
szobahőmérsékleten 1-2 percen belül
kialakul.
 Tárgylemez agglutinációs próba kivitelezése
Reagensek
 Elölt (festett) bakteriális Atg (Mycoplasma, Salmonella, Brucella, Bacillus
anthracis, Francisella tularensis)
 Pozitív és negatív kontroll savó
 Vizsgálandó vérsavó

Eszközök
 Tiszta üveglap
 Cseppentő, vagy automata mikropipetta

Próba elvégzése
 Szobahőmérsékleten
 1 csepp (40-70 µl) antigénhez azonos mennyiségű vizsgálandó (vagy
kontroll) szérumot kell keverni és kb. 1,5 cm területre széleszteni

Elbírálás
 2 percen belül
 A csapadék minősége változó
 Csak két perc után minősíthető negatívnak
 A 2 perc után kialakuló agglutináció kétes eredménynek minősítendő
Csőagglutináció
mikroagglutináció
(kvantitatív teszt)

A vizsgálandó minta különböző

hígításaihoz azonos mennyiségű antigént
mérünk, majd inkubáljuk (1-24 óra).

Az adott minta titere az a legmagasabb

hígítási fok, amelynél még kialakul az
agglutináció.

Magas Ea titerű minták esetén gyakran

megfigyelhető a zónajelenség, melynek
a kiküszöbölése a vérsavó hígításával
lehetséges.
O agglutináció:
bakteriális sejtfal Atg reagál, cső alján felkúszó szélű üledék, rögös

H agglutináció:
csilló Atg-ek reagálnak, vattaszerű üledék, pelyhes
A zóna jelenség látható egy Brucella
agglutinációs teszt esetében
Coombs teszt
(antiglobulin-próba)
Inkomplett Ea-ok kimutatása

Funkcionálisan monovalens Ea-ok,

amelyek specifikusan kötődnek ugyan a Normál, flexibilis Inkomplett, nem flexibilis
korpuszkuláris antigénekhez, de látható ellenanyag ellenanyag
szerológiai reakciót nem hoznak létre,
sőt, gátolják a bivalens molekulák Nincs
kötődését. agglutináció

Az antiglobulin összekapcsolja az
inkomplett ellenanyagokkal fedett
antigéneket, és így kialakulhat az
agglutináció.
Agglutináció
Az autoimmun haemolitikus anémia
diagnosztikájában is használatos,
amikor a vörösvérsejtek felületén saját
eredetű inkomplett ellenanyagok
találhatók.
 Direkt Coombs teszt

Coombs Reagens
Páciens vvt (Antiglobulin)

Indirekt Coombs teszt

1. lépés

Páciens széruma Target vvt

2. lépés

+
Coombs Reagens
(Antiglobulin)
Haemagglutináció-gátlási
(HAG) próba

Egyes mikroorganizmusok a felületükön HA

olyan fehérjéket (haemagglutinin, H)
hordoznak, amelyek képesek
meghatározott állatfajok vörösvérsejtjeit
agglutinálni.

A mikroorganizmust specifikus Ea-ot

tartalmazó savóval inkubálva, az Ea
kötődik a H-hez, meggátolva a
haemagglutináció kialakulását. HAG
A módszer alkalmas a szérum
ellenanyag-tartalmának meghatározására.

A haemagglutináció-gátlási titer a szérum legnagyobb hígítása,

amely még meggátolja a haemagglutináció kialakulását.
Haemagglutinációs (HA) próba (NDV-antigénnel)
Reagensek
 7,0–7,4 pH, foszfáttal pufferolt izotóniás sóoldat (PBS)
 1 %-os csirke vörösvérsejt szuszpenzió PBS-ben
 standard Atg: NDV Ulster 2C vagy LaSota
Eszközök
 automata mikropipetta
 96 lyukú lemez (Takátsy mikrotiter lemez)

Eljárás
1. 25 μl PBS-t mérünk a lemez minden vájulatába.
2. 25 μl vírusszuszpenziót (azaz allantois folyadékot) kell helyezni az első
vájulatba.
3. Minden további vájulatba az előző vájulat térfogatának felét kell továbbvinni.
4. 25 μl 1 %-os vörösvérsejtet mérünk minden vájulatba.
5. 4 °C-on inkubáljuk és 30–40 perc múlva leolvassuk. A leolvasást a lemezek
megdöntésével kell elvégezni.

A HA titer az a legnagyobb hígítás, amely a vörösvérsejtek agglutinációját okozza.

A hígítás egy HA egységet (HAE) tartalmazónak tekinthető.
Haemagglutináció-gátlási próba
(NDV)

Reagensek
 foszfáttal pufferolt sóoldat (PBS)
 4 vagy 8 HAE/25 μl, PBS-sel hígított, vírustartalmú allantois folyadék
 1 % csirke vörösvérsejt
 negatív kontroll szérum
 pozitív kontroll szérum
 vizsgálati minta

Eljárás
1. 25 μl PBS-t mérünk minden vájulatba
2. 25 μl szérumot kell helyezni az első vájulatba
3. A szérumból felező hígítási sort készítünk.
4. 25 μl hígított, 4 vagy 8 HAE-t tartalmazó vírust mérünk minden lyukba.
5. Inkubálás: min. 60 perc 4 °C-on vagy min. 30 perc szobahőmérsékleten.
6. 25 μl 1 %-os vörösvérsejtet mérünk minden vájulatba és 4 °C-on inkubáljuk
30–40 percig.

A HAG titer az antiszérum legnagyobb hígítása, amely a négy vagy nyolc egység
vírus teljes gátlását okozza.
 Haemagglutináció-gátlási próba

1/1024
1/128
1/256
1/512
1/16
1/32
1/64

Neg.
Pos.
1/8
1/2
minta 1/4 Titer

1 256
2 32
3 8
4 32
5 1024
6 2
7 128
8 16

Ea-ok a Nincsenek Ea-ok a szérumban

szérumban
 ABR (Abortus Bang Ring) próba
(Tej-gyűrűpróba)
Friss tej Brucella abortus specifikus Ea-ainak kimutatására szolgál.
A Ea-ok agglutinálják a festett antigént, a komplex a tejzsírral a felszínre
emelkedik (színes korong, gyűrű).

Atg: hematoxylinnel festett bakteriális szuszpenzió

Ea: tejminta (tilos lefagyasztani, melegíteni, vagy erőteljes rázkódásnak kitenni)

Módszer
 2 ml legalább 25 mm magas tejoszlopot képező tejhez hozzá kell önteni
0,05 ml antigént.
 A keveréket 37 °C-on 60 percen keresztül kell inkubálni.
 További 16–24 órán keresztül 4 °C-on történő inkubálás növeli a vizsgálat
érzékenységét.

Értékelés
 Negatív reakció: elszíneződött tej, színtelen tejszín
 Pozitív reakció:
 egyformán elszíneződött tej és tejszín, vagy
 színtelen tej és elszíneződött tejszín
 ABR (Abortus Bang Ring) teszt
(tej-gyűrűteszt)
Negatív reakció
a tej színes, a tejszín fehér

Pozitív reakció
a tej és a tejszín egyaránt színes,
vagy a tej fehér, a tejszín színes